JP2024500164A - 新規な改変レオウイルス及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、改変レオウイルス及びその用途に関し、野生型レオウイルスから誘導した新規な改変レオウイルスが希少がんを含む様々ながんに対して優れた抗がん効果を有するだけでなく、免疫抗がん剤の効果を増進させることができることを確認して完成した。具体的には、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、舌がんなどの希少がんを含む様々な種類のがん細胞に処理された場合、すべてのがん細胞株の生存率を著しく減少させ、特にタキサン系抗がん剤-耐性がん細胞株に対しても優れた抗がん効果を有することが確認された。また、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、膀胱がん、及び口腔がんマウスモデルにおいても投与経路にかかわらず用量依存的な抗がん効果を発揮し、繰り返し投与するか、または野生型レオウイルスとの交差投与時の抗がん効果がさらに増加することが示された。特に、本発明による改変レオウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤と併用するとシナジー抗がん効果を引き起こすことが確認された。したがって、本発明による改変レオウイルスは、希少がんなどを治療するための新しい抗がん療法であり、免疫抗がん剤の併用薬物として有用に活用されるものと期待される。【選択図】図3
Description
本発明は、新規な改変レオウイルス及びその用途に関する。
本出願は、2020年12月22日付で出願された韓国特許出願第10-2020-0180824号、及び2021年12月22日付で出願された韓国特許出願第10-2021-0184947号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
がんの早期診断法の開発及び新しい抗がん療法の持続的な開発によってがんの治療効果が向上しているにもかかわらず、がんは現在までも全世界の主要な死亡原因である。2015年、大韓民国の総死亡数275,895人のうち27.9%ががんで死亡し、大韓民国の死亡原因1位を記録し、がん発生率と死亡率は、持続的に増加する様相を見せている。
希少がんは有病人口が2万人以下であるか、または早期診断が難しく、正確な有病人口が分からないがんで、大韓民国保健福祉部令で定めた手続きと基準に従って定めている(希少疾患管理法、施行2019.4.30)。大韓民国は、血液がんなど希少がんが全がん発生の16%を占めており、現在、ほとんどの新薬開発は、患者数が多い10代がん種に集中しているため、希少がんに対する新薬開発の事例は、微々たるものであるのが実状である。希少がんの場合、治療のための抗がん剤やガイドラインがよく確立されておらず、初期診断が難しく、ほとんどが既に転移が発生したステージ3以上で発見され、それによって治療効果も低いという問題がある。
代表的な皮膚発生希少がん腫である舌がん及び悪性黒色腫は、治療過程中に皮膚潰瘍と顔面醜形などを起こし、患者の生活の質を落とし、ひどい場合、うつ病や自殺などの合併症まで発生しうる。舌がん(tongue cancer)は、口の中の舌で発生する代表的な口腔がんの一種である。口腔がんの90%以上が口の中の粘膜を構成する扁平上皮細胞で発生する悪性腫瘍に該当する。全体のがん患者の0.2%以下の希少がんである舌がんの特性上、咀嚼運動能力の減少、顔貌醜形変形などの後遺症が残ることがあり、治療時期を逃すと発病後5年以内の死亡率が約44%に達するなど、非常に危険ながんに属する。
現在、開発途上国の舌がんなどを含む口腔がんの発生率は、13%程度と非常に高い方であり、Moresなどの研究によると、米国の場合、舌、口、咽喉、その他の口腔がんなどが1998年に約30,300件が発生し、8,000人程度が死亡したことが知られている(Oral Oncol.1999 Jan;35(1):1-8)。がんの発生傾向は多様であり、東部と中央ヨーロッパなどでも増加する傾向を示している。MariaとSusanの研究では、1998年までに人口10万人あたり8.3人が口腔がんにかかり、95%以上が40歳以上で発生し、1975年から1998年まで男性の方が口腔がんがより多く発生し、黒人における発生頻度がより高いことが報告されている(Oral Oncol.2002 Sep;38(6):610-7)。大韓民国の場合、舌がんを含む口腔がんは、年3,000人内外の患者が発生すると報告されている。
黒色腫の発病原因は、正確には明らかになっていないが、遺伝的要因だけでなく紫外線露出などの環境的要因が複合的に作用することが知られている。黒色腫の家族歴は、全患者の10~15%を占め、同じ世代に患者がいる場合、危険度は2倍になる。環境的要因の中で紫外線、特に紫外線Bが黒色腫の発生に関連しており、皮膚に色素性母斑が多いか、または非定型的母斑を有している場合、黒色腫の発生頻度が増加することが知られている。
一方、抗がんウイルス(oncolytic virus)は、自ら複製が可能であり、正常細胞ではないがん細胞にのみ選択的に感染、増殖及び殺傷を誘導するウイルスで、今後の抗がん剤市場を変化させる第4世代抗がん剤として台頭している。抗がんウイルスによる腫瘍細胞の破壊は、周囲の腫瘍細胞の感染を再誘導し、この現象が繰り返されて抗がん効果が増幅され得るという長所がある。特に、抗がんウイルスは、直接がん細胞を攻撃するほか、腫瘍の血管内皮細胞内の感染を通じて新生血管の生成を抑制する機能もある。抗がんウイルス免疫治療剤は、開発及び生産技術の難易度が非常に大きく、進入障壁が大きい。したがって、実際の臨床に適用できる抗がんウイルスの開発は、未だに不十分な状況であり、特に希少がんを効果的にターゲットとする抗がんウイルスは発掘されていない。
本発明は、前記問題点を解決するために案出されたもので、野生型レオウイルスから誘導された新規な改変レオウイルスが希少がんを含む様々ながんに対して優れた抗がん効果を有するだけでなく、免疫抗がん剤の効果を増進させることができることを確認して完成されたものである。
したがって、本発明の目的は、野生型レオウイルスに抵抗性を示すがんにおいて抗がん効果を有する改変レオウイルスを提供することである。
本発明の他の目的は、前記改変レオウイルスを有効成分として含むがんの予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記改変レオウイルスを有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤併用投与用の薬学的組成物を提供することである。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、以下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が明確に理解できるだろう。
本発明は、配列番号1のアミノ酸配列において251番~455番のアミノ酸が欠失して;配列番号2のアミノ酸配列において963番目のMetがValに置換された突然変異及び配列番号2のアミノ酸配列において1265番目のThrがIleに置換された突然変異からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異を含むことを特徴とする、改変レオウイルスを提供する。
本発明の一具現例において、前記改変レオウイルスは、配列番号1のアミノ酸配列において227番目のIleがValに置換された突然変異をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記改変レオウイルスは、下記からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
(a)配列番号3のアミノ酸配列において73番目のGluがAspに置換される;
(b)配列番号3のアミノ酸配列において434番目のAspがAsnに置換される;
(c)配列番号3のアミノ酸配列において644番目のValがAlaに置換される。
(a)配列番号3のアミノ酸配列において73番目のGluがAspに置換される;
(b)配列番号3のアミノ酸配列において434番目のAspがAsnに置換される;
(c)配列番号3のアミノ酸配列において644番目のValがAlaに置換される。
本発明のさらに他の具現例において、前記改変レオウイルスは、下記からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない:
(a)配列番号4のアミノ酸配列において64番目のLysがGluに置換される;
(b)配列番号4のアミノ酸配列において177番目のSerがPheに置換される;
(c)配列番号4のアミノ酸配列において229番目のGluがAspに置換される;
(d)配列番号4のアミノ酸配列において251番目のHisがLeuに置換される。
(a)配列番号4のアミノ酸配列において64番目のLysがGluに置換される;
(b)配列番号4のアミノ酸配列において177番目のSerがPheに置換される;
(c)配列番号4のアミノ酸配列において229番目のGluがAspに置換される;
(d)配列番号4のアミノ酸配列において251番目のHisがLeuに置換される。
本発明の一具現例において、前記改変レオウイルスは、野生型ヒトレオウイルスに由来するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、前記改変レオウイルスを有効成分として含むがんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記改変レオウイルスをそれを必要とする個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記改変レオウイルスのがんの予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、がん治療用薬物の製造のための前記改変レオウイルスの用途を提供する。
また、本発明は、本発明による組成物を含むがんの予防または治療用キットを提供する。
