JP2014193882A - 腫瘍崩壊ワクシニアウイルス癌療法 - Google Patents

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Abstract

【課題】癌治療に適した腫瘍崩壊ワクシニアウイルスを含むポックスウイルスおよび癌を治療するための該腫瘍崩壊性ポックスウイルスの使用方法を提供する。
【解決手段】ウイルスの宿主感染能が高まり宿主細胞に対する毒性が少なくなり、および/または癌細胞感染能が高まるように、癌細胞の死滅においてさらに有効もしくは効率的になるように、非癌細胞に対する毒性もしくは損傷が少なくなるように、遺伝子産物が変異または改変された、チミジンキナーゼ欠損、GM-CSF発現性の複製能を有するワクシニアウイルスベクター、及び腫瘍を有する被験体において腫瘍崩壊または腫瘍脈管構造の崩壊を誘導するための、該ワクシニアウイルスベクターを高ウイルス濃度（少なくとも1x108ウイルス粒子）で投与する工程を提供する。
【選択図】図５

Description

I.発明の分野
本発明は、概して、腫瘍学およびウイルス学の分野に関する。特に、本発明は、ポックスウイルス、具体的には、癌治療に適した腫瘍崩壊ワクシニアウイルスを含むポックスウイルスに関する。
II.背景
正常な組織恒常性は、細胞増殖および細胞死の高度に調節されたプロセスである。細胞増殖または細胞死の不均衡は癌状態に進展することがある(Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997; Mumby and Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al., 1998)。例えば、子宮頚部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、および脳癌は、結果となって現れる多くの癌の数例にしかすぎない(Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray and King, 1998; Mougin et al., 1998)。実際に、癌の発生率は非常に高いために、米国のみで毎年500,000人以上が癌で死亡している。
細胞増殖および細胞死の維持は、少なくとも部分的には、癌原遺伝子および腫瘍サプレッサーによって調節される。癌原遺伝子または腫瘍サプレッサーは、細胞増殖を誘導するタンパク質(例えば、sis、erbB、src、ras、およびmyc)、細胞増殖を阻害するタンパク質(例えば、Rb、p16、p19、p21、p53、NF1、およびWT1)、またはプログラム細胞死を調節するタンパク質(例えば、bcl-2)をコードし得る(Ochi et al., 1998; Johnson and Hamdy, 1998; Liebermann et al., 1998)。しかしながら、これらの癌原遺伝子および腫瘍サプレッサーの遺伝子再編成または変異が起こると、癌原遺伝子が強力な発癌性癌遺伝子に変わるか、または腫瘍サプレッサーが不活性なポリペプチドに変わる。多くの場合、トランスフォーメーションが起こるには、1つの点変異で十分である。例えば、p53腫瘍サプレッサータンパク質に点変異があると、野生型p53の機能は完全に消失する(Vogelstein and Kinzler, 1992)。
現在、よく見られる多くの癌タイプの治療には有効な選択肢がほとんどない。ある特定の個体の治療経過は、診断、疾患の発症段階、ならびに患者の年齢、性別、および身体全体の健康などの要因に左右される。癌治療の最もありふれた選択肢は、外科手術、放射線療法、および化学療法である。外科手術は、癌の診断および治療において中心的な役割を果たしている。典型的には、生検および癌腫瘍の切除には外科的なアプローチが必要とされる。しかしながら、癌が転移し、広範にある場合、外科手術によって治癒する可能性は低く、別のアプローチを取らなければならない。
放射線療法および化学療法は、癌の外科的治療の代わりとなる最も一般的な方法である(Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998)。放射線療法は、癌細胞を破壊するために高エネルギー放射線の正確な照準を必要とし、外科手術と同様に、主に、転移をしていない局所的な癌細胞の治療において有効である。放射線療法の副作用には、皮膚の炎症、嚥下困難、口内乾燥、悪心、下痢、脱毛、および無気力(loss of energy)が含まれる(Curran, 1998; Brizel, 1998)。抗癌薬による癌の治療である化学療法は別の癌療法であり、ほとんどの化学療法アプローチは、多種多様な癌に対する奏功率が高いことが分かっている複数の抗癌薬の組み合わせを含む(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,824,348号;米国特許第5,633,016号、および米国特許第5,798,339号)。しかしながら、化学療法薬の主な副作用は正常組織細胞にも影響を及ぼす点にある。影響を受ける可能性が最も高い細胞は、ある場合では、速く分裂する細胞(例えば、骨髄、胃腸管、生殖器系、および毛包)である。化学療法薬の他の毒性副作用には、口内の痛み、嚥下困難、口内乾燥、悪心、下痢、嘔吐、疲労、出血、脱毛、および感染症が含まれることがある。
複製選択性腫瘍崩壊ウイルスは癌治療法として大いに有望である(Kirn et al., 2001)。これらのウイルスは、複製依存性および/またはウイルス遺伝子発現依存性の腫瘍崩壊効果によって直接的な腫瘍細胞死を引き起こすことができる(Kirn et al., 2001)。さらに、ウイルスは、宿主内で抗腫瘍性の細胞性免疫の誘導を増強することができる(Todo et al., 2001; Sinkovics et al., 2000)。これらのウイルスはまた、抗腫瘍有効性を増強するために腫瘍内で治療用導入遺伝子を発現するように操作することもできる(Hermiston,2000)。しかしながら、この治療アプローチにも大きな制約がある。
従って、癌治療のためのさらなる療法が必要とされている。腫瘍崩壊ウイルスの使用は潜在的な発展分野である。
本発明の態様は、チミジンキナーゼ欠損ワクシニアウイルスの投与を含む方法に関する。前記方法は、ワクシニアウイルスを高ウイルス濃度で投与する工程を含む。ある特定の局面において、ある特定の局面において、前記方法は、腫瘍を有する被験体において腫瘍崩壊または腫瘍脈管構造の崩壊を誘導する方法を含む。この方法は、被験体に、腫瘍内の細胞の腫瘍崩壊を誘導するのに十分な少なくとも1x108ウイルス粒子の、TK欠損性、GM-CSF発現性の複製能を有するワクシニアウイルスベクターを投与する工程を含む。本発明のさらなる局面において、前記方法は、ワクシニアワクチンによる被験体の前治療を排除することができる。例えば、被験体は、本明細書に記載の療法を投与する、1日前、2日前、3日前、4日前、5日前、もしくはそれより前に、1週間前、2週間前、3週間前、4週間前、5週間前、もしくはそれより前に、1ヶ月前、2ヶ月前、3ヶ月前、4ヶ月前、5ヶ月前、もしくはそれより前に、または1年前、2年前、3年前、4年前、5年前、もしくはそれより前に、ワクチン接種する必要がない。ある局面では、注射されていない腫瘍または癌に治療用ウイルスが感染し、従って、局部投与および全身播種の両方によって患者が治療される。
ある特定の局面において、被験体には、少なくとも2x108、5x108、1x109、2x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011、5x1011、1x1012、5x1012またはそれ以上のウイルス粒子またはプラーク形成単位(pfu)が、前記の数値の間にある様々な値および範囲を含めて投与される。0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mLまたはそれ以上のウイルス用量を、前記の数値の間にある全ての値および範囲を含めて投与することができる。1つの局面において、用量は、例えば、少なくとも約5pg/mL、少なくとも約10pg/mL、少なくとも約40pg/mL、少なくとも約50pg/mL、少なくとも約100pg/mL、少なくとも約200pg/mL、少なくとも約500pg/mL、少なくとも約1,000pg/mL、少なくとも約5,000pg/mL、少なくとも約10,000pg/mL、少なくとも約15,000pg/mL〜少なくとも約20,000pg/mL、多くても約5pg/mL、多くても約10pg/mL、多くても約40pg/mL、多くても約50pg/mL、多くても約100pg/mL、多くても約200pg/mL、多くても約500pg/mL、多くても約1,000pg/mL、多くても約5,000pg/mL、多くても約10,000pg/mL、多くても約15,000pg/mL〜多くても約20,000pg/mL、または約5pg/mL、約10pg/mL、約40pg/mL、約50pg/mL、約100pg/mL、約200pg/mL、約500pg/mL、約1,000pg/mL、約5,000pg/mL、約10,000pg/mL、約15,000pg/mL〜約20,000pg/mLであり、前記の数値の間にある全ての値および範囲を含む、患者の血清中に検出可能なレベルのGM-CSFを生じさせるのに十分な用量である。ウイルスの一用量は、1時間、2時間、5時間、10時間、15時間、20時間、または24時間にわたって被験体または腫瘍に投与される量を指すことが意図される。用量は経時的に広がってもよく、別々の注射により広がってもよい。典型的には、複数の用量が、同じ一般的な標的領域、例えば、腫瘍の近くにある領域、または静脈内投与の場合では、被験体の血流またはリンパ系の特定の流入点に投与される。ある特定の局面において、ウイルス用量は、1本の針に複数の口を設けた針、もしくは注射器とつながっている複数の尖った先、またはその組み合わせを備えた注射器具によって送達される。さらなる局面において、ワクシニアウイルスベクターは、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上投与される。なおさらなる局面において、ワクシニアウイルスは、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくはそれ以上、または1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間もしくはそれ以上にわたって投与される。
ある特定の局面において、被験体はヒトである。被験体は癌および/または腫瘍に罹患していてもよい。ある特定の態様において、腫瘍は治療前に切除不能であり、かつ治療後に切除可能でもよい。ある特定の局面において、腫瘍は肝臓上に位置するか、または肝臓内に位置する。他の局面において、腫瘍は、脳癌腫瘍、頭頚部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝癌瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍でもよい。他の態様において、腫瘍は膀胱腫瘍である。なおさらなる態様において、腫瘍は黒色腫である。腫瘍は再発性でもよく、原発性でもよく、転移性でもよく、および/または多剤耐性の腫瘍でもよい。ある特定の態様において、腫瘍は肝細胞腫瘍であるか、または別の組織もしくは位置に由来する転移腫瘍である。ある特定の局面において、腫瘍は肝臓内にある。
ある特定の局面において、前記方法は、被験体に第2の癌療法を投与する工程をさらに含む。第2の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、寒冷療法、毒素療法および/または外科手術でもよく、その組み合わせを含んでもよい。さらなる局面において、化学療法はタキソールまたはソラフェニブでもよい。なおさらなる局面において、外科手術は、経動脈的化学塞栓術(TACE法、Vogl et al., European Radiology 16(6): 1393, 2005を参照されたい)を含む。前記方法は、ワクシニアウイルスベクターの第2の投与をさらに含んでもよい。本発明の方法は、治療前に、治療中に、もしくは治療後に、またはその組み合わせで、腫瘍細胞の生存を評価する工程をさらに含んでもよい。ある特定の態様において、ウイルスは、血管内に、腫瘍内に、またはその組み合わせで投与される。さらなる局面において、投与は、腫瘍塊への注射によるものである。なおさらなる態様において、投与は、腫瘍脈管構造への注射または腫瘍脈管構造の領域内への注射によるものである。なおさらなる態様において、投与は、腫瘍の領域のリンパ系または脈管構造系への注射によるものである。ある特定の局面において、前記方法は、投与前または投与中に腫瘍を画像化する工程を含む。ある特定の局面において、患者には、ワクシニアウイルスワクチンで予め免疫されるか、または予め免疫されない。さらなる局面において、被験体は天然で免疫無防備状態でもよく、臨床的に免疫無防備状態でもよい。
ある特定の局面において、ウイルスは、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも20％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも30％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも30％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも40％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも50％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも60％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも70％、注射された腫瘍内の細胞の少なくとも80％、または注射された腫瘍内の細胞の少なくとも90％において腫瘍崩壊を誘導するのに十分な量で投与される。
ある特定の態様において、ワクシニアウイルスは1つまたは複数の改変ウイルス遺伝子を含む。1つまたは複数の改変ウイルス遺伝子は、(a)インターフェロン調節ポリペプチド;(b)補体制御ポリペプチド;(c)TNF調節ポリペプチドもしくはケモカイン調節ポリペプチド;(d)セリンプロテアーゼ阻害剤;(e)IL-1β調節ポリペプチド;(f)非感染性EEV型ポリペプチド;(g)細胞からの感染性ウイルスの放出を阻害するように働くウイルスポリペプチド(抗感染性ウイルス型ポリペプチド)、またはその組み合わせの1つまたは複数を含んでもよい。
本発明の態様は一般的で重要な癌経路を標的とする。これらの経路の標的化は、腫瘍崩壊:壊死、血管閉鎖、CTL攻撃誘導、全身:IT、IV;腫瘍特異的CTLなどの複数の有効性のある機構につながる、様々な細胞機構(例えば、細胞チミジンキナーゼレベル:E2F応答性;EGF-R経路活性化;免疫避難所(immune sanctuary):抗ウイルスIFN応答(ras、p53);VEGFにより誘導される血管孔のサイズ:沈着IV)の調節を伴う。
本発明の態様は、癌治療としてワクシニアウイルスに安全性および有効性があることを証明した第1相臨床試験に基づいている。平均余命の中央値が6ヶ月未満の7人の転移性黒色腫患者による臨床試験を、2週間に1回の用量漸増試験において、腫瘍内注射を用いて行った。この臨床試験から、ワクシニアウイルスは安全性があり、忍容性が良好であり、5人の患者(71％)の腫瘍に対して奏功を示し、2人の長期生存者は疾患が認められなかった。
第1相/第2相臨床試験からの初期結果からも、JX-594の安全性が継続して証明された。インフルエンザ様の症状が5〜8日間観察された。血小板(plt)、リンパ、好中球絶対数(ANC)の一過的な減少(典型的には、Gr1〜2)も観察された。試験8日目に1人死亡したが、治療と関係がないことが確かめられた。全体的に見て、JX-594ウイルス血症は忍容性が良好であり、注射直後(15〜30分):3x108の最大血中総ゲノム、および複製ピーク(5〜8日目):1010の最大血中総ゲノムであった。
本願全体を通じて本発明の他の態様が議論される。本発明のある局面に関して議論されたいずれの態様も本発明の他の局面に当てはまり、逆の場合も同様である。実施例の項の中の態様は、本発明の全ての局面に適用可能な本発明の態様であると理解される。
「阻害する」、「低下させる」、もしくは「阻止」という用語、またはこれらの用語の任意の語尾変化は、特許請求の範囲および/または明細書において用いられた場合、望ましい結果を得るための任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
「1つの（a）」および「1つの（an）」という語句の使用は、特許請求の範囲または明細書において「含む(comprising)」という用語と共に用いられた場合、「1つ」を意味することがあるが、「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」、および「1つまたは1を超える」という意味とも一致する。
本明細書において議論された任意の態様は本明細書の任意の方法または組成物に関して実施できることが意図され、逆の場合も同様である。さらに、本発明の方法を実現するために、本発明の組成物およびキットを使用することができる。
本願全体を通じて、「約」という用語は、ある値が、この値を求めるために用いられている装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指す、すなわち、選択肢が互いに相反することを指すように明確な指示が出されていない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、この開示は、選択肢のみと「および/または」を指す定義を裏付ける。
本明細書および特許請求の範囲において使用する「含む(comprising)」(ならびに「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などの、含む(comprising)の任意の形)、「有する(having)」(ならびに「有する(have)」および「有する(has)」などの、有する(having)の任意の形)、「含む(including)」(ならびに「含む(includes)」および「含む(include)」などの、含む(including)の任意の形)、または「含有する(containing)」(ならびに「含有する(contains)」および「含有する(contain)」などの、含有する(containing)の任意の形)という語句は包括的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されなかった要素または方法の工程を排除しない。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の特定の態様を示しているが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中で様々な修正および変更が当業者に明らかになるので、例示にすぎないことが理解されるはずである。
添付の図面は、本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。これらの図面の1つまたは複数を、本明細書において示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をさらに深く理解することができる。
腫瘍内注射によるJX-594を用いた肝臓腫瘍臨床試験案。 腫瘍内注射によるJX-594を用いた黒色腫臨床試験案。 複数の新規の癌根絶機構を有する標的化腫瘍ウイルス療法。 転移性黒色腫に対するJX-594第1相臨床試験後の無病長期生存者。上の患者1は32歳女性である:難治性:DTIC,IL-2;注射腫瘍:CR;非注射転移:皮膚:CR;乳房:外科手術によりCR。生存、無病1.5+年。下の患者2は75歳男性である:複数の転移部位(n=24);注射腫瘍:CR;非注射転移:-CR;生存、無病3+年。 注射腫瘍および非注射腫瘍におけるJX-594第1相臨床試験の奏功。 JX594-IT-hep001-患者の人口統計値および治療状況-コホート1および2。 JX594-IT-hep001-患者の人口統計値および治療状況-コホート3。 血流中へのJX-594の静脈内播種:腫瘍からの早期漏出は用量と一致する。大部分が6時間までに一掃される。 患者の80％において明らかなJX-594複製によるウイルス血症。血中JX-594の第二波がサイクル1〜7において証明された。(+)投与後、用量が一掃された、(-)検出限界以下のレベル、四角=患者が試験休み、および(p)=データ保留中。検出限界=700ゲノム/ml。 患者の80％において明らかなJX-594複製によるウイルス血症。血液サイクル1〜7、3〜22日目における血中JX-594の第二波。 JX-594複製に関連する急性血管閉鎖の治療により誘導された虚血壊死(pt.1,胃癌)。 JX-594による長期の安定した疾患。扁平上皮癌の管理(肺-コホート2)。 代謝(PET)応答。2サイクルのJX-594の後のJX-594が注射された腫瘍黒色腫に対する奏功(コホート3)。 代謝(PET)応答。JX-594が注射された腫瘍肝癌の9+ヶ月にわたる長期管理(コホート2)。 腫瘍マーカー応答:AFPの99.9％減少。迅速な肝臓癌破壊が血液マーカーによって証明された。 JX-594による体重増加。10％の増加(6kg;14lb.)は忍容性、有効性を証明している。 全身ウイルス血症および腫瘍に対する奏功:JX-594関連ウイルス血症、結果として得られる全身有効性(HCC-コホート2)-AFPは 40％減少。 腫瘍へのJX-594全身送達および奏功:肝臓転移に注射した後の非注射遠位腫瘍における有効性。2サイクル後の2つの非注射腫瘍におけるPET代謝応答(Pt.304,コホート3)。 治療、有効性、および生存データ:CTおよびPETによる腫瘍に対する奏功、長期生存者。 試験の概要。 重要な血液検査および肝機能検査(エラーバー,平均の標準偏差)。(A)ANCの増加は、JX-594用量およびhGM-CSFの発現の増加と相関関係があった。黒色の棒:ANC;白色の棒:GM-CSF。X軸:患者の識別番号。(B)1回目のサイクルにおけるコホート3および4の患者のALTレベル。患者の大半は、ALTレベルが有意に経時変化しなかった。軽度の一過的なトランスアミナーゼ上昇も観察された。 血液検査の変化。(A)用量依存性の血小板減少。(B)血小板減少の大きさはサイクル依存性である。(C)サイクル1におけるANC、好酸球、および単球の変化の大きさは、後のサイクルと比較して大きかった。白色の棒:ANC;灰色の棒:好酸球;黒色の棒:単球。エラーバーは平均の標準誤差である。 JX-594による薬物動態、血液を介した伝播および遠位腫瘍感染。循環中の急性ゲノム濃度。注射15分後と早い段階でJX-594ゲノムが検出された。コホート1〜3については、急性クリアランス速度はコホート間で一致していた。 JX-594による薬物動態、血液を介した伝播および遠位腫瘍感染。サイクル1におけるコホート1および3のJX-594ゲノム濃度を示す。第2ピークのウイルス血症レベルを含めて、JX-594ゲノムの濃度は用量と関係があった。LOQ:定量限界。エラーバーは平均の標準誤差である。 JX-594による薬物動態、血液を介した伝播および遠位腫瘍感染。サイクル1における代表的なJX-594ゲノム濃度。 JX-594による薬物動態、血液を介した伝播および遠位腫瘍感染。黒色腫患者(コホート3)からのJX-594の回復およびhGM-CSFの発現。高レベルのJX-594ゲノムおよびGM-CSFが循環中ならびに悪性体液中に検出された(コホート3,黒色腫患者)。星印:検出不可能;PE:胸水。 JX-594による薬物動態、血液を介した伝播および遠位腫瘍感染。感染性JX-594の存在が悪性胸水中の細胞からのlac-Z発現(青色)によって証明された。 JX-594による薬物動態、血液を介した伝播および遠位腫瘍感染。非注射肝臓癌転移(頚部)からの生検試料はワクシニアウイルスB5R染色(矢印;茶色)を示している。 抗腫瘍有効性。(A)非小細胞肺癌標的腫瘍の代表的なCTスキャンおよび腫瘍測定。丸:腫瘍。矢印:JX-594投与を開始した時間。腫瘍断面積の経時変化に注意のこと。(B)代表的な身体検査、CTおよびPET-CTスキャンの結果から、高力価のJX-594中和抗体が誘導された後に注射された頚部転移腫瘍に対する客観的腫瘍奏功(4サイクル後)が証明された。
発明の詳細な説明
本発明は、癌を治療するための腫瘍崩壊性ポックスウイルスの使用に関する。特に、GM-CSFを発現するワクシニアウイルスを用いて、ある特定の程度の腫瘍崩壊が達成されることが説明される。別の態様において、GM-CSF発現ポックスウイルスは、ウイルスの宿主感染能が高まり、宿主細胞に対する毒性が少なくなり、および/または癌細胞感染能が高まるように遺伝子産物を変異または改変することによって、癌細胞の死滅においてさらに有効もしくは効率的になるように、および/または非癌細胞に対する毒性もしくは損傷が少なくなるように操作することができる。ある特定の改変は、ウイルスのチミジンキナーゼ(TK)機能を欠損させることである。
I.ポックスウイルス
ポックスウイルスは、何世紀もわたって、この科の名前の由来となった痘瘡ウイルス(天然痘)が作り出す特徴的な痘痕で知られている。天然痘は、2000年以上前に中国および極東において最初に出現したらしい。幸運にも、命にかかわることが多いこのウイルスは現在、根絶されており、最後の自然大発生は1977年にソマリアで起こった。
ポックスウイルスのウイルス粒子は卵状または煉瓦状であり、長さが約200〜400nmである。外面は平行な列になった隆起があり、時としてらせん状に並んでいる。粒子は極めて複雑であり、100種類以上の異なるタンパク質を含有している。細胞外型は2枚の膜を含有するのに対して(EEV-細胞外エンベロープビリオン)、細胞内粒子は内膜しか有さない(IMV-細胞内成熟ビリオン)。コアを取り囲む外面は、脂質およびタンパク質からなり、コアは、きつく圧縮された核タンパク質からなる。抗原的にもポックスウイルスは非常に複雑であり、特異的抗体および交差反応抗体を両方とも誘導する。粒子には少なくとも10種類の酵素が存在し、大部分が核酸代謝/ゲノム複製に関与している。
ポックスウイルスのゲノムは130〜300Kbpの直鎖二本鎖DNAである。ゲノムの末端には、いくつかの縦列反復配列を有する末端ヘアピンループがある。いくつかのポックスウイルスゲノムが配列決定されており、必須遺伝子のほとんどがゲノム中心部に位置しているのに対して、必須でない遺伝子は末端に位置している。ポックスウイルスゲノムには約250の遺伝子がある。
このウイルスはゲノム複製に必要な全ての機能を獲得しているほど十分に複雑であるので、複製は細胞質内で行われる。細胞はある程度寄与するが、この寄与がどういったものかは明らかでない。しかしながら、除核細胞ではポックスウイルスの遺伝子発現およびゲノム複製は起こるが、成熟はブロックされるので、細胞にはある程度の役割があることが分かる。
ポックスウイルスの受容体は一般に知られていないが、おそらく、複数あり、異なる細胞タイプ上にある。ワクシニアの場合、可能性が高い受容体の1つがEGF受容体である(McFadden, 2005)。侵入も複数の機構が伴うことがある。脱外被は2段階で起こる。(a)粒子が細胞に入り、細胞質内に入る時に外膜が取り除かれる、および(b)粒子のさらなる脱外被が起こり、コアが細胞質に入る。
細胞質に入ると、コアに関連するウイルス酵素によって遺伝子発現が行われる。発現は2つの局面に分けられ:ゲノムの約50％に相当する早期遺伝子がゲノム複製前に発現され、後期遺伝子がゲノム複製後に発現される。発現の時間制御は、活性がDNA複製に左右される後期プロモーターによってもたらされる。ゲノム複製は、高分子量コンカテマー形成につながるセルフプライミング(self-priming)を伴うと考えられている。後に、高分子量コンカテマーは、ウイルスゲノムを作るために切断および修復される。ウイルスの組み立ては細胞骨格内で起こり、おそらく、細胞骨格タンパク質(例えば、アクチン結合タンパク質)との相互作用を伴う。細胞質内の封入体がウイルス粒子に成熟する。細胞間伝播は、感染伝播とは別の機構であり得る。全体的に見て、この大きく複雑なウイルスの複製はかなり速く、平均して12時間しかかからない。
少なくとも9種類のポックスウイルスがヒト疾患の原因となるが、痘瘡ウイルスおよびワクシニアが最もよく知られている。痘瘡株は大痘瘡(致死率25〜30％)および小痘瘡(同じ症状であるが死亡率1％未満)に分けられる。両ウイルスとも感染は天然では呼吸器経路によって起こり、全身感染であり、様々な症状を生じるが、痘瘡に特徴的な膿疱および皮膚瘢痕が最も目立つ。
A.ワクシニアウイルス
ワクシニアウイルスは、約190Kbpの直鎖二本鎖DNAゲノムを有し、約250の遺伝子をコードする、大きく複雑なエンベロープウイルスである。ワクシニアは、天然痘を根絶したワクチンとして役割を果たしたことがよく知られている。天然痘が根絶された後に、科学者らは、遺伝子を生物組織に送達するための道具(遺伝子療法および遺伝子工学)としてワクシニアを用いることを研究してきた。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質でしか複製しないためにDNAウイルスの中では独特のウイルスである。従って、この大きなゲノムは、ウイルスDNA複製に必要な様々な酵素およびタンパク質をコードする必要がある。複製中に、ワクシニアは、外膜が異なる数種類の感染型:細胞内成熟ビリオン(IMV)、細胞内エンベロープビリオン(IEV)、細胞結合性エンベロープビリオン(CEV)、および細胞外エンベロープビリオン(EEV)を産生する。IMVは最も豊富な感染型であり、宿主間の伝播を担っていると考えられている。他方で、CEVは細胞間の伝播において役割を果たしていると考えられおり、EEVは、宿主生物内での広範囲の播種に重要だと考えられている。
ワクシニアは、ウイルスをインターフェロン耐性にする数種類のタンパク質をコードする。K3Lは、eIF-2αと相同性を有するタンパク質である。K3Lタンパク質は、インターフェロンのアクチベーターであるPKRの働きを阻害する。E3Lは別のワクシニアタンパク質であり、これもPKR活性化を阻害し、二本鎖RNAに結合することができる。
ワクシニアウイルスは、牛痘の原因となるウイルスと密接な関係がある。ワクシニアの正確な起源は分かっていないが、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、および痘瘡ウイルス(天然痘の原因作用物質)は全て共通の祖先ウイルスから生じたというのが最も一般的な見解である。ワクシニアウイルスは最初にウマから単離されたという推測もある。ワクシニアウイルスの感染は穏やかであり、典型的には、健常個体では無症候性であるが、軽度の発疹および発熱を引き起こすことがあり、致死率は極めて低い。ワクシニアウイルス感染に対して生じた免疫応答があると、致死性の天然痘感染が阻止される。このため、ワクシニアウイルスは、天然痘に対する生ウイルスワクチンとして用いられた。ワクシニアウイルスワクチンは天然痘ウイルスを含有しないため安全であるが、時々、特に、ワクチンが免疫無防備状態である場合に、ある特定の合併症および/またはワクチン副作用が生じることがある。
