CN116917468A - 新型修饰的呼肠孤病毒及其用途 - Google Patents

新型修饰的呼肠孤病毒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种修饰的呼肠孤病毒及其用途，并已证实一种由野生型呼肠孤病毒衍生的新型修饰的呼肠孤病毒不仅对各种癌症，包括罕见癌症有很好的抗癌效果，而且还能增强癌症免疫治疗剂的效果。特别是，证实了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在用于治疗各种类型的癌细胞，包括罕见的癌症，如黑色素瘤和舌癌时，可显著降低所有癌细胞系的细胞活力，特别是，即使对基于紫杉烷的抗癌药物耐受的癌细胞系也有很好的抗癌效果。此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒即使在黑色素瘤、膀胱癌和口腔癌小鼠模型中也表现出无关给药途径的剂量依赖性的抗癌效果，而在重复给药或与野生型呼肠孤病毒交替给药时，显示抗癌效果进一步提高。特别是，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒与免疫检查点抑制剂联合使用时，表现出协同抗癌作用。因此，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒有望有效地作为用于治疗罕见癌症等的一种新的抗癌疗法，并作为一种与癌症免疫治疗剂联合使用的药物。

Description

新型修饰的呼肠孤病毒及其用途
技术领域
本发明涉及一种新型修饰的呼肠孤病毒及其用途。
本申请要求于2020年12月22日提交的韩国专利申请第10-2020-0180824号和2021年12月22日提交的韩国专利申请第10-2021-0184947号的优先权，上述申请的说明书和附图中公开的所有内容均通过引用合并于此。
背景技术
癌症早期诊断方法的发展和新的抗癌疗法的不断发展，提高了癌症的治疗效果。然而，癌症仍然是全世界的一个主要死因。2015年，韩国总死亡人数的27.9％(275,895人)是由于癌症，使其成为该国死亡的主要原因。癌症的发病率和死亡率在持续上升。
罕见的癌症是指流行人口少于20,000或确切的流行率不详的癌症，因为早期诊断很困难。它们是根据韩国卫生和福利部制定的程序和标准来定义的(罕见疾病管理法，2019年4月30日执行)。在韩国，罕见癌症，如血癌，占所有癌症病例的16％。然而，大多数新药开发都集中在前10种癌症上，这些癌症的患者人数较多。因此，针对罕见癌症的新药开发案例非常少。对于罕见癌症，由于缺乏既定的治疗指南和抗癌药物，存在治疗效果差的问题，而且早期诊断困难，导致在第三阶段或更晚的时候才诊断，而此时已经发生了转移。
具有代表性的罕见癌症，如舌癌和恶性黑色素瘤，在治疗过程中会引起皮肤溃疡和面部畸形，这会降低患者的生活质量，严重时还会导致抑郁症或自杀等并发症。舌癌是一种常见的口腔癌类型，发生在口腔内的舌头上。90％以上的口腔癌对应的是起源于口腔粘膜鳞状细胞的恶性肿瘤。舌癌是一种罕见的癌症，占所有癌症患者的不到0.2％，可能导致后遗症，如咀嚼运动减少和口面部畸形。如果错过了适当的治疗时间，舌癌作为一种高度危险的癌症，在发病后5年内可导致约44％的死亡率。
在发展中国家，包括舌癌在内的口腔癌的发病率高达13％。根据Mores等人的统计，1998年美国大约有30,300例口腔癌，包括舌癌、口腔癌、咽癌和其他口腔癌，导致大约8000人死亡(Oral Oncol.1999Jan；35(1):1-8)。癌症的发生趋势各不相同，在东欧和中欧出现了上升的趋势。Maria和Susan报告说，直到1998年，口腔癌的发病率为每10万人中有8.3例，95％以上的病例发生在40岁或以上的人身上。从1975年到1998年，口腔癌更频繁地发生在男性身上，并且在黑色种族群中的发病率更高(Oral Oncol.2002Sep；38(6):610-7)。据报道，在韩国，每年约有3,000例口腔癌，包括舌癌。
黑色素瘤的病因尚不完全清楚，但已知它是由遗传和环境因素的复杂相互作用造成的，如暴露于紫外线辐射。有黑色素瘤家族史的人占所有病例的10％至15％，如果同一代有病人，风险会增加一倍。在环境因素中，紫外线辐射，特别是紫外线B，与黑色素瘤的发展有关，特别是在有色素痣或不典型痣的人中。
同时，溶瘤病毒是一种自我复制的病毒，可以选择性地感染、复制和诱导癌细胞而不是正常细胞的凋亡，并被喻为第四代抗癌剂，将彻底改变抗癌药物市场。溶瘤病毒对肿瘤细胞的破坏可以诱发周围肿瘤细胞的再感染，导致抗肿瘤效果的放大。此外，溶瘤病毒还具有通过感染肿瘤中的血管内皮细胞来抑制新血管生成的能力。然而，溶瘤病毒免疫疗法的发展受到了开发和制造病毒的高度困难的阻碍，这造成了一个巨大的进入壁垒。因此，可应用于临床的溶瘤病毒的开发仍处于起步阶段，针对罕见癌症的有效溶瘤病毒还没有被发现。
发明内容
技术问题
本发明是为了解决上述问题，并通过证实一种由野生型呼肠孤病毒衍生的新型修饰的呼肠孤病毒不仅对包括罕见癌症在内的各种癌症有很好的抗癌效果，而且可以增强抗癌免疫治疗的效果，从而完成本发明。
因此，本发明的一个目的是提供修饰的呼肠孤病毒，其对野生型呼肠孤病毒有抗性的癌症具有抗癌效果。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包括上述修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
然而，本发明的还一个目的是提供一种用于与免疫检查点抑制剂共同给药的药物组合物，该组合物包括上述修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
然而，本发明所要解决的技术问题并不限于上述问题，本发明所属技术领域的技术人员将从以下描述中清楚地了解其他未提及的问题。
技术方案
本发明提供了一种修饰的呼肠孤病毒，其包括：突变，其中从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中删除了第251至455位氨基酸；以及
一个或多个选自以下的突变：SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第963位Met被Val取代，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第1265位Thr被Ile取代。
在本发明的一个实施方案中，修饰的呼肠孤病毒还可包括突变，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第227位Ile被Val取代，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的呼肠孤病毒还可包括一个或多个选自但不限于以下的突变：
(a)在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第73位的Glu被Asp取代；
(b)在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第434位的Asp被Asn取代；以及
(c)在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第644位的Val被Ala取代。
在本发明的还另一个实施方案中，修饰的呼肠孤病毒还可包括一个或多个但不限于以下的突变：
(a)在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第64位的Lys被Glu取代；
(b)在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第177位的Ser被Phe取代；
(c)在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第229位的Glu被Asp取代；以及
(d)在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第251位的His被Leu取代。
在本发明的一个实施方案中，修饰的呼肠孤病毒可以衍生自野生型人类呼肠孤病毒，但不限于此。
本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中包括修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
此外，本发明提供了一种癌症预防或治疗方法，包括向有需要的受试者施用修饰的呼肠孤病毒。
此外，本发明提供了修饰的呼肠孤病毒在癌症预防或治疗方面的用途。
此外，本发明提供了修饰的呼肠孤病毒制造抗癌药物的用途。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其中包括根据本发明的组合物。
在本发明的一个实施方案中，癌症可选自包括鳞状细胞癌、神经母细胞瘤、肺癌、肺腺癌、腹膜癌、皮肤癌、眼癌、直肠癌、肛周癌、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、尿道癌、血癌、肝癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、口腔癌、舌癌、脑癌和间质瘤，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，癌症可以是对基于紫衫烷(taxane)的抗癌剂有抵抗力的癌症，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，基于紫杉烷的抗癌剂可选自包括以下：紫杉醇(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、多西他赛(docetaxel)、奥他赛(oltataxel)和和特西他赛(tesetaxel)，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，修饰的呼肠孤病毒可以以1×105至1×1020TCID50的剂量包含在组合物中，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物可用于直接瘤内给药或静脉给药，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物可以对需要的受试者进行一次以上的给药，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物可与野生型呼肠孤病毒共同给药，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物可在野生型呼肠孤病毒给药之前或之后给药，但不限于此。
在本发明的又一实施方案中，该组合物还可包括免疫检查点抑制剂作为活性成分，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，免疫检查点抑制剂可包括选自：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、OX40抑制剂、CTLA-4抑制剂、4-1BB抑制剂、LAG-3抑制剂、B7-H4抑制剂、HVEM抑制剂、TIM4抑制剂、GAL9抑制剂、VISTA抑制剂、KIR抑制剂、TIGIT抑制剂和BTLA抑制剂，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物可以是混合物的形式，其中修饰的呼肠孤病毒和免疫检查点抑制剂被混合，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物可以是修饰的呼肠孤病毒和免疫检查点抑制剂的单独制剂形式，同时或依次给药，但不限于此。
此外，本发明还提供了一种用于与免疫检查点抑制剂联合治疗的药物组合物，其中包括修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
在本发明的一个实施方案中，该组合物可与免疫检查点抑制剂同时、分别或依次施用，但不限于此。
此外，本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用包括修饰的呼肠孤病毒和免疫检查点抑制剂两者的组合物。
此外，本发明提供了一种修饰的呼肠孤病毒与免疫检查点抑制剂联合治疗的用途。
此外，本发明还提供了修饰的呼肠孤病毒用于制造与免疫检查点抑制剂联合治疗的药物的用途。
有益效果
本发明涉及一种修饰的呼肠孤病毒及其用途，其中衍生自野生型呼肠孤病毒的新型修饰呼肠孤病毒不仅对各种癌症，包括罕见癌症表现出优异的抗癌效果，而且还能增强免疫治疗剂的功效。具体来说，在用修饰的呼肠孤病毒处理时，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒显著降低了所有癌症细胞系的存活率，包括各种类型的癌症细胞，包括罕见的癌症细胞，如黑色素瘤细胞、舌癌细胞等，并且特别是，发现对基于紫衫烷抗癌剂的癌症细胞系具有优异的抗癌效果。此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在黑色素瘤、膀胱癌和口腔癌小鼠模型中表现出剂量依赖性的抗癌效果，无论给药途径如何，当重复给药或与野生型呼肠孤病毒联合使用时，抗癌效果进一步提高。值得注意的是，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒与免疫检查点抑制剂联合使用时，协同增强了抗癌效果。因此，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒有望作为一种新的抗癌疗法用于治疗罕见的癌症，并作为免疫治疗剂的组合药物。
附图说明
图1A显示了用紫杉醇或修饰的呼肠孤病毒(RP116)在不同浓度下处理正常细胞系后，根据处理浓度不同的细胞存活率结果。
图1B显示了用紫杉醇或RP116在不同浓度下处理各种紫杉醇耐药癌细胞系后，根据处理浓度的不同，癌细胞存活率的结果。
图2A显示用不同浓度的RP116处理各种人源癌细胞系后，根据处理浓度得出的癌细胞存活率和IC50值的结果。
图2B是用RP116在不同浓度下处理正常细胞系和各种类型的癌细胞系后，根据处理浓度汇总的细胞死亡率的表格。
图3显示了用野生型呼肠孤病毒或RP116处理各种皮肤癌细胞系后，根据处理浓度的癌细胞存活水平结晶紫染色的结果(Mock：未经处理的对照组，以下同)。
图4显示用野生型呼肠孤病毒或RP116处理各种口腔癌细胞系后，根据处理浓度的癌细胞存活水平的结晶紫染色结果。
图5显示了用野生型呼肠孤病毒或RP116处理各种口腔癌细胞系后，根据处理浓度的不同，癌细胞存活率和IC50值的结果。
图6A是显示对皮肤癌小鼠模型进行瘤内(IT)或静脉(IV)给药的方法的示意图。
图6B显示了对皮肤癌小鼠模型以1×108TCID50或1×109TCID50的剂量进行瘤内或静脉注射RP116后，各组平均肿瘤体积随时间变化的结果(对照组：未处理的对照组，以下同)。
图6C显示了对皮肤癌小鼠模型进行1×108TCID50或1×109TCID50剂量的RP116瘤内或静脉注射后，各组平均体重随时间变化的结果。
图7A显示了对皮肤癌小鼠模型以1×109TCID50的剂量静脉注射RP116 2次或5次后，各组平均肿瘤体积随时间变化的结果(空载：未处理的对照组，以下同)。
图7B显示了对皮肤癌小鼠模型静脉注射1×109TCID50剂量的RP116后，各组的存活率随时间变化的结果。
图7C显示了对皮肤癌小鼠模型静脉注射1×109TCID50剂量的RP116后，各组的平均体重随时间变化的结果。
图8A显示了对皮肤癌小鼠模型单独或与免疫治疗剂(αPD-L1)联合施用RP116后，各组的平均肿瘤体积随时间变化的结果。
图8B是对皮肤癌小鼠模型单独或与免疫治疗剂联合施用RP116后，各组生存率随时间变化的结果。
图9A显示了对口腔癌小鼠模型施用RP116后，各组平均肿瘤体积随时间变化的结果。
图9B显示了对口腔癌小鼠模型施用RP116后，各组的平均体重随时间变化的结果。
图10A显示了各组平均肿瘤体积随时间变化的结果，其中在皮肤癌小鼠模型中连续施用野生型呼肠孤病毒(WT/WT)，或在施用野生型呼肠孤病毒后施用RP116(WT/RP116)。
图10B是在皮肤癌小鼠模型中连续施用RP116(RP116/RP116)或在RP116治疗后施用野生型呼肠孤病毒(RP116/WT)后各组平均肿瘤体积随时间变化的结果。
图11A是确定对RP116或野生型呼肠孤病毒(RC402)的中和抗体的抗性的实验示意图。
图11B显示用RC402或RP116病毒和RC402诱导的中和抗体(RC402ab)处理细胞后，根据中和抗体的稀释倍数得出的细胞存活率结果(Y轴)。
