CN113710260A - 编码ccl21的重组棒状病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及溶瘤病毒及尤其在其基因组中编码CCL21蛋白的重组棒状病毒(例如水疱性口炎病毒)之领域。本发明进一步涉及该重组病毒在治疗癌症中之用途亦及产生所述病毒之方法。

Description

编码CCL21的重组棒状病毒
【技术领域】
本发明涉及溶瘤病毒及尤其在基因组中编码CCL21蛋白的重组棒状病毒之领域。本发明另外涉及该重组棒状病毒在治疗癌症中之用途亦及产生所述病毒之方法。
【现有技术】
溶瘤病毒系一类新兴生物物质，其选择性复制于癌细胞中并杀死癌细胞且能够在肿瘤内扩散。在尝试进一步改良溶瘤病毒以增加其治疗潜力时已研发所谓的武装病毒，所述武装病毒在其基因组中编码肿瘤抗原或免疫调节转基因以改良其在肿瘤治疗中之效能。
在许多情形下，在肿瘤中存在少量T细胞且由此存在称为“免疫沙漠”，免疫沙漠系其中免疫系统之T细胞不能或并不渗透肿瘤以杀死脱离控制而生长之细胞之肿瘤微环境。已假设，为逃避免疫监督，肿瘤通过募集骨髓源抑制细胞或分泌包含TGFβ在内之因子来创建免疫抑制性微环境，此可发挥双重作用，亦即诱导表达细胞外基质基因及抑制促进T细胞浸润至肿瘤中所需之趋化介素及细胞介素之表达(Pickup M、Novitskiy S、Moses HL.Theroles of TGFbeta in the tumour microenvironment.Nat Rev Cancer2013；13:788-99)。另外，研究已发现，高度表达对应于免疫抑制性微环境之基因之肿瘤与诸多癌症类型(包含卵巢癌及结肠直肠癌)中之较差结果有关(Calon A、Lonardo E、Berenguer-LlergoA、Espinet E、Hernando-Momblona X、Iglesias M等人，Stromal gene expressiondefines poor-prognosis subtypes in colorectal cancer.Nat Genet 2015；47:320-9；Ryner L、Guan Y、Firestein R、Xiao Y、Choi Y、Rabe C等人，Upregulation of periostinand reactive stroma is associated with primary chemoresistance and predictsclinical outcomes in epithelial ovarian cancer.Clin Cancer Res 2015；21:2941-51；Tothill RW、Tinker AV、George J、Brown R、Fox SB、Lade S等人，Novel molecularsubtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinicaloutcome.Clin Cancer Res 2008；14:5198-208)。
一种最新方式展望了在基因组中编码作为负荷之IFN-β蛋白之溶瘤病毒。在另一方式中，预测肿瘤抗原MAGE-A3之表达。除所鉴别之适宜及有效之负荷外，来自病毒骨架之其他负荷之表达亦总是携载一定风险，其不仅增强抗肿瘤效能且亦增强抗病毒免疫性。应注意，负荷并不将病毒之溶瘤潜力限制于其中通过表达治疗负荷所获得之益处由溶瘤功效损失抵消之程度。因此，业内需要进一步改良可用于有效治疗肿瘤之武装溶瘤病毒。另外，业内需要选择性改良T细胞及/或树突状细胞至免疫抑制性肿瘤微环境之浸润。
【发明内容】
本发明通过提供在基因组中编码CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21、重组棒状病毒(例如水疱性口炎病毒)来解决上述需要。
应理解，关于具体方面之任一实施方案亦可与亦关于该具体方面之另一实施方案进行组合，即使在包括关于该具体方面之若干实施方案之多个排列及组合中。
在第一方面中，本发明涉及在基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体的重组棒状病毒。
在关于第一方面之一实施方案中，CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白；(ii)c-末端截短的CCL21蛋白；(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；(vi)如(i)-(v)中任一者之进一步包括信号肽序列的蛋白质；(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；或(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质。
在关于第一方面之一实施方案中，重组棒状病毒系水疱病毒(vesiculovirus)。
