KR20190102018A - Pd-l1 발현에 기반한 종양 및 면역 세포 영상화 - Google Patents

Pd-l1 발현에 기반한 종양 및 면역 세포 영상화 Download PDF

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사미트 채터지
보이치에흐 쥐. 레스니악
디라지 쿠마르
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본원에 개시된 주제는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출할 수 있는 영상화 제제를 포함하는 조성물, 키트, 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 영상화 제제는 대상체에서 암, 감염, 및 염증과 같은 질병 및 장애를 검출하는데 사용될 수 있다.

Description

PD-L1 발현에 기반한 종양 및 면역 세포 영상화
관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2016년 12월 23일 출원된 U.S. 가특허출원 번호 62/438,575호, 및 2017년 6월 14일 출원된 62/519,534호의 이익을 주장하며, 이들의 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발
본 발명은 국립 보건원(National Institute of Health, NIH)이 수여한 NIH R01CA16631 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
배경
분자 영상화는 종양 면역 미세환경의 상태를 보고하고 면역치료 전략을 유도하여 면역 조절 요법의 효능을 향상시킬 수 있다. 면역조절 요법의 표적에 대해 신속히 보고할 수 있는 영상화 제제는 거의 없다.
암 세포를 사멸시키기 위해 자신의 면역 시스템을 활용하는 면역요법은 다양한 암의 치료에서 중심적인 역할을 하고 있다(Topalian et al., 2016). 현저히 개선된 치료적 성과에도 불구하고, 많은 암은 면역조절 요법에 반응하지 않는다. 면역조직화학(IHC)을 통해 작동하는 기존의 동반 진단제는 동적 종양 면역 환경의 스냅샷만을 제공하며 종종 치료 반응을 정확하게 예측하지 못한다(Mansfield and Dong, 2016). 비침습적 영상화 기술은 종양 생물학의 정량적, 실시간 평가를 제공하고 약물 개발을 유도할 수 있다(Willmann et al., 2008).
중개 영상화 기술의 가장 분자적이고 정량적인 양전자 방출 단층촬영(PET)은 주어진 환자의 모든 병변에서 전체 표적 발현을 반복적으로 측정하는데 사용되어 왔다. 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암을 검출하기 위해 분자에 의해 표적화된 PET 추적자, 예를 들어, [18F]플루오로에스트라디올(18F-FES)은 요법에 대한 반응 및 무진행 생존을 예측할 수 있다(Peterson et al., 2008, and Linden et al., 2006). PET 추적자는 물론, 면역조절 요법과 관련된 표적 발현의 신속한 실시간 평가를 제공할 수 있는, 자기 공명 영상(MRI), 형광 영상화, 근적외선(NIR) 영상화, 광음향 영상화, 및 라만(Raman) 영상화를 비제한적으로 포함하는 다른 영상화 방법을 위한 영상화 제제는 진행 중인 임상 시험에 큰 도움이 될 수 있었다.
프로그램된 세포사멸 리간드(programmed death ligand 1, PD-L1)은 여러 암에서 과발현되는 면역 체크포인트 단백질이고 종양 면역 억제에 기여한다. 종양 PD-L1 발현은 PD-1 및 PD-L1 표적화된 요법에 대한 종양 반응을 나타낸다. 방사선표지된 항-PD-L1 항체는 인간 종양 이종이식편 및 동계 종양 모델에서 PD-L1 발현을 비침습적으로 평가하는데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Heskamp et al., 2015; Maute et al., 2015; Chatterjee et al., 2016; Deng et al., 2016; Hettich et al., 2016; Josefsson et al., 2016). 방사선표지된 항체 컨쥬게이트는 종양-특이적 단백질을 영상화하기 위해 사용이 점점 늘고 있지만, 향상된 콘트라스트 및 병변 검출을 위해서는 최대 며칠까지 연장되는 더 긴 제거 시간이 필요하다(Pandit-Taskar et al., 2015; Oosting et al., 2016).
개요
일부 양태에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 영상화 제제를 제공하고, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 펩티드 및 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 보고 모이어티는 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 펩티드에 직접 부착된다. 다른 양태에서, 보고 모이어티는 펩티드 내에 직접 혼입되고, 예를 들어, 보고 모이어티는 방사선표지된 아이오도티로신 또는 플루오로티로신과 같은 펩티드의 방사선표지된 아미노산을 포함한다.
특정 양태에서, PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, A113, M115, 및 Y123과 상호작용한다.
특정 양태에서, 펩티드는 WL12이고 영상화 제제는 하기 화학식 (I), 화학식 (II), 및 화학식 (III)로 구성된 군으로부터 선택된 화합물이다:
Figure pct00001
DK-A-221-(L)n-Rpt (II); 또는
DK-A-222-(L)n-Rpt (III);
상기 식에서, n은 0 및 1로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; L은 링커이고; Rpt는 보고 모이어티이다; 상기 보고 모이어티 또는 링커가 존재하는 경우, 이는 화학식 (I), 화학식 (II), 또는 화학식 (III)의 영상화 제제를 포함하는 펩티드의 아미노산의 1차 아민기에 부착된다.
특정 양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 WL12 DOTA이다:
Figure pct00002
다른 양태에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 영상화 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 유효량의 영상화 제제를 제공하는 단계로서, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 펩티드 및 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 보고 모이어티는 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 펩티드에 직접 부착되는, 단계; (b) 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화 제제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 이미지를 생성하여 PD-L1을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 영상화 제제는 PD-L1의 Y56, E58, A113, M115 및 Y123와 상호작용하는 화학식 (I)의 화합물 또는 펩티드이다.
특정 양태에서, 본원에 개시된 영상화 제제는 대상체에서 암, 감염, 및 염증과 같은 질병 및 장애를 검출하는데 사용될 수 있다.
또한 추가 양태에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)를 검출하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 영상화 제제를 포함하고, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 펩티드 및 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 보고 모이어티는 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 펩티드에 직접 부착된다.
상기 언급된 본원에 개시된 주제의 특정 양태는 본원에 개시된 주제에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 다루어지며, 본원의 하기에 가장 잘 설명되는 바와 같이 수반되는 실시예 및 도면과 관련하여 취해지는 경우에 설명이 진행됨에 따라 다른 양태가 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
따라서, 본원에 개시된 주제는 일반적인 용어로 기재되었으며, 반드시 일정한 비율로 그려진 것은 아닌 하기 수반되는 도면이 이제 참조될 것이다:
도 1a, 도 1b, 및 도 1c는 PD-L1에 결합하는 WL12를 나타낸다. 도 1a는 WL12 및 이의 유사체의 구조적 표현 및 WL12의 아미노산 서열(WL12 아미노산 서열 = 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Leu-Hyp-Trp-Ser-Trp(메틸)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2)을 나타내고; 도 1b는 PD-L1에 대한 WL12의 예측된 결합 방식을 나타낸다. WL12는 PD-L1의 홈에 베타 시트-유사 구조를 형성한다. WL12는 하늘색(cyan)으로 표시된다. PD-L1의 표면 표시는 회색으로 보여지고, 리본 및 키 측쇄는 자홍색(magenta)으로 표시되고; 도 1c는 WL12가 PD-L1에 대한 PD-1 결합을 모방함을 보여준다. PD-1의 구조는 청록색(teal)으로 표시된다. PD-1의 두 주요 상호작용 베타 가닥은 PD-L1에 결합된 WL12에 의해 채택된 형태와 잘 중첩된다.
도 2는 펩티드 WL12의 원-UV CD 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 WL의 전자분무 이온화(ESI) 질량 스펙트럼을 도시한다; 이론적인 화학식: C91H128N22O20S2. 관측치 m/z: 1882.7 - (M + 1)+1, 941.9 - (M + 2)+2/2. 예상치: 1882.19;
도 4는 WL12D의 RP-HPLC 정제를 도시한다;
도 5는 PDL1-PD의 저해상도 질량 스펙트럼을 도시한다; 이론적인 화학식: C91H128N22O20S2 정확한 질량: 2339.14, 분자량: 2340.65, 관측치 m/z: 2340.9 - (M + 1)+1, 1171.1 - (M + 2)+2/2 및 781.1 - (M + 2)+3/3;
도 6은 [PDL1-PD-Cu2+]의 RP-HPLC 정제를 도시한다;
도 7은 [PDL1-PD-Cu2+] 복합체의 저해상도 질량 스펙트럼을 도시한다; 이론적인 화학식: C110H156N26O29S 정확한 질량: 2400.05, 분자량: 2402.18, 관측치 m/z: 2402.6 - (M + 1)+1, 1201.9 - (M +2)+2/2;
도 8a, 도 8b, 및 도 8c는 PD-L1 결합 펩티드 WL12의 시험관 내 특성화를 나타낸다. 도 8a는 PD-1:PD-L1 상호작용을 억제하는 WL12 유사체의 친화도를 나타내는 경쟁적 억제 검정을 나타내고; 도 8b는 가변적인 PD-L1 발현을 나타내는 시험관 내 연구에 사용된 세포주의 유세포분석 히스토그램을 나타내고; 도 8c는 [64Cu]W12가 과량의 펩티드(PEP)에 의해 차단될 수 있는 높은 PD-L1 발현을 갖는 세포에 대한 증가된 결합을 나타냄을 보여준다;
도 9는 PD-1에 대한 PD-L1 결합의 대표적인 곡선을 나타낸다; KD=69.66 ±11.65 nM (95% CI 44.82 - 94.48 nM);
도 10은 WL12D-Cu2+ 복합체에 의한 PD-1에 대한 PD-L1 결합의 억제에 대한 대표적인 곡선을 도시한다; IC50=2.97 nM (95% CI 2.17 - 40.5 nM) Ki=1.38 nM (95% CI 1.01 - 1.89 nM);
도 11은 [64Cu] WL12 방사선추적자(적색) 및 "저온" WL12- Cu2+ 복합체의 RP-HPLC 크로마토그램을 도시한다;
도 12는 PDL1-PD 및 [PDL1-PD-Cu2+]의 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 도시한다;
도 13은 흡수 검정에 사용된 다양한 세포주의 평균 형광 강도 값을 나타낸다;
도 14는 세포주 MFI 대 %ID의 상관관계를 도시한다;
도 15a 및 도 15b는 [64Cu]WL12에 의한 종양 PD-L1 발현의 신속한 생체 내 검출을 나타낸다. hPD-L1(적색 화살표) 및 CHO 종양(청색 화살표)을 지닌 NSG 마우스에 150 μCi의 [64Cu]WL12를 정맥내 투여하고 방사선추적자를 주사한지 10, 30, 60 및 120분 후에 이미지를 획득하였다. 도 15a는 hPD-L1 종양에서 [64Cu] WL12의 특이적 축적을 나타내는 단면(상부) 및 3D 부피 렌더링된(하부) 이미지를 도시하고; 도 15b는 PD-L1 IHC가 hPD-L1 종양에서 강한 면역반응성(갈색)을 나타내는 것을 보여준다;
도 16은 NSG 마우스의 hPD-L1 종양에서 [64Cu]WL12의 특이적 흡수를 도시한다. hPD-L1 및 CHO 종양을 보유하고 추적자를 주사한지 24시간 후에 [64Cu]WL12를 주사한 NSG 마우스의 대표적인 부피 렌더링된 PET-CT 이미지. CHO(청색 화살표) 종양에 비해 hPD-L1(적색 화살표) 종양에서의 흡수 증가는 방사선추적자의 PD-L1 매개된 흡수를 확인시켜 준다;
도 17은 hPD-L1 및 CHO 종양을 지닌 NSG 마우스에서 [64Cu]WL12의 생체 외 생체분포 분석을 도시한다. NSG 마우스에게 20 μCi의 [64Cu]WL12를 정맥내 투여하고 주사한지 60 및 120분 후에 조직을 수확하였다. 차단 연구를 위해, 마우스는 방사선추적자 주사와 함께 과량의 펩티드(pep)를 투여받았다.
도 18a, 도 18b, 및 도 18c는 (도 18a) Wl12-IR800CW 컨쥬게이트의 구조(화학식: C137H177N24O34, 분자량: 2864.34), (도 18b) 피크(삽입) 아래에 기록된 UV-Vis 스펙트럼이 염료와 펩티드의 컨쥬게이션을 나타내는 WL12-IR800CW의 HPLC 크로마토그램; 및 (도 18c) 예상되는 분자량과 상관되는 WL12-IR800CW 컨쥬게이트의 ESI-MS 스펙트럼을 도시한다.
도 19a, 도 19b, 및 도 19c는 CHO 및 hPDL1 종양을 지닌 마우스에서 WL12-IR800CW의 평가를 나타낸다: (도 19a) 5 nmole의 WL12-IR800CW를 주사한 마우스 및 컨쥬게이트를 주사한지 24시간 후 기록된 생체 외 기관의 대표적인 이미지, (도 19b, 차단) 25 nmole의 비변형된 WL12 및 5 nmole의 WL12-IR800CW를 주사하고, 24 h pi에 획득한 마우스의 대표적인 이미지; 및 (도 19c) 1 nmole, 3 nmole, 및 5 nmole의 컨쥬게이트로 처리되고 WL12로 차단된 마우스로부터 획득된 선택된 기관 및 종양에서의 WL12-IR800CW의 생체 외 생체분포의 정량(숫자는 상응하는 기관을 나타낸다, n=4);
도 20A, 20B, 20C, 및 20D는 인간 NSCLC 및 TNBC 이종이식편에서 [111In]아테졸리주맙 흡수가 전적으로 발현 의존적이 아니라는 것을 보여준다. (A) 가변적인 PD-L1 발현을 나타내는 다양한 TNBC 및 NSCLC 세포주의 흐름세포 분석; (B) 암 세포주에 대한 [111In]AtzMab의 결합은 PD-L1 발현에 의존적이다; (C) PD-L1low SUM149에 비해 PD-L1high MDAMB231 TNBC 이종이식편에서 [111In]AtzMab의 증가된 흡수; 및 (D) PD-L1low H1155에 비해 PD-L1high H2444 NSCLC 이종이식편에서 [111In]AtzMab의 증가된 흡수. 상응하는 조직학이 표시된다. 출처 Chatterjee, et al., Oncotarget, 2016;
도 21A, 21B, 21C, 및 21D는 [64Cu]WL12-PET가 종양에서 AtzMab 축적을 검출함을 보여준다. (A) 전신 [64Cu]WL12 이미지는 hPD-L1 종양에서 60 min p.i.까지 방사활성의 특이적 축적을 나타낸다; (B) [64Cu]WL12 흡수는 추적자를 주사하기 24시간 전에 20 mg/Kg 용량의 AtzMab을 투여받은 마우스의 hPD-L1 종양에서 현저하게 감소된다; (C) [64Cu]WL12가 종양에서 AtzMab PD-L1 진입을 검출할 가능성을 확인하는 상응하는 생체분포 연구; 및 (D) WL12는 AtzMab이 PD-L1에 결합하는 것을 억제한다. WL12의 연속 희석액과 함께 인큐베이션된 hPD-L1 세포를 Cy5- AtzMab 또는 상업적인 BD 항체 BD-MIH1-PE로 염색하였다. 평균 형광 강도(MFI) 대 펩티드 농도 플롯은 Cy5- AtzMab 및 BD-MIH1-PE에 대해 각각 2.5 nM 및 37.8 nM의 IC50을 나타낸다;
도 22는 [64Cu]WL12-PET가 삼중 네거티브 유방암 이종이식편에서 AtzMab 축적을 검출하는 것을 보여준다. [64Cu]WL12 흡수는 추적자를 주사하기 24시간 전에 20 mg/Kg 용량의 AtzMab을 투여받은 마우스의 MDAMB231 종양에서 현저하게 감소된다.
도 23a, 도 23b, 및 도 23c는 (A) Wl12-IR800 컨쥬게이트의 구조(화학식: C137H177N24O34, 분자량: 2864.34), (B) 피크(삽입) 아래에 기록된 UV-Vis 스펙트럼이 염료와 펩티드의 컨쥬게이션을 나타내는 WL12-IR800의 HPLC 크로마토그램; 및 (C) 예상되는 분자량과 상관되는 WL12-IR800의 ESI-MS 스펙트럼을 도시한다.
도 24A, 도 24B, 및 도 24C는 CHO 및 hPDL1 종양을 보유한 마우스에서 WL12-IR800의 평가를 나타낸다: (A) 5 nmole의 WL12-IR800을 주사한 마우스 및 컨쥬게이트를 주사한지 24시간 후 기록된 생체 외 기관의 대표적인 이미지, (B, 차단) 25 nmole의 비변형된 WL12 및 5 nmole의 WL12-IR800을 주사하고, 24 h pi에 획득한 마우스의 대표적인 이미지; 및 (C) 1 nmole, 3 nmole, 및 5 nmole의 컨쥬게이트로 처리되고 WL12로 차단된 마우스로부터 획득된 선택된 기관 및 종양에서의 WL12-IR800의 생체 외 생체분포의 정량(숫자는 상응하는 기관을 나타낸다, n=4);
도 25a 및 도 25b는 CHO 및 CHO-hPDL1 종양 모델에서 [68Ga]WL12의 평가를 나타낸다: (A) CHO-hPD-L1(적색 화살표, 높은 PD-L1발현) 및 CHO(검정색 화살표, 낮은 PD-L1 발현) 종양(n=3)에서의 [68Ga]WL12 흡수의 PET-CT(부피 렌더링됨) 이미지는 방사선추적자의 PD-L1 매개된 흡수를 확인시켜 준다; (B) 동일한 종양 모델에서 [68Ga]WL12를 주사한지 1시간 후 생체 외 생체분포 분석. 차단 용량 코호트에는 50 마이크로그램의 찬 펩티드를 공동-주사하였다.
도 26은 CHO 및 CHO-hPDL1 종양 모델에서 [18F]WL12의 평가를 나타낸다. (A) CHO-hPD-L1(적색 화살표, 높은 PD-L1발현) 및 CHO(청색 화살표, 낮은 PD-L1 발현) 종양(n=3)에서의 [18F]WL12 흡수의 PET-CT(부피 렌더링됨) 이미지는 방사선추적자의 PD-L1 매개된 흡수를 확인시켜 준다;
도 27은 MDAMB231 및 SUM149 종양을 지닌 마우스에 20 mg/Kg 용량의 아테졸리주맙을 주사한 것을 나타낸다. mAb를 투여한지 20시간 후, 마우스에 20 μCi의 [64Cu]WL12를 주사하고 생체분포 연구를 추적자 주사 24시간 후에 수행하였다. 데이터는 종양에서 PD-L1에 대한 아테졸리주맙 결합이 [64Cu]WL12에 의해 정량될 수 있음을 입증한다.
도 28은 PD-L1 치료용 항체인 아테졸리주맙에 대한 용량 의존성 PD-L1 점유율 측정을 보여준다. MDAB231 유방 종양을 지닌 마우스에 다양한 용량의 아테졸리주맙을 주사하고 24시간 후, 마우스에 [64Cu]WL12를 주사하고 추적자를 주사한지 2시간 후 생체분포 연구를 수행하였다. 데이터는 항체 용량이 증가함에 따라 종양에서 [64Cu]WL12 축적이 감소하는 것을 나타낸다;
도 29는 [64Cu]WL12에 의해 측정된 아테졸리주맙의 PD-L1 점유율에서의 시간 및 용량 의존적 변화를 나타낸다. MDAMB231 종양 보유 마우스에 1 또는 10 mg/Kg 용량의 아테졸리주맙을 투여하였다. mAb을 투여한지 24 또는 120시간 후에, 마우스에 [64Cu] WL12를 주사하고 방사활성의 종양 축적을 생체분포 연구에 의해 측정하였다. 예상대로, 10 mg/Kg 용량에서 PD-L1의 완전한 차단이 24 및 120시간 둘 모두에 관찰되었다. 한편 1 mg/Kg 용량에서, [64Cu]WL12의 증가된 축적이 120시간에는 관찰될 수 있지만 24시간에는 볼 수 없다는 것은 낮은 mAb 용량 사용시 종양으로부터의 시간에 따른 아테졸리주맙의 세척을 시사한다. 이들 데이터는 종양에서 PD-L1 치료용 mAb 체류 시간이 본원에 개시된 펩티드를 사용하여 분석될 수 있었음을 시사한다.