本発明の一具現例において、前記がんは、扁平上皮細胞がん、神経膠腫、肺がん、肺腺がん、腹膜がん、皮膚がん、眼がん、直腸がん、肛門付近のがん、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟部組織肉腫、尿道がん、血液がん、肝臓がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、頭頸部がん、口腔がん、舌がん、脳がん、及び基質腫瘍からなる群から選ばれる1つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記がんは、タキサン系抗がん剤に対する耐性のあるがんであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記タキサン系抗がん剤は、パクリタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、ドセタキセル、オルタタキセル、及びテセタキセルからなる群から選ばれる1つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記改変レオウイルスは、前記組成物内に1×105~1×1020TCID50の用量で含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、腫瘍内直接投与用または静脈投与用であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、それを必要とする個体に2回以上繰り返し投与されてもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、野生型レオウイルスと交差投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、野生型レオウイルスの投与前または投与後に投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤を有効成分としてさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、PD-L2阻害剤、OX40阻害剤、CTLA-4阻害剤、4-1BB阻害剤、LAG-3阻害剤、B7-H4阻害剤、HVEM阻害剤、TIM4阻害剤、GAL9阻害剤、VISTA阻害剤、KIR阻害剤、TIGIT阻害剤、及びBTLA阻害剤からなる群から選ばれる1つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤が混合された混合剤の形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤がそれぞれ製剤化されて同時にまたは順次に投与される形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、前記改変レオウイルスを有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤併用投与用の薬学的組成物を提供する。
本発明の一具現例において、前記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と同時に、別々に、または順次に投与されてもよいが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤の両方を含む組成物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記改変レオウイルスの免疫チェックポイント阻害剤との併用投与用途を提供する。
また、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤併用の投与用薬剤の製造のための前記改変レオウイルスの用途を提供する。
本発明は、改変レオウイルス及びその用途に関し、野生型レオウイルスから誘導した新規な改変レオウイルスが希少がんを含む様々ながんに対して優れた抗がん効果を有するだけでなく、免疫抗がん剤の効果を増進させることができることを確認して完成した。具体的には、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、舌がんなどの希少がんを含む様々な種類のがん細胞に処理された場合、すべてのがん細胞株の生存率を著しく減少させ、特にタキサン系抗がん剤-耐性がん細胞株に対しても優れた抗がん効果を有することが確認された。さらに、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、膀胱がん、及び口腔がんマウスモデルにおいても投与経路にかかわらず用量依存的な抗がん効果を発揮し、繰り返し投与するか、または野生型レオウイルスとの交差投与時の抗がん効果がさらに増加することが示された。特に、本発明による改変レオウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤と併用すると相乗的な抗がん効果を引き起こすことが確認された。したがって、本発明による改変レオウイルスは、希少がんなどを治療するための新しい抗がん療法であり、免疫抗がん剤の併用薬物として有用に活用されるものと期待される。
本発明は、改変レオウイルス及びその用途に関し、野生型レオウイルスから誘導した新規な改変レオウイルスが希少がんを含む様々ながんに対して優れた抗がん効果を有するだけでなく、免疫抗がん剤の効果を増進させることができることを確認して完成した。
具体的には、本発明の一実施例では、改変レオウイルス(RP116)を製造してその分子生物学的特性を確認した(実施例1及び2)。
本発明の他の実施例では、正常細胞及びタキサン系抗がん剤であるパクリタキセル(Paclitaxel)に耐性のあるがん細胞株のそれぞれにRP116を処理した後、細胞生存率を観察した結果、本発明による改変レオウイルスが正常細胞については毒性がなく、タキサン系抗がん剤抵抗性がん細胞に対して特異的な抗がん効果を発揮することを確認した(実施例3)。
本発明のさらに他の実施例では、希少がんを含む様々ながん細胞株にRP116を処理して細胞生存率を観察した結果、本発明による改変レオウイルスが様々な種類のがんに対して用量依存的な抗がん効果を発揮することを確認した(実施例4)。
本発明のさらに他の実施例では、様々な皮膚がん細胞株、口腔がん細胞株、及び膀胱がん細胞株に野生型レオウイルス及びRP116をそれぞれ処理して細胞生存率を観察した結果、本発明による改変レオウイルスが野生型レオウイルスより強力な抗がん効果を有することを確認した(実施例5~7)。
本発明のさらに他の実施例では、RP116を皮膚がんマウスモデルに低用量または高用量で腫瘍内に直接投与または静脈投与した結果、本発明による改変レオウイルスが両方の投与経路において優れた抗がん効果を示し、前記抗がん効果は、ウイルス用量と相関関係があることを確認した(実施例8)。
本発明のさらに他の実施例では、皮膚がんマウスモデルにおいてRP116の投与回数による抗がん効果を比較した結果、本発明による改変レオウイルスを多数回投与するほど、抗がん効果がさらに増進されることを確認した(実施例9)。
本発明のさらに他の実施例では、皮膚がんマウスモデルにおいてRP116とともに免疫チェックポイント抑制剤を併用投与してその抗がん効果を確認した結果、本発明による改変レオウイルスがそれ自体としても優れた抗がん効果を発揮するだけでなく、免疫抗がん剤との併用時に相乗的な抗がん効果を発揮することを確認した(実施例10)。
本発明のさらに他の実施例では、口腔がんマウスモデルを作製してRP116を投与した結果、本発明による改変レオウイルスが口腔がんにおいても強力な腫瘍の成長抑制効果を有することを確認した(実施例11)。
本発明のさらに他の実施例では、皮膚がんマウスモデルを用いてRP116及び野生型レオウイルスの交差投与(RP116→WT、またはWT→RP116)時にウイルスの抗がん効果が増進されるかを確認した結果、同じ種類のウイルスを連続投与することに比べて本発明による改変レオウイルス及び野生型レオウイルスを交差投与すると、抗がん効果がさらに増進されることを確認した(実施例12)。
本発明のさらに他の実施例では、RP116または野生型レオウイルスに誘導された中和抗体に対するRP116の耐性を確認した結果、本発明による改変レオウイルスが2つの中和抗体の両方に対して強力な耐性を有することを確認した(実施例13)。
以上の実施例を通じて、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、舌がんなどの希少がんを含む様々ながんに対して特異的な抗がん効果を有することが確認されており、前記抗がん効果は、野生型レオウイルスよりさらに優れていることが確認された。さらに、前記改変レオウイルスは、腫瘍内投与はもちろん、静脈投与時にも動物モデルでの腫瘍の成長を強力に抑制したため、がんの種類に応じて自由な投与経路が選択可能であり、繰り返し投与または野生型レオウイルスの交差投与を通じて抗がん効果をさらに増進させることができる。さらに、前記改変レオウイルスは、免疫抗がん剤と併用すると、より強力な抗がん効果を発揮し、抗がんウイルスの弱点である中和抗体に対しても高い耐性を有することが示された。したがって、本発明による改変レオウイルスは、希少がんなどを治療するための新しい抗がん療法及び免疫抗がん剤の併用薬物として活用されるものと期待される。
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、野生型レオウイルスに抵抗性を示すがんにおいて抗がん効果を有する改変レオウイルスを提供する。前記改変レオウイルスは、シグマ-1タンパク質の抗原決定基の欠損に加えてウイルス粒子の外部カプシドを構成する構造タンパク質ラムダ-2などの配列変異をさらに含むことを特徴とする。
レオウイルス(respiratory enteric orphan virus, REO virus)は、二本鎖のRNA断片をゲノムとして有する、エンベロープのない(non-enveloped)20面体のウイルスである。レオウイルスは、健康な人間の消化器及び呼吸器からよく分離され、病原性のないバイロム(virome)であると考えられる。レオウイルスは、様々な形質転換(transformed)細胞を感染及び死滅させることができる腫瘍溶解性ウイルス(oncolytic virus)として知られている。すなわち、レオウイルスは、一般的な腫瘍溶解性ウイルスと同様に正常細胞には影響をほとんど及ぼさずに、がん細胞のみ特異的に感染させてその死滅を誘導できるので、副作用の問題が低いという長所があり、1次感染されたがん細胞で増殖した後、周辺及び遠く離れたがん細胞まで感染させることができ、広範囲な抗がん効果を引き起こすことができるという長所がある。