图11C显示了用RC402或RP116病毒和RP116诱导的中和抗体(RP116ab)处理细胞后，根据中和抗体的稀释倍数计算的细胞存活率(y轴)结果。
具体实施方式
本发明涉及一种修饰的呼肠孤病毒及其用途，其中衍生自野生型呼肠孤病毒的新型修饰的呼肠孤病毒不仅对各种癌症(包括罕见癌症)表现出优异的抗癌效果，而且已经证实可以增强免疫治疗剂的效果。
具体来说，在本发明的一个实施方案中，制备了一种修饰的呼肠孤病毒(RP116)，并确认了其分子生物学特性(实施例1和2)。
在本发明的另一个实施方案中，在用RP116处理正常细胞和对紫杉醇(一种基于紫衫烷的抗癌药物)有抗性的癌细胞系后，证实了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对紫衫烷抗癌药物抗性的癌细胞发挥了特定的抗癌作用，而对正常细胞没有毒性(实例3)。
在本发明的又一个实施方案中，在用RP116处理各种癌细胞系，包括罕见的癌症后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对多种类型的癌症表现出剂量依赖性的抗癌作用(实施例4)。
在本发明的另一个实施方案中，在用野生型呼肠孤病毒和RP116分别处理各种皮肤癌细胞系、口腔癌细胞系和膀胱癌细胞系后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒比野生型呼肠孤病毒有更强的抗癌作用(实施例5至7)。
在本发明的又一个实施方案中，在皮肤癌小鼠模型中以低剂量或高剂量直接向肿瘤内或静脉注射RP116后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在两种给药途径中都表现出极好的抗癌效果，并且抗癌效果与病毒剂量相关(实施例8)。
在本发明的又一个实施方案中，在比较RP116在皮肤癌小鼠模型中的抗癌效果取决于给药次数后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒给药次数越多，抗癌效果越强(实施例9)。
在本发明的又一个实施方案中，在皮肤癌小鼠模型中施用免疫检查点抑制剂与RP116联合治疗后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒不仅自身发挥了优异的抗癌作用，而且与免疫治疗剂联合治疗时还能协同增强抗癌作用(实施例10)。
在本发明的又一个实施方案中，在口腔癌小鼠模型中施用RP116后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在口腔癌中也具有强大的肿瘤生长抑制作用(实施例11)。
在本发明的又一个实施方案中，在皮肤癌小鼠模型中检测RP116和野生型呼肠孤病毒以交叉方式给药(RP116→WT，或WT→RP116)时病毒的抗癌作用的增强，证实与连续给药相同类型的病毒相比，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒和野生型呼肠孤病毒以交叉方式给药时，其抗癌作用进一步增强(实施例12)。
在本发明的又一个实施方案中，在确认RP116对RP116或野生型呼肠孤病毒诱导的中和抗体的抗性后，证实根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对两种类型的中和抗体都有很强的抗性(实施例13)。
通过上述实施方案，证实了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对各种癌症，包括黑色素瘤和舌癌等罕见的癌症表现出特异的抗癌作用，而且这种抗癌作用优于野生型呼肠孤病毒。此外，修饰的呼肠孤病毒在动物模型中瘤内和静脉给药后不仅能有效抑制肿瘤生长，可根据癌症类型灵活选择给药途径，而且通过重复给药或与野生型呼肠孤病毒交叉给药，进一步增强了抗癌效果。此外，修饰的呼肠孤病毒在与免疫性抗癌剂结合时表现出更强的抗癌效果，并表现出对中和抗体的高抗性，这是抗癌病毒的弱点。因此，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒有望作为一种新的抗癌疗法，用于治疗罕见的癌症，并作为与免疫性抗癌剂的联合药物。
下面，将详细描述本发明。
本发明提供了一种修饰的呼肠孤病毒，它在对野生型呼肠孤病毒有抗性的癌症中表现出抗癌作用。修饰的呼肠孤病毒的特点是不仅具有sigma-1蛋白的抗原决定簇的缺陷，而且还包括结构蛋白如构成病毒颗粒外衣壳的lambda-2的额外序列变体。
呼肠孤病毒(Reovirus，REO病毒)是一种无包膜的二十面体病毒，拥有双链RNA片段作为其基因组。呼肠孤病毒通常从健康的人类胃肠道和呼吸系统中分离出来，被认为是一种非致病性的病毒体。呼肠孤病毒被认为是一种能够感染和杀死各种转化细胞的溶瘤病毒。因此，与其他典型的溶瘤病毒一样，该呼肠孤病毒具有副作用小的优点，因为它可以特异性地感染并诱导癌细胞死亡，而不会对正常细胞产生明显的影响。此外，在主要感染的癌细胞中增殖后，病毒可以感染周围和远处的癌细胞，从而产生广泛的抗癌效果。
然而，野生型呼肠孤病毒注入人体后，其抗癌功能可能被中和抗体削弱，而且病毒的抗癌功能可能被癌细胞的肿瘤微环境等因素所抑制。此外，仍然存在着呼肠孤病毒感染正常细胞并导致宿主异常的问题。为了解决野生型呼肠孤病毒的宿主毒性问题，本发明人开发了一种减毒呼肠孤病毒(AV)，由于野生型Sigma 1蛋白编码基因中存在一个过早的终止密码子，该病毒表达一种Sigma 1蛋白的截短形式。已发现，与野生型呼肠孤病毒相比，该减毒呼肠孤病毒的宿主毒性降低，但其抗癌效果只能保持与野生型呼肠孤病毒相当的肿瘤裂解水平。作为回应，发明人对一种修饰的呼肠孤病毒进行了研究，与野生型呼肠孤病毒相比，它对正常细胞的毒性更低，同时发挥出更强的抗癌效果。根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的特点是，与野生型呼肠孤病毒相比，对正常细胞没有毒性，同时能够更有力地感染和杀死癌细胞。
因此，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的特点是由S1
片段(SEQ ID NO:1；Sigma-1蛋白)编码的多肽缺少第251至455位氨基酸，由L2片段(SEQ ID NO:2；Lambda-2蛋白)编码的多肽的第963位Met被Val取代和/或第1265位Thr被Ile取代。换句话说，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的特点是，与野生型呼肠孤病毒和减毒呼肠孤病毒相比，在Lambda-2蛋白中包括替代突变。在本发明中，Sigma-1蛋白是一种参与病毒附着在细胞上的蛋白，对应于病毒颗粒的主要抗原决定簇。在本发明中，Lambda-2蛋白是一种外衣壳蛋白，参与呼肠孤病毒的mRNA封装。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括突变，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第227位Ile(异亮氨酸)被Val(缬氨酸)取代。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括M2片段(SEQ ID NO:3；Mu-1蛋白)所编码的多肽中的额外的突变。具体而言，修饰后的呼肠孤病毒还可包括一个或多个选自以下的突变：
(a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的第73位Glu被Asp取代；
(b)SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的第434位Asp被Asn取代；以及
(c)SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的第644位Val被Ala取代。
在本发明中，Mu-1蛋白是参与病毒渗透入宿主细胞膜的主要外衣壳蛋白。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括S4片段(SEQ ID NO:4；Sigma-3蛋白)所编码的多肽的额外的突变。具体而言，修饰的呼肠孤病毒还可包括一个或多个选自以下的突变：
(a)SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的第64位Lys被Glu取代；
(b)SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的第177位Ser被Phe
取代；
(c)SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的第229位Glu被Asp取代；以及
(d)SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的第251位His被Leu取代。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括突变，其中L1片段编码的多肽(SEQ ID NO:5；Lambda-3蛋白)的氨基酸序列中的第399位Ile被Thr取代和/或L1片段编码的多肽(SEQ ID NO:5；Lambda-3蛋白)的氨基酸序列中的第1202位Lys被Glu取代。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括突变，其中L3片段编码的多肽(SEQ ID NO:6；Lambda-1蛋白)的氨基酸序列中的第16位Gly被Val取代。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括突变，其中M3片段编码的多肽(SEQ ID NO:7；MuNS蛋白)的氨基酸序列中的第478位Ile被Leu取代和/或M3片段编码的多肽(SEQ ID NO:7；MuNS蛋白)的氨基酸序列中的第657位Thr被Ala取代。
此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒还可包括突变，其中S2片段(SEQ ID NO:8；Sigma-2蛋白)编码的多肽的氨基酸序列中的第50位Arg被Lys取代。
根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的每个基因片段的核苷酸序列和由它们编码的蛋白质的氨基酸序列列在本说明书的序列表中。
在本发明中，具有特定SEQ ID NO.的基因(核酸分子)可以包括或由特定SEQ IDNO.的核苷酸序列组成，只要保持根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的目的和功能，该核苷酸序列的变体也包括在本发明的范围内。例如，由特定的SEQ ID NO.表示的核苷酸序列的核酸分子是一个概念，其包括组成核酸分子的功能等价物，如通过删除、替换或插入修改了部分核苷酸序列，但在功能上能与核酸分子的作用相同的变体。具体来说，由特定的SEQ IDNO.表示的核酸分子可以包括与特定的SEQ ID NO.表示的核苷酸序列有70％或更多，更优选80％或更多，甚至更优选90％或更多，最优选95％或更多的序列同源性。例如，它包括具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列同一性的多核苷酸。多核苷酸的"序列同源性％"是通过比较两个优化排列的序列和比较区来确定的，相对于两个序列的优化排列(不包括增加或删除)的参考序列，比较区中的一部分多核苷酸序列可能包括增加或删除(即间隙)。
同样，具有特定SEQ ID NO.的多肽(蛋白质)可以包括或由特定SEQ ID NO.的氨基酸序列组成，只要保持根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的目的和功能，该氨基酸序列的变体就包括在本发明的范围内。例如，由特定的SEQ ID NO.表示的氨基酸序列的多肽是一个概念，包括组成多肽分子的功能等价物，如通过删除、替换或插入修改了部分氨基酸序列但在功能上能与该多肽作用相同的变体。具体来说，由特定的SEQ ID NO.表示的多肽可以包括与特定的SEQ ID NO.表示的氨基酸序列具有70％或更多，更优选80％或更多，甚至更优选90％或更多，最优选95％或更多的序列同源性。例如，多肽可以具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。多肽的"序列同一性％"是通过比较比较区中两个最佳排列的序列来确定的，其中比较区中的一部分氨基酸序列可能包括相对于两个序列的最佳排列的参考序列(没有添加或删除)的添加或删除(即间隙)。
根据本发明的修饰的呼肠孤病毒包括与野生型呼肠孤病毒相同的野生型核苷酸和氨基酸序列，除了上述的突变。然而，很明显，由于病毒的性质，在保持野生型序列的功能和特性的范围内，可以发生一些突变，如一些核苷酸或氨基酸的缺失、替换和/或插入。因此，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒除了上述的突变外，还可以包括不损害病毒功能(抗癌作用)的野生型序列的变种。根据本发明的野生型呼肠孤病毒的基因组序列在本说明书的序列列表中进行了详细描述。
根据本发明，修饰的呼肠孤病毒可以来自任何野生型呼肠孤病毒，可以是呼肠孤病毒家族的成员，可以从各种来源获得。优选的是，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒可以来自于野生型人类呼肠孤病毒。优选的是，野生型呼肠孤病毒可选自人类呼肠孤病毒1型、人类呼肠孤病毒2型和人类呼肠孤病毒3型。更优选的是，野生型呼肠孤病毒可选自人类呼肠孤病毒1型菌株Lang，人类呼肠孤病毒2型菌株Jones，以及人类呼肠孤病毒3型菌株Dearing或Abney。最优选的是，根据本发明的野生型呼肠孤病毒可以是3型呼肠孤病毒。此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒可以来自一种或多种对其他哺乳动物种属的细胞表现出趋向性的呼肠孤病毒，包括灵长类动物(黑猩猩、大猩猩、短尾猴、猴子等)、啮齿类动物(小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、兔子、豚鼠等)、狗、猫和普通家畜(牛、马、猪、羊)，但不限于此。
此外，本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中包括根据本发明的修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
在本说明书中，术语"癌症"是指不受控制的细胞生长，其特征是形成一个称为肿瘤的细胞团，它侵入周围组织，在严重的情况下，转移到身体的其他器官。在本发明中，癌症可以是实体癌或血液病癌症，可以选自包括鳞状细胞癌、神经母细胞瘤、肺癌、肺腺癌、腹膜癌、皮肤癌、眼癌、直肠癌、肛周癌、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、尿道癌、血癌、肝癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、口腔癌、舌癌、脑癌和间质肿瘤。血癌可以是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤，等等。优选地，皮肤癌可以选自鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤。优选的是，该黑色素瘤可以是转移性黑色素瘤。在本发明的一个实施方案中，该癌症可以是表达或不表达PD-L1的癌症。在本发明的另一个实施方案中，该癌症可以是具有抑癌基因(p53、Rb等)突变或RAS激活突变的癌症。更优选的是，根据本发明的癌症可以对野生型呼肠孤病毒产生抗性。
另外，在本发明中，癌症可以是对基于紫杉烷的抗癌药物有抗性的癌症。
在本发明中，"对抗癌药物的耐药性"是指在使用抗癌药物治疗癌症时，尽管最初有治疗效果，但从治疗开始就没有治疗效果或在连续治疗过程中失去治疗效果。根据WHO制定的标准，抗癌药物的一般疗效标准分为四类：(1)肿瘤完全消失，疗效持续4周以上(完全反应)；(2)肿瘤体积缩小50％以上(部分反应)；(3)肿瘤体积缩小50％以下(病情稳定)；(4)肿瘤体积增大25％以上(病情进展)。因此，根据WHO的标准，抗癌药物的耐药性是指从治疗开始就没有治疗效果，或者有最初的癌症治疗效果(上述(1)和(2))，但在持续治疗过程中癌症治疗效果丧失(上述(3)和(4))。
在本发明中，抗癌药物可以是一种基于紫衫烷的抗癌药物。更优选地，基于紫杉烷的抗癌药物可以选自：紫杉醇、拉罗他赛、卡巴他赛、多西他赛、奥他赛和特西他赛。