前記のように、ワクシニアウイルスは、多数の外来タンパク質を発現するように操作されてきた。このようなタンパク質の1つが顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、すなわちGM-CSFである。GM-CSFは、顆粒球(好中球、好酸球、および好塩基球)ならびにマクロファージを産生するように幹細胞を刺激する、マクロファージによって分泌されるタンパク質である。ヒトGM-CSFは、アミノ酸残基23(ロイシン)、27(アスパラギン)、および39(グルタミン酸)でグリコシル化されている(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,073,627号を参照されたい)。GM-CSFはモルグラモスチム、または、このタンパク質が酵母細胞において発現された時にはサルグラモスチム(商標登録Leukine(商標登録))とも知られる。これらは、化学療法後に、白血球、特に、顆粒球およびマクロファージの産生を刺激する薬として用いられる。GM-CSF発現ワクシニアウイルスは以前に報告されている。しかしながら、これは腫瘍崩壊剤ではなく、単にGM-CSFの送達ベクターと考えられた。従って、それは、有意な腫瘍崩壊を実現できる投与量より少ない投与量で患者に投与されてきた。本明細書では、GM-CSF発現ワクシニアウイルスの使用、ある態様では、1x108のpfuまたは粒子を超える濃度で投与されるGM-CSF発現ワクシニアウイルスの使用が説明される。
B.改変ポックスウイルス
ウイルスは、免疫調節分子、例えば、インターフェロン(α、β、γ)および腫瘍壊死因子α(TNFα)によって頻繁に不活化、阻害、または一掃される(Moss, 1996)。宿主組織および炎症細胞/免疫細胞は、ウイルス感染に応答して、これらの分子を頻繁に分泌する。これらの分子は、直接的な抗ウイルス作用ならびに/または炎症細胞およびリンパ球の動員および/もしくは活性化を介した間接的な作用を有し得る。これらの免疫によるクリアランス機構は重要であるので、ウイルスは、これらのサイトカイン/ケモカインおよびインターフェロンの誘導および/または機能を阻害する遺伝子産物を発現するように進化してきた。例えば、ワクシニアウイルス(VV、および他のいくつかのポックスウイルス)は、CCケモカイン(例えば、RANTES、エオタキシン、MIP-1-α)に結合し、阻害する分泌型タンパク質vCKBP(B29R)をコードする(Alcami et al., 1998)。VV株の中には、TNFに結合し、不活化する分泌型ウイルスタンパク質(例えば、Lister A53R)を発現するものもある(Alcami et al., 1999)。ほとんどのポックスウイルス株には、インターフェロンα/βに結合し、その機能を阻害する分泌型タンパク質(例えば、B18R)、またはインターフェロンに結合し、その機能を阻害する分泌型タンパク質(B8R)をコードする遺伝子がある。vC12Lは、IL-18がIFN-γおよびNK細胞/細胞傷害性T細胞の活性化を誘導しないようにするIL-18結合タンパク質である。
ほとんどのポックスウイルスビルレンス研究はマウスで行われてきた。これらのタンパク質の全てではないが多くがマウスにおいて活性がある(例えば、B18R)。これらのタンパク質が、標的サイトカインのマウスバージョンに対して活性のある状況では、これらの遺伝子が欠失すると、これらの遺伝子に欠失または機能的変異があるVV変種に関してビルレンスが低下し、安全性が高まる。さらに、阻害タンパク質を発現する親ウイルス株と比較して、これらの変種に対する炎症応答/免疫応答およびウイルスクリアランスが増加することが多い。例えば、ポックスウイルス分泌型タンパク質(ケモカイン結合性/阻害性タンパク質)のT1/35kDaファミリーが欠失すると、ウイルス感染組織への白血球浸潤が著しく増加する(Graham et al., 1997)。VVのvC12L遺伝子が欠失すると、マウスに鼻腔内投与した後のウイルス力価/毒性が低下する。さらに、IFN-γ誘導と共に、NK細胞および細胞傷害性Tリンパ球の活性が増加する(Smith et al., 2000)。粘液腫ウイルスT7遺伝子(IFN-γおよび広範囲のケモカインに結合することができる)が欠失するとビルレンスが低下し、毒性モデルにおける組織炎症/浸潤が著しく増加する(Upton et al., 1992; Mossman et al., 1996)。ウサギモデルでも、粘液腫ウイルスからM-T2遺伝子が欠失するとビルレンスが低下した(Upton et al. 1991)。また、B18R抗インターフェロンα/β遺伝子産物を欠失させても、IFNを介したクリアランスに対するウイルス感受性が増強し、正常組織における力価が低下し、ビルレンスが低下した(Symons et al., 1995; Colamonici et al., 1995; Alcami et al., 2000)。まとめると、これらのウイルス遺伝子産物は、抗ウイルス免疫応答およびウイルス感染組織への炎症細胞の浸潤を減少させるように機能する。タンパク質機能が欠失/変異により消失すると、宿主組織内でのウイルスのビルレンスが減少し、および/または炎症誘発性が増加する。
サイトカインおよびケモカインは強力な抗腫瘍作用を有することがある(Vicari et al., 2002; Homey et al., 2002)。これらの作用は、直接、腫瘍細胞自体に及ぶ場合があり(例えば、TNF)、非癌細胞に対する作用により間接的な場合がある。後者の一例はTNFであり、TNFは、腫瘍関連血管に対する毒性を引き起こすことによって抗腫瘍作用を有することがある。これによって、腫瘍への血流が消失し、その後に、腫瘍が壊死する。さらに、ケモカインは、免疫エフェクター細胞、例えば、好中球、好酸球、マクロファージおよび/またはリンパ球を動員(場合によっては活性化)するように働くことがある。これらの免疫エフェクター細胞は多くの機構によって腫瘍破壊を引き起こすことができる。これらの機構には、抗腫瘍サイトカイン(例えば、TNF)の発現、fas-リガンド発現、パーフォリンおよびグランザイムの発現、ナチュラルキラー細胞の動員などが含まれる。炎症応答は、最終的に、全身の腫瘍特異免疫の誘導につながり得る。最後に、これらのサイトカイン(例えば、TNF)またはケモカインの多くは化学療法または放射線療法と協力作用して、腫瘍を破壊することができる。
これらの免疫賦活タンパク質の組換えバージョンの臨床上有効な全身投与は、(1)全身投与により重篤な毒性が誘導されるため、ならびに(2)局部浸潤および抗腫瘍作用を刺激するのに腫瘍組織内での局部発現が必要なため、実行することができない。腫瘍塊内でのこれらの分子の局部濃度を高めながら、体循環中のレベルを最小限にするアプローチが必要とされる。ウイルスは、その有効性を増強しようとサイトカイン遺伝子またはケモカイン遺伝子を発現するように操作することができる。これらの遺伝子を複製選択性ベクターから発現させるのは、非複製ベクターから発現させるより潜在的に有利である。複製ウイルスから発現させると、腫瘍塊内の局部濃度が高くなり得る。さらに、複製ウイルスは、腫瘍細胞の破壊/腫瘍崩壊および炎症誘発環境における腫瘍抗原の放出を介して抗腫瘍免疫を誘導するのに役立ち得る。しかしながら、このアプローチにはいくつかの制約がある。高い局部濃度で発現されれば毒性となり得る遺伝子を有する、(腫瘍選択性であるが)複製能のあるウイルスが環境に放出される可能性があることから、重大な安全上の懸念が生じる。従って、ゲノムから強力な炎症誘発性遺伝子を発現するウイルスは、治療を受けている患者および一般大衆に安全上のリスクをもたらすことがある。これらの遺伝子を発現する腫瘍標的化、複製選択性ウイルスを用いても、正常組織において遺伝子発現が起こって、毒性が生じる可能性がある。さらに、サイズの制約が、ウイルス、例えば、アデノウイルスに由来する複数のおよび/または大きな遺伝子の発現を妨げる。明らかに、これらの分子は組み合わされると、より効果的に作用する。最後に、使用されている腫瘍崩壊ウイルスの多くは抗炎症タンパク質を発現し、従って、これらのウイルスは、感染した腫瘍塊内の炎症誘発環境の誘導を打ち消す。結果として、抗腫瘍免疫、抗血管作用、および化学療法/放射線療法に対する感受性増大(sensitization)の誘導が阻害されることになるだろう。
C.改変ワクシニアウイルス
1.インターフェロン調節ポリペプチド
インターフェロンα/βは、いくつかの機構によってウイルス複製をブロックする。インターフェロンγの直接的なウイルス阻害作用は弱いが、インターフェロンγは、いくつかの機構を介する細胞性免疫の強力な誘導物質である。ウイルスは、インターフェロンの抗ウイルス作用を打ち消すことができる分泌型遺伝子産物を発現するように進化してきた。例えば、ワクシニアウイルス(および他のポックスウイルス)は、インターフェロンγに結合する分泌型タンパク質B8R、およびインターフェロンα/βに結合する分泌型タンパク質B18Rをコードする(Smith et al., 1997; Symons et al., 1995; Alcami et al., 2000)。インターフェロン誘導を低下させるワクシニア遺伝子産物のさらなる例は、インターフェロンγ誘導因子であるIL-18の活性化を阻害するカスパーゼ-1阻害剤B13Rである。インターフェロン調節ポリペプチドには、B18R、他のウイルス株、例えば、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン(Copenhagen)株ではB19Rと呼ばれることがある;B8R;B13R;vC12L;A53R;E3L、および類似の活性または特性を有する他のウイルスポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。IFN調節ポリペプチドは、IFNα経路および/またはβ経路を優先的に調節するもの(例えば、B18R、B8R、B13R、またはvC12L)と、IFNγ経路を調節するもの(例えばB8R、B13R、またはvC12L)の包括的なカテゴリーに分けることができる。
癌細胞は、インターフェロンの作用に対して頻繁に耐性になる。多くの機構が関与している。これらは、癌細胞のよく見られる特徴であるrasシグナル伝達経路の活性化(例えば、ras変異、上流増殖因子受容体の過剰発現/変異などによる)によってPKRが阻害されるという事実を含んでいる。さらに、腫瘍塊の中でリンパ球は、腫瘍細胞によるIL-10産生およびfas-L発現を含む様々な機構によって阻害されることが多い。リンパ球は主なインターフェロンγ産生源であるので、リンパ球が阻害されると、腫瘍におけるインターフェロンγの産生が減少する。従って、腫瘍塊は、インターフェロンの作用から逃れる避難所になる傾向がある。さらに、インターフェロン自体に抗腫瘍作用があることがある。例えば、IFN-γは、MHCクラスI関連抗原提示を増加することができる。これにより、腫瘍細胞を、CTLを介してさらに効率的に死滅させることができる。例えば、IFNα/βは、腫瘍塊内の血管形成をブロックし、それによって腫瘍成長をブロックすることができる。
2.補体制御ポリペプチド
ウイルス病原体クリアランスの主な機構は、補体依存性機構による宿主内の感染細胞または生物内のビリオンの死滅である。感染細胞は死ぬので、感染性ウイルスを産生し続けることができない。さらに、アポトーシスの間に、DNAを分解する細胞内酵素が放出される。これらの酵素は、ウイルスDNAを分解し、ウイルスを不活化することができる。アポトーシスは、活性化補体および補体膜侵襲複合体の結合を含む非常に多くの機構によって誘導され得る。ワクシニアなどのポックスウイルスは、補体を介した、ウイルスおよび/またはウイルス感染細胞のクリアランスを打ち消すことができる遺伝子産物を発現するように進化してきた。それによって、これらの遺伝子はアポトーシスを阻止し、補体依存性機構によるウイルスクリアランスを阻害し、従って、ウイルス感染の進行およびウイルスビルレンスの増加が可能になる。例えば、ワクシニアウイルス補体制御タンパク質(VCP;例えば、C21L)は、補体を介した細胞死滅および/またはウイルス不活化の阻止において役割を有する(Isaacs et al., 1992)。VCPは発現するとウイルス感染組織への白血球浸潤が減少するので、抗炎症作用も有する。補体制御ポリペプチドには、C3LまたはC21Lとも知られるVCPが含まれるが、これに限定されない。
癌細胞は、抗補体性の細胞タンパク質を頻繁に過剰発現する。これにより、癌細胞は補体攻撃から生き残ることができる。従って、腫瘍細胞には補体を介した死滅に対する耐性が本来備わっているために、腫瘍細胞を優先的な標的とする薬剤には、広範囲のヒト癌における選択性および潜在的な有効性があるだろう(Durrant et al., 2001)。さらに、癌細胞の顕著な特徴の1つが正常なアポトーシス機構の消失である(Gross et al., 1999)。アポトーシスに対する耐性は、発癌、ならびに免疫剤、化学療法剤および放射線療法剤を含む抗腫瘍剤に対する耐性を促進する(Eliopoulos et al., 1995)。アポトーシスの阻害は、アポトーシス促進分子機能(例えば、bax)の消失、抗アポトーシス分子(例えば、bcl-2)のレベル/機能の増加、最後に、補体感受性の消失によって媒介されることがある。
3.TNF調節ポリペプチド
ウイルス病原体クリアランスの様々な機構の1つが、前記のようなアポトーシス誘導による宿主内の感染細胞の死滅である。アポトーシスは、細胞内シグナル伝達カスケードを誘発する、細胞TNF受容体へのTNFおよびリンホトキシンα(LTα)の結合を含む非常に多くの機構によって誘導され得る。TNF受容体の活性化は、免疫応答および炎症応答の調節ならびにアポトーシス細胞死の誘導において機能する(Wallach et al., 1999)。
一部のワクシニアウイルス株を含む様々なポックスウイルス株は、ウイルスおよび/またはウイルス感染細胞のTNFを介したクリアランスを打ち消すことができる遺伝子産物を発現するように進化してきた。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞外TNFに結合し、細胞外TNFを隔離することによってTNFの炎症誘発活性およびアポトーシス誘導活性を回避し、それにより、ウイルスクリアランスが阻害される。ウイルスは一掃されないので、ウイルス感染は進行し、従って、ウイルスビルレンスは増加する。ポックスウイルス科の様々なメンバーが分泌型ウイルスTNF受容体(vTNFR)を発現する。例えば、いくつかのポックスウイルス、例えば、粘液腫(T2タンパク質) はvTNFRをコードし、牛痘およびワクシニアウイルス株、例えば、リステリア(Lister)は、CrmB、CrmC(A53R)、CrmD、CrmE、B28Rタンパク質および/またはその等価物の1つまたは複数をコードすることがある。これらのvTNFRは、TNFを介した細胞死滅および/またはウイルス不活化の阻止において役割を有する(Saraiva and Alcami, 2001)。TNF調節ポリペプチドには、A53R、B28R(このタンパク質は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に存在するが、不活性な場合がある)、および類似の活性または特性を有する他のポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
癌細胞の顕著な特徴の1つが異常な遺伝子発現である。異常な遺伝子発現によって、増殖調節の多くの分子機構に対する感受性、例えば、TNF抗癌活性に対する感受性が消失する場合がある。従って、腫瘍微小環境内でウイルスが増殖するには、ウイルスの免疫調節機構は必要とされない場合がある。
4.セリンプロテアーゼ阻害剤
ウイルス病原体クリアランスの主な機構は、宿主内の感染細胞におけるアポトーシス誘導である。感染細胞は死ぬので、感染性ウイルスを産生し続けることができない。さらに、アポトーシスの間に、DNAを分解する細胞内酵素が放出される。これらの酵素は、ウイルスDNAを分解し、ウイルスを不活化することができる。アポトーシスは、サイトカイン(例えば、腫瘍壊死因子)の結合、細胞傷害性Tリンパ球によるグランザイム産生またはfas-リガンド結合を含む、非常に多くの機構によって誘導され得る。カスパーゼ活性化は、最後の共通するアポトーシス経路の重要な部分である。ウイルスは、fas-リガンドまたは腫瘍壊死因子(TNF)/TNF関連分子を含む、このような分子により誘導された細胞内シグナル伝達カスケードを打ち消すことができる遺伝子産物(例えば、アデノウイルスのE3 10.4/14.5、14.7遺伝子(Wold et al., 1994);アデノウイルスのE1B-19kD(Boyd et al., 1994);牛痘ウイルスに由来するcrmA;ワクシニアウイルスに由来するB13R)(Dobbelstein et al., 1996; Kettle et al., 1997))を発現するように進化してきた。これらの遺伝子産物は、アポトーシス誘導分子によるアポトーシスを阻止し、従って、抗ウイルス性のアポトーシス誘導サイトカイン、fas、グランザイムまたは他のアポトーシス刺激物質が存在するのにもかかわらずウイルス複製が進行するのを可能にする。
VV SPI-2/B13Rは牛痘CrmAとの相同性が高く、SPI-1(VV)はCrmAとの相同性が低い(Dobbelstein et al., 1996)。これらのタンパク質はセルピン(セリンプロテアーゼ阻害剤)であり、CrmAおよびSPI-2は様々な形のアポトーシスの阻止において役割を有する。例えば、インターロイキン1β変換酵素(ICE)およびグランザイムを阻害すると、感染細胞のアポトーシスを阻止することができる。これらの遺伝子産物には抗炎症作用もある。これらはIL-18活性化を阻害することができ、次いで、IL-18活性化が阻害されることによって、IL-18を介したIFN-γの誘導が減少する。それによって、細胞性免疫に対するIFN-γの免疫賦活作用が阻害される(Kettle et al., 1997)。SPIには、B13R、B22R、および類似の活性または特性を有する他のポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
癌細胞の顕著な特徴の1つが正常なアポトーシス機構の消失である(Gross et al., 1999)。アポトーシスに対する耐性は、発癌、ならびに免疫剤、化学療法剤および放射線療法剤を含む抗腫瘍剤に対する耐性を促進する(Eliopoulos et al., 1995)。アポトーシスの阻害は、アポトーシス促進分子機能(例えば、bax)の消失、抗アポトーシス分子(例えば、bcl-2)のレベル/機能の増加によって媒介されることがある。
5.IL-1β調節ポリペプチド
IL-1βは、局部に作用し、全身にも作用する生物学的に活性な因子である。IL-1βとIL-1αの間には機能上の差異がわずかしかないことが述べられている。IL-1βの非常に多くの生物学的活性は、IL-1を表している多くの異なる頭字語によって例示される。IL-1は、ブタ細胞において不活性なヒトIL-1βを除いて種特異性を示さない。IL-1の生物学的活性の一部は、ACTH(コルチコトロピン)、PGE2(プロスタグランジンE2)、PF4(血小板因子4)、CSF(コロニー刺激因子)、IL-6、およびIL-8を含む他のメディエーターの合成を誘導することによって間接的に媒介される。IL-1の合成は、TNF-α、IFN-α、IFN-β、およびIFN-γを含む他のサイトカインによって誘導されることがあり、細菌エンドトキシン、ウイルス、マイトジェン、および抗原によっても誘導されることがある。IL-1の主な生物学的活性はTヘルパー細胞の刺激であり、Tヘルパー細胞は、IL-2を分泌し、IL-2受容体を発現するために誘導される。ウイルス感染マクロファージは多量のIL-1阻害剤を産生する。IL-1阻害剤は、T細胞成熟血管を有する患者において日和見感染および細胞トランスフォーメーションを助け得る。IL-1はB細胞に直接作用して、B細胞の増殖および免疫グロブリン合成を促進する。IL-1はまた、B細胞をIL-5応答性にするプライミング因子(priming factor)の1つとして機能する。IL-1は、NK細胞および線維芽細胞、胸腺細胞、グリア芽細胞腫細胞の増殖および活性化を刺激する。
ウイルスタンパク質によるIL-1β合成のブロックは、IL-1によって誘発される全身抗ウイルス反応の抑制または減弱を可能にするウイルス戦略とみなされている。B1 5Rと類似の活性を有する、IL-1の機能を効果的にブロックする結合タンパク質が牛痘ウイルス遺伝子によってコードされることも見出されている。ワクシニアウイルスはまた、サイトカイン受容体のようにふるまうB8Rと呼ばれる別のタンパク質をコードする(Alcami and Smith, 1992; Spriggs et al., 1992)。IL-1調節ポリペプチドには、B13R、B15R、および類似の活性または特性を有する他のポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
癌細胞の顕著な特徴の1つが異常な遺伝子発現である。異常な遺伝子発現によって、増殖調節の多くの分子機構に対する感受性、例えば、IL-1抗癌活性に対する感受性が消失する場合がある。従って、腫瘍微小環境内でウイルスが増殖するには、ウイルスの免疫調節機構は必要とされない場合がある。
6.EEV型
転移性腫瘍部位へのウイルス伝播は概して非効率的であり、感染固形腫瘍塊内での伝播でも概して非効率的である(Heise et al., 1999)。ウイルスは静脈内投与されても、典型的には、抗体(例えば、アデノウイルス)(Kay et al., 1997)および/または補体系(例えば、HSV)(Ikeda et al., 1999)によってクリアランスまたは不活化される。これらの免疫を介した機構に加えて、これらのウイルスの体内分布によって、大多数の静脈内ウイルスは腫瘍塊ではなく正常組織に沈着する。例えば、静脈内アデノウイルスは、最後は、主に肝臓および脾臓にある。腫瘍内に沈着した投入ウイルスは免疫不全マウスでさえ0.1％未満である(Heise et al., 1999)。従って、免疫不全マウス腫瘍モデルにおいて極めて高い相対用量を用いると中程度の抗腫瘍有効性が証明できるが、静脈内送達は極めて非効率的であり、有効性を大きく制限する。
ワクシニアウイルスには、固形腫瘍内で複製し、壊死を引き起こす能力がある。さらに、チミジンキナーゼ欠失変種はマウス腫瘍モデル系において腫瘍塊および卵巣組織に感染し、マーカー遺伝子を優先的に発現することができる(Gnant et al., 1999)。しかしながら、これらの研究では5日後のマーカー遺伝子発現に基づいて腫瘍標的化が大まかに測定されたので、ウイルス優先的にが腫瘍/卵巣組織に沈着するか、腫瘍/卵巣組織において遺伝子を発現するか、または腫瘍/卵巣組織において複製するかどうかは不明である(Puhlmann et al., 2000)。機構に関係なく、さらなる導入遺伝子を有さない、このウイルスの抗腫瘍有効性は統計的に有意でなかった(Gnant et al., 1999)。対照的に、腫瘍内ウイルス注射には有意な抗腫瘍有効性があった(McCart et al. 2000)。従って、腫瘍への静脈内送達が改善されれば、静脈内有効性は改善できるだろう。
ワクシニアウイルスは細胞内で複製し、細胞内ウイルス(IMV,細胞内成熟ウイルス;IEV,細胞内エンベロープウイルス)と細胞外ウイルス(REV,細胞外エンベロープウイルス;CEV,細胞結合性細胞外ウイルス)を産生する(Smith et al., 1998)。IMVは、野生型ワクシニアウイルス株による複製後のウイルス収量の約99％に相当する。このウイルス型は環境において比較的安定であり、従って、主に、個体間の伝播を担っている。対照的に、このウイルスは、細胞からの放出が非効率的であり、補体に対する感受性および/または抗体中和があるために感染宿主内で効率的に伝播しない。対照的に、EEVは細胞外環境に放出され、典型的には、ウイルス収量の約1％しか相当しない(Smith et al., 1998)。EEVは感染宿主内でのウイルス伝播を担っており、宿主の外で比較的に簡単に分解される。重要なことに、EEVは、血流内での中和を阻害する、いくつかの機構を発達させてきた。第1に、EEVは補体に対してかなり耐性がある(Vanderplasschen et al., 1998)。この特徴は、宿主細胞の補体阻害剤が外膜外被に組み込まれていることと、ワクシニアウイルス補体制御タンパク質(VCP)が局部細胞外環境に分泌されるためである。第2に、EEVは、IMVと比較して中和抗体作用に対してかなり耐性がある(Smith et al., 1997)。EEVはまた、感染後、IMVより早い時点(例えば、4〜6時間)で放出され(IMVは細胞死の間/後にしか放出されない)、従って、EEV型の伝播は迅速である(Blasco et al., 1993)。
しかしながら、残念なことに、野生型ワクシニア株は、比較的、非常に少量のEEVしか作らない。さらに、ワクシニアウイルスを用いた治療(すなわち、ウイルスの投与)は、現在のところ細胞内ウイルス型に限られている。標準的なワクシニアウイルス(VV)を製造および精製する手順はEEV不活化につながり(Smith et al., 1998)、このウイルスを製造するために非ヒト細胞株が頻繁に用いられている。非ヒト細胞に由来するEEV型は、補体を介したクリアランスから保護されない(EEVが細胞から得る補体阻害タンパク質の作用は種限定的である)。従って、ワクシニアウイルスの有効性は、中和に対するIMV型の相対的な感受性、および固形腫瘍塊内でのその非効率的な伝播による制約を受けてきた。この伝播は、典型的には、細胞から隣接する細胞への伝播である。血流またはリンパ管を介した遠位腫瘍塊へのIMVの伝播もまた非効率的である。
従って、稀なEEV型ワクシニアウイルスは、現在まで患者において用いられているワクシニアウイルス型(IMV)より優れた特徴を天然に獲得している。EEVは、固形腫瘍の局部に、および局所腫瘍部位または遠位腫瘍部位に、迅速かつ効率的に伝播するのに最適である。EEVは補体作用に対してかなりの耐性があるので、同じ種に由来する細胞タイプにおいて増殖された場合、このウイルスは血管内投与された後に、(IMVのみ含有する)標準的なワクシニアウイルス調製物より高い安定性を有し、長期間、血中で活性を保持する(Smith et al.,1998)。EEVは抗体を介した中和に対して耐性があるので、このウイルス型は血管内投与された後に、(ほとんどIMVしか含有しない)標準的なワクシニアウイルス調製物より長期間、血中で活性を保持する(Vanderplasschen et al., 1998)。この特徴は、中和抗体レベルが増加した時の反復投与に特に重要であろう。認可された抗癌療法は全て反復投与を必要とする。従って、EEV型ワクシニアおよび他のポックスウイルスは、優れた治療用ウイルス送達、および血流を介した腫瘍への遺伝子ペイロード(genetic payload)をもたらすだろう。これは、標準的なポックスウイルス調製物と比較して高い全身有効性につながるだろう。最後に、EEVが体外で極めて不安定であるので、一般大衆間で伝播するリスクは大幅に低下するはずである。EEV型ウイルスの調節に関与するポリペプチドには、A34R、B5R、およびEEV型のポックスウイルスの産生に影響を及ぼす様々な他のタンパク質が含まれるが、これに限定されない。A34Rのコドン151がリジンからアスパラギン酸(K151D変異)に変異すると、A34Rタンパク質は、EEV型を細胞膜につなぎとめることができなくなる。B5Rは、補体に結合し得るEEV膜結合性ポリペプチドである。A43Rが完全に欠失すると、EEV放出が増加するが、ウイルス感染性が著しく低下する可能性があるのに対して、K151D変異が起こると、EEV放出が増加すると同時に、放出ウイルスの感染性は維持される。B5RはVCP(抗補体)と配列相同性を有するが、補体阻害はまだ証明されていない。
簡単に述べると、強化EEV型を同定する方法の1つは以下の通りである。EEVを氷冷MEMで希釈し、氷冷MEMで希釈した活性のある血清または熱失活させた(56℃、30分、対照)血清(血清の最終希釈1/10、1/20、または1/30)と混合する(1:1体積)。7℃で75分間インキュベートした後に、試料を氷上で冷却し、汚染物質(IMVおよび破裂したEEV)を中和するために、mAb 5B4/2F2を新鮮なEEV試料に添加する。次いで、ビリオンをRK13細胞に氷上で1時間結合させ、補体が結合しなかったビリオンを洗い流し、2日後にプラークの数を数える。プラーク数が多ければ多いほど、補体に対する耐性が大きい(参照により本明細書に組み入れられる、Vanderplasschen et al., 1998)。EEV型ワクシニアウイルスの単離について述べている例示的な方法は、(参照により本明細書に組み入れられる)Blasco et al., 1992に見つけることができる。
7.他のポリペプチド
他のウイルス免疫調節ポリペプチドは、免疫応答の他のメディエーターに結合するポリペプチド、および/または免疫応答に関連する分子経路を調節するポリペプチド、例えば、ケモカイン結合ポリペプチド、例えば、B29R(このタンパク質はワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に存在するが、不活性な場合がある)、C23L、vCKBP、A41L、および類似の活性または特性を有するポリペプチドを含んでもよい。他のワクシニアウイルスタンパク質、例えば、ウイルスのEGF様増殖因子であるワクシニアウイルス増殖因子(例えば、C11L)もまた、本発明のある態様において変化の標的であり得る。ウイルス免疫調節因子として分類することができる他のポリペプチドには、B7R、N1L、またはポックスウイルスのビルレンスを高める活性もしくは特性を有する他のポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
8.ワクシニアウイルスにより誘導される細胞融合
本発明のある特定の態様において、A56RまたはK2Lをコードする核遺伝子の変化、欠失、または変異は、VV感染により誘導される細胞間融合または合胞体形成につながることがある。ワクシニアウイルスにより誘導される細胞融合は、典型的には、腫瘍内ウイルスを蔓延させるのでVVの抗腫瘍有効性を増加させる。腫瘍内ウイルスが細胞融合により蔓延すると、典型的には、中和抗体および免疫応答を回避することができる。これらの遺伝子の一方または両方において変異を有するVVでは、隣接する非感染細胞の死滅および隣接する非感染細胞への感染(すなわち、「バイスタンダー効果」)がより効率的になるので、局部抗腫瘍作用が改善され得る。
D.他のポックスウイルス