도 30은 DK-A-221 및 DK-A-222의 화학 구조를 도시한다;
도 31A 및 도 31B는 DK222 PD-L1 결합 펩티드에 관한 데이터를 나타낸다. NOTA 컨쥬게이션된 DK222를 합성하고 CHO/CHO-HPD-L1 종양을 보유한 마우스에서 평가하였다. 영상화(A) 및 생체분포(B) 데이터는 [64Cu]DK222의 우수한 약동학을 보여준다;
도 32는 CHO/CHO-hPD-L1 종양을 보유한 NSG 마우스에서 [64Cu]DK222의 생체분포를 도시한다;
도 33a, 도 33b, 및 도33c는 WL12가 시험관 내에서 PD-1 및 PD-L1 치료제 간의 상호작용을 억제함을 입증한다. 도 33a는 PD-L1(녹색 및 하늘색)에 대한 WL12 결합 방식이 AtzMab(적색 및 하늘색), AveMab(주황색 및 하늘색) 및 DurMab(청색 및 하늘색)에 대한 PD-1의 방식과 중첩됨을 보여준다. 상호작용하지 않는 잔기는 회색으로 표시된다. 공유된 결합 영역(하늘색)을 포괄하는 다양한 접촉은 상이한 치료용 mAb의 다양한 결합 메커니즘을 설명한다. 도 33b는 경쟁적 억제를 통해 입증된 바와 같이 WL12가 PD-L1에 대한 Cy5-컨쥬게이션된- AtmMab, AveMab 및 DurMab을 억제하는 것을 나타낸다. 평균 형광 강도는 유세포분석에 의해 결정되었다. 도 33c는 PD-L1-양성 HCC827, H226, hPD-L1, 및 MDAMB231 세포에 대한 [64Cu]WL12 결합이 60 nM AtzMab, AveMab 및 DurMab의 존재 하에, PBS 대조군에 비해 억제되는 것을 나타낸다. PD-L1-음성 CHO 및 SUM149 세포에서의 [64Cu]WL12 결합도 도시된다. ****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 34A는 PD-1과 PD-L1 상호작용 계면을 둘러싸는 분자 표면를 표시한다. PD-1 경쟁적 치료제와의 상호작용에 관련되는 일반적인 잔기는 하늘색으로 표시되고, PD-1 상호작용에 특이적인 분자 접촉은 보라색으로 표시되며, 상효작용하지 않는 잔기는 회색으로 표시된다. 분자 상호작용의 중첩을 설명하기 위해, 결합된 PD-1의 구조는 보라색으로 표시되고 WL12의 예측된 형태는 녹색으로 표시된다;
도 34B는 WL12가 hPD-L1 세포에서 PD-L1에 대한 Cy5-컨쥬게이션된 PD-1-Fc 단백질의 결합을 억제하는 것을 보여준다. 유세포분석에 의해 결정된 평균 형광 강도;
도 35C는 WL12(5 nM)가 HCC827 및 H226 세포에서 PD-L1에 대한 Cy5-컨쥬게이션된- AtmMab, AveMab 및 DurMab(2 nM)의 결합을 억제하는 것을 보여준다. 유세포분석에 의해 결정된 평균 형광 강도 및 도 35D는 도 34B 및 도 35C로부터 유세포분석에 의해 결정된 평균 형광 강도를 도시한다;
도 35A, 도 35B, 도 35C, 도 35D, 도 35E, 도 35F, 도 35G, 도 35H, 및 도 35I는 PD-L1 mAb에 의한 PD-L1 진입이 가변적인 PD-L1 발현을 갖는 이종이식편에서 [64Cu]WL12를 사용하여 종양에서 정량되는 것을 입증한다. 도 35A-35H는 염수 처리된 대조군에 비해, 방사선추적자를 주입하기 24시간 전에 20 mg/kg의 AtzMab로 처리된 마우스의 H226(도 35A, 도 35B), HCC827(도 35C, 도 35D), 및 hPD-L1/CHO(도 35G, 도 35H) 이종이식편에서의 [64Cu]WL12의 감소된 흡수를 나타낸다. 전신, 부피-렌더링된 [64Cu]WL12 PET-CT 이미지(도 35A, 도 35D, 도 35G) 및 생체 외 생체분포(도 35B, 도 35E, 도 35H). 도 35C, 도 35F 및 도 35I는 PD-L1에 대한 IHC 염색이 상응하는 종양으로부터 도시된 것을 나타낸다 ****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; NS, 유의하지 않음;
도 36A, 도 36B, 도 36C, 및 도 36D는 다음을 나타낸다: 도 36A, 다양한 세포주에서 PD-L1 발현 및 상응하는 평균 형광 강도 값. 도 36B, 도 36C, 및 도 36D, 추적자를 주사하기 24시간 전에 20 mg/Kg 용량의 AtzMab을 투여받은 H226(B), HCC827(C) 또는 hPD-L1/CHO(D) 종양을 보유한 종양 보유 마우스에서 [64Cu]WL12의 생체 외 생체분포. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. ****, P<0.0001; ***, P<0.001; NS, 유의하지 않음;
도 37A, 도 37B, 도 37C, 도 37D, 도 37E, 및 도 37F는 [64Cu]WL12를 사용하여 검출된 종양 PD-L1 발현 및 AtzMab에 의한 이의 진입에서의 동적 변화를 나타낸다. 도 37A는 6시간 및 72시간 동안 독시사이클린으로 처리된 A549-iPDL1 세포에서 증가된 PD-L1 세포 표면 발현을 나타낸다. 유세포분석 히스토그램. 도 37B는 WL12가 72시간 동안 독시사이클린으로 처리된 A549-iPD-L1 세포에 대한 Cy5-컨쥬게이션된- AtzMab, AveMab 및 DurMab(2 nM)의 결합을 억제하는 것을 보여준다(5 nM). 도 37C는 A549-iPDL1 세포(72시간 독시사이클린)에 대한 [64Cu]WL12 결합이 대조군에 비해 60 nM AtzMab의 존재 하에 현저하게 감소되는 것을 나타낸다. 도 37D 및 도 37E는 A549-iPDL1 이종이식편에서 [64Cu]WL12 흡수가 염수 대조군에 비해, 방사선추적자를 주사하기 24시간 전에 정맥내 AtzMab을 투여받은 마우스에서 현저하게 낮고 부모 A549 이종이식편과 유사함을 보여준다. 부피 렌더링된 전신 PET-CT 이미지(D) 및 생체 외 정량(도 37E). 도 37F는 상응하는 종양의 PD-L1에 대한 IHC 염색을 나타낸다. ****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 38은 72시간 동안 독시사이클린 제공되고 방사선추적자를 주사하기 24시간 전에 20mg/Kg의 AtzMab으로 처리된 A549-iPDL1 및 A549 대조군 종양 보유 마우스에서 [64Cu]WL12의 생체 외 생체분포를 나타낸다. ****, P<0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 39A, 도 39B, 도 39C, 도 39D, 도 39E, 도 39F는 [64Cu]WL12를 사용하여 정량된 3개의 상이한 PD-L1 치료용 mAb에 의한 종양 PD-L1 진입을 입증한다. 도 39A - 도 39E. MDAMB231 이종이식편에서 [64Cu]WL12 흡수는 방사선추적자를 주사하기 24시간 전에 AtzMab(20 mg/kg), AveMab(10 mg/kg), 또는 DurMab(10 mg/kg)을 투여받은 마우스에서 현저하게 감소한다. 염수(도 39A), AtzMab(도 39B), AveMab(도 39C), DurMab(도 39D) 처리된 마우스의 전신 부피 렌더링된 [64Cu]WL12 PET-CT 이미지, 및 생체 외 생체분포(도 39E). 도 39F는 상응하는 종양에서 PD-L1에 대한 IHC 염색을 나타낸다. .****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 40은 방사선추적자를 주사하기 24시간 전에 AtzMab(20mg/Kg), AveMab(10 mg/Kg), 또는 DurMab(10 mg/Kg)으로 처리된 MDAMB231 보유 마우스에서 [64Cu]WL12의 생체외 생체분포를 보여준다. ****, P<0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 41A, 도 41B, 도 41C, 도 41D, 및 도 41E는 [64Cu]WL12를 사용하여 정량된 AtzMab에 의한 종양 PD-L1 점유율에 대한 용량 및 시간의 효과를 나타낸다. 도 41A는 마우스의 MDA-MB-231 종양에서 AtzMab 용량(mg/kg)의 증가에 따른 유리 PD-L1 리간드의 감소를 묘사하는 용량-노출 관계를 나타낸다. 0.06 mg/kg, 0.6 mg/kg 및 3.2 mg/kg의 AtzMab을 투여받은 MDAMB231 종양-보유 마우스의 전신 [64Cu]WL12 PET-CT 이미지(도 41A). 도 41B 및 도 41C는 증가된 용량의 AtzMab(0.0009에서 24 mg/kg)으로 처리된 마우스의 종양에서 [64Cu]WL12 흡수의 생체 외 정량을 나타낸다. AtzMab을 방사선추적자를 주사하기 24시간 전에 주사하였다(도 41B). 유리 PD-L1 리간드의 백분율은 0 mg/kg에서 측정된 중간 유리 PD-L1 리간드에 대해 계산되었다(도 41C). 파란색 빈 도트: 마우스에서 각 용량 수준에 대해 측정된 유리 PD-L1 리간드. 붉은색 점선: 평균 모델-예측된 용량-반응 관계. 도 41D 및 도 41E는 0.6 또는 1 mg/kg 용량의 AtzMab에서는 유리 PD-L1 리간드의 증가를 묘사하지만, 10 또는 20 mg/kg AtzMab 용량에서는 그렇지 않은 mAb의 비선형 동역학의 개요를 보이는 시간 경과에 따른 종양 PD-L1 점유율에 대한 AtzMab(mg/kg) 용량 효과를 나타낸다. 전신 부피 렌더링된 [64Cu]WL12 PET-CT 이미지(D) 및 생체 외 생체분포(E)..****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 42는 추적자를 주사하기 24시간 전에 AtzMab의 용량을 증가시키며(0.0009에서 12 mg/Kg) MDAMB231 종양 보유 마우스에서 [64Cu]WL12의 생체 외 생체분포를 도시한다.
도 43은 DK-A-221와 DK-A-222 및 이의 유사체의 구조적 표현 및 DK-A-221의 아미노산 서열(DK-A-221아미노산 서열 = 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(카르복시메틸)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2)을 나타낸다.
특허 또는 출원 파일은 색상으로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색상 도면이 있는 상기 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불시에 사무소에 의해 제공될 것이다.
상세한 설명
본원에 개시된 주제는 이제 본원에 개시된 주제의 전부가 아닌 일부 구체예가 제시되는 수반 도면을 참조로 하여 이하 더욱 충분히 설명될 것이다. 동일한 번호는 본 명세서 전체에 걸쳐 동일한 구성요소를 나타낸다. 본원에 개시된 주제는 많은 상이한 형태로 구체화될 수 있고, 본원에 기재된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며; 오히려, 이들 구체예는 본 발명의 개시가 적용 가능한 법적 요건을 충족시키도록 제공된다. 실제로, 상기 설명 및 관련 도면에 제공된 교시내용의 이점을 갖는 본원에 기재된 본원에 개시된 주제의 많은 변형 및 다른 구체예가 본원에 개시된 주제가 속하는 분야의 당업자에 의해 생각날 것이다. 따라서, 본원에 개시된 주제가 개시된 특정 구체예로 제한되지 않고, 변형 및 다른 구체예가 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다.
I. 영상화 제제를 포함하는 조성물
일부 구체예에서, 본원에 개시된 주제는 PD-L1과 같은 면역 체크포인트 단백질을 검출하기 위한 고도로 특이적인 펩티드-기반 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화 제제를 제공한다. 이들 영상화 제제를 사용하여 대상체에게 투여 후 종양 PD-L1 발현을 특이적으로 그리고 곧 검출할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 영상화 제제를 제공하고, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 펩티드 및 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 보고 모이어티는 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 펩티드에 직접 부착된다. 다른 구체예에서, 보고 모이어티는 펩티드 내에 직접 혼입되고, 예를 들어, 보고 모이어티는 방사선표지된 아이오도티로신 또는 플루오로티로신과 같은 펩티드의 방사선표지된 아미노산을 포함한다.
일부 구체예에서, 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 PD-L1의 4개의 특정 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, 펩티드는 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, D61, 및 A113와 상호작용할 수 있다. 일부 구체예에서, PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 PD-L1의 5개의 특정 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, 펩티드는 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, A113, M115 및 Y123와 상호작용할 수 있다. 일부 구체예에서, PD-L1과 상호작용하는 펩티드는 펩티드 WL12이다. 펩티드 WL12는 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Leu-Hyp-Trp-Ser-Trp(메틸)-NMeNle-N MeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2 (SEQ ID NO.:1)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, WL12는 PD-L1의 4개의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, WL12는 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, D61, 및 A113와 상호작용할 수 있다. 일부 구체예에서, WL12는 PD-L1의 5개의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, WL12는 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, A113, M115 및 Y123와 상호작용할 수 있다. 다른 구체예에서, PD-L1과 상호작용하는 펩티드는 DK-A-221이다. 펩티드 DK-A-221은 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(카르복시메틸)-NMeNle-N MeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2 (SEQ ID NO.: 2)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, DK-A-221은 PD-L1의 4개의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, DK-A-221은 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, D61, 및 A113와 상호작용할 수 있다. 일부 구체예에서, DK-A-221은 PD-L1의 5개의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, DK-A-221은 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, A113, M115 및 Y123와 상호작용할 수 있다. 다른 구체예에서, PD-L1과 상호작용하는 펩티드는 DK-A-222이다. 일부 구체예에서, DK-A-222은 PD-L1의 4개의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, DK-A-222은 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, D61, 및 A113와 상호작용할 수 있다. 일부 구체예에서, DK-A-222은 PD-L1의 5개의 아미노산과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, DK-A-222은 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, A113, M115 및 Y123와 상호작용할 수 있다.
일부 구체예에서, PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 1과 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 2와 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 1과 적어도 85%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 2와 적어도 85%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 2와 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 1과 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 2와 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 1과 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드는 SEQ ID NO.: 2와 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
당 분야에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성 퍼센트"는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 결정된 서열들 사이의 관계이다. 당 분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라, 그러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"과 "유사성"은 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것들을 비제한적으로 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이의 최상의 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 서열 정렬 및 동일성 퍼센트 계산은 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 스위트(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)의 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 페어와이즈 정렬을 위한 기본 파라미터를 포함하여, Clustal 정렬 방법(Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153)을 사용하여 기본 파라미터로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산" 및 "잔기"는 상호교환 가능하고, 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 자연 발생 아미노산 및 합성 아미노산 둘 모두 뿐만 아니라 아미노산 유사체, 아미노산 모방체 및 자연 발생 아미노산과 화학적으로 유사한 비-자연 발생 아미노산을 지칭한다.
용어 "자연 발생 아미노산" 및 "자연적으로 인코딩된 아미노산"은 상호교환적으로 사용되고, 유전 암호에 의해 인코딩된 아미노산 뿐만 아니라 합성 후 변형된 유전 암호에 의해 인코딩된 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린을 지칭한다.
"아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 또는 메티오닌 메틸 설포늄이다. 상기 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가질 수 있지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지할 것이다.
용어 "비-자연 발생 아미노산" 및 "비-자연적으로 인코딩된 아미노산"은 상호교환적으로 사용되고, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖지만 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 사슬 내에 혼입되지 않는 화합물을 지칭한다. "비-자연 발생 아미노산"은 또한 자연적으로 인코딩된 아미노산(비제한적으로 20개의 공통 아미노산 포함)의 변형(예를 들어, 번역 후 변형)에 의해 발생하지만 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 사슬 내에 자신들이 자연적으로 혼입되지 않는 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드 서열 내에 삽입되거나 폴리펩티드 서열에서 야생형 잔기 대신 치환될 수 있는 비-자연 발생 아미노산의 비제한적인 예의 목록은 β-아미노산, 호모아미노산, 사이클릭 아미노산 및 유도체화된 측쇄를 지닌 아미노산을 포함한다. 예로는 (L-형태 또는 D-형태의; 괄호 안은 약어임): 시트룰린(Cit), 호모시트룰린(hCit), Nα-메틸시트룰린(NMcCit), Nα-메틸호모시트룰린(Nα-MeHoCit), 오르니틴(Orn), Nα-메틸오르니틴(Nα-MeOrn 또는 NMeOrn), 사르코신(Sar), 호모리신(hLys 또는 hK), 호모아르기닌(hArg 또는 hR), 호모글루타민(hQ), Nα-메틸아르기닌(NMeR), Nα-메틸류신(Nα-MeL 또는 NMeL), N-메틸호모리신(NMeHoK), Nα-메틸글루타민(NMeQ), 노르류신(Nle), 노르발린(Nva), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린(Tic), 옥타하이드로인돌-2-카르복실산(Oic), 3-(1-나프틸)알라닌 (1-Nal), 3-(2-나프틸)알라닌(2-Nal), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린(Tic), 2-인다닐글리신(IgI), 파라-아이오도페닐알라닌(pI-Phe), 파라-아미노페닐알라닌(4AmP 또는 4-Amino-Phe), 4-구아니디노 페닐알라닌(Guf), 글리실리신(약어 "K(Nε-glycyl)" 또는 "K(glycyl)" 또는 "K(gly)"), 니트로페닐알라닌(nitrophe), 아미노페닐알라닌(aminophe 또는 Amino-Phe), 벤질페닐알라닌(benzylphe), γ-카르복시글루탐산(γ-carboxyglu), 하이드록시프롤린(hydroxypro), p-카르복실-페닐알라닌(Cpa), α-아미노아디프산(Aad), Nα-메틸 발린(NMeVal), Nα-메틸 류신(NMeLeu), Nα-메틸노르류신 (NMeNle), 사이클로펜틸글리신(Cpg), 사이클로헥실글리신(Chg), 아세틸아르기닌(acetylarg), α,β-디아미노프로피온산(Dpr), α,γ-디아미노부티르산(Dab), 디아미노프로피온산(Dap), 사이클로헥실알라닌(Cha), 4-메틸-페닐알라닌(MePhe), β,β-디페닐-알라닌(BiPhA), 아미노부티르산(Abu), 4-페닐-페닐알라닌(또는 바이페닐알라닌; 4Bip), α-아미노-이소부티르산(Aib), 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프리오산, 아미노헵탄산, 아미노피멜산, 데스모신(desmosine), 디아미노피멜산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 4-하이드록시프롤린(Hyp). γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, €-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, ω-메틸아르기닌, 4-아미노-O-프탈산(4APA), N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코실아미닐-L-트레오닌, O-포스포티로신 및 다른 유사한 아미노산, 및 구체적으로 열거된 것 중 어느 것의 유도체화된 형태를 포함한다.
"펩티드" 또는 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 3개의 아미노산의 스트링을 포함한다. 용어 "단백질" 및 "펩티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 펩티드는 개별 펩티드 또는 펩티드의 집합을 지칭할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 영상화 제제 내의 아미노산 중 하나 이상은, 예를 들어, 화학적 존재물, 예를 들어, 탄수화물 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 설폭사이드 기, 지방산 기, 컨쥬게이션, 기능화, 또는 다른 변형을 위한 링커의 첨가 등에 의해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 다른 변형은 D-아미노산, N-말단 및 C-말단에 컨쥬게이션된 다른 분자, 형광 프로브의 컨쥬게이션, 생체분자, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜), 표적화 리간드 등, 레트로-역전(retro-inversion) 등의 혼입을 포함할 수 있다. 어떠한 변형도 펩티드의 요망되는 생물학적 활성을 실질적으로 방해해서는 안된다.
본원에 개시된 영상화 제제의 일부 구체예에서, 보고 모이어티는 킬레이팅제, 방사선표지된 기질, 형광 염료, 광음향 보고 분자, 및 Raman-활성 보고 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 영상화 제제의 일부 구체예에서, 보고 모이어티는 킬레이팅제이고 킬레이팅제는 DOTAGA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데세칸,1-(글루타르산)-4,7,10-트리아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTASA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-(2-석신산)-4,7,10-트리아세트산), CB-DO2A(10-비스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자바이사이클로[5.5.2]테트라데칸), DEPA(7-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-4,10-비스-카르복시메틸-1,4,7,10-테트라아자-사이클로도덱-1-일-아세트산)), 3p-C-DEPA(2-[(카르복시메틸)][5-(4-니트로페닐-1-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]펜탄-2-일)아미노]아세트산)), TCMC(2-(4-이소티오시아노토벤질)-1,4,7,10-테트라아자-1,4,7,10-테트라-(2-카르바모닐 메틸)-사이클로도데칸), 옥소-DO3A(1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-5-S-(4-이소티오시아나토벤질)-4,7,10-트리아세트산), p-NH2-Bn-옥소-DO3A(1-옥사-4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-5-S-(4-아미노벤질)-4,7,10-트리아세트산), TE2A((1,8-N,N'-비스-(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸), MM-TE2A, DM-TE2A, CB-TE2A(4,11-비스(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸), CB-TE1A1P(4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1-(메탄포스폰산)-8-(메탄카르복실산), CB-TE2P(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,8-비스(메탄포스폰산), TETA(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), NOTA(1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산), NODA(1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세테이트); NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산), (NOTAGA) 1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산 DFO(데스페록사민), NETA([4-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-7-카르복시메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일}-아세트산), TACN-TM(N,N',N", 트리스(2-메르캅토에틸)-1,4,7-트리아자사이클로노난), Diamsar(1,8-디아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로(6,6,6)에이코산, 3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민), Sarar(1-N-(4-아미노벤질)-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6] 에이코산-1,8-디아민), AmBaSar(4-((8-아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로 [6.6.6] 이코산-1-일아미노) 메틸) 벤조산), 및 BaBaSar로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 펩티드, 링커, 보고 컨쥬게이트는 클릭 화학(click chemistry)을 통해 제조된다. 예를 들어, 2017년 2월 16일 공개된 Triazole Conjugated Ureas, Thioureas, Carbamates, and "Reversed" Carbamates for PSMA-Targeted Imaging Agents and Uses Thereof에 대한 Pomper 등의 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2017/027870호 및 2014년 11월 20일 공개된 Homomultivalent and Heteromultivalent Inhibitors of Prostate Specific Membrane Antigen (Pmsa) and Uses Thereof에 대한 Pomper 등의 U.S. 특허 출원 공개 번호 20140341804호를 참조하며, 이들 각각은 전문이 참조로서 포함된다.