本发明组合物中修饰的呼肠孤病毒的含量可以根据疾病的症状、症状的发展程度和病人的情况进行适当的调整，例如，基于组合物的总重量，从0.0001到99.9重量％或从0.001到50重量％，但不限于此。上述量比是以不包括溶剂的干重为基础的。
优选的是，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒可以以1×105至1×1020TCID50(组织培养感染性剂量50％)的剂量包含在组合物中。例如，修饰的呼肠孤病毒可按1×105至1×1020、1×105至1×1019、1×105至1×1018、1×105至1×1017、1×105至1×1016、1×105至1×1015、1×105至1×1014、1×105至1×1013、1×105至1×1012、1×105至1×1011、1×105至1×1010、1×105至1×109、1×105至1×108、1×105至1×107、1×105至1×106、1×106至1×1015、1×106至1×1012、1×106至1×1010、1×107至1×1015、1×107至1×1012、或1×107至1×1010TCID50的剂量包含在组合物中，但不限于此。
根据本发明的药物组合物还可以包括合适的载体、赋形剂和稀释剂，这些都是在制备药物组合物中常用的。例如，赋形剂可以是一个或多个选自以下：稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、薄膜涂层材料和控释添加剂。
根据本发明的药物组合物可以按照常用方法配制成粉剂、颗粒剂、缓释型颗粒剂、肠溶颗粒剂、液体、滴眼剂、酏剂、乳剂、悬浮剂、烈酒、特罗凯、芳香水、柠檬水、片剂、缓释型片剂肠溶片、舌下片、硬胶囊、软胶囊、缓释型胶囊、肠溶胶囊、丸剂、酊剂、软提取物、干提取物、液体提取物、注射剂、胶囊、灌流液，或外用制剂，如膏剂、洗剂、糊剂、喷雾剂、吸入剂、贴片、无菌注射液或气雾剂。外用制剂可以有配方，例如膏药、凝胶、贴片、喷雾、软膏、膏药、洗剂、麻药、糊剂或弹力胶。
作为可包括在根据本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂，乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、槐树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油均可使用。
为了配制，可使用常用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、
增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。根据本发明的药物组合物可以按这样配制，即组合物中所包含的修饰的呼肠孤病毒在给受试者施用时是生物可利用的。
根据本发明的药物组合物是以药学有效量给药的。在本发明中，"药学有效量"是指足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量，有效剂量水平可根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物等因素以及其他医学领域众所周知的因素确定。优选地，根据本发明的药物组合物的有效剂量可以是一个剂量，在该剂量下，修饰的呼肠孤病毒的给药量为1×105至1×1020TCID50。
本发明的药物组合物可通过各种途径给受试者施用。所有的给药方法都可以预测，药物组合物可以通过例如口服给药、皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、鞘内(脊髓周围空间)注射、舌下给药、经口腔粘膜给药、直肠内插入、阴道内插入、眼部给药、耳内给药、鼻内给药、吸入、经口或鼻喷洒、经皮给药、经皮给药或类似方法。优选的是，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒可以通过直接瘤内注射或静脉给药，根据肿瘤的状况和类型选择适当的给药方法。
根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其他治疗剂联合施用，与常规治疗剂依次或同时施用，可以单剂量或多剂量施用。考虑到上面提到的所有因素，重要的是给药量能以最小的量达到最大的效果，而且没有副作用，这一点可以由本发明所涉及的技术领域的普通技术人员轻易确定。优选的是，根据本发明的药物组合物可以对有需要的受试者(如癌症患者)进行一次以上的给药。发明人通过具体实施例证实，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的抗癌效果在多次给药后进一步增强。
因此，根据本发明的组合物不仅可以作为单剂量给药给有需要的受试者，还可以给药两次以上并重复给药，直到肿瘤减少或消除。例如，根据本发明的药物组合物可以给药2至50次，2至45次，2至40次，2至35次，2至30次，2至25次，2至20次，2至15次，2至14次，2至13次，2至12次，2至11次，2至10次，2至9次，2至8次，2至7次，2至6次，2至5次，或2至4次，但这不限于这些例子。
此外，重复给药可以以1至100天的间隔进行。例如，重复给药可以以1至100天、1至90天、1至80天、1至70天、1至60天、1至50天、1至40天、1至30天、1至20天、1至15天、1至10天、1至9天、1至8天、1至7天、1至6天或1至5天的间隔进行，但这不限于这些例子。
此外，根据本发明的组合物可与野生型呼肠孤病毒共同给药。在本发明的背景下，"交叉给药"是指以固定或不确定的间隔交替给药两种或多种药物。发明人通过具体实施例证实，与连续给药相同的呼肠孤病毒相比，当根据本发明的修饰的呼肠孤病毒与野生型呼肠孤病毒共同给药时，抗癌效果增加。对根据本发明的组合物(即根据本发明的修饰的呼肠孤病毒)和野生型呼肠孤病毒共同给药的顺序没有限制。也就是说，根据本发明的组合物可以先给药，然后是野生型呼肠孤病毒，或者反之亦然。
或者，根据本发明的药物组合物除了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒外，还可以包括野生型呼肠孤病毒。优选的是，该组合物可采用修饰的呼肠孤病毒和野生型呼肠孤病毒分别配制并依次给药的形式。
在本发明中，"受试者"是指需要治疗疾病的目标，更具体地说，哺乳动物，如人类或非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
在本发明中，"给药(施用，administration)"是指通过任何适当的方式向受试者提供本发明的预定成分。
在本发明中，"预防"是指所有抑制或推迟目标疾病发病的行为，"治疗"是指所有行为，该行为中目标疾病及其相关的代谢异常通过施用根据本发明的药物组合物得到改善或有利的改变，"改善"是指所有行为，该行为中与目标疾病相关的参数，例如症状的严重程度，通过施用根据本发明的组合物得到降低。
根据本发明，药物组合物除了修饰的呼肠孤病毒外，还可包括免疫治疗性抗癌剂。免疫治疗性抗癌剂是一种通过激活免疫系统和增强特异性、记忆和适应性来发挥抗癌作用的抗癌剂。发明人通过具体的实施方案证实，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒和免疫治疗性抗癌剂联合使用时，其抗癌效果进一步增强。在本发明中，免疫治疗性抗癌剂可选自免疫检查点抑制剂、免疫细胞疗法、抗癌疫苗和抗体-药物结合物，但不限于此。
优选地，免疫治疗性抗癌剂可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点是一种在正常细胞表面表达的免疫反应调节蛋白，它能削弱过度的免疫反应，抑制有害的、无差别的自身免疫反应，以保护正常组织。然而，一些癌细胞表达免疫检查点蛋白，与免疫细胞相互作用，并使其免疫功能失活，从而中和抗癌免疫反应。免疫检查点抑制剂针对癌细胞上表达的免疫检查点蛋白，干扰它们与免疫细胞的互动，从而阻断癌细胞的免疫逃逸。
对免疫检查点抑制剂的具体类型没有限制，但优选地，它们可以选自包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、OX40抑制剂、CTLA-4抑制剂、4-1BB抑制剂、LAG-3抑制剂、B7-H4抑制剂、HVEM抑制剂、TIM4抑制剂、GAL9抑制剂、VISTA抑制剂、KIR抑制剂、TIGIT抑制剂和BTLA抑制剂的一组。优选地，根据本发明的免疫检查点抑制剂可以是针对免疫检查点蛋白的小分子、配体或大分子，更优选地，是针对免疫检查点蛋白的抗体。另外，根据本发明的免疫检查点抑制剂可以选自伊匹木单抗(ipilimumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和度伐鲁单抗(duvalumab)。
根据本发明，该组合物可以是混合物的形式，其中修饰的呼肠孤病毒和免疫检查点抑制剂被混合。
或者，根据本发明的组合物可以是一种形式，其中修饰的呼肠孤病毒和免疫检查点抑制剂各自被配制成同时或依次给药。在这种情况下，该组合物可以是用于同时或依次给药的联合给药的药物组合物，包括含有药学上有效剂量的修饰的呼肠孤病毒的第一药物组合物；和含有药学上有效剂量的免疫检查点抑制剂的第二药物组合物。此时，对于依次给药，对给药顺序没有限制，可以根据病人的情况适当调整给药方法。也就是说，如果该药物组合物是用于序贯组合治疗，该组合物可涉及先施用修饰的呼肠孤病毒("第一成分")，然后是免疫检查点抑制剂("第二成分")，相反的顺序也是可以的。根据本发明的修饰的呼肠孤病毒和免疫检查点抑制剂可以通过不同的途径给药。例如，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒可以在瘤内或静脉内给药，而免疫检查点抑制剂可以在腹膜内给药。
此外，本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其中包括根据本发明的修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。该试剂盒还可包括野生型呼肠孤病毒和/或免疫治疗性抗癌剂。该试剂盒指的是可用于癌症预防或治疗的物质或装置的组合，它可以是适合于制造、储存或施用修饰的呼肠孤病毒的任何形式，而不限制于特定的形式。因此，根据本发明的试剂盒不仅可以包括修饰的呼肠孤病毒、野生型呼肠孤病毒和免疫治疗性抗癌剂，还可以包括本领域已知的治疗特定疾病的试剂盒的任何成分，但不受限制。
此外，本发明提供了一种用于与免疫检查点抑制剂联合治疗的药物组合物，其中包括根据本发明的修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。该免疫治疗抗癌剂优选是一种免疫检查点抑制剂。
在本说明书中，术语"联合(组合，combination)疗法"是指同时、依次或单独施用治疗方案的各个组成部分的方法。联合疗法可能涉及同时或依次施用两种或更多的药物，或以固定或不确定的时间间隔交替施用，以及其他方法。虽然不限于此，但当以反应幅度、反应率、疾病进展时间或生存时间衡量的疗效大于以常规剂量施用组合疗法中的一种或其余成分所能获得的疗效时，组合疗法可被定义为提供治疗上的优势和协同效应。
根据本发明，用于联合治疗的药物组合物可以增强免疫治疗性抗癌剂的抗癌效果并维持效果。这里，"增强抗癌效果"是指所有能够最终加强免疫治疗性抗癌剂功能的效果，包括增强抗癌剂的抗癌效果，如抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤复发，以及进一步增强抗癌免疫反应或抑制癌细胞对免疫治疗性抗癌剂的抗性或耐受形成，最终增强抗癌效果。另外，"维持效果"包括这样的概念：即使在肿瘤完全消退后，对癌细胞的抗癌免疫效果仍能维持。
在本发明中，用于联合给药的药物组合物可以与免疫治疗性抗癌剂同时给药，也可以与免疫治疗性抗癌剂分开给药，或者依次给药，即使与免疫治疗性抗癌剂依次给药，也没有限制给药的顺序。但是，可以根据癌症的类型、抗癌剂的类型和病人的情况适当调整给药方法。
在本发明的整个说明书中，当说一个部分"包括"某种成分时，意味着它可以进一步包括其他成分，除非有相反的具体说明，而不是排除其他成分。在本发明的整个说明书中使用的程度术语，如"大约"、"基本上"等，在固有的制造和材料公差呈现所提及的含义时，其含义接近于或达到数值，并用于防止那些可能依赖精确或绝对数值来帮助理解本发明的无良侵权者不公平地利用本发明的公开。
在本发明的整个说明书中，包括在马库什式表达中的术语"这些的组合"是指从马库什式表达中所列成分组成的组中选出的一种或多种混合物或组合，意思是它包括从所述成分组成的组中选出的一种或多种。
下面，为了便于理解本发明，提供了优选的实施方案。然而，提供以下实施例是为了更好地理解本发明，并不打算限制本发明的范围。
实施例
实施例1.制备修饰的呼肠孤病毒
根据本发明，通过用减毒的呼肠孤病毒(AV；Br J Cancer.2011Jan 18；104(2):290-9)和野生型呼肠孤病毒共同感染对野生型呼肠孤病毒有抗性的细胞系，诱导病毒和宿主细胞之间的基因片段重配和适应，从而产生修饰的呼肠孤病毒RP116，野生型呼肠孤病毒来自韩国病原体病毒库(KBPV-VR-38)。
具体来说，在12孔板中以3×105个细胞/孔处理对野生型呼肠孤病毒有抵抗力的U-2OS细胞(KCLB，300096)，并在37℃和5％CO2培养箱中培养24小时，使细胞很好地粘附在底部。将野生型呼肠孤病毒和减毒型呼肠孤病毒AV按1:1的比例混合，用DMEM完全培养基稀释到10-5、10-6和10-7。每个稀释液在两个12孔板的每个孔中用100μl处理。病毒处理18小时后，除去孔板中的DMEM完全培养基，并在每个孔中加入1ml 1％琼脂。每天在显微镜下观察斑块，做标记，并使用1ml移液器吸头收集快速生长的视觉可识别的斑块。收集的斑块被混合，快速生长的斑块再次在U-2OS细胞中分离，并在BHK21细胞中扩增。为了表征所选择的和扩大的斑块，根据制造商的说明，用PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini试剂盒(Invitrogen，USA)从病毒中提取RNA，并使用引物对5'-ATGGATCCTCGCCTACGTKAAGAAG-3'、5'-CTGATCCTCACGTGAAACTACGC-3'和AccuPower RT-PCR PreMix试剂盒(Bioneer,Cat#.K-2057)提取S1片段(野生型病毒与AV的主要区别)，并进行了核苷酸测序。在分析的137个斑块样品中，有37个被发现含有单一的S1片段序列，所有这些斑块都有带有停止密码子的S1基因。将主要选出的37个突变株在96孔板中用人类结直肠癌细胞系Lovo和DLD1以及正常皮肤细胞HS27的连续稀释液处理，并培养3天。用WST试剂处理，分析处理过的细胞的存活率，选出最有效和最安全的突变株作为根据本发明的修饰的呼肠孤病毒。所选的修饰的呼肠孤病毒在结直肠癌细胞株LoVo和DLD1中显示出最高的细胞生长抑制能力，而人类正常细胞HS27即使用基于病毒颗粒数量的高达60000MOI的病毒处理也几乎没有细胞死亡。对选定的突变株进行了完整的核苷酸序列分析。
实施例2.修饰的呼肠孤病毒的分子生物学特性的验证
使用PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini试剂盒(Invitrogen，USA)从选定的突变株中提取RNA，通过下一代测序(NGS)获得病毒的整个核苷酸序列数据。采用GATK最佳实践标准化指南对整个核苷酸序列进行突变检测，通过与Genebank数据库中记载的呼肠孤病毒3型(Dearing株)(T3D)的数据进行比较，验证了引起多肽序列变化的突变的新颖性。
结果发现，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒的特征性氨基酸突变分布在Sigma-1蛋白(SEQ ID NO:1)的第251至455位的氨基酸序列的缺失中，这对应于病毒颗粒的主要抗原决定簇，Lambda-2蛋白(SEQ ID NO:2)的羧基端与Sigma-1蛋白，以及外衣壳的结构蛋白Mu-1(SEQ ID NO:3)和Sigma-3蛋白(SEQ ID NO:4)，相互作用。
[表1]
实施例3.修饰的呼肠孤病毒对紫杉醇耐药癌细胞生长的抑制作用
紫杉醇是一种广泛用于各种类型癌症的化疗药物，包括肺癌、卵巢癌和乳腺癌。然而，已知一些癌细胞对紫杉醇表现出抗性，导致细胞死亡效果降低。因此，验证根据本发明的修饰的呼肠孤病毒RP116对紫杉醇抗性的癌细胞是否具有抗癌作用。
