KR20220090467A - 신규한 변형 레오바이러스 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형 레오바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로서, 야생형 레오바이러스로부터 유도한 신규한 변형 레오바이러스가 희귀암을 포함한 다양한 암에 대해 우수한 항암효과를 가질 뿐만 아니라, 면역항암제의 효과를 증강시킬 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 흑색종, 설암 등의 희귀암을 포함한 다양한 종류의 암세포에 처리되었을 때 모든 암세포주의 생존율을 현저히 감소시켰으며, 특히 탁산계 항암제-내성 암세포주에 대해서도 우수한 항암효과를 갖는 것이 확인되었다. 나아가 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 흑색종, 방광암, 및 구강암 마우스 모델에서도 투여경로에 상관 없이 용량-의존적인 항암효과를 발휘하였으며, 반복투여하거나 야생형 레오바이러스와의 교차투여시 항암효과가 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 면역관문 억제제와 병용하면 시너지적인 항암효과를 일으키는 것이 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 희귀암 등을 치료하기 위한 새로운 항암 요법이자 면역항암제의 병용 약물로 유용히 활용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 신규한 변형 레오바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.
암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 현재까지도 전 세계적인 주요 사망 원인이다. 2015년 대한민국 전체 사망자 총 275,895명 중 27.9%가 암으로 사망하며 우리나라 사망 원인 1위를 기록하였으며, 암 발생률과 사망률은 지속해서 증가하는 양상을 보이고 있다.
희귀암은 유병 (有病)인구가 2만명 이하이거나 조기 진단이 어려워 정확한 유병인구를 알 수 없는 암으로서, 대한민국 보건복지부령으로 정한 절차와 기준에 따라 정하고 있다 (희귀질환 관리법, 시행 2019.4.30). 대한민국은 혈액암 등 희귀암이 전체 암 발생의 16%를 차지하고 있으며 현재 대부분의 신약 개발은 환자수가 많은 10대 암종에 집중되어 있으므로, 희귀암에 대한 신약 개발 사례는 미미한 실정이다. 희귀암의 경우 치료를 위한 항암제나 가이드라인이 잘 정립되어 있지 않으며 초기 진단이 어려워 대부분 이미 전이가 발생한 3기 이상에서 발견되며 그로 인해 치료 효과도 낮은 문제가 있다.
대표적인 피부 발생 희귀암종인 설암 및 악성 흑색종은 치료 과정 중 피부궤양과 안면추형 등을 일으켜 환자의 삶의 질을 떨어뜨리며 심한 경우 우울증이나 자살 등의 합병증까지 발생할 수 있다. 설암 (tongue cancer)은 입안의 혀에서 발생하는 대표적인 구강암의 일종이다. 구강암의 90% 이상이 입 안의 점막을 구성하는 편평상피세포에서 발생하는 악성종양에 해당한다. 전체 암환자의 0.2% 이하 수준의 희귀암인 설암의 특성상, 저작운동 능력의 감소, 안모추형변형과 같은 후유증이 남을 수 있고 치료 시기를 놓치면 발병 후 5년 이내 사망률이 약 44%에 달하는 등, 매우 위험한 암에 속한다.
현재 개발도상국가의 설암 등을 포함한 구강암 발생률은 13% 정도로 매우 높은 편이며, Mores 등의 연구에 의하면 미국의 경우 혀, 입, 인후 그리고 기타 구강암 등이 1998년에 약 30,300건이 발생하였으며, 8,000명 정도가 사망한 것으로 알려져 있다 (Oral Oncol. 1999 Jan;35(1):1-8). 암의 발생 경향은 다양하며, 동부와 중앙유럽 등에서도 증가하는 경향을 보이고 있다. Maria와 Susan의 연구에서는 1998년까지 인구 10만명당 8.3명이 구강암에 걸렸으며, 95% 이상이 40세 이상에서 발생하였고, 1975부터 1998년까지 남성에게서 구강암이 더 많이 발생하고, 흑인에서의 발생 빈도가 더 높은 것으로 보고되었다 (Oral Oncol. 2002 Sep;38(6):610-7). 대한민국의 경우 설암을 포함한 구강암은 연 3,000명 내외의 환자가 발생하는 것으로 보고된 바 있다.
흑색종의 발병 원인은 정확히 밝혀져 있지 않으나, 유전적 요인뿐만 아니라 자외선 노출과 같은 환경적 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 흑색종의 가족력은 전체 환자의 10 내지 15%를 차지하며 같은 세대에 환자가 있을 경우 위험도는 2배가 된다. 환경적 요인 중 자외선, 특히 자외선 B가 흑색종의 발생과 관련이 있으며 피부에 색소성 모반이 많거나 비정형적 모반을 가지고 있는 경우 흑색종의 발생 빈도가 증가하는 것으로 알려져 있다.
한편, 항암바이러스는 (oncolytic virus)는 스스로 복제가 가능하며 정상 세포가 아닌 암세포에만 선택적으로 감염, 증식 및 살상을 유도하는 바이러스로서, 향후 항암제시장을 변화시킬 제4세대 항암제로 대두되고 있다. 항암 바이러스에 의한 종양 세포의 파괴는 주위 종양 세포들의 감염을 다시 유도하고 이 현상이 반복되어 항암효과가 증폭될 수 있다는 장점이 있다. 특히, 항암 바이러스는 직접 암세포를 공격하는 것 외에도 종양의 혈관내피세포내 감염을 통해 신생혈관 생성을 억제하는 기능도 있다. 항암 바이러스 면역치료제는 개발 및 생산기술의 난이도가 매우 커 진입장벽이 크다. 따라서 실제 임상에 적용할 수 있는 항암바이러스의 개발은 아직까지 미비한 실정이며, 특히 희귀암을 효과적으로 타겟으로하는 항암바이러스는 발굴되지 않고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 야생형 레오바이러스로부터 유도된 신규한 변형 레오바이러스가 희귀암을 포함한 다양한 암에 대해 우수한 항암효과를 가질 뿐만 아니라, 면역항암제의 효과를 증강시킬 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 야생형 레오바이러스에 저항성을 보이는 암에서 항암효과를 가지는 변형 레오바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제 병용투여용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 251번 내지 455번 아미노산이 결실되고;
서열번호 2의 아미노산 서열에서 963번째 Met이 Val로 치환된 돌연변이 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1265번째 Thr이 Ile로 치환된 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형 레오바이러스를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 변형 레오바이러스는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 227번째 Ile가 Val로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 변형 레오바이러스는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 73번째 Glu가 Asp로 치환됨;
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 434번째 Asp가 Asn로 치환됨; 및
(c) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 644번째 Val이 Ala로 치환됨.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 변형 레오바이러스는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 64번째 Lys가 Glu로 치환됨;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 177번째 Ser가 Phe로 치환됨;
(c) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 229번째 Glu가 Asp로 치환됨; 및
(d) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 251번째 His가 Leu로 치환됨.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 변형 레오바이러스는 야생형 인간 레오바이러스로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 레오바이러스를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 레오바이러스의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 암 치료용 약물 제조를 위한 상기 변형 레오바이러스의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암은 탁산계 항암제에 대한 내성이 있는 암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 탁산계 항암제는 파클리탁셀, 라로탁셀, 카바지탁셀, 도세탁셀, 오르타탁셀, 및 테세탁셀로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 변형 레오바이러스는 상기 조성물 내에 1×105 내지 1×1020 TCID50의 용량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 종양 내 직접투여용 또는 정맥투여용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 2회 이상 반복투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 야생형 레오바이러스와 교차투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 야생형 레오바이러스의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 면역관문 억제제를 유효성분으로 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 면역관문 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, OX40 억제제, CTLA-4 억제제, 4-1BB 억제제, LAG-3 억제제, B7-H4 억제제, HVEM 억제제, TIM4 억제제, GAL9 억제제, VISTA 억제제, KIR 억제제, TIGIT 억제제, 및 BTLA 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제가 혼합된 혼합제 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제가 각각 제제화되어 동시에 또는 순차적으로 투여되는 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제 병용투여용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 면역관문 억제제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제를 모두 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 레오바이러스의 면역관문 억제제와의 병용투여 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 면역관문 억제제 병용투여용 약제 제조를 위한 상기 변형 레오바이러스의 용도를 제공한다.
본 발명은 변형 레오바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로서, 야생형 레오바이러스로부터 유도한 신규한 변형 레오바이러스가 희귀암을 포함한 다양한 암에 대해 우수한 항암효과를 가질 뿐만 아니라, 면역항암제의 효과를 증강시킬 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 흑색종, 설암 등의 희귀암을 포함한 다양한 종류의 암세포에 처리되었을 때 모든 암세포주의 생존율을 현저히 감소시켰으며, 특히 탁산계 항암제-내성 암세포주에 대해서도 우수한 항암효과를 갖는 것이 확인되었다. 나아가 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 흑색종, 방광암, 및 구강암 마우스 모델에서도 투여경로에 상관 없이 용량-의존적인 항암효과를 발휘하였으며, 반복투여하거나 야생형 레오바이러스와의 교차투여시 항암효과가 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 면역관문 억제제와 병용하면 시너지적인 항암효과를 일으키는 것이 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 희귀암 등을 치료하기 위한 새로운 항암 요법이자 면역항암제의 병용 약물로 유용히 활용될 것으로 기대된다.
도 1a는 정상 세포주에 Paclitaxel 또는 변형 레오바이러스 (RP116)을 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 1b는 다양한 Paclitaxel-저항성 암세포주에 Paclitaxel 또는 RP116을 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2a는 다양한 인간-유래 암세포주에 RP116을 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존율 및 IC50을 확인한 결과이다.
도 2b는 정상 세포주 및 다양한 종류의 암세포주에 RP116를 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 세포 사멸률을 정리한 표이다.
도 3은 다양한 피부암 세포주에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존 정도를 크리스털 바이올렛 염색으로 확인한 결과이다 (Mock: 무처리 대조군, 이하 동일).
도 4는 다양한 구강암 세포주에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존 정도를 크리스털 바이올렛 염색으로 확인한 결과이다.
도 5는 다양한 구강암 세포주에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존율 및 IC50을 확인한 결과이다.
도 6a는 피부암 마우스 모델에 변형 레오바이러스를 종양 내 직접투여 (IT) 또는 정맥투여 (IV)하는 방법을 보여주는 그림이다.
도 6b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×108 TCID50 또는 1×109 TCID50의 용량으로 종양 내 직접투여 또는 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다 (Control: 무처리 대조군, 이하 동일).
도 6c는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×108 TCID50 또는 1×109 TCID50의 용량으로 종양 내 직접투여 또는 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 7a는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 또는 5회 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다 (Vehicle: 무처리 대조군, 이하 동일).
도 7b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 또는 5회 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 7c는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 또는 5회 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 8a는 피부암 마우스 모델에 RP116을 단독투여하거나 면역항암제 (αPD-L1)와 병용투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 8b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 단독투여하거나 면역항암제와 병용투여한 후 시간에 따른 그룹별 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 9a는 구강암 마우스 모델에 RP116을 투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 9b는 구강암 마우스 모델에 RP116을 투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 10a는 피부암 마우스 모델에 야생형 레오바이러스를 연속투여하거나 (WT/WT), 야생형 레오바이러스 투여 후 RP116을 교차투여 (WT/RP116)하고 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 10b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 연속투여하거나 (RP116/RP116), RP116 투여 후 야생형 레오바이러스를 교차투여 (RP116/WT)하고 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 11a는 RP116 또는 야생형 레오바이러스 (RC402)의 중화항체에 대한 내성을 확인하기 위한 실험 개략도이다.
도 11b는 세포에 RC402 또는 RP116 바이러스를 RC402-유도 중화항체 (RC402 ab)를 처리하여 중화항체의 희석배수에 따른 세포 생존율 (y축)을 확인한 결과이다.