특정 구체예에서, 킬레이팅제는 하기로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00003
Figure pct00004
또한 더욱 특정한 구체예에서, 보고 모이어티는 킬레이팅제이고 킬레이팅제는 94mTc, 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 55Co, 57Co, 47Sc, 225Ac, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 153Sm, 166Ho, 152Gd, 82Rb, 89Zr, 및 166Dy로 구성된 군으로부터 선택된 방사선금속을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 영상화 제제의 다른 구체예에서, 보고 모이어티는 방사선표지된 기질이고 방사선표지된 기질은 11C, 13N, 15O, 123I, 124I, 125I, 126I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br, 80Br, 80mBr, 82Br, 83Br, 및 211At로 구성된 군으로부터 선택된 방사성동위원소를 포함한다.
특정 구체예에서, 방사선표지된 기질은 18F-표지된 기질을 포함한다. 또한 더욱 특정한 구체예에서, 18F-표지된 기질은 2-플루오로-PABA, 3-플루오로-PABA, 2-플루오로-만니톨, 및 N-석신이미딜-4-플루오로벤조에이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 기질은, 예를 들어, NOTA, NODA, 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 킬레이터에 의한 알루미늄 플루오라이드의 킬레이션에 기반하여, AlF 방법을 사용하여 18F로 표지된다. 예를 들어, 문헌[Liu S., et al., "One-step radiosynthesis of 18F-AlF-NOTA-RGD2 for tumor angiogenisis PET imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2011, 38(9):1732-41; McBride W.J., et al., "A novel method of 18F radiolabeling for PET. J Nucl Med. 2009;50:991-998; McBride W.J, D'Souza CA, Sharkey RM, Sharkey RM, Karacay H, Rossi EA, Chang C-H, Goldenberg DM. Improved 18F labeling of peptides with a fluoride-aluminum-chelate complex. Bioconjug Chem. 2010;21:1331-1340]을 참조한다.
본원에 개시된 영상화 제제의 다른 구체예에서, 보고 모이어티는 형광 염료이고 형광 염료는 카르보시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 튜이(thui)카르보시아닌, 메로시아닌, 폴리메틴, 쿠마린, 로다민, 크산텐, 플루오레세인, 보론-디피로메탄(BODIPY) 염료, 또는 이의 유도체, 예를 들어, 비제한적으로 BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TR, BODIPY TMR, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, 및 BODIPY 650/665, Cy5, Cy5.5, Cy7, VivoTag-680, VivoTag-S680, VivoTag-S750, AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor700, AlexaFluor750, AlexaFluor790, Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, Dy780, DyLight547, Dylight647, HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 680, HiLyte Fluor 750, IR800(디메틸{4-[1,5,5-트리스(4-디메틸아미노페닐)-2,4-펜타디에닐리덴]-2,5-사이클로헥사디엔-1-일리덴}암모늄 퍼클로레이트), IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 700DX, ADS780WS, ADS830WS, 및 ADS832WS로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 영상화 제제의 다른 구체예에서, 보고 모이어티는 광음향 보고 분자이고 광음향 보고 분자는 염료 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 염료는 형광 염료를 포함한다. 또한 더욱 특정한 구체예에서, 형광 염료는 인도시아닌-그린(ICG), Alexa Fluor 750, Evans Blue, BHQ3, QXL680, IRDye880CW, MMPSense 680, 메틸렌 블루, PPCy-C8, 및 Cypate-C18로 구성된 군으로부터 선택된다. 문헌[Wu et al., Int. J. Mol. Sci., 15, 23616-23639 (2014)] 참조.
다른 구체예에서, 나노입자는 플라스몬 나노입자, 예를 들어, 비제한적으로 금 나노구체(nanosphere), 금 나노셀(nanoshell), 금 나노로드(nanorod), 금 나노케이지(nanocage), 금 나노스타(nanostar), 및 금 나노클러스터(nanocluster), 퀀텀닷, 나노다이아몬드, 폴리피롤 나노입자, 구리 설파이드 나노입자, 그래핀 나노시트, 산화철-금 코어-셀 나노입자, Gd2O3 나노입자, 단일벽 카본 나노튜브, 염료-부하 퍼플루오로카본 나노입자, 및 초상자성 산화철 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 영상화 제제의 다른 구체예에서, 보고 모이어티는 Raman-활성 보고 분자이고 Raman-활성 보고 분자는 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT) 및 표면-강화 Raman 산란(SERS) 제제로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, SERS 제제는 Raman-활성 리포터 분자로 표지된 금속(예를 들어, 금 또는 은) 나노입자를 포함한다. 또한 더욱 특정한 구체예에서, Raman-활성 리포터 분자는 형광 염료를 포함한다. 특정 구체예에서, 형광 염료는 Cy3, Cy5, 로다민, 및 캘코게노피릴륨 염료로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 영상화 제제의 다른 구체예에서, 링커는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a)
Figure pct00005
상기 식에서, Rpt는 보고 모이어티이고; W1은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 사이클로알킬렌, 및 아릴렌으로 구성된 군으로부터 선택되고; W2는 -NR1-(C=O)-, -NR1-(C=S)-, -(C=O)-NR1-, -(C=S)-NR1-, 및 -S-로 구성된 군으로부터 선택되고, 이 때 각각의 R1은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이고; 각각의 R2는 독립적으로 H 또는 -COOR3이고, 이 때 각각의 R3는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C12 아릴 또는 C4-C16 알킬아릴이고; b는 0, 1, 2, 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; d는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; 물결선은 링커와 펩티드 사이의 부착점을 나타낸다;
(b)
Figure pct00006
상기 식에서, Rpt는 보고 모이어티이고; X 및 Z는 각각 독립적으로 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C1-C8 헤테로알킬, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 헤테로알키닐, C1-C8 알콕시, 또는 결합이고, 이들 각각은 0-5개의 RA로 치환될 수 있고; Y 및 W3는 각각 독립적으로 -O-, -S(O)p-, -NH-, -NRB-, -CH=CH-, -CRB=CH-, -CH=CRB-, -NH-CO-, -NH-CO2-, -NRB-CO-, -NRB-CO2-; -CO-NH-, -CO2-NH-, -CO-NRB-, -CO2-NRB-, 또는 결합이고; p는 0, 1, 또는 2이고; RA는, 각 경우에, 할로겐, 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, CO2H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 모노 또는 디알킬아미노, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 알킬설피닐, 선택적으로 치환된 알킬설포닐, 선택적으로 치환된 모노- 또는 디알킬카르복사미드, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고; RB는, 각 경우에, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 모노 또는 디알킬아미노, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 또는
(c) 아미노산 링커.
특정 구체예에서, 영상화 제제는 하기 화학식 (I), 화학식 (II), 및 화학식 (III)로 구성된 군으로부터 선택된 화합물이다:
Figure pct00007
DK-A-221-(L)n-Rpt (II); 또는
DK-A-222-(L)n-Rpt (III);
상기 식에서, n은 0 및 1로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; L은 링커이고; Rpt는 보고 모이어티이다; 상기 보고 모이어티 또는 링커가 존재하는 경우, 이는 화학식 (I), 화학식 (II), 또는 화학식 (III)의 영상화 제제를 포함하는 펩티드의 아미노산의 1차 아민기에 부착된다.
특정 구체예에서, 링커는, 존재하는 경우, 화학식(I)의 화합물의 13오르니틴(Orn) 1차 아민기에 부착된다. 특정 구체예에서, 보고 모이어티는 DOTAGA 킬레이팅제를 포함한다. 또한 더욱 특정한 구체예에서, DOTAGA 킬레이팅제는 64Cu 방사선금속을 추가로 포함한다.
또한 더욱 특정한 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 다음과 같다:
Figure pct00008
당업자는 킬레이팅제/방사선 금속 이온의 다양한 조합이 본원에 개시된 영상화 제제와 함께 사용하기에 적합하다는 것을 본원에 개시된 주제의 검토시에 인지할 것이다. 대표적인 킬레이팅제는 당 분야에 공지되어 있다. 비제한적인 예로서, 특정 킬레이팅제 및 링커는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2015/0246144호 및 2015/0104387호에 개시되어 있고, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구체예에서, 영상화 제제는 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외에서 PD-L1을 검출할 수 있다. 일부 구체예에서, 영상화 제제는 생체 내에서 PD-L1을 검출할 수 있다. PD-L1은 다양한 종양에 의해 발현되며, 이의 과발현은 종양 세포에서 종양 침윤성 세포독성 T-세포에 반응하여 적응 메커니즘으로서 유도된다(Topalian et al., 2016). 당업자는 PD-L1이 변형 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있고 본원에 개시된 영상화 제제에 의해 여전히 검출될 수 있는 한, 본원에 개시된 방법에 여전히 적용 가능할 것임을 인지할 것이다.
일부 구체예에서, PD-L1과 이의 리간드인 프로그램된 세포사멸 단백질 1(PD-1)의 상호작용을 억제하는 본원에 개시된 영상화 제제의 IC50은 약 100 nM 내지 약 1 pM의 범위를 갖는다. 일부 구체예에서, IC50은 100 nM 미만, 다른 구체예에서, 10 nM 미만, 다른 구체예에서, 8 nM 미만, 다른 구체예에서, 5 nM 미만, 다른 구체예에서, 4 nM 미만, 및 다른 구체예에서, 3 nM 미만이다.
용어 "결합 친화도"는 2개 이상의 화합물이 비공유적 관계로 서로 얼마나 강하게 결합하는지를 나타내는 특성이다. 결합 친화도는 정성적으로(예를 들어, "강", "약", "높음" 또는 "낮음") 또는 정량적으로(예를 들어, Kd 측정) 특성화될 수 있다.
II. 영상화 제제를 사용한 검출 방법
일부 구체예에서, 본원에 개시된 주제는 PD-L1과 같은 면역 체크포인트 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 주제는 암, 염증, 감염 등과 같이 PD-L1의 과발현을 초래하는 질병, 장애, 또는 질환을 검출하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 주제는 (a) 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 유효량의 영상화 제제를 제공하는 단계로서, 바로 위에 기술된 대로, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 펩티드 및 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 보고 모이어티는 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 펩티드에 직접 부착되는, 단계; (b) 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화 제제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 이미지를 생성하여 PD-L1을 검출하는 단계를 포함하는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 영상화 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "영상화" 또는 "이미지 생성"은 화합물에 의해 방출된 에너지를 측정함으로써 검출 가능한 화합물을 가시화하는 임의의 영상화 기술의 사용을 지칭한다. 일부 구체예에서, 용어 "영상화"는 투여 후 화합물의 국소화 후에 화합물에 의해 방출된 에너지를 측정함으로써 대상체에 투여한 후 검출 가능한 화합물을 가시화하는 임의의 영상화 기술의 사용을 지칭한다. 일부 구체예에서, 영상화 기술은 대상체에 대해 외부에서 검출될 수 있는 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이미지는 대상체의 다양한 위치에 축적되는 영상화 제제의 공간 분포의 차이에 의해 생성된다. 일부 구체예에서, 영상화 제제의 투여는 주사에 의해 발생한다.
용어 "영상화 제제"는, 예를 들어, 양전자 방출 단층촬영(PET)에 의해 영상화될 수 있는 화합물을 포함하도록 의도된다. 본원에서 사용되는 "양전자 방출 단층촬영 영상화" 또는 "PET"는 모든 양전자 방출 단층촬영 영상화 시스템 또는 동등물 및 양전자 방출 단층촬영 영상화가 가능한 모든 장치를 포함한다. 본원에 개시된 주제의 방법은 임의의 그러한 장치, 또는 PET 장치 또는 동등물의 변형을 사용하거나, 임의의 공지된 PET 방법과 함께 실시될 수 있다. 예를 들어, 각각이 본원에 참조로서 포함되는 U.S. 특허 번호 6,151,377호; 6,072,177호; 5,900,636호; 5,608,221호; 5,532,489호; 5,272,343호; 5,103,098호 참조. 동물 영상화 양식, 예를 들어, 마이크로-PET(Corcorde Microsystems, Inc.)이 포함된다.
보고 모이어티에 따라, 본원에 개시된 영상화 제제는 PET, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 근적외선(형광), 광음향, 및 Raman 영상화에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 영상화는 검출 시스템을 사용하여 전체 대상체 또는 환자, 또는 대상체 또는 환자의 특정 영역을 스캔하고, 신호를 검출하는 것을 포함한다. 이후 검출된 신호는 이미지로 변환된다. 생성된 이미지는, 예를 들어, 의사와 같은 숙련된 관찰자에 의해 판독되어야 한다. 일반적으로, 영상화는 영상화 제제를 투여한지 약 1분 내지 약 48시간 후에 수행된다. 영상화의 정확한 타이밍은 당업자에게 쉽게 명백한 바와 같이, 투여된 화합물의 제거율과 같은 인자에 좌우될 것이다. 영상화의 시간 프레임은 사용되는 방사성뉴클레오티드에 기반하여 달라질 수 있다. 특정 구체예에서, 영상화는 투여 후 약 1분 내지 약 4시간, 예를 들어, 15분 내지 30분, 30분 내지 45분, 45분 내지 60분, 60분 내지 90분, 및 60분 내지 120분 사이에 수행된다. 일부 구체예에서, PD-L1의 검출은 대상체에게 영상화 제제를 투여한지 약 60분이 되자마자 일어난다. 일부 구체예에서, 영상화는 Zr-89로 표지된 펩티드를 주사한지 24시간 후에 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 영상화는 I-124로 표지된 펩티드를 주사한지 24시간 후에 수행될 수 있다.
일단 이미지가 획득되면, 당업자는 화합물의 위치를 결정할 수 있다. 이 정보를 사용하여, 기술자는, 예를 들어, 감염, 염증 또는 암과 같은 질환이 존재하는지 여부, 질환의 정도, 또는 대상체에서 진행 중인 치료의 효능을 결정할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 또는 조직을 영상화 제제와 접촉시키는 것은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행된다. "접촉"은 본원에 개시된 주제의 적어도 하나의 영상화 제제를 적어도 하나의 세포 또는 조직과 물리적으로 접촉시키는 임의의 조치를 의미한다. 따라서 이것은 적어도 하나의 영상화 제제와 적어도 하나의 세포 또는 조직의 접촉을 발생시키기에 충분한 양의 영상화 제제에 세포(들) 또는 조직(들)을 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 조절된 환경, 예를 들어, 배양 접시 또는 튜브에서 영상화 제제 및 세포들 또는 조직들을 도입시키고, 바람직하게는 혼합시킴으로써 시험관 내 또는 생체 외에서 실시될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 생체 내에서 실시될 수 있으며, 이러한 경우 접촉은 임의의 적합한 경로를 통해 대상체에게 영상화 제제를 투여하는 것과 같이 본원에 개시된 주제의 적어도 하나의 영상화 제제에 대상체의 적어도 하나의 세포 또는 조직을 노출시키는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 세포 또는 조직을 영상화 제제와 접촉시키는 것은 대상체에서 수행된다.
용어 영상화 제제의 "유효량"은 본원에 기재된 기술, 예를 들어, 양전자 방출 단층촬영(PET)을 사용하여 영상화할 때 판독 가능한 신호를 제공하기 위해 필요하거나 충분한 양이다. 유효량은 대상체의 크기 및 중량, 질병 유형, 또는 특정 화합물과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 화합물의 선택은 "유효량"을 구성하는 것에 영향을 줄 수 있다. 당업자는 본원에 포함된 인자를 연구하고 과도한 실험 없이 화합물의 유효량에 관한 결정을 내릴 수 있을 것이다.
많은 구체예에서 본원에 개시된 방법에 의해 진단되거나 치료되는 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이나, 본원에 기재된 방법은 용어 "대상체"에 포함되는 것으로 의도되는 모든 척추동물 종에 대하여 효과적인 것이 이해되어야 한다. 따라서, "대상체"는 존재하는 질병, 장애, 또는 질환의 진단 또는 치료를 위한 것과 같은 의학적 목적을 위한 인간 대상체, 또는 의학적, 수의학적 목적, 또는 개발 목적을 위한 동물 대상체를 포함할 수 있다. 적합한 동물 대상체는 영장류, 예를 들어, 인간, 원숭이, 유인원, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 마카크 등; 소과, 예를 들어, 소, 황소 등; 양과, 예를 들어, 양 등; 염소과, 예를 들어, 염소 등; 돼지과, 예를 들어, 돼지, 호그(hog) 등; 말과, 예를 들어, 말, 당나귀, 얼룩말 등; 고양이과, 예를 들어, 야생 및 애완 고양이; 개과, 예를 들어, 개; 토끼과, 예를 들어, 토끼, 야토 등; 및 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 포유동물을 포함한다. 동물은 트랜스제닉 동물일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년, 및 성인 대상체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 인간이다. 또한, "대상체"는 질병, 장애, 또는 질환에 걸렸거나, 걸린 것으로 의심되는 환자를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 또한 동물 질병 모델(예를 들어, 실험에 사용된 래트 또는 마우스 등)을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간, 래트, 마우스, 고양이, 개, 말, 양, 소, 원숭이, 조류, 또는 양서류이다.
일반적으로, 본원에 개시된 영상화 제제는 경구, 경비, 경피, 안구, 직장, 질내, 또는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근내, 피하, 척수내 주사 뿐만 아니라 경막내, 직접 뇌실내, 관절내, 흉골내, 활막내, 간내, 병변내, 두개내, 복강내, 비내, 또는 안내 주사, 수조내, 국소, 분말, 연고 또는 점적(점안제 포함)에 의해, 예를 들어, 협측 및 설하, 경피, 흡입 스프레이를 통해, 또는 당 분야에 공지된 다른 전달 방법을 포함하는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 질병, 장애, 또는 질환을 검출하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "전신 투여", "전신적으로 투여", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여"는 조성물이 대상체 또는 환자의 시스템에 들어가서 대사 및 다른 유사한 과정을 겪도록 하는 조성물의 투여, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 투여를 의미한다.
본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 일반적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방법을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근내, 동맥내, 척수내, 수정체낭내, 안와내, 안내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피부밑, 관절내, 낭하, 거미막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
일부 구체예에서, 영상화 제제는 적어도 3:1의 표적 대 비-표적 비를 나타낸다. 일부 구체예에서, 용어 "표적"은 PD-L1 단백질의 과발현을 나타내는 세포 또는 조직을 지칭하고 용어 "비-표적"은 PD-L1 단백질의 과발현을 나타내지 않는 세포 또는 조직을 지칭한다.
일부 구체예예에서, 영상화 방법은 암을 검출하는데 사용된다. 대상체 또는 환자의 "암"은 암을 유발하는 세포의 전형적 특징, 예를 들어, 조절되지 않는 증식, 특화된 기능의 상실, 불멸, 유의한 전이 잠재성, 항-아폽토시스 활성의 유의한 증가, 신속한 성장 및 증식 속도, 및 특정한 특징적인 형태 및 세포 마커를 갖는 세포의 존재를 나타낸다. 일부 상황에서, 암 세포는 종양의 형태일 것이며; 그러한 세포는 동물 내에서 국소적으로 존재하거나, 독립적 세포, 예를 들어, 백혈병 세포로서 혈류에서 순환할 수 있다. 본원에서 사용되는 암은 모세포종, 암종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 및 육종을 비제한적으로 포함하는 새롭게 진단된 암 또는 재발성 암을 포함한다. 본원에서 사용되는 암은 비제한적으로 두부암, 경부암, 두경부암, 폐암, 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암, 전립선암, 결장직장암, 식도암, 위암, 백혈병/림프종, 자궁암, 피부암, 내분비암, 요도암, 췌장암, 위장암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 뇌암, 및 선종을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 0 단계 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 1 단계 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 II 단계 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 III 단계 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 IV 단계 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 난치성 및/또는 전이성 암이다.
본원에서 사용되는 "종양"은 악성 또는 양성 여부에 상관없이 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "고형 종양"은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 비제한적인 예로서 뇌, 결장, 유방, 전립선, 간, 신장, 폐, 식도, 두경부, 난소, 자궁경부, 위, 결장, 직장, 방광, 자궁, 고환, 및 췌장에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 영상화 방법은 고형 종양을 검출하는데 사용된다. 또한 다른 구체예에서, 영상화 방법은 전이성 암을 검출하는데 사용된다.
일부 구체예에서, 영상화 방법은 감염을 검출하는데 사용된다. 임의의 진균 또는 박테리아에 의한 감염과 같은 감염성 질병은 본원에 개시된 주제를 사용하여 검출하기 위해 고려된다. 본원에서 사용되는 용어 "감염"은 질병-유발 유기체에 의한 숙주 생물체의 신체 조직의 침입, 이들의 증식, 및 이들 유기체 및 이들이 생산하는 독소에 대한 숙주 조직의 반응을 지칭한다. 감염은 비제한적으로 원내감염, 수술 감염, 및 심한 복부 감염, 예를 들어, 복막염, 췌장염, 담낭 농흉, 및 흉막 농흉, 및 골수염과 같은 뼈 감염을 포함한다. 패혈증, 패혈증과 패혈 쇼크, 면역-억제제 약물, 암 화학요법, 방사선, 오염된 i.v. 유체의 사용으로 인한 또는 그 후의 감염, 출혈성 쇼크, 허혈, 외상, 암, 면역-결핍, 바이러스 감염, 및 당뇨병의 검출도 고려된다. 미생물 감염, 예를 들어, 박테리아 및/또는 진균 감염의 예는 비제한적으로 마이코박테리움 투베르쿨로리스(Mycobacterium tuberculosis), E. 콜리(E. coli), 클렙시엘라 종(Klebsiella sp.), 엔테로박터 종(Enterobacter sp.), 프로테우스 종(Proteus sp.), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스태필로코쿠스 종(Staphylococcus spp.), 예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus) 및 coag.-음성 스태필로코쿠스, 엔테로코쿠스 종(Enterococcus sp.), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 박테로이데스 종(Bacteroides spp.), 아시네토박터 종(Acinetobacter spp.), 헬리코박터 종(Helicobacter spp.), 캔디다 종(Candida sp.) 등으로 인한 감염을 포함한다. 내성 미생물, 예를 들어, 메티실린-내성 스태필로코쿠스 아우레우스(MRSA) 및 반코마이신-내성 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)(VRE)로 인한 감염이 포함된다. 일부 구체예에서, 감염은 박테리아 감염이다. 일부 구체예에서, 감염은 만성 박테리아 감염이다. 일부 구체예에서, 박테리아 감염은 결핵이다. 일부 구체예에서, 감염은 파종 결핵이다. 일부 구체예에서, 감염은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 및/또는 인간 면역결핍 바이러스일 수 있다.