本例中使用的细胞系如下：正常细胞系HS27，以及紫杉醇耐药癌细胞系Skmel28、A375和B16F10。每个细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，在96孔板中以3,000个细胞/孔的密度播种，然后在37℃和5％CO2下培养24小时。将RP116以0.008至1,000MOI(感染倍数)的浓度进行连续稀释，并对准备好的细胞进行处理，在37℃和5％的CO2下进一步培养3天。根据制造商的说明，使用WST试剂盒(DoGen,Seoul,South Korea,Cat No:EZ-3000)检测存活细胞的数量。
结果是，当紫杉醇处理正常细胞系时，与对照组相比，细胞存活率以浓度依赖的方式下降，证实了紫杉醇在细胞中的毒性。相反，在对照组和RP116处理组之间没有观察到细胞活力的明显差异，表明RP116对正常细胞没有毒性(图1A)。另一方面，在癌细胞中观察到RP116有突出的抗癌作用(图1B)。尽管紫杉醇与对照组相比，即使在100nM以上的高浓度下，细胞存活率也没有明显差异，但RP116在所有的癌细胞系中都表现出抑制癌细胞生长的作用，并观察到浓度依赖性的细胞死亡效应，证实了剂量反应关系。实验结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对正常细胞没有毒性，同时对紫杉醇耐药的癌细胞有特异的抗癌作用。
实施例4.验证修饰的呼肠孤病毒对各种癌症细胞株的生长抑制作用
接下来，确定了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒是否对各种类型的人源癌症细胞系产生抗癌作用。
人源结肠癌细胞系(LoVo、HCT116和DLD-1)、皮肤癌细胞系(A431)、胶质瘤细胞系(SNU489、U87-MG和SNU466)、乳腺癌细胞系(MCF7)、宫颈癌细胞系(SiHa、HeLa和ME-180)和肝癌细胞系(Hep3B)用于实验。每个细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，在96孔板中以3,000个细胞/孔的浓度播种，并在37℃和5％CO2下培养24小时。将RP116连续稀释到0.008至1,000MOI的浓度，对制备的细胞进行处理，并在37℃和5％的CO2下进一步培养3天。根据制造商的说明，使用WST分析试剂盒测量存活细胞的数量。使用Prism GraphPad9.1.0中的非线性回归计算IC50值。
结果是，RP116在所有的癌细胞系中都观察到了抗癌效果，没有无反应的细胞系，并且证实了浓度依赖性的癌细胞杀伤效果，验证了剂量依赖关系(图2A)。
此外，用RP116处理正常细胞系(HS27)、黑色素瘤细胞系(Skel28、A375和B16F10)、头颈癌细胞系(YD15)、肺癌细胞系(LLC1、A549)、肝癌细胞系(Huh7)和基质肿瘤细胞系(L929)，浓度从0.01到10MOI，并培养72小时。然后检查细胞杀伤率。结果，RP116在正常细胞系中没有显示出毒性，但在所有的癌细胞中表现出极好的抗癌效果(图2B)。
上述实验结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对各种癌症具有抗癌作用，包括结肠癌、皮肤癌、胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、肝癌和头颈癌。
实施例5.验证修饰的呼肠孤病毒对皮肤癌抗癌作用
在此实施例中，比较了野生型呼肠孤病毒和修饰的呼肠孤病毒RP116对皮肤癌的抗癌作用。
各种皮肤癌细胞系(B16F10、HS294T、SK-MEL-28、A375和A431细胞系)或者不处理(Mock)，或者用不同浓度的野生型呼肠孤病毒或RP116感染，然后进行CPE(病毒诱导的细胞病理学效应)分析。具体来说，将每个癌细胞系以相等的数量播种在24孔板中，用病毒处理或不处理，感染4天后，用结晶紫染色，测量存活率。随着病毒抗癌效果的增加，用结晶紫染色的存活细胞数量减少。
结果，如图3所示，当一些皮肤癌细胞系用野生型的呼肠孤病毒处理，浓度超过10MOI时，癌细胞的存活率下降；然而，RP116在0.1MOI的低浓度下对大多数癌细胞系显示出更明显的癌细胞杀伤作用，而大多数癌细胞在10MOI以上的浓度下被杀死。这些实验结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对皮肤癌的抗癌作用比野生型呼肠孤病毒强。
实施例6.验证修饰的呼肠孤病毒对口腔癌的抗癌作用
接下来，比较了野生型呼肠孤病毒和修饰的呼肠孤病毒RP116对口腔癌的抗癌作用。
各种口腔癌细胞系(YD-10B、YD15M和YD15细胞系)或者不处理(Mock)，或者用野生型呼肠孤病毒或RP116以不同浓度感染，然后进行CPE分析。如同前面的实施例，将每个癌细胞系以相等的数量播种在24孔板中，用病毒处理或不处理，感染4天后，用结晶紫对存活的细胞进行染色，测量存活率。
结果是，当用相同浓度的病毒处理时，与野生型呼肠孤病毒相比，用RP116处理的组的癌细胞存活率进一步降低(图4)。特别是，即使用100MOI的高浓度野生型呼肠孤病毒处理，也有存活的癌细胞；然而，RP116在10MOI的浓度下显示出几乎完全杀死癌细胞。这些实验结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对口腔癌的抗癌作用也比野生型呼肠孤病毒强。
实施例7.修饰的呼肠孤病毒对膀胱癌抗癌作用的验证
在此实施例中，比较了野生型呼肠孤病毒和修饰的呼肠孤病毒RP116对膀胱癌的抗癌作用。
培养各种膀胱癌细胞系(HT-1376、5637、253J和T24细胞系)，然后在96孔板中以2,000个细胞/孔的浓度播种，接着在37℃和5％CO2下培养24小时。将制备好的细胞以0.1至10,000MOI的浓度用3倍的连续稀释液处理野生型的呼肠孤病毒或RP116，然后在37℃和5％CO2下再培养3天。细胞存活率用WST检测法测量。IC50值用Prism GraphPad 9.1.0中的非线性回归法计算。
结果是，RP116在大多数膀胱癌细胞系中的IC50值都比野生型呼肠孤病毒低(图5)。这些实验结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒比野生型呼肠孤病毒对膀胱癌有更强的抗癌作用。
实施例8.验证修饰的呼肠孤病毒根据给药途径和剂量的抗癌效果
在证实了RP166对各种癌细胞类型的优良抗癌作用后，通过皮肤癌动物模型研究了RP116根据给药途径和剂量的抗癌作用。
实验中使用的动物是6周大的雌性C57BL/6小鼠，购自Nara Biotech(韩国首尔)。小鼠在动物实验室经过7天的适应期后进行实验，在此期间不限制水和饲料。为实验动物提供标准化的环境条件，保持昼夜12小时的间隔，室内温度(23±2℃)保持在一个适当的水平。将1×105个黑色素瘤细胞系B16F10细胞以1:1的比例悬浮在100μL基质胶(Corning)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，皮下注射到C57BL/6小鼠的右腹中。当肿瘤体积达到约80mm3时，RP116以1×108TCID50或1×109TCID50的剂量，在瘤内(IT)或静脉(IV)给药(图6A)。施用病毒后，每周用卡尺测量肿瘤大小2至3次，当肿瘤体积超过2,000mm3时，小鼠被安乐死。肿瘤体积用以下公式计算：体积＝长度×宽度×宽度×0.5。
对肿瘤体积随时间变化的测量显示，与未处理的对照组相比，RP116在小鼠模型中的IT和IV给药都能显著抑制肿瘤的生长，并且观察到剂量依赖性的肿瘤生长抑制效果(图6B)。此外，比较病毒给药后小鼠模型的体重，IT和IV给药组的体重都没有随时间变化，与未治疗的对照组相比也没有差异，证实了没有因给药途径或剂量而产生的毒性(图6C)。
实施例9.基于重复给药的修饰的呼肠孤病毒的抗癌作用的验证
由于在前面的例子中已经证实，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在瘤内和静脉给药中都表现出很好的抗癌效果，所以研究了修饰的呼肠孤病毒的抗癌效果随给药次数的变化。
使用与实施例8相同的小鼠肿瘤模型，当肿瘤体积达到约80mm3时，以1×109TCID50的剂量静脉注射(IV)2次(第0天，第1天)或5次(第0天，第1天，第3天，第5天，第7天)RP116，并检查肿瘤体积和小鼠生存率随时间的变化。
结果，与未治疗的对照组相比，接受RP116 2次的组和接受5次的组都明显抑制了肿瘤的生长，提高了存活率。尤其是接受RP116治疗5次的组别，与接受2次的组别相比，进一步延缓了肿瘤的生长，明显提高了生存率(图7A和7B)。结果表明，随着给药次数的增加，根据本发明的修饰型呼肠孤病毒的抗癌效果进一步增强。同时，在接受RP116的2次或5次的两组中，体重没有随时间变化，与未处理的对照组相比也没有差异，证实没有因重复给药而产生的毒性(图7C)。
实施例10.修饰的呼肠孤病毒与免疫抗癌药物协同作用的验证
在体外和体内实验中证实了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒具有优越的抗癌效果后，研究了修饰的呼肠孤病毒和一种免疫抗癌药物的协同作用。
实验分为未处理的对照组、RP116单一给药组、RP116和免疫抗癌药物共同给药组。建立类似于实施例8的小鼠肿瘤模型，当肿瘤体积达到约80mm3时，开始给予RP116和免疫性抗癌药物。首先，RP116以1×108TCID50的剂量进行瘤内给药(IT)，共2次(第0天，第1天)，共同给药组随后从第11天开始腹腔注射免疫检查点抑制剂，抗PD-L1抗体(Bioxcell，Cat#BE0101)，剂量为10mg/kg。
测量肿瘤体积和小鼠存活率随时间的变化，并通过使用T检验/F检验计算P值来确认其意义。结果是，未经处理的对照组在小鼠体内形成肿瘤后显示出持续的肿瘤生长。然而，RP116的给药明显抑制了肿瘤的生长，而抗PD-L1抗体的给药则进一步有效地阻止了肿瘤的生长(图8A)。与未处理的对照组相比，RP116单次给药组的小鼠存活率也明显提高，而在RP116和抗PD-L1抗体共同给药组中，即使在病毒给药后40天，也有超过一半的小鼠存活(图8B)。
实施例11.修饰的呼肠孤病毒在口腔癌小鼠模型中的抗肿瘤作用验证。
在前面的例子中证实了RP116在皮肤癌小鼠模型中的抗肿瘤作用后，通过建立口腔癌小鼠模型进一步验证了RP116的抗肿瘤作用。
该小鼠模型的制备方法与实施例8大致相似，只是将免疫力低下的BALB/c裸鼠模型植入口腔癌细胞系YD10B，建立口腔癌小鼠模型。当肿瘤体积达到150mm3时，将RP116直接注射到肿瘤中，并观察肿瘤体积随时间的变化。
结果是，在未经处理的对照组中，肿瘤在小鼠体内形成后继续生长，而在RP116处理组中，肿瘤生长受到抑制，与未经处理的对照组相比，肿瘤体积明显缩小(图9A)。此外，通过测量病毒给药后的体重变化，没有观察到体重随时间的变化，与未处理的对照组相比，也没有发现差异，证实RP116对小鼠无毒(图9B)。这些结果表明，根据本发明的修饰型呼肠孤病毒在口腔癌小鼠模型中具有强大的抗肿瘤作用。
实施例12.通过交叉施用野生型呼肠孤病毒和修饰的呼肠孤病毒验证抗肿瘤效果
尽管溶瘤病毒可以成为治疗癌症的有用手段，但由于长期静脉注射过程中形成中和抗体，溶瘤病毒的疗效可能会降低。在这方面，本发明人注意到，修饰的呼肠孤病毒RP116表现出与野生型呼肠孤病毒不同的抗原性，并研究了呼肠孤病毒的抗肿瘤作用是否可以通过RP116和野生型呼肠孤病毒的交叉给药来增强。
按实施例8的方法制备皮肤癌小鼠模型，当植入的皮肤癌细胞系的肿瘤体积达到50mm3以上时，静脉注射病毒4次(第0、1、7、8天)。为了准确比较，将连续使用野生型呼肠孤病毒(WT/WT)治疗的组与使用野生型呼肠孤病毒后的修饰的呼肠孤病毒(WT/RP116)治疗的组进行比较，将连续使用修饰的呼肠孤病毒(RP116/RP116)治疗的组与使用修饰的呼肠孤病毒后的野生型呼肠孤病毒(RP116/WT)进行比较。
结果是，与未经处理的对照组相比，WT/WT组的肿瘤生长明显下降，而交叉给药组(WT/RP116)的肿瘤生长进一步减少(图10A)。同样，与未经处理的对照组相比，RP116/RP116组表现出肿瘤生长的明显下降，交叉给药组(RP116/WT)表现出更有效的肿瘤生长抑制。这些结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒与野生型呼肠孤病毒交叉处理(RP116→WT或WT→RP116)，可以进一步增强呼肠孤病毒的抗肿瘤作用。
实施例13.验证对修饰的呼肠孤病毒的中和抗体的抗性
如上所述，中和抗体是抑制抗癌病毒的抗癌作用的一个主要原因。因此，为了验证根据本发明的修饰的呼肠孤病毒是否能成为有效的癌症治疗方法，确定修饰的呼肠孤病毒RP116是否对野生型呼肠孤病毒或RP116诱导的中和抗体有抵抗力。
对C57BL/6小鼠模型以1×108PFU/ml的剂量静脉注射野生型呼肠孤病毒(RC402)或修饰型呼肠孤病毒(RP116)4次(0、2、4、7天)，14天后，从每只小鼠体内分离血清，获得各病毒诱导的中和抗体。然后，将不同稀释比例的中和抗体与RC402或RP116病毒一起处理L929细胞，并对WST-1进行处理，进行细胞生存分析(图11A)。实验组划分如下：RC402病毒+RC402诱导的中和抗体处理组，RP116病毒+RC402诱导的中和抗体处理组，RC402病毒+RP116诱导的中和抗体处理组，以及RP116病毒+RP116诱导的中和抗体处理组。
结果是，对于野生型呼肠孤病毒RC402诱导的中和抗体，当稀释到729倍时，野生型病毒的中和效果降低到可以忽略的程度，而对于修饰的病毒RP116，仅稀释81倍时，中和效果就完全消失了，说明对RP116的中和能力比对野生型呼肠孤病毒低约9倍(图11B)。此外，RP116诱导的中和抗体显示，在RC402和RP116相似的243倍稀释条件下，中和效果完全消失(图11C)。上述结果表明，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒对中和抗体具有很强的抵抗力。
如上所述，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒已被证实对各种癌症，包括黑色素瘤和口腔癌等罕见癌症具有特异性抗癌作用，且抗癌效果优于野生型呼肠孤病毒。此外，在动物模型中，修饰的呼肠孤病毒不仅在瘤内给药和静脉给药过程中强烈抑制肿瘤生长，可以根据癌症类型自由选择给药途径，而且通过重复给药或与野生型呼肠孤病毒交叉给药，进一步增强了抗癌效果。此外，修饰的呼肠孤病毒与免疫性抗癌剂结合时，可发挥更强的抗癌作用，并表现出对中和抗体的高抗性，而这是抗癌病毒的一个缺点。因此，根据本发明的修饰过的呼肠孤病毒有望作为一种新的抗癌疗法和免疫抗癌剂的组合药物被利用，用于治疗罕见癌症等。
上述对本发明的描述是为了说明问题，在本发明所属技术领域具有公知常识的人很容易理解，在不改变本发明的技术概念或基本特征的情况下，可以将其修改成其他具体形式。因此，上述实施例应被理解为是示范性的，而不是在所有方面都有限制。
工业实用性
本发明涉及一种修饰的呼肠孤病毒及其用途，经证实，衍生自野生型呼肠孤病毒的新型修饰呼肠孤病毒不仅对各种癌症，包括罕见癌症具有良好的抗癌效果，而且可以增强免疫抗癌剂的效果。具体来说，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在处理各种类型的癌细胞时，包括罕见的癌症如黑色素瘤和舌癌，都能显著降低所有癌细胞系的存活率，而且证实它甚至对紫杉烷耐受的癌细胞系也有很好的抗癌作用。此外，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在黑色素瘤、膀胱癌和口腔癌小鼠模型中表现出剂量依赖性的抗癌效果，无论给药途径如何，在重复给药或与野生型呼肠孤病毒交叉给药时，抗癌效果进一步提高。特别是证实了根据本发明的修饰的呼肠孤病毒在与免疫检查点抑制剂结合时产生协同抗癌作用。因此，根据本发明的修饰的呼肠孤病毒有望作为一种新的抗癌疗法和免疫抗癌剂的组合药物被有效利用，用于治疗罕见癌症等。
<110> 百洛克株式会社
<120> 新型修饰的呼肠孤病毒及其用途
<130> MPCT21-117
<150> KR 10-2020-0180824
<151> 2020-12-22
<150> KR 10-2021-0184947
<151> 2021-12-22
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sigma-1
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1185 1190 1195 1200
Ser Thr Glu Tyr Asn Asp Arg Ser Leu Phe Cys Thr Asn Ser Ser Ser
1205 1210 1215
Pro Gln Thr Ile Ala Gly Pro Asp Lys His Ile Pro Val Glu Arg Tyr