도 11c는 세포에 RC402 또는 RP116 바이러스를 RP116-유도 중화항체 (RP116 ab)를 처리하여 중화항체의 희석배수에 따른 세포 생존율 (y축)을 확인한 결과이다.
도 1b는 다양한 Paclitaxel-저항성 암세포주에 Paclitaxel 또는 RP116을 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2a는 다양한 인간-유래 암세포주에 RP116을 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존율 및 IC50을 확인한 결과이다.
도 2b는 정상 세포주 및 다양한 종류의 암세포주에 RP116를 다양한 농도로 처리한 후 처리 농도에 따른 세포 사멸률을 정리한 표이다.
도 3은 다양한 피부암 세포주에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존 정도를 크리스털 바이올렛 염색으로 확인한 결과이다 (Mock: 무처리 대조군, 이하 동일).
도 4는 다양한 구강암 세포주에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존 정도를 크리스털 바이올렛 염색으로 확인한 결과이다.
도 5는 다양한 구강암 세포주에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 처리한 후 처리 농도에 따른 암세포 생존율 및 IC50을 확인한 결과이다.
도 6a는 피부암 마우스 모델에 변형 레오바이러스를 종양 내 직접투여 (IT) 또는 정맥투여 (IV)하는 방법을 보여주는 그림이다.
도 6b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×108 TCID50 또는 1×109 TCID50의 용량으로 종양 내 직접투여 또는 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다 (Control: 무처리 대조군, 이하 동일).
도 6c는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×108 TCID50 또는 1×109 TCID50의 용량으로 종양 내 직접투여 또는 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 7a는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 또는 5회 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다 (Vehicle: 무처리 대조군, 이하 동일).
도 7b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 또는 5회 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 7c는 피부암 마우스 모델에 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 또는 5회 정맥투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 8a는 피부암 마우스 모델에 RP116을 단독투여하거나 면역항암제 (αPD-L1)와 병용투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 8b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 단독투여하거나 면역항암제와 병용투여한 후 시간에 따른 그룹별 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 9a는 구강암 마우스 모델에 RP116을 투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 9b는 구강암 마우스 모델에 RP116을 투여한 후 시간에 따른 그룹별 평균 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 10a는 피부암 마우스 모델에 야생형 레오바이러스를 연속투여하거나 (WT/WT), 야생형 레오바이러스 투여 후 RP116을 교차투여 (WT/RP116)하고 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 10b는 피부암 마우스 모델에 RP116을 연속투여하거나 (RP116/RP116), RP116 투여 후 야생형 레오바이러스를 교차투여 (RP116/WT)하고 시간에 따른 그룹별 평균 종양 부피 변화를 확인한 결과이다.
도 11a는 RP116 또는 야생형 레오바이러스 (RC402)의 중화항체에 대한 내성을 확인하기 위한 실험 개략도이다.
도 11b는 세포에 RC402 또는 RP116 바이러스를 RC402-유도 중화항체 (RC402 ab)를 처리하여 중화항체의 희석배수에 따른 세포 생존율 (y축)을 확인한 결과이다.
도 11c는 세포에 RC402 또는 RP116 바이러스를 RP116-유도 중화항체 (RP116 ab)를 처리하여 중화항체의 희석배수에 따른 세포 생존율 (y축)을 확인한 결과이다.
본 발명은 변형 레오바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로서, 야생형 레오바이러스로부터 유도한 신규한 변형 레오바이러스가 희귀암을 포함한 다양한 암에 대해 우수한 항암효과를 가질 뿐만 아니라, 면역항암제의 효과를 증강시킬 수 있음을 확인하여 완성된 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 변형 레오바이러스 (RP116)를 제조하여 이의 분자생물학적 특성을 확인하였다 (실시예 1 및 2).
본 발명의 다른 실시예에서는 정상 세포 및 탁산계 항암제인 파클리탁셀 (Paclitaxel)에 내성이 있는 암세포주 각각에 RP116을 처리한 뒤 세포 생존율을 관찰한 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 정상 세포에 대해서는 독성이 없으면서 탁산계 항암제-저항성 암세포에 대해 특이적인 항암효과를 발휘하는 것을 확인하였다 (실시예 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 희귀암을 포함한 다양한 암세포주에 RP116을 처리하여 세포 생존율을 관찰한 결과 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 여러 종류의 암에 대해 용량-의존적인 항암효과를 발휘하는 것을 확인하였다 (실시예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 다양한 피부암 세포주, 구강암 세포주, 및 방광암 세포주에 야생형 레오바이러스 및 RP116을 각각 처리하여 세포 생존율을 관찰한 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 야생형 레오바이러스보다 강력한 항암효과를 갖는다는 것을 확인하였다 (실시예 5 내지 7).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, RP116을 피부암 마우스 모델에 저용량 또는 고용량으로 종양 내 직접투여 또는 정맥투여한 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 두 투여경로 모두에서 우수한 항암효과를 보였으며, 상기 항암효과는 바이러스 용량과 상관관계가 있음을 확인하였다 (실시예 8).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 피부암 마우스 모델에서 RP116의 투여 횟수에 따른 항암효과를 비교한 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 다회 투여할수록 항암효과가 더욱 증진됨을 확인하였다 (실시예 9).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 피부암 마우스 모델에서 RP116과 함께 면역관문 억제제를 병용투여하여 이의 항암효과를 확인한 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 그 자체로서도 우수한 항암효과를 발휘할 뿐만 아니라, 면역항암제와 병용시 시너지적인 항암효과를 발휘함을 확인하였다 (실시예 10).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 구강암 마우스 모델을 제작하여 RP116을 투여한 결과 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 구강암에서도 강력한 종양 성장 억제효과를 갖는 것을 확인하였다 (실시예 11).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 피부암 마우스 모델을 이용하여 RP116 및 야생형 레오바이러스의 교차투여 (RP116→WT, 또는 WT→RP116)시 바이러스의 항암효과가 증진되는지 확인한 결과, 동일한 종류의 바이러스를 연속 투여하는 것에 비해 본 발명에 따른 변형 레오바이러스 및 야생형 레오이러스를 교차투여할 때 항암효과가 더욱 증진되는 것을 확인하였다 (실시예 12).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 RP116 또는 야생형 레오바이러스로 유도한 중화항체에 대한 RP116의 내성을 확인한 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 두 가지 중화항체 모두에 대해 강력한 내성을 갖는다는 것을 확인하였다 (실시예 13).
이상의 실시예를 통해, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 흑색종, 설암 등의 희귀암을 포함한 다양한 암에 대해 특이적인 항암효과를 가진다는 것이 확인되었으며, 상기 항암효과는 야생형 레오바이러스보다 더욱 우수함이 확인되었다. 나아가 상기 변형 레오바이러스는 종양 내 투여는 물론 정맥투여시에도 동물모델에서의 종양 성장을 강력하게 억제한 바 암종류에 따라 자유로운 투여경로가 선택 가능하며, 반복투여 또는 야생형 레오바이러스의 교차투여를 통해 항암효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 변형 레오바이러스는 면역 항암제와 병용시 더욱 강력한 항암효과를 발휘하며, 항암 바이러스의 약점인 중화항체에 대해서도 높은 내성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 희귀암 등을 치료하기 위한 새로운 항암 요법 및 면역항암제의 병용 약물로 활용될 것으로 기대된다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 야생형 레오바이러스에 저항성을 보이는 암에서 항암효과를 가지는 변형 레오바이러스를 제공한다. 상기 변형 레오바이러스는 시그마-1 단백질의 항원 결정기의 결손에 더하여 바이러스 입자의 outer capsid를 구성하는 구조 단백질 람다-2 등의 서열변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
레오바이러스 (respiratory enteric orphan virus, REO virus)는 이중가닥의 RNA 단편을 게놈으로 갖는, 외피가 없는 (non-enveloped) 20면체의 바이러스이다. 레오바이러스는 건강한 인간의 소화기 및 호흡기에서 흔하게 분리되며, 병원성이 없는 바이롬 (virome)으로 여겨진다. 레오바이러스는 다양한 형질전환 (transformed) 세포를 감염 및 사멸시킬 수 있는 종양용해성 바이러스 (oncolytic virus)로 알려져 있다. 즉, 레오바이러스는 일반적인 종양용해성 바이러스와 마찬가지로 정상세포에는 영향을 거의 미치지 않으면서 암세포만 특이적으로 감염시켜 이의 사멸을 유도할 수 있으므로 부작용의 문제가 낮은 장점이 있으며, 1차 감염된 암세포에서 증식한 후 주변 및 멀리 떨어진 암세포까지 감염시킬 수 있어 광범위한 항암효과를 일으킬 수 있다는 장점이 있다.
그럼에도 불구하고, 야생형 레오바이러스는 체내 주입시 중화항체 등에 의해 항암 기능이 약화될 수 있는 문제점이 있고, 암세포의 종양미세환경 등에 의해 레오바이러스의 항암 기능이 억제될 수 있는 위험이 있다. 나아가, 레오바이러스가 암세포가 아닌 정상 세포를 감염시켜 숙주에 이상을 일으킬 문제점도 여전히 존재한다. 본 발명자들은 야생형 레오바이러스의 숙주 독성 문제를 해결하기 위해 야생형 시그마 1 단백질 (Sigma 1 protein) 코딩 유전자 중간에 미성숙 STOP 코돈이 존재하여 절단된 (truncated) 형태의 시그마 1 단백질을 발현하는 약독화된 레오바이러스 (attenuated reovirus, AV)를 제조하였다. 상기 약독화된 레오바이러스는 야생형 레오바이러스와 비교해 숙주에 대한 독성이 더욱 감소한 것으로 확인되었으나, 항암효과면에서는 야생형 레오바이러스에 상응하는 정도의 종양 용해성을 유지하는 것에 불과하였다. 이에, 본 발명자들은 야생형 레오바이러스와 비교해 정상세포에 대한 독성은 더욱 낮으면서 더욱 강력한 항암효과를 발휘할 수 있는 변형 레오바이러스에 대해 연구를 수행한 결과, 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 야생형 레오바이러스와 비교하여 정상 세포에 대한 독성은 없으면서 암세포는 더욱 강력하게 감염 및 사멸시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 S1 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 1; 시그마-1 단백질)의 251번 내지 455번 아미노산이 결실되고, L2 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 2; 람다-2 단백질)의 963번째 Met이 Val 로 치환되고/치환되거나, L2 segment가 코딩하는 폴리펩타이드의 1265번째 Thr이 Ile로 치환된 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 야생형 레오바이러스 및 약독화 레오바이러스와 비교하여 람다-2 단백질에 치환 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 시그마-1 (Sigma-1) 단백질은 바이러스가 세포에 부착하는 것에 관여하는 단백질로, 바이러스 입자의 주요 항원 결정기에 해당한다. 본 발명에 있어서, 람다-2 (Lambda-2) 단백질은 레오바이러스의 mRNA capping에 관여하는 외부 캡시드 (outer capsid) 단백질이다.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 227번째 Ile (Isoleucine)가 Val (Valine)로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 M2 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 3; 뮤-1 단백질)에 추가의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 변형 레오바이러스는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 73번째 Glu가 Asp로 치환됨;
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 434번째 Asp가 Asn로 치환됨; 및
(c) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 644번째 Val이 Ala로 치환됨.