일부 구체예에서, 영상화 방법은 염증을 검출하는데 사용된다. 염증과 관련된 장애의 예는 비제한적으로 천식, 자가면역 질환, 자가염증성 질환, 셀리악병, 게실염, 사구체신염, 화농 땀샘염, 과민증, 염증성 장 질환, 간질성 방광염, 이염, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 이식 거부, 루푸스, 예를 들어, 전신홍반루푸스, 및 혈관염을 포함한다. 일부 구체예에서, 염증은 류마티스 관절염 또는 전신홍반루푸스에 의해 초래된다.
PD-L1은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 골수 세포에서 발견되는 이의 수용체인 PD-1에 결합하여, 활성화 또는 억제를 조절한다. 따라서, PD-L1 발현을 검출하는 본원에 개시된 영상화 제제는 T 세포, B 세포, 및 골수 세포와 같은 면역 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 영상화 제제는 종양에서 면역 세포를 검출한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 영상화 제제는 대상체에서 면역 세포의 분포를 전신적으로 검출한다. 일부 구체예에서, 영상화 방법은 감염성 세포에서 면역 세포 반응을 검출하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 영상화 방법은 염증 세포에서 면역 세포 반응을 검출하는데 사용된다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 영상화 방법은 PD-L1 발현의 치료-유도된 변화와 같은 PD-L1 발현의 변화를 검출 및/또는 측정한다. 상기 방법을 사용하여 특정 치료 방법의 효능을 확인하고/거나 유효 치료 투여량 범위를 결정할 수 있다.
III. 영상화 제제를 포함하는 키트
일부 구체예에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)를 검출하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 영상화 제제를 포함하고, 상기 기술된 대로, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 펩티드 및 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 보고 모이어티는 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 펩티드에 직접 부착된다.
통상적으로, 본원에 개시된 주제의 키트는 본원에 개시된 영상화 제제 및 적어도 하나의 본원에 개시된 방법을 수행하는 방법에 대한 설명서를 포함한다. 영상화 제제는 일반적으로 적어도 한 명의 대상체 또는 환자에서 PD-L1을 적어도 1회 검출하기에 충분한 양으로 키트에 공급된다. 키트는 또한 본원에 개시된 방법의 적어도 하나의 구체예를 수행하는데 필요한 다른 시약들 및 공급물 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
이의 가장 간단한 형태에서, 본원에 개시된 주제에 따른 키트는 본원에 개시된 주제에 따른 적어도 한 유형의 영상화 제제를 함유하는 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 다수의 용기를 포함하고, 각각은 적어도 하나의 영상화 제제 또는 본원에 개시된 방법의 하나 이상의 구체예를 수행하는데 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.
용기는 본원에 개시된 조성물 또는 본원에 개시된 방법을 수행하는데 유용한 다른 물질을 함유하기에 적합한 임의의 물질일 수 있다. 따라서, 용기는 바이알 또는 앰풀일 수 있다. 이것은 유리, 플라스틱, 금속, 또는 종이 또는 종이 제품과 같은 임의의 적합한 물질로 제작될 수 있다. 구체예들에서, 이것은, 예를 들어, 마개, 마개와 크림프 밀봉, 또는 플라스틱 또는 금속 캡에 의해 밀봉될 수 있는 유리 또는 플라스틱 앰플 또는 바이알이다. 용기에 함유된 영상화 제제의 양은 본원에 개시된 주제에 따라 적절한 다수의 파라미터에 기반하여 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
구체예들에서, 용기는 통상적으로 패키징 물질을 포함하는 더 큰 유닛(이하 간단하게 하기 위해 키트로서 지칭됨)의 구성요소로서 제공된다. 본원에 개시된 키트는 적합한 패키징 및 설명서 및/또는 조성물의 사용과 관련된 다른 정보를 포함할 수 있다. 통상적으로, 키트는 카드보드 및 플라스틱과 같은 견고한 물질로 제작되며, 설명서 또는 그 위에 직접 인쇄된 다른 정보를 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 조성물을 함유하는 다수의 용기를 포함할 수 있다. 상기 키트에서, 각각의 용기는 서로의 용기와 동일한 크기일 수 있고, 동일한 양의 조성물을 함유할 수 있거나, 상이한 용기는 상이한 크기일 수 있고/있거나 상이한 양의 조성물 또는 상이한 성분을 갖는 조성물을 함유할 수 있다. 당업자는 본 발명에 의해 용기 크기 및 내용물의 수많은 상이한 구성이 구현됨을 즉시 인지할 것이므로, 모든 순열이 본원에 구체적으로 인용될 필요는 없다.
본원에서 특정 용어가 이용되었으나, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며, 제한의 목적이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원에 기재된 주제가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
장기간의 지속된 특허법 협약에 따라, 단수 용어는 청구항을 포함하여 본 출원에서 사용되는 경우 "하나 이상"을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, "대상체"에 대한 언급은 문맥이 명백히 반대하지 않는 한 복수의 대상체(예를 들어, 복수의 대상체들)를 포함하며, 그 밖의 것도 마찬가지이다.
본 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐, 용어 "~들을 포함하다", "~을 포함하다" 및 "포함하는"은 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고는 배타적이지 않은 의미로 사용된다. 마찬가지로, 용어 "포함하다" 및 이의 문법적 변형은 비제한적인 것으로 의도되어, 목록 내의 항목의 언급은 대체될 수 있거나 나열된 항목에 추가될 수 있는 다른 유사한 항목의 배제가 아니다.
본 명세서 및 첨부된 청구항의 목적을 위해, 달리 명시하지 않는 한, 양, 크기, 치수, 비율, 형태, 제형, 파라미터, 백분율, 파라미터, 양, 특징을 표현하는 모든 수, 및 본 명세서 및 청구항에서 사용되는 다른 수치적 값은 용어 "약"이 값, 양 또는 범위와 함께 명시적으로 나타나지 않을지라도 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 표시하지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구항에 기재된 수치적 파라미터는 정확하지 않고, 정확활 필요도 없으며, 근사치이고/이거나 요망시 더 크거나 작으며, 이는 본원에 개시된 주제에 의해 획득하고자 하는 요망되는 특성에 따라 허용오차, 변환 인자, 반올림, 측정 오차 등, 및 당업자에게 공지된 다른 요인을 반영한다. 예를 들어, 값을 언급하는 경우의 용어 "약"은 명시된 양으로부터, 일부 구체예에서, ± 100%, 일부 구체예에서, ± 50%, 일부 구체예에서, ± 20%, 일부 구체예에서, ± 10%, 일부 구체예에서, ± 5%, 일부 구체예에서, ±1%, 일부 구체예에서, ± 0.5%, 및 일부 구체예에서, ± 0.1%의 변화를 포함하는 것을 의미할 수 있는데, 이는 상기 변화가 개시된 방법을 수행하거나 개시된 조성물을 이용하는데 적절하기 때문이다.
또한, 하나 이상의 수 또는 수치적 범위와 함께 사용되는 경우의 용어 "약"은 범위 내의 모든 수를 포함하는 모든 상기 수를 나타내는 것으로 이해되어야 하며, 기재된 수치 값 위 및 아래의 경계를 연장함으로써 상기 범위를 변형시킨다. 종말점에 의한 수치적 범위의 언급은 상기 범위 내에 포함된 모든 수, 예를 들어, 전체 정수, 예를 들어, 이의 분수(예를 들어, 1 내지 5의 언급은 1, 2, 3, 4, 및 5, 뿐만 아니라 이의 분수, 예를 들어, 1.5, 2.25, 3.75, 4.1 등을 포함함) 및 상기 범위 내의 임의의 범위를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 주제의 대표적인 구체예를 실시하기 위해 당업자에게 지침을 제공하기 위해 포함되었다. 본 개시내용 및 당 분야의 일반적인 기술 수준에 비추어, 당업자는 하기 실시예가 단지 예시적인 것으로 의도되며, 본원에 개시된 주제의 범위를 벗어남이 없이 다수의 변화, 변형, 및 변경이 적용될 수 있음을 인지할 것이다. 후속되는 합성 설명 및 특정 실시예는 단지 예시의 목적으로 의도되며, 다른 방법에 의한 본 개시내용의 화합물을 제조하는 임의의 방식을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1
고도로 특이적인 펩티드를 사용한 PET로 신속한 종양 PD-L1 검출
1.1 배경. 종양 미세환경(TME)에서 증가된 PD-L1은 활성 면역 침윤물에 의해 발현되는 프로그램된 세포사멸 단백질 1(PD-1) 수용체에 대한 결합을 통해 면역 침윤물의 불활성화에 의한 면역억제를 일으킨다(Okazaki et al., 2007, and Topalian et al., 2015). 종양 세포 및 TME에서의 PD-L1 발현은 환자 계층화 및 치료 모니터링을 위한 잠재적인 바이오마커로 간주된다(Herbst et al., 2014). PD-L1 IHC에 기반한 보완적인 진단 검사는 최근에 미국 식품의약청(FDA)에 의해 승인되었고, 이는 PD-L1이 생체 내 영상화에 적합한 표적일 수 있음을 시사한다(Roach et al., 2016).
현재, 면역조직화학(IHC) 검출은 PD-L1/PD-1 표적화 요법의 치료 모니터링을 위한 가장 잘 연구된 예측 바이오마커이지만, 이 접근법 및 PD-L1에 대한 이의 이용 가능한 FDA-승인된 진단 IHC 검사는 일관성 없는 항원-양성의 정의, 불일치 검출 항체, 불충분한 검정-내 합의, 및 정확도 및 신뢰도를 저해하는 종양내 및 종양간 이질성, 및 이에 따른 치료적인 의사-결정에 의해 방해 받는, 상당한 한계를 갖는다(Roach et al., 2016; Mansfield and Dong, 2016; and Phillips et al., 2015). 또한, 검사를 위해 생검으로 얻은 조직 샘플은 통상적으로 매우 제한적이고, 다른 경로에서 민감성 또는 기존 요법에 대한 내성을 부여하는 표적화 가능한 종양발생 돌연변이(예를 들어, 상피 세포 성장 인자 수용체(EGFR), 역형성 림프종 키나제, DNA 복구 유전자)를 확인하기 위한 분자 프로파일링에 요구될 수 있다. 그러한 귀중한 샘플은 PD-L1 발현의 신뢰할만한 표현을 위해 다수의 PD-L1 평가를 수행하는 것을 종종 비실용적으로 만든다. PD-L1 발현 수준, 동역학 및 분포를 비침습적으로 평가할 수 있고 투여 60분 이내인 표준 임상 영상화 작업 흐름 내에 그렇게 할 수 있는 신규한 PET 영상화 제제는 PD-L1 발현 상태를 평가하기 위해 이용 가능한(IHC-기반) 방법의 단점을 극복할 것으로 기대된다.
종양 면역 미세환경의 동적 특성은 TME의 신속한 평가를 허용하는 PET 추적자의 개발에 대한 이론적 근거를 제공한다. 이와 관련하여, 저 분자량, 펩티드-기반 PET 추적자는 이들의 신속한 제거율 및 합성 용이성으로 인해 임상 적용에 바람직한 후보이다(Reubi et al., 2008; Sun et al., 2016). 소마토스타틴 수용체 및 케모카인 수용체 4(CXCR4)를 표적화하는 펩티드-기반 PET 추적자는 환자에서 높은 표적-대-비-표적 비를 생성한다(Herrmann et al., 2016; Gourni et al., 2011).
최근에, PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩티드가 보고되었다(International PCT patent application publication no. WO2016039749 to Miller, et al., for Macrocyclic Inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80 (B7-1)/PD-L1 Protein/Protein Interactions, published March 17, 2016; International PCT patent application publication no. WO 2016/100285 to Mapelli, et al., for Immunomodulators, published June 23, 2016; International PCT patent application publication no. WO 2016/100608 to Sun, et al. for Immunomodulators, published June 23, 2016; International PCT patent application publication no. WO 2016/126646 to Miller et al., for Immunomodulators, published August 11, 2016 참고, 각각은 전문이 본원에 포함됨); 그러나, 생체 내에서 PD-L1 발현을 검출하는 이들의 잠재력은 입증되지 않았다. 이들 PD-L1 결합 펩티드는 종양에서 PD-L1 발현을 신속하고 높은 특이성으로 검출할 잠재력이 있다는 가설을 세웠다. 이 가설을 시험하기 위해, 보고된 펩티드 라이브러리로부터 컨쥬게이션에 가장 적합하고 단일 1차 아민을 보유하는 펩티드 WL12를 선택하고 PD-L1에 대한 이의 결합 방식을 평가하였다. DOTAGA 킬레이터를 64Cu로 방사선표지하기 위해 WL12에 컨쥬게이션시켜 [64Cu]WL12를 생성하고(Eisenwiener et al., 2000), PD-L1에 대한 펩티드 유도체의 결합 친화도를 평가하고, 가변적인 PD-L1 발현을 갖는 세포주에서 [64Cu]WL12의 시험관 내 흡수를 결정하였다. 개념 증명으로서, PET 영상화에 의해 [64Cu]WL12가 생체 내 PD-L1 발현을 검출하는 능력을 항시적 인간 PD-L1 발현(hPD-L1)을 갖는 중국 햄스터 난소(CHO) 종양 및 동계 음성 대조군 종양(CHO)을 갖는 NSG 마우스에서 평가하였다. [64Cu]WL12의 조직 분포 및 표적 특이성은 생체 외 생체분포 및 차단 연구에 의해 확인되었다.
1.2 결과 및 논의
1.2.1 WL12는 PD-1과 유사한 방식으로 PD-L1에 결합한다. PD-L1에 대한 WL12의 결합 방식을 평가하기 위해, PD-1 대신 WL12를 도킹하기 위해 PD-1에 결합된 인간 PD-L1의 공동-결정 구조를 사용하였다(PDB ID: 4ZQK)(Zak et al., 2015). 거대고리, WL12의 구조적 복잡성을 감안할 때, 본 발명자들은 먼저 구조 검색을 수행하고 글라이드(Glide)를 사용하여 PD-L1 상의 PD-1 결합 부위 내로 이형태체를 도킹시켰다(Friesner et al., 2004; Halgren et al., 2004). WL12는 2개의 거대고리 가닥의 백본 사이에 형성된 2개의 수소 결합을 갖는 베타 시트 유사 구조를 형성한다(도 1b). 이 형태는 원편광 이색성 실험에 의해 지지된다(도 2). 결합된 WL12와 PD-1의 구조의 오버레이는 이들 둘 사이의 결합 방식의 유사성을 나타낸다. PD-L1과 결합 계면을 형성하는 PD-1의 2개의 베타 가닥은 WL12의 슈도-가닥과 중첩된다(도 1c). WL12의 L-류신은 PD-1의 Ile134와 동일한 작고 소수성인 포켓에 삽입되고, 2개의 노르류신 잔기 중 하나는 PD-1의 Ile126과 정렬된다. 이러한 소수성 상호작용 외에도, WL12와 PD-L1 사이에는 많은 수소 결합이 존재한다. WL12 상의 아스파라긴의 카르복사미드는 Tyr123과 수소 결합을 형성하고, 글리신 아미드는 Gly120의 백본과 수소 결합을 형성하고, 세린 하이드록실은 Gln66과 상호작용한다. 오르니틴 잔기는 노출되어 있고 PD-L1과의 결합에 관여하지 않는다. 어느 한 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으며, 이는 아민-커플링 방법을 통한 적합한 표지의 컨쥬게이션이 WL12가 PD-L1에 결합하는 것을 방해하지 않을 것임을 시사한다.
1.2.2 [ 64 Cu]WL12는 시험관 내에서 PD-L1-특이적 세포 흡수를 나타낸다. 13오르니틴(Orn) 1차 아민을 이용하여 DOTAGA를 컨쥬게이션시킨 후, 비-방사활성 Cu2+ 유사체(WL12-Cu)를 제조하고 64Cu로 방사선표지하는데 사용하였다. 생성된 WL12D 및 상응하는 WL12-Cu를 HPLC에 의해 정제하고, 질량 분석에 의해 특성화하고(도 2, 도 3, 도 4, 도 5, 도 6, 및 도 7), 시험관 내 평가하였다. PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하는 WL12 및 이의 유도체의 반최대 억제 농도(IC50)를 평가하기 위해, 형광 공명 에너지 전달에 의존하는 이전에 기술된 시험관 내 검정(Woodard et al., 2014)을 최적화하였다. WL12, WL12D, 및 WL12-Cu에 대해 각각 22, 23, 및 2.9 nM의 IC50 값이 관찰되었다(도 8a, 도 9, 도 10 및 하기 표 1). 이들 데이터는 WL12가 DOTAGA에 의한 13Orn 측쇄의 변형 및 Cu2+에 킬레이션시 PD-L1에 대한 높은 결합 친화도를 유지함을 나타낸다.
표 1: WL12 - 비변형된 펩티드; WL12D - DOTAGA와 컨쥬게이션된 펩티드, WL-Cu2+ - WL12D의 구리 복합체. 95% CI - 95% 신뢰 구간.
Figure pct00009
PD-L1 특이성 및 세포 흡수를 입증하기 위해, [64Cu]WL12를 높은 특이적 방사활성(1.9 ± 0.1 mCi/μg) 및 방사화학 순도(> 95%)로 생성하였다(도 11 및 도 12). [64Cu]WL12와 함께 1시간 동안 인큐베이션된 hPD-L1 세포는 음성 대조군 CHO 세포에 비해 인큐베이션된 용량의 > 50% 흡수 및 결합 방사활성의 43배 증가를 나타내었다(도 8c). 이후 hPD-L1 세포를 [64Cu]WL12 단독과 함께 또는 1 μM 차단 용량의 WL12의 존재 하에 인큐베이션함으로써 결합 특이성을 시험하였다. 결합된 [64Cu]WL12에서 > 95% 감소는 펩티드의 존재 하에 관찰되었고, 이는 PD-L1에 대한 [64Cu]WL12 결합이 특이적임을 나타낸다(도 8c). 내인성 PD-L1 발현을 검출하는 [64Cu]WL12의 능력은 각각 높고 낮은 PD-L1 발현을 나타내는 2개의 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주인 MDAMB231 및 SUM149에서 추가로 시험되었다(도 8b). SUM149 세포에 비해 MDAMB231 세포에서의 방사활성의 2배 더 높은 흡수는 PD-L1에 대한 [64Cu]WL12의 특이성을 추가로 확인시켜 주었다(도 8c). PD-L1 발현에 대한 유세포 계측 분석은 방사활성의 흡수와 관계가 있는 hPD-L1 > MDAMB231 > SUM149 > CHO의 순서로 평균 형광 강도 값을 나타내었다(r = 0.9977, 도 13 및 도 14). 종합적으로, 그러한 결과는 [64Cu]WL12가 시험관 내에서 PD-L1 발현-의존적인 방식으로 암 세포에 결합한다는 것을 입증한다.
1.2.3 [ 64 Cu]WL12는 높은 PD-L1 발현을 보이는 종양에 특이적으로 축적된다. [64Cu]WL12의 생체 내 특이성 및 분포에 대한 이해를 위해, hPD-L1 및 CHO 종양을 보유한 마우스(n = 4)에서 PET-CT 영상화 연구를 수행하였다. PET 영상화 연구는 hPD-L1 종양에서 [64Cu]WL12의 강력한 흡수를 나타내었다. hPD-L1 종양에서의 증가된 흡수는 10분 내에 조기에 관찰될 수 있었고 주입 후 24시간 동안 유지되었으며(도 15a 및 도 16), PD-L1 발현은 IHC에 의해 확인되었다(도 15b). 종양 이외에, 신장 및 간에서도 높은 흡수가 관찰되었다. PET 영상화 관찰을 확인하기 위해, [64Cu]WL12를 주사한지 1 및 2시간 후에 생체분포 연구를 수행하였다(각각 n = 3 및 n = 5). PD-L1-양성 종양에서 관찰된 빠른 흡수를 고려할 때, 1 및 2 h에서의 생체분포는 18F-표지된 유사체의 개발에 더욱 유용할 것으로 생각되었다. 영상화 연구와 일관되게, hPD-L1 종양은 1 h에 14.9±0.8의 주사 용량/g(%ID/g) 값의 백분율로 방사활성 흡수를 나타내었다. 대조적으로, 대조군 CHO 종양 흡수는 4.0±0.6 %ID/g이었다(도 17). 신장 및 간에서의 흡수도 상대적으로 높았고, 흡수 값은 각각 34.4±3.1 및 24.2±2.5 %ID/g이었다. hPD-L1 종양에 대한 종양-대-근육 및 종양-대-혈엑 비율은 각각 25.6±1.9 및 4.7±1.2였고, 이는 높은 신호-대-잡음 비를 갖는 PD-L1 특이적 이미지를 제공하는 [64Cu]WL12의 능력과 일치한다(도 15a 및 도 15b).
