JP7298103B2 - 免疫療法のためのマクロファージの遺伝子組換え - Google Patents
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Description
本願は、2015年9月9日に出願された米国仮出願第62/216,224号「免疫療法のためのマクロファージの遺伝子組換え」および2016年7月12日に出願された米国仮出願第62/361,348号「免疫療法のためのマクロファージの遺伝子組換え」の優先権を主張するものであり、これらの内容はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。
本発明は、Steven Higgins Brain Tumor Research FundおよびSarah M Hughes財団からの助成を一部受けてなされたものである。
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、Sequence SCRI.101WO.TXTのファイル名で2016年9月6日に作成された46kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
以下の説明では、様々な用語を広い意味で使用する。本発明の実施形態の理解を容易にするため、用語の定義を以下に記載する。
腫瘍微小環境(TME)を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が開示される。腫瘍微小環境は腫瘍を含んでいてもよい。前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および/もしくは活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第1のベクターを免疫細胞に送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第1のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および/またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および/または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目~136番目のアミノ酸配列(KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI(配列番号7))を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン(XCL1)、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(Tcr)を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第2のベクターを前記免疫細胞に送達すること;および前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第2のベクターまたは第3のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする。いくつかの実施形態において、第2のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記方法は、第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第4のベクターを前記免疫細胞に送達すること;ならびに前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第2のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第4のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも1つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。いくつかの実施形態において、第1のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)/ガンシクロビル(GCV)自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。
好ましい実施形態のいくつかによれば、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第1のベクターを含む遺伝子組換え免疫細胞が提供される。第1のベクターは、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境(TME)を改変するための前記遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第1のベクターを免疫細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
好ましい実施形態のいくつかによれば、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第1のベクターを含む遺伝子組換え免疫細胞が提供される。第1のベクターは、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および/もしくは活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境(TME)を改変するための前記遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および/もしくは活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第1のベクターを免疫細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物は、がん、疾患または感染症に罹患している対象(たとえばヒト)において腫瘍環境を改変するために使用される。本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍環境の改変を必要とする患者は、不応性再発神経芽腫に罹患している小児年齢の患者である。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象(たとえばヒト)において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の1種以上を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および/または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象(たとえばヒト)において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の1種以上を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および/または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象(たとえばヒト)において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記対象(たとえばヒト)に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および/または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定することを含む方法が提供される。
実施したいくつかの実験において、ドナーのPBMCからCD14+単球を単離し、M1様マクロファージに分化させ、次いで骨髄系細胞に特異的なレンチウイルスを感染させた。感染させたマクロファージをqPCR、Bioplexアッセイおよびフローサイトメトリーで試験し、IL12、TNFαおよび/またはI型インターフェロンなどの炎症促進性サイトカインの発現のアップレギュレーションについて調べた。また、CAR T細胞の存在下および非存在下において、この遺伝子組換えマクロファージ(GEM)が膠芽腫マウスモデルの頭蓋内腫瘍の成長を遅延させることができるかどうかを試験した。
マクロファージの浸潤を調べるため、マウスの高悪性度神経膠腫を使用して実験を行った。図1Aは、正常細胞、グレード1の神経膠腫、グレード2の神経膠腫、グレード3の神経膠腫、グレード4の神経膠腫、および髄膜腫を示す。図1A~1Dに示すように、高悪性度の神経膠腫は、顕著なマクロファージ浸潤を示す。
200,000個のU87腫瘍細胞を8週齢のNSGマウスに頭蓋内注射した。28日後に脳を摘出し、冠状方向に切断した組織をパラフィン包埋固定した。組織を5μmに薄切し、1:100に希釈したラット抗F4/80(シグマ)で染色した後、ヤギ抗ラットHRP(Life technologies)で染色し、Alexa488を組み合わせたチラミドシグナル増幅法を用いて検出した。ニコンEclipse Ciを用いてスライドを撮影し、タイリング法によって10×1720の画像を得た。移植したU87腫瘍に動員されたマウスマクロファージを示す染色スライドを図2に示す。
正常ヒトPBMCからCD14+細胞を単離し、25nM/mlのM-CSFで6日間処理した。得られた単球由来マクロファージ(MDM)に、Vpx含有GFPレポーターレンチウイルス(pLenti-CMV-eGFP)粒子をマクロファージ1個あたり0個、88個、220個または308個感染させることによって形質導入した。13日目にトリプシン処理を行ってMDMを回収し、抗HLA-DR-PE Cy7で染色し、フローサイトメトリーでGFPの発現を分析した。MDM1個あたり0個、88個、220個または308個のLV粒子を有するMDMを分析したフローサイトメトリーの結果を図3に示す。
GFPおよびルシフェラーゼをコードするレンチウイルスを用いてMDMに形質導入し、30日後にフローサイトメトリーを実施してGFPの発現を評価した(図4A)。0日目に2×105個の野生型U87細胞を頭蓋内注射したNSGマウスの画像を図4Bに示す。発光バックグラウンドは6日目に測定した。U87細胞を注射した7日目に、1.44×105個のルシフェラーゼ発現GEM(パネルAにおいて65.5%を占めたGFP+マクロファージ)を注射し、週2回画像を撮影した。図4Bおよび図4Cは縦方向のGEMの発光シグナルを示す。
MDMにおいてTGFβRIIを発現させるための図5に示すベクターを用いて、免疫細胞をトランスフェクトした。GM-CSFを用いて初代単球から分化誘導したマクロファージを、抗HLA-DR-PE-Cy7抗体および抗TGFβRII-488抗体で染色し、FCMで分析した。その結果を図6A(上パネル)に示す。HLA-DR+細胞(細胞集団の98%)のMFIを図6C(下パネル)に示す。SBE(SMAD binding element)-ルシフェラーゼレポーターおよび/またはdnTGFβRIIを発現する293T細胞を1ng/mLのTGFβ1で3時間処理した結果を図6Bに示す。
単球由来マクロファージ(MDM)においてPD-1/IFNα融合タンパク質を発現させるための図5に示すベクターを用いて、免疫細胞をトランスフェクトした。図7Aに示すように、形質導入されたH9細胞は、PD-1/IFNα融合タンパク質(PIFP)を分泌する。H9親細胞またはPD1:IFNαを形質導入したH9細胞から回収した上清を濃縮し、電気泳動にかけ、IFNαタンパク質が有する2Aタグに対するモノクローナル抗体(左:1:5000)または抗PD1モノクローナル抗体(右:1:250)を用いてウエスタンブロットを行った。また、H9親細胞またはPD1:IFNαを形質導入したH9細胞にブレフェルジンAを添加して培養した後、各細胞を固定し、透徹し、蛍光色素結合抗体で細胞内染色した結果を図7Bに示す。抗IFNα抗体(左)および抗PD1抗体(右)を使用したFCMで細胞を分析した。
図8に示すように、レンチウイルスパッケージング成分(gag-pol、vsv-gおよびrev)をコードするプラスミド、導入される目的遺伝子(ピンク色)をepHIV7レンチウイルス骨格中にコードするプラスミド、および骨髄系細胞への形質導入を可能にするための因子Vpxをコードするプラスミドを293T細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、Vpxタンパク質を含めてパッケージングしたビリオンを293T細胞の上清から精製した。このVpx含有ウイルスを骨髄単核細胞(MMC)(初代ヒト単球またはインビトロで分化誘導したマクロファージ)に感染させた。過去に報告されているように、MMCによって発現される制限因子SAMHD1がVpxによって分解されることによって、ウイルスの逆転写酵素が不活性化され、安定した遺伝子の組み込みと発現が可能となる。Vpxタンパク質とともにパッケージングしたレンチウイルスベクターを使用することによって、骨髄系細胞の安定したトランスフェクションが可能となる。
初代ヒト末梢血単球や単球由来マクロファージなどの骨髄単核細胞(MMC)は、レンチウイルスを感染させることができる。図10Aに示したように、第1のプロトコルでは、磁気分離によって末梢血単球(PBMC)からCD14+単球を単離し、10ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を添加して培養することによって炎症促進性の表現型へと分化させるか、あるいは25ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加して培養することによって抗炎症性の表現型へと分化させる。分化の7日後に、Vpx含有レンチウイルスをマクロファージに感染させ、1週間後に導入遺伝子が安定して発現された後、実験に使用した。感染の7日後(CD14+単球を単離した14日後)までには、導入遺伝子を発現するマクロファージの割合は95%を超える。図10Bに示したように、PBMCからCD14+単球を単離し、これと同じ日にVpx含有レンチウイルスに感染させ、次いでGM-CSFまたはM-CSFを用いて7日間培養することによって分化誘導する。この場合も7日間培養した後には、導入遺伝子を発現するマクロファージの割合は95%を超える。
GM-CSFで分化誘導したマクロファージにレンチウイルスを感染させるには、レンチウイルスをVpxとともにパッケージングすることが必要である。マクロファージまたは単球にウイルスを感染させなかったもの、Vpxを除いてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたもの、またはVpxを含めてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたものをフローサイトメトリーで分析し、プロットの右側に示した時間点におけるGFPおよびHLA-DRの共発現(図11A)またはGFPおよびCD11bの共発現(図11B)を調べた。プロットの右側に示した時間点は、MMCのうち単球(感染0日目)およびマクロファージ(感染7日目)の感染を示す。
M-CSFで分化誘導したマクロファージにレンチウイルスを感染させるには、レンチウイルスをVpxとともにパッケージングすることが必要である。CD14+細胞を単離し、7日目のマクロファージにウイルスを感染させなかったもの、Vpxを除いてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたもの、またはVpxを含めてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたものを準備し、21日目にフローサイトメトリーを使用してGFPおよびHLA-DRの共発現(図12A)またはGFPおよびCD11bの共発現(図12B)を分析した。