1220 1225 1230
Asn Ile Leu Thr Asn Pro Asp Ala Pro Pro Thr Gln Ile Gln Leu Pro
1235 1240 1245
Glu Val Val Asp Leu Tyr Asn Val Val Thr Arg Tyr Ala Tyr Glu Thr
1250 1255 1260
Pro Pro Ile Thr Ala Val Val Met Gly Val Pro
1265 1270 1275
<210> 7
<211> 721
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MuNS
<400> 7
Met Ala Ser Phe Lys Gly Phe Ser Ala Asn Thr Val Pro Val Ser Lys
1 5 10 15
Ala Lys Arg Asp Ile Ser Ser Leu Ala Ala Thr Pro Gly Leu Arg Ser
20 25 30
Gln Ser Phe Thr Pro Ser Val Asp Met Ser Gln Ser Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Thr Lys Ala Ile Glu Gln Gly Ser Met Ser Ile Pro Tyr Gln His Val
50 55 60
Asn Val Pro Lys Val Asp Arg Lys Val Val Ser Leu Val Val Arg Pro
65 70 75 80
Phe Ser Ser Gly Ala Phe Ser Ile Ser Gly Val Ile Ser Pro Ala His
85 90 95
Ala Tyr Leu Leu Glu Cys Leu Pro Gln Leu Glu Gln Ala Met Ala Phe
100 105 110
Val Ala Ser Pro Glu Ser Phe Gln Ala Ser Asp Val Ala Lys Arg Phe
115 120 125
Ala Ile Lys Pro Gly Met Ser Leu Gln Asp Ala Ile Thr Ala Phe Ile
130 135 140
Asn Phe Val Ser Ala Met Leu Lys Met Thr Val Thr Arg Gln Asn Phe
145 150 155 160
Asp Val Ile Val Ala Glu Ile Glu Arg Leu Ala Ser Thr Ser Val Ser
165 170 175
Val Arg Thr Glu Glu Ala Lys Val Ala Asp Glu Glu Leu Met Leu Phe
180 185 190
Gly Leu Asp His Arg Gly Pro Gln Gln Leu Asp Val Ser Asp Ala Lys
195 200 205
Gly Ile Met Lys Ala Ala Asp Ile Gln Thr Thr His Asp Val His Leu
210 215 220
Ala Pro Gly Val Gly Asn Ile Asp Pro Glu Ile Tyr Asn Glu Gly Arg
225 230 235 240
Phe Met Phe Met Gln His Lys Pro Leu Ala Ala Asp Gln Ser Tyr Phe
245 250 255
Thr Leu Glu Thr Ala Asp Tyr Phe Lys Ile Tyr Pro Thr Tyr Asp Glu
260 265 270
His Asp Gly Arg Met Ala Asp Gln Lys Gln Ser Gly Leu Ile Leu Cys
275 280 285
Thr Lys Asp Glu Val Leu Ala Glu Gln Thr Ile Phe Lys Leu Asp Ala
290 295 300
Pro Asp Asp Lys Thr Val His Leu Leu Asp Arg Asp Asp Asp His Val
305 310 315 320
Val Ala Arg Phe Thr Lys Val Phe Ile Glu Asp Val Ala Pro Gly His
325 330 335
His Ala Ala Gln Arg Ser Gly Gln Arg Ser Val Leu Asp Asp Leu Tyr
340 345 350
Ala Asn Thr Gln Val Ile Ser Ile Thr Ser Ala Ala Leu Lys Trp Val
355 360 365
Val Lys His Gly Val Ser Asp Gly Ile Val Asn Arg Lys Asn Val Lys
370 375 380
Val Cys Val Gly Phe Asp Pro Leu Tyr Thr Leu Ser Thr His Asn Gly
385 390 395 400
Val Ser Leu Cys Ala Leu Leu Met Asp Glu Lys Leu Ser Val Leu Asn
405 410 415
Ser Ala Cys Arg Met Thr Leu Arg Ser Leu Met Lys Thr Gly Arg Asp
420 425 430
Val Asp Ala His Arg Ala Phe Gln Arg Val Leu Ser Gln Gly Tyr Thr
435 440 445
Ser Leu Met Cys Tyr Tyr His Pro Ser Arg Lys Leu Ala Tyr Gly Glu
450 455 460
Val Leu Phe Leu Glu Arg Ser Asn Asp Val Thr Asp Gly Ile Lys Leu
465 470 475 480
Gln Leu Asp Ala Ser Arg Gln Cys His Glu Cys Pro Val Leu Gln Gln
485 490 495
Lys Val Val Glu Leu Glu Lys Gln Ile Ile Met Gln Lys Ser Ile Gln
500 505 510
Ser Asp Pro Thr Pro Val Ala Leu Gln Pro Leu Leu Ser Gln Leu Arg
515 520 525
Glu Leu Ser Ser Glu Val Thr Arg Leu Gln Met Glu Leu Ser Arg Ala
530 535 540
Gln Ser Leu Asn Ala Gln Leu Glu Ala Asp Val Lys Ser Ala Gln Ser
545 550 555 560
Cys Ser Leu Asp Met Tyr Leu Arg His His Thr Cys Ile Asn Gly His
565 570 575
Ala Lys Glu Asp Glu Leu Leu Asp Ala Val Arg Val Ala Pro Asp Val
580 585 590
Arg Arg Glu Ile Met Glu Lys Arg Ser Glu Val Arg Gln Gly Trp Cys
595 600 605
Glu Arg Ile Ser Lys Glu Ala Ala Ala Lys Cys Gln Thr Val Ile Asp
610 615 620
Asp Leu Thr Leu Met Asn Gly Lys Gln Ala Gln Glu Ile Thr Glu Leu
625 630 635 640
Arg Asp Ser Ala Glu Lys Tyr Glu Lys Gln Ile Ala Glu Leu Val Ser
645 650 655
Thr Ile Thr Gln Asn Gln Ile Thr Tyr Gln Gln Glu Leu Gln Ala Leu
660 665 670
Val Ala Lys Asn Val Glu Leu Asp Ala Leu Asn Gln Arg Gln Ala Lys
675 680 685
Ser Leu Arg Ile Thr Pro Ser Leu Leu Ser Ala Thr Pro Xaa Asp Ser
690 695 700
Xaa Xaa Gly Val Ala Asp Leu Ile Asp Phe Ser Val Pro Thr Asp Glu
705 710 715 720
Leu
<210> 8
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sigma-2
<400> 8
Met Ala Arg Ala Ala Phe Leu Phe Lys Thr Val Gly Phe Gly Gly Leu
1 5 10 15
Gln Asn Val Pro Ile Asn Asp Glu Leu Ser Ser His Leu Leu Arg Ala
20 25 30
Gly Asn Ser Pro Trp Gln Leu Thr Gln Phe Leu Asp Trp Ile Ser Leu
35 40 45
Gly Arg Gly Leu Ala Thr Ser Ala Leu Val Pro Thr Ala Gly Ser Arg
50 55 60
Tyr Tyr Gln Met Ser Cys Leu Leu Ser Gly Thr Leu Gln Ile Pro Phe
65 70 75 80
Arg Pro Asn His Arg Trp Gly Asp Ile Arg Phe Leu Arg Leu Val Trp
85 90 95
Ser Ala Pro Thr Leu Asp Gly Leu Val Val Ala Pro Pro Gln Val Leu
100 105 110
Ala Gln Pro Ala Leu Gln Ala Gln Ala Asp Arg Val Tyr Asp Cys Asp
115 120 125
Asp Tyr Pro Phe Leu Ala Arg Asp Pro Arg Phe Lys His Arg Val Tyr
130 135 140
Gln Gln Leu Ser Ala Val Thr Leu Leu Asn Leu Thr Gly Phe Gly Pro
145 150 155 160
Ile Ser Tyr Val Arg Val Asp Glu Asp Met Trp Ser Gly Asp Val Asn
165 170 175
Gln Leu Leu Met Asn Tyr Phe Gly His Thr Phe Ala Glu Ile Ala Tyr
180 185 190
Thr Leu Cys Gln Ala Ser Ala Asn Arg Pro Trp Glu Tyr Asp Gly Thr
195 200 205
Tyr Ala Arg Met Thr Gln Ile Val Leu Ser Leu Phe Trp Leu Ser Tyr
210 215 220
Val Gly Val Ile His Gln Gln Asn Thr Tyr Arg Thr Phe Tyr Phe Gln
225 230 235 240
Cys Asn Arg Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Trp Ile Leu Ser Cys Ser
245 250 255
Leu Asn His Ser Ala Gln Ile Arg Pro Gly Asn Arg Ser Leu Phe Val
260 265 270
Met Pro Thr Ser Pro Asp Trp Asn Met Asp Val Asn Leu Ile Leu Ser
275 280 285
Ser Thr Leu Thr Gly Cys Leu Cys Ser Gly Ser Gln Leu Pro Leu Ile
290 295 300
Asp Asn Asn Ser Val Pro Ala Val Ser Arg Asn Ile His Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Arg Ala Gly Asn Gln Leu His Gly Phe Gln Val Arg Arg Met Val
325 330 335
Thr Glu Phe Cys Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gly Val Met Thr Gln Ala
340 345 350
Gln Gln Asn Gln Val Glu Ala Leu Ala Asp Gln Thr Gln Gln Phe Lys
355 360 365
Arg Asp Lys Leu Glu Thr Trp Ala Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Asn Gln
370 375 380
Ala His Pro Asn Ser Thr Met Phe Arg Thr Lys Pro Phe Thr Asn Ala
385 390 395 400
Gln Trp Gly Arg Gly Asn Thr Gly Ala Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ala
405 410 415
Leu Ile
<210> 9
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 片段
<400> 9
gctattggtc ggatggatcc tcgcctacgt gaagaagtag tacggctgat aatcgcatta 60
acgagtgata atggagtatc actgtcaaaa gggcttgaat caagggtctc ggcgctcgag 120
aagacgtctc aaatacactc tgatactatc ctccggatca cccagggact cgatgatgca 180
aacaaacgaa tcatcgctct tgagcaaagt cgggatgact tggttgcatc agtcagtgat 240
gctcaacttg caatctccag attggaaagc tctatcggag ccctccaaac agttgtcaat 300
ggacttgatt cgagtgttac ccagttgggt gctcgagtgg gacaacttga gacaggactt 360
gcagagctac gcgttgatca cgacaatctc gttgcgagag tggatactgc agaacgtaac 420
attggatcat tgaccactga gctatcaact ctgacgttac gagtaacatc catacaagcg 480
gatttcgaat ctaggatatc cacattagag cgcacggcgg tcactagcgc gggagctccc 540
ctctcaatcc gtaataaccg tatgaccatg ggattaaatg atggactcay gttgtcaggg 600
aataatctcg ccatccgatt gccaggaaat acgggtctga atattcaaaa tggtggactt 660
cagtttcgat ttaatactga tcaattccag atagttaata ataacttgac tctcaagacg 720
actgtgtttg attctatcaa ctcaaggaba ggcgcaaytg agcaaagtkm cgtggcgtcg 780
gcagtgactc ccttgagatt aaacagtagc acgaaggtgc tggatatgct aatagacagt 840
tcaacacttg aaattaattc tagtggacag ctaactgtta gatcgacatc cccgaatttg 900
aggtatccga tagctgatgt tagcggcggt atcggaatga gtccaaatta taggtttagg 960
cagagcatgt ggataggaat tgtctcctat tctggtagtg ggctgaattg gagggtacag 1020
gtgaactccg acatttttat tgtagatgat tacatacata tatgtcttcc agcttttgac 1080