2 h에 수행된 생체분포 연구는 신장, 간 및 종양에서 감소된 방사활성으로의 경향과 유사한 프로파일을 보였다(도 17). 생체 내 특이성을 입증하기 위해, [64Cu]WL12를 과량의 WL12(50 μg, 2 mg/kg)와 함께 공동-주사하고 2 h에 생체분포 연구를 수행하였다. hPD-L1 종양에서 %ID/g 값의 > 75% 감소(P < 0.0001)가 관찰되었고 대조군 CHO 종양에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 신장도 감소된 흡수를 보였다. 다른 조직에서 방사활성 흡수의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 64Cu-기반의 영상화 제제에서 종종 관찰되는 경향인 간에서의 증가된 흡수(Anderson et al., 2009)는 킬레이터로부터 Cu2+의 해리 및 알부민 및 세룰로플라스민과 같은 혈장 단백질에 대한 후속 교차킬레이션 때문일 수 있었다(Smith-Jones et al., 1991; Wadas et al., 2007; and Boswell et al., 2004). 증가된 신장 흡수는 또한 펩티드의 우세한 신장 제거율을 시사한다. PD-L1을 발현하는 것으로 공지되고 증가된 방사선표지된 항체 흡수를 나타내는 것으로 보고된(Chatterjee et al., 2016; Hettich et al., 2016; and Josefsson et al., 2016) 조직인 비장, 흉선 및 갈색 지방에서 관찰된 낮은 흡수는 [64Cu]WL12가 마우스 PD-L1에 대해 매우 낮은 친화도를 갖거나 친화도가 없다는 것을 시사한다. 인간 PD-L1에 대한 [64Cu]WL12 특이성을 추가로 지지하면서, 신장을 제외하고, 대조군과 차단 용량 그룹 사이에 이들 조직에서 흡수의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 영상화 및 생체분포 연구는 종합적으로 [64Cu]WL12가 인간 PD-L1에 신속하고 특이적으로 결합한다는 것을 입증한다.
1.2.4 CD 결과. 수성 및 막 모방 용액에서 WL12의 2차 구조를 평가하기 위해, CD 분광법을 물, DPC, 및 SDS의 조합으로 수행하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, Trp 잔기는 220-240 nm의 영역에서 WL12 펩티드의 CD 스펙트럼에 유의한 영향을 미친다. 계면활성제-비함유 용액에서 약 220 nm에서 최소 및 약 230 nm에서 양성 숄더가 관찰된다. 계면활성제를 첨가하면, 둘 모두의 밴드는 약간 적색-이동하여 후자의 강도 증가가 나타난다. 이들 밴드는 Trp-Trp 커플링이 원인이다. 둘 모두의 Trp 발색단은 근접해 있고 이들은 단일 흡수 단위로 거동한다. 결과적으로, 이들의 여기 상태는 상호작용하여 이량체 시스템의 여기 상태는 둘 모두의 단량체 상에서 다른 위치로 옮겨간다. 엑시톤 효과로서 지칭되는 이 현상은 여기 상태가 2개의 성분으로 분할되게 하는데, 이 중 하나는 2개의 단량체 여기의 위상-일치(in-phase) 조합으로부터 발생하고 다른 하나는 위상-불일치(out-of-phase) 조합으로부터 발생한다. (Grishina 1994, and Kelly 2000).
정렬되지 않은 펩티드의 CD 스펙트럼은 전형적으로 200 nm 미만의 단일 밴드에 의해 특성화되는 반면, α-헬릭스는 192 nm에서 하나의 양성 밴드를 가지며 208 및 222 nm에서 2개의 음성 밴드를 나타내고, β-시트 구조는 일반적으로 195 nm에서 하나의 양성 밴드를 가지며 217 nm에서 음성 밴드를 나타낸다. 따라서, WL12 펩티드의 CD 스펙트럼에서 약 205 nm에서의 강한 음성 밴드 및 약 190 nm에서의 강한 양성 밴드는 혼합물에 임의의 코일 형태 및 보다 규칙적인 구조를 제안할 수 있다. CD 스펙트럼의 디콘볼루션은 모든 측정 조건에서 높은 β-시트 함량(약 40%)을 나타낸다. 그럼에도 불구하고 WL12의 원-UV CD 스펙트럼에 대한 Trp 발색단의 강한 기여는 2차 구조 내용물의 정량적 분석의 정밀도에 영향을 미치며 그 결과는 신중하게 해석되어야 한다.
1.3 요약. 요약하면, 신속한 종양 PD-L1 검출 및 PD-L1 선택성은 고도로 특이적인 PD-L1 결합 펩티드 [64Cu]WL12를 사용한 PET로 시험관 내 및 생체 내에서 입증되었다. [64Cu]WL12의 약동학 및 생체분포는 PD-L1 검출이 방사선추적자를 투여한지 60분 이내에 영상화 환자의 표준 임상 작업 흐름 내에 들어가도록 실현 가능하다는 것을 나타낸다. 모든 악성 병변에서 PD-L1 발현의 신속하고 비침습적인 검출은 전체적으로 면역 조절 요법을 위해 환자를 계층화할 수 있는 전례없는 기회를 제공한다.
1.4 물질 및 방법
1.4.1 물질: PD-L1 결합 펩티드인 WL12는 CPC Scientific(Sunnyvale, CA)에 의해 >95% 순도로 맞춤 합성되었다. 다른 모든 화학물질은 달리 명시하지 않는 한 Sigma-Aldrich 또는 Fisher Scientific에서 구입하였다. 2,2',2''-(10-(2,6-디옥소테트라하이드로-2H-피란-3-일)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산(DOTAGA 안하이드레이트) 및 [64Cu]Cl2는 CheMatech Macrocycle Design Technologies(catalog # C109; Dijon, France) 및 The University of Wisconsin으로부터 각각 구입하였다. 모든 세포 배양 관련 시약들은 달리 명시하지 않는 한 Invitrogen에서 구입하였다. 폴리클로날 항-인간 IgG-Eu3+Cryptate(catalog # 61HFCKLA) 및 XL665-컨쥬게이션된 마우스 모노클로날 항-6히스티딘 항체(catalog # 61HISXLA)는 Cisbio Assays(Bedford, MA)로부터 구입하였다. 재조합 인간 PD-1 Fc 키메라 단백질(catalog # 1086-PD-050) 및 재조합 인간 PD-L1(B7-H1)-His-tag 단백질(catalog #9049-B7)은 R&D systems(Minneapolis, MN)로부터 구입하였다.
1.4.2 도킹 연구: PD-L1에 대한 WL12의 도킹을 수행하기 위해, PD-L1에 결합된 인간 PD-1의 결정 구조를 주형으로서 사용하였다(PDB ID: 4ZQK). 상기 모델은 먼저 Maestro의 Protein Preparation Wizard를 사용하여 준비되었다(Schrodinger Release 2016-2: Maestro, version 10.6, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2016)(Sastry et al., 2013). 이는 결합 순서 및 공식적인 전하의 정렬, 수소 원자의 첨가 및 누락된 측쇄의 첨가를 포함한다. 단백질 내의 수소 결합 네트워크를 최적화한 다음(티올 및 하이드록실기의 재배향, Asn, Gln 및 His 측쇄 샘플링, 및 His, Asp 및 Glu의 양자화 상태의 예측 포함), 간단히 최소화한다. PD-1의 구조는 제거되었다. 구조 검색은 Prime Conformational Search(Schrodinger Release 2016-2: Prime, version 4.4, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2016)을 사용하여 WL12의 구조에 대해 수행되었다. 도킹 실험을 위해 100개의 최저 에너지 이형태체를 선택하였다. 기본 설정 및 입력 링 형태(Friesner et al., 2004, Halgren et al., 2004)를 사용하여 글라이드(Schrodinger Release 2016-2: Glide, version 7.1, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2016)로 도킹을 수행하였다. 이러한 계산에 사용된 소프트웨어는 SBGrid(Morin et al., 2013)에 의해 큐레이팅되었다.
1.4.3 원편광 이색성(CD) 측정: 수성 계면활성제-비함유 및 도데실포스파티딜콜린(DPC), 소듐 도데실설페이트(SDS) 및 5:1 몰 비의 혼합된 DPC:SDS 미셀의 수성 미셀 용액에서 펩티드의 CD 스펙트럼을 Jasco J-815 분광편광계(Jasco, Easton, MD)를 사용하여 획득하였다. 모든 측정은 25℃에서 0.15 mg/mL 펩티드 용액을 사용하여 수행되었다. 실험은 185-260 nm 범위에서 수행되었고 신호-대-잡음 비를 높이기 위해 삼중으로 수행되었다. 최종 스펙트럼은 배경 제거에 의해 보정되고 평균 잔기 몰 타원율, MRME(각도 × cm2 × dmol-1) 대 파장 λ(nm)로 분석되었다. CONTIN 방법(Sreerama et al., 2000)을 사용하여 스펙트럼으로부터 2차 구조의 내용물을 계산하였다.
1.4.4 WL12-DOTAGA(WL12D)의 합성: 3mg의 펩티드(1.5 μmol)를 0.5 mL의 DMF에 용해시키고 3.7 mg의 DOTAGA 무수물(0.5 mL의 DMF 중 7.51 μmol) 및 20 μL의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 생성물을 Agilent Technology 1260 Infinity 광다이오드 어레이 검출기(Agilent Technologies, Wilmington, DE)를 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템(Varian ProStar) 상에서 반-분취용 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA) 및 98% H2O(0.1% TFA) 및 2% MeOH(0.1% TFA)로 출발하여 60분 후에 100%의 MeOH에 도달하는 구배 용리를 사용하여 4 mL/분의 유량으로 정제시켰다. 요망되는 WL12D를 44.5분에 수집하고, 증발시키고, 탈이온수에 용해시키고 동결건조시켜 3.1 mg(1.3 μmol)의 생성물을 백색 분말로서 수득하였다(수율: 82.9%, 도 2). 0.1% 포름산과 함께 H2O-MeOH 50%(v/v)에 용해된 생성된 컨쥬게이트를 전자 분무 이온화 질량 분석기(ESI MS, Esquire 3000 Plus spectrometer, Bruker Daltonics, Billerica, MA)에 의해 분석하였다(도 4). 이론적인 화학식: C91H128N22O20S2. 관측치 ESI-MS m/z: 2340.9 - (M + 1)+1, 1171.1 - (M + 2)+2/2 및 781.1 - (M + 2)+3/3. (예상치: 2340.65)
1.4.5 WL12-Cu 2+ 복합체의 제조: 1.5 mg의 WL12D(0.64 μmol)를 200 μL의 소듐 아세테이트(0.1M, 빙초산으로 조정된 pH=4.5)에 용해시키고 55 μL의 0.02M CuCl2 수용액(1.1 μmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 WL12D에 대해 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 정제하고(도 5), 동결건조시키고, 생성된 밝은 청색 분말을 ESI MS에 의해 분석하였다(도 6). 이후 WL12-Cu2+ 복합체를 사용하여 방사선표지를 위한 표준으로서, 그리고 PD-L1 및 PD-1 경쟁 결합 검정을 위해 RP-HPLC 조건을 최적화하였다(도 7). 이론적인 화학식: C110H156N26O29S. 관측치 ESI-MS m/z: 2402.6 - (M + 1)+1, 1201.9 - (M + 2)+2/2 (예상치: 2402.18)
1.4.6 PD-L1 및 PD-1 결합 억제 검정: PD-1에 결합하는 PD-L1에 대한 경쟁적 억제 검정은 Cisbio(Woodard et al., 2014)에 의한 논의에서 이전에 기술된 형광 공명 에너지 전달(FRET)-기반 검정으로부터 최적화되었다. 모든 결합/억제 검정은 21 μL의 FRET 검정 완충제(dPBS, 소 혈청 알부민(0.1%, w/v), Tween-20(0.05% v/v) 및 소듐 플루오라이드(400 mM))에서 수행되었다. 검정 조건은 PD-1 및 PD-L1 농도에 대해 먼저 최적화되었다. 10 nM, 20 nM 및 40 nM의 최종 농도의 PD-1-Ig를 0.65 내지 320 nM 범위의 최종 농도의 PD-L1-His-태그와 함께 15분 동안 인큐베이션한 다음(각각의 농도는 삼중으로), 항-인간 IgG-Eu3+ cryptate(IgG-Eu, 최종 농도 2 nM) 및 항-6HIS-XL665 모노클로날 항체(항-6HIS-XL665, 최종 농도 40 nM)를 함유하는 10 μL의 FRET 완충제를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 1 μL의 NaF 검정 완충제 용액을 첨가하고(최종 농도, 400 mM) 플레이트를 Perkin Elmer Victor3 1420 다중-표지 계수기(Perkin Elmer, Waltham, MA)를 사용하여 판독하였다.
경쟁 억제 검정을 위해, 억제제(WL12, WL12D 및 WL12-Cu2+, 범위: 1 pM 내지 1mM)를 10 μL 검정 완충제에서 PD-L1-His-태그(최종 80 nM)와 함께 15분 동안 예비-인큐베이션한 다음, PD-1-Ig(최종 농도 20 nM)를 함유하는 5 μL의 검정 완충제를 첨가하고 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후 IgG-Eu(최종 농도 2nM) 및 항-6HIS-XL665(최종 농도 40nM)를 갖는 5 μL의 검정 완충제를 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후 1 μL의 NaF를 첨가하고(최종 농도 400 mM) 플레이트를 Perkin Elmer Victor3 1420 다중-표지 계수기에서 판독하였다. 80 nM의 농도에서 PD-L1에 대해 유도된 KD=70 nM인 Cheng-Prusoff 방정식 및 S자형 용량 반응 곡선에 데이터를 핏팅시킴으로써 IC50 및 Ki 값을 계산하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었고 3회 반복되었다.
1.4.7. [ 64 Cu]WL12의 생성: University of Wisconsin에서 구입한 64CuCl2를 소량으로 증발시키고 0.1 M 소듐 아세테이트 용액으로 적정함으로써 64Cu(OAc)2로 전환시켰다. 방사선표지를 위해, 100 μL의 소듐 아세테이트 중 약 10 μg의 WL12D 펩티드 컨쥬게이트(4.27 nmol)를 약 185 MBq(약 5 mCi)의 64Cu(OAc)2와 혼합하고 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 방사선추적자를 방사활성 단일-채널 방사선 검출기(model 105S; Bioscan, Poway, California) 및 280 nm로 설정된 Varian ProStar UV 흡광도 검출기가 장착된 Varian ProStar 시스템을 사용하여 C-18(Luna,5 μm, 10 x 250 mm; Phenomenexsystem) 반-분취용 컬럼 상에서 정제시켰다. 98% H2O(0.1% TFA) 및 2% MeOH(0.1% TFA)로 출발하여 70분 후에 90% MeOH에 도달하는 5 mL/분의 유량의 구배 용리를 적용하였다. [64Cu]WL12를 약 56.2분(표지되지 않은 펩티드의 체류 시간: 53.6분)에 수집하고 증발시키고, 5% DMSO 및 두 방울의 Tween 20을 함유하는 염수로 희석시키고, 시험관 내 및 생체 내 평가에 사용하였다. [64Cu]WL12는 52.09 +-6.3%의 수율로 획득되었고 비활성(specific activity)은 1.9 ± 0.11 mCi/μg이었다.
1.4.7. 세포주: 중국 햄스터 난소 세포주 CHO-K1(이하 CHO로 지칭됨) 및 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주 MDAMB231을 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여 새로운 배양물을 동결된 세포의 바이알로부터 개시한 후 3개월 미만으로 계대배양하였다. SUM149 세포주는 Stephen P. Ethier 박사(Medical University of South Carolina)에 의해 친절하게 제공되었고, Johns Hopkins 유전 자원 시설에서 STR 프로파일링으로 인증되었다. SUM149 세포를 5% FBS, 1% P/S 및 5 μg/mL 인슐린, 및 0.5 μg/mL 하이드로코르티손을 지닌 Ham의 F-12 배지에서 유지시켰다. 다른 모든 세포주를 5% CO2를 함유하는 대기에서 37℃의 인큐베이터에서 ATCC 권장 배지로 배양하였다. 본 발명자들의 연구실에서 인간 PD-L1(이하 hPD-L1으로 지칭됨)을 안정하게 발현하는 CHO 세포주를 생성하고(Chatterjee et al., 2016) 10% FBS, 1% P/S 및 2 mg/mL G418을 지닌 F-12K 배지에서 유지시켰다.
1.4.8. 유세포분석: 현탁액 중 세포를 원심분리에 의해 수확하고 부착 세포를 효소-비함유, PBS-기반 세포 해리 완충제(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 탈착시켰다. 수확된 세포를 유세포분석 완충제(2 mM EDTA와 함께 1xPBS 및 0.5% FBS)로 2회 세척하였다. 세포를 피코에리트린과 컨쥬게이션된 항-인간 PD-L1 항체(BD-MIH-PE로서 표시됨, clone # MIH1, catalog #557924, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 제조업체의 프로토콜에 따라 염색하고 FACSCalibur 유세포분석기(Becton Dickinson) 상에서 분석하였다. 최소 20,000 사건을 기록하였다.
1.4.9. 시험관 내 결합: 1 μCi의 방사선추적자를 1×106개 세포와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 hPD-L1, CHO, MDAMB231 및 SUM149 세포에 대한 [64Cu]WL12의 시험관 내 결합을 결정하였다. 인큐베이션 후, 세포를 찬 PBS로 3회 세척한 후 자동화 감마 계수기(1282 Compugamma CS, Pharmacia/LKBNuclear, Inc., Gaithersburg, MD) 상에서 계수하였다. [64Cu]WL12의 PD-L1 특이적 결합을 입증하기 위해, PD-L1 차단을 1 μM의 WL12 펩티드 또는 인간화된 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙으로 수행하였다. 평균 형광 강도 값은 % 인큐베이션된 용량(%ID) 흡수와 상관 관계가 있었다. 모든 세포 흡수 연구는 각 세포주에 대해 삼중으로 수행되었고 3회 반복되었다.
1.4.10. 동물 모델: 동물 연구는 JHU 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. 6-8주령 암컷 비-비만 당뇨병 중증-복합 면역결핍 감마(NSG) 마우스를 JHU Immune Compromised Animal Core로부터 얻었다. 마우스에 10 × 106개의 CHO-PDL1 및 CHO 세포를 상부 옆구리의 대향 측면에 피하 이식하였다. 종양이 200-300 mm3의 부피에 도달했을 때 마우스를 영상화 생체분포(orbiodistribution) 실험에 사용하였다.
1.4.11. 마우스 이종이식편의 PET-CT 영상화: 스캐너에 놓이기 전에 3% 이소플루오란 하에 마취된 마우스에 200 μL의 염수 중 150 μCi의 [64Cu]WL12를 정맥내 주사하였다(n = 3). 마우스를 영상화 중 1% 이소플루오란 수준에서 유지하였다. PET 이미지는 ARGUS 소-동물 PET/CT 스캐너(Sedecal, Madrid, Spain)에서 10분/베드로 2개의 베드 위치에서 획득되었다. 해부학적 공동-등록을 위해 각 PET 스캔의 끝에 CT 스캔(512개 프로젝션)이 수행되었다. PET 데이터는 2차원 정렬된 서브세트-예상 최대화 알고리즘(2D-OSEM)을 사용하여 재구성되었고 데드 타임 및 방사활성 붕괴에 대해 보정되었다. cc 값 당 %ID는 알려진 방사활성 양으로 얻은 보정 계수에 기반하여 계산되었다. 최종 데이터 가시화 및 이미지 생성은 Amira®(FEI, Hillsboro, OR)를 사용하여 수행되었다.
1.4.12. 생체 외 생체분포: 각각 높고 낮은 PD-L1 발현을 갖는 hPD-L1 및 CHO 종양을 보유한 마우스(n=5)에 40 μCi의 [64Cu]WL12를 정맥내 주사하였다. [64Cu]WL12를 주사한지 1시간 및 2시간 후에 혈액, 종양, 및 선택된 조직을 수확하고, 칭량하고 자동화 감마 계수기(Perkin Elmer - 2480 Automatic Gamma counter - Wizard2 3” Wallac)에서 계수하였다. 차단 연구를 위해, 마우스에 방사선추적자와 함께 2 mg/kg(50 μg)의 비변형된 펩티드를 공동-주사하였다. 조직 그램 당 주사된 용량의 백분율(%ID/g) 값은 신호 감쇠 보정 및 외부 [64Cu] 표준에 대한 표준화에 기반하여 계산되었고, 이는 삼중으로 측정되었다. 제시된 생체분포 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)이다.
1.4.13. 데이터 분석: 통계 분석은 Prism 6 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 페어링되지 않은 투 테일드 t-테스트를 사용하여 수행되었다. P-값이 < 0.05이면 유의한 것으로 간주되었고 비교 기준은 PD-L1 발현이 낮은 세포주 또는 종양이었다. 유세포분석 데이터는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR.)를 사용하여 분석되었다. IC50 및 Ki 값은 Prism 6 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 계산되었다.