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科(Poxviridae)、チョルドポックスウイルス亜科(Chordopoxvirinae)、オルトポックスウイルス属(Orthopoxvirus)のメンバーである。オルトポックスウイルス属は、チョルドポックスウイルス亜科の他のメンバーより比較的均一であり、11の異なるが近縁の種を含み、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス(天然痘の原因作用物質)、牛痘ウイルス、バッファロー痘ウイルス、サル痘ウイルス、マウス痘ウイルス、および馬痘ウイルス種、ならびに他の種を含む(Moss, 1996を参照されたい)。本発明のある特定の態様は、本明細書に記載のように、オルトポックスウイルス属ならびにパラポックスウイルス属(Parapoxvirus)、アビポックスウイルス属(Avipoxvirus)、カプリポックスウイルス属(Capripoxvirus)、レポリポックスウイルス属(Leporipoxvirus)、スイポックスウイルス属(Suipoxvirus)、モルシポックスウイルス属(Molluscipoxvirus)、およびヤタポックスウイルス属(Yatapoxvirus)の他のメンバーまで及んでもよい。ポックスウイルス科の属は、概して、実験動物における中和および交差反応性を含む血清学的手段によって規定される。オルトポックスウイルス属の様々なメンバーならびにチョルドポックスウイルス亜科の他のメンバーは、宿主生物の免疫応答に対抗するために免疫調節分子を利用する。免疫調節分子の例は本明細書において提供される。従って、本明細書に記載の発明はワクシニアウイルスに限定されず、多数のウイルスに適用することができる。
E.ウイルスの増殖
ワクシニアウイルスは、参照により本明細書に組み入れられるAusubel et al., 1994の中でEarl and Mossによって述べられた方法を用いて増殖させることができる。
II.タンパク質組成物および核酸組成物
本発明はポックスウイルスに関する。ポックスウイルスには、ウイルスが癌細胞に対して使用するのに望ましい特性を有すると同時に、非癌細胞に対して低毒性または無毒になるように、野生型と比較して1つまたは複数の変異を持つように構築されたポックスウイルスが含まれる。下記の開示は、例として、本発明の方法および組成物を実施する様々なプロトコール、例えば、組換えDNA技術を用いて変異ウイルスを作製する方法を提供する。
ある特定の態様において、本発明は、1つもしくは複数の機能的なポリペプチドもしくはタンパク質を欠いたポックスウイルスを作製すること、および/または特定の形のウイルス、例えば、感染性EEV型をより多く放出する能力を有するポックスウイルスを作製することに関する。他の態様において、本発明は、ポックスウイルス、およびポックスウイルスを、薬学的に許容される製剤の一部としてタンパク質組成物と併用することに関する。
本明細書で使用する「タンパク質」または「ポリペプチド」は、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む分子を指す。ある態様において、野生型のタンパク質またはポリペプチドが用いられる。しかしながら、本発明の多くの態様において、ウイルスが患者における癌細胞または癌の治療にさらに有用になるように、ウイルスタンパク質またはウイルスポリペプチドは存在しないか、または変えられる。前記の用語は本明細書において同義に用いられる。「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」は、野生型タンパク質または野生型ポリペプチドに対して化学構造が変化しているタンパク質またはポリペプチドを指す。ある態様において、改変タンパク質または改変ポリペプチドは、少なくとも1つの改変された活性または機能を有する(タンパク質またはポリペプチドは複数の活性または機能を有してもよいと認める)。活性または機能の改変は、野生型タンパク質または野生型ポリペプチドの活性または機能に対する、他の何らかのやり方(例えば、特異性)での低下、減弱、排除、増強、改善、または変化でもよい。具体的には、改変されたタンパク質またはポリペプチドは、ある活性または機能に関して変化しているが、他の点では野生型の活性または機能をなお保持してもよいと意図される。または、改変タンパク質は完全に機能的しなくてもよい。または、そのコグネイト核酸配列が、ポリペプチドが全く発現しなくなるように、切断されるように、またはフレームシフトの結果として異なるアミノ酸配列を発現するように変えられていてもよい。
ある特定の態様において、変異されたタンパク質またはポリペプチドのサイズは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500、またはそれ以上のアミノ分子残基、およびその中から得られる任意の範囲を含むが、これに限定されない。ポリペプチドは、対応する野生型よりポリペプチドを短くする切断によって変異されてもよいことが意図される。
本明細書で使用する「アミノ分子」は、当業者に公知の任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸模倣物を指す。ある特定の態様において、タンパク質分子の残基は連続しており、アミノ分子残基の配列は非アミノ分子によって中断されない。他の態様において、配列は、1つまたは複数の非アミノ分子部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質分子残基の配列は1つまたは複数の非アミノ分子部分によって中断されてもよい。
従って、「タンパク質組成物」という用語は、天然で合成されるタンパク質の中の20種類の一般的なアミノ酸の少なくとも1つ、または少なくとも1つの改変アミノ酸もしくは稀なアミノ酸を含む、アミノ分子配列を包含する。
タンパク質組成物は、標準的な分子生物学的技法によるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質化合物の単離、またはタンパク質材料の化学合成を含む当業者に公知の任意の技法によって作ることができる。様々な遺伝子のヌクレオチド配列ならびにタンパク質配列、ポリペプチド配列およびペプチド配列は以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースにおいて見つけることができる。このようなデータベースの1つが米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)のGenBankおよびGenPeptデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/)である。これらの公知の遺伝子のコード領域は、本明細書において開示された技法または当業者に公知の技法を用いて増幅および/または発現することができる。
A.機能的局面
本願が、ウイルスタンパク質またはウイルスポリペプチドの機能または活性について言及している場合、特に定めのない限り、生理学的条件下でのウイルスタンパク質またはウイルスポリペプチドの活性または機能について言及していると意図される。例えば、インターフェロン調節ポリペプチドは、少なくとも1種類のインターフェロンおよびその活性に直接的にまたは間接的な影響を及ぼすポリペプチドを指す。ポリペプチドは、インターフェロンの活性を、直接的にまたは間接的に、誘導、増強、上昇、増加、減弱、弱体化、低下、誘導、阻害、または遮蔽してもよい。インターフェロンに直接影響を及ぼす一例は、ある態様では、インターフェロンに特異的に結合するインターフェロン調節ポリペプチドを伴う。どの分子がこの活性を有するかは、当業者によく知られているアッセイ法を用いて確かめることができる。例えば、インターフェロンを調節する産物をコードする遺伝子またはその変異体を、インターフェロン活性が誘導されている細胞に導入し、このように遺伝子が導入された細胞と、インターフェロン活性が誘導されている細胞を比較すると、異なるインターフェロン応答レベルによって、インターフェロン調節機能を有する分子を特定することができる。
具体的には、モジュレーターは、標的分子の経路に関与するタンパク質組成物の発現に、例えば、インターフェロンをコードする転写物に結合することによって影響を及ぼす分子でもよいことが意図される。どの分子が、インターフェロン、IL-1β、TNF、または治療上利益のある他の分子の適切なモジュレーターであるかは、当業者によく知られているアッセイ法を用いて確かめることができる。前記のアッセイ法のいくつかは本明細書において開示され、例えば、ネイティブウイルスタンパク質および/または組換えウイルスタンパク質の使用を含んでもよい。
B.ウイルスポリペプチドの変異体
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体でもよい。ウイルスポリペプチドをコードする遺伝子の変異は、野生型と比較して、ポリペプチドの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、またはそれ以上の非連続アミノ酸または連続アミノ酸に影響を及ぼしてもよい。ワクシニアウイルスがコードする様々なポリペプチドは、Rosel et al., 1986、Goebel et al., 1990、およびGenBankアクセッション番号NC001559を参照することによって同定することができる。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
欠失変異体は、ネイティブタンパク質または野生型タンパク質の1つまたは複数の残基を欠いている。1つ1つの残基を欠失してもよく、ドメイン(例えば、触媒ドメインまたは結合ドメイン)の全てまたは一部を欠失してもよい。切断型タンパク質を作製するために、(置換または挿入によって)コード核酸配列に停止コドンが導入されてもよい。挿入変異体は、典型的には、ポリペプチドの非末端点に材料を付加することを伴う。これは、免疫反応性エピトープの挿入を含んでもよく、単に、1つまたは複数の残基の挿入を含んでもよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加も作製することができる。
置換変異体は、典型的には、タンパク質の中にある1つまたは複数の部位にあるアミノ酸を別のアミノ酸に交換することを含み、ポリペプチドの1つまたは複数の特性を調節しながら、他の機能もしくは特性も消失させるように、または他の機能もしくは特性を消失させないように設計されてもよい。置換は、保存的置換、すなわち、あるアミノ酸が類似する形状および電荷のアミノ酸で置換されてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへの変更;アルギニンからリジンへの変更;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変更;アスパラギン酸からグルタミン酸への変更;システインからセリンへの変更;グルタミンからアスパラギンへの変更;グルタミン酸からアスパラギン酸への変更;グリシンからプロリンへの変更;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変更;イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変更;ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変更;リジンからアルギニンへの変更;メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変更;フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変更;セリンからスレオニンへの変更;スレオニンからセリンへの変更;トリプトファンからチロシンへの変更;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変更;およびバリンからイソロイシンまたはロイシンの変更を含む。または、置換は、ポリペプチドの機能または活性に影響を及ぼすような非保存的置換でもよい。非保存的な変更は、典型的には、極性アミノ酸または荷電アミノ酸などの化学的に似てない特性を有する残基を、非極性アミノ酸または無電荷アミノ酸で置換することを含み、逆の場合も同様である。
「機能的に等価なコドン」という用語は、同じアミノ酸をコードするコドン(以下の表1を参照されたい)を指すために本明細書において用いられる。
（表１）コドン表
Figure 2014193882
アミノ酸配列および核酸配列は、さらなる残基、例えば、さらなるN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸または5'配列もしくは3'配列を含んでもよいが、タンパク質発現に関連する生物学的タンパク質活性の維持を含めて前記の基準を配列が満たしている限り、本質的には依然として、本明細書において開示される配列の1つに示される配列であることも理解されるだろう。末端配列の付加は特に核酸配列に適用され、核酸配列は、例えば、コード領域の5'部分または3'部分に隣接する様々な非コード配列を含んでもよく、遺伝子内で生じることが知られている様々な内部配列、すなわち、イントロンを含んでもよい。
以下は、等価な、さらには改善された第二世代の分子を作り出すための、タンパク質のアミノ酸の変更に基づく議論である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの構造との相互作用結合能力を相当量失うことなく、タンパク質構造のある特定のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の生物機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および相互作用性であるので、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列およびその基礎となるDNAコード配列において行い、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を作製することができる。従って、下記のように生物学的有用性または活性を相当量失うことなく、遺伝子のDNA配列に様々な変更を加えることができることが本発明者らによって意図される。表1は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示している。
このような変更を行う際に、アミノ酸ハイドロパシー指数が考慮されることがある。タンパク質への相互作用的生物機能の付与におけるアミノ酸ハイドロパシー指数の重要性は当技術分野において一般に理解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特徴が、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次に、この二次構造が、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などの相互作用を規定すると受け入れられている。
類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的になされ得ることも当技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,554,101号は、隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第4,554,101号に詳述されるように、以下の親水性値:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(-0.4);プロリン(-0.5±1);アラニン(-0.5);ヒスチジン(＊-0.5);システイン(-1.0);メチオニン(-1.3);バリン(-1.5);ロイシン(-1.8);イソロイシン(-1.8);チロシン(-2.3);フェニルアラニン(-2.5);トリプトファン(-3.4)がアミノ酸残基に割り当てられている。
アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換することができ、それでもなお、生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質を生成できることが理解される。このような変更において、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±0.5以内のアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
前記で概説したように、アミノ酸の置換は、概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。様々な前述の特徴を考慮に入れた例示的な置換が当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびスレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
III.核酸分子
A.ネイティブタンパク質または改変タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、タンパク質またはポリペプチドの全てまたは一部を発現することができる、細胞から単離可能なポリヌクレオチドに関する。本発明のある態様において、本発明は、ある特定の機能的なウイルスポリペプチドを欠くウイルスを生じるように特異的に変異されたウイルスゲノムに関する。このポリヌクレオチドは、ウイルスアミノ酸配列の全てまたは一部を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよく、このようなウイルスポリペプチドをコードしないように操作されてもよく、または少なくとも1つの機能または活性が低下した、減弱した、または存在しないウイルスポリペプチドをコードするように操作されてもよい。組換えタンパク質を発現細胞から精製して、活性タンパク質を得ることができる。ワクシニアウイルスのゲノムならびにコード領域の定義は、Rosel et al., 1986; Goebel et al., 1990;および/またはGenBankアクセッション番号NC 001559に見られる。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用する「DNAセグメント」という用語は、ある特定の種の総ゲノムDNAから取り出されて単離されているDNA分子を指す。従って、ポリペプチドをコードするDNAセグメントは、野生型ポリペプチドコード配列、多型ポリペプチドコード配列、または変種ポリペプチドコード配列を含有するが、哺乳動物またはヒトの総ゲノムDNAから取り出されて単離または精製されている、DNAセグメントを指す。「DNAセグメント」という用語には、ポリペプチド、ポリペプチドより小さなDNAセグメント、および、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。
本願において使用する「ポックスウイルスポリヌクレオチド」という用語は、総ゲノム核酸から取り出されて単離されている、ポックスウイルスポリペプチドをコードする核酸分子を指す。同様に、「ワクシニアウイルスポリヌクレオチド」は、総ゲノム核酸から取り出されて単離されている、ワクシニアウイルスポリペプチドをコードする核酸分子を指す。「ポックスウイルスゲノム」または「ワクシニアウイルスゲノム」は、ヘルパーウイルスの存在下または非存在下で、宿主細胞に供給するとウイルス粒子を生じることができる核酸分子を指す。このゲノムは、野生型ウイルスと比較して、組換えにより変異されていてもよく、変異されてなくてもよい。
「cDNA」という用語は、メッセンジャーRNA(mRNA)をテンプレートとして用いて調製されたDNAを指すことが意図される。ゲノムDNA、またはゲノムに由来する、プロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされたRNAテンプレートから重合されたDNAとは対照的に、cDNAを使用する利点は、cDNAが主に対応タンパク質のコード配列を含有する点にある。最適な発現に非コード領域が必要とされる場合、またはイントロンなどの非コード領域をアンチセンス戦略の標的としようとする場合など、完全ゲノム配列または部分ゲノム配列が好ましい時もある。
ある特定の種に由来するある特定のポリペプチドが、わずかに異なる核酸配列を有するが、それにもかかわらず、同じタンパク質をコードする天然変異体によって表すことができるとも意図される(前記の表1を参照されたい)。
同様に、単離または精製された野生型ポリペプチド遺伝子または変種ポリペプチド遺伝子を含むポリヌクレオチドは、野生型ポリペプチドコード配列または変種ポリペプチドコード配列を含み、ある特定の局面では、他の天然の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離された調節配列を含む、DNAセグメントを指す。この点で、「遺伝子」という用語は、機能的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする単位(適切な転写、翻訳後修飾、または局在化に必要な任意の配列を含む)を指すのを簡単にするために用いられる。当業者に理解されるように、この機能的な用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変種を発現するか、または発現するように適合されてもよい、ゲノム配列、cDNA配列、およびさらに小さな操作された遺伝子セグメントを含む。ネイティブポリペプチドまたは改変ポリペプチドの全てまたは一部をコードする核酸は、以下の長さ:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、もしくは塩基対の、このようなポリペプチドの全てまたは一部をコードする連続した核酸配列を含有してもよい。
特定の態様において、本発明は、アミノ酸配列の中に、ネイティブポリペプチドに従う連続アミノ酸配列またはネイティブポリペプチドに本質的に対応する連続アミノ酸配列を含む、野生型または変種のポックスウイルスポリペプチドまたはポックスウイルスペプチドをコードするDNA配列を組み込んでいる、単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。従って、単離されたDNAセグメントまたはDNAセグメントを含有するベクターは、例えば、INF活性を阻害または低下することができるINFモジュレーターまたはTNF調節ポリペプチドをコードしてもよい。「組換え」という用語は、ポリペプチドまたはある特定のポリペプチドの名前と共に用いられてもよく、これは、概して、インビトロで操作されている核酸分子、またはこのような分子の複製産物である核酸分子から生成されたポリペプチドを指す。
他の態様において、本発明は、アミノ酸配列の中に、ポリペプチドに従う連続アミノ酸配列またはポリペプチドに本質的に対応する連続アミノ酸配列を含む、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列を組み込んでいる、単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。
本発明において用いられる核酸セグメントは、コード配列自体の長さに関係なく、他の核酸配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどと組み合わせることができ、その結果、全長はかなり変化することがある。従って、ほぼ全ての長さの核酸断片を使用できることが意図され、全長は、好ましくは、目的の組換えDNAプロトコールにおける調製のしやすさおよび使いやすさによって制限される。
本発明の核酸構築物は、任意の供給源に由来する完全長ポリペプチドをコードしてもよく、コード領域の転写物が切断型となるように、切断型ポリペプチド、例えば、切断型ワクシニアウイルスポリペプチドをコードしてもよいことが意図される。次に、切断型転写物は切断型タンパク質に翻訳されてもよい。または、核酸配列は、完全長ポリペプチド配列と、さらなる異種コード配列、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にする異種コード配列、または標的化もしくは有効性などの治療上利益のある異種コード配列をコードしてもよい。前記のように、タグまたは他の異種ポリペプチドが改変ポリペプチドコード配列に付加されてもよく、ここで、「異種」は改変ポリペプチドと同一でないポリペプチドを指す。
非限定的な例において、B18R遺伝子などの特定の遺伝子と同一のまたは相補的なヌクレオチド連続配列を含む、1つまたは複数の核酸構築物が調製されてもよい。核酸構築物は、長さが少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100,000、250,000、500,000、750,000から、少なくとも1,000,000のヌクレオチド、ならびに酵母人工染色体などの核酸構築物の出現が当業者に公知であれば、染色体サイズまでおよび染色体サイズを含む(全ての中間の長さおよび中間の範囲を含む)それより大きなサイズの構築物でもよい。本明細書で使用する「中間の長さ」および「中間の範囲」は、引用された値を含む、および引用された値の間の任意の長さまたは範囲(すなわち、このような値を含む全ての整数、およびこのような値の間の全ての整数)を意味することが容易に理解されるだろう。
本発明において用いられるDNAセグメントは、生物機能的に等価な改変されたポリペプチドおよびペプチド、例えば、改変ゲロニン毒素を包含する。このような配列は、核酸配列内に天然に生じることが知られているコドン重複性(codon redundancy)および機能等価性の結果として生じることがあり、タンパク質はこのようにコードされる。または、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えDNA技術を適用することによって作り出されてもよい。ここで、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づいて、タンパク質構造の変化を操作することができる。人為的に設計される変化は、部位特異的変異誘発法を適用することによって、例えば、タンパク質の抗原性への改善を導入するように、タンパク質が与えられた被験体に対するインビボでのタンパク質の毒性作用を低下させるように、またはタンパク質を伴う任意の治療の有効性を高めるように部位特異的変異誘発法を適用することによって導入することができる。
ある特定の他の態様において、本発明は、本明細書において同定された(および/または参照により組み入れられる)配列で示された配列に由来する連続核酸配列を配列内に含む、単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。しかしながら、このような配列は、野生型に対して活性が変化しているタンパク質産物を生じるように変異されてもよい。
本発明は、これらの同定された配列の特定の核酸配列およびアミノ酸配列に限定されないことも理解されるだろう。従って、組換えベクターおよび単離されたDNAセグメントは、ポックスウイルスコード領域それ自体、選択された変化および改変を基本コード領域の中に有するコード領域を様々に含んでもよく、さらに大きなポリペプチドをコードするのにもかかわらずポックスウイルスコード領域を含んでもよく、変異体アミノ酸配列を有する生物機能的に等価なタンパク質またはペプチドをコードしてもよい。
本発明のDNAセグメントは、生物機能的に等価なポックスウイルスタンパク質およびポックスウイルスペプチドを包含する。このような配列は、核酸配列内に天然に生じることが知られているコドン重複性および機能等価性の結果として生じることがあり、タンパク質はこのようにコードされる。または、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えDNA技術を適用することによって作り出されてもよい。ここで、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づいて、タンパク質構造の変化を操作することができる。人為的に設計される変化は、部位特異的変異誘発法を適用することによって、例えば、タンパク質の抗原性への改善を導入するように部位特異的変異誘発法を適用することによって導入することができる。
B.ポックスウイルスポリヌクレオチドの変異誘発
様々な態様において、ポックスウイルスポリヌクレオチドは変化または変異誘発されてもよい。変化または変異は挿入、欠失、点変異、逆位などを含んでもよく、ある特定の経路または分子機構の調節、活性化、および/または不活化をもたらしてもよく、遺伝子産物の機能、位置、または発現の変化をもたらしてもよく、特に、遺伝子産物を機能しないようにしてもよい。ポックスウイルスの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドの変異誘発が用いられる場合、様々な標準的な変異誘発手段によって達成することができる(Sambrook et al., 1989)。変異は、生物の量または構造の変化をもたらすプロセスである。変異は、単一遺伝子のヌクレオチド配列、ひとまとまりの遺伝子、または染色体全体の改変を伴ってもよい。単一遺伝子の変化は、DNA配列内の1個のヌクレオチド塩基の除去、付加、または置換を伴う点変異の結果でもよく、多数のヌクレオチドの挿入または欠失を伴う変化の結果でもよい。
変異は、化学的変異原または物理的変異原への曝露後に誘導されてもよい。このような変異誘導剤には、電離放射線、紫外線、ならびに多様な化学物質、例えば、アルキル化剤および多環式芳香族炭化水素が含まれる。前記の化学物質は全て、直接的にまたは間接的に(一般的に、代謝による生体内変換の後に)核酸と相互作用することができる。このような作用物質によって誘導されたDNA損傷は、影響を及ぼしたDNAが複製または修復される時に塩基配列を改変し、従って、変異につながり得る。変異はまた、特定の標的化方法を用いることによって部位特異的な変異でもよい。
C.ベクター
ポックスウイルスゲノムにおいて変異を生じさせるために、ネイティブポリペプチドおよび改変ポリペプチドは、ベクター内に含まれる核酸分子によってコードされてもよい。「ベクター」という用語は、外因性核酸配列を、複製可能な細胞に導入するために挿入することができる担体核酸分子を指すために用いられる。核酸配列は「外因性」でもよい。「外因性」は、核酸配列が、ベクターが導入される細胞にとって外来のものであること、または細胞内の配列と相同であるが、通常見られない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YACs)が含まれる。当業者であれば、Sambrook et al., (1989)およびAusubel et al., 1994に記載の標準的な組換え技法によってベクターを構築するのに十分な装備を持っているだろう。Sambrook et al., (1989)およびAusubel et al., 1994は両方とも参照により本明細書に組み入れられる。ベクターは、改変ゲロニンなどの改変ポリペプチドをコードすることに加えて、タグまたは標的化分子などの非改変ポリペプチド配列をコードしてもよい。このような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、pINベクター(Inouye et al., 1985)、ヒスチジン配列をコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断のためのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質の作製において用いられるpGEXベクターが含まれる。標的化分子は、改変ポリペプチドを、ある特定の器官、組織、細胞、または被験体内にある他の位置に向ける分子である。