ggtttctcta tagctgacgg tggagatcta tcgttgaact ttgttaccgg attgttacca 1140
ccgttactta caggagacac tgagcccgct tttcataatg acgtggtcac atatggagca 1200
cagactgtag ctatagggtt gtcgtcgggt ggtgcgcctc agtatatgag taagaatctg 1260
tgggtggagc agtggcagga tggagtactt cggttacgtg ttgagggggg tggctcaatt 1320
acgcactcaa acagtaagtg gcctgccatg accgtttcgt acccgcgtag tttcacgtga 1380
ggatcagacc accccgcggc actggggcat ttcatc 1416
<210> 10
<211> 3916
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L2 片段
<400> 10
gctaaaaggc gcgatggcga acgtttgggg ggtgagactt gcagactcgt tatcttcacc 60
cactattgag acacgaacgc gtcagtatac cttacacgat ctttgctcag acctagatgc 120
taatccgggg agggaaccgt ggaaacctct gcgtaatcag cgtactaata atattgtggc 180
tgtgcaatta ttcagaccat tgcagggttt agttttagat acccagcttt atggatttcc 240
aggagcattt gatgactggg agcgattcat gagagagaag ctgcgtgtgc taaagtatga 300
agtattgcgc atctatccaa tcagcaacta tagcaatgaa catgtcaacg tcttcgtggc 360
caatgctttg gtgggcgctt tcctgtcgaa tcaagctttc tatgacctgc taccgttgtt 420
gataattaat gacactatga ttggtgatct acttggcacg ggggcatcgc tatcacagtt 480
ctttcaatct catggagatg tgctggaagt cgcagctggt cgtaagtatc tgcagatgga 540
aaactactcc aacgatgacg atgatcctcc attatttgcg aaagacctgt cagattatgc 600
taaagcattc tacagtgaca catatgaagt gttggacagg ttcttttgga cgcatgactc 660
ttcagcgggg gtcttagtgc attatgataa gccaacgaat ggtcatcact atctgctggg 720
tactttgact cagatggtca gtgcacctcc ttatattatt aacgctactg acgcaatgtt 780
gcttgaatcc tgtctagaac agttctcagc taatgtgcgt gcgagacctg cgcaacccgt 840
tacacgctta gaccaatgct atcatttaag atggggagca caatatgtag gagaagattc 900
actgacatat cggttggggg tgttatcctt gctggctacc aatggatatc aattagctag 960
accgattcca agacagttga cgaatcgatg gttgtcgagc tttgtgagtc aaattatgtc 1020
tgacggcgtc aacgagactc cactgtggcc ccaagaaagg tatgtgcaga tcgcttatga 1080
ttcaccatcc gttgttgatg gggctacgca atatggctat gtcaggaaga atcaactcag 1140
actcggcatg agaatatcgg cgctgcaatc gctgagtgat acgccctcgc cggtacagtg 1200
gcttccacaa tacaccatcg accaggcagc gatggacgaa ggcgatctga tggttagtcg 1260
gcttacgcaa ctcccgttac gtcctgatta tggtaatatc tgggtcggcg atgcgctatc 1320
ctattatgtg gactacaatc ggagtcatcg agtcgtgctt tcatcggaac ttcctcagct 1380
tccggacaca tattttgatg gcgatgaaca gtatgggcgc agcctgttct cactagctcg 1440
taagattggt gaccgctcgt tagtgaaaga tacggctgtc ttgaagcacg cttaccaagc 1500
catcgatcca aatactggta aggagtatct gagatctggg caatctgtcg catattttgg 1560
tgcatcagcg ggtcattctg gtgccgacca gccgttagtc atagagccct ggattcaagg 1620
gaaaatcagt ggtgtgccgc caccctcctc agtgcgacag ttcggctatg atgttgcccg 1680
tggcgcgatc gtcgatctgg cgagaccatt tccttctgga gattatcaat ttgtctattc 1740
ggatgttgac caggtggtcg atggccatga cgatctgagt atatcatctg gactggtgga 1800
gagccttttg tcttcatgca tgcacgccac agcacccggg ggctcatttg ttgttaagat 1860
aaattttccg actagacccg tatggcacta catcgaacag aagatcttgc ccaatattac 1920
gtcatacatg ttgatcaagc ctttcgtcac caacaacgtc gaattgttct tcgtcgcttt 1980
cggtgtgcat caacactcat cacttacttg gacatctgga gtgtacttct tcttggtgga 2040
ccatttttat cgttatgaga ctttatctac gatctcacga caattgccgt cttttgggta 2100
tgttgatgat gggtcttccg tgactggtat cgagacaatt agtattgaga accctggctt 2160
ctcgaatatg acccaggccg ctcgcattgg tatctcagga ttgtgtgcta atgtaggtaa 2220
cgcgcgtaag tccattgcca tttacgaatc ccatggggcc agagtattaa ctatcacatc 2280
aaggagatct ccggcatcag ctagaagaaa gtctaggttg cgatatttgc cattaataga 2340
ccctaggtcg ttagaggtac aggcgcgcac tattctgcca gctgatccag tgttatttga 2400
aaacgtgagc ggagcgtcac cccatgtttg tctgacaatg atgtacaact tcgaagtgtc 2460
gtcagcggta tatgatggag acgttgtgct agatcttggg acgggaccag aggctaaaat 2520
ccttgaactg atacccgcaa cctctccagt cacatgcgtg gacatacggc ctacagcgca 2580
gcctagtgga tgttggaacg ttcgtaccac gttccttgag ttagattatt tgagcgatgg 2640
atggatcact ggggtgcgtg gggacatagt tacttgtatg ttatctttgg gggccgctgc 2700
cgctggaaaa tcaatgactt ttgacgctgc gtttcagcaa ttaatcaaag tattatccaa 2760
gagtacggct aatgttgtgc tggtgcaggt taactgccct acagacgtgg tgaggagcat 2820
taagggctac ctagagatag attcgactaa caagaggtat aggttcccca aatttggtcg 2880
agacgagccg tactctgaca tggatgcgct ggagaaaata tgtcgtaccg cctggccaaa 2940
ctgctcaatt acctgggttc cattgtcata cgacttgcgg tggactagac tggcattatt 3000
agagtccacg acattgagta gcgcgtcgat tagaattgct gagctgatgt ataaatacat 3060
gcctattatg aggattgata ttcatggact acccatggaa aagcgaggta acttcatagt 3120
ggggcagaac tgctcattag taatccctgg ttttaatgcg caggatgtct ttaactgtta 3180
tttcaattcc gccctcgctt tctcgactga agatgtcaat gctgcgatga ttccccaagt 3240
gtctgcgcag tttgatgcga ctaagggtga gtggacgttg gatatggtct tctccgacgc 3300
aggaatctat accatgcagg ctctagtggg atctaatgct aatccagtct ctttgggttc 3360
ctttgtagtt gattctccag atgtagatat aactgacgct tggccagctc agttagactt 3420
tacgatcgcg ggaactgatg tcgatataac agttaatcct tattaccgtc tgatgacctt 3480
tgtaaggatc gatggacagt ggcagattgc caatccagac aaatttcaat tcttttcgtc 3540
ggcgtctggg acgttagtga tgaacgtcaa attagatatc gcagataaat atctactata 3600
ctatatacga gatgtccagt ctcgagatgt tggcttttac attcagcatc cacttcaact 3660
tttgaatacg atcacattgc caaccaacga ggaccttttt ctgagcgcac ctgacatgcg 3720
agagtgggca gttaaggaaa gcggtaacac gatatgtata ctcaatagtc aagggtttgt 3780
gctacctcaa gattgggatg tgttaacaga taccataagt tggtccccat cgatacccac 3840
atacattgtg ccaccgggtg attatacctt gactcctctg taactcactg tccctcgtga 3900
gcgcgcctaa ttcatc 3916
<210> 11
<211> 2203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M2 片段
<400> 11
gctaatctgc tgaccgttac tctgcaaaga tggggaacgc ttcctctatc gttcagacga 60
tcaacgtcac tggagatggc aatgtattta aaccatcagc tgaaacttca tctaccgctg 120
taccatcgtt aagcttatca cctggaatgc tgaatcccgg aggggtacca tggattgctg 180
ttggagatga gacatctgtg acttcaccag gcgcattacg tcgaatgacg tcaaaggaca 240
tcccggaaac ggcaataatc aacacagaca attcatcagg cgccgtgcca agcgaatcag 300
ccttggtgcc ctacatcgat gagccgctgg tagtggttac agagcatgct attaccaact 360
tcaccaaagc tgagatggca cttgaawtca atcgtgagtt ccttgacaag atgcgtgtgc 420
tgtcagtgtc accaaaatat tcggatcttc tgacctatgt tgactgctac gtcggtgtgt 480
ctgctcgtca ggctttaaac aattttcaga aacaagtgcc tgtgattaca cctactaggc 540
agacgatgta tgtcgactcg atacaagcgg ccttgaaagc tttagaaaag tgggagattg 600
atctgagagt ggctcaaacg ttgctgccta cgaacgttcc gattggagaa gtctcttgtc 660
caatgcagtc ggtagtgaaa ctgctggatg atcagctgcc agatgacagc ctgatacgga 720
ggtatcccaa ggaagccgcc gtcgctttgg ctaaacgaaa cgggggaata caatggatgg 780
acgtatcaga aggcaccgtg atgaacgagg ctgtcaacgc tgttgcagct agtgcactgg 840
caccttcagc atcagcccca cccttagaag agaagtcaaa gttaaccgaa caagcgatgg 900
atctcgtgac cgcggctgag cctgagataa ttgcctcact cgygccagtt cccgcacccg 960
tgtttgccat aycacctaaa ccagcagatt ataatgtgcg tactctgagg atcgacgagg 1020
ccacttggct gcgaatgatt ccaaaatcaa tgaacacacc ttttcaaatc caggtgactg 1080
ataacacagg aactaattgg catctcaatt tgaggggggg gactcgtgta gtgaatctgg 1140
accaaatcgc tccgatgcgg tttgyattag atctaggggg aaagagttat aaagagacga 1200
gctgggatcc aaacggcaag aaggtcggat tcatcgtttt tcaatcgaag ataccattcg 1260
aactttggac tgctgcttca cagatcggtc aagccacggt ggttaactat gtccaactat 1320
acgctgaaga cagctcattt accgcgcagt ctatcattgc tactacctct ttggcttata 1380
actatgagcc tgagcagttg aataagactg accctgagat gaattattat cttttggcga 1440
cctttataga ctcagccgct ataacgccaa cgaatatgac acagcctgat gtttgggatg 1500
ccttgctgac gatgtcccca ctatcagctg gcgaggtgac agtgaagggt gcggtagtga 1560
gtgaagtagt ccctgcagac ttgataggta gctacactcc agaatcccta aacgcctcac 1620
ttccgaatga tgctgctaga tgcatgatcg atagagcttc gaagatagcc gaagcaatca 1680
agattgatga tgatgctgga ccagatgaat attccccaaa ctctgtacca attcaaggtc 1740
agcttgctat ctcgcaactc gaaactggat atggtgtgcg aatattcaac cctaaaggga 1800