본 발명에 있어서, 뮤-1 (Mu-1) 단백질은 바이러스의 숙주 세포막 침투에 관여하는 주요 외부 캡시드 단백질이다.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 S4 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 4; 시그마-3 단백질)에 추가의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 변형 레오바이러스는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 64번째 Lys가 Glu로 치환됨;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 177번째 Ser가 Phe로 치환됨;
(c) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 229번째 Glu가 Asp로 치환됨; 및
(d) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 251번째 His가 Leu로 치환됨.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 L1 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 5; 람다-3 단백질)의 아미노산 서열에서 399번째 Ile가 Thr로 치환된 돌연변이 및/또는 1202번째 Lys가 Glu로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 L3 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 6; 람다-1 단백질)의 아미노산 서열에서 16번째 Gly가 Val로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 M3 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 7; MuNS 단백질)의 아미노산 서열에서 478번째 Ile가 Leu로 치환된 돌연변이 및/또는 657번째 Thr가 Ala로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 S2 segment가 코딩하는 폴리펩타이드 (서열번호 8; 시그마-2 단백질)의 아미노산 서열에서 50번째 Arg가 Lys로 치환된 돌연변이를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 각 gene segment의 염기서열 및 이들이 코딩하는 각 단백질의 아미노산 서열은 본 명세서의 서열목록에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 특정 서열번호가 병기된 유전자 (핵산 분자)는, 해당 서열번호의 염기서열을 포함하거나 해당 서열번호의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 목적 및 기능이 유지되는 한, 해당 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 특정 서열번호로 표시되는 염기서열의 핵산 분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시된 핵산 분자는 해당 서열번호로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
마찬가지로, 특정 서열번호가 병기된 폴리펩타이드 (단백질)는, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하거나 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 목적 및 기능이 유지되는 한, 해당 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드는 이를 구성하는 폴리펩타이드 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 결실, 치환, 또는 삽입에 의해 변형되었지만, 상기 폴리펩타이드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시된 폴리펩타이드는 해당 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 아미노산 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상술한 돌연변이 외에는 야생형 레오바이러스와 동일한 야생형 염기 서열 및 아미노산 서열을 포함한다. 다만, 바이러스의 특성상 야생형 서열이라도 바이러스의 기능 및 특성이 유지되는 범위 내에서 일부 염기 또는 아미노산의 결실, 치환, 및/또는 삽입의 돌연변이가 일어날 수 있음은 자명하다. 따라서 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상기 돌연변이 외에도 바이러스의 기능 (항암효과)을 헤치지 않는 야생형 서열의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 야생형 레오바이러스의 유전체 서열은 본 명세서의 서열목록에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 임의의 야생형 레오바이러스로부터 유래될 수 있으며, 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있는 레오바이러스과 (Reovirus family)의 구성원일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 야생형 인간 레오바이러스로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 야생형 레오바이러스는 인간 레오바이러스 타입 1, 인간 레오바이러스 타입 2, 및 인간 레오바이러스 타입 3에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 야생형 레오바이러스는 인간 레오바이러스 타입 1 균주 Lang, 인간 레오바이러스 타입 2 균주 Jones, 및 인간 레오바이러스 타입 3 균주 Dearing 또는 Abney에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 야생형 레오바이러스는 타입 3 레오바이러스일 수 있다. 뿐만 아니라, 또한, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 인간을 제외한 영장류 (챔팬지, 고릴라, 짧은 꼬리 원숭이, 원숭이 등), 설치류 (생쥐, 쥐, 게리빌스쥐, 햄스터, 토끼, 기나아피그 등), 개, 고양이, 일반 가축 (소, 말, 돼지, 염소)을 포함하는 기타 포유류 종의 세포에 대해 향성 (tropism)을 나타내는 하나 또는 그 이상의 레오바이러스로부터 유도될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 피부암은 편평상피세포암, 기저세포암, 및 흑색종에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 흑색종은 전이성 흑색종일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 PD-L1을 발현 또는 발현하지 않는 암일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 암은 암 발병억제 유전자 (p53, Rb 등)의 돌연변이 또는 RAS 활성 돌연변이를 갖는 암일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 암은 야생형 레오바이러스에 대해 저항성이 있는 암일 수 있다.
또는, 본 발명에 있어서 상기 암은 탁산계 항암제에 대한 내성이 있는 암일 수 있다.
본 발명에 있어서 "항암제에 대한 내성”이란 암 치료를 위해 항암제를 사용할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 항암제에 있어서 일반적인 치료 효과 판정은 WHO에서 제정한 기준에 따라 4가지로 분류되는데, (1) 종양이 모두 소실되고 4주 이상 치료 효과가 지속되는 경우 (완전관해, complete response); (2) 종양의 크기가 50% 이상 감소하는 경우 (부분 반응, partial response); (3) 종양의 크기가 50% 미만 감소하는 경우 (불변, stable disease); 및 (4) 종양의 크기가 25% 이상 증가하는 경우 (진행, progressive disease)로 구분된다. 즉, 상기 WHO의 기준에 의하면, 항암제에 대한 내성이란 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나, 초기에는 암 치료 효과가 있으나 (상기 (1) 및 (2)) 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것 (상기 (3) 및 (4))을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 탁산계 항암제 (Taxane-based anticancer drugs) 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 탁산계 항암제는 파클리탁셀 (Paclitaxel), 라로탁셀 (Larotaxel), 카바지탁셀 (Cabazitaxel), 도세탁셀 (Docetaxel), 오르타탁셀 (Ortataxel), 및 테세탁셀 (Tesetaxel)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 변형 레오바이러스의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 상기 조성물 내에 1×105 내지 1×1020 TCID50 (Tissue Culture Infective Dose 50%)의 용량으로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 변형 레오바이러스는 상기 조성물 내에 1×105 내지 1×1020, 1×105 내지 1×1019, 1×105 내지 1×1018, 1×105 내지 1×1017, 1×105 내지 1×1016, 1×105 내지 1×1015, 1×105 내지 1×1014, 1×105 내지 1×1013, 1×105 내지 1×1012, 1×105 내지 1×1011, 1×105 내지 1×1010, 1×105 내지 1×109, 1×105 내지 1×108, 1×105 내지 1×107, 1×105 내지 1×106, 1×106 내지 1×1015, 1×106 내지 1×1012, 1×106 내지 1×1010, 1×107 내지 1×1015, 1×107 내지 1×1012, 또는 1×107 내지 1×1010 TCID50의 용량으로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 대상체 내로 투여되었을 때 상기 조성물 내에 포함된 변형 레오바이러스가 생체에서 이용 가능하도록 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효투여량은 상기 변형 레오바이러스가 1×105 내지 1×1020 TCID50의 양으로 투여되는 용량일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 종양 내 직접투여 또는 정맥투여를 통해 투여될 수 있으며, 종양의 상태 및 종류 등에 따라 적절한 투여방법을 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 개체 (즉, 암환자 등)에 2회 이상 반복투여될 수 있다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 다회 투여할수록 이의 항암효과가 더욱 증진되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 단회 투여될 수 있을 뿐만 아니라, 2회 이상 반복투여될 수 있으며, 종양이 감소하거나 소멸할 때까지 반복투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 2회 내지 50회, 2회 내지 45회, 2회 내지 40회, 2회 내지 35회, 2회 내지 30회, 2회 내지 25회, 2회 내지 20회, 2회 내지 15회, 2회 내지 14회, 2회 내지 13회, 2회 내지 12회, 2회 내지 11회, 2회 내지 10회, 2회 내지 9회, 2회 내지 8회, 2회 내지 7회, 2회 내지 6회, 2회 내지 5회, 또는 2회 내지 4회 투여될 수 있으나, 이는 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 반복투여는 1일 내지 100일 간격을 두고 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 반복투여는 1일 내지 100일, 1일 내지 90일, 1일 내지 80일, 1일 내지 70일, 1일 내지 60일, 1일 내지 50일, 1일 내지 40일, 1일 내지 30일, 1일 내지 20일, 1일 내지 15일, 1일 내지 10일, 1일 내지 9일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 또는 1일 내지 5일 간격을 두고 이루어질 수 있으나, 이는 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 야생형 레오바이러스와 교차투여되는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, “교차투여 (crossover administration)”란 2 이상의 약물을 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 것을 의미한다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 야생형 레오바이러스와 교차투여하면 동일한 레오바이러스를 연속투여할 때보다 항암효과가 증가하는 것을 확인하였다. 교차투여시 본 발명에 따른 조성물 (즉, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스)과 야생형 레오바이러스의 순서에는 제한이 없다. 즉, 본 발명에 따른 조성물을 먼저 투여한 후 야생형 레오바이러스를 투여할 수 있고, 반대로 야생형 레오바이러스를 먼저 투여한 후 본 발명에 따른 조성물을 투여할 수 있다.
또는, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 변형 레오바이러스에 더하여 야생형 레오바이러스를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 야생형 레오바이러스가 각각 제제화되어 순차적으로 투여되는 형태일 수 있다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 변형 레오바이러스에 더하여 면역항암제를 유효성분으로 더 포함할 수 있다. 면역항암제는 면역체계를 활성화하고 특이성 (specificity), 기억능력 (memory), 적응력 (adaptiveness)을 증강시킴으로써 항암 효과를 발휘하는 항암제이다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 변형 레오바이러스 및 면역항암제의 병용시 이들의 항암효과가 더욱 증진되는 것을 확인하였다. 본 발명에 있어서 면역항암제는 면역관문 억제제 (immune checkpoint inhibitors), 면역세포치료제 (immune cell therapy), 항암백신 (anticancer vaccine), 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate) 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 면역항암제는 면역관문 억제제일 수 있다. 면역관문 (immune checkpoint)이란 정상세포의 표면에 발현하는 면역반응 조절 단백질로, 과도한 면역반응을 약화시켜 유해하고 무차별적인 자가면역반응을 억제함으로써 정상조직을 보호하는 역할을 하는 단백질이다. 그러나 일부 암세포는 면역관문 단백질을 발현하여 면역세포와 상호작용하고, 이들의 면역 기능을 불활성화시킴으로써 항암 면역반응을 무력화시킨다. 면역관문 억제제는 암세포에 발현된 면역관문 단백질을 표적으로 하여 면역세포와의 상호작용을 방해하므로, 암세포의 면역회피를 차단할 수 있다.
면역관문 억제제의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, OX40 억제제, CTLA-4 억제제, 4-1BB 억제제, LAG-3 억제제, B7-H4 억제제, HVEM 억제제, TIM4 억제제, GAL9 억제제, VISTA 억제제, KIR 억제제, TIGIT 억제제, 및 BTLA 억제제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 면역관문 억제제는 상기 면역관문 단백질을 표적으로 하는 소분자 (small molecules), 리간드, 고분자 (macromolecules) 등일 수 있고, 바람직하게는 상기 면역관문 단백질을 표적으로 하는 항체 (antibodies)일 수 있다. 또는, 본 발명에 따른 면역관문 억제제는 Ipilimumab, Pembrolizumab, Nivolumab, Cemiplimab, Atezolizumab, Avelumab 및 Durvalumab 등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제가 혼합된 혼합제 형태일 수 있다.