「発現ベクター」という用語は、遺伝子産物の少なくとも一部をコードする転写可能な核酸配列を含有するベクターを指す。場合によっては、次に、RNA分子はタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は翻訳されず、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムが生成される。発現ベクターは、ある特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の転写に必要であり、おそらく翻訳に必要な核酸配列を指す様々な「制御配列」を含有してもよい。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、他の機能も果たし以下で説明される核酸配列を含有してもよい。
1.プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および調節分子が結合し得る遺伝因子を含有してもよい。「機能的に配置された」「機能的に連結された」、「制御下にある」、および「転写制御下にある」という句は、プロモーターが、核酸配列の転写開始および/または発現を制御するために、核酸配列に対して正しい機能的な位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは「エンハンサー」と共に用いられてもよく、用いられなくてもよい。エンハンサーは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す。
プロモーターは遺伝子または配列と天然で関連しているものでもよく、コードセグメントおよび/またはエキソンの上流に位置する5'非コード配列を単離することによって得ることができる。このようなプロモーターは「内因性」プロモーターと呼ばれることがある。同様に、エンハンサーは核酸配列と天然で関連しているものでもよく、核酸配列の下流に位置してもよく、上流に位置してもよい。または、コード核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下に置くことによって、ある特定の利益が得られる。組換えプロモーターまたは異種プロモーターは、天然環境において核酸配列と通常関連していないプロモーターを指す。組換エンハンサーえまたは異種エンハンサーも、天然環境において核酸配列と通常関連していないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他の任意の原核細胞、ウイルス細胞、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然」ではないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび/または発現を変える変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含んでもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、配列は、本明細書において開示される組成物と共に、組換えクローニング技術および/またはPCR(商標)を含む核酸増幅技術を用いて生成されてもよい(米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号を参照されたい。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。さらに、配列を、直接、ミトコンドリア、葉緑体などの核でない細胞小器官の中で転写および/または発現させる制御配列も使用できることが意図される。
もちろん、発現のために選択された細胞タイプ、細胞小器官、および生物においてDNAセグメントを効率的に発現させるプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用することが重要な場合もある。分子生物学の当業者であれば、タンパク質を発現させるために、プロモーター、エンハンサー、および細胞タイプの組み合わせを用いることを通常知っている。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al. (1989)を参照されたい。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および/または導入されたDNAセグメントを高レベルに発現させるのに適切な条件下で、例えば、組換えタンパク質および/または組換えペプチドの大規模産生に有利な条件下で有用なプロモーターでよい。プロモーターは異種プロモーターでもよく、内因性プロモーターでもよい。
組織特異的なプロモーターまたはエレメントの正体、ならびにその活性を特徴付けるアッセイ法は当業者に周知である。このような領域の例には、ヒトLIMK2遺伝子(Nomoto et al., 1999)、ソマトスタチン受容体2遺伝子(Kraus et al., 1998)、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子(Lareyre et al., 1999)、ヒトCD4(Zhao-Emonet et al., 1998)、マウスα2(XI)コラーゲン(Tsumaki, et al., 1998)、D1Aドーパミン受容体遺伝子(Lee, et al., 1997)、インシュリン様増殖因子II(Wu et al., 1997)、ヒト血小板内皮細胞接着分子-1(Almendro et al., 1996)、およびSM22αプロモーターが含まれる。
2.開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
コード配列が効率的に翻訳されるには、ある特定の開始シグナルも必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを設けることが必要な場合がある。当業者であれば、このことを容易に決定し、必要なシグナルを設けることができるだろう。インサート全体の翻訳を確実にするために、開始コドンが望ましいコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然のものでもよく、合成のものでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントの含有によって増強することができる。
本発明のある特定の態様において、多重遺伝子のメッセージまたはポリシストロニックなメッセージを作り出すために、配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントの使用が用いられる。IRESエレメントは、5'メチル化Cap依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる(Pelletier and Sonenberg, 1988)。ピコルナウイルス科の2つのメンバー(ポリオおよび脳心筋炎)に由来するIRESエレメントが述べられおり(Pelletier and Sonenberg, 1988)、哺乳動物メッセージに由来するIRESも述べられている(Macejak and Sarnow, 1991)。IRESエレメントは異種オープンリーディングフレームと連結することができる。それぞれIRESによって分けられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写して、ポリシストロニックなメッセージを作り出すことができる。IRESエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近することができる。1種類のプロモーター/エンハンサーを用いて1本のメッセージを転写するように、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号を参照されたい)。
3.マルチクローニングサイト
ベクターは、マルチクローニングサイト(NCS)を含んでもよい。マルチクローニングサイトは、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域であり、どの制限酵素部位も、ベクターを消化するために標準的な組換え技術と共に使用することができる(参照により本明細書に組み入れられる、Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998、およびCocea, 1997を参照されたい)。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でしか機能しない酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者に広く理解されている。往々にして、外因性配列がベクターに連結できるように、MCS内で切断する制限酵素を用いて、ベクターは直線化または断片化される。「連結」は、2つの核酸断片間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。2つの核酸断片は互いに連続してもよく、連続してなくてもよい。制限酵素および連結反応を伴う技法は組換え技術の当業者に周知である。
4.スプライシング部位
ほとんどの転写された真核生物RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するRNAスプライシングを受ける。転写物を適切にプロセシングして、タンパク質を発現するために、ゲノム真核生物配列を含有するベクターはドナースプライシング部位および/またはアクセプタースプライシング部位と必要とする場合がある(参照により本明細書に組み入れられる、Chandler et al., 1997を参照されたい)。
5.終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は、一般的に、少なくとも1つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写の特異的な終結に関与するDNA配列からなる。従って、ある特定の態様において、RNA転写物の生成を終わらせる終結シグナルが意図される。望ましいメッセージレベルを得るために、ターミネーターがインビボで必要な場合がある。
真核生物系において、ターミネーター領域はまた、新たな転写物を部位特異的に切断して、ポリアデニル化部位を曝露するのを可能にする特定のDNA配列も含んでよい。これは、約200のA残基(ポリA)の配列を転写物の3'末端に付加するように、特殊な内因性ポリメラーゼにシグナルを送る。このポリAテールで修飾されたRNA分子は安定性が高いように見られ、より効率的に翻訳される。従って、真核生物を伴う他の態様において、ターミネーターはRNA切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルはメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび/またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強するのに、および/またはカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするのに役立ち得る。
本発明における使用が意図されるターミネーターには、本明細書に記載のまたは当業者に公知の任意の公知の転写ターミネーターが含まれる。これには、例えば、遺伝子終結配列、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター、またはウイルス終結配列、例えば、SV40ターミネーターが含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様において、終結シグナルは、転写可能な配列または翻訳可能な配列が欠けたもの、例えば、配列が切断されたために転写可能な配列または翻訳可能な配列が欠けたものでもよい。
6.ポリアデニル化シグナル
発現、特に、真核生物での発現において、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルが組み込まれる。ポリアデニル化シグナルがどういったものであるかは本発明の実施の成功に重要だと考えられておらず、および/またはこのような任意の配列を使用することができる。好ましい態様には、便利な、および/または様々な標的細胞において良好に機能することが知られている、SV40ポリアデニル化シグナルおよび/またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は転写の安定性を高めてもよく、細胞質への輸送を容易にしてもよい。
7.複製起点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、ベクターは、1つまたは複数の複製起点部位(しばしば「ori」と呼ばれる)を含有してもよい。複製起点部位は、複製が開始する特定の核酸配列である。または、宿主細胞が酵母であれば、自己複製配列(ARS)を使用することができる。
8.選択マーカーおよびスクリーニングマーカー
本発明のある特定の態様において、本発明の核酸構築物を含有する細胞は、発現ベクター内にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。このようなマーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、それにより、発現ベクターを含有する細胞を容易に同定できるようになる。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーは、マーカーが存在すると細胞の選択が可能になるものであるのに対して、負の選択マーカーは、マーカーが存在すると細胞の選択が妨げられるものである。正の選択マーカーの一例は薬物耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーの含有は、形質転換体のクローニングおよび同定を助ける。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン(zeocin)、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。条件実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析を基本原理とするGFPなどのスクリーニングマーカーを含む他のタイプのマーカーも意図される。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)などのスクリーニング可能な酵素を使用することができる。当業者であれば、免疫マーカーを、おそらくFACS分析と共に使用する方法も知っているだろう。使用されるマーカーは遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できさえすれば、重要だと考えられていない。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
D.宿主細胞
本明細書で使用する「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という用語は同義に使用することができる。これらの全ての用語は、任意のおよび全ての次世代である子孫も含む。全ての子孫は、故意の変異または故意でない変異のために同一でなくてもよいことが理解される。異種核酸配列の発現という状況において、「宿主細胞」は原核細胞または真核細胞を指し、ベクターを複製することができる、および/またはベクターがコードする異種遺伝子を発現することができる任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターまたはウイルスのレシピエントとして使用することができ、ベクターまたはウイルスのレシピエントとして用いられてきた(外因性ポリペプチドを発現しなければ、ベクターとしての資格がない)。宿主細胞には、改変タンパク質コード配列などの外因性核酸が宿主細胞に移動または導入されるプロセスを指す「トランスフェクト」または「形質転換」がなされてもよい。形質転換細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
宿主細胞は、望ましい結果がベクターの複製であるか、またはベクターによりコードされる核酸配列の一部もしくは全ての発現であるかに応じて、原核生物に由来してもよく、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む真核生物に由来してもよい。非常に多くの細胞株および培養物が宿主細胞として使用するために入手可能であり、生きている培養物および遺伝物質の保存機関として働く組織であるアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)を通じて入手することができる(www.atcc.org)。適切な宿主は、ベクターバックボーンおよび望ましい結果に基づいて当業者により決定することができる。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製用の原核宿主細胞に導入することができる。ベクターの複製用および/または発現用の宿主細胞として用いられる細菌細胞には、DH5α、JM109、およびKC8、ならびに多数の市販の細菌宿主、例えば、SURE(登録商標)コンピテント細胞およびSOLOPACK(商標)Gold細胞(STRATAGENE(登録商標), La Jolla, Calif)が含まれる。または、ファージウイルスの宿主細胞として大腸菌LE392などの細菌細胞を使用することができる。適切な酵母細胞には、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)が含まれる。
ベクターの複製用および/または発現用の真核宿主細胞の例には、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos、およびPC12が含まれる。様々な細胞タイプおよび生物に由来する多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者に公知である。同様に、ウイルスベクターが、真核宿主細胞または原核宿主細胞、特に、ベクターの複製または発現を許容する細胞と共に使用することができる。
一部のベクターは、原核細胞および真核細胞におけるベクターの複製および/または発現を可能にする制御配列を使用することがある。当業者であれば、細胞を維持し、ベクターの複製を可能にするために、前記の全ての宿主細胞をインキュベートする条件をさらに理解しているだろう。ベクターの大規模生成ならびにベクターがコードする核酸およびそのコグネイトポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生成を可能にする技法および条件も理解されており、公知である。
E.遺伝子導入法
本発明の組成物を発現させる適切な核酸送達法は、本明細書に記載または当業者に公知のように、核酸(例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むDNA)を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入することができる実質的に任意の方法を含むと考えられている。このような方法には、DNAの直接送達、例えば、マイクロインジェクション(参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub,1985;米国特許第5,789,215号)を含む、注入(米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号、同第5,580,859号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);エレクトロポレーション(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,253号);リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990);DEAE-デキストラン後のポリエチレングリコールの使用(Gopal, 1985);ダイレクトソニックローディング(direct sonic loading)(Fechheimer et al., 1987);リポソームを介したトランスフェクション(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991);微粒子銃(PCT出願WO94/09699およびWO95/06128;米国特許第5,610,042号;同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号、および同第5,538,880号。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);炭化ケイ素繊維を用いた攪拌(Kaeppler et al., 1990;米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);アグロバクテリウム(Agrobacterium)を介した形質転換(米国特許第5,591,616号および同第5,563,055号。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);またはPEGを介したプロトプラスト形質転換(Omirulleh et al., 1993;米国特許第4,684,611号および同第4,952,500号。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);乾燥/阻害を介したDNA取り込み(Potrykus et al., 1985)によるDNAの直接送達が含まれるが、これに限定されない。これらの方法などの技法を適用することによって、細胞小器官、細胞、組織、または生物を、安定してまたは一過的に形質転換することができる。
F.脂質成分および脂質部分
ある特定の態様において、本発明は、核酸、アミノ酸分子、例えば、ペプチド、または別の低分子化合物に関連する1種類または複数の種類の脂質を含む組成物に関する。本明細書において議論される任意の態様において、前記の分子は、ポックスウイルスポリペプチドまたはポックスウイルスポリペプチドモジュレーター、例えば、ポックスウイルスポリペプチドの全てもしくは一部をコードする核酸、またはポックスウイルスポリペプチドモジュレーターの全てもしくは一部をコードするアミノ酸分子でもよい。脂質は、特徴として、水不溶性であり、有機溶媒で抽出可能な物質である。本明細書に具体的に記載されたもの以外の化合物が当業者により脂質と理解されており、本発明の組成物および方法に包含される。脂質成分および非脂質は互いに共有結合により結合してもよく、非共有結合により結合してもよい。
脂質は天然の脂質でもよく、合成の(すなわち、人間が設計または生成した)脂質でもよい。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル結合およびエステル結合した脂肪酸を有する脂質ならびに重合可能な脂質、ならびにその組み合わせを含む。
脂質と関連する核酸分子またはアミノ酸分子、例えば、ペプチドは、脂質を含有する溶液中に分散されてもよく、脂質と共に溶解されてもよく、脂質と共に乳化されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質に共有結合されてもよく、懸濁液として脂質中に含有されてもよく、または別の方法で脂質と関連してもよい。本発明の脂質または脂質/ポックスウイルス関連組成物は特定の構造に限定されない。例えば、本発明の脂質または脂質/ポックスウイルス関連組成物は溶液中に単に散在されてもよく、おそらく、サイズまたは形状が均一でない凝集物を形成する。別の例では、本発明の脂質または脂質/ポックスウイルス関連組成物はミセルとして二重層構造で存在してもよく、「崩壊した」構造を伴って存在してもよい。非限定的な別の例において、リポフェクタミン(Gibco BRL)-ポックスウイルスまたはSuperfect(Qiagen)-ポックスウイルス複合体も意図される。
ある特定の態様において、脂質組成物は、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、約60％、約61％、約62％、約63％、約64％、約65％、約66％、約67％、約68％、約69％、約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、またはおよびその中から得られる任意の範囲の、ある特定の脂質、脂質型成分、または非脂質成分、例えば、薬物、タンパク質、糖、核酸、または本明細書において開示される、もしくは当業者に公知の他の材料を含んでもよい。非限定的な例において、脂質組成物は、約10％〜約20％の中性脂質、および約33％〜約34％のセレブロシド、および約1％のコレステロールを含んでもよい。別の非限定的な例において、リポソームは、約4％〜約12％のテルペン、約10％〜約35％のホスファチジルコリン、および約1％の薬物を含んでもよく、ミセルの約1％は具体的にはリコペンであり、リポソームの約3％〜約11％は他のテルペンを含む。従って、本発明の脂質組成物は、脂質、脂質型、または他の成分のいずれかを任意の組み合わせまたはパーセント範囲で含んでもよいことが意図される。
IV.薬学的製剤、送達および治療レジメン
本発明の一態様において、変化したポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスを送達することによって、過剰増殖性疾患、例えば、癌を治療する方法が意図される。治療が意図される癌の例には、肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、子宮頚癌、胃腸癌、リンパ腫、肺の新生物発生前の病変、結腸癌、黒色腫、膀胱癌、および治療され得る他の任意の癌または腫瘍が含まれる。
薬学的組成物の有効量は、腫瘍崩壊、癌細胞の破壊または溶解、ならびに腫瘍の成長およびサイズの遅延、阻害、または低下を誘導するのに十分な量と本明細書において定義され、ある特定の場合では腫瘍の根絶を含む。有効量はまた、間接的に、治療用ウイルスを全身播種して腫瘍に送る量、例えば、非注射腫瘍に感染する量を包含してもよい。
好ましくは、患者は、十分な骨髄機能(末梢顆粒球絶対数>2,000/mm3および血小板数100,000/mm3と規定した)、十分な肝機能(ビリルビン<1.5mg/dl)、ならびに十分な腎機能(クレアチニン<1.5mg/dl)を有する。
A.投与
本発明の方法および組成物を用いて腫瘍崩壊を誘導するために、腫瘍とGM-CSF発現ポックスウイルスを接触させる。当然、投与経路は、病変の位置および種類によって変わり、例えば、皮内投与、経皮投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮下投与、局所投与(例えば、腫瘍の近くへの投与、特に、腫瘍の脈管構造または腫瘍の隣接する脈管構造の近くへの投与)、経皮的投与、気管内投与、腹腔内投与、動脈内投与、膀胱内投与、腫瘍内投与、吸入、灌流、洗浄、ならびに経口投与および経口製剤を含む。
孤立性で接近可能な固形腫瘍については、腫瘍内注射または腫瘍脈管構造に直接注射することが特に意図される。局部投与、局所投与、または全身投与も適している場合がある。>4cmの腫瘍の場合、投与される体積は約4〜10ml(好ましくは10ml)であるのに対して、<4cmの腫瘍の場合、約1〜3mlの体積が用いられる(好ましくは3ml)。単一用量として送達される複数回注射は約0.1〜約0.5mlの体積からなる。約1cm間隔で腫瘍に複数回注射を投与することによって、ウイルス粒子を有利に接触させることができる。外科的介入の場合、手術不能の腫瘍を切除できるようにするために、本発明は手術前に用いられてもよい。適宜、例えば、カテーテルを腫瘍または腫瘍脈管構造に移植することによって、連続投与が適用されてもよい。このような連続灌流は、治療開始後に、約1〜2時間、約2〜6時間、約6〜12時間、約12〜24時間、約1〜2日、約1〜2週間、またはそれ以上、行われてもよい。一般的に、連続灌流による治療用組成物の用量は、一回または複数回の注射によって与えられる用量と同等であり、灌流が行われる期間にわたって調節される。本発明の治療用組成物を投与するために、特に、黒色腫および肉腫の治療において本発明の治療用組成物を投与するために、四肢灌流を使用できることがさらに意図される。
治療レジメンも異なってもよく、しばしば、腫瘍タイプ、腫瘍の位置、疾患の進行、ならびに患者の健康および年齢に左右される。明らかに、あるタイプの腫瘍はより積極的な治療を必要とするが、同時に、ある特定の患者は負担の重いプロトコールに耐えられない。治療用製剤の公知の有効性および(毒性がもしあれば)毒性に基づいて、このような判断を下すのに、医師が最も適しているだろう。
ある特定の態様では、治療されている腫瘍は、少なくとも最初は、切除可能でなくてもよい。治療用ウイルス構築物を用いて治療すると、外縁が縮小するために、または特に侵襲性のある、ある特定の部分が無くなることで、腫瘍の切除可能性が高まることがある。治療後に、切除が可能となってもよい。切除後にさらに治療を行うと、腫瘍部位に残存する微小疾患を無くすのに役立つだろう。
治療は様々な「単位用量」を含んでもよい。単位用量は、所定量の治療用組成物を含有する量と定義される。投与される量ならびに特定の経路および処方は、臨床分野の当業者の技術の範囲内である。単位用量は1回の注射で投与される必要はなく、所定の期間にわたる連続注入からなってもよい。本発明の単位用量は、都合よく、ウイルス構築物のプラーク形成単位(pfu)で表されることがある。単位用量は、103pfu、104pfu、105pfu、106pfu、107pfu、108pfu、109pfu、1010pfu、1011pfu、1012pfu、1013pfuおよびそれ以上に及ぶ。または、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、1〜100、10〜50、100〜1000、あるいは約1x104まで、約1x105まで、約1x106まで、約1x107まで、約1x108まで、約1x109まで、約1x1010まで、約1x1011まで、約1x1012まで、約1x1013まで、約1x1014まで、もしくは約1x1015まで、または少なくとも約1x104、少なくとも約1x105、少なくとも約1x106、少なくとも約1x107、少なくとも約1x108、少なくとも約1x109、少なくとも約1x1010、少なくとも約1x1011、少なくとも約1x1012、少なくとも約1x1013、少なくとも約1x1014、もしくは少なくとも約1x1015、あるいはそれ以上の感染性ウイルス粒子(vp)が、前記の数値の間にある全ての値および範囲を含めて、腫瘍または腫瘍部位に送達される。