tcctttctaa aattgcatct agggcaatgc aggctttcat tggtgacccg agcacaatca 1860
tcacgcaggc ggcgccagtg ttatcagaca agaataattg gattgcattg gcacagggag 1920
tgaaaactag tctgcgtact aaaagtctat cagcgggagt gaagactgca gtgagtaagc 1980
tgagctcatc tgagtctatc cagaattgga ctcaaggatt cttggataaa gtgtcagcgc 2040
attttccagc accaaagccc gattgtccga ctagcggaga tagtggtgaa tcgtctaatc 2100
gccgagtgaa gcgcgactca tacgcaggag tggtcaaacg tgggtacaca cgttaggccg 2160
ctcgccctgg tgacgcgggg ttaagggatg caggcaaatc atc 2203
<210> 12
<211> 1196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S4 片段
<400> 12
gctatttttg cctcttccca gacgttgtcg caatggaggt gtgcttgccc aacggtcatc 60
aggtcgtgga cttgattaac aacgcttttg aaggtcgtgt atcaatctac agcgcgcaag 120
agggatggga caaaacaatc tcagcacagc cagatatgat ggtatgtggt ggcgccgtcg 180
tttgcatgca ttgtctaggt gttgttggat ctctacaacg caagctgaag catttgcctc 240
accatagatg taatcaacag atccgtcatc aggattacgt cgatgtacag ttcgcagacc 300
gtgttactgc tcactggaag cggggtatgc tgtccttcgt tgcgcagatg cacgagatga 360
tgaatgacgt gtcgccagat gacctggatc gtgtgcgtac tgagggaggt tcactagtgg 420
agctgaacyg gcttcaggtt gacccaaatt caatgtttag atcaatacac tcaagttgga 480
cagatccttt gcaggtggtg gacgaccttg acactaagct ggatcagtac tggacagcct 540
taaacctgat gatcgactca tccgacttga tacccaactt tatgatgaga gacccatcac 600
acgcgttcaa tggtgtgaaa ctggrgggag atgctcgtca aacccaattc tccaggactt 660
ttgattcgag atcgagtttg gaatggggtg tgatggttta tgattactct gagctggagc 720
atgatccatc gaagggccgt gcttacagaa aggaattggt gacgccagct cgagatttcg 780
gtcactttgg attatcccat tattctaggg cgactacccc aatccttgga aagatgccgg 840
ccgtattctc aggaatgttg actgggaact gtaaaatgta tccattcatt aaaggaacgg 900
ctaagctgaa gacagtgcgc aagctagtgg aggcagtcaa tcatgcttgg ggtgtcgaga 960
agattagata tgctcttggg ccaggtggca tgacgggatg gtacaatagg actatgcaac 1020
aggcccccat tgtgctaact cctgctgctc tcacaatgtt cccagatacc atcaagtttg 1080
gggatttgaa ttrtccagtg aygattggcg atccgatgat tcttggctaa acacccccat 1140
cttcacagcg ccgggcttga ccaacctggt gtgacgtggg acaggcttca ttcatc 1196
<210> 13
<211> 3860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 片段
<400> 13
gctacacgtt ccacttccac gacaatgtca tccatgatac tgactcagtt tggaccgttc 60
attgagagca tttcaggtat cactgatcaa tcgaatgacg tgtttgaaga tgcagcaaaa 120
gcattctcta tgtttactcg cagcgatgtc tacaaggcgc tggatgaaat acctttctct 180
gatgatgcga tgcttccaat ccctccaact atatatacga aaccatctca cgattcatat 240
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c 3901
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<210> 19
<211> 3860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型呼肠孤病毒_L1
<400> 19
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ctcgccctgg tgacgcgggg ttaagggatg caggcaaatc atc 2203
<210> 24
<211> 2241
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型呼肠孤病毒_M3
<400> 24
gctaaagtga ccgtggtcat ggcttcattc aagggattct ccgccaacac tgttccagtt 60
tctaaggcca agcgtgacat atcatctctt gccgctactc ctggacttcg ttcacaatcc 120
ttcactccgt ctgtggatat gtctcaatcg cgtgaattcc tcacaaaggc aattgagcaa 180
gggtccatgt ctatacctta tcagcatgtg aatgtaccga aagttgatcg taaagttgtt 240
agcctggtag tgcgaccttt ctcttcaggt gctttctcta tctctggagt gatttcgcca 300
gcccatgcct atctactaga gtgtctaccc cagcttgagc aggcgatggc ttttgttgct 360
tcacctgagt ctttccaggc ttccgacgtc gcgaagcgct ttgccataaa gccaggtatg 420
agcctccagg atgccatcac tgcctttatt aactttgtgt ccgcgatgct gaaaatgacg 480
gtgactcgtc aaaactttga cgttattgtg gctgagatcg agaggcttgc ttcaaccagc 540
gtgtccgtca ggactgaaga agcgaaggtt gctgatgagg agctaatgct attcgggtta 600
gatcatagag ggccacagca gctggatgtt tctgacgcta aagggataat gaaggctgct 660
gatattcaga caactcatga tgtccatttg gcaccaggcg ttggtaatat tgatcctgaa 720
atctataacg aggggcggtt catgttcatg cagcacaagc cacttgcggc ggatcaatcg 780
tatttcacct tggagactgc ggattatttc aagatttatc caacatacga tgaacatgat 840
ggcaggatgg ctgaccaaaa gcagtcggga ttgatactgt gtactaagga cgaggtattg 900
gctgagcaaa ctatatttaa actggacgcc cctgatgaca agactgttca tctgttggat 960
cgcgatgacg accacgttgt tgccagattt actaaggtat ttatagagga cgtggctccc 1020
gggcatcatg ctgctcaaag atcgggacaa cgctctgtgc ttgatgacct atatgcgaat 1080
acgcaagtga tttccattac ttctgctgct ttaaagtggg tggtcaagca cggcgtatct 1140
gatggaatcg tgaacaggaa gaatgtcaaa gtgtgtgttg gttttgaccc cctgtacacc 1200
ttgtctacac ataacggggt gtccttatgt gccctgctga tggacgaaaa actctctgtg 1260
ctgaacagtg cgtgtcgtat gacgttacgc tcactcatga agaccggacg cgacgttgat 1320
gcacacagag cttttcagcg agtcctctct caaggataca catcgctaat gtgctactat 1380
catccttcac ggaagttggc atatggtgag gtgctctttc tagaacgatc caatgacgtg 1440
acagatggga tcaagcttca gttggacgca tctagacagt gtcatgaatg tcctgtgttg 1500
cagcagaaag tggttgagtt agagaaacag attattatgc agaagtcaat ccagtcagac 1560
cctaccccag tggcgctgca accattgttg tctcagttgc gtgagttgtc tagtgaagtt 1620
actaggctac agatggagtt gagtcgagct cagtccctga atgctcagtt ggaggcggat 1680
gtcaagtcag ctcaatcatg tagcttggat atgtatctga gacaccacac ttgcattaat 1740
ggtcatgcta aagaagatga attgcttgac gctgtgcgtg tcgcgccgga tgtgaggaga 1800
gaaatcatgg aaaagaggag tgaagtgaga caaggttggt gcgaacgtat ttctaaggaa 1860
gcagctgcca aatgtcaaac tgttattgat gacctgactt tgatgaatgg aaagcaagca 1920
caagagataa cagaattacg tgattcggct gaaaaatatg agaaacagat tgcagagctg 1980
gtgagtacca tcacccaaaa ccagataacg tatcagcaag agctacaagc cttggtagcg 2040
aaaaatgtgg aattggacgc gttgaatcag cgtcaggcta agtctttgcg tattactccc 2100
tctcttctat cagccactcc tabcgattca gytgmtggtg ttgctgactt aattgatttc 2160
tctgttccaa ctgatgagtt gtaaataatc cgtgatgcag tgttgcccta atcccttaag 2220
ccttcccgac ccccattcat c 2241
<210> 25
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型呼肠孤病毒_S1
<400> 25
gctattggtc ggatggatcc tcgcctacgt gaagaagtag tacggctgat aatcgcatta 60
acgagtgata atggagtatc actgtcaaaa gggcttgaat caagggtctc ggcgctcgag 120
aagacgtctc aaatacactc tgatactatc ctccggatca cccagggact cgatgatgca 180
aacaaacgaa tcatcgctct tgagcaaagt cgggatgact tggttgcatc agtcagtgat 240
gctcaacttg caatctccag attggaaagc tctatcggag ccctccaaac agttgtcaat 300
ggacttgatt cgagtgttac ccagttgggt gctcgagtgg gacaacttga gacaggactt 360
gcagagctac gcgttgatca cgacaatctc gttgcgagag tggatactgc agaacgtaac 420
attggatcat tgaccactga gctatcaact ctgacgttac gagtaacatc catacaagcg 480
gatttcgaat ctaggatatc cacattagag cgcacggcgg tcactagcgc gggagctccc 540
ctctcaatcc gtaataaccg tatgaccatg ggattaaatg atggactcay gttgtcaggg 600
aataatctcg ccatccgatt gccaggaaat acgggtctga atattcaaaa tggtggactt 660
cagtttcgat ttaatactga tcaattccag atagttaata ataacttgac tctcaagacg 720
actgtgtttg attctatcaa ctcaaggaba ggcgcaaytg agcaaagtkm cgtggcgtcg 780
gcagtgactc ccttgagatt aaacagtagc acgaaggtgc tggatatgct aatagacagt 840
tcaacacttg aaattaattc tagtggacag ctaactgtta gatcgacatc cccgaatttg 900
aggtatccga tagctgatgt tagcggcggt atcggaatga gtccaaatta taggtttagg 960
cagagcatgt ggataggaat tgtctcctat tctggtagtg ggctgaattg gagggtacag 1020
gtgaactccg acatttttat tgtagatgat tacatacata tatgtcttcc agcttttgac 1080
ggtttctcta tagctgacgg tggagatcta tcgttgaact ttgttaccgg attgttacca 1140
ccgttactta caggagacac tgagcccgct tttcataatg acgtggtcac atatggagca 1200
cagactgtag ctatagggtt gtcgtcgggt ggtgcgcctc agtatatgag taagaatctg 1260
tgggtggagc agtggcagga tggagtactt cggttacgtg ttgagggggg tggctcaatt 1320
acgcactcaa acagtaagtg gcctgccatg accgtttcgt acccgcgtag tttcacgtga 1380
ggatcagacc accccgcggc actggggcat ttcatc 1416
<210> 26
<211> 1331
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型呼肠孤病毒_S2
<400> 26
gctattcgct ggtcagttat ggctcgcgct gcgttcctat tcaagactgt tgggtttggt 60