또는, 본 발명에 따른 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제가 각각 제제화되어 동시에 (simultaneously), 또는 순차적으로 (sequentially) 투여되기 위한 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 조성물은 변형 레오바이러스의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학적 조성물; 및 면역관문 억제제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학적 조성물을 포함하는, 동시 또는 순차적 투여를 위한 병용투여용 약학적 조성물일 수 있다. 이 때, 순차적 투여의 경우 투여 순서에 제한되는 것은 아니며, 환자의 상태 등에 따라 투여 요법은 적절하게 조절될 수 있다. 즉, 상기 약학적 조성물이 순차적 투여를 위한 병용투여용 약학적 조성물인 경우, 상기 조성물은 변형 레오바이러스 (“제1 성분”)가 먼저 투여된 후 면역관문 억제제 (“제2 성분”)가 투여되는 것일 수 있으며, 그 반대 순서도 가능하다. 본 발명에 따른 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제는 각각 독립된 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 종양 내 직접투여 또는 정맥투여될 수 있으며, 면역관문 억제제는 복강투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 야생형 레오바이러스 및/또는 면역항암제를 더 포함할 수 있다. 상키 키트는 암을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있는 물질 내지 기기 등의 조합을 의미하며, 상기 변형 레오바이러스를 제조, 보관, 또는 투여할 수 있는 형태이면 되고, 구체적인 형태에는 제한이 없다. 따라서 본 발명에 따른 키트는 변형 레오바이러스, 야생형 레오바이러스, 및 면역항암제뿐만 아니라 특정 질환의 치료를 위한 키트의 구성요소로서 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제 병용투여용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 면역항암제는, 바람직하게는 면역관문 억제제이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “병용투여”는, 치료 요법의 개별 성분들을 동시, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여하는 방식으로 이룰 수 있다. 2 이상의 약물을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나, 또는 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 등의 방법으로 병용 치료 효과를 얻는 것으로, 병용 치료법은 이에 한정되지 아니하지만, 예를 들어 반응 정도, 반응 속도, 질병 진행까지의 기간 또는 생존 기간을 통해 측정된 효능이 병용 치료법의 성분 중 하나 또는 나머지를 통상적인 용량으로 투약하여 얻을 수 있는 효능보다 치료학적으로 우수하면서 상승효과를 제공할 수 있는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명에 따른 병용투여용 약학적 조성물은 면역항암제의 항암 효과를 증진시키고, 효과를 지속시킬 수 있다. 여기서, “항암 효과를 증진”시킨다는 것은, 결과적으로 면역항암제의 기능을 강화할 수 있는 모든 효과를 이르는 것으로서, 종양의 성장 억제, 종양의 전이 억제, 종양의 재발 억제 등과 같은 항암제의 항암 효과를 증진시키는 것은 물론, 항암 면역반응을 더욱 증진시키거나, 면역항암제에 대한 암세포의 저항 내지 내성 형성을 억제함으로써 결과적으로 항암 효과를 증진시키는 것까지 모두 포함하는 개념이다. 또한 “효과를 지속”시킨다는 것은, 종양의 완전관해 이후에도 암세포에 대한 항암 면역 효과가 유지되는 것을 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 상기 병용투여용 약학적 조성물은 면역항암제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 면역항암제와 순차적으로 투여되는 경우에도 투여 순서에 제한되는 것은 아니나, 암의 종류 및 항암제의 종류, 환자의 상태 등에 따라 투여 요법은 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 변형 레오바이러스의 제조
본 발명에 따른 변형 레오바이러스 RP116은 야생형 레오바이러스에 대해 감염 저항성이 있는 세포주에 병원성바이러스은행 (Korea Bank for Pathogenic Viruses, KBPV-VR-38)으로부터 분양받은 야생형 레오바이러스를 약독화 레오바이러스 (AV; Br J Cancer. 2011 Jan 18;104(2):290-9)와 혼합 감염시켜 유전자 세그먼트의 reassortment와 바이러스 및 숙주세포간 적응 (adaptation)을 유도하여 제조하였다.
구체적으로, 야생형 레오바이러스에 저항성이 있는 U-2OS 세포 (KCLB,300096)를 3×105 cells/well 이 되도록 12웰 플레이트에 처리한 후 24시간 동안 세포가 바닥에 잘 붙을 수 있도록 37 ℃ 및 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 야생형 레오바이러스와 약독화된 레오바이러스 AV를 각각 1:1 혼합하여 DMEM complete media를 이용하여 10-5, 10-6, 및 10-7의 희석액을 만들고 각 희석액 당 2개의 12웰 플레이트의 각 웰에 100 μl 씩 처리해 주었다. 바이러스 처리 후 18시간 뒤, 웰 플레이트에 들어있는 DMEM complete media를 제거하고 1% Agar를 각 웰마다 1 ml 씩 추가해 주었다. Plaque 생성을 확인하기 위하여 매일 현미경을 관찰하고 plaque을 표시하여 육안으로 확인 가능한 크기로 빠르게 생성한 플라크를 1 ml 피펫을 이용해 회수하였다. 수집한 플라크를 혼합하고 다시 U-2 OS 세포에서 빠르게 성장한 플라크를 분리하여 BHK21 세포에서 확장하였다. 선별하여 확장시킨 플라크의 특징을 확인하기 위해, 제조자가 제시한 방법에 따라 PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 바이러스로부터 RNA를 추출하였으며, 야생형바이러스와 AV의 일차적인 차이점인 S1 segment를 특이적으로 인식하는 프라이머 쌍 5'-ATGGATCCTCGCCTACGTKAAGAAG-3', 5'-CTGATCCTCACGTGAAACTACGC-3', 및 AccuPower RT-PCR PreMix (Bioneer, Cat #. K-2057) 키트를 사용하여 유전자를 선택적으로 증폭하여 염기서열 분석을 실시했다. 염기서열을 분석한 137개 plaque 시료 중에서 37개가 단일한 S1 segment 서열을 포함하는 것으로 확인되었으며 이들은 모두 stop codon을 보유한 S1 gene을 가진 것으로 확인되었다. 1차 선별된 이들 37개의 변이주를 96웰 플레이트에서 배양한 사람 대장암세포주 Lovo, 및 DLD1, 그리고 정상피부세포 HS27에 각각 연속희석하여 처리한 다음 3일간 배양하여 처리한 세포의 생존율을 WST 시약을 처리하여 분석하여 유효성 및 안전성이 가장 우수한 변이주를 본 발명에 따른 변형 레오바이러스로 선정하였다. 선정된 변형레오 바이러스는 대장암 세포주 LoVo 및 DLD1에서 가장 높은 세포성장 저해능을 보였으며, 사람의 정상 세포인 HS27 세포의 경우 바이러스를 바이러스 입자수를 기준으로 60,000 MOI 까지 처리하였음에도 불구하고 거의 죽지 않는 모습을 보였다. 선정된 변이주에 대해서 전체 염기설열 분석을 진행하였다.
실시예 2. 변형 레오바이러스의 분자생물학적 특성 확인
선정된 변이주에 대해서 PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 RNA를 추출하여 차세대염기서열 분석 (Next Generation Sequence Analysis, NGS) 분석을 통하여 바이러스 전체 염기서열을 자료를 얻었다. 전체 염기서열에서 변이 검출 과정은 GATK best practice 표준화 지침을 활용하여 진행하였으며 이중 폴리펩타이드 서열의 변이를 유발하는 부분은 Genebank Database에 보고된 Reovirus type3 (strain Dearing) (T3D) 의 자료와 비교하여 변이의 신규성을 확인하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스의 특징적인 아미노산 변이는 바이러스 입자의 주요 항원 결정기에 해당하는 시그마-1 (Sigma-1) 단백질 (서열번호 1)의 251 내지 455번 아미노산 서열의 결손 및 시그마-1 단백질과 함께 작용하는 람다-2 (Lambda-2) 단백질 (서열번호 2)의 카르복시 말단, 그리고 outer capsid의 구조단백질인 뮤-1 (mu-1) (서열번호 3) 및 시그마-3 단백질 (서열번호 4)에 분포하는 것을 확인하였다.
Segment | Protein Name | 아미노산 변이 |
L1 | lambda-3 | Ile399Thr, Lys1202Glu |
L2 | Lambda-2 | Met963Val, Thr1265Ile |
L3 | Lambda-1 | Gly16Val |
M2 | Mu1 | Glu73Asp, Asp434Asn, Val644Ala |
M3 | MuNS | Ile478Leu, Thr657Ala |
S1 | Sigma-1 | Ile227Val, Gln251STOP |
S2 | Sigma-2 | Arg50Lys |
S4 | Sigma-3 | Lys64Glu, Ser177Phe, Glu229Asp, His251Leu |
실시예 3. 변형 레오바이러스의 Paclitaxel-저항성 암세포 성장 억제효과 확인
Paclitaxel은 폐암, 난소암, 유방암 등 여러 유형의 암에 광범위하게 사용되는 화학항암제이지만, 일부 암세포는 Paclitaxel에 저항성이 있어 약물에 의한 사멸 효과가 감소한다는 것이 알려져 있다. 이에, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스 RP116이 Pclitaxel에 저항성이 있는 암세포에 대해 항암효과가 있는지 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 세포주는 다음과 같다: 정상 세포주인 HS27, 및 Paclitaxel 저항성 암세포주인 Skmel28, A375, 및 B16F10 세포주. 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 각 세포주를 배양한 뒤 96웰 플레이트에 3,000 cells/well의 농도로 씨딩 (seeding)한 후 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 준비한 각 세포에 0.008 ~ 1,000 MOI (Multiplicity of infection)의 농도로 연속 희석한 RP116을 처리하고 추가로 3일 동안 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양한 후, WST 키트 (DoGen, 서울, 대한민국, Cat No: EZ-3000)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 생존 세포수를 측정하였다.
그 결과, 정상 세포주에 Paclitaxel을 처리함에 따라 대조군에 비해 세포 생존율 (cell viability)이 농도 의존적으로 감소한 바 Paclitaxel이 세포에 독성이 있음을 확인한 반면, RP116의 경우 대조군과 RP116 처리군 간에 유의한 세포 생존율 차이가 확인되지 않은 바, RP116은 정상 세포에 대해 독성이 없음을 알 수 있었다 (도 1a). 반면 암세포에 대해서는 RP116의 뛰어난 항암효과가 관찰되었다 (도 1b). Paclitaxel은 100 nM 이상의 고용량을 처리한 군에서도 대조군과 비교하여 세포 생존율에 큰 차이가 없었으나, RP116은 모든 암 세포주에 대해 암세포 성장 억제효과가 나타났으며, 농도 의존적인 암세포 사멸 효과가 나타난 바, 용량-반응 상관관계가 확인되었다. 상기 실험 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 정상 세포에 대해서는 독성이 없으면서 Paclitaxel-저항성 암세포에 대해선 특이적인 항암효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 4. 변형 레오바이러스의 다양한 종류의 암세포주에 대한 성장 억제효과 확인
다음으로, 다양한 종류의 인간-유래 암세포주에 대해 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 항암효과를 발휘하는지 확인하였다.
인간 유래의 대장암 세포주 (LoVo, HCT116, 및 DLD-1), 피부암 세포주 (A431), 신경교종 세포주 (SNU489, U87-MG, 및 SNU466), 유방암 세포주 (MCF7), 자궁경부암 세포주 (SiHa, HeLa, 및 ME-180), 및 간암 세포주 (Hep3B)를 실험에 사용하였다. 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 각 세포주를 배양한 뒤 96웰 플레이트에 3,000 cells/well의 농도로 씨딩한 후 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 준비한 각 세포에 0.008 ~ 1,000 MOI의 농도로 연속 희석한 RP116을 처리하고 추가로 3일 동안 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양한 후, WST 분석 키트를 제조사에서 제시한 방법에 따라 사용하여 생존 세포수를 측정하였다. 측정 결과로서 IC50 값은 Prism GraphPad 9.1.0 버전의 비선형회귀를 사용하여 계산하였다.
그 결과, 무반응 세포주 없이 모든 암세포주에서 RP116에 의한 암세포 사멸 효과가 나타났으며, 농도 의존적인 암세포 사멸 효과가 나타난 바, 용량-반응 상관관계가 확인되었다 (도 2a).
추가로, 정상 세포주 (HS27), 흑색종 세포주 (Skmel28, A375, 및 B16F10), 두경부암 세포주 (YD15), 폐암 세포주 (LLC1, A549), 간암 세포주 (Huh7), 및 기질 종양 세포주 (L929)에 0.01 내지 10 MOI의 RP116을 처리하여 72시간 동안 배양한 후 세포 사멸률을 확인하였다. 그 결과, 정상 세포주에서는 RP116이 독성을 나타내지 않았으나, 모든 암세포에서는 뛰어난 암세포 사멸 효과를 나타낸 것을 확인하였다 (도 2b)
상기 실험 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 대장암, 피부암, 신경교종, 유방암, 자궁경부암, 간암, 두경부암 등을 포함한 다양한 암에 대해 항암효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 5. 변형 레오바이러스의 피부암에 대한 항암효과 확인
본 실시예에서는 피부암에 대한 야생형 레오바이러스 및 변형 레오바이러스 RP116의 항암효과를 비교하였다.