B.注射用組成物および製剤
本発明においてポックスウイルスゲノムの全てまたは一部をコードする発現構築物またはウイルスを癌または腫瘍細胞に送達するのに好ましい方法は、腫瘍内注射による方法である。しかしながら、腫瘍内注射の代わりに、本明細書において開示される薬学的組成物を、米国特許第5,543,158号;米国特許第5,641,515号および米国特許第5,399,363号(それぞれ全体が参照により本明細書に特に組み入れられる)に記載のように非経口的投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、経皮投与、さらには腹腔内投与することができる。
核酸構築物の注射液は、発現構築物が、注射に必要な特定の注射針ゲージを通過できる限り、注射器または溶液の注射に用いられる他の任意の方法によって送達することができる。新規の注射針のない注射システムが最近述べられており(米国特許第5,846,233号)、溶液を保持するためのアンプルチャンバを規定するノズル、およびノズルから溶液を送達部位に押し出すためのエネルギー装置を備える。所定量の溶液を正確に任意の深さで複数回注射するのを可能にする注射器システムも、遺伝子療法における使用について述べられている(米国特許第5,846,225号)。
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合されて、水に溶解して調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物、ならびに油に溶解して調製することができる。通常の保管条件および使用条件の下では、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止する防腐剤を含有する。注射液として使用するのに適した薬学的形態には、滅菌水溶液もしくは分散液、および滅菌注射液もしくは分散液の即時調製のための滅菌散剤が含まれる(全体が参照により本明細書に特に組み入れられる、米国特許第5,466,468号)。すべての場合で、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に液状でならなければならない。形態は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、ならびに/または植物油を含有する、溶媒または分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適当な流動性を維持することができる。微生物の活動は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張性薬剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって可能になる。
水溶液に溶解して非経口投与する場合、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化しなければならず、液体希釈剤は、まず最初に、十分な食塩水またはグルコースで等張にしなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒質は、本開示を考慮すれば当業者に公知であろう。例えば、1投与量を等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに添加するか、提案された注入部位に注射してもよい(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照されたい)。投与量のある程度のばらつきは、治療を行っている被験体の状態に応じて必ず生じる。いずれにしても、投与を担当している人によって、被験体1人1人に適した用量が決定される。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、FDAの生物製剤部(Office of Biologics)の基準により求められるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記の様々な他の成分と共に、適当な溶媒中に取り込み、その後に、濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、上記の基本分散媒および必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌された溶液から活性成分および任意のさらなる望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥法および凍結乾燥法である。
本明細書において開示される組成物は中性または塩の形で処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が含まれ、これは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸を用いて形成されるか、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第2鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。溶液が処方されたら、投与製剤に適合するやり方で、および治療に有効な量で投与される。製剤は、注射液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で簡単に投与される。
本明細書で使用する「担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質のための、このような媒質および薬剤の使用は当技術分野において周知である。従来のどの媒質または薬剤も活性化合物と適合しない場合を除いて、このような媒質および薬剤が治療用組成物において用いられることが意図される。補助的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、ヒトに投与された時にアレルギー反応または同様の有害な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は当技術分野においてよく理解されている。典型的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液いずれかの注射液として調製される。液体の溶液または懸濁液にした後に注射するのに適した固体形態も調製することができる。
C.組み合わせ治療
本発明の化合物および方法は、癌を含む過剰増殖性の疾患/状態の状況において使用することができる。GM-CSF発現ワクシニアウイルスなどの本発明の組成物を用いた治療の有効性を高めるために、これらの組成物と、前記の疾患および状態の治療において有効な他の薬剤を組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、癌の治療は、本発明の治療用化合物および他の抗癌療法、例えば、抗癌剤または外科手術を用いて実施されてもよい。
様々な組み合わせを使用することができる。例えば、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルスは「A」であり、二次的な抗癌療法は「B」である。
Figure 2014193882
本発明のポックスウイルス/ワクシニアベクターの患者への投与は、ポックスウイルス治療の毒性がもしあればそれを考慮に入れて、特定の二次的療法の一般的な投与プロトコールに従う。この治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。様々な標準療法ならびに外科的介入を、記載の癌療法または腫瘍細胞療法と組み合わせて適用できることも意図される。
「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させることによって、癌細胞のアポトーシスを誘導することによって、癌細胞の増殖速度を遅くすることによって、転移の発生率または数を少なくすることによって、腫瘍サイズを小さくすることによって、腫瘍成長を阻害することによって、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を減らすことによって、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進することによって、癌進行を阻止もしくは阻害することによって、または癌を有する被験体の寿命を延ばすことによって、被験体の癌に負の影響を及ぼすことができる。抗癌剤には、生物学的薬剤(生物療法)、化学療法剤、および放射線療法剤が含まれる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞の死滅または細胞の増殖の阻害に有効な組み合わせた量で提供される。このプロセスは、細胞と、発現構築物および薬剤または複数の因子を同時に接触させる工程を伴ってもよい。これは、細胞と、両方の薬剤を含む1種類の組成物または薬理学的製剤を接触させることよって達成されてもよく、細胞と、一方の組成物が発現構築物を含み、他方の組成物が第2の薬剤を含む2種類の異なる組成物または製剤を同時に接触させることによって達成されてもよい。
化学療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は臨床腫瘍学における大きな問題である。現在の癌研究の目標の1つは、化学療法および放射線療法の有効性を、これらと遺伝子療法を組み合わせることによって改善するやり方を発見することである。例えば、単純ヘルペス-チミジンキナーゼ(HS-tK)遺伝子はレトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達されると、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を首尾よく誘導した(Culver et al., 1992)。本発明の状況でも、同様に、ポックスウイルス療法は、他のアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤に加えて、化学療法による介入、放射線療法による介入、免疫療法による介入または他の生物学的介入と共に使用できると意図される。
または、ポックスウイルス療法は、数分から数週間の間隔をあけて他の薬剤治療の前に行われてもよく、または他の薬剤治療の後に行われてもよい。他の薬剤およびポックスウイルスが細胞に別々に適用される態様では、細胞に対して有利な併用効果を発揮できるように、一般的に、有効な期間がそれぞれの送達の間に終わらないようにする。このような場合、両モダリティーと細胞を接触させるのは、どちらかのモダリティーを投与して約12〜24時間以内に、より好ましくは、どちらかのモダリティーを投与して約6〜12時間以内に行ってもよいことが意図される。しかしながら、状況によっては、治療期間を大幅に延ばすことが望ましいこともある。この場合、それぞれの投与の間の期間は、数日(2日、3日、4日、5日、6日、または7日)〜数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)である。
1.化学療法
癌療法は、化学物質に基づく治療および放射線に基づく両方の治療を用いた様々な併用療法も含む。併用化学療法には、例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン(gemcitabien)、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチン(transplatinum)、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、テマゾロミド(Temazolomide)(DTICの水性型)、または前記の任意の類似体もしくは誘導変異体が含まれる。化学療法と生物学的療法の併用は生物化学療法として知られる。
2.放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた他の因子には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達と一般に知られているものが含まれる。DNA損傷因子の他の形態は、マイクロ波および紫外線なども意図される。これらの因子は全て、DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に広範囲の損傷をもたらす可能性が最も高い。X線の線量の範囲は、長期間(3〜4週間)では1日線量50〜200レントゲンから1回線量2000〜6000レントゲンに及ぶ。放射性同位体の線量の範囲は多種多様であり、同位体半減期、発せられる放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みに左右される。
「接触した」および「曝露した」という用語は細胞に適用される場合、治療用構築物および化学療法剤もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達されるプロセス、または標的細胞に直接並べて配置されるプロセスについて述べるために本明細書において用いられる。細胞を死滅および静止させるために、両薬剤とも、細胞の死滅または細胞分裂の阻止に有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
3.免疫療法
免疫療法は、一般的に、癌細胞を標的化および破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子を使用することに頼っている。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面上の、あるマーカーに特異的な抗体でよい。抗体は単独で療法のエフェクターとして役立ってもよく、細胞を実際に死滅させるように他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)と結合され、単に、標的化薬剤として役立ってもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。治療モダリティーの組み合わせ、すなわち、直接的な細胞傷害性活性と、ある特定のポックスウイルスポリペプチドの阻害または低下を用いると、癌治療において治療上の利益が得られるだろう。
免疫療法は併用療法の一部としても使用することができる。併用療法のための一般的なアプローチを以下で議論する。免疫療法の1つの局面において、腫瘍細胞は、標的化を受け入れる、すなわち、他の細胞の大半には存在しない、あるマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本発明の状況における標的化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス(Sialyl Lewis)抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、抗癌作用と免疫刺激作用が伴うことである。サイトカイン、例えば、IL-2、IL4、IL-12、GM-CSF、IFNγ、ケモカイン、例えば、MIP-1、MCP-1、IL-8、および増殖因子、例えば、FLT3リガンドを含む、免疫刺激分子も存在する。免疫刺激分子を、タンパク質として、または遺伝子送達を用いて、mda-7などの腫瘍サプレッサーと組み合わせると、抗腫瘍作用が増強することが示されている(Ju et al., 2000)。
前記のように、現在研究されている、または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント(例えば、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物)(米国特許第5,801,005号; 米国特許第5,739,169号; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998)、サイトカイン療法(例えば、インターフェロンα、β、およびγ;IL-1、GM-CSF、ならびにTNF)(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998)、遺伝子療法(例えば、TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998;米国特許第5,830,880号および米国特許第5,846,945号)、ならびにモノクローナル抗体(例えば、抗ガングリオシドGM2、抗HER-2、抗p185)(Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998;米国特許第5,824,311号)である。ハーセプチン(トラスツズマブ)は、HER2-neu受容体を遮断するキメラ(マウス-ヒト)モノクローナル抗体である。ハーセプチンは抗腫瘍活性を有し、悪性腫瘍の治療における使用に認可されている(Dillman, 1999)。ハーセプチンと化学療法による癌併用療法は、個々の療法より有効性が高いことが示されている。従って、1つまたは複数の抗癌療法が本明細書に記載のポックスウイルス関連療法と共に使用できることが意図される。
受動的免疫療法
癌の受動的免疫療法のための多数の異なるアプローチが存在する。これらは、以下に大きく分けることができる:
抗体のみの注射;毒素または化学療法剤と結合した抗体の注射;放射性同位体と結合した抗体の注射;抗イディオタイプ抗体の注射;最後に、骨髄からの腫瘍細胞の一掃。
好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は患者において副作用をほとんどまたは全く生じないので、受動的免疫療法において用いられる。ヒト化モノクローナル抗体およびキメラモノクローナル抗体も癌療法において首尾よく用いられる。癌治療剤として用いられるモノクローナル抗体には、エドレコロマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ニモツズマブ(nimotuzumab)、およびパニツママブ(panitumamab)が含まれる。
2種類の抗原に対する複数のモノクローナル抗体、さらには複数の抗原特異性を有する抗体を投与することが好ましい場合がある。治療プロトコールはまた、リンフォリン(lympholine)またはBajorin et al. (1988)に記載の他の免疫エンハンサーの投与を含んでもよい。ヒトモノクローナル抗体の開発は、本明細の他の場所でさらに詳細に説明される。
能動的免疫療法
能動的免疫療法では、抗原性のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己由来もしくは同種異系の腫瘍細胞組成物、または「ワクチン」が、一般的に別個の細菌アジュバントと共に投与される(Ravindranath and Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993)。黒色腫免疫療法では、高IgM応答を誘発している患者は、IgM抗体を誘発していない患者または低IgM抗体を誘発している患者より長く生存することが多い(Morton et al., 1992)。IgM抗体は、多くの場合、一過的抗体であり、この規則に対する例外は、抗ガングリオシド抗体または抗炭水化物抗体であるように見られる。
養子免疫治療
養子免疫治療では、患者の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球がインビトロで単離され、リンホカイン、例えば、IL-2によって活性化されるか、または腫瘍壊死のための遺伝子が導入され、再投与される(Rosenberg et al., 1988; 1989)。これを達成するために、動物またはヒト患者には、免疫学的に有効量の活性化リンパ球と、アジュバントが組み込まれた本明細書に記載の抗原性ペプチド組成物が投与される。活性化リンパ球は、最も好ましくは、血液または腫瘍試料から前もって単離され、インビトロで活性化(または「増殖された」)患者自身の細胞である。この形の免疫療法は黒色腫および腎臓癌腫の後退のいくつかの症例をもたらしたが、奏功した者の割合は、奏功しなかった者と比較して少なかった。
4.遺伝子
さらに別の態様では、二次的治療は、弱毒化ポックスウイルスが投与される前、弱毒化ポックスウイルスが投与された後、または弱毒化ポックスウイルスが投与されると同時に、治療用ポリヌクレオチドが投与される遺伝子療法である。ポックスウイルスと、以下の遺伝子産物の1つをコードするベクターとの送達には、標的組織に対して、組み合わされた抗癌作用がある。または、ポックスウイルスは、治療用ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターとして操作することができる。本発明には様々なタンパク質が包含され、一部を以下で説明する。表7は、本発明と組み合わせた、ある形の遺伝子療法の標的となり得る様々な遺伝子を示す。
細胞増殖の誘導物質
細胞増殖を誘導するタンパク質は、機能に応じて様々なカテゴリーにさらに分類される。これらのタンパク質の全ての共通点は、細胞増殖を調節する能力である。例えば、PDGF の一形態であるsis癌遺伝子は分泌型増殖因子である。癌遺伝子は、増殖因子をコードする遺伝子から稀にしか生じず、現在、sisは、唯一知られている天然の発癌性増殖因子である。本発明の1つの態様において、ある特定の細胞増殖誘導物質の発現を阻止するために、細胞増殖誘導物質に対するアンチセンスmRNAが用いられると意図される。
タンパク質FMS、ErbA、ErbB、およびneuは増殖因子受容体である。これらの受容体に対する変異は、調節可能な機能の消失をもたらす。例えば、Neu受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響を及ぼす点変異は、neu癌遺伝子をもたらす。erbA癌遺伝子は、甲状腺ホルモンの細胞内受容体に由来する。改変された発癌性ErbA受容体は、内因性の甲状腺ホルモン受容体と競合して、無秩序な増殖を引き起こすと考えられている。
癌遺伝子の最大のクラスには、シグナル伝達タンパク質(例えば、Src、Ab1、およびRas)が含まれる。タンパク質Srcは細胞質タンパク質-チロシンキナーゼであり、癌原遺伝子から癌遺伝子へのトランスフォーメーションは、ある場合では、チロシン残基527が変異した結果である。対照的に、GTPaseタンパク質の癌原遺伝子から癌遺伝子へのトランスフォーメーションは、一例では、配列内のアミノ酸12のバリンがグリシンに変異して、ras GTPase活性が低下した結果である。
タンパク質Jun、Fos、およびMycは、転写因子として核機能に直接影響を及ぼすタンパク質である。
細胞増殖阻害剤
腫瘍サプレッサー癌遺伝子は過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子が不活化すると、その阻害活性が破壊され、無秩序な増殖が起こる。腫瘍サプレッサーp53、p16、およびC-CAMを以下で説明する。
前記で説明したp53に加えて、別の細胞増殖阻害剤がp16である。真核生物の細胞周期の主な移行は、サイクリン依存性キナーゼすなわちCDKによって誘発される。CDKの1つであるサイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)は、G1の進行を調節する。この酵素の活性は、G1後期でのRbリン酸化である可能性がある。CDK4の活性は、活性化サブユニットであるD型サイクリンおよび阻害サブユニットであるp16INK4によって調節され、p16INK4は、CDK4に特異的に結合し、CDK4を阻害し、従って、Rbリン酸化を調節し得るタンパク質として生化学的に特徴付けられている(Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995)。p16INK4タンパク質はCDK4阻害剤であるので(Serrano, 1993)、この遺伝子が欠失するとCDK4活性が増加し、Rbタンパク質が過剰リン酸化される可能性がある。p16はCDK6の機能も調節することが知られている。
p16INK4は新たに述べられたCDK阻害タンパク質クラスに属し、このクラスは、p16B、p19、p21、WAF1、およびp27KIP1も含む。p16INK4遺伝子は、多くの腫瘍タイプにおいて頻繁に欠失される染色体領域である9p21に位置する。p16INK4遺伝子のホモ欠失および変異はヒト腫瘍細胞株において頻繁に起こる。この証拠は、p16INK4遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している。しかしながら、この解釈は、培養されていない原発腫瘍でのp16INK4遺伝子変化の頻度が培養細胞株よりかなり低いという観察によって疑いがかけられている(Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1994; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995)。プラスミド発現ベクターを用いたトランスフェクションによって野生型p16INK4機能が回復すると、一部のヒト癌細胞株によるコロニー形成が低下した(Okamoto, 1994; Arap, 1995)。
本発明に従って使用することができる他の遺伝子には、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合、p21/p27融合、抗血栓遺伝子(例えば、COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管形成に関与する遺伝子(例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはその受容体)、ならびにMCCが含まれる。
プログラム細胞死の制御因子
アポトーシスすなわちプログラム細胞死は、正常な胚発生、成人組織における恒常性の維持、および発癌の抑制に必須のプロセスである(Kerr et al., 1972)。Bcl-2タンパク質ファミリーおよびICE様プロテアーゼが、他の系におけるアポトーシスの重要な制御因子およびエフェクターであることが証明されている。Bcl-2タンパク質は濾胞性リンパ腫に関連して発見され、多様なアポトーシス刺激に応答したアポトーシスの制御および細胞生存の上昇において顕著な役割を果たしている(Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986)。進化上保存されたBcl-2タンパク質は、現在、デスアゴニストまたはデスアンタゴニストとして分類することができる、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識されている。
Bcl-2が発見された後、Bcl-2は、様々な刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示された。また、現在、共通の構造相同性および配列相同性を有するBcl-2細胞死調節タンパク質ファミリーがあることも明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Bcl-2と類似の機能を有する(例えば、BClXL、Bclw、Bcls、Mcl-1、Al、Bfl-1)、またはBcl-2機能を打ち消し、細胞死を促進する(例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Haraliri)ことが示されている。
5.外科手術
癌を有する人の約60％が何らかのタイプの外科手術を受ける。外科手術には、予防的手術、診断的手術または進行期分類のための手術、治癒的手術、および待期的手術が含まれる。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および／または代替治療などの他の治療と併用することができる癌治療である。
治癒的手術には、癌組織の全てまたは一部を物理的に除去、摘出、および／または破壊する切除が含まれる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加えて、外科手術による治療には、レーザー手術、冷凍外科、電気外科、および顕微鏡下で行う手術（モース外科）が含まれる。本発明は、表層部の癌、前癌、または付随的な量の正常組織の除去と併用できることがさらに意図される。
癌の細胞、組織、または腫瘍の一部または全てが摘出されると、身体に空洞が形成されることがある。その領域に、さらなる抗癌療法を灌流するか、直接注射するか、または局所適用することによって、治療が行われてもよい。このような治療は、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、もしくは7日毎、または1週間毎、2週間毎、3週間毎、4週間毎、および5週間毎、または1ヶ月毎、2ヶ月毎、3ヶ月毎、4ヶ月毎、5ヶ月毎、6ヶ月毎、7ヶ月毎、8ヶ月毎、9ヶ月毎、10ヶ月毎、11ヶ月毎、もしくは12ヶ月毎に繰り返されてもよい。これらの治療はまた様々な投与量の治療でもよい。
6.他の薬剤
治療の治療的有効性を改善するために、他の薬剤を本発明と併用できることが意図される。これらのさらなる薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびGAP結合のアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞分裂阻害剤および分化剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；IL-2および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカイン類似体；またはMIP-1、MIP-1.β、MCP-1、RANTES、および他のケモカインが含まれる。Fas/Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAIL(Apo-2リガンド)などの細胞表面受容体またはそのリガンドのアップレギュレーションは、過剰増殖細胞に対するオートクライン効果またはパラクライン効果を確立することによって本発明のアポトーシス誘導能を増強することがさらに意図される。GAP結合の数を増やすことによって細胞内シグナル伝達を増加させると、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖作用が高まるだろう。他の態様では、治療の抗過剰増殖有効性を改善するために、本発明と細胞分裂阻害剤または分化剤を併用することができる。細胞接着阻害剤は、本発明の有効性を改善すると意図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（FAKs）阻害剤およびロバスタチンである。治療の有効性を改善するために、本発明と、抗体c225などのアポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の薬剤を併用できることがさらに意図される。