실시예 2
PD-L1 표적화 약물 개발에 대한 PD-L1 지향 PET
2.1 개괄. 암 면역요법(CIT)은 다양한 악성종양에서 지속적인 반응을 일으켜 환자의 생존율을 개선시키고 있다. 그러나, 면역 체크포인트 표적화 요법으로 치료된 환자의 거의 70%는 단일요법에 반응하지 않는다(Lipson, et al., 2015; Topalian, et al., 2015). 정밀 면역요법에 대한 반응의 결정요인을 규명할 필요가 충족되지 않고 있다. 체크포인트 조합 요법은 생존을 연장시키지만, 종종 증가된 면역 관련 부작용(irAE)이라는 대가를 지불하며, 이는 독성을 완화시키기 위해 조합 전략에 대한 증가된 지식이 필요하다는 것을 시사한다(Marrone, et al., 2016). 면역 체크포인트 요법 및 이들의 조합에 대한 새로운 바이오마커를 확인하여 그 폭과 지속력을 향상시키고 irAE를 감소시키기 위한 집중적인 연구가 절실히 필요하다. 따라서, 본원에 개시된 주제의 한 양태는 PD-L1 표적화 치료 약물의 개발 및 평가에서 PD-L1 기반 PET 영상화를 사용하는 전략을 개발하는 것이다. 진행 단계 환자에서 침습적이고 비실용적인 혈장 또는 조직(생검)-기반의 바이오마커에 의존하는 현재의 전략과는 달리, 제안된 발명은 관련 생체 내 모델의 종양에서 PD-L1 PET 영상화를 사용하여 PD-L1 표적화 치료제(항체, 펩티드, 소분자)의 용량 대 점유율 관계를 확립할 것이다.
2.1.1. PD-L1 동역학의 PET-기반 정량에 의해 가능해진 진전: 높은 PD-L1 발현을 갖는 H2444 NSCLC 이종이식편이 IHC 및 유세포분석에 의해 검출되는 바와 같이, 낮은 PD-L1 발현을 갖는 유방암 이종이식편에서 관찰된 것에 비해 현저하게 낮은 양의 방사선표지된 AtzMab을 축적하였으므로(Chatterjee, et al., 2016), NSCLC, TNBC 및 결장 종양 내에서 PD-L1-표적화 치료제 AtzMab 및 이의 마우스 키메라(PRO)의 축적은 전적으로 PD-L1 발현-의존성이 아니라는 것이 최근에 발견되었다. 유사하게, 동계 마우스 종양 모델에서, 전신적으로 주사된 방사선표지된 PRO는 주로 종양 혈관계와 연관되었고, 종양의 종양 실질 내로의 확산은 거의 또는 전혀 나타나지 않았다(Deng, et al., 2016). 상기 발견은 종양 내에서 증가된 간질압을 포함하는 병태생리학적 특징 때문일 수 있는데(Baxter, et al., 1989; Baxter, et al., 1990), 이는 치료 내성에 중요한 기여를 하는 종양 내 치료제의 축적을 불가능하게 한다(Goel, et al., 2011). 또한, 상기 효과는 종양 세포 및 종양 면역 침윤물에 주로 작용하는 PD-L1-표적화 치료제의 종양 세포에 대한 접근을 잠재적으로 방해할 수 있다. 따라서, WL12/[18F]WL12 또는 유사한 방사선표지된 펩티드와 같은 펩티드는 이들의 훨씬 작은 분자 크기로 인해 종양 조직에 침투하여 항체보다 더욱 효과적 및 효율적으로 표적 세포에 도달할 수 있다. 적절한 분석 및 보정을 사용함으로써, [18F]WL12 측정 또는 유사한 방사선표지된 펩티드를 사용하여 이루어진 측정은 따라서 표적화된 종양 세포에서, 종양 조직 내에서의 요망되는 점유율을 달성하는데 필요한 치료용 mAb 용량을 확인/최적화하는데 도움이 될 수 있다.
따라서, PD-L1-지향 PET는 PD-L1-표적화 약물 개발에 사용되었다. 잠재적인 가치를 평가하기 위해, 혁신적인 전략에서 [64Cu]WL12를 사용하여 PET에서 보이는 종양에서의 치료용 PD-L1 항체 아테졸리주맙(AtzMab)의 용량 대 mAb 국소화와 관련하여, 종양 PD-L1-진입 특성을 평가하고 비교하였다. 본원에 개시된 전임상 관찰은 임상적으로 실행 가능한 결과를 가질 것이다. 환자에서, 유사한 PD-L1 PET-기반 영상 측정은 치료 결과를 향상시키기 위해 치료 용량 강화를 유도하는데 잠재적으로 사용될 수 있었다(Yang, et al., 2013; Oude Munnink, et al., 2016). 또한, 상기 PD-L1 PET 측정은 잠재적으로 종양 부위에서 이들의 잠재적인 표적 진입을 정량할 수 있게 함으로써 새로운 PD-L1-표적화 치료제의 향후 개발을 유도할 수 있었다.
2.1.2. 약물 개발 및 평가에서 PD-L1 PET를 사용함에 있어서의 혁신: 본원에 개시된 혁신적인 PD-L1 펩티드-기반 PET 영상화 전략은 가장 적합한, 현재 및 미래의 항-PD-L1 치료제의 종양에서의 표적 진입 역가(즉, 점유율 및 체류 시간)의 평가를 허용한다. 동적 PD-L1 밀도/회전율, 및 혈청 mAb 농도에 영향을 미치는 PD-L1-발현 종양 부담의 정도는, 종양 관류 및 결과적인 종양내 mAb 축적의 완전성과 함께, 치료 효능에 상당한 영향을 미친다. 방사선표지된 항체는 필요한 mAb 투여 수준을 정의하고 표적 표면 분자 점유율을 계산하기 위해 이전에 사용되었으나(Deng, et al., 2016), 그 접근법의 주요 한계는 작용 종양 부위의 PD-L1 점유율만이 투영될 수 있다는 것이다. 본원에 개시된 접근법은 이 문제를 효과적으로 해결하여, 종양 부위에서 PD-L1 점유율을 정량할 것이다. 따라서 효과적인 mAb 용량 및 도달되는 축적에 대한 주요 종양 생리학적 파라미터의 기여에 대한 설명 외에도, 본 발명자들은 본 발명자들의 신규한 PET 추적자-기반 방안이 PD-L1-양성 종양을 지닌 일부 환자가 CIT에 반응하지 않는 이유에 대한 현재의 이해를 향상시키고, 종양에서 요망되는 점유율 수준에 도달하기 위한 용량 확대 전략을 유도할 수 있을 것으로 기대한다.
2.1.3. PD-L1-표적화 치료 약물의 개발 & 평가에서 PD-L1-PET의 유용성 평가:
2.1.3.1 이론적 근거
PD-L1 및 PD-1을 표적화하는 치료용 항체는 PD-L1-양성 종양을 갖는 환자 중 소수에 탁월한 효능을 보였다. 현재-사용된 용량에서, 반응자 및 비-반응자 집단은 PBMC에서 약 65% PD-L1 점유율을 나타내지만, PBMC에서의 PD-L1 점유율 및 종양에서의 점유율 사이의 역학적인 관계는 잘 알려져 있지 않다(Brahmer, et al., 2012). 또한, 종양 모델의 연구는 일부 종양에서, PD-L1 항체가 종양 혈관계에 국한된다는 것을 발견하였다(Deng, et al., 2016). 방사선표지된 AtzMab에 의한 예비 결과는 NSCLC 이종이식편에서 이러한 발견을 요약하였다(Chatterjee, et al., 2016). 종합적으로 말하자면, 이러한 발견은 PD-L1-지향 요법을 더 잘 알리기 위해서는 종양에서의 PD-L1 점유율 및 용량에 대한 이의 의존성, 및 종양에서의 항-PD-L1 항체의 체류 시간에 대한 개선된 이해가 필요하다는 것을 시사한다. 어떤 한 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으며, PD-L1 PET는 표적 진입 및 체류 시간과 관련하여 항-PD-L1 항체(또는 펩티드 및 소분자)의 상기 PK 척도를 평가하는 유용한 도구를 제공할 것으로 생각된다. 또한, PET-정보에 의한 투여는 PD-L1 PET에 의해 정량될 수 있고 종양 PD-L1 발현 및 면역 세포 침윤물의 요법-유도된 변화와 관련될 수 있는 종양 내 면역 프로파일 변화를 유도할 것으로 생각된다.
2.1.3.2 대표적인 데이터: 이용 가능한 항-PD-L1 항체 및 PD-1 유도체의 방사선표지된 형태를 사용하여 PD-L1 발현을 비침습적으로 검출하였다(Chatterjee, et al., 2016; Deng, et al., 2016; Hettich, et al., 2016; Josefsson, et al., 2016; Lesniak, et al., 2016; Heskamp, et al., 2015; Maute, et al., 2015). 그렇게 하기 위해, 치료용 항체 AtzMab을 인간 및 마우스 교차-반응성에 대해 선택하고 PD-L1 검출의 특이성을 면역손상된 마우스 및 4T1 동계 유선 종양 모델에서 인간 TNBC 및 NSCLC 이종이식편에서, PET, SPECT 및 광학 영상화에 의해 입증하였다(Chatterjee, et al., 2016; Lesniak, et al., 2016)(도 20A, 도 20B, 도 20C, 및 도 20D). AtzMab는 높은 친화도로 인간 및 마우스 PD-L1 둘 모두에 결합하고, 해리 상수(Kd)는 각각 0.43 nM 및 0.13 nM이었다. (Irving, et al., 2012; Powles, et al., 2014) AtzMab은 진행성 또는 전이성 방광암(Powles, et al., 2014), 흑색종(Hamid, et al., 2013), NSCLC(Spigel, et al., 2013), RCC(Cho, et al., 2013), TNBC 및 여러 다른 암의 치료를 위해 임상 평가 중이다.
종양 내 방사선표지된 AtzMab의 축적은 둘 모두의 암 유형(NSCLC 및 TNBC)에서 PD-L1-특이적인 것으로 밝혀졌다(Chatterjee, et al., 2016; Lesniak, et al., 2016). 종양 내 [111In]AtzMab 축적은 또한 전적으로 PD-L1 발현-의존성은 아닌 것으로 나타났고, 이는 항체에서 종종 관찰되는 문제인 간질 액압, 종양 대류, 및 혈관외유출의 공간적 변화가 기여 요인들 중 일부일 수 있음을 시사한다(Baxter, et al., 1989). MDAMB231 TNBC 이종이식편은 피하 및 정위 H2444 NSCLC 종양보다 더 높은 조직 축적(그램 당 주사된 용량의 백분율; %ID/g)을 보였고, 이는 유세포분석 및 IHC 분석 둘 모두에 의해 더 높은 PD-L1 발현을 나타내었다(Chatterjee, et al., 2016). 본 발명자들의 새로운 펩티드-기반 PD-L1 PET 추적자의 특이성 및 유연성을 활용하여, 종양에서 항체 분포에 영향을 미치는 많은 요인을 설명하고 다양한 PD-L1 표적화 항체에 적용될 수 있는 전적으로 상이한 접근법에 의해, PD-L1-발현 종양 내에서의 AtzMab 축적의 동역학을 생체 내 분석하였다.
2.1.3.3 PD-L1 PET에 의한 종양에서의 PD-L1 치료용 항체 축적: PD-L1에 대한 WL12의 특이성을 평가하는 동안, WL12는 PD-L1 상의 동일한 결합 부위에 대해 AtzMab와 경쟁한다는 것이 발견되었다. 이것은 PD-L1-지향 PET를 사용하여, 필요한 경우, 종양 부위에서 AtzMab 요법을 평가하는 새롭고 종래에 예기치 못한 수단을 제공한다. 종양에서 PD-L1 항체의 분포에 대한 개선된 이해는 임상 항체 투여 및 치료 모니터링에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 종양 내 PD-L1에 대한 AtzMab 결합을 평가하는 [64Cu]WL12-PET의 능력을 시험하였다. [64Cu]WL12-PET 및 생체분포 연구에 의해 정량시 hPD-L1 종양에서 방사활성의 축적은 AtzMab(20 mg/kg)가 주사된 마우스에서 80%만큼 감소되었다(도 21A, 도 21B, 및 도 21C). 신장을 제외한 다른 조직에서 방사활성 흡수의 감소는 있었지만 유의한 차이는 아니었는데, 이는 [64Cu]WL12 결합이 인간 PD-L1에 특이적임을 나타낸다(Lesniak, et al., 2016). 시험관 내 결합 연구에 의해, 본 발명자들은 비표지된 WL12가, 37.8 nM의 IC50으로, PD-L1에 대한 Cy5-컨쥬게이션된 AtzMab의 결합을 농도-의존적으로 억제하였음을 발견하였는데, 이는 AtzMab이 [64Cu]WL12 결합을 억제함에 있어 WL12보다 더 강력했지만 둘 모두의 리간드가 PD-L1 결합에 대해 경쟁하며(도 21D) AtzMab 투여시 종양에서 점유되지 않은 PD-L1 수준을 검출할 수 있을 것임을 확인시켜 주었다. 종합적으로, 이러한 결과는 WL12와 AtzMab의 결합 부위가 중첩되고 이는 PD-L1-발현 종양에서 AtzMab 표적 진입 및 체류 시간(표적 진입 능력)을 평가하기 위한 [64Cu]WL12-PET의 잠재적 유용성을 나타낸다는 것을 입증한다. 이 접근법의 이용가능성은 PD-L1 발현의 고유 증가를 갖는 암 세포주까지 확대되었다. 삼중 유방암 이종이식편에서, 높은 PD-L1 발현 MDAMB231 이종이식편에서 AtzMab 축적을 검출하는 [64Cu]WL12 능력을 관찰하였다(도 22). 20 mg/Kg AtzMab 용량을 투여받은 마우스에서 PD-L1 PET 영상화 제제 흡수의 유의한 감소가 관찰되었다.
이것은 아벨루맙(Avelumab)(AvMab)과 같은 치료용 항체를 표적화하는 다른 PD-L1과 유사한 적용으로 생각된다. AvMab은 NSCLC(NCT02395172), 진행성 RCC 및 위암을 포함하는 여러 암에서 현재 다중 III상 임상 시험 중인 인간 IgG1 항체이다. AvMab과 복합체화된 PD-L1의 결정 구조를 분석하였고, AvMab이 WL12와 마찬가지로 PD-L1 상의 동일한 아미노산들 중 일부(R113, D61,및 E58)와 상호작용하는 것이 발견되었는데(Liu, et al., 2016), 이는 AvMab 및 아마도 다른 PD-L1-지향 치료용 mAb에 의한 생체 내 표적 진입을 평가하기 위한 WL12-기반 추적자의 잠재적으로 유리한 유용성을 나타낸다. 이들 연구는 진행 중인 PD-L1 mAb 요법을 표적 진입 능력과 관련하여 평가하는 PD-L1-PET의 잠재력을 입증할 것이다.
실시예 3
테라노스틱(theranostic) 항체에 의한 PD-L1 진입의 비침습적 정량
3.1 개괄. 프로그램된 세포사멸 리간드-1(PD-L1) 표적화 항체 치료제는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 임상 시험의 거의 1/4에서 사용된다. 총 PD-L1 수준, PD-L1 치료제에 의한 이들의 점유율 및 최적의 면역 반응을 보장하기 위해 종양 내 표적 진입의 정도 및 지속기간에 대한 용량의 관련성은 알려져 있지 않다. 종양 내 PD-L1의 점유율은 PD-L1 발현의 동적 변화, 및 혈장 및 종양 항체 농도를 변경시키는 종양 내재적 및 외인성 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러나, 상기 주요 변화는 말초 약동학 및 약역학 평가에 의해 포착되지 않는다. PD-L1 치료제의 용량-투약 노출 관계의 차이를 해결하기 위해, PD-L1 발현의 동적 변화를 정량할 수 있는 방사선표지된 PD-L1 결합 펩티드를 연구하였다. 구조 분석 결과 양전자 방출 단층촬영(PET)을 사용하여 종양에서 치료용 모노클로날 항체(mAb)의 점유율을 측정할 수 있는 펩티드의 중첩 및 PD-L1과 치료용 mAb 상호작용이 나타났다. 많은 이종이식편 모델에서, PET 영상화 및 생체분포 연구는 가변적인 PD-L1 발현, 및 PD-L1 치료용 항체에 의한 이의 포화가 정량될 수 있음을 보여주었다. 또한, 세 별개의 항체에 의한 종양에서의 PD-L1 점유율이 측정되었고 종양에서 PD-L1 점유율에 대한 용량 및 시간 효과가 정량되었다. 펩티드-기반 PD-L1 PET는 면역-관련 부작용을 줄이기 위한 목적으로 용량 및 치료 요법을 최적화하는 도구로서 유망하다.
보다 특히, 본원에 개시된 주제는 생체 내에서, 종양에서 PD-L1 발현 수준 및 PD-L1 mAb 표적 진입을 특성화할 필요를 다루기 위해 정량적 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화를 사용한다. 이것은 종양(Willman, et al., 2008) 및 약물 개발과 평가에서 표적 발현의 반복 측정에 효과적이지만, 종양학에서의 수용체 점유율 연구에만 드물게 사용되고(Rathkopf, et al., 2013), PD-L1 또는 PD-1 mAb의 약동학 및 약역학 평가를 위해서는 구체적으로 실현되지 않았다(Peterson, et al., 2008; Linden, et al., 2006).
인간 PD-L1에 높은 친화도 및 특이성으로 결합하고, 방사선추적자를 투여한지 120분 이내에 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 64Cu로 방사선표지된 작은 펩티드인 [64Cu]WL12가 최근에 개발되었다(Chatterjee, et al., 2017). 이 예는 PD-L1 검출을 위한 [64Cu]WL12-PET를 설명하고 폐암 및 유방암의 실험 모델에서 PD-L1 발현의 동적 변화를 정량한다. 세 상이한 FDA-승인된 mAb인 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 두르발루맙(durvalumab)(DurMab)에 의한 PD-L1 진입을 평가하는 [64Cu]WL12 PET의 능력을 평가하였다. 또한, 종양에서 PD-L1 진입의 정도 및 지속기간에 대한 PD-L1 mAb 용량의 관련성을 비침습적으로 평가하였다.
3.2 배경. 암 면역요법(CIT)은 다양한 악성종양에 지속적인 반응을 일으킨다. 선호되는 CIT 표적 중 하나는 체크포인트 단백질 프로그램된 세포사멸-리간드 1(PD-L1)이다. PD-L1은 종양-침윤성 세포독성 T 세포를 피하는 수단으로 많은 종양에 의해 발현되어(Topalian, et al., 2016), PD-1 수용체에 직접 결합하여 면역 억제를 일으킨다(Okazaki, et al., 2007; Topalian, et al., 2015). PD-L1:PD-1 상호작용을 억제하는 다수의 PD-L1 표적화 모노클로날 항체 치료제(mAb)가 임상 시험 중이고, 이러한 치료를 받은 환자의 거의 30%는 지속적인 반응을 나타낸다(Topalian, et al., 2015; Lipson, et al., 2015). 그러나, 그 성공에도 불구하고, 임상적 과제를 제기하고 임상의가 체크포인트 요법을 발전시키는 능력을 제한하는, 지연되거나 혼합된 종양 퇴화와 같은, 비정상적인 반응 패턴에 기여하는 생물학적 메커니즘에 대한 불완전한 이해가 존재한다.
항-PD-L1 mAb의 치료 작용은 주로 종양 미세환경 내에서 일어나는 것으로 간주된다(Topalian, et al., 2015). 그러나, 약역학(PD) 데이터는 제한적이다; 이들은 작용 부위(종양)에서의 표적 진입을 반영하지 않고, 제한된 횟수의 시험에서만 보고되며, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 획득된다. PD-L1 항체 BMS-936559의 경우, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위의 용량에 대해 64-70%의 균일한 표적 점유율이 보고되었다(Brahmer, et al., 2012). 가장 관련된 부위, 즉, 종양에서의 PD-L1 mAb의 소인, 및 최적의 면역 반응을 보장하기 위해 표적 진입의 정도 및 지속기간과 용량의 관련성에 대해서는 아직 많이 알려져 있지 않다.
PD-L1/PD-1 표적화 요법의 치료 모니터링을 위해 가장 잘-연구된 예측 바이오마커는 PD-L1 면역조직화학(IHC)이다(Gibney, et al., 2016). 그러나, 이 방법은 제한된 유용성의 생검 표본을 필요로 하므로 상당한 한계를 갖고, 시간적으로 동적인 면역 종양 미세환경(TME), 및 PD-L1 발현의 종양내 및 종양간 이질성을 정확하게 반영하지 못할 수 있다(Mansfield, et al., 2016; McLaughlin, et al., 2016). 원발성 및 전이성 종양에서 PD-L1 발현 수준, 동역학, 및 PD-L1 치료용 약물 소인의 비침습적 평가에 대한 충족되지 않은 요구가 있으며, 영상화의 표준 임상 작업 흐름 내에서 이를 수행하여야 한다.
3.3 결과
3.3.1 WL12 및 PD-L1 mAb와 PD-L1 상호작용의 구조 분석 및 시험관 내 검증. WL12는 높은 친화도(IC50: 20nM)로 PD-L1:PD-1 상호작용을 억제하는 14개 아미노산 펩티드이다(Chatterjee, et al., 2017). 이전의 분자 모델링 분석은 PD-L1:WL12 및 PD-L1:PD-1의 상호작용 표면에서 중요한 분자 상호작용에 기여하는 PD-L1의 4개 아미노산(Y56, E58, D61 및 A113)과의 중첩을 제안하였다(Chatterjee, et al., 2017). 치료용 항체 아테졸리주맙(AtzMab)과 복합체를 이룬 PD-L1의 매장된 표면(2,106 Å2)은 PD-1의 것(1,970 Å2)보다 크다(Lee, et al., 2017). 어떤 한 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으며, 임상적으로 이용 가능한 치료용 mAb가 PD-L1:PD-1 상호작용을 억제하도록 유사하게 설계되었기 때문에 PD-L1에 대한 WL12 상호작용 표면도 임상적으로 이용 가능한 치료용 mAb의 표면과 중첩되는 것으로 생각되었다. 이를 시험하기 위해, WL12의 예측된 결합 구조를 PD-L1 mAb의 구조와 비교하였다. PD-1 및 WL12 뿐만 아니라 모든 mAb 사이의 AA 접촉의 중첩은 PD-L1 잔기 Y56, E58, A113, M115 및 Y123로 구성된 공통 결합 도메인을 드러낸다. PD-L1 분자 표면의 가시화에서 밝혀진 바와 같이(도 33a, 도 34A), 중첩 영역(하늘색)은 깊은 포켓을 형성하고, 모든 상호작용점에 대한 앵커 포인트로서 작용한다. 표면적의 관점에서 AtzMab(적색)은 더 많은 PD-L1 표면과 상호작용하고 항체로부터의 루프는 PD-1(보라색), WL12(녹색), 아벨루맙(AveMab, 주황색), 및 두르발루맙(DurMab, 청색)으로부터의 상호작용 표면과 중첩되는 공통 결합 코어의 모든 측면에서 잔기와의 분자 접촉을 발생시킨다.