다양한 피부암 세포주 (B16F10, HS294T, SK-MEL-28, A375, 및 A431 세포주)에 바이러스를 무처리 하거나 (Mock), 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 다양한 농도로 처리하여 감염시킨 후, CPE (viral-induced cytopathic effects) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 각 암세주를 24웰-플레이트에 동일한 수로 씨딩하고 바이러스를 처리 또는 무처리하였으며, 감염 4일 후에 크리스털 바이올렛 (crystal violet)으로 생존 세포를 염색하여 생존율을 측정하였다. 바이러스에 의한 항암효과가 클수록 크리스털 바이올렛으로 염색되는 생존 세포의 수가 감소한다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 일부 피부암 세포주에서 야생형 레오바이러스를 10 MOI 이상으로 처리하였을 때 암세포 생존 정도가 감소하였으나, RP116는 대부분의 암세포주에서 0.1 MOI의 낮은 농도에서도 더욱 확연한 암세포 사멸 효과를 나타냈으며, 10 MOI 이상의 농도에서는 대부분의 암세포가 사멸하였다. 상기 실험 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 피부암에 대해 야생형 레오바이러스보다 강력한 항암효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 6. 변형 레오바이러스의 구강암에 대한 항암효과 확인
이어서, 구강암에 대한 야생형 레오바이러스 및 변형 레오바이러스 RP116의 항암효과를 비교하였다.
다양한 구강암 세포주 (YD-10B, YD15M, 및 YD15 세포주)에 바이러스를 무처리 하거나 (Mock), 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 다양한 농도로 처리하여 감염시킨 후, CPE 분석을 실시하였다. 앞선 실시예와 마찬가지로, 각 암세주를 24웰-플레이트에 동일한 수로 씨딩하고 바이러스를 처리 또는 무처리하였으며, 감염 4일 후에 크리스털 바이올렛로 생존 세포를 염색하여 생존율을 측정하였다.
그 결과, 동일한 농도를 처리하였을 때 야생형 레오바이러스에 비해 RP116를 처리한 군에서 암세포 생존 정도가 더욱 감소한 것으로 나타났다 (도 4). 특히, 야생형 레오바이러스는 100 MOI의 고농도로 처리한 경우에도 생존한 암세포가 존재하였으나, RP116은 10 MOI 농도로 처리하였을 때에도 암세포가 거의 전멸한 것으로 나타났다. 상기 실험 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 구강암에 대해서도 야생형 레오바이러스보다 강력한 항암효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 7. 변형 레오바이러스의 방광암에 대한 항암효과 확인
다음으로 방광암에 대한 야생형 레오바이러스 및 변형 레오바이러스 RP116의 항암효과를 비교하였다.
다양한 방광암 세포주 (HT-1376, 5637, 253J, 및 T24 세포주)를 각각 배양한 후 96웰 플레이트에 2,000 cells/well의 농도로 씨딩한 후 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 준비한 세포에 야생형 레오바이러스 또는 RP116을 3배 연속 희석하여 0.1 내지 10,000 MOI의 농도로 처리하고 추가로 3일 동안 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양한 후 WST 분석으로 생존 세포수를 측정하였다. 측정 결과로서 IC50 값은 Prism GraphPad 9.1.0 버전의 비선형회귀를 사용하여 계산하였다.
그 결과, 대부분의 방광암 세포주에서 야생형 레오바이러스에 비해 RP116의 IC50 값이 더욱 낮은 것으로 나타났다 (도 5). 상기 실험 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 방광암에 대해서도 야생형 레오바이러스보다 강력한 항암효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 8. 변형 레오바이러스의 투여경로 및 투여용량에 따른 항암효과 확인
다양한 종류의 암세포에 대해 RP166이 뛰어난 항암효과를 갖는 것을 확인한 바, 피부암 동물모델을 이용하여 투여경로 및 투여용량에 따라 RP116의 항암효과가 달라지는지 확인하였다.
실험에 사용된 동물은 6주령의 암컷 C57BL/6 마우스로 나라 바이오텍 (Nara Biotech., 서울, 대한민국)으로부터 구입하였다. 마우스는 동물실험실에서 7일간의 적응기간 후 실험을 진행하였으며, 적응기간 동안 물과 사료를 제한하지 않았다. 실험동물에 표준화된 환경을 제공하였으며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 유지하였고, 실내온도 (23±2℃)를 적정 수준으로 유지시켰다. 1×105 개의 흑색종 세포주 B16F10을 100 μL 마트리젤 (Corning) 및 인산완충용액 (PBS)과 1:1 비율로 현탁하여 상기 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사로 이식하였다. 종양 부피가 약 80 mm3 이상에 도달하였을 때 RP116을 1×108 TCID50 또는 1×109 TCID50의 용량으로 종양 내 직접투여 (Intratumoral injection, IT) 하거나 정맥투여 (Intravenous Injection, IV) 하였다 (도 6a). 바이러스 투여 후 종양 크기를 캘리퍼로 일주일에 2 내지 3회 측정하였으며, 종양 부피가 2,000 mm3을 초과할 때 마우스를 안락사시켰다. 종양의 길이와 너비를 측정한 값으로 부피는 다음과 같이 계산하였다: 부피=길이×너비×너비×0.5.
시간에 따른 종양 부피 변화를 측정한 결과, RB116을 IT 투여한 마우스 모델과 IV 투여한 마우스 모델 모두 무처리 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였으며, 바이러스 처리 용량에 비례한 종양 성장 억제효과가 있음을 확인하였다 (도 6b). 또한, 마우스 모델의 바이러스 투여 후 체중을 비교한 결과, RB116를 종양 내 투여한 그룹과 정맥투여한 그룹 모두 시간에 따른 체중 변화가 없었으며, 무처리 대조군과도 차이가 없는 것으로 나타난 바, 투여경로나 용량에 따른 독성이 없음을 확인하였다 (도 6c).
실시예 9. 변형 레오바이러스의 반복투여에 따른 항암효과 확인
앞선 실시예에서 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 종양 내 투여 및 정맥투여 모두에서 뛰어난 항암효과를 발휘하는 것을 확인하였으므로, 이어서 투여 횟수에 따른 변형 레오바이러스의 항암효과 변화가 있는지 확인하였다.
실시예 8과 동일한 마우스 종양모델을 제작하여 종양 부피가 약 80 mm3 이상에 도달하였을 때 RP116을 1×109 TCID50의 용량으로 2회 (0일, 1일), 또는 5회 (0일, 1일, 3일, 5일, 7일) IV 투여한 후, 시간에 따른 종양 부피 및 마우스 생존율을 확인하였다.
그 결과, RP116을 2회 투여한 그룹과 5회 투여한 그룹 모두 무처리 대조군과 비교하여 종양 성장을 크게 억제되었으며 생존율도 증가한 것으로 나타났다. 특히, RP116을 5회 투여한 그룹은 2회 투여 그룹과 비교하여 종양 성장을 더욱 지연시키고 생존율도 크게 향상시켰다 (도 7a 및 7b). 상기 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스를 다회 투여할수록 항암효과가 더욱 증진된다는 것을 시사한다. 한편, RP116을 2회 또는 5회 투여한 그룹 모두 시간에 따른 체중 변화가 없었으며, 무처리 대조군과도 차이가 없는 것으로 나타난 바, 반복 투여에 따른 독성이 없음을 확인할 수 있었다 (도 7c).
실시예 10. 변형 레오바이러스 및 면역항암제의 병용 효과 확인
앞선 실시예들을 통해 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 in vitro에서는 물론 in vivo에서도 우수한 항암효과를 가짐을 확인한 바, 이어서 변형 레오바이러스와 면역항암제의 병용 효과를 확인하였다.
그룹은 무처리 대조군, RP116 단독투여군, 및 RP116 및 면역항암제 병용투여군으로 나누어 실험을 진행하였다. 실시예 8과 동일한 마우스 종양모델을 제작하여 종양 부피가 약 80 mm3 이상에 도달하였을 때 RP116 및 면역항암제 투여를 시작하였다. 먼저 RP116을 1×108 TCID50의 용량으로 2회 (0일, 1일) IT 투여하였으며, 병용투여군은 이어서 11일차부터 면역관문 억제제인 항-PD-L1 항체 (Bioxcell, Cat# BE0101)를 10 mg/kg 용량으로 복강 내 투여하였다.
시간에 따른 종양 부피 및 마우스 생존율 변화를 측정하고, T 테스트/F 테스트로 P-value를 계산하여 유의성을 확인하였다. 그 결과, 무처리 대조군은 마우스에서 종양이 생성된 이후 지속적으로 성장하였으나, RP116을 투여함에 따라 종양 성장이 크게 억제되었으며, 항-PD-L1 항체를 투여함에 따라 종양 성장이 더욱 효과적으로 차단되었다 (도 8a). 마우스 생존율 역시, 무처리 대조군에 비해 RP116 단독투여군의 생존율이 크게 증가하였으며, RP116 및 항-PD-L1 항체 병용투여군은 바이러스 투여 후 40일이 경과했을 때에도 절반 이상의 마우스가 생존하였다 (도 8b).
실시예 11. 변형 레오바이러스의 구강암 마우스 모델에 대한 항암효과 확인
앞선 실시예를 통해 피부암 마우스 모델에 대한 RP116의 항암효과를 확인하였으므로, 구강암 마우스 모델을 제작하여 RP116의 항암효과를 추가 검증하였다.
마우스 모델은 실시예 8과 대체로 동일한 방법으로 제작하였으며, 다만 면역체계가 일부 결핍된 BALB/c 누드 마우스 모델에 구강암 세포주인 YD10B 세포주를 이식시켜 구강암 마우스 모델을 확립하였다. 종양 부피가 150 mm3에 도달하였을 때 RP116을 종양 내 직접투여하고, 시간에 따른 종양 부피 변화를 확인하였다.
그 결과, 무처리 대조군은 마우스에서 종양이 생성된 이후 지속적으로 성장하였으나, RP116을 투여한 그룹은 종양 성장이 억제되었으며, 무처리 대조군과 비교하여 유의하게 종양 크기가 작아진 것을 확인할 수 있었다 (도 9a). 아울러, 바이러스 투여 후 체중 변화를 측정한 결과 시간에 따른 체중 변화가 없었으며, 무처리 대조군과도 차이가 없는 것으로 나타난 바, RP116이 마우스에 대해 독성이 없음을 확인하였다 (도 9b). 상기 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 구강암 마우스 모델에서도 강력한 항암효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 12. 야생형 레오바이러스 및 변형 레오바이러스의 교차투여에 의한 항암효과 확인
항암 바이러스는 암 치료의 유용한 수단이 될 수 있으나, 항암 바이러스를 장기간 정맥투여하면 중화항체의 형성 등으로 인해 약효가 저하되는 문제가 있다. 이에, 본 발명자들은 변형 레오바이러스 RP116이 야생형 레오바이러스와 상이한 항원성을 나타냄에 착안하여, RP116과 야생형 레오바이러스의 교차투여시 레오 바이러스의 항암효과가 증진되는지 확인하였다.
실시예 8과 동일한 피부암 마우스 모델을 제작하였으며, 이식된 피부암 세포주로부터 종양이 생성되어 종양 부피가 50 mm3 이상에 도달하였을 때 4회 (0일, 1일, 7일, 8일)에 걸쳐 바이러스를 IV 투여하였다. 정확한 비교를 위해, 야생형 레오바이러스만 연속투여한 그룹 (WT/WT), 및 야생형 레오바이러스 투여 후 변형 레오바이러스를 투여한 그룹 (WT/RP116)을 비교하였으며, 변형 레오바이러스만 연속투여한 그룹 (RP116/RP116) 및 변형 레오바이러스 투여 후 야생형 레오바이러스를 투여한 그룹 (RP116/WT)을 비교하였다.