それにもかかわらず、野生型レオウイルスは、体内注入時に中和抗体などにより抗がん機能が弱くなる問題点があり、がん細胞の腫瘍微細環境などによりレオウイルスの抗がん機能が抑制されるおそれがある。さらに、レオウイルスががん細胞ではない正常細胞を感染させて宿主に異常を引き起こすという問題点も依然として存在する。本発明者らは、野生型レオウイルスの宿主毒性問題を解決するため、野生型シグマ1タンパク質(Sigma 1 protein)コーディング遺伝子の中間に未成熟終止コドンが存在して切断された(truncated)形態のシグマ1タンパク質を発現する弱毒化されたレオウイルス(attenuated reovirus,AV)を製造した。前記弱毒化されたレオウイルスは、野生型レオウイルスに比べて宿主に対する毒性がさらに減少したことが確認されたが、抗がん効果の面では、野生型レオウイルスに相応する程度の腫瘍溶解性を維持するに過ぎなかった。そこで、本発明者らは野生型レオウイルスに比べて正常細胞に対する毒性はさらに低く、より強力な抗がん効果を発揮できる改変レオウイルスについて研究を行った結果、本発明を完成した。すなわち、本発明による改変レオウイルスは、野生型レオウイルスに比べて正常細胞に対する毒性がなく、がん細胞はより強力に感染及び死滅させることができることを特徴とする。
したがって、本発明による改変レオウイルスは、S1セグメントがコーディングするポリペプチド(配列番号1;シグマ-1タンパク質)の251番~455番アミノ酸が欠失し、L2セグメントがコードするポリペプチド(配列番号2;ラムダ-2タンパク質)の963番目のMetがValに置換及び/置換されるか、またはL2セグメントがコードするポリペプチドの1265番目のThrがIleに置換されたことを特徴とする。すなわち、本発明による改変レオウイルスは、野生型レオウイルス及び弱毒化レオウイルスに比べてラムダ-2タンパク質に置換突然変異を含むことを特徴とする。本発明において、シグマ-1(Sigma-1)タンパク質は、ウイルスが細胞に付着することに関与するタンパク質で、ウイルス粒子の主な抗原決定基に該当する。本発明において、ラムダ-2(Lambda-2)タンパク質は、レオウイルスのmRNAキャッピングに関与する外部カプシド(outer capsid)タンパク質である。
また、本発明による改変レオウイルスは、配列番号1のアミノ酸配列において227番目のIle(イソロイシン)がVal(バリン)に置換された突然変異をさらに含んでもよい。
また、本発明による改変レオウイルスは、M2セグメントがコードするポリペプチド(配列番号3;Mu-1タンパク質)に追加の突然変異をさらに含んでもよい。具体的には、前記改変レオウイルスは、下記からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異をさらに含んでもよい:
(a)配列番号3のアミノ酸配列において73番目のGluがAspに置換される;
(b)配列番号3のアミノ酸配列において434番目のAspがAsnに置換される;
(c)配列番号3のアミノ酸配列において644番目のValがAlaに置換される。
(a)配列番号3のアミノ酸配列において73番目のGluがAspに置換される;
(b)配列番号3のアミノ酸配列において434番目のAspがAsnに置換される;
(c)配列番号3のアミノ酸配列において644番目のValがAlaに置換される。
本発明において、ミュー-1(Mu-1)タンパク質は、ウイルスの宿主細胞膜浸透に関与する主要な外部カプシドタンパク質である。
また、本発明による改変レオウイルスは、S4 segmentがコードするポリペプチド(配列番号4;シグマ-3タンパク質)に追加の突然変異をさらに含んでもよい。具体的には、前記改変レオウイルスは、下記からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異をさらに含んでもよい:
(a)配列番号4のアミノ酸配列において64番目のLysがGluに置換される;
(b)配列番号4のアミノ酸配列において177番目のSerがPheに置換される;
(c)配列番号4のアミノ酸配列において229番目のGluがAspに置換される;及び
(d)配列番号4のアミノ酸配列において251番目のHisがLeuに置換される。
(a)配列番号4のアミノ酸配列において64番目のLysがGluに置換される;
(b)配列番号4のアミノ酸配列において177番目のSerがPheに置換される;
(c)配列番号4のアミノ酸配列において229番目のGluがAspに置換される;及び
(d)配列番号4のアミノ酸配列において251番目のHisがLeuに置換される。
また、本発明による改変レオウイルスは、L1セグメントがコードするポリペプチド(配列番号5;ラムダ-3タンパク質)のアミノ酸配列において399番目のIleがThrに置換された突然変異及び/又は1202番目のLysがGluに置換された突然変異をさらに含んでもよい。
また、本発明による改変レオウイルスは、L3セグメントがコードするポリペプチド(配列番号6;ラムダ-1タンパク質)のアミノ酸配列において16番目のGlyがValに置換された突然変異をさらに含んでもよい。
また、本発明による改変レオウイルスは、M3セグメントがコードするポリペプチド(配列番号7;MuNSタンパク質)のアミノ酸配列において478番目のIleがLeuに置換された突然変異及び/又は657番目のThrがAlaに置換された突然変異をさらに含んでもよい。
また、本発明による改変レオウイルスは、S2セグメントがコードするポリペプチド(配列番号8;シグマ-2タンパク質)のアミノ酸配列において50番目のArgがLysに置換された突然変異をさらに含んでもよい。
本発明による改変レオウイルスの各遺伝子セグメントの塩基配列及びそれらがコードする各タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書の配列リストに記載されている。
本発明において、特定の配列番号が併記された遺伝子(核酸分子)は、当該配列番号の塩基配列を含むか、または当該配列番号の塩基配列からなってもよく、本発明による改変レオウイルスの目的及び機能が維持される限り、該当塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。例えば、特定の配列番号で表される塩基配列の核酸分子は、それを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、核酸分子の一部の塩基配列が欠失、置換または挿入によって改変されたが、核酸分子と機能的に同じ作用が可能な変異体(variants)を含む概念である。具体的には、特定の配列番号で表される核酸分子は、当該配列番号で表される塩基配列とそれぞれ70%以上、より好ましくは、80%以上、さらに好ましくは、90%以上、最も好ましくは、95%以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の%」は、2つの最適に配列された配列と比較領域とを比較することによって確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、2つの配列の最適配列に対する参照配列(追加または削除を含まない)に比べて追加または削除(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。
同様に、特定の配列番号が併記されたポリペプチド(タンパク質)は、当該配列番号のアミノ酸配列を含むか、または当該配列番号のアミノ酸配列からなってもよく、本発明による改変レオウイルスの目的及び機能が維持される限り、該当アミノ酸配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。例えば、特定の配列番号で表されるアミノ酸配列のポリペプチドは、それを構成するポリペプチド分子の作用性等価物、例えば、ポリペプチドの一部のアミノ酸配列が欠失、置換、または挿入によって改変されたが、前記ポリペプチドと機能的に同じ作用が可能な変異体(variants)を含む概念である。具体的には、特定の配列番号で表されるポリペプチドは、該当配列番号で表されるアミノ酸配列とそれぞれ70%以上、より好ましくは、80%以上、さらに好ましくは、90%以上、最も好ましくは、95%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列相同性を有するポリペプチドを含む。ポリペプチドに対する「配列相同性の%」は、2つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるアミノ酸配列の一部は、2つの配列の最適配列に対する参照配列(追加または削除を含まない)に比べて追加または削除(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。
本発明による改変レオウイルスは、上述した突然変異の他には、野生型レオウイルスと同じ野生型塩基配列及びアミノ酸配列を含む。ただし、ウイルスの特性上、野生型配列でもウイルスの機能及び特性が維持される範囲内で一部の塩基またはアミノ酸の欠失、置換、及び/又は挿入の突然変異が起こり得ることは明らかである。したがって、本発明による改変レオウイルスは、前記突然変異の他にもウイルスの機能(抗がん効果)を損なわない野生型配列の変異体をさらに含んでもよい。本発明による野生型レオウイルスの遺伝子配列は、本明細書の配列リストに詳細に記載されている。
本発明による改変レオウイルスは、任意の野生型レオウイルスに由来してもよく、様々な供給源から得られるレオウイルス科(Reovirus family)のメンバーであってもよい。好ましくは、本発明による改変レオウイルスは、野生型ヒトレオウイルスに由来するものであってもよい。好ましくは、前記野生型レオウイルスは、ヒトレオウイルスタイプ1、ヒトレオウイルスタイプ2、及びヒトレオウイルスタイプ3から選ばれてもよい。より好ましくは、前記野生型レオウイルスは、ヒトレオウイルスタイプ1菌株Lang、ヒトレオウイルスタイプ2菌株Jones、及びヒトレオウイルスタイプ3菌株DearingまたはAbneyから選ばれてもよい。最も好ましくは、本発明による野生型レオウイルスは、タイプ3レオウイルスであってもよい。また、本発明による改変レオウイルスは、ヒトを除く霊長類(チンパンジー、ゴリラ、マカクザル、サルなど)、げっ歯類(マウス、ラット、ゲリビルズラット、ハムスター、ウサギ、ギニアピッグなど)、イヌ、ネコ、一般家畜(ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ)を含むその他の哺乳類の細胞に対して向性(tropism)を示す1つまたはそれ以上のレオウイルスから誘導されてもよいが、これに制限されるものではない。