Apo2リガンド（Apo2L、TRAILとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（TNF）サイトカインファミリーのメンバーである。TRAILは、多くのタイプの癌細胞において迅速なアポトーシスを活性化するが、正常細胞に対しては無毒である。TRAIL mRNAは多種多様な組織において生じる。ほとんどの正常細胞は、TRAILの細胞傷害作用に対して耐性があるように見られる。このことは、TRAILによるアポトーシス誘導を防御できる機構が存在することを示唆している。TRAILについて述べられた最初の受容体はデス受容体4（DR4）と呼ばれ、細胞質「デスドメイン」を含有する。DR4は、TRAILによって運ばれるアポトーシスシグナルを伝達する。TRAILに結合するさらなる受容体が同定されている。DR5と呼ばれる1つの受容体は細胞質デスドメインを含有し、DR4と同様にアポトーシスシグナルを伝達する。DR4およびDR5のmRNAは多くの正常組織および腫瘍細胞株において発現している。最近、TRAILがDR4およびDR5を介してアポトーシスを誘導するのを阻止するデコイ受容体、例えば、DcR1およびDcR2が同定された。従って、これらのデコイ受容体は、アポトーシス促進性サイトライン(cytoline)に対する感受性を、細胞表面で直接調節する新規の機構である。これらの抑制性受容体が正常組織において優先的に発現されることは、TRAILが、正常細胞を残しながら癌細胞においてアポトーシスを誘導する抗癌剤として有用であり得ることを示唆している（Marsters et al., 1999）。
細胞傷害性化学療法剤が導入された後に、癌治療に多くの進歩が見られた。しかしながら、化学療法の結果の一つは、薬剤耐性表現型の発生／獲得および多剤耐性の発生である。薬剤耐性の発生は、依然として、このような腫瘍の治療における主要な障害であり、したがって、遺伝子療法などの代替アプローチが明らかに必要とされている。
化学療法、放射線療法、または生物学的療法と併用される別の形の療法には、患者の組織を高温（106°Fまで）に曝露する処置であるハイパーサーミアが含まれる。局部ハイパーサーミア、局所ハイパーサーミア、または全身ハイパーサーミアの適用には、外部加温装置または内部加温装置が関与してもよい。局部ハイパーサーミアは、腫瘍などの小さな領域に熱を加えることを伴う。熱は、体外の装置からの腫瘍を標的とする高周波によって外部から発生させてもよい。内部の熱は、薄い加温ワイヤまたは温水を満たした中空管、埋め込み型マイクロ波アンテナ、または高周波電極を含む滅菌プローブを含んでもよい。
局所療法の場合には患者の臓器または四肢が加温され、これは磁石などの高エネルギーを発する装置を用いて行われる。または、患者の血液の一部を取り出し、加温した後に、内部加温を行う領域に灌流する。癌が全身に広がっている症例では、全身加温も行ってもよい。この目的のために、温水ブランケット、ホットワックス、誘導コイル、およびサーマルチャンバが用いられてもよい。
ホルモン療法もまた、本発明または前記の他の任意の癌療法と併用されてもよい。ホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頚癌などの特定の癌の治療において、テストステロンまたはエストロゲンなどの特定のホルモンのレベルを低下させる、またはその作用をブロックするために使用することができる。この治療はしばしば、治療選択肢として、または転移のリスクを下げるために、少なくとも1つの他の癌療法と併用されることが多い。
表-US-00007 表 6 癌遺伝子 遺伝子 起源 ヒト疾患 機能 増殖因子 HST/KS トランスフェクション FGFファミリーメンバー INT-2 MMTVプロモーターFGFファミリー挿入メンバー INTI/WNTI MMTVプロモーター因子様 挿入SIS サル肉腫PDGF Bウイルス 受容体型チロシンキナーゼ ERBB/HER トリ増幅、EGF/TGF-α/赤血球の欠失した扁平上皮癌 アンフィレギュリン/赤芽球症細胞癌；ヘタセルリンウイルス；ALV神経膠芽腫受容体プロモーター挿入；増幅されたヒト腫瘍ERBB-2/NEU/トランスフェクトされ増幅された乳癌、ラット由来HER-2により制御 卵巣癌、胃癌 NDF/神経膠芽腫の癌 ヘレグリンおよびEGF関連因子 FMS SMネコCSF-1受容体肉腫ウイルス KIT HZネコMGF/スチール肉腫ウイルス受容体 造血 TRK トランスフェクション NGF(ヒト由来神経成長因子) 結腸癌受容体 MET トランスフェクション スキャッター因子/ヒトHGF受容体から骨肉腫から RET 転座 散発性甲状腺 オーファン（Orphan）受容体および点 癌；家族性 チロシン突然変異 髄様甲状腺 キナーゼ 癌；多発性内分泌新生物2Aおよび2B ROS URII トリ オーファン受容体肉腫ウイルス チロシンキナーゼ PDGF受容体 転座 慢性 TEL(ETS様 骨髄単球性 転写 白血病 因子)/PDGF受容体遺伝子融合体
V.実施例
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示する目的で示され、本発明を限定するものであると、いかようにも意図されない。当業者であれば、目的を実施し、述べられた目標および利点、ならびに本明細書に内在する目的、目標、および利点を得るために、本発明は良好に適合されることを容易に理解するだろう。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、好ましい態様を現在代表するものであり、例示であり、本発明の範囲を限定するものと意図されない。当業者であれば、特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内の変更および本発明の精神に包含される他の使用を考え付くだろう。
実施例1
肝癌の治療
A.目的
(1)腫瘍内(IT)注射によって投与されたJX-594の最大耐用量(MTD)および/または最大投与可能用量(MFD)を求めること。(2)I.T.注射によって投与されたJX-594の安全性を評価すること。(3)I.T.注射によって投与されたJX-594の複製/薬物動態を評価すること。(4)I.T.注射後のJX-594および腫瘍関連抗原に対する免疫応答(注射部位および非注射部位での炎症性浸潤の増加;中和抗体形成;サイトカイン応答;ならびに腫瘍およびウイルスに特異的なTリンパ球誘導)を評価すること。(5)注射部位および非注射部位へのI.T.注射によって投与されたJX-594の抗腫瘍有効性を評価すること。
B.試験案
これは、イメージガイド下で注射可能な表在性腫瘍結節を有する肝癌患者における第1相非盲検用量漸増試験である。難治性腫瘍を有する患者は、用量が連続して漸増する案で、以下の4種類の用量レベルの1治療を受ける:
コホート1:1x108pfu、コホート2:3x108pfu、コホート3:1x109pfu、コホート4:3x109pfu。
このような試験の目標期間は15ヶ月である。登録患者には、1サイクルごとに1回の治療を行う。患者に用量制限毒性(DLT)の無い治療が行われ、標的腫瘍が進行していなければ、合計4サイクルまでさらなるサイクルが進められる。患者の標的腫瘍が進行したか、患者がDLTまたは他の理由により試験から離脱すれば、試験のための来院を終了し、フォローアップ期に入る。1サイクルは3週間と定義する。DLTは1回目のサイクルでしか観察されない。
1用量を1〜3個の病変に分散させることができる。注射される病変の最大直径の総計は10cm未満でなければならない。DLTが観察されなければ、各用量レベルで3人の患者を治療する。3人の患者のうち誰もDLTを経験しなければ、登録者は次の用量レベルに進む。最初の3人の患者のうち1人がDLTを経験すれば、第2のDLTが起こるまで(この時点での毒性用量と定義される)、または合計6人の患者が治療を受けるまで、さらなる患者を登録する。このコホートにおいて第2のDLTが現れなければ、患者は次の用量に進む。
MTDは、JX-594による治療後に2人の患者がDLTを経験する用量のすぐ前の用量と定義される。MFDは、MTDが定義されていない時の最大用量レベルと定義される。MTD/MFDが定義されている場合、この用量レベルでの安全性および毒性のさらなるデータを得るために、さらに6人の患者を治療する。MTDがコホート4において起こらず、PRの有効性が前のコホート用量で2/3以上発生すれば、この用量を用いて、さらに6人の患者からなる臨床試験が行われる。
JX-594によるDLTは、以下のいずれか1つと定義される:
1. 任意の期間のグレード4毒性、
2. 5日超続く、グレード3毒性(インフルエンザ様症状:疲労、悪心、筋肉痛、発熱を除く)。
この試験において起こる毒性の重篤度の割り当てには、米国立癌研究所の共通毒性基準が用いられる。
1.対照腫瘍(非注射腫瘍)(サイクル1)およびJX-594注射(サイクル2+)の決定
サイクル1の間に、治験医師（investigator）は対照腫瘍部位を決定する。対照腫瘍は、標的腫瘍の肝葉以外の肝葉に位置する明瞭な腫瘍結節で、かつ標的腫瘍のリンパドレナージ(lymphatic drainage)の外でなければならない。従って、対照腫瘍は、肝臓の左葉および右葉に別々に位置する。しかしながら、腫瘍結節が肝臓の片側の範囲内に存在するのであれば、対照腫瘍は、JX-594が注射されていない腫瘍結節でもよい。しかしながら、腫瘍が広範囲にわたる単一の結節を有するのであれば、対照腫瘍は設けられなくてもよい。この対照腫瘍は、JX-594を用いて治療された腫瘍と同じように評価される。これにより、腫瘍成長および局部毒性/活性に対する対照の影響の評価が可能になる。
この患者がサイクル2に進めば、対照腫瘍に、サイクル1の標的腫瘍と同じ用量レベルのJX-594を注射する。前記のように、用量は、腫瘍サイズに比例して腫瘍間で分散される。
2.非標的(非注射)腫瘍に対して奏功を示した者
この試験では非注射腫瘍に対して奏功が認められることがある。この現象は、このような患者による以前のJX-594第1相試験において報告されている。この作用の機構を理解する必要がある。可能性として、注射腫瘍からのウイルスの伝播および/または腫瘍特異的な細胞傷害性の誘導(Tリンパ球(CTL)の腫瘍浸潤およびそれに続く細胞傷害性Tリンパ球を介した腫瘍破壊)が挙げられる。この作用の機構をさらに深く理解するために、治験医師は以下のことを行う。非注射腫瘍に対して臨床的な奏功が認められるのであれば、注射腫瘍と同じ採取時点でコア生検または穿刺吸引が行われる(付録Aを参照されたい;非標的腫瘍の全生検は2つの部位を超えない)。非注射腫瘍からの標本は、注射腫瘍から得られた材料に用いられるものと同じ方法で分析される。
C.患者の選択
1.選択基準
典型的には、患者は全員、以下の基準:(1)年齢18歳以上、(2)イメージガイド下で注射可能な表在性腫瘍(<10cm最大直径)を有する、臨床的または組織学的に確認された(原発性または転移性)肝癌患者。腫瘍は、標準的な療法にもかかわらず進行している(すなわち、標準的な療法に対して難治性である)、(3)標準的な治療、例えば、外科的切除、動脈内化学塞栓術、化学療法、および放射線療法にもかかわらず腫瘍が進行している、(4)患者のカルノフスキー・パフォーマンス・ステータス(KPS)が>70、(5)患者の生存期間が少なくとも16週間と予測されている、(6)患者が性的に活発であれば、患者には、JX-594による治療後3ヶ月間、避妊法を使う意思がある、(7)患者には、書面によるインフォームドコンセントを理解する能力および書面によるインフォームドコンセントに署名する意思がある、(8)患者には、試験手順およびフォローアップ検査を遵守する能力がある、(9)患者には、十分な骨髄機能:WBC>3,000細胞/mm3、ANC>1,500細胞/mm3、ヘモグロビン>10g/dL、および血小板数>75,000細胞/mm3がある、(10)患者には、十分な腎機能:血清クレアチニン<1.5mg/dLがある、(11)患者には、十分な肝機能:血清AST(<2.5のULN)、ALT(<2.5のULN)、総ビリルビン(<2.0mg/dL)がある、を全て満たしている。原発性肺癌の場合、患者は、チャイルドピュー(Child-Pugh)分類でAまたはBに分類されていなければならない。
2.除外基準
患者は、以下の除外基準:(1)妊娠中または授乳中、(2)HIV患者、(3)患者がチャイルドピュー分類でCに分類されている;AまたはBに分類された患者のうち(原発性肝臓癌の場合)、患者の総ビリルビンが>2mg/dLである、(4)患者には、新しい治験薬による治療には高リスクと思われる、臨床的に意義のある活動性感染症または管理されていない医学的状態(例えば、呼吸器、神経、心血管、胃腸、泌尿生殖器系)がある、(5)患者には基礎疾患および/または服薬により重大な免疫不全症があるか、重大な免疫不全症になった家族がいる、(6)患者には、全身療法を必要とする湿疹になった病歴がある、(7)患者には、患者が試験に登録する前、6ヶ月以内に、MI、不安定狭心症、うっ血性心不全、心筋炎、不整脈を含む不安定心疾患と診断され、薬を必要としていたか、または心臓の状態で他の任意の臨床的に意義のある状態がある、(8)試験薬による治療の前、4週以内に、患者には、全身コルチコステロイドまたは他の任意の免疫抑制薬が与えられた、(9)患者が試験に登録する前、4週以内に、患者に、他の任意の治験薬試験、放射線療法、化学療法または外科手術が行われた、(10)書面によるインフォームドコンセントを与えることができない、または書面によるインフォームドコンセントを与える意思が無い、(11)患者には、試験薬の成分に対する過敏性がある、をいずれも満たしてはならない。
D.試験のための来院の手順
試験手順をまとめた表を、観察および試験のスケジュールに示した。通常、予定日から+1/-1日の開きが許されることがある。週末および休日は数に入れない。
1.スクリーニングのための来院(-14〜0日目)
これはウイルスを用いた臨床試験であり、患者と話し合いをしながら、試験が進む。参加を希望するどの患者も、書面によるインフォームドコンセントを与えなければならない。インフォームドコンセントに署名した後に、各患者は、試験開始前、14日以内に以下の評価を行う。
臨床での評価には、(1)抗癌治療を含む完全な病歴および手術歴、(2)体重およびバイタルサイン(温度、脈拍数、および血圧)、(3)身体検査(全身)、(4)カルノフスキー・パフォーマンス・スコア、(5)胸部x線(後前および左右)、(6)12誘導ECG(患者が試験に登録する前、3ヶ月以内に行われていれば許容可能)、(7)併用した薬の評価(患者が試験に登録する前、14日以内に、全ての服薬を行う)が含まれる。
検査室での評価には、以下が含まれる。(1)日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、(2)血清化学検査;ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース(random glucose)、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、(3)凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、(4)HIV、HBVおよびαフェトプロテイン試験、(5)中和抗体価、(6)ウイルスゲノム(Q-PCR)、(7)日常的な尿検査(顕微鏡検査を含む)、(8)妊娠検査(妊娠している可能性のある女性の場合)、(9)腫瘍タイプに応じて、スクリーニング検査において適切な腫瘍マーカー(CA125、CEA、AFP、PSA、CA19-9など)の検査;マーカーが高い場合には、この試験は各サイクルの22日目に行う。
腫瘍の画像に基づく評価および測定には、腹部CTスキャン(最大直径の測定)を用いた腫瘍結節の測定が含まれる。1日目(治療前)に撮影されるCTを代わりに用いてもよい(患者が試験に登録する前、2週以内に行われていれば許容可能)。
1日目(サイクル1〜4)- JX-594投与の前または後に、評価を行わなければならないことに留意しなければならない。
1日目;治療前--
臨床での評価:身体検査(全身)、体重およびバイタルサイン(温度、脈拍数、および血圧)、カルノフスキー・パフォーマンス・スコア、併用療法の特定、標的腫瘍の検査および評価、標的腫瘍の測定(n=1〜3);さらなる非注射腫瘍の測定(n=1〜3)、標的腫瘍の生検。
検査室での評価:血液--
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.サイトカイン(GM-CSFを含む)、5.中和抗体価、6.ウイルスゲノム(Q-PCR)。
検査室での評価:その他--
1.pfuについての尿検査、2.pfuについて咽頭スワブ
試験薬の投与-
1.8章に記載のJX-594の投与
1日目:治療後--
1.身体検査。バイタルサインを6時間にわたって1時間に2回(30分および60分)測定し、その後は日常的に測定する。2.以下の時点:治療の1時間後および3時後に、サイトカイン分析のために採血を行う。3.以下の時点:治療開始の10〜15分後、25〜35分後、および4〜6時間後に、循環JX-594ゲノムを測定するために採血を行う。4.治療の3〜4時間後に、ウイルス散布についての尿試料および咽頭スワブ試料を採取する。5.副作用および併発症の記録。
3日目(サイクル1〜4)--
検査室での評価:血液-
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.サイトカイン(GM-CSFを含む)、5.中和抗体価、6.ウイルスゲノム(Q-PCR)。
検査室での評価:その他-
1.pfuについての尿検査、2.pfuについて咽頭スワブ。
臨床での評価-
副作用および併発症の記録。
画像に基づく評価:
臨床での評価において副作用の疑いがある時には腹部CTスキャン。
5日目(サイクル1〜4)--
臨床での評価-
副作用および併発症の記録。
検査室での評価:血液-
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.ウイルスゲノム(Q-PCR)。
8日目(サイクル1〜4)--
臨床での評価-
身体検査、CTスキャン;標的腫瘍の生検(生検は、炎症、壊死または収縮などを含む有意な変化を示した、1個または2個までの非注射腫瘍にも行う)。生検は、患者状態のPIの主観評価によって、サイクル1および2でのみ行う。副作用および併発症の記録。
検査室での評価:血液-
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.サイトカイン(GM-CSFを含む)、5.中和抗体価、6.ウイルスゲノム(Q-PCR)。
検査室での評価:その他-
1.pfuについての尿検査、2.pfuについて咽頭スワブ、3.壊死が起こった時には壊死の穿刺吸引(サイクル1および2でのみ行う)。
15日目(サイクル1〜4)--
臨床での評価-
身体検査。
検査室での評価:血液-
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.ウイルスゲノム(Q-PCR)。
検査室での評価:その他-
1.pfuについての尿検査、2.pfuについて咽頭スワブ。
22日目(サイクル1〜4)--
臨床での評価-
1.身体検査、2.画像に基づく評価:腹部CTスキャン(サイクル2および4でのみ行う)、3.標的腫瘍の測定(n=1〜3);さらなる非注射腫瘍の測定(n=1〜3)、4.標的腫瘍の生検(生検は、炎症、壊死または収縮などを含む有意な変化を示した、1個または2個までの非注射腫瘍にも行う)、5.副作用および併発症の記録、6.22日目は、次のサイクルの1日目の前の日として用いてもよい。22日目と次のサイクルの1日目の間には1週間まで間隔があいてもよい。
検査室での評価:血液-
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.中和抗体、5.ウイルスゲノム(Q-PCR)、6.腫瘍タイプに応じて、スクリーニング検査において適切な腫瘍マーカー(CA125、CEA、AFP、PSA、CA19-9など)の検査;マーカーが高い場合には、この試験は各サイクルの22日目に行う。
検査室での評価:その他-
1.pfuについての尿検査、2.pfuについて咽頭スワブ。
28日目または試験のための来院の終了-
臨床での評価-
身体検査、ならびに副作用および併発症の記録。
検査室での評価:血液-
1.日常的な血液検査(血小板数および白血球百分率を含む)、2.血清化学検査:ナトリウム、カリウム、BUN、クレアチニン、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、LDH、カルシウム、リン、マグネシウム、ランダムグルコース、総タンパク質、アルブミンおよび尿酸、3.凝固試験:プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間(PTT)、および国際標準比(INR);フィブリノゲン、4.ウイルスゲノム(Q-PCR)。
サイクル3〜4--
1.サイクル2の22日目に、注射部位腫瘍の最大直径が>25％増加しなかった患者はサイクル3〜4に進む。2.サイクル2の22日目に、注射部位腫瘍の最大直径が25〜50％増加した患者はサイクル3〜4に進む場合がある。3.サイクル2の22日目に、注射部位腫瘍の最大直径が>50％増加した患者は試験終了となる。
患者のフォローアップおよび再調査--
臨床試験が完了した患者は、試験のための来院の終了の後、1年間、日常的な肝臓癌患者フォローアップのやり方でフォローアップされる。臨床試験に関係なく、生存している患者は、来院のために病院に戻った時には、日常的な検査、例えば、ヘパトーム血清検査および画像に基づく評価を受け、3ヶ月ごとに検査を受けることができる。臨床試験が完了した後、顕著な臨床的有用性が確かめられた場合には、別の書面によるインフォームドコンセントを得た後に、さらなる注射が合計4回まで投与されてもよい。この時、全ての試験手順は、この試験の最初の4回の投与と同じやり方で進む。試験がサイクル4までに完了した後には、(安定した疾患より大きな)重大な臨床的有用性があるとPIが判断するまで、試験薬のさらなる注射が合計4回まで投与されてもよい。この場合、PIは、前もってスポンサーと話し合い、スポンサーから同意を得なければならない。全ての試験計画は、この臨床試験と同じやり方で進む。
E.ウイルスの複製、伝播および特別な試験
1.血漿および尿のQ-PCRおよびプラーク形成単位アッセイ法(薬物動態学的試験)
血流へのウイルス伝播は、定量ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)試験によって評価する。ウイルスが尿および咽頭スワブに存在するかどうか検出するために、治療後に試料を集める。
2.腫瘍生検および穿刺吸引(免疫応答試験)
腫瘍部位でのウイルス複製を発見するために、治療の前後に、(安全かつ簡単と思われたら)コア生検および穿刺吸引を行う。これらの生検は、ウイルス複製、炎症細胞および免疫細胞の浸潤、壊死およびアポトーシスの証拠があるかどうか分析される。
組織を得るために、コア生検針を用いるか、穿刺吸引生検をイメージガイド下で行う。しかしながら、時として、これらの生検は、患者にとって緊急または危険な状況を引き起こすことがある。従って、組織を行うために生検を行う時には、患者の安全性は最優先に念頭に置かなければならない。患者の状態が危険に陥る可能性が高い場合(被膜性肝臓腫瘍など)、組織は安全な経路によって入手すべきである。
組織生検(穿刺吸引)が患者に危険を引き起こす可能性が高いとPIが判断したら、生検(穿刺吸引)は行われなくてもよい。さらに、患者の安全性が必要とされれば、PIの自由裁量で、患者を入院させ、組織生検(穿刺吸引)および/またはJX-594腫瘍内注射の前後5日まで観察してもよい。
3.サイトカイン分析(免疫応答試験)
GM-CSF、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-δ、およびTNF-αの血清中濃度はELISAアッセイ法を用いて測定する。
4.中和抗体アッセイ法(薬物動態学的試験)
患者の連続希釈血清中のJX-594中和抗体価の発生はプラークアッセイ法を用いて特定する。
5.薬物動態学的試験のための採血
薬物動態学的試験のための採血した3mLの血液はそれぞれ、ミニイエロートップバキュテナー(mini yellow top vacutainer)に入れる。
F.治験薬の投与
1.用量、投与、および治療スケジュール
用量
用量は典型的には以下の通りである:
コホート1:1x108pfu、コホート2:3x108pfu、コホート3:1x109pfu、コホート4:3x109pfu。
薬物の投与
JX-594は腫瘍内注射によって投与することができる。説明するように、専門の医師が腫瘍内注射を投与する。21ゲージ針またはそれより細い針を用いて、注射しようとする腫瘍(1〜3個の腫瘍)の総体積の約25％に相当する体積を有するウイルス含有溶液を、腫瘍に直接注射する。典型的には、注射はイメージガイド(例えば、CT)の下で行う。1〜3個の腫瘍に注射することができる。それぞれの腫瘍には同量の溶液を与えなければならない。2〜3個の腫瘍に注射する場合、ある腫瘍に注射されるウイルス溶液の体積は、他の腫瘍と比べて、腫瘍の体積に比例する(すなわち、ある腫瘍の体積が他の腫瘍の2倍であれば、大きな方の腫瘍にはウイルス溶液の総体積の2/3を与える)。
サイクル1で選択された標的腫瘍が成長を止めることがあるが、注射は全てのサイクルで継続しなければならない。しかしながら、必要に応じて、サイクル3では、治験医師は、サイクル1の標的腫瘍を含めて、サイクル1および2で注射されなかった非標的腫瘍を3個までさらに選択してもよい。注射腫瘍の最大直径の合計は<10cmでなければならない。腫瘍内に注射されるウイルス溶液の用量は腫瘍の体積に比例する。
JX-594の調製
JX-594は、(0.1mL送達用の)ウイルス製剤150μlを含有する凍結した(-60℃またはそれ以下の)使い捨てガラスバイアルに入れられて供給されている。体積100μlに1.9x108pfuのウイルスが含まれる。このバイアルは縦にして室温で解凍しなければならない。JX-594は温水浴に入れてはいけない。ピペットを用いて再懸濁する。希釈している間および患者に移している間は、ウイルスは4℃で保管してもよい。解凍したJX-594は、4時間経過したら注射してはならない。
上級薬剤師および他の任命された薬剤師は、JX-594を生物学的安全キャビネット(biological safety cabinet)(クラス2)の中に入れて縦にして慎重に(手袋、安全ガラス、ガウンなどの使用)保管しなければならない。全ての希釈の最初の手順:注射器を使用する時には、必要な体積の滅菌食塩水を引き抜き、標準的なfalconチューブに移す。注射用のウイルスと希釈剤の最終体積は、標的腫瘍体積の約25％に相当しなければならない。
コホート1:
コホート1の患者には、1個(1)のJX-594バイアルを使用する。滅菌食塩水に移された処方された体積のJX-594を、マイクロピペット/注射器を用いて吸い出す。
コホート2:
コホート2の患者には、2個(2)のJX-594バイアルを使用する。混合後に、1番目のバイアルの内容物を2番目のウイルスに移す。滅菌食塩水に移された処方された体積のJX-594を、マイクロピペット/注射器を用いて吸い出す。
コホート3および4:
コホート3または4の患者には、それぞれ、4個(4)または11個(11)のJX-594バイアルを投与する。全ての内容物を、小さな混合ポリプロピレンチューブに移す。滅菌食塩水に移された処方された体積のJX-594を、マイクロピペット/注射器を用いて吸い出す。
全ての希釈の最後の手順:
室温でチューブをアルミニウム箔で包むか、遮光性バックに入れる。投与前には10秒間、勢いよくボルテックスする。室温で曝露して30分間経過したら、または解凍して4時間経過したら、注射してはならない。
治療スケジュール
典型的には、登録患者には、1サイクルごとに1回の治療または1用量のJX-594を与える。JX-594が注射された標的腫瘍がサイクル終了時に進行していなかった患者には、次のサイクル(合計4サイクルまで)の治療を与える。標的腫瘍が進行していた患者は来院終了となる。1サイクルは3週間と定義する。1用量は、1〜3個の病変の中で均等に分けることができる。注射された病変の最大直径の合計は<10cmでなければならない。
用量漸増
臨床試験の用量漸増期では、各コホートごとに2〜6人の患者を登録する。最初の3人の患者のうち誰もDLTを経験しなければ、試験は次のコホートに進む。コホートの最初の3人の患者のうち1人にDLTが現れれば、合計6人の患者がコホートに登録されるまで、または最初の患者を含む2人の患者がDLTを経験するまで、試験は進む。
コホート1の6人の患者のうち、最初の注射の2週間後までにDLTを経験する患者が2人未満であれば、試験は次のコホートに進む。2人の患者がDLTを経験すれば、直前の用量がMTDと定義される。
サイクル1において最初の患者に最初の注射を投与した後、1週間経過するまで、2番目の患者は登録しない。この規則は次の患者の参加に適用される。DLTがコホートに現れれば、後で登録された患者は全員、前に登録された患者全員へのサイクル1の最初の注射が完了して2週間後に治療を開始する。前のコホートの最後の患者がサイクル1の最初の注射を完了して少なくとも2週間後に、患者は次の用量レベルのコホートに進む。
コホート1においてDLTを経験する患者が2人を超えれば、臨床試験は中断する。
G.安全性
治療後、全身副作用:発熱、悪寒、筋肉痛、疲労/無力、悪心、および嘔吐が現れることがある。注射腫瘍部位での副作用、例えば、疼痛、壊死、潰瘍化および炎症が現れることがある。前臨床試験およびGM-CSF臨床試験を考慮すれば、リンパ球、単球、または白血球の一時的な増加と好中球の増加が現れることがある。注射腫瘍部位において以下が現れることがある:疼痛、壊死、潰瘍化および炎症。
JX-594を用いた以前の第1相試験では極めて可能性が低く、述べられなかったが、播種ワクシニアに関連する発疹または脳炎が理論的には起こり得る。これらの合併症は、それぞれ、ワクチンレシピエントの10,000人に約1人および1,000,000人に1人に現れると述べられている。
1.用量制限毒性(DLT)
DLTは、インフルエンザ様症状(例えば、疲労、悪心もしくは筋肉痛)を除く、JX-594に起因し、5日超続く、グレード3もしくはそれ以上の毒性、またはJX-594に起因する任意の期間のグレード4毒性と定義される。
処置のリスクからの患者の安全性の確保