Bloodworks Northwestから健常ドナーの全血および成分分離血液製剤を得た(Seattle Children’s Research Institute IRB# 14412)。標準プロトコルを使用して、Ficoll-Paque密度勾配(GEヘルスケア)によってPBMCを単離した15。メーカーのプロトコルに従ってEasySep Human CD14 Positive Selection Kit(Stemcell Technologies)を使用して、PBMCからCD14+単球を精製した(Noble PB, Cutts JH. Separation of blood leukocytes by Ficoll gradient. Can Vet J 1967;8:110-111;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。
単離したCD14+単球は、250,000個/cm2の密度を超えないように、25ng/mLのM-CSFまたは10ng/mLのGM-CSF(R&Dシステムズ)の存在下において、組織培養処理プラスチックディッシュ(コーニング)中のマクロファージ培地(10%FBS(Hyclone)を添加したRPMI1640培地(Gibco))に37℃、5%CO2で播種した。播種の72時間後、培地の半量を、最終濃度25ng/mlのM-CSFまたは10ng/mlのGM-CSFを添加した新鮮なマクロファージ培地と交換した。単離の6日後には単球がマクロファージに完全に分化したと見なした。必要に応じて0.25%トリプシン(Gibco)を加え、穏やかに掻き取って細胞を剥がし、再播種することができた。
単離したCD14+単球を、Spadaroらのプロトコルに従って樹状細胞(DC)に分化誘導した(Spadaro M, Montone M, Arigoni M et al. Recombinant human lactoferrin induces human and mouse dendritic cell maturation via Toll-like receptors 2 and 4. FASEB J 2014;28:416-429;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。具体的には、10%FBS、100ng/mL GM-CSFおよび50ng/mL IL-4(R&Dシステムズ)を添加したRPMI-1640にCD14+細胞を播種した。72時間後に培地を交換し、新鮮なサイトカインを加えた。
特に記載がない限り、コンストラクトはいずれも、Michael Jensen博士(Seattle Children’s Research Institute)から供与されたepHIV7レンチウイルス骨格またはepHIV7.2レンチウイルス骨格を使用して作製した。epHIV7において、pHIV7のCMVプロモーター(Yam PY, Li S, Wu J et al. Design of HIV vectors for efficient gene delivery into human hematopoietic cells. Mol Ther 2002;5:479-484;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)をEF1αプロモーターと置換した。epHIV7.2は、EF1αプロモーターを最小EF1αプロモーター(HTLV-1ドメインを持たない)と置換し、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と置換した。緑色蛍光タンパク質-ホタルルシフェラーゼ(GFP-ffluc)融合タンパク質は過去に報告されている(Brown CE, Starr R, Martinez C et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Res 2009;69:8886-8893;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。epHIV7骨格中に含まれるGFP-fflucは、Michael Jensen博士から供与された。緑色蛍光タンパク質-ホタルルシフェラーゼ(GFP-ffluc)融合タンパク質は、配列番号29に示される配列によってコードされる(atggaggatgccaagaatattaagaaaggccctgccccattctaccctctggaagatggcactgctggtgagcaactgcacaaggccatgaagaggtatgccctggtccctggcaccattgccttcactgatgctcacattgaggtggacatcacctatgctgaatactttgagatgtctgtgaggctggcagaagccatgaaaagatatggactgaacaccaaccacaggattgtggtgtgctctgagaactctctccagttcttcatgcctgtgttaggagccctgttcattggagtggctgtggcccctgccaatgacatctacaatgagagagagctcctgaacagcatgggcatcagccagccaactgtggtctttgtgagcaagaagggcctgcaaaagatcctgaatgtgcagaagaagctgcccatcatccagaagatcatcatcatggacagcaagactgactaccagggcttccagagcatgtatacctttgtgaccagccacttaccccctggcttcaatgagtatgactttgtgcctgagagctttgacagggacaagaccattgctctgattatgaacagctctggctccactggactgcccaaaggtgtggctctgccccacagaactgcttgtgtgagattcagccatgccagagaccccatctttggcaaccagatcatccctgacactgccatcctgtctgtggttccattccatcatggctttggcatgttcacaacactggggtacctgatctgtggcttcagagtggtgctgatgtataggtttgaggaggagctgtttctgaggagcctacaagactacaagatccagtctgccctgctggtgcccactctgttcagcttctttgccaagagcaccctcattgacaagtatgacctgagcaacctgcatgagattgcctctggaggagcacccctgagcaaggaggtgggtgaggctgtggcaaagaggttccatctcccaggaatcagacagggctatggcctgactgagaccacctctgccatcctcatcacccctgaaggagatgacaagcctggtgctgtgggcaaggtggttcccttttttgaggccaaggtggtggacctggacactggcaagaccctgggagtgaaccagaggggtgagctgtgtgtgaggggtcccatgatcatgtctggctatgtgaacaaccctgaggccaccaatgccctgattgacaaggatggctggctgcactctggtgacattgcctactgggatgaggatgagcactttttcattgtggacaggctgaagagcctcatcaagtacaaaggctaccaagtggcacctgctgagctagagagcatcctgctccagcaccccaacatctttgatgctggtgtggctggcctgcctgatgatgatgctggagagctgcctgctgctgttgtggttctggagcatggaaagaccatgactgagaaggagattgtggactatgtggccagtcaggtgaccactgccaagaagctgaggggaggtgtggtgtttgtggatgaggtgccaaagggtctgactggcaagctggatgccagaaagatcagagagatcctgatcaaggccaagaagggtggcaaa)。EGFP:ffluc-T2A-CD19tは、配列番号34に示される配列によってコードされる(atggaggatgccaagaatattaagaaaggccctgccccattctaccctctggaagatggcactgctggtgagcaactgcacaaggccatgaagaggtatgccctggtccctggcaccattgccttcactgatgctcacattgaggtggacatcacctatgctgaatactttgagatgtctgtgaggctggcagaagccatgaaaagatatggactgaacaccaaccacaggattgtggtgtgctctgagaactctctccagttcttcatgcctgtgttaggagccctgttcattggagtggctgtggcccctgccaatgacatctacaatgagagagagctcctgaacagcatgggcatcagccagccaactgtggtctttgtgagcaagaagggcctgcaaaagatcctgaatgtgcagaagaagctgcccatcatccagaagatcatcatcatggacagcaagactgactaccagggcttccagagcatgtatacctttgtgaccagccacttaccccctggcttcaatgagtatgactttgtgcctgagagctttgacagggacaagaccattgctctgattatgaacagctctggctccactggactgcccaaaggtgtggctctgccccacagaactgcttgtgtgagattcagccatgccagagaccccatctttggcaaccagatcatccctgacactgccatcctgtctgtggttccattccatcatggctttggcatgttcacaacactggggtacctgatctgtggcttcagagtggtgctgatgtataggtttgaggaggagctgtttctgaggagcctacaagactacaagatccagtctgccctgctggtgcccactctgttcagcttctttgccaagagcaccctcattgacaagtatgacctgagcaacctgcatgagattgcctctggaggagcacccctgagcaaggaggtgggtgaggctgtggcaaagaggttccatctcccaggaatcagacagggctatggcctgactgagaccacctctgccatcctcatcacccctgaaggagatgacaagcctggtgctgtgggcaaggtggttcccttttttgaggccaaggtggtggacctggacactggcaagaccctgggagtgaaccagaggggtgagctgtgtgtgaggggtcccatgatcatgtctggctatgtgaacaaccctgaggccaccaatgccctgattgacaaggatggctggctgcactctggtgacattgcctactgggatgaggatgagcactttttcattgtggacaggctgaagagcctcatcaagtacaaaggctaccaagtggcacctgctgagctagagagcatcctgctccagcaccccaacatctttgatgctggtgtggctggcctgcctgatgatgatgctggagagctgcctgctgctgttgtggttctggagcatggaaagaccatgactgagaaggagattgtggactatgtggccagtcaggtgaccactgccaagaagctgaggggaggtgtggtgtttgtggatgaggtgccaaagggtctgactggcaagctggatgccagaaagatcagagagatcctgatcaaggccaagaagggtggcaaaGgcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttct)。epHIV7.2レンチウイルスベクターおよびepHIV7:GFP-ffluc、ならびにdnTGFBRII-t2a-Her2tgおよびsTGFBRII-t2a-Her2tgは、Michael Jensen博士の厚意により供与された。T2A-sTGFBRIIは、配列番号32に示される配列によってコードされる(Ggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgggtcgggggctgctcaggggcctgtggccgctgcacatcgtcctgtggacgcgtatcgccagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggagaagaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaatga)。mCherryコンストラクトは、ギブソンクローニングによってHIV7.2のNheI/NotIに挿入することによって作製した。過去に報告されている可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体II(sTβRII)コンストラクトを作製するため(Rowland-Goldsmith MA, Maruyama H, Kusama T et al. Soluble type II transforming growth factor-beta (TGF-beta) receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357 pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation. Clin Cancer Res 2001;7:2931-2940.;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)、ヒトTGFβRIIアイソフォームAの細胞外部分(aa 1-159;NCBI accession # NP_001020018.1)を、epHIV7.2のNheI/NotI部位にクローニングした。末端切断型CD19(CD19t)(Sato S, Miller AS, Howard MC et al. Regulation of B lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu 13 complex requires the cytoplasmic domain of CD19. J Immunol 1997;159:3278-3287;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)は、ギブソンクローニングによってsTβRII遺伝子の上流に挿入し、CD19tとsTβRII遺伝子の間にT2A配列を配置した。IL-21プラスミドは、オリジーン社から購入し(NCBI RefSeq NM_021803に示されるコード配列を含むプラスミドRC215235)、epHIV7.2のNheI/NotIにクローニングした。CD19t(Sato S, Miller AS, Howard MC et al. Regulation of B lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu 13 complex requires the cytoplasmic domain of CD19. J Immunol 1997;159:3278-3287;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)は、ギブソンクローニングによってIL-21遺伝子の下流に挿入し、CD19tとIL-21遺伝子の間にT2A配列を配置した。