また、本発明は、本発明による改変レオウイルスを有効成分として含むがんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本明細書で使用される用語の「がん」とは、制御されない細胞成長として特徴付けられ、このような異常な細胞成長によって腫瘍と呼ばれる細胞塊が形成されて周囲の組織に浸透し、ひどい場合には身体の他の器官に転移されることをいう。本発明において、がんは固形がんまたは血液がんであってもよく、扁平上皮細胞がん、神経膠腫、肺がん、肺腺がん、腹膜がん、皮膚がん、眼がん、直腸がん、肛門付近のがん、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟部組織肉腫、尿道がん、血液がん、肝臓がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、頭頸部がん、口腔がん、舌がん、脳がん、及び基質腫瘍からなる群から選ばれてもよい。前記血液がんは、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などであってもよい。好ましくは、前記皮膚がんは、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、及び黒色腫から選ばれてもよい。好ましくは、前記黒色腫は、転移性黒色腫であってもよい。本発明の一具現例において、前記がんは、PD-L1を発現または発現しないがんであってもよい。本発明の他の具現例において、前記がんは、がん発病抑制遺伝子(p53,Rbなど)の突然変異またはRAS活性突然変異を有するがんであってもよい。より好ましくは、本発明によるがんは、野生型レオウイルスに対して抵抗性のあるがんであってもよい。
また、本発明において、前記がんは、タキサン系抗がん剤に対する耐性のあるがんであってもよい。
本発明において「抗がん剤に対する耐性」とは、がん治療のために抗がん剤を使用する場合、治療初期から治療効果がないか、または初期には治療効果があるが、継続的な治療過程でがん治療効果が失われることを意味する。抗がん剤において一般的な治療効果の判定は、WHOで制定した基準によって4つに分類されるが、(1)腫瘍がすべて消失し、4週間以上治療効果が持続する場合(完全奏功、complete response)、(2)腫瘍の大きさが50%以上減少する場合(部分反応、partial response)、(3)腫瘍の大きさが50%未満減少する場合(不変、stable disease)、及び(4)腫瘍の大きさが25%以上増加する場合(進行、progressive disease)に区分される。すなわち、前記WHOの基準によれば、抗がん剤に対する耐性とは抗がん剤を用いてがん患者を治療する際、治療初期から治療効果がないか、または初期には治療効果があるが(前記(1)及び(2))、継続的な治療過程においてがん治療効果が失われること(前記(3)及び(4))を意味する。
本発明において、前記抗がん剤は、タキサン系抗がん剤(Taxane-based anticancer drugs)であってもよい。より好ましくは、前記タキサン系抗がん剤は、パクリタキセル(Paclitaxel)、ラロタキセル(Larotaxel)、カバジタキセル(Cabazitaxel)、ドセタキセル(Docetaxel)、オルタタキセル(Ortataxel)、及びテセタキセル(Tesetaxel)からなる群から選ばれてもよい。
本発明の組成物内の前記改変レオウイルスの含量は、疾患の症状、症状の進行程度、患者の状態などに応じて適宜調節可能であり、例えば、全組成物の重量に基づいて0.0001~99.9重量%、または0.001~50重量%であってもよいが、これに限定されるものではない。前記含量比は、溶媒を除去した乾燥量を基準とした値である。
好ましくは、本発明による改変レオウイルスは、前記組成物内に1×105~1×1020TCID50(Tissue Culture Infective Dose 50%)の用量で含まれたものであってもよい。例えば、前記改変レオウイルスは、前記組成物内に1×105~1×1020、1×105~1×1019、1×105~1×1018、1×105~1×1017、1×105~1×1016、1×105~1×1015、1×105~1×1014、1×105~1×1013、1×105~1×1012、1×105~1×1011、1×105~1×1010、1×105~1×109、1×105~1×108、1×105~1×107、1×105~1×106、1×106~1×1015、1×106~1×1012、1×106~1×1010、1×107~1×1015、1×107~1×1012、または1×107~1×1010TCID50の容量で含まれたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明による薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。前記賦形剤は、例えば、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、吸着剤、保湿剤、フィルム-コーティング物質、及び制御放出添加剤からなる群から選ばれる少なくとも1つであってもよい。
本発明による薬学的組成物は、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤、液剤、点眼剤、エルシリック剤、乳剤、懸濁液剤、酒精剤、トローチ剤、芳香水剤、リモナーデ剤、錠剤、徐放性錠剤、腸溶性錠剤、舌下錠、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、丸剤、チンキ剤、軟調エキス剤、乾燥エキス剤、流動エキス剤、注射剤、カプセル剤、灌流液、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、噴霧剤、吸入剤、パッチ剤、滅菌注射液、またはエアロゾルなどの外用剤などの形態で剤形化して使用されてもよく、前記外用剤は、クリーム、ジェル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤などの剤形を有してもよい。
本発明による薬学的組成物に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェイト、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。
製剤化する場合は、通常、使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。本発明による薬学的組成物は、対象体に投与されたときに前記組成物に含まれる改変レオウイルスが生体で利用可能であるように剤形化されてもよい。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット/リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野においてよく知られている要素によって決定されてもよい。好ましくは、本発明による薬学的組成物の有効投与量は、前記改変レオウイルスが1×105~1×1020TCID50の量で投与される用量であってもよい。
本発明の薬学的組成物は、個体に様々な経路で投与されてもよい。投与のすべての方式は、予想できるが、例えば、経口服用、皮下注射、腹腔投与、静脈注射、筋肉注射、脊髄周囲空間(硬膜内)注射、舌下投与、頬粘膜投与、直腸内挿入、膣内挿入、眼球投与、耳投与、鼻腔投与、吸入、口または鼻を通じた噴霧、皮膚投与、経皮投与などによって投与されてもよい。好ましくは、本発明による改変レオウイルスは、腫瘍内に直接投与または静脈投与を通じて投与されてもよく、腫瘍の状態及び種類などに応じて適切な投与方法が選ばれてもよい。
本発明による薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは本発明が属する技術分野において通常の技術者によって容易に決定されてもよい。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、それを必要とする個体(すなわち、がん患者など)に2回以上繰り返し投与されてもよい。本発明者らは、具体的な実施例を通じて、本発明による改変レオウイルスを多数回投与するほど、その抗がん効果がさらに増進されることを確認した。
したがって、本発明による組成物は、それを必要とする個体に単回投与できるだけでなく、2回以上繰り返し投与されてもよく、腫瘍が減少するか、または消滅するまで繰り返し投与されてもよい。例えば、本発明による薬学的組成物は、2回~50回、2回~45回、2回~40回、2回~35回、2回~30回、2回~25回、2回~20回、2回~15回、2回~14回、2回~13回、2回~12回、2回~11回、2回~10回、2回~9回、2回~8回、2回~7回、2回~6回、2回~5回、または2回~4回投与されてもよいが、これは例示に過ぎず、これに限定されるものではない。
また、前記繰り返し投与は、1日~100日の間隔をおいて行われてもよい。例えば、前記繰り返し投与は、1日~100日、1日~90日、1日~80日、1日~70日、1日~60日、1日~50日、1日~40日、1日~30日、1日~20日、1日~15日、1日~10日、1日~9日、1日~8日、1日~7日、1日~6日、または1日~5日の間隔を置いて行われてもよいが、これは例示に過ぎず、これに限定されるものではない。
また、本発明による組成物は、野生型レオウイルスと交差投与されるものであってもよい。本発明において、「交差投与(crossover administration)」とは、2つ以上の薬物を一定または定められていない間隔で交互に投与することを意味する。本発明者らは、具体的な実施例を通じて、本発明による改変レオウイルスを野生型レオウイルスと交差投与すると、同じレオウイルスを連続投与する場合よりも抗がん効果が増加することを確認した。交差投与時、本発明による組成物(すなわち、本発明による改変レオウイルス)と野生型レオウイルスの順序に制限はない。すなわち、本発明による組成物を先に投与した後に野生型レオウイルスを投与してもよく、逆に野生型レオウイルスを先に投与した後に本発明による組成物を投与してもよい。
また、本発明による薬学的組成物は、本発明による改変レオウイルスに加えて、野生型レオウイルスをさらに含んでもよい。好ましくは、前記組成物は、前記改変レオウイルス及び野生型レオウイルスがそれぞれ製剤化され、順次投与される形態であってもよい。
本発明において、「個体」とは、疾患の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトの霊長類、マウス(mouse)、ラット(rat)、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシなどの哺乳類を意味する。
本発明において「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