生検は、合併症、例えば、腫瘍の破裂による腹腔内出血および/またはショックを引き起こすことがある。報告されている合併症の発生率は<0.1％であり、経カテーテル塞栓術を用いて治癒することができるが、患者の安全性は最優先に念頭に置かなければならない。従って、生検が患者に危険を引き起こす可能性が高いと、治療を行っている医師が判断したら、生検は行われなくてもよい。さらに、患者の安全性が必要とされれば、PIの自由裁量で、患者を入院させ、生検および/またはJX-594腫瘍内注射の前後5日まで観察してもよい。
H.有効性
このような試験の主目的は、臨床的有用性ではなく安全性についての第1相臨床試験である。にもかかわらず、この試験は、治療により誘導される、直接的なウイルス作用(すなわち、腫瘍崩壊作用)および/または免疫を介した腫瘍破壊のために、注射腫瘍および/または非注射腫瘍の収縮を引き起こすと予想される。
有効性評価の基準は標的病変の変化である。非標的病変に変化があれば、以下の表を参照して標的病変の応答に基づいて評価される。
標的病変の評価
完全奏功(CR):全ての標的病変の消失。部分奏功(PR):ベースラインLD合計を基準とした時に、標的病変のLD合計の少なくとも30％の減少。進行(PD):治療が開始してから報告された最小のLD合計を基準とした時に、標的病変のLD合計の少なくとも20％の増加。安定した疾患(SD):治療が開始してからの最小のLD合計を基準とした時に、PRとするには縮小が不十分で、かつPDとするには増加が不十分である。
全奏功の評価基準を以下の表に示した。最良の全奏功は、治療開始時から疾患の進行/再発までに記録された最良の奏功を意味する。
（表２）最良の全奏功の評価
Figure 2014193882
注:この時に疾患進行の客観的な証拠が無く、治療中断が必要な健康状態の包括的悪化のある患者は「症候性悪化」と有すると分類しなければならない。治療中断後でも、客観的な疾患進行を検出するために、あらゆる努力を尽くさなければならない。
場合によっては、残存している疾患と正常組織を区別することが難しいことがある。完全奏功の評価がこの決定に左右される時には、完全奏功の状況を確認する前に、残存している病変を調べる(穿刺吸引/生検)ことが推奨される。
測定可能な病変の評価のためのガイドライン
全ての測定は、サイクル2の最終日(22日目)およびサイクル4の最終日(22日目)に、CTまたはMRIによって行われ、定規またはカリパスを用いてメートル法で記録しなければならない。全てのベースライン評価は可能な限り治療開始と離れずに行い、治療開始前、4週間以上あけてはならない。
注:以前に放射線が照射されたことのある病変は、測定可能な病変として許容されない。治験医師の自由裁量で、これらの病変が測定可能な病変とみなされる場合には、これらの病変を検討するための条件をプロトコールに記載しなければならない。以前に放射線が照射されたことのある部位に位置する腫瘍病変は、測定可能とみなされない可能性があることにも留意されたい。治験医師が、以前に放射線が照射されたことのある部位に位置する腫瘍病変が測定可能な病変として適しているとみなす場合には、このような病変を検討すべき条件をプロトコールに定義しなければならない。
特定および報告された病変をそれぞれ特徴付けるには、ベースライン時およびフォローアップ中に、同じ評価方法および同じ技法を使用しなければならない。治療の抗腫瘍作用を評価するのに両方法とも用いられる場合、臨床検査による評価には画像に基づく評価が好ましい。
従来のCTは、スライス厚が10mmまたはそれ以下の連続カットを用いて行わなければならない。スパイラルCTは、5mm連続再構築アルゴリズムを用いて行わなければならない。適用可能であれば、スクリーニング来院においてPET-CTが行われてもよく、この場合、PET-CTはサイクル2の22日目の評価において使用しなければならない。必要に応じて、PET-CTは、サイクル4の22日目に繰り返してもよい。
測定値/奏功期間の確認
確認:
PRまたはCRの状況を割り当てるために、奏功の基準が最初に満たされた8週間後に行わなければならない反復評価によって、腫瘍測定値の変化を確認しなければならない。SDの場合、最低16週間隔のフォローアップ測定値が、SD基準を試験参加後少なくとも1回は満たしていなければならない。
奏功期間:
全奏功の期間は、(どちらが最初に記録に残されていても)最初に記録に残されたCRまたはPRの日から、客観的に確認された再発または進行の最も早い日までの時間として定義される(治療開始から記録された最小測定値を進行の基準とする)。全完全奏功の期間は、最初に記録に残されたCRの日から、客観的に確認された再発の最も早い日までの時間として定義される。
安定した疾患の期間:
SDは、治療後、最初に記録に残されたSDの日から、客観的に確認されたPDの最も早い日までの時間として定義される(治療開始から記録された最小測定値を基準とする)。
腫瘍に対する奏功の再評価
必要に応じて、この試験の外部の放射線科医が腫瘍に対する奏功を評価する。しかしながら、評価結果は試験目的にのみ用いられ、臨床上の結論に影響を及ぼさない。
I.統計法およびデータ分析
1.サンプルサイズ
評価されるサンプルサイズは18人の患者であり、可能な範囲は2〜30人の患者である。この試験の主目的は、腫瘍内注射によるJX-594の安全性およびMTDまたはMFDを決定することである。この試験は、ヒトにおける2回目のJX-594臨床試験に相当する。意味ある統計計算に基づくヒトでの臨床試験は以前に無いので、この試験のサンプルサイズは、臨床安全性を考慮して選択される。この試験の結果は、将来の臨床試験のサンプルサイズの必要条件を決定するために、ばらつきを見積もるのに用いられてもよい。
各コホートの患者には、実際のMTDに達する前に試験を止める機会ならびに実際のMTDより先に進む機会がある。以下の表は、真のDLT発生率に基づく、各転帰の統計的な可能性を示している。以下の表は、最初の3人の患者からなるコホートにおける各転帰の確率(様々な真の発生率が各患者集団に与えられている)を示している。
（表３）
Figure 2014193882
以下の表は、6人の患者からなるコホートにおける各転帰の確率を示す。最初の3人の患者のコホートにDLTが1回観察され、コホートにさらに3人の患者が加えられた後、以下の表は、この特定の患者集団における様々な真の発生率を表している。
（表４）
Figure 2014193882
＊最初の3人の患者から1人の患者および次の3人の患者から1人の患者
2.統計法/データ分析
集計しようとする集団は治療意図(ITT)集団である。治療意図(ITT)集団は、患者全員がJX-594による少なくとも1回の治療を受けていると定義される。さらに、評価可能な患者集団はまたITT集団の一部としても評価される。評価可能な患者は、少なくとも1サイクルの療法を受けたことがあり、治療前および治療後の適切な期間に適切な腫瘍測定が行われている、患者である。
この試験は、コホートにつき2〜6人の患者を有するように4つの治療コホートを用いて進む。各コホートのデータは、適切な記述統計学、頻度作表、グラフ、およびデータ表作成を用いて集計される。治療コホートからのデータは、選択されたデータ表示のために組み合わされる。作成しようとする特定のデータ表示を以下で説明する。
被験者の年齢、体重、および身長は、記述統計学(平均、中央値、標準偏差、最小値および最大値)を用いて集計するが、性別および人種は頻度作表を用いて集計する。治療コホートのデータは各患者について別個に、ならびに組み合わせて集計する。これを行うために、患者1人1人のリストを作成する。それぞれの治療コホートについて身体病歴データが分けられ、頻度作表を用いて集計するために組み合わされる。治療投与は、記述統計学(平均、中央値、標準偏差、最小値および最大値)を用いて集計する。試験薬が与えられたどの患者も安全性分析に含める。安全性データは、有害事象、検査室での結果、毒性、バイタルサイン、および中止情報を含み、それぞれの治療コホートの終了時に別々に集計する。AEはコード付与され、COSTART身体系分類法を用いて作表される。AEを有する被験者の数およびパーセントは、治療コホートおよび治療目的によって作表する。さらに、データは、AEの重篤度および治験医師によって特定されたJX-594との関係によって層別化する。
検査室での結果は終了時に集計する。シフト表は、治療前から治療後に変化した患者の数を表している。選択された変数の検査室での結果を図示する。
腫瘍に対する全奏功率に加えて、標的部位および非標的部位での腫瘍に対する奏功率を記録する。標的部位および非標的部位での腫瘍の無進行期間を報告し、全生存期間も報告する。これは、各グループの少数の患者を用いた調節されていない非ランダム化試験であるので、この試験のみから試験データに対する仮説を立てない。治療コホート間の差異を評価するために、各グループを比較するのに、適宜、パラメトリック法またはノンパラメトリック法を使用することができる。
実施例2
切除不能な悪性黒色腫の治療
A.用量およびスケジュール
1.用量およびスケジュールの根本的理由
1回の治療につき全用量1x108pfuを与える。この用量は、外科手術により治癒しない皮膚黒色腫の治療のための最初のJX-594第1相試験において安全に投与された最大毎週用量である1.6x108pfuより少ない(Mastrangelo et al., 1998)。さらに、1x108pfuは、進行中のJX-594第1相腫瘍内(IT)試験において現在まで安全に投与された最大用量の1/10であり(n=2患者)、現在まで明らかになった最大用量レベルの1/3である。前記の試験では、1〜3個の肝臓腫瘍へのIT注射による治療が3週間ごとに投与された。この試験からの予備結果から、インフルエンザ様症状および血液学的パラメータが、典型的には、JX-594による治療後4日以内に(すなわち、5日目に)ベースラインレベルに戻ることが分かっている。
前記の進行中の肝臓IT試験において、全てのコホートの中の患者が5日目までに軽度〜中程度の治療関係毒性から回復したので、毎週投与計画を選択した。さらに、Mastrangelo et al. 1998からのデータから、1回の治療あたり8x107pfuまでの週2回IT注射が安全かつ有効であることが分かっている。
最初の第1相/第2相黒色腫試験(Mastrangelo et al., 1998)によって証明されたように、患者は、再ワクチン接種後14〜21日以内に、ワクシニアウイルスに対して有意な体液性免疫応答を生じたことが見出された。抗体価は、続行中の治療にもかかわらず、曝露して4〜6週後にプラトーに達することが見出された。従って、このプロトコールは、高力価の抗体およびT細胞が生じる前に、可能性のある最大送達およびJX-594抗腫瘍作用を付与することを目的とした毎週IT投与を6週間調べる。
2.試験の根本的理由
黒色腫は、注射可能な疾患が比較的高い割合あり、IL-2免疫療法を用いて見られる黒色腫のポジティブな応答があり、転移性黒色腫患者に対する有効で忍容性のある療法が無いので、JX-594免疫療法の最適な標的であるかもしれない。さらに、JX-594複製は、メラノサイトにおいて高発現しているEGFR経路を標的とすると考えられている。
最初の第1相/第2相試験からの結果から、JX-594の腫瘍内注射は、外科手術により治癒しない転移性黒色腫を有する患者の注射された疾患および遠位疾患の治療において安全かつ有効であることが示唆されている。JX-594治療に対して部分奏功(6+ヶ月)および完全奏功(4+ヶ月)を実現した2人の患者を含めて、注射腫瘍に対する奏功 (7人の患者うち5人)および少なくとも1個の非注射腫瘍に対する奏功(7人の患者うち4人)が証明された。特に注目に値するのは、患者全員において、治療前のワクチン接種(従って、既存の抗ワクシニア免疫)があるにもかかわらず、有効性および遺伝子発現が認められたことである。
この試験案は、前記の最初の第1相/第2相試験をさらに詳しく調べること、およびステージ3またはステージ4の切除不能な転移性黒色腫を有する15人までの評価可能な患者における注射腫瘍に対する奏功を評価することを目的として選択した。さらに、JX-594の安全性、薬物動態、薬力学、JX-594に対する免疫応答、ならびに血中および腫瘍組織におけるGM-CSF導入遺伝子の発現を評価する。治験医師らは、JX-594が静脈内伝播し、注射されていない局所疾患および遠位疾患に感染できるかどうかも評価する。感染が認められれば、直接腫瘍内に注射した部位で遭遇したものと類似の抗腫瘍作用を付与できる可能性があることが示唆される。この知見は、IT投与JX-594の全臨床経験に付け加わわるほかに、進行性/転移性疾患を治療するための、特に、進行性悪性黒色腫の治療における、IV投与によるJX-594治療を強く裏付けるだろう。
B.治験用製品の説明
JX-594は、一般的に用いられるWyethワクチン株(Dryvax(登録商標), Wyeth laboratories)に由来する、癌を標的とする複製選択性ワクシニアウイルスである。このウイルスは、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子が不活化されたワクチン株に由来する。JX-594は、免疫応答に関与する強力なサイトカインであるhGM-CSFの遺伝子およびプロモーターを含有する。JX-594は、組織内のウイルスの追跡を可能にするlacZ遺伝子の挿入によってさらに改変されている。
C.目的
目的には、(a)注射腫瘍に対する客観的奏功率、(b)IT注射によって投与されたJX-594の安全性および毒性、(c)IT注射によるJX-594投与後の全疾病負荷(entire disease burden)に対する客観的奏功率(RECIST基準)、(d)無増悪生存期間(PFS)、および(e)非注射腫瘍に対する奏功率の評価が含まれる。
D.試験案
1.試験の概要
これは、ステージ3またはステージ4の切除不能な悪性黒色腫を有する患者における第1相/第2相非盲検試験である。患者には、6週間にわたって、合計6回(6)のJX-594腫瘍内注射を与える。各治療には全用量1x108プラーク形成単位(pfu)が投与され、5個(5)までの腫瘍の中で均等に分けられる。6回の治療が完了した後に、JX-594 IT治療によって患者の注射腫瘍に対して部分奏功が認められれば、さらに3回の治療が毎週与えられてもよい。
2.試験エンドポイント
臨床試験の一次エンドポイントは、典型的には、完全奏功率、部分奏功率、および奏功期間を含む、注射腫瘍の奏功率である。この試験の二次エンドポイントには、治療に関係する有害事象の発生率により求められる安全性、重篤な有害事象(SAE)、および完全奏功率、部分奏功率、奏功期間を含む、日常的な検査室パラメータのベースラインからの臨床的に有意義な変化、無増悪生存期間(PFS)、完全奏功率、部分奏功率、および奏功期間を含む非注射腫瘍に対する奏功率が含まれることがある。他のエンドポイントには、全生存期間、臨床的有用性(体重増加およびパフォーマンスステータスの改善を含む)、JX-594評価(例えば、血漿中および/または全血中のウイルスゲノム(Q-PCR);血漿中および/または全血中のウイルス感染性ウイルス、任意(プラークアッセイ法))、免疫学的評価(血清中のJX-594中和抗体;血漿中のGM-CSF測定(ELISAアッセイ法))、組織学的評価(組織内のウイルス遺伝子発現;GM-CSF発現;lac-Z発現;炎症細胞浸潤;壊死;アポトーシス;細胞質内のウイルス複製工場;EGFR経路状況;ならびに腫瘍チミジンキナーゼ状況)が含まれることがある。
3.用量
典型的には、ウイルスは、本明細書に記載のように滅菌生理食塩水で希釈する。各治療には全用量1x108プラーク形成単位(pfu)が投与され、5個(5)までの腫瘍の中で均等に分けられる。
4.試験全期間およびフォローアップ
試験期間は、典型的には、スクリーニング、試験治療、および治療後フォローアップ評価のための患者来院からなる。
スクリーニング
試験のための患者適格性は、JX-594による最初の治療前、14日以内に決められる。
治療
適格性のある患者に6週間にわたって合計6回の治療を行い、1x108pfuの用量を毎週(1日目、8日目、15日目、22日目、29日目、および36日目)腫瘍内注射することによって治療する。患者は、再治療の前に全ての適格性基準を満たし続けなければならない。何らかの理由で治療が省略された場合、適格性基準が満たされ、来院スケジュールが調節され、患者が合計6回の治療を受けるように、それに応じて追跡されれば、省略された治療を翌週に行う。注射は、累計で最大4週間まで遅らせてもよい。治療が遅れた患者は全6回の治療を完了し、6回目の治療の1週間後に奏功について評価される。奏功の評価は、最後の用量が投与された1週間後(すなわち、43日目)に最初に行う。6回の治療が完了した後に、JX-594 IT治療によって患者の注射腫瘍に対して部分奏功が認められれば、さらに3回の治療が毎週与えられてもよい。
治療後フォローアップ
JX-594による最後の治療の28日後(すなわち、64日目)に、患者は全員、フォローアップ来院のために戻る。療法が完了した後6ヶ月間行うか、患者の注射部位が進行するまで行うか、患者が新たな癌療法を開始するまで行うか、または患者が死亡するまで行う。患者は、最後の注射の後3週間ごとに、身体検査(PE)による腫瘍測定(可能であれば)および奏功評価のために診療所に戻る。6週間ごとに、患者は、PEおよび/またはCT/MRIによる奏功評価も受ける。6ヶ月のフォローアップの後3ヶ月ごとに、患者は、注射部位が進行するまで、死亡するまで、または新たな癌療法を開始するまで、腫瘍測定および奏功評価(CT/MRIを含む)のために診療所に戻る。
遺伝子療法産物の長期フォローアップ
注射部位が進行したか、または新たな癌療法を開始した後、患者は、現行のFDAガイドラインに従って、生存および遺伝子療法の潜在的な長期作用についてモニタリングされ続けてもよい。患者が治療または治療後フォローアップのために診療所にもはや戻らなければ、このデータは郵送または電話によって集められてもよい。
E.試験集団
1.選択基準
患者は、典型的には、以下の基準を全て満たしている:
組織学的に確認された、ステージ3またはステージ4の悪性黒色腫;
CT/MRIおよび/または身体検査によって測定可能であり、直接可視化または超音波ガイダンスによって注射可能な少なくとも1個の腫瘍塊;
生存期間が少なくとも16週間と予測されている;
治癒のために癌が外科手術で切除不能である;
KPSスコア>70;年齢>18歳;
生殖能のある男性および女性は、治療中およびJX-594による最後の治療後3ヶ月間、一般に認められている避妊法に従うことに同意しなければならない;
治験審査委員会(IRB)/医療機関内倫理委員会(IEC)が認可したインフォームドコンセント書面を理解し、故意に署名している;
試験手順およびフォローアップ検査を遵守できる;
十分な肝機能(総ビリルビン<2.0×ULN;AST、ALT<2.0×ULN);
十分な骨髄機能(WBC>3,500細胞/mm3および<50,000細胞/mm3;ANC>1,500細胞/mm3、ヘモグロビン>10g/dL;血小板数>125,000plts/mm3);
許容可能な凝固状況(INR<(ULN+10％));および
許容可能な腎機能(血清クレアチニン<2.0mg/dL)。
2.除外基準
典型的には、患者は、以下の除外基準:標的腫瘍が主要な血管構造(例えば、頚動脈)に付着および/または浸潤している;妊娠中または授乳中;HIVに感染していることが分かっている;JX-594による最初の治療の4週以内の全身コルチコステロイドまたは他の免疫抑制薬の使用;新しい治験薬による治療には高リスクと思われる、臨床的に意義のある活動性感染症または管理されていない医学的状態(例えば、肺、神経、心血管、胃腸、泌尿生殖器);基礎疾患および/または服薬(例えば、全身コルチコステロイド)による重大な免疫不全症;ある段階で全身療法が必要となったことがある湿疹の病歴;臨床的に意義のあるおよび/または急速に蓄積する腹水、心外膜滲出液、および/または胸水(例えば、症状管理のためにドレナージを必要とする);スクリーニング前6ヶ月以内に、心筋梗塞、不安定狭心症、うっ血性心不全、心筋炎、不整脈のいずれかを含むが、これに限定されない、重篤または不安定心疾患と診断され、薬を必要としていたか、または心臓の状態の臨床的に有意義な任意の変化;スクリーニングして4週間以内の、放射線療法、化学療法、外科手術、または治験薬による標的腫瘍の治療(マイトマイシンCまたはニトロソ尿素の場合は6週間以内);以前の天然痘ワクチン接種の結果として重篤な反応または副作用を経験したことがある;インフォームドコンセントを与えることができない、もしくはそうする意思が無い、またはこのプロトコールに必要な手順を遵守することができない、もしくはそうする意思が無い、をいずれも満たしてはならない。妊娠中もしくは授乳中の家族、5歳未満の小児、ある段階で全身療法が必要となったことがある湿疹の病歴を有する家族、または基礎疾患(例えば、HIV)および/もしくは服薬(例えば、全身コルチコステロイド)による重大な免疫不全症を有する家族と接触のある患者は、患者の有効な投与期間中および治験薬の最後の投与後3週間、代わりの生活環境を手配できなければ、除外する。
3.他の適格性基準の考慮すべき事項
適格性基準からの逸脱
前記の選択基準/除外基準からのわずかな逸脱(例えば、予め決められた範囲の外にある検査値)を有する患者は、これらの逸脱が患者の安全性、試験の実施、または試験結果の解釈に影響を及ぼすと予想されなければ、試験への参加が許可されてもよい。わずかな逸脱のある患者が登録されるかどうかは、試験のスポンサーまたはスポンサーの代表者の書面による認可を求めなければならない。
4.患者登録の手順
治験医師がスクリーニング評価を行い、患者の適格性を確認したら、スポンサーは、典型的には、スクリーニングおよび適格性の情報を審査し、各患者の登録について治験医師に書面による確認を行う。登録が確認されたら、あらかじめ定義された患者ナンバリング法を用いて、患者に識別子が割り当てられる。患者の識別子は、試験番号の一部、治験施設の番号、患者番号および患者のイニシャルである。
F.治験製品
JX-594は、Jennerex Biotherapeuticsによって供給される。典型的には、JX-594は液体として処方され、使い捨て用に設計されたガラスバイアルに入れて凍結された状態で保管される。それぞれのバイアルは0.15mLを含有する。ウイルス溶液は、無色からわずかに黄色で、透明からわずかに乳白色の溶液である。JX-594の濃度は1.9x109pfu/mLである。
JX-594は、バイオセイフティーレベル2(BSL-2)の感染性物質とみなされている。BSL-2の指定および関連ガイドラインは、人間および環境に対して中程度の潜在的な危険性のある作用物質に適用される。他のBSL-2作用物質の例には、麻疹ウイルス、サルモネラ菌およびB型肝炎ウイルスが含まれる。施設内感染管理方針を調べなければならない。
JX-594は、典型的には、利用が制限され、監視下にある頑丈な冷凍庫に入れて保管される。JX-594を明瞭なラベルのあるバイアルに入れ、バイアルを二次包装の中に入れ、冷凍庫のドアおよび部屋のドアに(作用物質がどういったものであるかを示す)適切なバイオハザードラベルを付けて-60℃またはそれ以下で保管する。冷凍庫は、冷凍庫温度が-60℃まで上昇する前に対応する時間をとっておくために、アラートリミットを-65℃に設定しなければならない。-60℃を長時間上回れば、力価が再確認できるまで、力価が再確認できるまで、影響を受けた材料を検疫する必要がある。
JX-594の適切な取り扱いおよび調製を確実に行うように設計された作業票が試験の捕捉情報と共に治験施設に提供される。ウイルスベクター[バイオセイフティーレベル2(BSL-2)]の調製、輸送、および処分についての施設内感染管理方針を調べ、それに従わなければならない。手袋、ガウン、および眼を保護するものを常に着用しなければならない。JX-594を用いた全ての作業は、薬局/検査室におけるBSL-2取り扱いガイドラインに従って、認可された薬剤師/科学者の指揮下で、垂直な生物学的安全キャビネット(クラス2)の内で行われる。フード自体は、各使用の前後に70％エタノールで拭き取られる。
解凍
解凍は、バイアルを垂直にして室温で行わなければならない。JX-594は温水浴に入れてはいけない。解凍したら、バイアルを円錐形の15mLポリプロピレン遠心チューブ(例えば、CorningまたはFalcon)に入れ、チューブに蓋をし、100xgで2分間遠心分離する。ピンセットまたは同等品を用いて、ポリプロピレンチューブからJX-594バイアルを取り出す。ウイルス製剤は希釈されるかまたは患者に送達されるまで、氷上で保管するか、または冷蔵(2〜8℃)しなければならない。ウイルス製剤を解凍して4時間超経過したら、注入を開始してはならない。
調製
バイアルを遠心分離した後、マイクロピペッターを用いて穏やかに再懸濁する(200μLマイクロピペッターを、示唆された100μLに設定する)。製剤に泡を入れないように注意しなければならない。典型的には、約2.75mLのウイルス溶液(JX-594+食塩水)を調製し、5個の注射器にそれぞれ0.5mLずつ分配する。マイクロピペッターを用いて、滅菌生理食塩水2.64mLを、適切なサイズのポリプロピレンチューブ(例えば、5mL Falconチューブ)に移す。1個(1)のJX-594バイアルから116μL のJX-594を吸い上げ、食塩水を含有するFalconチューブに移す。Falconチューブの蓋を交換し、(箔を用いてまたは遮光容器に入れて)チューブを遮光し、すぐに、覆いをしたチューブを2〜8℃にする(冷蔵するか、または濡れた氷の上に置く)。
投与前30分以内に、10秒間、勢いよくボルテックスする。ボルテックス後、ウイルス溶液(JX-594+食塩水)0.5mLを5個の注射器それぞれに吸い上げる。注射器に蓋をし、注射のために治験医師に送る。ウイルス製剤を解凍して4時間超経過したら、注射を開始してはならない。ウイルス製剤は希釈されるかまたは患者に送達されるまで、氷上で保管するか、または冷蔵(2〜8℃)しなければならない。
1.JX-594の投与
JX-594は、6週間にわたって合計6回（6）、腫瘍内注射によって毎週投与される。投与は、1日目、8日目、15日目、22日目、29日目、および36日目に行われる。患者には、1回の治療につき1x108pfuの用量が5個以下の病変に分けて与えられる。経皮注射による治療が可能な病変(例えば、触診可能な皮膚結節もしくはリンパ節転移)または超音波(US)ガイド下注射による治療が可能な病変のみに治療適格性がある。
治験医師は、それぞれの治療において、どの病変(腫瘍)に注射するかを決定する。サイズに基づいて腫瘍に注射する。それぞれの治療において、最も大きな病変に注射しなければならない。治験医師の自由裁量で、腫瘍を治療するのに1つまたは複数の注射器を使用することができる。
針の進入部位において無菌皮膚が準備された後、局部麻酔薬が投与される。注射には18〜22ゲージ針が用いられる。注射針は以下のように腫瘍に導入される。注射は治験責任医師（principal investigator）または治験分担医師（sub-investigator）によって行われる。
各腫瘍への注射は、注射器の全体積(0.5mL)を、中心穿刺部位から放射状に広がる、腫瘍1つあたり4箇所の等間隔の針跡に注射することによって行う。一例として、ウイルス注射は、以下の通りに行うことができる。(1)針(18〜22ゲージ)を腫瘍中心に挿入する、(2)針を腫瘍の端に向けて(腫瘍の端の1〜3mm以内まで)伸ばす、(3)中心穿刺部位に向けて引き戻しながら注射器体積の約25％(約0.125mL)を注射する、(4)針を腫瘍から完全に引き抜かずに、合計4箇所の針跡に対して90°間隔をあけて前記の工程を繰り返す。
予想される毒性
治療後には、以下の全身毒性:発熱、悪寒、食欲不振、筋肉痛、疲労/無力、および/または頭痛が予想される。好中球、リンパ球、血小板、およびヘマトクリットの一過的な減少が予想される。血液学的パラメータは、典型的には、5日目(典型的な期間2〜3日)までにベースラインレベルに戻った。サイクル1のみで、初回注射後、最初の4日以内に、白血球増加が起こり得る。投与後5〜8日以内に、コホート3の2人の患者において、24,000/μLおよび118,000/μLの白血球総数が報告された。治療後には好酸球の増加も予想され、典型的には、8日目まで高い状態が続く。注射部位では、以下の毒性:疼痛、壊死、潰瘍化、および炎症が起こる可能性が高い。他のウイルス複製部位(例えば、遠位腫瘍)では、疼痛、壊死、潰瘍化、および炎症が起こり得る。
治療後またはJX-594への曝露後には可能性が極めて低く、かつ観察されていないが、播種ワクシニアに関連する発疹または脳炎が起こり得る。これらの合併症は、それぞれ、天然痘ワクチンレシピエントの10,000人に約1人および1,000,000人に1人に現れると述べられている。さらに、NYCBOHワクシニア株を用いた最近のワクチン接種プログラムにおいて、心筋炎の統計的に有意なリスク上昇(10,000ワクチンにつき1〜2人)が証明されている(Arness et al., 2004)。
G.統計
1.転帰の定義
以下は、統計分析に関係する転帰の定義である。毒性コード化および進行、完全奏功、部分奏功、奏功期間、評価可能な患者、および治療関係の定義はこのプロトコールの他の場所で議論する。
無増悪生存期間
JX-594による最初の治療から、治験医師により評価されるように進行が診断された日までの、または進行が認められずに死亡した日までの期間。進行が認められることなく生存していると最後に分かった患者は、進行が最後に評価された時に打ち切られる。進行が記録される前に非プロトコール療法を受けた患者もまた、統計分析が打ち切られると指定される。
全生存期間
JX-594による最初の治療から、死亡した日または生存していると最後に分かった日までの期間。生存していると最後に分かった患者は、統計分析が打ち切られると指定される。
2.分析セットまたは集団
JX-594が与えられた患者は全員、スクリーニング時に人口統計学的特徴について分析され、続いて、安全性、有効性、薬物動態学および薬力学について分析される。集計しようとする集団は治療意図(ITT)集団であり、治療意図(ITT)集団は、患者全員がJX-594による少なくとも1回の治療を受けていると定義される。さらに、評価可能な患者集団も評価される(ITT集団のサブセット)。患者は、JX-594による少なくとも1回の治療を受け、ベースライン時および治療後最初の適切な時点での適切な腫瘍測定値を有するのであれば、評価可能な患者とみなされる。
3.分析方法
記述統計学(n、平均、標準偏差、中央値、最小値、および最大値)を用いて、連続変数を集計する。それぞれの分類内で、患者の数およびパーセント(n、％)を示すカテゴリー変数を集計する。評価可能な患者ならびに治療意図集団に基づいて分析を行う。全体分析を行う。さらに、安全性および有効性の分析を疾患の病期分類と相関付ける。
安全性:分析方法
治験薬が与えられた患者を安全性分析に含める。有害事象、検査室での結果、毒性、バイタルサインおよび中止情報を含む、安全性データを経時的に集計する。患者の年齢、体重、および身長は記述統計学を用いて集計するのに対して、性別および人種は頻度作表を用いて集計する。病歴データは頻度作表を用いて集計する。