このIL-21-T2A配列(配列番号16;Gccaccatgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgctttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagattcc)のギャップは、フォワードプライマー(配列番号14;ccgccagaacacagctggctagcgccaccatgagatccagtcctggcaac)およびリバースプライマー(配列番号15;tgtcaccaggagaagcatcctagggccgggattctc)を使用して埋めた。また、EGFRt-P2A-可溶性VEGF受容体(配列番号28に示される配列によってコードされる)を発現する細胞を製造することもできる。LentiCRISPRv2ベクターはFeng Zhang氏(Addgeneプラスミド#52961)から供与されたものであり、IL-10を標的とするガイド配列(TGTTGCCTGGTCCTCCTGAC(配列番号1))およびPD-L1を標的とするガイド配列(TCCAGATGACTTCGGCCTTG(配列番号2))は、標準的なプロトコルを使用してBsmB1部位に挿入した(Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods 2014;11:783-784およびShalem O, Sanjana NE, Hartenian E et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014;343:84-87;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。末端切断型上皮成長因子受容体(EGFRt)(Wang X, Chang WC, Wong CW et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood 2011;118:1255-1263;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)エピトープタグを挿入して、ピューロマイシン耐性配列と置換した。可溶性TGFβRII(sTGFβRII)コンストラクトを作製するため、ヒトTGFβRIIアイソフォームAの細胞外部分(aa 1-166;NCBI accession # NP_001020018.1)をGen9社から購入し、epHIV7.2のNheI/NotI部位にクローニングした。IL-21プラスミドは、オリジーン社から購入し(NCBI RefSeq NM_021803に示されるコード配列を含むプラスミドRC215235)、epHIV7.2のNheI/NotIにクローニングした。
ウイルスの製造はいずれもBSL-2ラミナーフローフード内で行った。pcVpxおよびpMDL-Xは、Landau labの厚意により供与された(Bobadilla, Gene Therapy 2013)(Bobadilla S, Sunseri N, Landau NR. Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein. Gene Ther 2013;20:514-520;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。RSV-RevはAddgene社(プラスミド# 12253)から購入した。pCMV-GはMichael Jensen博士から供与された(Yee JK, Miyanohara A, LaPorte P et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:9564-9568;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。293T細胞をATCC(CRL-3216)から購入し、継代数20回未満で使用した。293T細胞は、15cmディッシュ1枚あたり107個の密度で293T培地(10mM HEPES、1%Glutamax(Gibco)および10%FBSを添加したDMEM)に播種した。一晩培養した後、CalPhos哺乳動物用トランスフェクションキット(クロンテック)を使用して、各プレートに、pcVpx(4.6μg)、pMDL-X(13.5μg)、RSV-Rev(6.8μg)、pCMV-G(9.5μg)および外来遺伝子導入ベクター(37.8μg)をそれぞれトランスフェクトした。16時間後、培地を新鮮な293T培地に交換した。48時間後、ウイルスを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過して残渣を除去し、SW-28ローターを備えたベックマン・コールター社のOptima L-90K超遠心分離機を使用して、4℃、108,000×gで90分間超遠心分離した。ウイルスペレットを無血清DMEMに再懸濁し、レンチウイルス構成タンパク質p24測定用ELISAキットであるQuick Titer Lentivirus titer kit(Cell Biolabs)を使用して、インタクトなレンチウイルス粒子(LP)の濃度を測定した。
Vpxを含めてパッケージングしたレンチウイルスまたはVpxを除いてパッケージングしたレンチウイルス1mLあたりの力価(TU)を測定するため、GFP-fflucをコードするウイルスを様々な濃度で使用してH9細胞に形質導入し、フローサイトメトリーで分析した。TU/mL=(形質導入時のH9細胞の数)×(GFP陽性細胞の割合)/(添加したウイルスの量(mL))。この式で算出された値を使用して、分化3日目の樹状細胞またはマクロファージに感染させる際のMOIを決定した(Breckpot K, Dullaers M, Bonehill A et al. Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med 2003;5:654-667;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。上記と同様にして、新鮮培地およびサイトカインとともにウイルスを加えた。Vpxを除いてパッケージングしたレンチウイルスの形質導入効率を向上させるため、硫酸プロタミン(100μg/mL)を加えた。
マクロファージ培地において、新鮮単離した単球または分化誘導したマクロファージに20~1000個/細胞の濃度でLPを感染させた(感染と同時に単球の分化が進むように、M-CSFまたはGM-CSFを適宜培地に添加した)。培地は3日ごとに新たなものに交換した。
野生型のU87神経膠腫細胞株はATCC(HTB-14)から購入した。epHIV7:GFP-fflucで安定に形質導入されたU87細胞はMichael Jensen博士の研究所から供与された。U87細胞はいずれも、1%Glutamaxおよび10%FBSを添加したDMEM中で37℃、5%CO2で培養した後、継代培養してから、ニューロスフェアを形成させた。継代数が5回を超えたGFP-ffluc発現U87細胞は使用しなかった。実験に使用する前に蛍光顕微鏡下でGFPの発現を確認した。
細胞1個あたりのレンチウイルスの組み込み数を測定するため、分化0日目または10ng/mL GM-CSFで分化誘導後7日目に、GFP-fflucをコードするLPを100個/細胞または250個/細胞の濃度でCD14+細胞に感染させて形質導入を行った。分化10日目に、Qiagen DNA Mini Kitを使用してゲノムDNAを単離した。2×Power SYBR Green Master Mix(サーモフィッシャー)を使用して、BioRad CFX96リアルタイムシステムにおいてqPCRを行い、WPREおよびアルブミン遺伝子を定量した。濃度が既知のプラスミドDNAから作製した標準曲線のCq値と、レンチウイルス(WPRE)およびゲノムDNA(アルブミン)のCq値とを比較することによって、レンチウイルス(WPRE)の量およびゲノムDNA(アルブミン)の量をピコグラム単位で求めた。細胞1個あたりのウイルスの組み込み数=2×(WPRE(pg))/(ALB(pg))。
遺伝子組換えマクロファージ(GEM)をVersene(Gibco)で処理し、穏やかに剥がして回収し、フローサイトメトリーに使用した。回収した細胞をFc Block(BDバイオサイエンス)で処理して非特異的な抗体の結合を防ぎ、蛍光色素標識抗体で染色し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、FACS DIVAソフトウェアを使用してBD LSR Fortessaフローサイトメーターによる測定を行った。Mac用のFlowJo v10(Treestar)を使用して分析を行った。抗ヒト抗体として、CD16-V500、CD163-Alexa647およびCD80-BV786(BDバイオサイエンス);ならびにCD11b-APC-Cy7、CD19-APC、HLA-DR-BV605またはHLA-DR-APC、CD45-BV785、およびPD-L1-PECy7(Biolegend)を使用し、また、Live/Dead fixable blue stain(サーモフィッシャー)を使用した。EZ-link biotinylation kit(サーモサイエンティフィック)を使用してアービタックス(ブリストル・マイヤーズ スクイブ)をビオチン標識し、ストレプトアビジン-FITC(Biolegend)と組み合わせて使用した。
健常ドナーPBMCからCD14+単球を単離し、mCherry Vpx+レンチウイルスのウイルス粒子を0個/細胞または250個/細胞の濃度で感染させて形質導入を行い、GM-CSFを添加して7日間分化誘導した。24時間馴化後、形質導入から24時間後および7日後に細胞500,000個につき培地1mLを回収した。培地試料を希釈せずに使用して、IL-12(p40/p70)、TNF、IFNαなどの測定が可能なLuminexキット(ライフテクノロジーズ)で測定した。
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール(gRNA非含有)、IL-10 gRNAまたはPD-L1 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2ウイルスのウイルス粒子を1000個/細胞の濃度で感染させた。5日間培養した後、メーカーのプロトコルに従ってDNeasyキット(キアゲン)を使用してゲノムDNAを単離した。Cas9の切断部位周辺のゲノム領域を、以下に示すプライマーセットでPCR増幅し、メーカーのプロトコルに従ってSurveyorアッセイ(Integrated DNA Technologies)を実施した。
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール(gRNA非含有)またはPD-L1 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2-EGFRtウイルスのウイルス粒子を1000個/細胞の濃度で感染させた。6日間培養した後、100ng/mLリポ多糖(LPS)および20ng/mLインターフェロンγ(IFNγ)で遺伝子組換えマクロファージ(GEM)を24時間刺激し、抗PD-L1抗体およびアービタックスでGEMを染色してフローサイトメトリーを行い、エピトープタグEGFRtの発現に基づいて形質導入効率を求めた。
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール(gRNA非含有)またはIL-10 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2:EGFRtウイルスのウイルス粒子を1000個/細胞の濃度で感染させた。6日間培養した後、500,000個/mLの遺伝子組換えマクロファージ(GEM)を100ng/mL LPSおよび20ng/mL IFNγで24時間刺激した。回収した馴化培地を希釈せずに使用して、Bio-Plex 200機器でバイオ・ラッド社のIL-10 BioPlex Proアッセイを行った。アービタックスで細胞を染色してフローサイトメトリーを行い、エピトープタグEGFRtの発現に基づいて形質導入効率を求めた。
sTβRIIの発現を確認するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、7日目にCD19t-T2A-sTβRIIをコードするレンチウイルスまたはCD19tコントロールベクターのウイルス粒子を250個/細胞の濃度で感染させて形質導入を行った(CD19t-T2A-sTβRII:配列番号33;AtgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtacccCctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataaGgcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgggtcgggggctgctcaggggcctgtggccgctgcacatcgtcctgtggacgcgtatcgccagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggagaagaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaatga)。500,000個/mLの密度で24時間馴化し、形質導入後5日目、6日目および7日目に培地を回収した。ヒトTGFβRII DuoSet ELISA(R&Dシステムズ)を使用して、分泌されたタンパク質を検出した。T2A-CD19tは、配列番号30に示される配列によってコードされる(Ggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataa)。CD19tエピトープタグは、配列番号31に示される配列によってコードされる(Atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataa)。
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール(gRNA非含有)またはIL-10 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2ウイルスのウイルス粒子を1000個/細胞の濃度で感染させた。また、単球にも1000個/細胞の濃度でLPを感染させて、これと同時にGM-CSFで分化誘導した。6日間培養した後、それぞれから遺伝子組換えマクロファージ(GEM)を回収し、細胞数をそろえて再播種し(24ウェルプレートの1ウェルあたり100,000~200,000個)、100ng/mL LPSおよび20ng/mL IFNγで48時間刺激した。回収した馴化培地を希釈せずに使用して、Bio-Plex 200機器でバイオ・ラッド社のIL-10 BioPlex Proアッセイを行った。
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール(gRNA非含有)またはIL-10 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2ウイルスのウイルス粒子を1000個/細胞の濃度で感染させた。また、単球にも1000個/細胞の濃度でLPを感染させ、これと同時に分化誘導した。6日間培養した後、それぞれから遺伝子組換えマクロファージ(GEM)を回収し、細胞数をそろえて再播種し(24ウェルプレートの1ウェルあたり100,000~200,000個)、100ng/mL LPSおよび20ng/mL IFNγで48時間刺激した。回収した馴化培地を希釈せずに使用して、Bio-Plex 200機器でバイオ・ラッド社のIL-10 BioPlex Proアッセイを行った。