在关于第一方面之一实施方案中，水疱病毒选自包括以下的群：阿拉戈斯水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis alagoas virus，VSAV)、卡拉加斯病毒(carajás virus，CJSV)、章地埔拉病毒(chandipura virus，CHPV)、科卡尔病毒(cocal virus，COCV)、水疱性口炎印第安纳病毒(vesicular stomatitis Indiana virus，VSIV)、伊斯法罕病毒(isfahan virus，ISFV)、马拉巴病毒(maraba virus，MARAV)、水疱性口炎新泽西病毒(vesicular stomatitis New Jersey virus，VSNJV)或皮理病毒(piry virus，PIRYV)、优选地水疱性口炎印第安纳病毒(VSIV)或优选地水疱性口炎新泽西病毒(VSNJV)。
在关于第一方面之一实施方案中，重组棒状病毒是具有复制能力的。
在关于第一方面之一实施方案中，CCL21蛋白或其功能变体系人类CCL21。
在关于第一方面之一实施方案中，重组棒状病毒缺乏编码糖蛋白G之功能基因，及/或缺乏功能糖蛋白G；或编码糖蛋白G之基因由编码另一病毒之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由另一病毒之糖蛋白GP代替；或编码糖蛋白G之基因由编码沙粒病毒之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由沙粒病毒之糖蛋白GP代替。在另一优选实施方案中，编码糖蛋白G之基因由编码丹德农病毒(Dandenong virus)或莫佩亚病毒(Mopeia virus)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由丹德农病毒或莫佩亚病毒之糖蛋白GP代替。甚至更佳地，编码糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由LCMV之糖蛋白GP代替。
在关于第一方面之一优选实施方案中，本发明提供在基因组中编码至少一种选自包括以下之群的CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21的重组水疱性口炎病毒：(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白；(ii)c-末端截短的CCL21蛋白；(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQID NO:2具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；(vi)如(i)-(v)中任一者之进一步包括信号肽序列的蛋白质；(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质；或(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质，其中编码重组水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由GP LCMV之糖蛋白代替。
在第二方面中，本发明涉及在基因组中至少编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21的重组水疱性口炎病毒。
在关于第二方面之一实施方案中，核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
在关于第二方面之一实施方案中，磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
在关于第二方面之一实施方案中，大蛋白(L)包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
在关于第二方面之一实施方案中，基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
在关于第二方面之一优选实施方案中，核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，大蛋白(L)包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，且基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
在关于第二方面之一实施方案中，重组水疱性口炎病毒是具有复制能力的。
在关于第二方面之一实施方案中，重组水疱性口炎病毒缺乏编码糖蛋白G之功能基因，及/或缺乏功能糖蛋白G；或编码糖蛋白G之基因由编码另一病毒之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由另一病毒之糖蛋白GP代替；或编码糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由GP LCMV之糖蛋白代替。