그 결과, 무처리 대조군과 비교하여 WT/WT 그룹의 종양 성장이 유의하게 감소하였으며, 교차투여군 (WT/RP116)에서는 종양 성장이 더욱 감소한 것으로 나타났다 (도 10a). 마찬가지로, 무처리 대조군과 비교하여 RP116/RP116 그룹에서 종양 성장이 크게 감소하였으며, 교차투여군 (RP116/WT)에서는 종양 성장이 더욱 효과적으로 지연된 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스와 야생형 레오바이러스의 교차치료 (RP116→WT, 또는 WT→RP116)시 레오바이러스에 의한 항암효과가 더욱 증진될 수 있음을 보여준다.
실시예 13. 변형 레오바이러스의 중화항체에 대한 내성 확인
상술한 바와 같이, 중화항체는 항암 바이러스의 항암효과를 저해하는 주요 원인이 된다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 효과적인 암 치료 수단이 될 수 있는지 검증하기 위해 변형 레오바이러스 RP116이 야생형 레오바이러스 또는 RP116의 투여로 유도된 중화항체에 대해 내성을 갖는지 확인하였다.
C57BL/6 마우스 모델에 1×108 PFU/ml의 용량으로 야생형 레오바이러스 (RC402) 또는 변형 레오바이러스 (RP116)을 4회 (0일, 2일, 4일, 7일)에 걸쳐 IV 투여하였으며, 14일이 경과하였을 때 각 마우스로부터 혈청을 분리하여 각 바이러스로부터 유도된 중화항체를 수득하였다. 이어서 L929 세포에 RC402 또는 RP116 바이러스와 함께 다양한 희석배수로 희석한 중화항체를 처리하고 WST-1을 처리하여 세포생존율 분석을 수행하였다 (도 11a). 실험군은 다음과 같이 나누었다: RC402 바이러스+RC402-유도 중화항체 처리군, RP116 바이러스+RC402-유도 중화항체 처리군, RC402 바이러스+RP116-유도 중화항체 처리군, RP116 바이러스+RP116-유도 중화항체 처리군.
그 결과, 야생형 레오바이러스 RC402로 유도된 중화항체의 중화 효과는 야생형 바이러스에 대해서는 729배까지 희석하여야 무시 가능한 수준으로 감소하는데 반해, 변형 바이러스 RP116에 대해서는 81배만 희석하여도 중화 효과가 완전히 사라지는 것으로 나타난 바, RP116 대한 중화 능력이 야생형 레오바이러스에 대한 중화 능력에 비해 약 9배 낮은 것으로 나타났다 (도 11b). 또한, RP116로 유도된 중화항체는 RC402 및 RP116 모두에 대해 유사한 희석배수인 243배 희석 조건에서 중화 효과가 완전히 사라지는 것으로 나타났다 (도 11c). 상기 결과는 본 발명에 따른 변형 레오바이러스가 중화항체에 대한 강력한 내성을 갖는다는 것을 보여준다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 흑색종, 설암 등의 희귀암을 포함한 다양한 암에 대해 특이적인 항암효과를 가진다는 것이 확인되었으며, 상기 항암효과는 야생형 레오바이러스보다 더욱 우수함이 확인되었다. 나아가 상기 변형 레오바이러스는 종양 내 투여는 물론 정맥투여시에도 동물모델에서의 종양 성장을 강력하게 억제한 바 암종류에 따라 자유로운 투여경로가 선택 가능하며, 반복투여 또는 야생형 레오바이러스의 교차투여를 통해 항암효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 변형 레오바이러스는 면역 항암제와 병용시 더욱 강력한 항암효과를 발휘하며, 항암 바이러스의 약점인 중화항체에 대해서도 높은 내성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 레오바이러스는 희귀암 등을 치료하기 위한 새로운 항암 요법 및 면역항암제의 병용 약물로 활용될 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> Virocure Inc.
<120> Novel modified Reovirus and the uses thereof
<130> MP20-264P1
<150> KR 10-2020-0180824
<151> 2020-12-22
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sigma-1
<400> 1
Met Asp Pro Arg Leu Arg Glu Glu Val Val Arg Leu Ile Ile Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ser Asp Asn Gly Val Ser Leu Ser Lys Gly Leu Glu Ser Arg Val
20 25 30
Ser Ala Leu Glu Lys Thr Ser Gln Ile His Ser Asp Thr Ile Leu Arg
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Leu Asp Asp Ala Asn Lys Arg Ile Ile Ala Leu Glu
50 55 60
Gln Ser Arg Asp Asp Leu Val Ala Ser Val Ser Asp Ala Gln Leu Ala
65 70 75 80
Ile Ser Arg Leu Glu Ser Ser Ile Gly Ala Leu Gln Thr Val Val Asn
85 90 95
Gly Leu Asp Ser Ser Val Thr Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Gln Leu
100 105 110
Glu Thr Gly Leu Ala Glu Leu Arg Val Asp His Asp Asn Leu Val Ala
115 120 125
Arg Val Asp Thr Ala Glu Arg Asn Ile Gly Ser Leu Thr Thr Glu Leu
130 135 140
Ser Thr Leu Thr Leu Arg Val Thr Ser Ile Gln Ala Asp Phe Glu Ser
145 150 155 160
Arg Ile Ser Thr Leu Glu Arg Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Ala Pro
165 170 175
Leu Ser Ile Arg Asn Asn Arg Met Thr Met Gly Leu Asn Asp Gly Leu
180 185 190
Xaa Leu Ser Gly Asn Asn Leu Ala Ile Arg Leu Pro Gly Asn Thr Gly
195 200 205
Leu Asn Ile Gln Asn Gly Gly Leu Gln Phe Arg Phe Asn Thr Asp Gln
210 215 220
Phe Gln Ile Val Asn Asn Asn Leu Thr Leu Lys Thr Thr Val Phe Asp
225 230 235 240
Ser Ile Asn Ser Arg Xaa Gly Ala Xaa Glu Gln Ser Xaa Val Ala Ser
245 250 255
Ala Val Thr Pro Leu Arg Leu Asn Ser Ser Thr Lys Val Leu Asp Met
260 265 270
Leu Ile Asp Ser Ser Thr Leu Glu Ile Asn Ser Ser Gly Gln Leu Thr
275 280 285
Val Arg Ser Thr Ser Pro Asn Leu Arg Tyr Pro Ile Ala Asp Val Ser
290 295 300
Gly Gly Ile Gly Met Ser Pro Asn Tyr Arg Phe Arg Gln Ser Met Trp
305 310 315 320
Ile Gly Ile Val Ser Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Trp Arg Val Gln
325 330 335
Val Asn Ser Asp Ile Phe Ile Val Asp Asp Tyr Ile His Ile Cys Leu
340 345 350
Pro Ala Phe Asp Gly Phe Ser Ile Ala Asp Gly Gly Asp Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Phe Val Thr Gly Leu Leu Pro Pro Leu Leu Thr Gly Asp Thr Glu
370 375 380
Pro Ala Phe His Asn Asp Val Val Thr Tyr Gly Ala Gln Thr Val Ala
385 390 395 400
Ile Gly Leu Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gln Tyr Met Ser Lys Asn Leu
405 410 415
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690 695 700
Trp Ala Glu Ile Ile His Arg Tyr Trp Pro Asn Pro Ser Gln Ile Arg
705 710 715 720
Tyr Gly Ala Pro Asn Val Phe Gly Ser Ala Asn Leu Phe Thr Pro Pro
725 730 735
Glu Val Leu Leu Leu Pro Ile Asp His Gln Pro Ala Asn Val Thr Thr
740 745 750
Pro Thr Leu Asp Phe Thr Asn Glu Leu Thr Asn Trp Arg Ala Arg Val
755 760 765
Cys Glu Leu Met Lys Asn Leu Val Asp Asn Gln Arg Tyr Gln Pro Gly
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Trp Thr Gln Ser Leu Val Ser Ser Met Arg Gly Thr Leu Asp Lys Leu
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Lys Leu Ile Lys Ser Met Thr Pro Met Tyr Leu Gln Gln Leu Ala Pro
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Val Glu Leu Ala Val Ile Ala Pro Met Leu Pro Phe Pro Pro Phe Gln
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Ala Ile Thr Val Ala Leu Leu Ser Gly Lys Tyr Pro Pro Asp Leu Val
885 890 895
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MuNS
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1 5 10 15
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675 680 685
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<213> Artificial Sequence
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Gly Asn Ser Pro Trp Gln Leu Thr Gln Phe Leu Asp Trp Ile Ser Leu
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Gly Arg Gly Leu Ala Thr Ser Ala Leu Val Pro Thr Ala Gly Ser Arg
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65 70 75 80
Arg Pro Asn His Arg Trp Gly Asp Ile Arg Phe Leu Arg Leu Val Trp
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100 105 110
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165 170 175
Gln Leu Leu Met Asn Tyr Phe Gly His Thr Phe Ala Glu Ile Ala Tyr
180 185 190
Thr Leu Cys Gln Ala Ser Ala Asn Arg Pro Trp Glu Tyr Asp Gly Thr
195 200 205
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Val Gly Val Ile His Gln Gln Asn Thr Tyr Arg Thr Phe Tyr Phe Gln
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Cys Asn Arg Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Trp Ile Leu Ser Cys Ser
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Leu Asn His Ser Ala Gln Ile Arg Pro Gly Asn Arg Ser Leu Phe Val
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Met Pro Thr Ser Pro Asp Trp Asn Met Asp Val Asn Leu Ile Leu Ser
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Asp Asn Asn Ser Val Pro Ala Val Ser Arg Asn Ile His Gly Trp Thr
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Gly Arg Ala Gly Asn Gln Leu His Gly Phe Gln Val Arg Arg Met Val
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Ala His Pro Asn Ser Thr Met Phe Arg Thr Lys Pro Phe Thr Asn Ala
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Leu Ile
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L2 segment
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aggagcattt gatgactggg agcgattcat gagagagaag ctgcgtgtgc taaagtatga 300
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catcgatcca aatactggta aggagtatct gagatctggg caatctgtcg catattttgg 1560
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cggtgtgcat caacactcat cacttacttg gacatctgga gtgtacttct tcttggtgga 2040
ccatttttat cgttatgaga ctttatctac gatctcacga caattgccgt cttttgggta 2100
tgttgatgat gggtcttccg tgactggtat cgagacaatt agtattgaga accctggctt 2160
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agacgagccg tactctgaca tggatgcgct ggagaaaata tgtcgtaccg cctggccaaa 2940
ctgctcaatt acctgggttc cattgtcata cgacttgcgg tggactagac tggcattatt 3000
agagtccacg acattgagta gcgcgtcgat tagaattgct gagctgatgt ataaatacat 3060
gcctattatg aggattgata ttcatggact acccatggaa aagcgaggta acttcatagt 3120
ggggcagaac tgctcattag taatccctgg ttttaatgcg caggatgtct ttaactgtta 3180
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tacgatcgcg ggaactgatg tcgatataac agttaatcct tattaccgtc tgatgacctt 3480
tgtaaggatc gatggacagt ggcagattgc caatccagac aaatttcaat tcttttcgtc 3540
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ctatatacga gatgtccagt ctcgagatgt tggcttttac attcagcatc cacttcaact 3660
tttgaatacg atcacattgc caaccaacga ggaccttttt ctgagcgcac ctgacatgcg 3720
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gctacctcaa gattgggatg tgttaacaga taccataagt tggtccccat cgatacccac 3840
atacattgtg ccaccgggtg attatacctt gactcctctg taactcactg tccctcgtga 3900
gcgcgcctaa ttcatc 3916
<210> 11
<211> 2203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M2 segment
<400> 11
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tcaacgtcac tggagatggc aatgtattta aaccatcagc tgaaacttca tctaccgctg 120
taccatcgtt aagcttatca cctggaatgc tgaatcccgg aggggtacca tggattgctg 180