過去に報告されているHIV7.2骨格にTGFβBRIIコンストラクトおよびIL-21プラスミドをクローニングした。24時間ごとにGEMの馴化培地を回収し、TGFβR duoset kit DY241(R&D)およびIL-21 Bioplex pro kit(バイオ・ラッド)を使用して可溶性TGFβ受容体の発現およびIL-21の発現をそれぞれ検出した。これらのアッセイでは、GM-CSFで分化誘導したマクロファージは、分化7日目に形質導入した。
いくつかの実験において、IL-21の発現を確認するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、7日目にIL-21-T2A-CD19tをコードするレンチウイルスまたはCD19tコントロールベクターのウイルス粒子を250個/細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。500,000個/mLの密度で細胞を24時間馴化し、形質導入の7日後(分化14日目)に培地を回収した。BioPlex Proアッセイ(バイオ・ラッド社)を使用して、IL-21の分泌を検出した。
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、epHIV7.2:CD19tコントロールベクター(配列番号12)、CD19t-T2A-sTβRIIウイルスまたはIL-21-T2A-CD19tウイルスのウイルス粒子を250個/細胞の濃度で感染させ、これと同時に、lentiCRISPRv2:EGFRtコントロールベクター、PD-L1gRNA-EGFRtウイルスまたはIL-10gRNA-EGFRtウイルスのウイルス粒子を1000個/細胞の濃度で感染させた。各エピトープタグをフローサイトメトリーで検出することによって、ダブルポジティブ細胞の割合(%)を測定し、上記と同様にして各因子の分析を行った。
リポ多糖/インターフェロン-γ(LPS/IFNγ)刺激によって誘導されたインターロイキン、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子の長期的な発現を測定するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、6日目に24ウェルプレートの1ウェルあたり200,000個のマクロファージを播種した。7日目に500μLの培地中でマクロファージを100ng/mL LPS、20ng/mL IFNγ、またはLPS+IFNγで18時間刺激した。18時間後(1日目)に馴化培地を回収し、サイトカインを添加していない新鮮培地で置換した。24時間ごとに10日間にわたって培地を回収した。Luminex Human 30-plexサイトカインキット(Life Tech)を使用してサイトカインの放出を検出した。
マウス研究はいずれもSeattle Children’s Research InstituteのIACUC(プロトコル#15181)の監督下で行なわれ、研究所の方針に従って動物の使用を最小限にするよう尽力した。悪液質、嗜眠、後肢麻痺などの腫瘍移植に伴う症状の発症が見られたり、マウスの体重が元の体重の80%に低下した場合には、マウスを安楽死させた。8週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)雄性マウスをJackson Laboratoryから購入した。ケタミン/キシラジンで麻酔したマウスを定位固定装置(Stoelting)に固定し、頭蓋を覆っている皮膚を0.5cm切開し、ブレグマから2mm外側、0.5mm前方にドリルで穴を空けて穿頭孔を作製した。野生型U87細胞またはGFP-ffluc発現U87細胞200,000個を、1μL/分の速度で、硬膜下2.5mmおよび2.25mmに、各部位につき1μLずつ、合計2μL注射した。縫合後、体液の補充のために乳酸リンゲル液をマウスに投与し、鎮痛薬としてブプレノルフィンを投与した。GEMを注射するための外科手術は、150,000個のGEMを3回に分けて硬膜下2.5mm、2.35mmおよび2.25mmに合計3μL注射したこと以外は、U87細胞の注射のための外科手術と同様に行った。GEMまたはffluc発現U87細胞の生物発光イメージングを週3回行った。イソフルランでマウスに麻酔をかけ、28.57mg/mLのD-ルシフェリン(パーキンエルマー)溶液150μLを腹腔内注射または首の付け根に皮下注射した。Xenogen IVIS Spectrum Imaging System(パーキンエルマー)およびLiving Image Software(パーキンエルマー)を使用して生物発光画像を撮影し、データを分析した。
(上述した)既定の実験エンドポイントに達したマウスに4%イソフルランで深く麻酔をかけ、開胸し、心臓および血管を通してPBS15mLを灌流し、次いで10%中性緩衝ホルマリン(NBF)15mLを灌流させた。マウスの脳を摘出し、標準的なプロトコルを使用して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。腫瘍異種移植片内の注射されたGEMを特定するため、1:100に希釈した抗ヒトCD45抗体(クローンHI30、BioLegend)で脳切片を免疫染色し、Ventana Ultra自動プラットフォームでiVIEW DAB検出キットを用いて検出した。DS-Ri1カラーカメラと20×PlanApo対物レンズ(NA:0.75)を備えたニコンEclipse Ciで写真を撮影した。ニコンElementsソフトウェアを使用して、タイリング法でスキャンした画像を統合した。
(上述した)既定の実験エンドポイントに達したマウスに4%イソフルランで深く麻酔をかけ、開胸し、心臓および血管を通してPBS15mLを灌流させた。脳および腫瘍を、これらを取り囲む正常組織を1mm残したまま切り出した。メーカーのプロトコルを使用して、ヒトTumor Dissociation Kit(ミルテニー)で脳腫瘍細胞を分散させ、Mouse Cellディプリーションキット(ミルテニー)でマウス細胞を除去した。上記と同様にして、ヒト細胞の単一細胞懸濁液を染色し、フローサイトメトリーで分析した。
特に記載がない限り、実験はいずれも様々なドナーから単離したマクロファージを使用して少なくとも3回行った。Prismソフトウェア(GraphPad)で結果を分析し、適切な検定(対応のあるt検定または分散分析)を行った。統計的有意差(p<0.05)はアスタリスクで示す。
近年、レンチウイルスを使用してT細胞に安定に形質導入し、これを用いてがん免疫療法を行うことは日常的に実施されている。しかしながら、骨髄系細胞に感染させるための標準的なシステムは存在しない。最近の研究では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびIL-4を使用して単球から分化誘導した樹状細胞(DC)や、GM-CSFのみを使用して分化誘導した炎症促進性マクロファージは、Vpxとともにパッケージングしたレンチウイルス粒子を使用することによって高効率に形質導入することができることが実証されている(Bobadilla S, Sunseri N, Landau NR. Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein. Gene Ther 2013;20:514-520およびSunseri N, O'Brien M, Bhardwaj N et al. Human immunodeficiency virus type 1 modified to package Simian immunodeficiency virus Vpx efficiently infects macrophages and dendritic cells. J Virol 2011;85:6263-6274;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。また、過去の研究では、DCの分化初期段階において高い感染多重度(MOI)でウイルスを感染させた場合、Vpxを使用することなく形質導入できることが報告されている(Breckpot K, Dullaers M, Bonehill A et al. Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med 2003;5:654-667およびChinnasamy N, Chinnasamy D, Toso JF et al. Efficient gene transfer to human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells using human immunodeficiency virus type 1-based lentiviral vectors. Hum Gene Ther 2000;11:1901-1909;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。単球由来のマクロファージの形質導入にVpxが必要かどうかを決定するため、標準的なレンチウイルス製造プロトコルを使用して、現在臨床試験中(NCT01683279、NCT02311621)のレンチウイルス骨格であるepHIV7:GFP-fflucを、Vpxを含めてあるいはVpxを除いてパッケージングした。健常ドナーPBMCからCD14+細胞を単離し、GM-CSFおよびIL-4を使用してDCに分化誘導するか、あるいはGM-CSFのみを使用してマクロファージに分化誘導した。単離および分化開始の3日後に細胞をカウントし、Vpxを含めてあるいはVpxを除いてパッケージングしたGFP-fflucをコードするレンチウイルスとサイトカインとを含む新鮮培地に再播種した。Vpxを含まないウイルスに感染させた細胞は、ウイルスの侵入を促すため、100μg/mL硫酸プロタミンをさらに添加した。インビトロでの分化誘導を6日間行った後、フローサイトメトリーで細胞を分析した。MOI=15で感染させたところ、100μg/mLの硫酸プロタミンを添加したDC25において、DCの20%およびマクロファージの60%が、レンチウイルスにコードされたGFPを発現したことが示された(図28Aおよび図28B)。しかしながら、ウイルス用量を高くし、かつ硫酸プロタミンの濃度を高くすると、マクロファージの生存率が大幅に低下し、死細胞または死につつある細胞を染色する色素に陽性を示した細胞は30%を超えていた(図28B)。このような影響はDCでは観察されなかった(図28A)。これに対して、Vpxを含めてパッケージングしたレンチウイルスでは、MOI=1で3日目のマクロファージをほぼ100%感染させることができ、さらに生存率の低下も見られなかった。これらを踏まえ、Vpx+レンチウイルスについての研究を進めることにした。
過去の研究では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびIL-4を使用して単球から分化誘導した樹状細胞、またはGM-CSFのみを使用して分化誘導した炎症促進性マクロファージは、Vpxとともにパッケージングしたレンチウイルス粒子を使用することによって、高効率に形質導入することができることが実証されている。このシステムが、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を使用して単球から分化させた抗炎症性集団に適用可能であるかどうかを決定するため、標準的なレンチウイルス製造プロトコルを使用して、現在臨床試験中(NCT01683279、NCT02311621)のレンチウイルス骨格であるepHIV7:GFP-fflucを、Vpxとともにパッケージングした。GM-CSFまたはM-CSFの存在下で7日間培養して単球由来マクロファージを得た後、マクロファージ1個あたりに感染させるレンチウイルス粒子(LP)の数を様々に変えて形質導入を行い、形質導入後さらに7日間培養してからGFPの発現を評価した(図13A、図13B)。Vpx含有ビリオンを感染させたこれら2種の表現型は、いずれの試験用量でも同等の形質導入効率を示し、細胞1個あたり250個のLPという低濃度でほぼ100%の形質導入効率を示すことがわかった。これに対して、Vpxを除いてパッケージングしたビリオンは、細胞1個あたり1000個のLPを感染させた場合であっても、いずれの表現型でも形質導入効率が非常に低く、GM-CSFで分化誘導したマクロファージでは5.09%であり、M-CSFで分化誘導したマクロファージでは14.6%であった。
この一連の実験では、ウイルスによる感染が、単球から炎症促進性または抗炎症性のマクロファージへの分化に影響を及ぼすかどうかを確認した。GM-CSFで分化誘導したGEM(図13A)およびM-CSFで分化誘導したGEM(図13B)の表現型を調べるため、赤色蛍光タンパク質mCherryをコードするepHIV7.2レンチウイルスのウイルス粒子を250個/細胞のウイルス濃度で単球に感染させて形質導入を行い、これと同時にGM-CSFまたはM-CSFで単球を分化させた。7日後にGEMにおけるmCherryの発現をフローサイトメトリーで分析したところ、分化条件に関係なく100%陽性であった(図15A)。さらに、一般的な骨髄系マーカーの表面発現を調べるため、フローサイトメトリーでGEMを分析した。骨髄系マーカーとして、CD163(スカベンジャー受容体)、HLA-DR(取り込まれた抗原をT細胞に提示する受容体)、CD80(T細胞に共刺激シグナルを伝える分子)、PD-L1(T細胞を抑制するタンパク質)、CD11b(細胞接着を担うインテグリン)、およびCD16(Fc受容体)(図15B~G);ならびにCD80(T細胞に共刺激シグナルを送達する分子)、主要組織適合遺伝子複合体II(HLADR)(取り込まれた抗原をT細胞に提示する分子)、PD-L1(免疫抑制タンパク質)、およびCD163(スカベンジャー受容体)(図22C、図23A~23F)を使用した。予想されたとおり、抗炎症性マクロファージの古典的マーカーCD163を発現したマクロファージの割合は、GM-CSFマクロファージよりもM-CSFマクロファージの方が高かった(90%対5%)(図15B)。特に重要な点として、過去の報告と一致して、抗原提示の増強に関連するタンパク質であるHLA-DRおよびCD80、ならびにPD-L1がGEMにおいてアップレギュレートされたことが示されたことから(図15C~E)、強力なtoll様受容体4(TLR4)アゴニストであるLPSと炎症促進性サイトカインであるIFNγによる刺激に対してGEMが応答性を示すことがわかった。Vpx含有ウイルスで形質導入を行っても、前記マーカーの多くにおいて発現に大きな影響は見られず、特にCD16はいずれの処理でも発現に影響は見られなかった(図15G)。しかし、興味深いことに、M-CSFで分化誘導したGEMにウイルスで形質導入を行った場合、CD11bの発現が60%低下し(図15F)、GM-CSFで分化誘導したGEMに刺激を与えなかった場合は、CD80の発現が3倍に上昇したことがわかった(図15D)。CD80の発現上昇による抗原提示への影響は、近いうちに調査がなされるであろう。TLR4シグナル伝達のためのEF1α-Her2tGタンパク質は、配列番号26に示される配列によってコードされる(GGCATTGANNGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGGGCTAGCATGTTGCTCCTCGTAACCTCCCTTTTGTTGTGTGAGCTCCCTCACCCAGCTTTTCTGCTGATCCCGTGCCACCCTGAGTGTCAACCACAGAATGGTAGCGTTACCTGCTTTGGGCCTGAAGCTGATCAGTGCGTTGCATGTGCTCACTATAAGGATCCGCCATTTTGCGTGGCGCGGTGCCCTTCGGGCGTGAAACCTGATCTAAGCTATATGCCGATCTGGAAGTTTCCCGATGAGGAGGGGGCTTGCCAGCCATGTCCCATCAATTGTACACATAGCTGCGTCGACTTAGATGACAAGGGGTGCCCGGCGGAACAACGCGCCTCGCCCCTTACTGGAGGCGGATCGGGAGGCGGCTCAATAATATCAGCGGTAGTTGGTATACTGCTGGTGGTGGTTCTCGGAGTAGTATTTGGGATATTGATAGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGTGCCGAGCCATCTCTCTTANGCGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGCAGCTGTCACAACTCCTAGCTGTCACTCAAGGGAAGACGCTGGTGCTGGGGAAGGAAGGGGAATCAGCAGAACTGCCCTGCGAGAGTTCCCAGAAGAAGATCACAGTCTTCACCTGNAAGTTCTCTGACCAGANGAAGATTCTGGGGCAGCATGGNAAAGTGTATTAATTAGAGGAGGTTCGCCTTCGCAGTTTGATCGTTTTGATTCCAAAAAAGGGCATGGGANNAAAGGATCGTTTCCNNTCATCATCAATAAACTTNAGATGGAAGANTCTCAGACTTANNNNNTGTGAGCTG)。