本発明において「予防」とは、所望の疾患の発病を抑制するか、または遅延させるすべての行為を意味し、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により所望の疾患とそれに伴う代謝異常の症状が好転するか、または有益に変更されるすべての行為を意味し、「改善」とは、本発明による組成物の投与により目的とする疾患に係るパラメータ、例えば症状の程度を減少させる全ての行為をいう。
本発明による薬学的組成物は、前記改変レオウイルスに加えて免疫抗がん剤を有効成分としてさらに含んでもよい。免疫抗がん剤は、免疫系を活性化し、特異性(specificity)、記憶能力(memory)、適応力(adaptiveness)を増進させることにより抗がん効果を発揮する抗がん剤である。本発明者らは、具体的な実施例を通じて、本発明による改変レオウイルス及び免疫抗がん剤の併用時、これらの抗がん効果がさらに増進されることを確認した。本発明において、免疫抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤(immune checkpoint inhibitors)、免疫細胞治療剤(immune cell therapy)、抗がんワクチン(anticancer vaccine)、抗体薬物複合体(antibody-drug conjugate)などから選ばれてもよいが、これに制限されるものではない。
好ましくは、前記免疫抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。免疫チェックポイント(immune checkpoint)とは、正常細胞の表面に発現する免疫反応調節タンパク質で、過剰な免疫反応を弱化させて有害で無差別的な自己免疫反応を抑制することにより、正常組織を保護する役割を果たすタンパク質である。しかし、一部のがん細胞は、免疫チェックポイントタンパク質を発現して免疫細胞と相互作用し、これらの免疫機能を不活性化させることにより、抗がん免疫反応を無力化させる。免疫チェックポイント阻害剤は、がん細胞に発現された免疫チェックポイントタンパク質を標的として免疫細胞との相互作用を妨げるため、がん細胞の免疫回避を遮断しうる。
免疫チェックポイント阻害剤の具体的な種類に制限はないが、好ましくは、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、PD-L2阻害剤、OX40阻害剤、CTLA-4阻害剤、4-1BB阻害剤、LAG-3阻害剤、B7-H4阻害剤、HVEM阻害剤、TIM4阻害剤、GAL9阻害剤、VISTA阻害剤、KIR阻害剤、TIGIT阻害剤、及びBTLA阻害剤からなる群から選ばれてもよい。好ましくは、本発明による免疫チェックポイント阻害剤は、前記免疫チェックポイントタンパク質を標的とする小分子(small molecules)、リガンド、大分子(macromolecules)などであってもよく、好ましくは、前記免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体(antibodies)であってもよい。また、本発明による免疫チェックポイント阻害剤は、Ipilimumab、Pembrolizumab、Nivolumab、Cemiplimab、Atezolizumab、Avelumab及びDurvalumabなどから選ばれてもよい。
本発明による組成物は、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤が混合された混合剤の形態であってもよい。
また、本発明による組成物は、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤がそれぞれ製剤化されて同時に(simultaneously)、または順次に(sequentially)投与されるための形態であってもよい。この場合、前記組成物は、改変レオウイルスの薬学的有効量を含む第1の薬学的組成物、及び免疫チェックポイント阻害剤の薬学的有効量を含む第2の薬学的組成物を含む、同時または順次投与のための併用投与用薬学的組成物であってもよい。このとき、順次投与の場合、投与順序に制限されるものではなく、患者の状態などに応じて投与療法は適切に調節できる。すなわち、前記薬学的組成物が順次投与のための併用投与用薬学的組成物の場合、前記組成物は、改変レオウイルス(「第1の成分」)が先に投与された後、免疫チェックポイント阻害剤(「第2の成分」)が投与されるものであってもよく、その逆の順序も可能である。本発明による改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤は、それぞれ独立した経路で投与されてもよい。例えば、本発明による改変レオウイルスは、腫瘍内に直接投与または静脈投与されてもよく、免疫チェックポイント阻害剤は、腹腔投与されてもよい。
また、本発明は、本発明による改変レオウイルスを有効成分として含むがんの予防または治療用キットを提供する。前記キットは、野生型レオウイルス及び/又は免疫抗がん剤をさらに含んでもよい。前記キットとは、がんを予防または治療するのに使用できる物質ないし機器などの組み合わせを意味し、前記改変レオウイルスを製造、保管、または投与できる形態であればよく、具体的な形態には制限がない。したがって、本発明によるキットは、改変レオウイルス、野生型レオウイルス、及び免疫抗がん剤だけでなく、特定疾患の治療のためのキットの構成要素として当業界で公知のものであれば、制限なく含んでもよい。
また、本発明は、本発明による改変レオウイルスを有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤併用投与用薬学的組成物を提供する。前記免疫抗がん剤は、好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤である。
本明細書で使用される用語の「併用投与」とは、治療療法の個々の成分を同時に、順次に、または個別に投与する方式で行われてもよい。2つ以上の薬物を同時にまたは順次に投与するか、または一定の、または定められていない間隔で交互に投与するなどの方法で併用治療効果を得ることで、併用治療法は、これに限定されるものではないが、例えば、反応程度、反応速度、疾病進行までの期間または生存期間を通じて測定された効能が、併用治療法の成分のうち1つまたは残りを通常の用量で投薬して得られる効能より治療学的に優秀でありながら、相乗効果を提供すると定義できる。
本発明による併用投与用薬学的組成物は、免疫抗がん剤の抗がん効果を増進させ、効果を持続させることができる。ここで、「抗がん効果を増進」させるということは、結果として免疫抗がん剤の機能を強化できるすべての効果をいうもので、腫瘍の成長抑制、腫瘍の転移抑制、腫瘍の再発抑制などのような抗がん剤の抗がん効果を増進させることはもちろん、抗がん免疫反応をさらに増進させるか、または、免疫抗がん剤に対するがん細胞の抵抗ないし耐性の形成を抑制することにより、結果として抗がん効果を増進させることまですべて含む概念である。また、「効果を持続」させるということは、腫瘍の完全寛解後もがん細胞に対する抗がん免疫効果が維持されることを含む概念である。
本発明において、前記併用投与用薬学的組成物は、免疫抗がん剤と同時に、別々に、または順次に投与されてもよく、免疫抗がん剤と順次に投与される場合でも投与順序に制限されるものではないが、がんの種類及び抗がん剤の種類、患者の状態などに応じて投与療法は適宜調節されてもよい。
本発明の明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。本発明の明細書の全体で使用される程度の用語の「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有の製造及び物質許容誤差が提示されるとき、その数値またはその数値に近い意味で使用され、本発明の理解を助けるために正確かつ絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用することを防止するために使用される。
本発明の明細書全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれる「これらの組み合わせ」という用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素からなる群から選ばれる1つ以上の混合または組み合わせを意味するもので、前記構成要素からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを意味する。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
[実施例1.改変レオウイルスの製造]
本発明による改変レオウイルスRP116は、野生型レオウイルスに対して感染抵抗性のある細胞株に病原性ウイルスバンク(Korea Bank for Pathogenic Viruses, KBPV-VR-38)から分譲された野生型レオウイルスを弱毒化レオウイルス(AV;Br J Cancer.2011 Jan 18;104(2):290-9)と混合感染させて遺伝子セグメントのreassortmentとウイルス及び宿主細胞間の適応(adaptation)を誘導して製造した。
本発明による改変レオウイルスRP116は、野生型レオウイルスに対して感染抵抗性のある細胞株に病原性ウイルスバンク(Korea Bank for Pathogenic Viruses, KBPV-VR-38)から分譲された野生型レオウイルスを弱毒化レオウイルス(AV;Br J Cancer.2011 Jan 18;104(2):290-9)と混合感染させて遺伝子セグメントのreassortmentとウイルス及び宿主細胞間の適応(adaptation)を誘導して製造した。