在关于第二方面之一实施方案中，CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白；(ii)c-末端截短的CCL21蛋白；(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质；(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质；(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质；(vi)如(i)-(v)中任一者之进一步包括信号肽序列的蛋白质；(vii)包括SEQ IDNO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质；或包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质。
在之关于第二方面一优选实施方案中，本发明提供在基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21的重组水疱性口炎病毒，其中CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白；(ii)c-末端截短的CCL21蛋白；(iii)包括SEQID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质；(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质；(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质；(vi)如(i)-(v)中任一者之进一步包括信号肽序列的蛋白质；(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质；或(viii)包括SEQ IDNO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％一致性的蛋白质，其中编码水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由GP LCMV之糖蛋白代替，且其中核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸或与SEQ IDNO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，大蛋白(L)包括如SEQID NO:9中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，且基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
在第三方面中，本发明提供一种药物组合物，其特征在于该组合物包括第一方面或其实施方案中的任一者的重组棒状病毒或第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒。
在第四方面中，本发明提供第一方面或其实施方案中的任一者的重组棒状病毒或第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒或第三方面或其实施方案中的任一者之药物组合物，其用作药剂。
在关于第四方面之一实施方案中，本发明提供重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其用于治疗癌症、优选地实体癌。在一优选实施方案中，实体癌系选自包括以下之清单：生殖系统肿瘤、卵巢肿瘤、胰脏肿瘤、睪丸肿瘤、内分泌肿瘤、胃肠道肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、结肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、呼吸系统肿瘤、肺肿瘤、乳房肿瘤、头颈肿瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)及骨肿瘤。
在关于第四方面之一实施方案中，拟经肿瘤内或经静脉内给予重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物。在另一相关实施方案中，拟经肿瘤内给予重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物至少一次且随后经静脉内给予。在另一相关实施方案中，在初始肿瘤内给予1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天之后经静脉内给予重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物或药物组合物。
在第五方面中，本发明提供一种组合物，其包括第一方面或其实施方案中的任一者的重组棒状病毒或第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒及另外抑制剂，其中抑制剂系PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物。
在关于第五方面之一实施方案中，PD-1路径抑制剂是针对PD-1或PD-L1的拮抗性抗体。在另一相关实施方案中，SMAC模拟物选自由以下组成之群：表2中之化合物1至26中的任一者或所述化合物中的一者之药学上可接受的盐。在另一相关实施方案中，PD-1路径抑制剂选自由以下组成之群之拮抗剂：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5(如表1中所展示)。