本研究は、初代ヒト単球から分化誘導したマクロファージをレンチウイルスで遺伝子組換えし、この遺伝子組換えマクロファージを使用した養子移入療法の治療有効性を評価した初めての試験である。炎症促進性マクロファージの抗腫瘍効果は、マウスを用いたいくつかの研究で実証されており、これらの研究では、TLRアゴニストを局所投与または全身投与することによって、腫瘍関連マクロファージ(TAM)の腫瘍支持プログラムを逆転させ、免疫監視を回復させることに成功している。炎症促進性マクロファージの抗腫瘍効果は、マウスを用いたいくつかの研究で実証されており、これらの研究では、TLRアゴニストを局所投与または全身投与することによって、腫瘍関連マクロファージ(TAM)の腫瘍支持プログラムを逆転させ、免疫監視を回復させることに成功している(Peng J, Tsang JY, Li D et al. Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett 2013;331:239-249; Huang Z, Gan J, Long Z et al. Targeted delivery of let-7b to reprogramme tumor-associated macrophages and tumor infiltrating dendritic cells for tumor rejection. Biomaterials 2016;90:72-84; Chang LS, Leng CH, Yeh YC et al. Toll-like receptor 9 agonist enhances anti-tumor immunity and inhibits tumor-associated immunosuppressive cells numbers in a mouse cervical cancer model following recombinant lipoprotein therapy. Mol Cancer 2014;13:60; Yu Q, Nie SP, Wang JQ et al. Toll-like receptor 4 mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide. J Agric Food Chem 2015;63:517-525;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。理想的なGEMとは、古典的なLPS/IFNγによる活性化によって誘導される因子(IL-12など)を持続的に放出し、かつ自然免疫系および獲得免疫系の両方を刺激するように遺伝子組換えされたものである(図18A~18CCを参照されたい)(Hao NB, Lu MH, Fan YH et al. Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors. Clin Dev Immunol 2012;2012:948098;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。GM-CSFで分化誘導したGEMがLPS/IFNγに対して応答性を示すことが実証されたことから、活性化マクロファージを、脳に直接注入される治療用細胞製剤として使用することが可能かどうかを試験することにした。具体的には、刺激したGEMまたは刺激しなかったGEMが、TMEにおいて生存可能であるかどうか、疾患に効果を及ぼすかどうか、腫瘍の増殖を促進するかどうかを評価することにした。他の免疫細胞の作用を混乱させることなくGEMの挙動を直接評価するため、細胞免疫療法の前臨床評価に使用されることが多い頭蓋内神経膠腫異種移植モデルを利用して、Tリンパ球およびBリンパ球を欠損したNOD SCID-γ(NSG)マウスにおけるGEMを評価した(Miao H, Choi BD, Suryadevara CM et al. EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor T cells migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma. PLoS One 2014;9:e94281; Kahlon KS, Brown C, Cooper LJ et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Res 2004;64:9160-9166; Krenciute G, Krebs S, Torres D et al. Characterization and Functional Analysis of scFv-based Chimeric Antigen Receptors to Redirect T Cells to IL13Ralpha2-positive Glioma. Mol Ther 2016;24:354-363; Shiina S, Ohno M, Ohka F et al. CAR T Cells Targeting Podoplanin Reduce Orthotopic Glioblastomas in Mouse Brains. Cancer Immunol Res 2016;4:259-268; KK, Naik S, Kakarla S et al. T cells redirected to EphA2 for the immunotherapy of glioblastoma. Mol Ther 2013;21:629-637; Hegde M, Corder A, Chow KK et al. Combinational targeting offsets antigen escape and enhances effector functions of adoptively transferred T cells in glioblastoma. Mol Ther 2013;21:2087-2101;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。これらの実験では、200,000個のU87細胞を頭蓋内注射し、6日間または7日間かけて腫瘍を樹立させた(図16A、図17A)。最初の実験では、新鮮単離した単球にepHIV7:GFP-fflucをコードするレンチウイルスのウイルス粒子を250個/細胞の濃度で形質導入し、6日間かけてGM-CSFで炎症促進性の表現型に分化誘導した(図16A)。分化および形質導入を行った5日目に、GEMの半数をLPS/IFNγで18時間刺激した。150,000個の刺激したGEMまたは刺激しなかったGEMを樹立腫瘍に注入し、生物発光を週3回測定した。
頭蓋内神経膠腫モデルは不完全な免疫系しか持たない動物モデルであり、上記GEMは抗腫瘍因子を産生しないことから、腫瘍担持動物の腫瘍増殖や全生存期間に影響が見られるとは予想していなかった。一方、IFNγおよび/またはLPSで刺激したマクロファージを評価することを目的として1990年代から実施されたヒト臨床試験では、LPS/IFNγで刺激することによって抗体依存性細胞傷害(ADCC)を高め、かつIFNγで18時間刺激することによってインビトロでの腫瘍壊死因子(TNF)の分泌を増加させたにもかかわらず、マクロファージに有効性が見られなかったことが示されている(Andreesen,1998)。このような評価条件においてマクロファージが生存期間を延長できなかった原因としては、腫瘍細胞によってマクロファージが腫瘍促進性の表現型すなわち抗炎症性の表現型に転換されたこと、他の細胞傷害性免疫細胞が存在しないか、あるいは無能力化されていること、またはインビトロ実験で観察されたように(図18A~図18CC)、LPS/IFNγによって誘導される炎症性シグナルが持続しないことが一因として考えられる。実際、LPSのような強力なTLR4アゴニストを使用すると、IL-10の分泌(図18J)などの抗炎症応答や、PD-L1の表面発現の上昇(図15B)が意図せずに起こる可能性がある。IL-10の分泌およびPD-L1の表面発現の上昇は、腫瘍に対して効果的な免疫応答を抑制することが知られている(参考文献を参照されたい)。したがって、腫瘍による抗炎症表現型への分極化に抵抗性を示すことができるGEMを製造すると同時に、細胞傷害性免疫細胞の有効性を向上させることを目的として以下の実験を行った。
頭蓋内膠芽腫モデルは不完全な免疫系しか持たず、GEMが機能性ペイロードを持っていないか、あるいは検出可能な量の炎症性サイトカインを発現しないことから(図31A~図31C)、異種移植片を移植した動物の腫瘍増殖や全生存期間に影響が見られるとは予想していなかった。一方、エクスビボにおいてIFNγおよび/またはLPSで刺激されたマクロファージを固形腫瘍患者の治療に使用することを目的として評価が行われた1980年代および1990年代のヒト臨床試験でも、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導し、かつIFNγで18時間刺激することによってインビトロにおける腫瘍壊死因子α(TNFα)の分泌を増加させたにもかかわらず、生存期間は延長されなかったことが示されている(Andreesen R, Hennemann B, Krause SW. Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages: rationale, current status, and perspectives. J Leukoc Biol 1998;64:419-426;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。完全な免疫系を利用したこのような条件においてマクロファージが生存期間を延長できなかった原因としては、1)腫瘍細胞によってマクロファージが腫瘍促進性の表現型すなわち抗炎症性の表現型に転換されたこと、2)他の細胞傷害性免疫細胞が存在しないか、あるいは無能力化されていること、または3)18時間刺激した後にインビトロで観察されたように(図19)、LPS/IFNγによって誘導される炎症性サイトカインの放出が持続しないことが考えられる。実際、LPSのような強力なTLR4アゴニストを使用すると、IL-10の持続的な分泌(図19)などの抗炎症応答や、PD-L1の表面発現の上昇(図15E)が意図せずに起こる可能性がある。IL-10およびPD-L1は、腫瘍から分泌されるシグナルの誘導によってTAMに発現される因子としても知られている(Bloch O, Crane CA, Kaur R et al. Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1 expression in tumor-associated macrophages. Clin Cancer Res 2013;19:3165-3175;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。これらを踏まえて、CRISPR/Cas9を利用して遺伝子を編集することによって、免疫回避に寄与するこれらの因子のGEMにおける発現を防ぐことが試みられた(Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods 2014;11:783-784; Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014;343:84-87;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。Cas9および特異的ガイドRNA19をコードするレンチウイルスベクターを使用して、IL-10およびPD-L1のゲノム座位を破壊した。これらのゲノム領域を増幅し、再アニーリングし、ミスマッチ塩基対を切断するSurveyorエンドヌクレアーゼとインキュベートしたところ、分解産物が生成されたことから、IL-10座位およびPD-L1座位が破壊されたことが示された(図19A、図19Dおよび図24AならびにBarrows)(Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques 2004;36:702-707;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。単球またはGM-CSFで分化誘導したマクロファージにIL-10のゲノム破壊を導入したところ、IL-10座位を破壊したことによって、LPS/IFNγで誘導したIL-10の分泌が60%低下した(図26Bおよび図26C)。また、GM-CSFで分化誘導したマクロファージに、Cas9およびPD-L1ガイドRNAをコードするウイルスを感染させると、LPS/IFNγ刺激で誘導したPD-L1の表面発現が40%低下した(図26Bおよび図26C)。この結果は、CRISPRシステムを利用した場合、1つのアレルのみしか組換えが起こらないことがしばしばあるという他の研究者らによる知見と一致している(Ran FA, Hsu PD, Wright J et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 2013;8:2281-2308; McComb S, Aguade-Gorgorio J, Harder L et al. Activation of concurrent apoptosis and necroptosis by SMAC mimetics for the treatment of refractory and relapsed ALL. Sci Transl Med 2016;8:339ra370;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。