有害事象はMedDRA分類法を用いてコード付与し、作表する。試験治療下で発現した（treatment-emergent）AEの発生率を作表する。さらに、データは、有害事象の重篤度(グレード)および治験医師によって特定されたJX-594との関係によって層別化する。安全性分析は、グレード3または4の非血液学的有害事象およびグレード4の血液学的有害事象に焦点を当てている。SAEのリストを作成する。
連続変数の記述統計学を用いて、血液検査および血清化学検査の結果を集計する。さらに、選択された血液学的パラメータの最下点分析を行い、集計する。検査室での結果は、基準範囲と比べて投与後にベースラインから変化した患者の数を表したシフト表に経時的に集計する。選択された変数の検査室での結果も図示する。
KPSパフォーマンススコアは、カテゴリー変数の記述統計学を用いて集計する。スクリーニングおよび/またはベースラインと比較したKPSパフォーマンススコアの最大シフトも集計されることがある。残りの安全性変数も記述統計学を用いて集計する。
薬物動態学/薬力学:分析方法
血中のゲノム濃度を追跡することによって、血液へのウイルス複製および散布を経時評価する。全ての患者において血中のJX-594濃度およびGM-CSFレベルを測定し、薬物動態学的パラメータを評価する。
分析しようとする薬力学的パラメータには、末梢血球数、MIA、および腫瘍生検組織に及ぼすJX-594およびGM-CSFの作用が含まれる。白血球サブセット(好酸球の絶対数、ANC、リンパ球)、サイトカイン、およびJX-594に対する中和抗体の形成のベースラインからの変化を含む、IT注射後のJX-594に対する免疫応答を評価および集計する。
炎症細胞浸潤、ウイルス遺伝子発現、GM-CSF発現、lac-Z発現および腫瘍壊死を含む、組織学的エンドポイント(腫瘍組織および正常組織対照)のベースラインからの変化を評価および集計する。アポトーシス、細胞質内のウイルス複製工場、EGFR経路状況、および腫瘍チミジンキナーゼ状況も評価されることがある。
有効性:分析方法
RECIST基準に基づく治療奏功率を、以下について評価する:全奏功、注射腫瘍に対する奏功、および非注射腫瘍に対する奏功。完全奏功、部分奏功、安定した疾患、および進行の率を集計する。無増悪生存期間、無進行期間、奏功期間、および全生存期間も報告する。疾患の病期分類との相関関係を評価する。
無増悪生存期間および奏功期間はカプラン・マイヤー(Kaplan-Meier)法を用いて評価する。中央値、中央値の(両側)95％信頼区間、最小期間および最大期間、ならびに打ち切られた患者の数が示される。無増悪生存期間についての記述統計値および曲線を作成する。JX-594による治療後の体重増加およびパフォーマンスステータスの改善を経時評価することによって、患者に対する臨床的有用性の評価も行う。黒色腫阻害活性タンパク質(MIA)の経時変化が評価されることがある。MIAも治療奏功と比較されることがある。
奏功評価の第三者審査
治験施設には、選択された患者の全ての放射線学データのコピー(デジタルまたはCD-ROMが好ましい)を第三者の放射線学審査人(IPR)に提供することが求められることがある。皮膚病変を有する患者の場合、第三者審査のためにIRRに写真も送られる。治験施設およびIRRからの結果が報告される。読み手間で一致しない結果は評価されない。
実施例3
難治性肝臓腫瘍の治療
JX-594第1相パイロット試験では、漸増用量を、7人の黒色腫患者の表在性皮膚転移に注射して与えた(Mastrangelo et al.,1999)。最大耐用量(MTD)は報告されず、腫瘍に対する奏功が報告された。本試験の目的は、(パイロット試験において行われたように)予備免疫無しでの、具体的には実質器官内での治療後の、極めて高い用量(100倍)の安全性およびMTD;3週間にわたる血液への複製依存性散布を含む薬物動態;広範囲の癌タイプに対する有効性を定義することであった。従って、この第1相試験では、本発明者らは、(原発性または転移性)肝臓腫瘍を有する患者を腫瘍内注射によって治療した。本発明者らは、MTDと、忍容性が良好な用量での高レベルのJX-594複製および全身GM-CSF発現、有効性、ならびに遠位腫瘍標的化を初めて報告する。本明細書において報告された結果は、JX-594およびこのクラスからの製品を用いた、将来のi.t.試験およびi.v.試験を裏付ける。
A.材料および方法
1.試験案
主目的は、JX-594の安全性およびMTDを決定することであった。第二目的には、薬物動態、複製および散布(尿、咽頭スワブ)、免疫応答(中和抗体、サイトカイン)、ならびに腫瘍に対する奏功が含まれた。患者には、用量漸増群逐次案で4種類の用量レベル(108、3x108、109、3x109プラーク形成単位、pfu)のうち1つを与えた(用量レベルあたり患者2〜6人)。MTDは、2回またはそれ以上の用量制限毒性(DLT)が観察された用量レベルのすぐ前の用量レベルと定義した。DLTは、任意のグレード4毒性、または5日以上続くグレード3毒性と定義した。第三者のデータ安全性モニタリング委員会(DSMB)が全ての用量漸増の決定および主な安全性評価を審査した。
2.患者の選択
患者は、優良臨床試験基準 (GCP)ガイドラインに従ってインフォームドコンセントに署名した。選択基準には、標準的な療法による治療にもかかわらず進行した、切除不能であり注射可能な肝臓内固形腫瘍、正常造血機能(白血球数>3,000mm3、ヘモグロビン>10g/dL、血小板数>75,000/mm3および臓器機能(クレアチニン<1.5mg/dL、AST/ALT<2・5のULN、チャイルドピュークラスAまたはBを含む)、平均余命>16週、およびカルノフスキー・パフォーマンス・ステータス(KPS)>70が含まれた。除外基準には、ワクチン接種合併症のリスクが高い(例えば、免疫抑制、湿疹)、4週間以内の免疫抑制剤もしくは癌治療剤を用いた治療、妊娠、または授乳が含まれた。
3.JX-594の製造および調製
JX-594は、合成初期後期プロモーター制御下にあるヒトGM-CSF遺伝子およびp7・5プロモーター制御下にあるlacZ遺伝子をTK遺伝子領域に挿入することによって改変されたWyeth株ワクシニアである。臨床試験材料は、GMPガイドラインに従ってVero細胞において作製し、スクロース勾配遠心分離法によって精製した。ゲノム対pfuの比は約70:1であった。JX-594は、10％グリセロール、138mM塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水pH7・4に溶解して処方した。最終産物のQC放出試験には、無菌性、エンドトキシン、および効力についてのアッセイ法が含まれた。JX-594を、標的腫瘍の推定総体積の25％に相当する体積になるように、0.9％生理食塩水に溶解して希釈した。
4.治療処置
JX-594は、21ゲージPEIT(経皮エタノール注射、マルチポア;HAKKO Medicals; Tokyo, Japan)針を用いて、イメージガイド下での腫瘍内注射によって投与した。3週間ごとに、腫瘍(n=1〜3)に、腫瘍から針を引き抜いている間、2箇所の針跡に沿って注射を行った。初回治療コースは2サイクルであった。腫瘍に対する奏功が生じれば、さらに6回までのサイクルを認めた。
5.患者のモニタリング
表5に記載のように、患者をモニタリングした。病院内での治療後少なくとも48時間、および外来患者として4週間、患者をモニタリングした。
（表５）試験手順
Figure 2014193882
6.中和抗体(NAb)価
NAb価は、細胞変性効果阻害アッセイ法によって求めた。熱失活血清を、半対数(half log)希釈を用いて培地で連続希釈した。50μLの試料を1,000pfu JX-594と2時間インキュベートし、次いで、A2780細胞に接種した。3日後、Cell Counting Kit-8(Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japan)を用いて、細胞生存率を求めた。NAb価は、>50％細胞生存率をもたらした最大血清希釈度の逆数と定義した。
7.JX-594の定量PCR
定量PCR(Q-PCR)は、抗体および/または補体中和に関係なく産物を検出する再現性および能力があるために、血中のJX-594ゲノムを連続して測定するのに使用した。JX-594 DNAは、QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を用いて試料から精製した。Q-PCRは、以前に述べられたように(Kulesh et al., 2004)行った。JX-594検出および定量の下限は、それぞれ、666コピー/mL血漿および3,333コピー/mL血漿であった。
8.JX-594散布の検出
プラーク形成アッセイ法は、感染性JX-594の環境への散布を検出するのに使用した。感染単位の散布は公衆衛生と関連があるだろう。尿および唾液試料を回転させ、10mM Tris(pH9・0)に再懸濁し、A2780細胞上でのプラークアッセイ法によって力価測定した。検出限界は20pfu/ml試料であった。
9.サイトカインアッセイ法
GM-CSFは、ELISAキット(BioSource International; Carlsbad, CA, USA)によってベンダーの説明書に従って検出した。LINCOplexキットを用いて、製造業者(LINCO; St. Charles, MO)により指示されたように、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、およびインターフェロン-γの血清中レベルを評価した。
10.血中および腫瘍試料中のワクシニアタンパク質およびLacZの組織病理学的染色
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した生検材料を、組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学検査については、B5Rマウスモノクローナル抗体(Vac-14, α-B5R, 46μg/mL;Dr. Gary Cohen, University Pennsylvannia;1:50または1:100に希釈)を使用した後に、DAKO EnVision+(商標)抗マウスHRP標識ポリマー(DAKO, Carpinteria, CA)とインキュベートした後、DAB(Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)を用いて発色させた。LacZ染色については、細胞を900rpmで1分間回転させ、リンスし、ガラススライド上で0.5％グルタルアルデヒドを用いて固定した。次いで、細胞を洗浄し、X-gal溶液を用いて4時間〜一晩染色した。
11.腫瘍に対する奏功の評価
腫瘍に対する奏功は2サイクルごとに評価した。コントラスト増強CTスキャンが(禁忌でない限り)標準であった。腫瘍の最大直径およびハウンスフィールド単位(HU;密度推定値)を得た。奏功についてはRECIST基準およびChoi基準を適用した(Choi et al., 2007)。腫瘍マーカーがベースライン時に高ければ、腫瘍マーカーを追跡した。
12.統計的な問題
試験サンプルサイズは安全上の問題によって決定した。治療意図集団(>1用量)および標準的な用量漸増案を用いた。用量漸増の可能性は、治療集団内に様々な真のDLT率があると仮定して、日常的な第1相用量漸増試験に従って計算した。
B.結果
1.患者の特徴
14人の患者を登録した(特徴を表6に列挙した;試験の概要を図20に示した)。3人の患者をコホート1〜2において治療し、6人を3番目のコホートにおいて治療し、2人を最大のコホートにおいて治療した。腫瘍進行に起因する関係のない患者死亡があったために、DSMBの要望により、6人の患者をコホート3において治療した。2人の患者(コホート1、3)は、関係のない有害事象により1サイクル後に治療を中止し、最大用量の患者にはDLTのために1サイクルを行った(以下を参照されたい)。
（表６）患者の人口統計
Figure 2014193882
2.治療に関係する毒性
a.有害事象(AE)
JX-594は、MTD(109pfu)まで忍容性が良好であった。治療に関係する死亡は試験時に起こらなかった。患者は全員、グレード1〜2のインフルエンザ様症状(治療後4〜16時間)を経験した。4〜12時間以内に用量に関係する低血圧(グレード2、臓器機能不全なし)が起こった。表7は、JX-594と関係する可能性のある最もよくみられるAEを示している。治療に関係しているとみなされた、重篤なAE症例(食欲不振および腹痛)は1つしかなかった。(PIにより)重篤かつ無関係な10のAEが報告され、腫瘍進行に関連した合併症によるものだとされた。4人の患者がAE報告期間中に腫瘍進行で死亡した。
コホート4の2人の患者がDLTを経験した。2人とも、腫瘍膨張および肝内胆管閉塞によるグレード3の直接型高ビリルビン血症と、グレード3の食欲不振および腹痛を経験した。
b.検査室データ
最初の3日間、リンパ球、血小板、およびヘマトクリットが、治療に関係して一過的に減少することが認められた。最初の4日以内に、9人の患者の好中球絶対数(ANC)が有意に増加した(7人が100％超増加した;図2A)。ANC増加は用量に関係し、血中のGM-CSF検出と頻繁に関連した。コホート3および4の患者の75％においてANCは有意に増加した(>5,000/μL)(対コホート1、2の17％;図21A)。単球および好酸球の増加が観察された。血小板減少も用量依存性であったが(図22A)、サイクル非依存性であった(図22B)。ANC増加はサイクル1において最大であった(図22C)。リンパ球減少および白血球減少が2人の患者において現れた(表7)。MTDにおいて有意なトランスアミナーゼ上昇は現れなかった(図21B)。
（表７）JX-594と関係する可能性のある、最もよくみられる有害事象(3人以上の患者が経験したグレード1/2のAEおよび1人以上の患者が経験したグレード3/4のAEを含む)
Figure 2014193882
3.薬物動態学的エンドポイントおよび薬力学的エンドポイント
a.血清中GM-CSF
13人の患者はベースライン時に血清中GM-CSF陰性であった。MTD時の3人の患者のGM-CSFは、JX-594注射後>48時間、検出可能であった(46〜16,000pg/mL)(図21A)。この濃度は、GM-CSFタンパクを患者に皮下注射した後に報告された濃度(Cebon et al., 1992)より高かった。GM-CSF濃度はWBC誘導と相関関係があった(図21A)。
b.中和抗体(NAb)
ベースライン時には、患者の79％において低い(<10)、または検出不可能な抗JX-594抗体(NAb)レベルが認められた。患者は全員、22日以内にNAbを発生した。NAb価は、初回投与後に患者の45％においてピークに達し、55％においてさらに増加した。
ベースラインまたは治療後のNAb価と、JX-594薬物動態、複製、GM-CSF発現または有効性を含む臨床エンドポイントまたは検査室エンドポイントとの間に相関関係は見られなかった。腫瘍に対して客観的RECIST奏功のある3人の患者のNAb価はベースライン時に検出可能であり、力価が治療後に高くなった(32,000、32,000、および10,000)。さらに、2人の患者では、新たに発症した頚部転移が高レベルNAb誘導後に治療され、両腫瘍に対して客観的奏功が認められた(以下;表8および図24B)。
（表８）標的腫瘍の奏功および生存期間
Figure 2014193882
1最初の番号は用量レベルを表す(例えば、103は用量レベル1であった)。
2RECIST基準:部分奏功(PR)は最大直径の>30％の減少である。進行(PD)は>20％の増加である。安定した疾患は、PRおよびPDのこれらの2つの限度間での直径の変化である。
3Choi基準:最大直径の>10％減少または密度の>15％減少;+は奏功を示す。
4腫瘍マーカー応答の定義:>50％減少:PR;>25％増加:PD;<50％減少または25％増加:SD;マーカーは、患者201、301、402ではα-フェトプロテイン(AFP)、401ではPIVKA2、302、305、306では癌胎児抗原(CEA)であった。
5生存:+は癌に関係する死亡が無いことを示す;m:月;d:日
6今なお生存
7HU:ハウンスフィールド単位
83週目で行ったCTスキャンは腫瘍進行を示した。
c.サイトカイン
インターロイキン-6、IL-10、およびTNF-αが3時間でピークに達した。それより後のピーク(3〜22日目)も観察された。サイトカイン誘導は、サイクル1よりサイクル2〜8において高かった。インターロイキン-6誘導は血清中のGM-CSFと相関関係があった。IL-1βおよびIL-4の誘導は認められなかった。
d.JX-594薬物動態
患者は全員、注射直後にJX-594ゲノムが検出された(50サイクルのうち49)。濃度は用量と相関関係があり、15分以内に約50％、4〜6時間以内に約90％減少した(図23Aおよび図23B)。クリアランス初速度は用量依存性でもなく抗体価依存性でもなかった。血中に注射されたJX-594の初回放出およびクリアランスの後、循環JX-594の遅れた再出現が複製と一致して、頻繁に検出された。3〜22日目に、15人の患者のうち12人(80％)に、検出可能なゲノム(血液または血漿)があった。二次ピーク濃度は用量と大まかな相関関係があり、薬物動態が似ていた(図23B)。サイクル2〜7での反復投与後に、さらに低い二次濃度ピークが検出された(11人の患者のうち4人)。代表的な薬物動態を図23Cに示す。
e.注射されていない遠位腫瘍部位内でのJX-594播種、複製
JX-594は非注射腫瘍組織において検出された。このことは、遠位腫瘍選択的な感染および複製を示している(図23D〜F)。例えば、ある患者の悪性腹水および胸水のゲノム濃度は同じ時点の血液より高く(それぞれ、17倍および12倍)、GM-CSF濃度も高かった(それぞれ、24倍および13倍) (図3D)。胸水中のLacZ(+)細胞からJX-594感染が確かめられた(図23E)。別の患者は遠位頚部腫瘍が生検により採取され、複製JX-594が組織学的に証明された(図23F)。
f.JX-594散布
感染性JX-594は咽頭試料でも尿試料でも検出されなかった。
4.JX-594の抗腫瘍有効性
標的腫瘍に対する奏功について10人の患者が評価可能であった。評価不可能な患者は、コントラストに対して禁忌を示したか(2)、または治療後のスキャンが無かった(2)。9人(90％)に、CT RECIST基準による客観的奏功(30％)または安定した疾患(60％)が認められた。8人(80％)に、Choi基準による客観的奏功が認められた(表8)。RECIST基準およびChoi基準の両方により奏功が認められた患者には、非小細胞肺癌(図24A)、HCC、および黒色腫(表8)があった。客観的奏功は永続性があり、奏功が認められた腫瘍部位の再成長は起こらなかった(4〜18ヶ月のフォローアップ)。肝臓における先の4サイクルの後に、2人の患者において、以前に注射されたことがない頚部腫瘍に直接注射が行われると、高レベルのJX-594中和抗体にもかかわらず、Choiおよび/またはRECISTによる奏功が認められた(表8、図24B)。従って、再治療による有効性は実現可能であった。
非注射遠位腫瘍における奏功も評価した。非注射遠位腫瘍を有する患者7人のうち6人の患者に、RECIST基準により、安定した遠位疾患が認められた。これらの遠位腫瘍の無進行期間は6+〜30+週間であった。これらの患者のうち3人に、Choi基準(n=2)またはPET-CT(n=1;25〜100％減少;表9)による奏功が認められた。
（表９）標的腫瘍対照を有する患者の遠位腫瘍に対する奏功(RECIST PRまたはSD)
Figure 2014193882
1最初の番号は、用量レベルを表す(例えば、103は用量レベル1であった)。
2CT RECISTによる;+は癌に関係する死亡が無いことを示す
HU:ハウンスフィールド単位;LN:リンパ節;SC:鎖骨上;PA:耳介前;CR:完全奏功;PR:部分奏功;SD:安定した疾患;PD:進行
現在まで、8人の患者(57％)が少なくとも8ヶ月間生存し、4人が1年を超えて生存し、1人が20+ヶ月まで生存している。生存期間の中央値は9ヶ月であった。
本明細書に開示および請求された組成物および方法は全て、本開示を考慮して過度の実験なく作成および実施することができる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して説明されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびに本明細書に記載の方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかであろう。さらに具体的には、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的および生理学的に関連しているある特定の薬剤を使用することができ、同時に、同一の結果または類似の結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかな、このような全ての類似の代用および変更は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内と考えられる。
参考文献
以下の参考文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載のものを補足する他の詳細を示す程度まで、参照として本明細書に特に組み入れられる。
Figure 2014193882
Figure 2014193882
Figure 2014193882
Figure 2014193882
Figure 2014193882
Figure 2014193882
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の特定の態様を示しているが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中で様々な修正および変更が当業者に明らかになるので、例示にすぎないことが理解されるはずである。
[本発明1001]
以下の工程を含む、腫瘍を有する被験体において腫瘍崩壊を誘導する方法:
該被験体に、腫瘍内の細胞の腫瘍崩壊を誘導するのに十分な少なくとも1x10 8 ウイルス粒子の、TK欠損性、GM-CSF発現性の複製能を有するワクシニアウイルスベクターを投与する工程。
[本発明1002]
被験体に少なくとも1x10 9 ウイルス粒子が投与される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ワクシニアウイルスベクターが、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上投与される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ワクシニアウイルスが、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくはそれ以上、または1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間もしくはそれ以上にわたって投与される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
被験体がヒトである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
腫瘍が、脳癌腫瘍、頭頚部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
腫瘍が肝細胞癌または黒色腫である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
量が、腫瘍内の細胞の少なくとも20％、腫瘍内の細胞の少なくとも30％、腫瘍内の細胞の少なくとも30％、腫瘍内の細胞の少なくとも40％、腫瘍内の細胞の少なくとも50％、腫瘍内の細胞の少なくとも60％、腫瘍内の細胞の少なくとも70％、腫瘍内の細胞の少なくとも80％、または腫瘍内の細胞の少なくとも90％において腫瘍崩壊を誘導するのに十分な量である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
腫瘍が再発性である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
腫瘍が原発性である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
腫瘍が転移性である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
腫瘍が多剤耐性である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
被験体に第2の癌療法を投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、寒冷療法、毒素療法、または外科手術より選択される第2の癌療法をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
ワクシニアウイルスベクターの第2の投与をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
被験体が免疫無防備状態である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
腫瘍が、治療前に切除不能であり、かつ治療後に切除可能である、本発明1001の方法。
[本発明1018]
治療後に腫瘍細胞の生存を評価する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
投与する工程が、腫瘍塊への注射を含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
投与する工程が、腫瘍脈管構造への注射を含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
投与する工程が、腫瘍の領域のリンパ系または脈管構造系への注射を含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
投与前に腫瘍を画像化する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
ワクシニアウイルスが、1つまたは複数の改変ウイルス遺伝子を含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
1つまたは複数の改変ウイルス遺伝子が、以下の1つまたは複数を含んでもよい、本発明1024の方法:
(a)インターフェロン調節ポリペプチド;
(b)補体制御ポリペプチド;
(c)TNF調節ポリペプチドまたはケモカイン調節ポリペプチド;
(d)セリンプロテアーゼ阻害剤;
(e)IL-1β調節ポリペプチド;
(f)非感染性EEV型ポリペプチド;または
(g)細胞からの感染性ウイルスの放出を阻害するように働くウイルスポリペプチド(抗感染性ウイルス型ポリペプチド)。

Claims (24)

  1. 以下の工程を含む、腫瘍を有する被験体において腫瘍崩壊を誘導する方法:
    該被験体に、腫瘍内の細胞の腫瘍崩壊を誘導するのに十分な少なくとも1x108ウイルス粒子の、TK欠損性、GM-CSF発現性の複製能を有するワクシニアウイルスベクターを投与する工程。
  2. 被験体に少なくとも1x109ウイルス粒子が投与される、請求項1記載の方法。
  3. ワクシニアウイルスベクターが、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上投与される、請求項1記載の方法。
  4. ワクシニアウイルスが、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくはそれ以上、または1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間もしくはそれ以上にわたって投与される、請求項3記載の方法。
  5. 被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
  6. 腫瘍が、脳癌腫瘍、頭頚部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、請求項1記載の方法。
  7. 腫瘍が肝細胞癌または黒色腫である、請求項6記載の方法。
  8. 量が、腫瘍内の細胞の少なくとも20％、腫瘍内の細胞の少なくとも30％、腫瘍内の細胞の少なくとも30％、腫瘍内の細胞の少なくとも40％、腫瘍内の細胞の少なくとも50％、腫瘍内の細胞の少なくとも60％、腫瘍内の細胞の少なくとも70％、腫瘍内の細胞の少なくとも80％、または腫瘍内の細胞の少なくとも90％において腫瘍崩壊を誘導するのに十分な量である、請求項1記載の方法。
  9. 腫瘍が再発性である、請求項1記載の方法。
  10. 腫瘍が原発性である、請求項1記載の方法。
  11. 腫瘍が転移性である、請求項1記載の方法。
  12. 腫瘍が多剤耐性である、請求項1記載の方法。
  13. 被験体に第2の癌療法を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  14. 化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、寒冷療法、毒素療法、または外科手術より選択される第2の癌療法をさらに含む、請求項1記載の方法。
  15. ワクシニアウイルスベクターの第2の投与をさらに含む、請求項1記載の方法。
  16. 被験体が免疫無防備状態である、請求項1記載の方法。
  17. 腫瘍が、治療前に切除不能であり、かつ治療後に切除可能である、請求項1記載の方法。
  18. 治療後に腫瘍細胞の生存を評価する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  19. 投与する工程が、腫瘍塊への注射を含む、請求項1記載の方法。
  20. 投与する工程が、腫瘍脈管構造への注射を含む、請求項1記載の方法。
  21. 投与する工程が、腫瘍の領域のリンパ系または脈管構造系への注射を含む、請求項1記載の方法。
  22. 投与前に腫瘍を画像化する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  23. ワクシニアウイルスが、1つまたは複数の改変ウイルス遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
  24. 1つまたは複数の改変ウイルス遺伝子が、以下の1つまたは複数を含んでもよい、請求項24記載の方法:
    (a)インターフェロン調節ポリペプチド;
    (b)補体制御ポリペプチド;
    (c)TNF調節ポリペプチドまたはケモカイン調節ポリペプチド;
    (d)セリンプロテアーゼ阻害剤;
    (e)IL-1β調節ポリペプチド;
    (f)非感染性EEV型ポリペプチド;または
    (g)細胞からの感染性ウイルスの放出を阻害するように働くウイルスポリペプチド(抗感染性ウイルス型ポリペプチド)。
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