在第六方面中，本发明提供一种部分试剂盒，其包括：如第一至第三方面中的任一者或其实施方案中的任一者中所定义的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物；及如关于第五方面之任一实施方案中所定义之PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物。
在第七方面中，本发明提供一种组合治疗剂，其包括：a)第一方面或其实施方案中的任一者的重组棒状病毒或第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒或第三方面或其实施方案中的任一者之药物组合物；及b)PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物。在关于第七方面之一实施方案中，a)及b)可同时、依序或交替给予。在一相关实施方案中，经由不同给予途径给予a)及b)。在另一相关实施方案中，经肿瘤内给予a)，经静脉内给予b)。
在关于第七方面之一实施方案中，PD-1路径抑制剂是针对PD-1或PD-L1的拮抗性抗体。在一相关实施方案中，PD-1路径抑制剂选自由以下组成之群：派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、阿替珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5(参见表1)。在另一相关实施方案中，SMAC模拟物选自由以下组成之群：表2之化合物1至26中的任一者或所述化合物中的一者之药学上可接受的盐。
在第八方面中，本发明提供产病毒细胞，其特征在于该细胞产生第一方面或其实施方案中的任一者的重组棒状病毒或第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒。
在关于第八方面之一实施方案中，产病毒细胞系Vero细胞、HEK细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
在第九方面中，本发明提供在细胞培养物中产生重组棒状病毒之方法：
(i)使用重组棒状病毒、优选地水疱性口炎病毒感染宿主细胞，
(ii)在容许复制重组棒状病毒之条件下培养宿主细胞，
(iii)自细胞培养物收获重组棒状病毒，
(iv)任选地，优选地使用全能核酸酶(benzonase)对病毒收获物进行酶处理，
(v)通过在阳离子交换整体膜上加载吸附剂或树脂且随后洗脱来捕获棒状病毒收获物，
(vi)通过对步骤(v)之洗脱液实施粒径筛析、多模态粒径筛析/离子交换或切向流过滤来润饰棒状病毒，
(vii)通过超滤/渗滤来对经润饰棒状病毒实施缓冲液交换，
(viii)无菌过滤棒状病毒。
在关于第九方面之一实施方案中，宿主细胞系HEK293细胞。
在关于第九方面之一实施方案中，在悬浮液中培养宿主细胞。
在关于第九方面之一实施方案中，将重组棒状病毒调配成药物组合物。在一优选实施方案中，将第一方面或其实施方案中的任一者的重组棒状病毒或第二方面或其实施方案中的任一者的重组水疱性口炎病毒调配成药物组合物。
在另一方面中，重组棒状病毒在其RNA基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21，其中重组棒状病毒之RNA基因组包括与SEQ ID NO:24相同或至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之编码序列或由其组成。
【图式简单说明】
图1：来自对照或VSV-GP治疗小鼠之LLC1-IFNARKO肿瘤(全RNA)中之指示基因之表达分析。
图2A-D：CT26.CL25-IFNARKO具肿瘤小鼠之单一肿瘤生长曲线。(A)对照小鼠(模拟治疗)，(B)使用抗PD-1治疗之小鼠，(C)使用VSV-GP经静脉内治疗之小鼠，或(D)使用VSV-GP及抗PD-1之组合治疗之小鼠。
图3A-C：使用VSV-GP(参见图2C)或VSV-GP及抗PD1之组合(参见图2D)预治疗之治愈小鼠之肿瘤(再)攻击分析。(A)使用具有CT26.CL25-IFNARKO肿瘤细胞之幼稚小鼠作为对照。对于肿瘤(再)攻击而言，将CT26Cl25 IFNAR-/-细胞注射至以下二者中：(B)来自如图2C中所展示实验之经VSV-GP治疗之长期无肿瘤小鼠(治愈)，或(C)来自如图2D中所展示实验之经VSV-GP及抗PD-1组合治疗之长期无肿瘤小鼠(治愈)。
图4：来自对照或VSV-GP治疗小鼠之LLC1-IFNARKO肿瘤(全RNA)中之指示趋化介素之表达分析。
图5A-B：(A)图解说明VSV-GP基因组内的CCL21(转基因)插入位点之草图。(B)图解说明病毒拯救之草图。
图6：(A)经VSV-GP-muCCL21(编码全长鼠类CCL21之VSV-GP)感染之HEK293细胞之上清液中之鼠类CCL21的分析。(B)使用Transwell设置及重组鼠类CCL21或来自经VSV-GP或VSV-GP-muCCL21感染之HEK293细胞之上清液进行之鼠类T细胞迁移的功能分析。