TMEの免疫抑制環境に抵抗性を示し、かつ細胞傷害性抗腫瘍免疫細胞の活性化、増殖および生存を支援するようにGEMをプログラムすることができるどうかを評価した。たとえば、トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)は、細胞傷害性免疫応答を様々な方法で阻害する腫瘍由来因子として過去に多くの報告がなされている(Crane CA, Han SJ, Barry JJ et al. TGF-beta downregulates the activating receptor NKG2D on NK cells and CD8+ T cells in glioma patients. Neuro Oncol 2010;12:7-13; Smyth MJ, Strobl SL, Young HA et al. Regulation of lymphokine-activated killer activity and pore-forming protein gene expression in human peripheral blood CD8+ T lymphocytes. Inhibition by transforming growth factor-beta. J Immunol 1991;146:3289-3297; Bright JJ, Sriram S. TGF-beta inhibits IL-12-induced activation of Jak-STAT pathway in T lymphocytes. J Immunol 1998;161:1772-1777; Peng Y, Laouar Y, Li MO et al. TGF-beta regulates in vivo expansion of Foxp3-expressing CD4+CD25+ regulatory T cells responsible for protection against diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:4572-4577; Gorelik L, Flavell RA. Immune-mediated eradication of tumors through the blockade of transforming growth factor-beta signaling in T cells. Nat Med 2001;7:1118-1122;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。過去に報告されているように、可溶性TGFβ受容体II(sTGFβRII)を分泌するようにGEMを遺伝子組換えすることができ(図19Gおよび図26D)、こうして分泌されたsTGFβRIIは、TGFβのデコイ受容体として機能し、TGFβのシグナル伝達を低下させることができることが実証された(Rowland-Goldsmith MA, Maruyama H, Kusama T et al. Soluble type II transforming growth factor-beta (TGF-beta) receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357 pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation. Clin Cancer Res 2001;7:2931-2940;この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される)。さらに、GEMは、通常はCD4+T細胞によって発現されるサイトカインであるIL-21を分泌するように遺伝子組換えすることができ(図19Hおよび図26E)、こうして分泌されたIL-21は、NK細胞およびT細胞を活性化させるとともにADCCを補助し44、TAMをM1表現型へと分極化させる(Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques 2004;36:702-707; Croce M, Rigo V, Ferrini S. IL-21: a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology. J Immunol Res 2015;2015:696578; Skak K, Frederiksen KS, Lundsgaard D. Interleukin-21 activates human natural killer cells and modulates their surface receptor expression. Immunology 2008;123:575-583; Xu M, Liu M, Du X et al. Intratumoral Delivery of IL-21 Overcomes Anti-Her2/Neu Resistance through Shifting Tumor-Associated Macrophages from M2 to M1 Phenotype. J Immunol 2015;194:4997-5006;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。組換えIL-21は、がんの単独療法として、またはチロシンキナーゼ阻害薬または治療用抗体との併用療法として、現在複数の臨床試験で評価されている(Croce M, Rigo V, Ferrini S. IL-21: a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology. J Immunol Res 2015;2015:696578; Spolski R, Leonard WJ. Interleukin-21: a double-edged sword with therapeutic potential. Nat Rev Drug Discov 2014;13:379-395;これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される)。実験結果から、高濃度のIL-21を分泌するようにマクロファージを遺伝子組換えすることができることが示され、このことから、IL-21発現GEMによって細胞傷害性免疫細胞の機能低下を回復できることが実証された。以上のデータから、GEMを遺伝子操作することによって、GEMにおける抗炎症性タンパク質の発現量を低下させたり、あるいは免疫抑制シグナル伝達を妨害する可溶性因子または抗腫瘍免疫応答を促進する可溶性因子をGEMに産生させることができることが実証された。
TMEの免疫抑制環境によって生じる様々な課題を克服するため、CRISPRを利用した遺伝子破壊によって腫瘍微小環境に抵抗性を示し、かつsTβRIIおよびIL-21を分泌するマクロファージの遺伝子組換え技術による製造を試みた。このようなマクロファージを製造するため、末端切断型CD19配列(CD19t)をepHIV7.2ベクターに挿入し(図24C)、lentiCRISPRv2ベクターのピューロマイシン配列をエピトープタグEGFRtと置換した(図24D)。CD19tエピトープタグおよびEGFRtエピトープタグはいずれも、各配列をコードするレンチウイルスに感染させたマクロファージにおいて検出可能であることが確認された(図24Eおよび図24F)。これら2種のウイルスを同時にGEMに感染させ、フローサイトメトリーで分析したところ、30~45%の細胞が二重陽性を示した(図27Aおよび図27E)。さらに、CD19tおよびEGFRtの両方を発現する細胞においてPD-L1の発現を評価したところ、PD-L1の発現が70%低下し(図27C)、また、sTβRIIは低減されることなく発現された(図27D)。興味深いことに、IL-21を発現させたことによって、LPSで誘導されたIL-10の発現が抑制されたと見られる。IL-21をコードするGEM単独では、IL-10の発現が76.4%低下し、IL-21の発現とIL-10gRNAとを組み合わせた場合では、IL-10の発現が87.3%低下する。これらのIL-10の発現は、IL-10gRNA+CD19tコントロールベクターと比べて有意に低く、38.5%低かった(図27F)。IL-10の発現を標的化しても、IL-21の発現はその影響を受けなかった(図27G)。
単離したCD14+単球は、250,000個/cm2の密度を超えないように、10ng/mLのGM-CSF(R&Dシステムズ)の存在下において組織培養処理プラスチックディッシュ(コーニング)中のマクロファージ培地(10%FBS(Hyclone)を添加したRPMI1640培地(Gibco))に37℃、5%CO2で播種した。播種の72時間後、培地の半量を、20ng/mLのGM-CSFを添加した新鮮なマクロファージ培地と交換した。epHIV7において、pHIV7のCMVプロモーターをEF1プロモーターと置換した。epHIV7.2は、EF1プロモーターを最小EF1プロモーター(HTLV-1ドメインを持たない)と置換し、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と置換した。mCherryコンストラクトは、クローニングによってmCherry遺伝子をHIV7.2に挿入することによって作製した。8週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)雄性マウスをJackson Laboratoryから購入した。ケタミン/キシラジンで麻酔したマウスを定位固定装置(Stoelting)に固定し、頭蓋を覆っている皮膚を0.5cm切開し、ブレグマから2mm外側、0.5mm前方にドリルで穴を空けて穿頭孔を作製した。野生型U87細胞またはGFP-ffluc発現U87細胞200,000個を、1μL/分の速度で、硬膜下2.5mmおよび2.25mmに、各部位につき1μLずつ、合計2μL注射した。縫合後、体液の補充のために乳酸リンゲル液をマウスに投与し、鎮痛薬としてブプレノルフィンを投与した。GEMを注射するための外科手術は、150,000個のGEMを3回に分けて硬膜下2.5mm、2.35mmおよび2.25mmに合計3μL注射したこと以外は、U87細胞の注射のための外科手術と同様に行った。GEMまたはffluc発現U87細胞の生物発光イメージングを週3回行った。イソフルランでマウスに麻酔をかけ、28.57mg/mLのD-ルシフェリン(パーキンエルマー)溶液150μLを腹腔内注射または首の付け根に皮下注射した。Xenogen IVIS Spectrum Imaging System(パーキンエルマー)およびLiving Image Software(パーキンエルマー)を使用して生物発光画像を撮影し、データを分析した。GEMの注射の21日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍細胞を分散させた。単一細胞懸濁液をCD45染色し、フローサイトメトリーによって、生細胞およびシングレットをゲーティングし、mCherryの発現およびCD45の発現を評価した。図21Aおよび図21Bを参照されたい。
増殖させ凍結保存した細胞から選択したCD4 T細胞およびCD8 T細胞を遺伝子組換えして、EGFRvIII 806CARと、IL2受容体(CD122)の細胞内シグナル伝達ドメインに融合させたキメラIL7受容体(CD127)細胞外ドメインとを発現させ、CD3/CD28で活性化し、凍結した。解凍したCD4 T細胞またはCD8 T細胞をCell Trace Violetで標識し、コントロールとしての組換えIL-7(500ng/ml)を加えて7日間培養するか、IL-7もしくはEGFRt(ベクターのみ)を発現するGEMから回収して一度凍結した馴化培地を加えて7日間培養するか、またはIL-7もしくはEGFRtを分泌する自家GEMと7日間共培養した。フローサイトメトリーでCellTrace Violetの希釈を分析することによって増殖を測定した。なお、CD4 T細胞およびCD8 T細胞はいずれも、CD3/CD28による再刺激は行わず、IL-7以外のサイトカインの添加も行わなかった。(図32および図33を参照されたい。)
いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第2のベクターを前記細胞に送達すること;および前記細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第2のベクターまたは第3のベクターに組み込まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第2のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記方法は、第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するために、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第4のベクターを前記細胞に送達すること;ならびに前記細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターを前記細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第2のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも1つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号35に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、コドンの最適化は、OptimumGeneTM、GeneGPS(登録商標)アルゴリズムおよび当業者に公知の他のプログラムによって行われる。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第4のベクター;ならびに前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および/または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第4のベクター;ならびに前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の1種以上;およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および/または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第4のベクター;ならびに前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の1種以上;およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および/または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および/または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および/または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の1種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および/または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の1種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。
[1]腫瘍の腫瘍微小環境(TME)を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第1のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法。
[2]第1のベクターがウイルスベクターである、[1]に記載の方法。
[3]前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[2]に記載の方法。