ttggagatga gacatctgtg acttcaccag gcgcattacg tcgaatgacg tcaaaggaca 240
tcccggaaac ggcaataatc aacacagaca attcatcagg cgccgtgcca agcgaatcag 300
ccttggtgcc ctacatcgat gagccgctgg tagtggttac agagcatgct attaccaact 360
tcaccaaagc tgagatggca cttgaawtca atcgtgagtt ccttgacaag atgcgtgtgc 420
tgtcagtgtc accaaaatat tcggatcttc tgacctatgt tgactgctac gtcggtgtgt 480
ctgctcgtca ggctttaaac aattttcaga aacaagtgcc tgtgattaca cctactaggc 540
agacgatgta tgtcgactcg atacaagcgg ccttgaaagc tttagaaaag tgggagattg 600
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ggtatcccaa ggaagccgcc gtcgctttgg ctaaacgaaa cgggggaata caatggatgg 780
acgtatcaga aggcaccgtg atgaacgagg ctgtcaacgc tgttgcagct agtgcactgg 840
caccttcagc atcagcccca cccttagaag agaagtcaaa gttaaccgaa caagcgatgg 900
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tgtttgccat aycacctaaa ccagcagatt ataatgtgcg tactctgagg atcgacgagg 1020
ccacttggct gcgaatgatt ccaaaatcaa tgaacacacc ttttcaaatc caggtgactg 1080
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accaaatcgc tccgatgcgg tttgyattag atctaggggg aaagagttat aaagagacga 1200
gctgggatcc aaacggcaag aaggtcggat tcatcgtttt tcaatcgaag ataccattcg 1260
aactttggac tgctgcttca cagatcggtc aagccacggt ggttaactat gtccaactat 1320
acgctgaaga cagctcattt accgcgcagt ctatcattgc tactacctct ttggcttata 1380
actatgagcc tgagcagttg aataagactg accctgagat gaattattat cttttggcga 1440
cctttataga ctcagccgct ataacgccaa cgaatatgac acagcctgat gtttgggatg 1500
ccttgctgac gatgtcccca ctatcagctg gcgaggtgac agtgaagggt gcggtagtga 1560
gtgaagtagt ccctgcagac ttgataggta gctacactcc agaatcccta aacgcctcac 1620
ttccgaatga tgctgctaga tgcatgatcg atagagcttc gaagatagcc gaagcaatca 1680
agattgatga tgatgctgga ccagatgaat attccccaaa ctctgtacca attcaaggtc 1740
agcttgctat ctcgcaactc gaaactggat atggtgtgcg aatattcaac cctaaaggga 1800
tcctttctaa aattgcatct agggcaatgc aggctttcat tggtgacccg agcacaatca 1860
tcacgcaggc ggcgccagtg ttatcagaca agaataattg gattgcattg gcacagggag 1920
tgaaaactag tctgcgtact aaaagtctat cagcgggagt gaagactgca gtgagtaagc 1980
tgagctcatc tgagtctatc cagaattgga ctcaaggatt cttggataaa gtgtcagcgc 2040
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S4 segment
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L1 segment
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<223> L3 segment
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type Reovirus_L1
<400> 19
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attgagagca tttcaggtat cactgatcaa tcgaatgacg tgtttgaaga tgcagcaaaa 120
gcattctcta tgtttactcg cagcgatgtc tacaaggcgc tggatgaaat acctttctct 180
gatgatgcga tgcttccaat ccctccaact atatatacga aaccatctca cgattcatat 240
tattacattg atgctctaaa ccgtgtgcgt cgcaaaacat atcagggccc tgatgacgtg 300
tacgtaccta attgttctat tgttgaattg ctggagccac atgagactct gacatcttat 360
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gccacaacgt atggtagaat cgctgaatct caagctcgac agattaaggc tccattggag 480
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<211> 3901
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Wild-type Reovirus_L3
<400> 21
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ccttggtgcc ctacatcgat gagccgctgg tagtggttac agagcatgct attaccaact 360
tcaccaaagc tgagatggca cttgaawtca atcgtgagtt ccttgacaag atgcgtgtgc 420
tgtcagtgtc accaaaatat tcggatcttc tgacctatgt tgactgctac gtcggtgtgt 480
ctgctcgtca ggctttaaac aattttcaga aacaagtgcc tgtgattaca cctactaggc 540
agacgatgta tgtcgactcg atacaagcgg ccttgaaagc tttagaaaag tgggagattg 600
atctgagagt ggctcaaacg ttgctgccta cgaacgttcc gattggagaa gtctcttgtc 660
caatgcagtc ggtagtgaaa ctgctggatg atcagctgcc agatgacagc ctgatacgga 720
ggtatcccaa ggaagccgcc gtcgctttgg ctaaacgaaa cgggggaata caatggatgg 780
acgtatcaga aggcaccgtg atgaacgagg ctgtcaacgc tgttgcagct agtgcactgg 840
caccttcagc atcagcccca cccttagaag agaagtcaaa gttaaccgaa caagcgatgg 900
atctcgtgac cgcggctgag cctgagataa ttgcctcact cgygccagtt cccgcacccg 960
tgtttgccat aycacctaaa ccagcagatt ataatgtgcg tactctgagg atcgacgagg 1020
ccacttggct gcgaatgatt ccaaaatcaa tgaacacacc ttttcaaatc caggtgactg 1080
ataacacagg aactaattgg catctcaatt tgaggggggg gactcgtgta gtgaatctgg 1140
accaaatcgc tccgatgcgg tttgyattag atctaggggg aaagagttat aaagagacga 1200
gctgggatcc aaacggcaag aaggtcggat tcatcgtttt tcaatcgaag ataccattcg 1260
aactttggac tgctgcttca cagatcggtc aagccacggt ggttaactat gtccaactat 1320
acgctgaaga cagctcattt accgcgcagt ctatcattgc tactacctct ttggcttata 1380
actatgagcc tgagcagttg aataagactg accctgagat gaattattat cttttggcga 1440
cctttataga ctcagccgct ataacgccaa cgaatatgac acagcctgat gtttgggatg 1500
ccttgctgac gatgtcccca ctatcagctg gcgaggtgac agtgaagggt gcggtagtga 1560
gtgaagtagt ccctgcagac ttgataggta gctacactcc agaatcccta aacgcctcac 1620
ttccgaatga tgctgctaga tgcatgatcg atagagcttc gaagatagcc gaagcaatca 1680
agattgatga tgatgctgga ccagatgaat attccccaaa ctctgtacca attcaaggtc 1740
agcttgctat ctcgcaactc gaaactggat atggtgtgcg aatattcaac cctaaaggga 1800
tcctttctaa aattgcatct agggcaatgc aggctttcat tggtgacccg agcacaatca 1860
tcacgcaggc ggcgccagtg ttatcagaca agaataattg gattgcattg gcacagggag 1920
tgaaaactag tctgcgtact aaaagtctat cagcgggagt gaagactgca gtgagtaagc 1980
tgagctcatc tgagtctatc cagaattgga ctcaaggatt cttggataaa gtgtcagcgc 2040
attttccagc accaaagccc gattgtccga ctagcggaga tagtggtgaa tcgtctaatc 2100
gccgagtgaa gcgcgactca tacgcaggag tggtcaaacg tgggtacaca cgttaggccg 2160
ctcgccctgg tgacgcgggg ttaagggatg caggcaaatc atc 2203
<210> 24
<211> 2241
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type Reovirus_M3
<400> 24
gctaaagtga ccgtggtcat ggcttcattc aagggattct ccgccaacac tgttccagtt 60
tctaaggcca agcgtgacat atcatctctt gccgctactc ctggacttcg ttcacaatcc 120
ttcactccgt ctgtggatat gtctcaatcg cgtgaattcc tcacaaaggc aattgagcaa 180
gggtccatgt ctatacctta tcagcatgtg aatgtaccga aagttgatcg taaagttgtt 240
agcctggtag tgcgaccttt ctcttcaggt gctttctcta tctctggagt gatttcgcca 300
gcccatgcct atctactaga gtgtctaccc cagcttgagc aggcgatggc ttttgttgct 360
tcacctgagt ctttccaggc ttccgacgtc gcgaagcgct ttgccataaa gccaggtatg 420
agcctccagg atgccatcac tgcctttatt aactttgtgt ccgcgatgct gaaaatgacg 480
gtgactcgtc aaaactttga cgttattgtg gctgagatcg agaggcttgc ttcaaccagc 540
gtgtccgtca ggactgaaga agcgaaggtt gctgatgagg agctaatgct attcgggtta 600
gatcatagag ggccacagca gctggatgtt tctgacgcta aagggataat gaaggctgct 660
gatattcaga caactcatga tgtccatttg gcaccaggcg ttggtaatat tgatcctgaa 720
atctataacg aggggcggtt catgttcatg cagcacaagc cacttgcggc ggatcaatcg 780
tatttcacct tggagactgc ggattatttc aagatttatc caacatacga tgaacatgat 840
ggcaggatgg ctgaccaaaa gcagtcggga ttgatactgt gtactaagga cgaggtattg 900
gctgagcaaa ctatatttaa actggacgcc cctgatgaca agactgttca tctgttggat 960
cgcgatgacg accacgttgt tgccagattt actaaggtat ttatagagga cgtggctccc 1020
gggcatcatg ctgctcaaag atcgggacaa cgctctgtgc ttgatgacct atatgcgaat 1080
acgcaagtga tttccattac ttctgctgct ttaaagtggg tggtcaagca cggcgtatct 1140
gatggaatcg tgaacaggaa gaatgtcaaa gtgtgtgttg gttttgaccc cctgtacacc 1200
ttgtctacac ataacggggt gtccttatgt gccctgctga tggacgaaaa actctctgtg 1260
ctgaacagtg cgtgtcgtat gacgttacgc tcactcatga agaccggacg cgacgttgat 1320
gcacacagag cttttcagcg agtcctctct caaggataca catcgctaat gtgctactat 1380
catccttcac ggaagttggc atatggtgag gtgctctttc tagaacgatc caatgacgtg 1440
acagatggga tcaagcttca gttggacgca tctagacagt gtcatgaatg tcctgtgttg 1500
cagcagaaag tggttgagtt agagaaacag attattatgc agaagtcaat ccagtcagac 1560
cctaccccag tggcgctgca accattgttg tctcagttgc gtgagttgtc tagtgaagtt 1620
actaggctac agatggagtt gagtcgagct cagtccctga atgctcagtt ggaggcggat 1680
gtcaagtcag ctcaatcatg tagcttggat atgtatctga gacaccacac ttgcattaat 1740
ggtcatgcta aagaagatga attgcttgac gctgtgcgtg tcgcgccgga tgtgaggaga 1800
gaaatcatgg aaaagaggag tgaagtgaga caaggttggt gcgaacgtat ttctaaggaa 1860
gcagctgcca aatgtcaaac tgttattgat gacctgactt tgatgaatgg aaagcaagca 1920
caagagataa cagaattacg tgattcggct gaaaaatatg agaaacagat tgcagagctg 1980
gtgagtacca tcacccaaaa ccagataacg tatcagcaag agctacaagc cttggtagcg 2040
aaaaatgtgg aattggacgc gttgaatcag cgtcaggcta agtctttgcg tattactccc 2100
tctcttctat cagccactcc tabcgattca gytgmtggtg ttgctgactt aattgatttc 2160
tctgttccaa ctgatgagtt gtaaataatc cgtgatgcag tgttgcccta atcccttaag 2220
ccttcccgac ccccattcat c 2241
<210> 25
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type Reovirus_S1
<400> 25
gctattggtc ggatggatcc tcgcctacgt gaagaagtag tacggctgat aatcgcatta 60
acgagtgata atggagtatc actgtcaaaa gggcttgaat caagggtctc ggcgctcgag 120
aagacgtctc aaatacactc tgatactatc ctccggatca cccagggact cgatgatgca 180
aacaaacgaa tcatcgctct tgagcaaagt cgggatgact tggttgcatc agtcagtgat 240
gctcaacttg caatctccag attggaaagc tctatcggag ccctccaaac agttgtcaat 300
ggacttgatt cgagtgttac ccagttgggt gctcgagtgg gacaacttga gacaggactt 360
gcagagctac gcgttgatca cgacaatctc gttgcgagag tggatactgc agaacgtaac 420
attggatcat tgaccactga gctatcaact ctgacgttac gagtaacatc catacaagcg 480
gatttcgaat ctaggatatc cacattagag cgcacggcgg tcactagcgc gggagctccc 540
ctctcaatcc gtaataaccg tatgaccatg ggattaaatg atggactcay gttgtcaggg 600
aataatctcg ccatccgatt gccaggaaat acgggtctga atattcaaaa tggtggactt 660