具体的には、野生型レオウイルスに抵抗性のあるU-2OS細胞(KCLB,300096)を3×105cells/wellとなるように12ウェルプレートに処理した後、24時間細胞が底によく付着できるように37℃及び5%CO2インキュベーターで培養した。野生型レオウイルスと弱毒化されたレオウイルスAVをそれぞれ1:1混合し、DMEM完全培地を用いて10-5、10-6、及び10-7の希釈液を作製し、各希釈液当たり2つの12ウェルプレートの各ウェルに100μlずつ処理した。ウイルス処理後の18時間後、ウェルプレートに入っているDMEM完全培地を除去し、1%寒天を各ウェルに1mlずつ加えた。プラークの生成を確認するために毎日顕微鏡で観察し、プラークを表示して目視で確認可能な大きさに急速に生成したプラークを1mlピペットを用いて回収した。収集したプラークを混合し、再びU-2 OS細胞で急速に成長したプラークを分離し、BHK21細胞から拡張した。選別して拡張させたプラークの特徴を確認するため、製造者が提示した方法によりPureLinkTM Viral RNA/DNA Mini kit(Invitrogen,USA)を使用してウイルスからRNAを抽出し、野生型ウイルスとAVの1次的な差異点であるS1セグメントを特異的に認識するプライマー対5’-ATGGATCCTCGCCTACGTKAAGAAG-3’,5’-CTGATCCTCACGTGAAACTACGC-3’、及びAccuPower RT-PCR PreMix(Bioneer,Cat #.K-2057)キットを使用して遺伝子を選択的に増幅して塩基配列分析を行った。塩基配列を分析した137個のplaque試料のうち、37個が単一のS1セグメント配列を含むことが確認され、これらはすべて終止コドンを保有したS1遺伝子を有することが確認された。1次選別されたこれら37の変異株を96ウェルプレートで培養したヒト大腸がん細胞株Lovo、及びDLD1、そして正常皮膚細胞HS27にそれぞれ連続希釈して処理した後、3日間培養して処理した細胞の生存率をWST試薬を処理して分析し、有効性及び安全性に最も優れた変異株を本発明による改変レオウイルスとして選定した。選定された改変レオウイルスは、大腸がん細胞株LoVo及びDLD1で最も高い細胞成長阻害能を示し、ヒトの正常細胞であるHS27細胞の場合、ウイルスをウイルス粒子数を基準に60,000MOIまで処理したにもかかわらず、ほとんど死なない様相を示した。選定された変異株に対して全体の塩基配列分析を行った。
[実施例2.改変レオウイルスの分子生物学的特性の確認]
選定された変異株について、PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini kit(Invitrogen,USA)を使用してRNAを抽出し、次世代塩基配列分析(Next Generation Sequence Analysis, NGS)を通じてウイルスの全体の塩基配列の資料を得た。全体の塩基配列において変異検出過程は、GATK best practice標準化指針を活用して行い、二重ポリペプチド配列の変異を誘発する部分は、Genebank Databaseに報告されたReovirus type3(strain Dearing)(T3D)の資料と比較して変異の新規性を確認した。
選定された変異株について、PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini kit(Invitrogen,USA)を使用してRNAを抽出し、次世代塩基配列分析(Next Generation Sequence Analysis, NGS)を通じてウイルスの全体の塩基配列の資料を得た。全体の塩基配列において変異検出過程は、GATK best practice標準化指針を活用して行い、二重ポリペプチド配列の変異を誘発する部分は、Genebank Databaseに報告されたReovirus type3(strain Dearing)(T3D)の資料と比較して変異の新規性を確認した。
その結果、本発明による改変レオウイルスの特徴的なアミノ酸変異は、ウイルス粒子の主な抗原決定基に該当するシグマ-1(Sigma-1)タンパク質(配列番号1)の251~455番アミノ酸配列の欠損及びシグマ-1タンパク質とともに作用するラムダ-2(Lambda-2)タンパク質(配列番号2)のカルボキシ末端、及び外部カプシドの構造タンパク質であるミュー-1(mu-1)(配列番号3)及びシグマ-3タンパク質(配列番号4)に分布することを確認した。
[実施例3.改変レオウイルスのPaclitaxel抵抗性がん細胞成長抑制効果の確認]
Paclitaxelは、肺がん、卵巣がん、乳がんなど様々な種類のがんに広く使用される化学抗がん剤であるが、一部のがん細胞は、Paclitaxelに抵抗性があり、薬物による死滅効果が減少することが知られている。そこで、本発明による改変レオウイルスRP116がPclitaxelに抵抗性のあるがん細胞に対して抗がん効果があるかどうかを確認した。
Paclitaxelは、肺がん、卵巣がん、乳がんなど様々な種類のがんに広く使用される化学抗がん剤であるが、一部のがん細胞は、Paclitaxelに抵抗性があり、薬物による死滅効果が減少することが知られている。そこで、本発明による改変レオウイルスRP116がPclitaxelに抵抗性のあるがん細胞に対して抗がん効果があるかどうかを確認した。
本実施例で使用した細胞株は、以下の通りである。正常細胞株であるHS27、及びPaclitaxel抵抗性がん細胞株であるSkmel28、A375、及びB16F10細胞株。10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で各細胞株を培養した後、96ウェルプレートに3,000cells/wellの濃度で播種した後、37℃及び5%CO2条件で24時間培養した。準備した各細胞に0.008~1,000MOI(Multiplicity of infection)の濃度で連続希釈したRP116を処理し、さらに3日間37℃及び5%CO2条件で培養した後、WSTキット(DoGen,ソウル,大韓民国,Cat No:EZ-3000)を使用してメーカーが提示した方法によって生存細胞数を測定した。
その結果、正常細胞株にPaclitaxelを処理することにより、対照群に比べて細胞生存率(cell viability)が濃度依存的に減少したので、Paclitaxelが細胞に毒性があることを確認したが、RP116の場合、対照群とRP116処理群との間で有意な細胞生存率の差が確認されなかったため、RP116は、正常細胞に対して毒性がないことが分かった(図1a)。一方、がん細胞に対してはRP116の優れた抗がん効果が観察された(図1b)。Paclitaxelは、100nM以上の高用量を処理した群でも対照群に比べて細胞生存率に大きな差はなかったが、RP116は、すべてのがん細胞株に対してがん細胞成長抑制効果が現れ、濃度依存的ながん細胞死滅効果が現れるので、用量応答相関関係が確認された。前記実験結果は、本発明による改変レオウイルスが正常細胞に対して毒性がなく、Paclitaxel抵抗性がん細胞に対しては特異的な抗がん効果を有することを示す。
[実施例4.改変レオウイルスの様々な種類のがん細胞株に対する成長抑制効果の確認]
次に、様々な種類のヒト由来がん細胞株に対して、本発明による改変レオウイルスが抗がん効果を発揮するかどうかを確認した。
次に、様々な種類のヒト由来がん細胞株に対して、本発明による改変レオウイルスが抗がん効果を発揮するかどうかを確認した。
ヒト由来の大腸がん細胞株(LoVo、HCT116、及びDLD-1)、皮膚がん細胞株(A431)、神経膠腫細胞株(SNU489、U87-MG、及びSNU466)、乳がん細胞株(MCF7)、子宮頸がん細胞株(SiHa、HeLa、及びME-180)、及び肝がん細胞株(Hep3B)を実験に使用した。10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で各細胞株を培養した後、96ウェルプレートに3,000cells/wellの濃度で播種した後、37℃及び5%CO2条件で24時間培養した。準備した各細胞に0.008~1,000MOIの濃度で連続希釈したRP116を処理し、さらに3日間37℃及び5%CO2条件で培養した後、WST分析キットをメーカーが提示した方法によって使用して生存細胞数を測定した。測定結果として、IC50値は、Prism GraphPad 9.1.0バージョンの非線形回帰を使用して計算した。
その結果、無反応細胞株なしにすべてのがん細胞株においてRP116によるがん細胞死滅効果が現れ、濃度依存的ながん細胞死滅効果が現れたので、用量応答相関関係が確認された(図2a)。
さらに、正常細胞株(HS27)、黒色腫細胞株(Skmel28、A375、及びB16F10)、頭頸部がん細胞株(YD15)、肺がん細胞株(LLC1、A549)、肝がん細胞株(Huh7)、及び基質腫瘍細胞株(L929)に0.01~10MOIのRP116を処理して72時間培養した後、細胞死滅率を確認した。その結果、正常細胞株ではRP116が毒性を示さなかったが、すべてのがん細胞において優れたがん細胞死滅効果を示したことを確認した(図2b)。
前記実験結果は、本発明による改変レオウイルスが大腸がん、皮膚がん、神経膠腫、乳がん、子宮頸部がん、肝臓がん、頭頸部がんなどを含む様々ながんに対して抗がん効果を有することを示す。
[実施例5.改変レオウイルスの皮膚がんに対する抗がん効果の確認]
本実施例では、皮膚がんに対する野生型レオウイルス及び改変レオウイルスRP116の抗がん効果を比較した。
本実施例では、皮膚がんに対する野生型レオウイルス及び改変レオウイルスRP116の抗がん効果を比較した。
様々な皮膚がん細胞株(B16F10、HS294T、SK-MEL-28、A375、及びA431細胞株)にウイルスを無処理とするか(Mock)、または野生型レオウイルスまたはRP116を様々な濃度で処理して感染させた後、CPE(viral-induced cytopathic effects)分析を行った。具体的には、各がん細胞株を24ウェルプレートに同数で播種し、ウイルスを処理または無処理とし、感染4日後にクリスタルバイオレット(crystal violet)で生存細胞を染色して生存率を測定した。ウイルスによる抗がん効果が大きいほど、クリスタルバイオレットで染色される生存細胞の数が減少する。
その結果、図3に示すように、一部の皮膚がん細胞株において野生型レオウイルスを10MOI以上で処理したとき、がん細胞生存度が減少したが、RP116は、ほとんどのがん細胞株において0.1MOIの低い濃度でもより明確ながん細胞死滅効果を示し、10 MOI以上の濃度ではほとんどのがん細胞が死滅した。前記実験結果は、本発明による改変レオウイルスが皮膚がんに対して野生型レオウイルスよりも強力な抗がん効果を有することを示す。
[実施例6.改変レオウイルスの口腔がんに対する抗がん効果の確認]
次に、口腔がんに対する野生型レオウイルス及び改変レオウイルスRP116の抗がん効果を比較した。
次に、口腔がんに対する野生型レオウイルス及び改変レオウイルスRP116の抗がん効果を比較した。
様々な口腔がん細胞株(YD-10B、YD15M、及びYD15細胞株)にウイルスを無処理とするか(Mock)、または野生型レオウイルスまたはRP116を様々な濃度で処理して感染させた後、CPE分析を行った。前述した実施例と同様に、各がん細胞株を24ウェル-プレートに同数で播種し、ウイルスを処理または無処理とし、感染4日後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色して生存率を測定した。