[4]前記レンチウイルスベクターが、Vpxタンパク質とともにパッケージングされている、[3]に記載の方法。
[5]前記タンパク質が、T細胞および/またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する、[1]~[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]前記タンパク質が、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である、[1]~[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]前記タンパク質が、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む、[1]~[5]のいずれか1つに記載の方法。
[8]前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む、[1]~[5]のいずれか1つに記載の方法。
[9]前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質が、PD-L1タンパク質またはその活性断片であること、および該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、[8]に記載の方法。
[10]前記タンパク質がPD-1タンパク質の断片を含むこと、該PD-1タンパク質断片が、腫瘍細胞および/または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、かつ該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、[8]または[9]に記載の方法。
[11]前記PD-L1タンパク質断片が、PD-L1の62番目~136番目のアミノ酸配列(KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI;配列番号7)を含む、[8]~[10]のいずれか1つに記載の方法。
[12]前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である、[8]~[10]のいずれか1つに記載の方法。
[13]前記タンパク質が、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである、[1]~[11]のいずれか1つに記載の方法。
[14]前記ケモカインが、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン(XCL1)、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む、[13]に記載の方法。
[15]前記免疫細胞が、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択された細胞である、[1]~[14]のいずれか1つに記載の方法。
[16]前記免疫細胞がT細胞である、[1]~[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17]前記免疫細胞がNK細胞である、[1]~[14]のいずれか1つに記載の方法。
[18]前記免疫細胞が遺伝子組換えNK細胞である、[1]~[14]のいずれか1つに記載の方法。
[19]前記T細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(Tcr)を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である、[16]に記載の方法。
[20]前記免疫細胞が骨髄系細胞である、[1]~[15]のいずれか1つに記載の方法。
[21]前記骨髄系細胞がマクロファージである、[20]に記載の方法。
[22]前記骨髄系細胞が小膠細胞である、[20]に記載の方法。
[23]前記腫瘍が神経膠腫である、[1]~[22]のいずれか1つに記載の方法。
[24]前記腫瘍が膠芽腫である、[1]~[23]のいずれか1つに記載の方法。
[25]Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第2のベクターを前記免疫細胞に送達すること;および前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第2のベクターまたは第3のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする、[1]~[24]のいずれか1つに記載の方法。
[26]第2のベクターがmRNAである、[25]に記載の方法。
[27]前記Cas9が、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、[25]または[26]に記載の方法。
[28]前記標的遺伝子が、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである、[25]~[27]のいずれか1つに記載の方法。
[29]第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第4のベクターを前記免疫細胞に送達すること;ならびに前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む、[1]~[28]のいずれか1つに記載の方法。
[30]第2のタンパク質が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである、[29]に記載の方法。
[31]第4のベクターがmRNAである、[29]または[30]に記載の方法。
[32]前記mRNAが、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、[29]~[31]のいずれか1つに記載の方法。
[33]前記少なくとも1つの標的遺伝子が、内在性の炎症促進遺伝子である、[29]~[32]のいずれか1つに記載の方法。
[34]前記炎症促進遺伝子が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする、[29]~[33]のいずれか1つに記載の方法。
[35]第1のベクターが、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む、[1]~[34]のいずれか1つに記載の方法。
[36]前記自殺遺伝子システムが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)/ガンシクロビル(GCV)自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである、[35]に記載の方法。
[37]前記タンパク質をコードする核酸が、調節因子によって制御される、[1]~[36]のいずれか1つに記載の方法。
[38]前記調節因子が、薬物によって誘導可能なプロモーターである、[37]に記載の方法。
[39]前記調節因子が、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである、[37]または[38]に記載の方法。
[40]前記調節因子が、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである、[37]~[39]のいずれか1つに記載の方法。
[41]前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む、[1]~[40]のいずれか1つに記載の方法。
[42]顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、前記免疫細胞を炎症促進性の表現型に分化誘導する、[41]に記載の方法。
[43]マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、前記免疫細胞を抗炎症性の表現型に分化誘導する、[42]に記載の方法。
[44]遺伝子組換え免疫細胞であって、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに/またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第1のベクターを含む細胞。
[45]前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である、[44]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[46]T細胞である、[44]または[45]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[47]遺伝子組換えT細胞である、[44]~[46]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[48]キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(Tcr)を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換え免疫細胞である、[44]~[47]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[49]NK細胞である、[44]~[48]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[50]遺伝子組換えNK細胞である、[44]~[48]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[51]マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択された細胞である、[44]~[50]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[52]骨髄系細胞である、[44]~[51]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[53]前記骨髄系細胞がマクロファージである、[52]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[54]前記骨髄系細胞が小膠細胞である、[52]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[55]第1のベクターがウイルスベクターである、[44]~[54]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[56]前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[55]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[57]前記レンチウイルスベクターが、Vpxタンパク質とともにパッケージングされている、[56]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[58]前記タンパク質が、T細胞および/またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する、[44]~[57]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[59]前記タンパク質が、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である、[44]~[58]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[60]前記タンパク質が、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む、[44]~[59]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[61]前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む、[44]~[60]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[62]前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質が、PD-L1タンパク質またはその活性断片であること、および該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、[44]~[61]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[63]前記タンパク質がPD-1タンパク質の断片を含むこと、該PD-1タンパク質が、腫瘍細胞および/または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、かつ該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、[44]~[62]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[64]前記PD-L1タンパク質断片が、PD-L1の62番目~136番目のアミノ酸配列(KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI;配列番号7)を含む、[44]~[63]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[65]前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である、[44]~[64]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[66]前記タンパク質が、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである、[44]~[65]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[67]前記ケモカインが、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン(XCL1)、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む、[66]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[68]Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第2のベクター;および前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第2のベクターまたは第3のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする、[44]~[67]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[69]第2のベクターがmRNAである、[68]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[70]前記Cas9が、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