전술한 구조 분석을 지지하기 위해 상업적으로 이용 가능한 Cy5 형광 N-하이드록시석신이미드 에스테르에 대한 항체의 컨쥬게이션을 통해 Cy5-표지된 AtzMab, AveMab 및 DurMab을 제조한 다음, PD-L1을 항시적으로 발현하는 CHO 세포(Cho-hPD-L1) 및 자연적으로 PD-L1을 발현하는 MDAMB231 유방암 세포에서 WL12과의 경쟁적 억제 검정을 수행하였다(Chatterjee, et al., 2016). PD-L1에 대한 Cy5-PD-L1 mAb 결합의 WL12 용량-의존적 억제가 2-5 nM의 억제 농도로 관찰되었다(도 33b). HCC827 및 H226 비소세포폐암(NSCLC) 세포도 시험하였다. 자연적으로 PD-L1을 발현하는 각각을 5 nM WL12의 존재 하에 AtzMab, AveMab 및 DurMab의 형광 형태와 함께 인큐베이션하였다. 유세포분석은 결합된 형광에서의 유의한 감소를 나타내었고(P < 0.001), 이는 항체-PD-L1 상호작용을 파괴하는 WL12의 능력을 추가로 입증한다(도 34C 및 34D). WL12:PD-L1 상호작용의 특이성에 대한 추가 확인은 CXCR4-특이적 항체인 MDX1338이 사용되었을 때 결합된 형광의 변화가 관찰되지 않음으로써 얻어졌다. PD-L1-양성(HCC827, H226, MDAMB231 및 hPD-L1) 및 PD-L1-음성(Sum149 및 CHO)세포를 64Cu로 방사선표지된 WL12-유사체([64Cu]WL12)와 함께 인큐베이션하였다. 종래에 WL12 유사체는 hPD-L1/CHO 세포에서 시험관 내 및 생체 내에서 높은 친화도(IC50<20 nM) 및 선택성으로 PD-L1에 결합하는 것으로 입증되었지만, 가변적인 발현을 갖는 인간 암 세포주에서는 검증되지 않았다(Chatterjee, et al., 2017). PD-L1 음성 세포와 비교하여 PD-L1 양성 세포에서 [64Cu]WL12의 높은 발현 의존성-흡수가 관찰되었다(P < 0.0001). 또한, PD-L1 결합 특이성에 대한 추가 조사로서, PBS 처리된 대조군과 비교하여 60 nM mAb로 처리한 경우 모든 PD-L1 양성 세포에서 [64Cu]WL12 흡수의 현저한 차단이 관찰되었다(P < 0.0001)(도 33c). 상기 결과는 [64Cu]WL12가 종양에서 유리 PD-L1 수준을 검출하고 PD-L1 mAb에 의한 PD-L1 진입을 모니터링하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
3.3.2 AtzMab에 의한 종양 PD-L1 진입의 정량. 생체 내 종양에서 치료용 mAb에 의한 PD-L1 진입을 비침습적으로 평가하기 위해, NSCLC 이종이식편 모델을 연구하였다. 그러한 모델은 NSCLC의 거의 50%가 PD-L1-양성이고 PD-L1 IHC가 면역 체크포인트 치료를 받고 있는 NSCLC 환자에서 예측 바이오마커로서 사용되기 때문에 선택되었다(Mansfield, et al., 2016). 낮은 및 중간 PD-L1 발현을 각각 나타내는(도 36A) H226 및 HCC827 세포-유래된 이종이식편을 보유하는 NOD scid 감마 마우스를 정맥내 투여되는 단일 용량의 AtzMab(24시간 동안 20 mg/kg)로 처리하였다. [64Cu]WL12를 주사한지 2시간 후에 획득된 PET 이미지는 H226에 비해 HCC827 종양에서 [64Cu]WL12의 높은 축적을 나타내었다. AtzMab-처리된 마우스의 종양에서 방사활성의 축적은 명백하게 감소되는데, 이는 처리된 대조군과 비교하여 이용 가능한 PD-L1 부위의 수준이 감소함을 나타낸다(도 35A 및 도 35B). PET 영상화 결과는 생체분포의 생체 외 측정에 의해 추가로 확인되었고(도 35D 및 도 35E, 도 36B 및 도 36C), 이는 염수 대조군에 비해 AtzMab-처리된 마우스에서 그램 당 주사된 용량의 [64Cu]WL12 퍼센트 값(%ID/g)의 현저한 감소를 보였다: H226를 지닌 마우스에서 34%(P < 0.0001) 및 HCC827 이종이식편에서 47%(P < 0.001). PD-L1 발현 수준은 이종이식편의 PD-L1 IHC에 의해 확인되었다(도 35C 및 도 35F). 상기 결과는 [64Cu]WL12가 종양에서 AtzMab에 의한 PD-L1의 생체 내 표적화를 정량하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
종양에서 상이한 PD-L1 수준을 표적화함에 있어 AtzMab의 단일 용량의 효과를 평가하기 위해, PET 및 생체분포 연구를 NSCLC 세포보다 4배 내지 10배 더 높은 PD-L1 발현을 갖는 CHO-hPDL1 세포주에서 유래된 종양에서 수행하였다(도 36). AtzMab(24시간 동안 20 mg/kg)으로 처리된 CHO-hPDL1/CHO 종양-보유 마우스는 대조군에 비해 CHO-hPDL1 종양에서 [64Cu]WL12 흡수의 현저한 감소를 나타내었다(도 35G). 생체분포 연구는 AtzMab-처리된 종양에 비해 CHO-hPDL1에서 [64Cu]WL12 결합의 77% 감소를 보였는데(도 35H, 도 36D)(P < 0.0001), 이는 AtzMab에 의한 종양 PD-L1 표적화의 측정을 입증한다. PD-L1-음성 CHO 종양에서 낮은 수준의 [64Cu]WL12 흡수가 관찰되었고, 이는 AtzMab으로 처리된 hPD-L1 종양의 것과 유사하였다. 그러한 관찰은 각각 hPD-L1 및 CHO 종양에서 관찰된 강력하고 약한(week) 면역반응성에 의해 확인되었다(도 35I). 상기 결과는 [64Cu]WL12-PET가 종양에서 PD-L1 발현의 등급화된 수준을 검출할 수 있고, 단일 20mg/kg AtzMab 용량이 종양에서 광범위한 PD-L1 수준에 관여할 수 있음을 입증한다.
3.3.3. PD-L1 발현에서 동적 변화의 정량. PD-L1은 PD-L1 발현에서 동적이고 시공간적인 이질성에 기여하는 다양한 사이토카인, 중요하게는 인터페론 감마(IFNγ)에 반응하여 상향조절되는 것으로 알려져 있다(Taube, et al., 2015; Taube, et al., 2012). 생체 내에서 종양 내 유도성 PD-L1 발현을 정량하기 위한 [64Cu]WL12의 강건성을 평가하여 AtzMab 처리에 의한 상기 상향조절된 PD-L1의 차단이 [64Cu]WL12-PET에 의해 모니터링될 수 있는지를 결정하였다(도 37A, 도 37B, 도 37C, 도 37D, 도 37E 및 도 37F).
그렇게 하기 위해, 독시사이클린-유도성 PD-L1 발현을 갖는 A549 NSCLC 세포주(A549-iPD-L1)를 생성하였다. A549는 기준선에서 낮은 PD-L1을 발현하는 Kras G12S 폐 선암종 세포주이다. 이것은 올인원 렌티바이러스 pINDUCER20 벡터에서 PD-L1으로 형질도입되고(Meerbrey, et al., 2011), G418로 선택되고, PD-L1 유도에 대해 유세포분석에 의해 확인되고(도 37A) 시험관 내 및 생체 내 연구에 사용되었다. 독시사이클린-처리된 A549-iPDL1 세포에 대한 Cy5-PD-L1-mAb 결합은 WL12에 의해 차단되었고 이는 WL12의 특이성을 입증하였다(도 37B). 또한, [64Cu]WL12와 함께 세포의 인큐베이션은 독시사이클린 처리 대 미처리 및 PD-L1-낮은 A549 세포에서 방사활성 흡수의 5.5배 증가를 나타내었다(P < 0.0001). 독시사이클린-처리된 A549-iPDL1 세포에 대한 [64Cu]WL12 결합은 60 nM AtzMab, AveMab 및 DurMab의 존재 하에 현저하게 감소하였다(65%, P > 0.0001)(도 37C). 그러한 시험관 내 연구는 독시사이클린 처리 72시간 후에 A549-iPDL1 NSCLC 종양에서 [64Cu]WL12의 축적이 A549 대조군 종양에서보다 65% 더 높았음을 보여주는 생체 내 연구에 의해 입증되었다(P > 0.0001). [64Cu]WL12-PET 및 생체분포 연구에 의해 정량된 바와 같이, 종양에서 [64Cu]WL12 흡수의 상기 증가는 대조군 A549 종양과 비교하여 20 mg/kg AtzMab 처리 그룹에서 > 75% 감소하였다(도 37D 및 도 37E). 종양의 IHC 분석은 A549-iPDL1에서 강한 PD-L1 신호를 나타내었지만 A549 종양에서는 그렇지 않았고 이는 영상화 및 생체분포 결과를 확인시켜 준다(도 37F). 종합해 볼때, 상기 결과는 PD-L1 발현 수준의 동적 변화 및 AtzMab에 의한 이의 차단을 검출하는 [64Cu]WL12의 가능성을 입증한다. 따라서, PET는 표준 임상 작업 흐름 내에서 PD-L1 발현의 동적 변화를 정량하는데 핵심 역할을 담당하여, 치료 결정에 영향을 미치는 새로운 방법을 제공할 것으로 기대된다.
3.3.4. 상이한 항체에 의한 종양 PD-L1 진입의 정량. 방사선표지된 항-PD-L1 항체가 개발되었고 인간 종양 이종이식편 및 동계 뮤린 종양 모델에서 PD-L1 발현을 비침습적으로 평가할 가능성이 증명되었다(Chatterjee, et al., 2016; Heskamp, et al., 2015; Maute, et al., 2015; Deng, et al., 2016; Hettich, et al., 2016; Josefsson, et al., 2016). 상기 방사선표지된 항체 컨쥬게이트는 현재 PD-L1(NCT02453984)을 검출하고 다른 종양-특이적 단백질을 영상화하고(Gebhart, et al., 2016) 항체 동역학을 결정하기 위해 임상적으로 사용되지만, 이들의 일상적인 임상 적용은 제한적이다. 콘트라스트 및 병변 검출을 향상시키기 위해(Pandit-Taskar, et al., 2015; Oosting, et al., 2016), 빠른 제거 시간(시간 대 일)을 갖는 방사선추적자가 필요하다(Wu, 2014). 추가적인 제한은 방사선표지된 항체를 사용하여 이루어진 관찰이 조사 중인 항체에 매우 특이적이고, 각각 약동학에 영향을 미치는 원자가(valency), 모양, 크기, 등전점, 및 투여량과 같은 항체 성질에 의존적이라는 것이다. 이러한 mAb의 고유한 생물물리학적 특성은 혈장 반감기, 조직 노출, 및 궁극적으로 효능에도 영향을 미친다. (i) PD-L1 항체의 표적 진입을 설명하는 한편, (ii) mAb의 특성을 고려하고, (iii) 모든 항체에 적용될 수 있는 새로운 접근법이 필요하다.
3개의 FDA-승인된 항체, AtzMab, AveMab 및 DurMab 각각에 의한 종양에서의 PD-L1 진입을 비침습적으로 정량하는 [64Cu]WL12-PET의 능력을 평가하였다. MDAMB231 종양-보유 NSG 마우스를 AtzMab, 또는 AveMab, 또는 DurMab으로 처리하고, 24시간 후에 이들을 [64Cu]WL12-PET로 영상화하였다(도 39A, 도 39B, 도 39C, 및 도 39D). 모든 처리된 마우스에서, 신호는 종양에서 염수 대조군에 비해 낮았고, 이는 종양 PD-L1 진입으로부터 유리 PD-L1의 낮은 수준 및 mAb에 의한 방사선추적자 차단을 입증한다. 종양의 생체 외 정량은 그러한 관찰을 입증하였고 주사한지 120분 후에 염수 대조군에 비해 mAb 처리된 마우스의 종양에서 [64Cu]WL12의 약 60% 더 적은 흡수를 나타내었다(P < 0.0001)(도 39E). 염수 대조군의 IHC 분석은 종양에서 중간 내지 높은 PD-L1 강도를 나타내었다(도 39F). 상기 결과는 PD-L1 치료용 mAb에 의한 종양 PD-L1 진입이 각 항체의 독특한 생물물리학적 특성, 혈장 및 조직 동역학에 관계없이 [64Cu]WL12-PET에 의해 정량될 수 있음을 보여준다.
3.3.5. 종양에서 PD-L1 점유율에 대한 용량의 효과. 종양에서의 항체 동역학은 종양 내재적 및 외인성 파라미터 둘 모두에 의해 좌우된다(Agoram, 2009). PD-L1 발현 그 자체 이외의 요인들이 NSCLC, TNBC 및 결장 종양 내에서 PD-L1-표적화 치료용 AtzMab 및 이의 마우스 키메라(PRO304397)의 축적을 감소시킬 수 있다는 것이 최근에 발견되었다(Chatterjee, et al., 2016). 또한, 1 mg/kg 미만의 용량으로, 전신 주사된 방사선표지된 항-PD-L1 항체 PRO304397는 주로 종양 혈관계와 관련되었고, PD-L1-발현 동계 마우스 종양 모델에서 종양 실질 내로의 최소 확산을 나타내었다(Deng, et al., 2016). 그러한 결과는 내성에 기여하는 종양에서의 mAb의 축적을 방해하는 종양내 간질압 상승(Baxter, et al., 1989; Baxter, et al., 1990)과 같은 요인 때문일 수 있다(Goel, et al., 2011). 상기 효과는 또한 표적화된 종양 세포 및 면역 침윤물에 대한 큰 PD-L1-지향 제제의 접근을 방해할 수 있다. PD-L1 및 PD-1 치료제의 점유율 측정은 종양에서 보고되지 않았고 PBMC를 사용하여 이루어진 평가에 제한되었다.
종양에서 종양 PD-L1 점유율에 대한 용량의 효과를 평가하기 위해, MDAMB231 종양을 보유한 마우스에 0.009에서 24 mg/체중 kg으로 증가하는 용량의 AtzMab을 주사하였다. 24시간 후, [64Cu]WL12를 주사한지 2시간 후에 영상화 및 생체분포 연구를 수행하였다. 0.06 mg/kg을 투여받은 마우스의 PET 이미지는 미처리된 대조군과 비교하여 [64Cu]WL12 흡수에서의 차이가 없었고, 이는 종양에서 AtzMab에 의한 낮은 PD-L1 점유율을 나타낸다(도 41A). 0.6 및 3.2 mg/kg 용량에서, 종양의 신호 강도는 - 3.2 mg/kg 용량의 경우 - 종양에서 항체에 의한 거의 100% 표적 진입을 나타내며 비례적으로 감소하였다.
이후 종양에서의 축적된 방사활성(%ID/g)을 사용하여 억제성 S자형 Emax 모델에 핏팅시켰다. %ID/g 데이터는 적절하게 핏팅되었고 본 발명자들의 실험에 사용된 AtzMab의 용량과 펩티드 방사선추적자 [64Cu]WL12를 사용하여 검출되는 종양에서의 유리 PD-L1 리간드의 감소 사이의 관계를 설명하였다(도 41B 및 도 41C). 종양에서 최대 PD-L1 진입의 50%(ID50) 또는 기준선에서 유리 PD-L1 리간드의 최대 분획 감소(Imax)를 책임지는 AtzMab의 용량은 0.43 mg/kg인 것으로 추정되었다(표 2). Imax의 90% 및 96%를 책임지는 ID90 및 ID96은 각각 0.87 mg/kg 및 1.19 mg/kg에 상응하였다. 이들 용량 수준은 PRO304397의 경우 Denget 등에 의해 보고된 1 mg/kg의 용량과 유사하다. (Deng, et al., 2016) 항-PD-L1 및 키메라 항-PD-L1 항체 PRO304397(21)에 대해 50 mL/kg의 유사한 평균 Vss를 가정하면, ID50, ID90 및 ED96으로부터 초래된 예상되는 평균 혈장 농도는 각각 59 nM(8.6 mcg/mL), 120 nM(17.4 mcg/mL) 및 164 nM(23.8 mcg/mL)인 것으로 시험적으로 추정되었다. 이들 결과는 용량 선택 및 최적화를 위해 종양에서 생성된 측정치를 사용할 가능성을 나타낸다.
항체 결합이 PD-L1의 안정화 또는 내재화와 같은 PD-L1의 자연 동역학 및 항체 종양 및 혈청 동역학에 유의한 영향을 미칠 수 있는 항-치료용 항체의 개발에 영향을 미칠 수 있다는 점에서, 항체와 이들의 표적의 상호작용은 소분자와는 상이하다(Tabrizi, et al., 2006). AtzMab에 대한 이전의 약동학 연구는 0.6-1 mg/kg 미만에서 비선형 PK 및 1 mg/용량 kg 이상에서 선형 PK를 보고하였고 ATA가 발병한 환자에서 혈청 항체 농도가 감소하는 경향에 주목하였다(Stroh, et al., 2017). 그러나, PD-L1 항체 PK 및 종양에서의 점유율에 대한 종양-내재적 및 외인성 파라미터의 효과는 알려져 있지 않다.
Figure pct00010
종양에서의 항체 동역학에서 시간 변화를 검출하는 [64Cu]WL12-PET의 능력을 조사하기 위해, MDAMB231 종양-보유 NSG 마우스에 비선형 및 선형 동역학을 각각 일으키는 0.6 및 10 또는 20 mg/kg 용량의 AtzMab을 주사하고, 24 및 120 h에 PET 영상화 및 생체분포 연구를 수행하였다. 24 h에, 미처리된 대조군에 비해 3개 모두의 용량 그룹에서 종양 흡수 값에 또한 반영된 [64Cu]WL12 흡수에서의 유의한 감소가 있었다(도 41D 및 도 41E). 120 h에, 24 h에 비해 0.6 mg/kg 용량 그룹에서 [64Cu]WL12 흡수가 유의하게 증가하였다. 대조적으로, 10 또는 20 mg/kg 처리 그룹에서 [64Cu]WL12 흡수에는 유의한 시간 차이가 없었다. 120 h에, 종양의 [64Cu]WL12 흡수는 0.06 mg/kg 처리 그룹과 염수 대조 그룹에서 유사하였고, 이는 종양으로부터 약물의 제거를 시사하고, 낮은 용량의 AtzMab의 비선형 PK를 반영하였다. 상기 결과는 마우스 모델에서 PD-L1 진입의 용량- 및 시간-의존적 변화 둘 모두가 [64Cu]WL12-PET에 의해 평가될 수 있음을 보여준다.
3.3.6. 논의
면역 체크포인트 치료제는 수백 건의 임상 시험에서 조사 중이며, 그 중 약 25%는 PD-L1을 표적으로 한다. PD-L1 치료제를 투여받은 환자의 30%만이 치료에 반응하기 때문에, 이러한 요법에 대한 반응 및 내성의 분자 및 세포 기저가 전사, 유전, 및 후성 연구를 사용하여 조사 중이다. 효능과 관련된, 종양에서의 약물 축적 및 표적 포화와 용량의 관련성은 알려져 있지 않다. 추가로, 항체 치료제의 큰 크기는 종양 침투를 제한하고 작용 부위의 역학적 평가에 대한 고유한 과제를 제기한다. 종양 내재적 및 종양 외인성 파라미터 둘 모두를 설명하고, 종양에서 실시간으로 PD-L1 포화/점유율 데이터를 제공하며, 광범위하게 적용될 수 있는 효과적인 방법이 부족한 실정이다. 이러한 지식 부족은 용량 선택, 용량 최적화, 치료제 개발, 및 독성을 줄이기 위한 요법 최적화를 방해한다. 본 연구에서, 방사선표지된 PD-L1 결합 펩티드는 가변적 및 동적 PD-L1 발현 수준을 비침습적으로 검출할 수 있고 종양 내재적(PD-L1 발현, 재사용, 간질압) 및 외인성 파라미터(항체 아이소형, 동역학, ATA, 이화작용)를 설명하면서 종양에서의 점유율을 측정하는데 사용될 수 있어 종양에서 PD-L1 항체를 억제하는 PD-L1:PD-1 상호작용의 치료 활성을 모니터링하는 보편적인 수단을 제공하는 것으로 나타났다.