その結果、同じ濃度を処理したとき、野生型レオウイルスに比べてRP116を処理した群においてがん細胞生存度がさらに減少したことが示された(図4)。特に、野生型レオウイルスは、100MOIの高濃度で処理した場合にも生存したがん細胞が存在したが、RP116は、10MOI濃度で処理したときにもがん細胞がほぼ全滅したことが示された。前記実験結果は、本発明による改変レオウイルスが口腔がんに対しても野生型レオウイルスよりも強力な抗がん効果を有することを示す。
[実施例7.改変レオウイルスの膀胱がんに対する抗がん効果の確認]
次に、膀胱がんに対する野生型レオウイルス及び改変レオウイルスRP116の抗がん効果を比較した。
次に、膀胱がんに対する野生型レオウイルス及び改変レオウイルスRP116の抗がん効果を比較した。
様々な膀胱がん細胞株(HT-1376、5637、253J、及びT24細胞株)をそれぞれ培養した後、96ウェルプレートに2,000cells/wellの濃度でシーディングした後、37℃及び5%CO2条件で24時間培養した。準備した細胞に野生型レオウイルスまたはRP116を3倍連続希釈して0.1~10,000MOIの濃度で処理し、さらに3日間37℃及び5%CO2条件で培養した後、WST分析により生存細胞数を測定した。測定結果として、IC50値は、Prism GraphPad 9.1.0バージョンの非線形回帰を使用して計算した。
その結果、ほとんどの膀胱がん細胞株において野生型レオウイルスに比べてRP116のIC50値がより低いことが示された(図5)。前記実験結果は、本発明による改変レオウイルスが膀胱がんに対しても野生型レオウイルスよりも強力な抗がん効果を有することを示す。
[実施例8.改変レオウイルスの投与経路及び投与用量による抗がん効果の確認]
様々な種類のがん細胞に対してRP166が優れた抗がん効果を有することを確認したところ、皮膚がん動物モデルを用いて投与経路及び投与用量によってRP116の抗がん効果が異なるかどうかを確認した。
様々な種類のがん細胞に対してRP166が優れた抗がん効果を有することを確認したところ、皮膚がん動物モデルを用いて投与経路及び投与用量によってRP116の抗がん効果が異なるかどうかを確認した。
実験に使用した動物は、6週齢の雌C57BL/6マウスでナラバイオテック(Nara Biotech.,ソウル,大韓民国)から購入した。マウスは、動物実験室で7日間の適応期間後に実験を行い、適応期間中に水と飼料を制限しなかった。実験動物に標準化された環境を提供し、12時間間隔で昼と夜を維持し、室温(23±2℃)を適切なレベルに維持した。1×105個の黒色腫細胞株B16F10を100μLのマトリゲル(Corning)及びリン酸緩衝溶液(PBS)と1:1の比率で懸濁し、前記C57BL/6マウスの右脇腹に皮下注射で移植した。腫瘍の体積が約80mm3以上に達したとき、RP116を1×108TCID50または1×109TCID50の用量で腫瘍内直接投与(Intratumoral injection,IT)するか、または静脈投与(Intravenous Injection,IV)した(図6a)。ウイルス投与後の腫瘍の大きさをキャリパーで1週間に2~3回測定し、腫瘍の体積が2,000mm3を超えるとマウスを安楽死させた。腫瘍の長さと幅を測定した値で体積は次のように計算した。体積=長さ×幅×幅×0.5。
時間による腫瘍の体積変化を測定した結果、RB116をIT投与したマウスモデルとIV投与したマウスモデルの両方が無処理対照群に比べて腫瘍の成長を有意に抑制し、ウイルス処理の容量に比例した腫瘍の成長抑制効果があることを確認した(図6b)。また、マウスモデルのウイルス投与後の体重を比較した結果、RB116を腫瘍内投与したグループと静脈内投与したグループの両方が時間による体重変化がなく、無処理対照群とも差がないことが示されたので、投与経路や用量による毒性がないことを確認した(図6c)。
[実施例9.改変レオウイルスの繰り返し投与による抗がん効果の確認]
前述した実施例で本発明による改変レオウイルスが腫瘍内投与及び静脈内投与の両方で優れた抗がん効果を発揮することを確認したため、続けて投与回数による改変レオウイルスの抗がん効果の変化があるかどうかを確認した。
前述した実施例で本発明による改変レオウイルスが腫瘍内投与及び静脈内投与の両方で優れた抗がん効果を発揮することを確認したため、続けて投与回数による改変レオウイルスの抗がん効果の変化があるかどうかを確認した。
実施例8と同じマウス腫瘍モデルを作製し、腫瘍の体積が約80mm3以上に達したとき、RP116を1×109TCID50の用量で2回(0日、1日)、または5回(0日、1日、3日、5日、7日)IV投与した後、時間による腫瘍の体積及びマウス生存率を確認した。
その結果、RP116を2回投与したグループと5回投与したグループの両方が無処理対照群に比べて腫瘍の成長が大きく抑制され、生存率も増加したことが示された。特に、RP116を5回投与したグループは、2回投与群に比べて腫瘍の成長をさらに遅延させて生存率も大きく向上させた(図7a及び7b)。前記結果は、本発明による改変レオウイルスを多回投与するほど、抗がん効果がさらに増進されることを示唆する。一方、RP116を2回または5回投与したグループは、いずれも時間による体重変化がなく、無処理対照群とも差がないことが示されたので、繰り返し投与による毒性がないことが確認できた(図7c)。
[実施例10.改変レオウイルス及び免疫抗がん剤の併用効果の確認]
前述した実施例を通じて、本発明による改変レオウイルスがin vitroではもちろん、in vivoでも優れた抗がん効果を有することを確認したところ、続けて改変レオウイルスと免疫抗がん剤の併用効果を確認した。
前述した実施例を通じて、本発明による改変レオウイルスがin vitroではもちろん、in vivoでも優れた抗がん効果を有することを確認したところ、続けて改変レオウイルスと免疫抗がん剤の併用効果を確認した。
グループは、無処理対照群、RP116単独投与群、及びRP116及び免疫抗がん剤併用投与群に分けて実験を行った。実施例8と同じマウス腫瘍モデルを作製し、腫瘍の体積が約80mm3以上に達したときにRP116及び免疫抗がん剤の投与を開始した。まず、RP116を1×108TCID50の用量で2回(0日、1日)IT投与し、併用投与群は、続けて11日目から免疫チェックポイント阻害剤である抗PD-L1抗体(Bioxcell,Cat#BE0101)を10mg/kg容量で腹腔内投与した。
時間による腫瘍の体積及びマウス生存率の変化を測定し、Tテスト/FテストでP-valueを計算して有意性を確認した。その結果、無処理対照群は、マウスで腫瘍が生成された後、持続的に成長したが、RP116を投与することにより腫瘍の成長が大きく抑制され、抗PD-L1抗体を投与することにより、腫瘍の成長がより効果的に遮断された(図8a)。マウス生存率も無処理対照群に比べてRP116単独投与群の生存率が大きく増加し、RP116及び抗PD-L1抗体併用投与群は、ウイルス投与後に40日が経過しても半分以上のマウスが生存した(図8b)。
[実施例11.改変レオウイルスの口腔がんマウスモデルに対する抗がん効果の確認]
前述した実施例を通じて皮膚がんマウスモデルに対するRP116の抗がん効果を確認したため、口腔がんマウスモデルを作製してRP116の抗がん効果をさらに検証した。
前述した実施例を通じて皮膚がんマウスモデルに対するRP116の抗がん効果を確認したため、口腔がんマウスモデルを作製してRP116の抗がん効果をさらに検証した。
マウスモデルは、実施例8とほぼ同じ方法で作製し、ただし、免疫系が一部欠損したBALB/cヌードマウスモデルに口腔がん細胞株であるYD10B細胞株を移植して口腔がんマウスモデルを確立した。腫瘍の体積が150mm3に達したときにRP116を腫瘍内に直接投与し、時間による腫瘍の体積変化を確認した。
その結果、無処理対照群は、マウスで腫瘍が生成された後、持続的に成長したが、RP116を投与したグループは、腫瘍の成長が抑制され、無処理対照群に比べて有意に腫瘍の大きさが小さくなっていることが確認できた(図9a)。さらに、ウイルス投与後の体重変化を測定した結果、時間による体重変化がなく、無処理対照群とも差がないことが示されたので、RP116がマウスに対して毒性がないことを確認した(図9b)。前記結果は、本発明による改変レオウイルスが口腔がんマウスモデルにおいても強力な抗がん効果を有することを示す。
[実施例12.野生型レオウイルス及び改変レオウイルスの交差投与による抗がん効果の確認]
抗がんウイルスは、がん治療の有用な手段となり得るが、抗がんウイルスを長期間静脈投与すると、中和抗体の形成などにより薬効が低下するという問題がある。そこで、本発明者らは、改変レオウイルスRP116が野生型レオウイルスと異なる抗原性を示すことに着目し、RP116と野生型レオウイルスの交差投与時にレオウイルスの抗がん効果が増進されるかどうかを確認した。
抗がんウイルスは、がん治療の有用な手段となり得るが、抗がんウイルスを長期間静脈投与すると、中和抗体の形成などにより薬効が低下するという問題がある。そこで、本発明者らは、改変レオウイルスRP116が野生型レオウイルスと異なる抗原性を示すことに着目し、RP116と野生型レオウイルスの交差投与時にレオウイルスの抗がん効果が増進されるかどうかを確認した。
実施例8と同じ皮膚がんマウスモデルを作製し、移植された皮膚がん細胞株から腫瘍が生成されて腫瘍の体積が50mm3以上に達したときに4回(0日、1日、7日、8日)にわたってウイルスをIV投与した。正確な比較のために、野生型レオウイルスのみ連続投与したグループ(WT/WT)、及び野生型レオウイルス投与後に改変レオウイルスを投与したグループ(WT/RP116)を比較し、改変レオウイルスのみ連続投与したグループ(RP116/RP116)及び改変レオウイルス投与後に野生型レオウイルスを投与したグループ(RP116/WT)を比較した。
その結果、無処理対照群に比べてWT/WTグループの腫瘍の成長が有意に減少し、交差投与群(WT/RP116)では、腫瘍の成長がさらに減少したことが示された(図10a)。同様に、無処理対照群に比べて、RP116/RP116グループで腫瘍の成長が大きく減少し、交差投与群(RP116/WT)では、腫瘍の成長がより効果的に遅延されたことが示された。前記結果は、本発明による改変レオウイルスと野生型レオウイルスとの交差治療(RP116→WT、またはWT→RP116)時、レオウイルスによる抗がん効果がさらに増進されることを示す。
[実施例13.改変レオウイルスの中和抗体に対する耐性の確認]
上述したように、中和抗体は、抗がんウイルスの抗がん効果を阻害する主な原因となる。したがって、本発明による改変レオウイルスが効果的ながん治療手段になり得るかを検証するため、改変レオウイルスRP116が野生型レオウイルスまたはRP116の投与に誘導された中和抗体に対して耐性を有するかどうかを確認した。