、[68]または[69]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[71]前記標的遺伝子が、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである、[68]または[69]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[72]第2のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第4のベクター;ならびに前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第5のベクターをさらに含む、[44]~[71]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[73]第2のタンパク質が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-αおよびIFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである、[72]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[74]第4のベクターがmRNAである、[72]または[73]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[75]前記mRNAが、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、[74]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[76]前記少なくとも1つの標的遺伝子が、内在性の炎症促進遺伝子である、[72]~[75]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[77]前記少なくとも1つの標的遺伝子が、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする、[72]~[76]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[78]第1のベクターが、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む、[44]~[77]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[79]前記自殺遺伝子システムが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)/ガンシクロビル(GCV)自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである、[78]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[80]前記タンパク質をコードする核酸が、調節因子によって制御される、[44]~[79]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[81]前記調節因子が、薬物によって誘導可能なプロモーターである、[80]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[82]前記調節因子が、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである、[80]または[81]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[83]前記調節因子が、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである、[80]~[82]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[84]分化誘導された免疫細胞である、[44]~[83]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[85]顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である、[84]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[86]マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である、[84]に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
[87][44]~[86]のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の1種以上;およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む組成物。
[88]腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、[44]~[86]のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および/または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法。
[89]腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法であって、[44]~[86]のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および/または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含む方法。
[90]抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法であって、[44]~[86]のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および/または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定することを含む方法。
[91]前記投与が養子細胞移入によって行われる、[88]~[90]のいずれか1つに記載の方法。
[92]前記遺伝子組換え免疫細胞が、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される、[88]~[90]のいずれか1つに記載の方法。
[93]前記対象が、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される、[88]~[92]のいずれか1つに記載の方法。
[94]前記がんが固形腫瘍である、[93]に記載の方法。
[95]前記固形腫瘍が、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される、[94]に記載の方法。
[96][44]~[86]に記載の細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む、[88]~[95]のいずれか1つに記載の方法。
[97]前記細胞療法がCAR T細胞療法である、[96]に記載の方法。
[98][44]~[86]に記載の細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体、小分子、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む、[88]~[97]のいずれか1つに記載の方法。
[99]前記抗体が、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、および/またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である、[98]に記載の方法。
[100]前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む、[88]~[99]のいずれか1つに記載の方法。
[101]前記プロドラッグが、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である、[100]に記載の方法。
[102][44]~[86]に記載の細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む、[88]~[101]のいずれか1つに記載の方法。
[103]前記薬物が、タモキシフェンおよび/またはその代謝産物である、[102]に記載の方法。
[104]前記対象が、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である、[88]~[103]のいずれか1つに記載の方法。
[105][44]~[86]に記載の細胞の1種以上または[87]に記載の組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および/もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む、[88]~[104]いずれか1つに記載の方法。
[106]前記さらなる治療剤が、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体、および/または放射線照射を含む抗がん療法である、[105]に記載の方法。
[107]前記モノクローナル抗体が、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である、[106]に記載の方法。
[108]前記ホルモン遮断療法が、タモキシフェン、アナストロゾール、および/またはレトロゾールの送達を含む、[106]に記載の方法。
[109]前記小分子が、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および/またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む、[106]に記載の方法。
[110]医薬品として使用するための、[44]~[86]のいずれか1つに記載の遺伝子組換え免疫細胞。
Claims (23)
- 遺伝子組換えマクロファージを製造する方法であって、
(a)ペイロードタンパク質をコードする核酸と、VPXタンパク質とを含む第1のベクターを単球に送達すること、および
(b)単球を分化させて遺伝子組換えマクロファージを得ることを含み、
(b)が(a)の後または(a)と同時に行われることを特徴とする、方法。 - (b)が(a)の後に行われる、請求項1に記載の方法。
- (b)が(a)と同時に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- (b)が単球をIL-4の非存在下でGM-CSFまたはM-CSFと接触させることを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記送達が、250以下の感染多重度(MOI)で単球と、第1のベクターとを接触することを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記送達が、15以下の感染多重度(MOI)で単球と、第1のベクターとを接触することを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペイロードタンパク質が、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、T細胞ケモカイン、NK細胞ケモカイン、PD-1チェックポイント結合性阻害物質、PD-1融合タンパク質、配列番号7で示されるアミノ酸配列の62番目~136番目のアミノ酸を含むPD-L1タンパク質断片、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質、末端切断型EGFRポリペプチド(EGFRt)および末端切断型CD19ポリペプチド(CD19t)から選択される細胞表面マーカー、ならびにキメラ抗原受容体(CAR)からなる群から選択される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のベクターが、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペイロードタンパク質をコードする核酸が、誘導可能なプロモーターと動作可能に連結されている、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第2のベクターを前記単球に送達すること;およびガイドRNAをコードする第1のポリヌクレオチドを前記単球に送達することをさらに含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βおよびPGEからなる群から選択される標的遺伝子に相補的である、請求項11に記載の方法。
- Cas9-VP64融合タンパク質をコードする核酸を含む第3のベクターを前記単球に送達すること;およびガイドRNAを含む第2のポリヌクレオチドを前記単球に送達することをさらに含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9-VP64融合タンパク質が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12、IL-18、IL-23およびGM-CSFからなる群から選択されるタンパク質の転写または翻訳を活性化できる、請求項13に記載の方法。
- 前記単球はヒト細胞である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1~15のいずれか1項に記載の方法で製造される遺伝子組換えマクロファージ。
- 医薬品用である、請求項16に記載の遺伝子組換えマクロファージ。
- 前記医薬品が、対象の腫瘍微小環境(TME)における免疫応答の抑制を調節するために使用される、請求項17に記載の医薬品用遺伝子組換えマクロファージ。
- 前記TMEが、固形腫瘍によって形成される微小環境である、請求項18に記載の医薬品用遺伝子組換えマクロファージ。
- 前記固形腫瘍が、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される、請求項19に記載の医薬品用遺伝子組換えマクロファージ。
- 細胞療法と組み合わせて投与される、請求項17~20のいずれか1項に記載の医薬品用遺伝子組換えマクロファージ。
- 前記細胞療法がCAR T細胞療法である、請求項21に記載の医薬品用遺伝子組換えマクロファージ。
- 抗体、小分子、タモキシフェン、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体、腫瘍溶解性ポリオウイルス、ならびにアービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506および二量体化誘導化学物質から選択されるプロドラッグからなる群から選択される治療剤と組み合わせて投与され、前記抗体が、α-フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、HER2、rasの異常生成物またはp53の異常生成物に特異的である、請求項17~22のいずれか1項に記載の医薬品用遺伝子組換えマクロファージ。
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