cagtttcgat ttaatactga tcaattccag atagttaata ataacttgac tctcaagacg 720
actgtgtttg attctatcaa ctcaaggaba ggcgcaaytg agcaaagtkm cgtggcgtcg 780
gcagtgactc ccttgagatt aaacagtagc acgaaggtgc tggatatgct aatagacagt 840
tcaacacttg aaattaattc tagtggacag ctaactgtta gatcgacatc cccgaatttg 900
aggtatccga tagctgatgt tagcggcggt atcggaatga gtccaaatta taggtttagg 960
cagagcatgt ggataggaat tgtctcctat tctggtagtg ggctgaattg gagggtacag 1020
gtgaactccg acatttttat tgtagatgat tacatacata tatgtcttcc agcttttgac 1080
ggtttctcta tagctgacgg tggagatcta tcgttgaact ttgttaccgg attgttacca 1140
ccgttactta caggagacac tgagcccgct tttcataatg acgtggtcac atatggagca 1200
cagactgtag ctatagggtt gtcgtcgggt ggtgcgcctc agtatatgag taagaatctg 1260
tgggtggagc agtggcagga tggagtactt cggttacgtg ttgagggggg tggctcaatt 1320
acgcactcaa acagtaagtg gcctgccatg accgtttcgt acccgcgtag tttcacgtga 1380
ggatcagacc accccgcggc actggggcat ttcatc 1416
<210> 26
<211> 1331
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type Reovirus_S2
<400> 26
gctattcgct ggtcagttat ggctcgcgct gcgttcctat tcaagactgt tgggtttggt 60
ggtctgcaaa atgtgccaat taacgacgaa ctatcttcac atctactccg agctggtaat 120
tcaccatggc agttaacaca gtttttagac tggataagcc ttgggagggg tttagctaca 180
tcggctctcg ttccgacggc tgggtcaaga tactatcaaa tgagttgcct tctaagtggc 240
actctccaga ttccgttccg tcctaaccac cgatggggag acattaggtt cttacgctta 300
gtgtggtcag ctcctactct cgatggatta gtcgtagctc caccacaagt tttggctcag 360
cccgctttgc aagcacaggc agatcgagtg tacgactgcg atgattatcc atttctagcg 420
cgtgatccaa gattcaaaca tcgggtgtat cagcaattga gtgctgtaac tctacttaac 480
ttgacaggtt ttggcccgat ttcctacgtt cgagtggatg aagatatgtg gagtggagat 540
gtgaaccagc ttctcatgaa ctatttcggg cacacgtttg cagagattgc atacacattg 600
tgtcaagcct cggctaatag gccttgggaa tatgacggta catatgctag gatgactcag 660
attgtgttat ccttgttctg gctatcgtat gtcggtgtaa ttcatcagca gaatacgtat 720
cggacattct attttcagtg taatcggcga ggtgacgccg ctgaggtgtg gattctttct 780
tgttcgttga accattccgc acaaattaga ccgggtaatc gtagcttatt cgttatgcca 840
actagcccag attggaacat ggacgtcaat ttgatcctga gttcaacgtt gacggggtgt 900
ttgtgttcgg gttcacagct gccactgatt gacaataatt cagtacctgc agtgtcgcgt 960
aacatccatg gctggactgg tagagctggt aaccaattgc atgggttcca ggtgagacga 1020
atggtgactg aattttgtga caggttgaga cgcgatggtg tcatgaccca agctcagcag 1080
aatcaagttg aagcgttggc agatcagact caacagttta agagggacaa gctcgaaacg 1140
tgggcgagag aagacgatca atataatcag gctcatccca actccacaat gttccgtacg 1200
aaaccattta cgaatgcgca atggggacga ggtaatacgg gggcgactag tgccgcgatt 1260
gcagccctta tctgatcgtc ttggagtgag ggggtccccc cacacccctc acgactgacc 1320
acacattcat c 1331
<210> 27
<211> 1198
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type Reovirus_S3
<400> 27
gctaaagtca cgcctgtcgt cgtcactatg gcttcctcac tcagagctgc gatctccaag 60
atcaagaggg atgacgtcgg tcagcaagtt tgtcctaatt atgtcatgct gcggtcctct 120
gtcacaacaa aggtggtacg aaatgtggtt gagtatcaaa ttcgtacggg cggattcttt 180
tcgtgcttag ctatgctaag gccactccag tacgctaagc gtgagcgttt gcttggtcag 240
aggaatctgg aacgtatatc gactagggat atccttcaga ctcgtgattt acactcacta 300
tgtatgccaa ctcctgatgc gccaatgtct aatcatcaag catccaccat gagagagctg 360
atttgcagtt acttcaaggt cgatcatgcg gatgggttga aatatatacc catggatgag 420
agatactctc cgtcatcact tgccagattg tttaccatgg gcatggctgg gctgcacatt 480
accactgagc catcttataa gcgtgttccg attatgcact tagctgcgga cttggactgt 540
atgacgctgg ctctacctta catgattacg cttgatggtg atactgtggt tcctgtcgct 600
ccaacactgt cagcggaaca gcttctggac gacggactca aaggattagc atgcatggat 660
atctcctatg gatgtgaggt ggacgcgaat agccggccgg ctggtgatca gagtatggac 720
tcttcacgct gcatcaacga gttgtattgc gaggagacag cagaagccat ctgtgtgctt 780
aagacatgcc ttgtgttaaa ttgcatgcag tttaaacttg agatggatga cctagcacat 840
aacgctgctg agctggacaa gatacagatg atgataccct tcagtgagcg tgtttttagg 900
atggcctcgt cctttgcgac tattgatgcc cagtgtttta ggttttgcgt gatgatgaag 960
gataaaaatc tgaaaataga tatgcgtgaa acgacgagac tgtggactcg ttcagcatca 1020
gatgattctg tggccacgtc atctttaagt atttccctgg accggggtcg atgggtggcg 1080
gctgacgcca gtgatgctag actgctggtt tttccgattc gcgtgtaatg ggtgagtgag 1140
ctgatgtggt cgccaagaca tgtgccggtg tcttggtggt gggtgacgcc taatcatc 1198
<210> 28
<211> 1196
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type Reovirus_S4
<400> 28
gctatttttg cctcttccca gacgttgtcg caatggaggt gtgcttgccc aacggtcatc 60
aggtcgtgga cttgattaac aacgcttttg aaggtcgtgt atcaatctac agcgcgcaag 120
agggatggga caaaacaatc tcagcacagc cagatatgat ggtatgtggt ggcgccgtcg 180
tttgcatgca ttgtctaggt gttgttggat ctctacaacg caagctgaag catttgcctc 240
accatagatg taatcaacag atccgtcatc aggattacgt cgatgtacag ttcgcagacc 300
gtgttactgc tcactggaag cggggtatgc tgtccttcgt tgcgcagatg cacgagatga 360
tgaatgacgt gtcgccagat gacctggatc gtgtgcgtac tgagggaggt tcactagtgg 420
agctgaacyg gcttcaggtt gacccaaatt caatgtttag atcaatacac tcaagttgga 480
cagatccttt gcaggtggtg gacgaccttg acactaagct ggatcagtac tggacagcct 540
taaacctgat gatcgactca tccgacttga tacccaactt tatgatgaga gacccatcac 600
acgcgttcaa tggtgtgaaa ctggrgggag atgctcgtca aacccaattc tccaggactt 660
ttgattcgag atcgagtttg gaatggggtg tgatggttta tgattactct gagctggagc 720
atgatccatc gaagggccgt gcttacagaa aggaattggt gacgccagct cgagatttcg 780
gtcactttgg attatcccat tattctaggg cgactacccc aatccttgga aagatgccgg 840
ccgtattctc aggaatgttg actgggaact gtaaaatgta tccattcatt aaaggaacgg 900
ctaagctgaa gacagtgcgc aagctagtgg aggcagtcaa tcatgcttgg ggtgtcgaga 960
agattagata tgctcttggg ccaggtggca tgacgggatg gtacaatagg actatgcaac 1020
aggcccccat tgtgctaact cctgctgctc tcacaatgtt cccagatacc atcaagtttg 1080
gggatttgaa ttrtccagtg aygattggcg atccgatgat tcttggctaa acacccccat 1140
cttcacagcg ccgggcttga ccaacctggt gtgacgtggg acaggcttca ttcatc 1196
Claims (21)
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서 251번 내지 455번 아미노산이 결실되고;
서열번호 2의 아미노산 서열에서 963번째 Met이 Val로 치환된 돌연변이 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1265번째 Thr이 Ile로 치환된 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형 레오바이러스.
- 제1항에 있어서,
상기 변형 레오바이러스는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 227번째 Ile가 Val로 치환된 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형 레오바이러스.
- 제1항에 있어서,
상기 변형 레오바이러스는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형 레오바이러스:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 73번째 Glu가 Asp로 치환됨;
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 434번째 Asp가 Asn로 치환됨; 및
(c) 서열번호 3의 아미노산 서열에서 644번째 Val이 Ala로 치환됨.
- 제1항에 있어서,
상기 변형 레오바이러스는 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형 레오바이러스:
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 64번째 Lys가 Glu로 치환됨;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 177번째 Ser가 Phe로 치환됨;
(c) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 229번째 Glu가 Asp로 치환됨; 및
(d) 서열번호 4의 아미노산 서열에서 251번째 His가 Leu로 치환됨.
- 제1항에 있어서,
상기 변형 레오바이러스는 야생형 인간 레오바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 변형 레오바이러스.
- 제1항의 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 암은 편평상피세포암, 신경교종, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 안암, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 골육종, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 구강암, 설암, 뇌암, 및 기질 종양으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 암은 탁산계 항암제에 대한 내성이 있는 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 탁산계 항암제는 파클리탁셀, 라로탁셀, 카바지탁셀, 도세탁셀, 오르타탁셀, 및 테세탁셀로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 변형 레오바이러스는 상기 조성물 내에 1×105 내지 1×1020 TCID50의 용량으로 포함된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 종양 내 직접투여용 또는 정맥투여용인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 2회 이상 반복투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 야생형 레오바이러스와 교차투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 조성물은 야생형 레오바이러스의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 면역관문 억제제를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 면역관문 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, OX40 억제제, CTLA-4 억제제, 4-1BB 억제제, LAG-3 억제제, B7-H4 억제제, HVEM 억제제, TIM4 억제제, GAL9 억제제, VISTA 억제제, KIR 억제제, TIGIT 억제제, 및 BTLA 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제가 혼합된 혼합제 형태인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 조성물은 상기 변형 레오바이러스 및 면역관문 억제제가 각각 제제화되어 동시에 또는 순차적으로 투여되는 형태인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트.
- 제1항의 변형 레오바이러스를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제 병용투여용 약학적 조성물.
- 제20항에 있어서,
상기 조성물은 면역관문 억제제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 병용투여용 약학적 조성물.
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Citations (1)
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KR20080084528A (ko) | 2007-03-15 | 2008-09-19 | 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. | 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료 |
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2021
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080084528A (ko) | 2007-03-15 | 2008-09-19 | 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. | 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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