上述したように、中和抗体は、抗がんウイルスの抗がん効果を阻害する主な原因となる。したがって、本発明による改変レオウイルスが効果的ながん治療手段になり得るかを検証するため、改変レオウイルスRP116が野生型レオウイルスまたはRP116の投与に誘導された中和抗体に対して耐性を有するかどうかを確認した。
C57BL/6マウスモデルに1×108PFU/mlの用量で野生型レオウイルス(RC402)または改変レオウイルス(RP116)を4回(0日、2日、4日、7日)にわたってIV投与し、14日が経過したとき、各マウスから血清を分離して各ウイルスから誘導された中和抗体を得た。続けて、L929細胞にRC402またはRP116ウイルスとともに様々な希釈倍数で希釈した中和抗体を処理し、WST-1を処理して細胞生存率の分析を行った(図11a)。実験群は、以下のように分けた。RC402ウイルス+RC402-誘導中和抗体処理群、RP116ウイルス+RC402-誘導中和抗体処理群、RC402ウイルス+RP116誘導中和抗体処理群、RP116ウイルス+RP116-誘導中和抗体処理群。
その結果、野生型レオウイルスRC402に誘導された中和抗体の中和効果は、野生型ウイルスに対しては729倍まで希釈してこそ無視可能なレベルに減少するのに対し、改変ウイルスRP116に対しては、81倍だけ希釈しても中和効果が完全に消失することが示されたので、RP116に対する中和能力が野生型レオウイルスに対する中和能力に比べて約9倍低いことが示された(図11b)。また、RP116に誘導された中和抗体は、RC402及びRP116の両方について類似した希釈倍数である243倍希釈条件で中和効果が完全に消失することが示された(図11c)。前記結果は、本発明による改変レオウイルスが中和抗体に対する強力な耐性を有することを示す。
前述したように、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、舌がんなどの希少がんを含む様々ながんに対して特異的な抗がん効果を有することが確認されており、前記抗がん効果は、野生型レオウイルスよりさらに優れていることが確認された。さらに、前記改変レオウイルスは、腫瘍内投与はもちろん、静脈投与時にも動物モデルでの腫瘍の成長を強力に抑制したところ、がんの種類に応じて自由な投与経路が選択可能であり、繰り返し投与または野生型レオウイルスの交差投与を通じて抗がん効果をさらに増進させることができる。さらに、前記改変レオウイルスは、免疫抗がん剤と併用すると、より強力な抗がん効果を発揮し、抗がんウイルスの弱点である中和抗体に対しても高い耐性を有することが示された。したがって、本発明による改変レオウイルスは、希少がんなどを治療するための新しい抗がん療法及び免疫抗がん剤の併用薬物として活用されるものと期待される。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に改変が可能であることが理解できるだろう。したがって、前述した実施例は、すべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。
本発明は、改変レオウイルス及びその用途に関し、野生型レオウイルスから誘導した新規な改変レオウイルスが希少がんを含む様々ながんに対して優れた抗がん効果を有するだけでなく、免疫抗がん剤の効果を増進させることができることを確認して完成したものである。具体的には、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、舌がんなどの希少がんを含む様々な種類のがん細胞に処理された場合、すべてのがん細胞株の生存率を著しく減少させ、特にタキサン系抗がん剤耐性がん細胞株に対しても優れた抗がん効果を有することが確認された。さらに、本発明による改変レオウイルスは、黒色腫、膀胱がん、及び口腔がんマウスモデルにおいても投与経路にかかわらず用量依存的な抗がん効果を発揮し、繰り返し投与するか、または野生型レオウイルスとの交差投与時に抗がん効果がさらに増加することが示された。特に、本発明による改変レオウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤と併用すると、シナジー抗がん効果を引き起こすことが確認された。したがって、本発明による改変レオウイルスは、希少がんなどを治療するための新しい抗がん療法であり、免疫抗がん剤の併用薬物として有用に活用されるものと期待される。
Claims (24)
- 配列番号1のアミノ酸配列において251番~455番のアミノ酸が欠失し;
配列番号2のアミノ酸配列において963番目のMetがValに置換された突然変異及び配列番号2のアミノ酸配列において1265番目のThrがIleに置換された突然変異からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異を含むことを特徴とする、改変レオウイルス。 - 前記改変レオウイルスが、配列番号1のアミノ酸配列において227番目のIleがValに置換された突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の改変レオウイルス。
- 前記改変レオウイルスが、下記からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の改変レオウイルス:
(a)配列番号3のアミノ酸配列において73番目のGluがAspに置換される;
(b)配列番号3のアミノ酸配列において434番目のAspがAsnに置換される;
(c)配列番号3のアミノ酸配列において644番目のValがAlaに置換される。 - 前記改変レオウイルスが、下記からなる群から選ばれる1つ以上の突然変異をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の改変レオウイルス:
(a)配列番号4のアミノ酸配列において64番目のLysがGluに置換される;
(b)配列番号4のアミノ酸配列において177番目のSerがPheに置換される;
(c)配列番号4のアミノ酸配列において229番目のGluがAspに置換される;
(d)配列番号4のアミノ酸配列において251番目のHisがLeuに置換される。 - 前記改変レオウイルスが、野生型ヒトレオウイルスに由来することを特徴とする、請求項1に記載の改変レオウイルス。
- 請求項1に記載の改変レオウイルスを有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物。
- 前記がんが、扁平上皮細胞がん、神経膠腫、肺がん、肺腺がん、腹膜がん、皮膚がん、眼がん、直腸がん、肛門付近のがん、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟部組織肉腫、尿道がん、血液がん、肝臓がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、頭頸部がん、口腔がん、舌がん、脳がん、及び基質腫瘍からなる群から選ばれる1つ以上であることを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記がんが、タキサン系抗がん剤に対する耐性のあるがんであることを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記タキサン系抗がん剤が、パクリタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、ドセタキセル、オルタタキセル及びテセタキセルからなる群から選ばれる1つ以上であることを特徴とする、請求項8に記載の薬学的組成物。
- 前記改変レオウイルスが、前記組成物内に1×105~1×1020TCID50の用量で含まれることを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、腫瘍内直接投与用または静脈投与用であることを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、それを必要とする個体に2回以上繰り返し投与されることを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、野生型レオウイルスと交差投与されることを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、野生型レオウイルスの投与前または投与後に投与されることを特徴とする、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、免疫チェックポイント阻害剤を有効成分としてさらに含むことを特徴とする、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、PD-L2阻害剤、OX40阻害剤、CTLA-4阻害剤、4-1BB阻害剤、LAG-3阻害剤、B7-H4阻害剤、HVEM阻害剤、TIM4阻害剤、GAL9阻害剤、VISTA阻害剤、KIR阻害剤、TIGIT阻害剤、及びBTLA阻害剤からなる群から選ばれる1つ以上であることを特徴とする、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤が混合された混合剤の形態であることを特徴とする、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、前記改変レオウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤がそれぞれ製剤化されて同時にまたは順次に投与される形態であることを特徴とする、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 請求項6~18のいずれか一項に記載の組成物を含む、がんの予防または治療用キット。
- 請求項1に記載の改変レオウイルスを有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤併用投与用薬学的組成物。
- 前記組成物が、免疫チェックポイント阻害剤と同時に、別々に、または順次に投与されることを特徴とする、請求項20に記載の併用投与用薬学的組成物。
- 請求項1に記載の改変レオウイルスを、それを必要とする個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法。
- がん治療用薬物の製造のための請求項1に記載の改変レオウイルスの用途。
- 請求項1に記載の改変レオウイルスのがんの予防または治療用途。
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