종양에서 PD-L1 발현을 평가하기 위한 IHC-기반 임상 시험이 이전에 개발되었지만(Herbst, et al., 2014; Roach, et al., 2016; Meng, et al., 2015), PD-L1 IHC는 단일 병변의 작은 부분(0.1%)만을 고려한다. 상기 접근법은 종양 미세환경에서의 PD-L1 발현이 공간적 및 시간적으로 이질적이고 면역 요법 반응이 지연되고, 복잡하며 본질적으로 압스코팔(abscopal) 효과를 가지므로 상당한 한계가 있다. 또한, 검사를 위해 생검으로 얻은 조직 샘플은 일반적으로 매우 제한적이고, 기존의 요법에 대한 민감성 또는 내성을 부여하는 다른 경로의 표적화 가능한 종양발생 돌연변이(예를 들어, BRCA1, BRCA2, PARP)를 확인하기 위한 분자 프로파일링에 요구될 수 있다(Nolan, et. al., 2017). 그러한 귀중한 샘플은 PD-L1 발현의 신뢰할만한 표현을 위해 다수의 PD-L1 평가를 수행하는 것을 종종 비실용적으로 만든다(Gibney, et al., 2016). 이러한 문제는 면역 체크포인트 치료제가 광범위하게 조사되는 집단인 전이성 질환을 지닌 환자에게 복합적으로 나타난다. 상기 요인들은 면역요법의 발전에 있어 제한된 성공의 원인이다. PD-L1 발현 및 보다 넓은 종양-면역 미세환경 둘 모두의 동적 성질은 TME의 신속한 평가를 가능하게 하는 PET 방사선추적자의 개발을 필요로 한다. 본원에 개시된 [64Cu]WL12에 의한 연구는 표준 임상 작업 흐름 내에서 PD-L1 발현의 가변적이고 동적인 변화를 정량할 수 있어, 환자 선택 및 모니터링 요법에 대한 중요한 임상적 의의를 제공한다.
PD-L1 치료용 항체는 암 면역요법에서 중요한 제제가 되었다. 소분자의 경우, 시험관내 결합 친화도 측정 및 점유율 연구는 CNS 질환에서 용량 선택 및 약리학적 반응의 예측에 일상적으로 사용된다(Lee, et al., 2006). 그러나, 항체와 같은 큰 분자는 시험관 내 결합 친화도에 기반하여 생체 내 수용체 점유율을 예측함에 있어 고유한 과제를 제기한다(Agoram, 2009). 종양 내의 항체 농도는 항원 밀도 및 회전율, 종양 부담, 및 mAb의 종양내 침투를 제한하는 종양 관류와 같은 몇몇 종양 내재적 파라미터에 의해 영향을 받는다. mAb의 종양 및 혈장 농도는 친화도, 용량, 환자 가변성, 악액질, 및 항-치료용 항체의 개발과 같은 종양 외인성 인자에 의해 추가 영향을 받는다(Sheng, et al., 2017). 기존의 PK/PD 예측 모델은 시험관 내 및 PBMC-기반 측정에 의존하여 최적 용량을 예측한다(Deng, et al., 2016). 그러나, 본원에 개시된 주제는 이제 PET가 종양에서 비침습적으로 치료용 항체에 의한 PD-L1 점유율을 실시간으로 측정하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
말초 약역학적 평가 및 PK/PD 모델링에 의해 뒷받침된 아테졸리주맙과 같은 방사선표지된 항체는 종양에서 요망되는 PD-L1 점유율을 달성하는데 필요한 mAb 투여 수준을 예측하는데 일상적으로 사용된다(Deng, et al., 2016). 그러한 측정 및 수학적 모델링에서 나온 점유율 예측은 항체의 혈장 및 종양 농도가 항체 아이소형 및 생물물리학적 특성, 예를 들어, 전하 및 원자가에 의해 영향을 받기 때문에 종종 주어진 항체에 특이적이고, 따라서 다른 PD-L1 mAb에 대해 그러한 관찰의 일반화가 제한된다(Kamath, 2016). PD-L1 치료용 mAb의 계속 확장되는 어레이에 대해 항체 동역학 및 종양에서의 표적 진입 잠재력을 평가하는데 사용될 수 있는 도구가 필요하다. 본원에 개시된 주제는 이러한 요구를 해결한다. WL12-PET를 사용한 시험관 내 및 생체 내 데이터와 조합된 인 실리코(in silico) 모델링 연구는 임상 시험에서 모든 PD-L1 치료용 mAb에 적용될 수 있는 개념인, 종양에서 PD-L1 포화/점유율이 정량될 수 있음을 입증한다.
총괄적으로, 본원에 개시된 데이터는 종양에서 PD-L1 발현의 동적 변화, 및 치료용 항체에 의한 PD-L1 포화/점유율이 비침습적으로 정량될 수 있음을 입증하고, 이는, 다시 말해, 항체 특성과 무관하고, 종양 내재적 및 외인성 파라미터를 설명하는 두 가지 기능을 갖는다. 세 별개의 치료용 항체 AtzMab, AveMab, DurMab에 대해, 종양에서의 PD-L1 정유율과 용량을 연결시키는 본원에 개시된 결과는 치료 반응 및 투여 효능에 대한 관련성을 가질 것으로 기대된다.
3.3.7. 요약.
본원에 개시된 주제는 방사선표지된 PD-L1 결합 펩티드가 가변적 및 동적 PD-L1 발현 수준을 비침습적으로 검출할 수 있고 종양 내재적(PD-L1 발현, 재사용, 간질압) 및 외인성 파라미터(항체 아이소형, 동역학, ATA, 이화작용)를 설명하면서 종양에서의 점유율을 측정하는데 사용될 수 있어 종양에서 PD-L1 항체를 억제하는 PD-L1:PD-1 상호작용의 치료 활성을 모니터링하는 보편적인 수단을 제공함을 입증한다.
[64Cu]WL12에 의한 연구는 표준 임상 작업 흐름 내에서 PD-L1 발현의 가변적이고 동적인 변화를 정량할 수 있어, 환자 선택 및 모니터링 요법에 대한 중요한 임상적 의의를 제공한다.
항체에 대한 기존의 PK/PD 예측 모델은 시험관 내 및 PBMC-기반 측정에 의존하여 최적 용량을 예측한다(Deng, et al., 2016). 그러나, 본원에 개시된 주제는 PET가 종양에서 비침습적으로 치료용 항체에 의한 PD-L1 점유율을 실시간으로 측정하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
PD-L1 치료용 mAb의 계속 확장되는 어레이에 대해 항체 동역학 및 종양에서의 표적 진입 잠재력을 평가하는데 사용될 수 있는 도구가 필요하다. 본원에 개시된 주제는 이제 이러한 요구를 해결하였다. WL12-PET를 사용한 시험관 내 및 생체 내 데이터와 조합된 인 실리코 모델링 연구는 임상 시험에서 모든 PD-L1 치료용 mAb에 적용될 수 있는 개념인, 종양에서 PD-L1 포화/점유율이 정량될 수 있음을 입증한다.
참고문헌
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 본원에 개시된 주제가 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌(예를 들어, 웹사이트, 데이터베이스 등)은 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 포함된다고 언급된 것과 동일한 정도로 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 다수의 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌이 본원에 언급되었지만, 그러한 참고문헌은 이들 문헌 중 임의의 것이 당 분야의 보통의 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 명세서와 임의의 포함된 참고문헌 간에 상충이 있는 경우, 본 명세서(포함된 참고문헌에 기반할 수 있는 이의 임의의 보정서 포함)가 우선할 것이다. 달리 언급하지 않는 한 용어의 표준 분야-허용되는 의미가 본원에서 사용된다. 다양한 용어에 대한 표준 약어가 본원에서 사용된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
전술한 주제가 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되었으나, 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
서열 목록:
SEQ ID NO.: 1
WL12 아미노산 서열 = 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Leu-Hyp-Trp-Ser-Trp(메틸)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2)
SEQ ID NO.: 2
DK-A-221 아미노산 서열 = 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(카르복시메틸)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2

Claims (53)

  1. 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드 및 보고 모이어티의 컨쥬게이트, 및 선택적으로 링커를 포함하는 영상화 제제로서, 상기 링커가 존재하는 경우, 이것은 상기 펩티드 및 상기 보고 모이어티를 연결시키고, 상기 링커가 부재하는 경우, 상기 보고 모이어티는 상기 펩티드의 아미노산의 1차 아민을 통해 상기 펩티드에 직접 부착되는, 영상화 제제.
  2. 제1항에 있어서, PD-L1에 결합 특이성을 갖는 펩티드가 PD-L1의 아미노산 Y56, E58, A113, M115, 및 Y123과 상호작용하는 영상화 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드가 펩티드 WL12, DK-A-221, 또는 DK-A-222와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 영상화 제제.
  4. 제3항에 있어서, 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드가 펩티드 WL12, DK-A-221, 또는 DK-A-222와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 영상화 제제.
  5. 제4항에 있어서, 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1) 영상화 제제에 결합 특이성을 갖는 펩티드가 펩티드 WL12, DK-A-221, 또는 DK-A-222와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 영상화 제제.
  6. 제5항에 있어서, 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)에 결합 특이성을 갖는 펩티드가 펩티드 WL12, DK-A-221, 또는 DK-A-222와 100% 서열 동일성을 갖는 영상화 제제.
  7. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 킬레이팅제, 방사선표지된 기질, 형광 염료, 광음향 보고 분자, 및 Raman-활성 보고 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  8. 제7항에 있어서, 보고 모이어티가 킬레이팅제이고 상기 킬레이팅제가 DOTAGA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데세칸,1-(글루타르산)-4,7,10-트리아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTASA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-(2-석신산)-4,7,10-트리아세트산), CB-DO2A(10-비스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자바이사이클로[5.5.2]테트라데칸), DEPA(7-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-4,10-비스-카르복시메틸-1,4,7,10-테트라아자-사이클로도덱-1-일-아세트산)), 3p-C-DEPA(2-[(카르복시메틸)][5-(4-니트로페닐-1-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]펜탄-2-일)아미노]아세트산)), TCMC(2-(4-이소티오시아노토벤질)-1,4,7,10-테트라아자-1,4,7,10-테트라-(2-카르바모닐 메틸)-사이클로도데칸), 옥소-DO3A(1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-5-S-(4-이소티오시아나토벤질)-4,7,10-트리아세트산), p-NH2-Bn-옥소-DO3A(1-옥사-4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-5-S-(4-아미노벤질)-4,7,10-트리아세트산), TE2A((1,8-N,N'-비스-(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸), MM-TE2A, DM-TE2A, CB-TE2A(4,11-비스(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸), CB-TE1A1P(4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1-(메탄포스폰산)-8-(메탄카르복실산), CB-TE2P(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,8-비스(메탄포스폰산), TETA(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), NOTA(1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산), NODA(1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세테이트); NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산), (NOTAGA) 1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산 DFO(데스페록사민), NETA([4-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-7-카르복시메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일}-아세트산), TACN-TM(N,N',N", 트리스(2-메르캅토에틸)-1,4,7-트리아자사이클로노난), Diamsar(1,8-디아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로(6,6,6)에이코산, 3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민), Sarar(1-N-(4-아미노벤질)-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6] 에이코산-1,8-디아민), AmBaSar(4-((8-아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로 [6.6.6] 이코산-1-일아미노) 메틸) 벤조산), 및 BaBaSar로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  9. 제7항에 있어서, 킬레이팅제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제:
    Figure pct00021
  10. 제7항에 있어서, 보고 모이어티가 킬레이팅제이고 상기 킬레이팅제가 94mTc, 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 55Co, 57Co, 47Sc, 225Ac, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 153Sm, 166Ho, 152Gd, 82Rb, 89Zr, 및 166Dy로 구성된 군으로부터 선택된 방사선금속을 추가로 포함하는 영상화 제제.
  11. 제7항에 있어서, 보고 모이어티가 방사선표지된 기질이고 상기 방사선표지된 기질이 11C, 13N, 15O, 123I, 124I, 125I, 126I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br, 80Br, 80mBr, 82Br, 83Br, 18F, 및 211At로 구성된 군으로부터 선택된 방사성동위원소를 포함하는 영상화 제제.
  12. 제11항에 있어서, 방사선표지된 기질이 18F-표지된 기질을 포함하는 영상화 제제.
  13. 제12항에 있어서, 18F-표지된 기질이 2-플루오로-PABA, 3-플루오로-PABA, 2-플루오로-만니톨, 및 N-석신이미딜-4-플루오로벤조에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  14. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 펩티드 내에 직접 혼입되는 영상화 제제.
  15. 제14항에 있어서, 보고 모이어티가 펩티드의 방사선표지된 아미노산을 포함하는 영상화 제제.
  16. 제15항에 있어서, 방사선표지된 아미노산이 아이오도티로신 및 플루오로티로신으로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  17. 제7항에 있어서, 보고 모이어티가 형광 염료이고 상기 형광 염료가 카르보시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 튜이카르보시아닌, 메로시아닌, 폴리메틴, 쿠마린, 로다민, 크산텐, 플루오레세인, 보론-디피로메탄(BODIPY) 염료, Cy5, Cy5.5, Cy7, VivoTag-680, VivoTag-S680, VivoTag-S750, AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor700, AlexaFluor750, AlexaFluor790, Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, Dy780, DyLight547, Dylight647, HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 680, HiLyte Fluor 750, IR Dye 800, IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 700DX, ADS780WS, ADS830WS, 및 ADS832WS로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  18. 제7항에 있어서, 보고 모이어티가 광음향 보고 분자이고 상기 광음향 보고 분자가 염료 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  19. 제18항에 있어서, 염료가 형광 염료를 포함하는 영상화 제제.
  20. 제19항에 있어서, 형광 염료가 인도시아닌-그린(ICG), Alexa Fluor 750, Evans Blue, BHQ3, QXL680, IRDye880CW, MMPSense 680, 메틸렌 블루, PPCy-C8, 및 Cypate-C18로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  21. 제18항에 있어서, 나노입자가 플라스몬 나노입자, 퀀텀닷, 나노다이아몬드, 폴리피롤 나노입자, 구리 설파이드 나노입자, 그래핀 나노시트, 산화철-금 코어-셀 나노입자, Gd2O3 나노입자, 단일벽 카본 나노튜브, 염료-부하 퍼플루오로카본 나노입자, 및 초상자성 산화철 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  22. 제7항에 있어서, 보고 모이어티가 Raman-활성 보고 분자이고 상기 Raman-활성 보고 분자가 단일벽 카본 나노튜브(SWNT) 및 표면-강화 Raman 산란(SERS) 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  23. 제22항에 있어서, SERS 제제가 Raman-활성 리포터 분자로 표지된 금속 나노입자를 포함하는 영상화 제제.
  24. 제23항에 있어서, Raman-활성 리포터 분자가 형광 염료를 포함하는 영상화 제제.
  25. 제24항에 있어서, 형광 염료가 Cy3, Cy5, 로다민, 및 캘코게노피릴륨 염료로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  26. 제7항에 있어서, 링커가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제:
    (a)
    Figure pct00022

    상기 식에서, Rpt는 보고 모이어티이고;
    W1은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 사이클로알킬렌, 및 아릴렌으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    W2는 -NR1-(C=O)-, -NR1-(C=S)-, -(C=O)-NR1-, -(C=S)-NR1-, 및 -S-로 구성된 군으로부터 선택되고, 이 때 각각의 R1은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이고;
    각각의 R2는 독립적으로 H 또는 -COOR3이고, 이 때 각각의 R3는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C12 아릴 또는 C4-C16 알킬아릴이고;
    b는 0, 1, 2, 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    d는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    물결선은 링커와 펩티드 사이의 부착점을 나타낸다;
    (b)
    Figure pct00023

    상기 식에서, Rpt는 보고 모이어티이고;
    X 및 Z는 각각 독립적으로 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C1-C8 헤테로알킬, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 헤테로알키닐, C1-C8 알콕시, 또는 결합이고, 이들 각각은 0-5개의 RA로 치환될 수 있고;
    Y 및 W3는 각각 독립적으로 -O-, -S(O)p-, -NH-, -NRB-, -CH=CH-, -CRB=CH-, -CH=CRB-, -NH-CO-, -NH-CO2-, -NRB-CO-, -NRB-CO2-; -CO-NH-, -CO2-NH-, -CO-NRB-, -CO2-NRB-, 또는 결합이고;
    p는 0, 1, 또는 2이고;
    RA는, 각 경우에, 할로겐, 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, CO2H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 모노 또는 디알킬아미노, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 알킬설피닐, 선택적으로 치환된 알킬설포닐, 선택적으로 치환된 모노- 또는 디알킬카르복사미드, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고; RB는, 각 경우에, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 모노 또는 디알킬아미노, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다; 또는
    (c) 아미노산 링커.
  27. 제1항에 있어서, 영상화 제제가 하기 화학식 (I), 화학식 (II), 및 화학식 (III)의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제:
    Figure pct00024

    DK-A-221-(L)n-Rpt (II); 또는
    DK-A-222-(L)n-Rpt (III);
    상기 식에서, n은 0 및 1로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    L은 링커이고;
    Rpt는 보고 모이어티이고;
    상기 보고 모이어티 또는 링커가 존재하는 경우, 이는 화학식 (I), 화학식 (II), 또는 화학식 (III)의 영상화 제제를 포함하는 펩티드의 아미노산의 1차 아민기에 부착된다.
  28. 제27항에 있어서, 링커는, 존재하는 경우, 화학식(I)의 화합물의 13오르니틴(Orn) 1차 아민기에 부착되는 영상화 제제.
  29. 제27항에 있어서, 보고 모이어티가 DOTAGA 킬레이팅제를 포함하는 영상화 제제.
  30. 제29항에 있어서, DOTAGA 킬레이팅제가 64Cu 방사선금속을 추가로 포함하는 영상화 제제.
  31. 제27항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 다음과 같은 영상화 제제:
    Figure pct00025
  32. 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하는 영상화 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 유효량의 영상화 제제를 제공하는 단계;
    (b) 하나 이상의 세포 또는 조직을 상기 영상화 제제와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 이미지를 생성하여 PD-L1을 검출하는 단계를 포함하는, 영상화 방법.
  33. 제32항에 있어서, 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화 제제와 접촉시키는 단계가 시험관 내, 생체 내, 또는 생체 외에서 수행되는 영상화 방법.
  34. 제33항에 있어서, 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화 제제와 접촉시키는 단계가 대상체에서 수행되는 영상화 방법.
  35. 제34항에 있어서, 대상체가 인간, 래트, 마우스, 고양이, 개, 말, 양, 소, 원숭이, 조류 또는 양서류인 영상화 방법.
  36. 제32항에 있어서, PD-L1의 검출이 대상체에게 영상화 제제를 투여한지 약 60-120분 후 또는 그 이내에 발생하는 영상화 방법.
  37. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 암을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  38. 제37항에 있어서, 암이 모세포종, 암종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 두부암, 경부암, 두경부암, 폐암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 전립선암, 결장직장암, 식도암, 위암, 백혈병/림프종, 자궁암, 피부암, 내분비암, 요도암, 췌장암, 위장암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 뇌암, 선종, 및 전이성 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 제제.
  39. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 고형 암을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  40. 제39항에 있어서, 고형 종양이 뇌, 결장, 유방, 전립선, 간, 신장, 폐, 식도, 두경부, 난소, 자궁경부, 위, 직장, 방광, 자궁, 고환, 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 기관에 있는 영상화 방법.
  41. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 감염을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  42. 제41항에 있어서, 감염이 미생물 감염인 영상화 방법.
  43. 제42항에 있어서, 미생물 감염이 마이코박테리움 투베르쿨로리스, E. 콜리, 클렙시엘라 종, 엔테로박터 종, 프로테우스 종, 세라티아 마르세센스, 슈도모나스 아에루기노사, S. 아우레우스 및 coag.-음성 스태필로코쿠스를 포함하는 스태필로코쿠스 종, 엔테로코쿠스 종, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 헤모필루스 인플루엔자, 박테로이데스 종, 아시네토박터 종, 헬리코박터 종, 캔디다 종, 메티실린-내성 스태필로코쿠스 아우레우스(MRSA) 및 반코마이신-내성 엔테로코쿠스 파에칼리스(VRE)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물로 인한 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 방법.
  44. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 염증을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  45. 제44항에 있어서, 염증이 천식, 자가면역 질환, 자가염증성 질환, 셀리악병, 게실염, 사구체신염, 화농 땀샘염, 과민증, 염증성 장 질환, 간질성 방광염, 이염, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 이식 거부, 루푸스, 전신홍반루푸스, 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택된 장애와 관련되는 영상화 제제.
  46. 제45항에 있어서, 염증이 류마티스 관절염 또는 전신홍반루푸스에 의해 유발되는 영상화 방법.
  47. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 종양 내의 하나 이상의 면역 세포를 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  48. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 종양 또는 대상체 내의 면역 세포의 전신 분포를 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  49. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 감염성 질환에 대한 면역 세포 반응을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  50. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 염증성 질환에 대한 종양 또는 정상 조직 반응에서의 면역 세포 반응을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  51. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 대상체의 PD-L1 발현 수준을 검출하는 영상화 방법.
  52. 제32항에 있어서, 영상화 방법이 대상체의 종양 부위 또는 정상 조직에서 항체 또는 펩티드 또는 PD-L1의 저분자량 제제에 의한 점유율 또는 표적 진입을 측정하는 영상화 방법.
  53. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 영상화 제제를 포함하는 프로그램된 세포사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 키트.
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