ggtctgcaaa atgtgccaat taacgacgaa ctatcttcac atctactccg agctggtaat 120
tcaccatggc agttaacaca gtttttagac tggataagcc ttgggagggg tttagctaca 180
tcggctctcg ttccgacggc tgggtcaaga tactatcaaa tgagttgcct tctaagtggc 240
actctccaga ttccgttccg tcctaaccac cgatggggag acattaggtt cttacgctta 300
gtgtggtcag ctcctactct cgatggatta gtcgtagctc caccacaagt tttggctcag 360
cccgctttgc aagcacaggc agatcgagtg tacgactgcg atgattatcc atttctagcg 420
cgtgatccaa gattcaaaca tcgggtgtat cagcaattga gtgctgtaac tctacttaac 480
ttgacaggtt ttggcccgat ttcctacgtt cgagtggatg aagatatgtg gagtggagat 540
gtgaaccagc ttctcatgaa ctatttcggg cacacgtttg cagagattgc atacacattg 600
tgtcaagcct cggctaatag gccttgggaa tatgacggta catatgctag gatgactcag 660
attgtgttat ccttgttctg gctatcgtat gtcggtgtaa ttcatcagca gaatacgtat 720
cggacattct attttcagtg taatcggcga ggtgacgccg ctgaggtgtg gattctttct 780
tgttcgttga accattccgc acaaattaga ccgggtaatc gtagcttatt cgttatgcca 840
actagcccag attggaacat ggacgtcaat ttgatcctga gttcaacgtt gacggggtgt 900
ttgtgttcgg gttcacagct gccactgatt gacaataatt cagtacctgc agtgtcgcgt 960
aacatccatg gctggactgg tagagctggt aaccaattgc atgggttcca ggtgagacga 1020
atggtgactg aattttgtga caggttgaga cgcgatggtg tcatgaccca agctcagcag 1080
aatcaagttg aagcgttggc agatcagact caacagttta agagggacaa gctcgaaacg 1140
tgggcgagag aagacgatca atataatcag gctcatccca actccacaat gttccgtacg 1200
aaaccattta cgaatgcgca atggggacga ggtaatacgg gggcgactag tgccgcgatt 1260
gcagccctta tctgatcgtc ttggagtgag ggggtccccc cacacccctc acgactgacc 1320
acacattcat c 1331
<210> 27
<211> 1198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型呼肠孤病毒_S3
<400> 27
gctaaagtca cgcctgtcgt cgtcactatg gcttcctcac tcagagctgc gatctccaag 60
atcaagaggg atgacgtcgg tcagcaagtt tgtcctaatt atgtcatgct gcggtcctct 120
gtcacaacaa aggtggtacg aaatgtggtt gagtatcaaa ttcgtacggg cggattcttt 180
tcgtgcttag ctatgctaag gccactccag tacgctaagc gtgagcgttt gcttggtcag 240
aggaatctgg aacgtatatc gactagggat atccttcaga ctcgtgattt acactcacta 300
tgtatgccaa ctcctgatgc gccaatgtct aatcatcaag catccaccat gagagagctg 360
atttgcagtt acttcaaggt cgatcatgcg gatgggttga aatatatacc catggatgag 420
agatactctc cgtcatcact tgccagattg tttaccatgg gcatggctgg gctgcacatt 480
accactgagc catcttataa gcgtgttccg attatgcact tagctgcgga cttggactgt 540
atgacgctgg ctctacctta catgattacg cttgatggtg atactgtggt tcctgtcgct 600
ccaacactgt cagcggaaca gcttctggac gacggactca aaggattagc atgcatggat 660
atctcctatg gatgtgaggt ggacgcgaat agccggccgg ctggtgatca gagtatggac 720
tcttcacgct gcatcaacga gttgtattgc gaggagacag cagaagccat ctgtgtgctt 780
aagacatgcc ttgtgttaaa ttgcatgcag tttaaacttg agatggatga cctagcacat 840
aacgctgctg agctggacaa gatacagatg atgataccct tcagtgagcg tgtttttagg 900
atggcctcgt cctttgcgac tattgatgcc cagtgtttta ggttttgcgt gatgatgaag 960
gataaaaatc tgaaaataga tatgcgtgaa acgacgagac tgtggactcg ttcagcatca 1020
gatgattctg tggccacgtc atctttaagt atttccctgg accggggtcg atgggtggcg 1080
gctgacgcca gtgatgctag actgctggtt tttccgattc gcgtgtaatg ggtgagtgag 1140
ctgatgtggt cgccaagaca tgtgccggtg tcttggtggt gggtgacgcc taatcatc 1198
<210> 28
<211> 1196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型呼肠孤病毒_S4
<400> 28
gctatttttg cctcttccca gacgttgtcg caatggaggt gtgcttgccc aacggtcatc 60
aggtcgtgga cttgattaac aacgcttttg aaggtcgtgt atcaatctac agcgcgcaag 120
agggatggga caaaacaatc tcagcacagc cagatatgat ggtatgtggt ggcgccgtcg 180
tttgcatgca ttgtctaggt gttgttggat ctctacaacg caagctgaag catttgcctc 240
accatagatg taatcaacag atccgtcatc aggattacgt cgatgtacag ttcgcagacc 300
gtgttactgc tcactggaag cggggtatgc tgtccttcgt tgcgcagatg cacgagatga 360
tgaatgacgt gtcgccagat gacctggatc gtgtgcgtac tgagggaggt tcactagtgg 420
agctgaacyg gcttcaggtt gacccaaatt caatgtttag atcaatacac tcaagttgga 480
cagatccttt gcaggtggtg gacgaccttg acactaagct ggatcagtac tggacagcct 540
taaacctgat gatcgactca tccgacttga tacccaactt tatgatgaga gacccatcac 600
acgcgttcaa tggtgtgaaa ctggrgggag atgctcgtca aacccaattc tccaggactt 660
ttgattcgag atcgagtttg gaatggggtg tgatggttta tgattactct gagctggagc 720
atgatccatc gaagggccgt gcttacagaa aggaattggt gacgccagct cgagatttcg 780
gtcactttgg attatcccat tattctaggg cgactacccc aatccttgga aagatgccgg 840
ccgtattctc aggaatgttg actgggaact gtaaaatgta tccattcatt aaaggaacgg 900
ctaagctgaa gacagtgcgc aagctagtgg aggcagtcaa tcatgcttgg ggtgtcgaga 960
agattagata tgctcttggg ccaggtggca tgacgggatg gtacaatagg actatgcaac 1020
aggcccccat tgtgctaact cctgctgctc tcacaatgtt cccagatacc atcaagtttg 1080
gggatttgaa ttrtccagtg aygattggcg atccgatgat tcttggctaa acacccccat 1140
cttcacagcg ccgggcttga ccaacctggt gtgacgtggg acaggcttca ttcatc 1196

Claims (24)

1.一种修饰的呼肠孤病毒，其包括：
突变，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第251至455位氨基酸被删除；以及
一个或多个选自以下的突变：SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第963位Met被Val取代，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第1265位Thr被Ile取代。
2.根据权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒，其中所述修饰的呼肠孤病毒还包括突变，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第227位Ile被Val取代。
3.根据权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒，其中所述修饰的呼肠孤病毒还包括一个或多个选自以下的突变：
(a)突变，其中SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的第73位Glu被Asp取代；
(b)突变，其中SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的第434位Asp被Asn取代；以及
(c)突变，其中SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的第644位Val被Ala取代。
4.根据权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒，其中所述修饰的呼肠孤病毒还包括一个或多个选自以下的突变：
(a)突变，其中SEQ ID NO：4的氨基酸序列中的第64位Lys被Glu取代；
(b)突变，其中SEQ ID NO：4的氨基酸序列中的第177位Ser被Phe取代；
(c)突变，其中SEQ ID NO：4的氨基酸序列中的第229位Glu被Asp取代；以及
(d)突变，其中SEQ ID NO：4的氨基酸序列中的第251位His被Leu取代。
5.根据权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒，其中所述修饰的呼肠孤病毒衍生自野生型人类呼肠孤病毒。
6.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述癌症是一个或多个选自以下的癌症：鳞状细胞癌、神经母细胞瘤、肺癌、肺腺瘤、腹膜癌、皮肤癌、眼癌、直肠癌、肛周癌、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、尿道癌、血癌、肝癌、胃肠癌、胰腺癌、绒毛癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头颈癌、口腔癌、舌癌、脑癌和间质瘤。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述癌症对紫杉烷抗癌药物具有抗性。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述的紫杉烷抗癌药物是一个或多个选自以下的药物：紫杉醇、拉罗他赛、卡巴他赛、多西他赛、奥他赛和特西他赛。
10.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物包括浓度为1×105至1×1020TCID50的所述修饰的呼肠孤病毒。
11.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于瘤内或静脉内给药。
12.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物对有需要的受试者至少给药两次。
13.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物与野生型呼肠孤病毒共同给药。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物组合物在所述施用所述野生型呼肠孤病毒之前或之后施用。
15.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括免疫检查点抑制剂作为活性成分。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是一个或多个选自以下的抑制剂：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、OX40抑制剂、CTLA-4抑制剂、4-1BB抑制剂、LAG-3抑制剂、B7-H4抑制剂、HVEM抑制剂、TIM4抑制剂、GAL9抑制剂、VISTA抑制剂、KIR抑制剂、TIGIT抑制剂和BTLA抑制剂。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述药物组合物是以混合物的形式，其包括所述修饰的呼肠孤病毒和所述免疫检查点抑制剂。
18.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述药物组合物是以所述修饰的的呼肠孤病毒和所述免疫检查点抑制剂各自单独配制从而同时或依次给药的形式。
19.一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其包括权利要求6至18中任一项的组合物。
20.一种用于与免疫检查点抑制剂共同给药的药物组合物，其包括权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒作为活性成分。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物与所述免疫检查点抑制剂同时、分别或依次给药。
22.一种预防或治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒。
23.权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒制造治疗癌症药物的用途。
24.权利要求1所述的修饰的呼肠孤病毒预防或治疗癌症的用途。
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