图7A-C：CT26.CL25-IFNARKO具肿瘤小鼠之单一肿瘤生长分析。使用(A)VSV-GP、(B)SMACm(SMAC模拟物)或(C)VSV-GP与SMACm(SMAC模拟物)之组合治疗具肿瘤小鼠。深黑线展示未治疗对照小鼠之肿瘤体积，而浅灰线展示使用(A)VSV-GP、(B)SMACm或(C)VSV-GP+SMACm治疗之小鼠之肿瘤体积。
图8A-C：CT26.CL25-IFNARKO具肿瘤小鼠之单一肿瘤生长分析。使用(A)VSV-GP-CCL21、(B)SMACm(SMAC模拟物)或(C)VSV-GP-CCL21与SMACm(SMAC模拟物)之组合治疗具肿瘤小鼠。深黑线展示未治疗对照小鼠之肿瘤体积，而浅灰线展示使用(A)VSV-GP-CCL21、(B)SMACm或(C)VSV-GP-CCL21+SMACm治疗之小鼠之肿瘤体积。
图9：图7A-C及图8A-C中所绘示实验之存活分析。
图10：来自对照、VSV-GP或VSV-GPmuCCL21治疗小鼠之LLC1-IFNARKO肿瘤(全RNA)中的CD3ε、CXCL10及由VSV-GP-muCCL21所编码鼠类CCL21之密码子优化序列之表达分析。
图11A-B：通过经脑内注射VSV-G DsRed(神经毒性wt VSV)、VSV-GP、VSV-GP-muCCL21或PBSA诱导之神经毒性之评价。图(A)展示在各别注射之后随时间变化之小鼠增重/失重百分比。图(B)展示在各别注射之后随时间变化之小鼠存活百分比。
图12A-B：(A)经VSV-GP-huCCL21(编码全长人类CCL21之VSV-GP)感染之HEK293细胞之上清液中之人类CCL21的分析。(B)使用Transwell设置及重组人类CCL21或来自经VSV-GP或VSV-GP-huCCL21感染之HEK293细胞之上清液之人类T细胞迁移的功能分析。
图13A-B：使用Transwell设置且分别使用重组小鼠对人类CCL21或大鼠对人类CCL21(用以测试物种交叉反应性)进行之小鼠(A，左图)及大鼠(B右图)T细胞迁移之功能分析。
图14：CT26.CL25-IFNARKO具肿瘤对照小鼠或使用VSV-GP或VSV-GP-huCCL21治疗之小鼠之单一肿瘤生长分析。
图15：图解说明通过胞浆素进行CCL21处理以生成短且可扩散n-末端片段之草图。
图16：使用Transwell设置及重组人类CCL21(rec.CCL21)或来自表达指示c-末端截短CCL21形式之经质体转染之HEK293细胞之上清液进行之人类T细胞迁移的功能分析。
图17：使用Transwell设置及重组人类CCL21或来自经VSV-GP或VSV-GP-huCCL21或VSV-GP-huCCL21(1-79)感染之HEK293细胞之上清液之人类单核球源树突状细胞(moDC)迁移的功能分析。
图18：来自经质体转染之HEK293细胞(表达指示c-末端截短或全长CCL21形式)之上清液或来自经VSV-GP或VSV-GP-huCCL21(1-79)或VSV-GP-huCCL21感染之HEK293细胞之上清液中CCL21的西方墨点(Western Blot，WB)分析。
图19A-C：在病毒感染后于指示时间点下测量指示细胞之上清液中之VSV-GP(GP)、VSV-GP-huCCL21(21)或VSV-GP-huCCL21(1-79)(21k)之病毒效价以测定病毒复制能力。不同图自左至右展示(A)Vero细胞、(B)BHK21细胞及(C)HEK293细胞。在每一图中，在0h、24h及48h下测量VSV-GP(GP)、VSV-GP-huCCL21(21)或VSV-GP-huCCL21(1-79)(21k)效价。
图20：CT26.CL25-IFNARKO具肿瘤对照小鼠或使用VSV-GP-huCCL21或VSV-GP-huCCL21(1-79)治疗之小鼠中之累积肿瘤生长。
图21：图20中之小鼠之30天存活。
图22：CT26.CL25-IFNARKO具肿瘤对照小鼠或经VSV-GP-huCCL21或VSV-GP-huCCL21(1-79)治疗之小鼠中T细胞浸润(可变、非坏死肿瘤区段)之基于IHC之量化。
图23：图解说明VSV-GP、VSV-GP-CCL21(全长CCL21)及VSV-GP-CCL21(1-79)(c-末端截短的CCL21)对病毒感染肿瘤之免疫浸润之影响之草图。
图24：CT26.CL25具肿瘤对照小鼠或经VSV-GP或VSV-GP-muCCL21治疗之小鼠中树突状细胞(CD11c阳性)浸润(具有活跃病毒复制之肿瘤区域＝坏死边缘)之基于IHC之量化。
【实施方式】
在下列详细说明中，陈述各种特定细节以完全理解本发明。然而，本领域技术人员将明了，可在无所述特定细节中之某些细节之情况下实践目标技术。在其他情况下，并未详细展示熟知结构及技术以免模糊本发明。包含标题仅便于阅读且不应理解为将本发明限于特定方面或实施方案。
棒状病毒
棒状病毒家族包含具有大约10-16kb之负义、单链RNA基因组之18个属类及134个物种(Walke等人，ICTV Virus Taxonomy Profile:Rhabdoviridae,Journal of GeneralVirology,99:447-448(2018))。
棒状病毒家族成员之特征性特征包含下列各项中之一或多者：子弹形或杆状颗粒，长度为100-430nm且直径为45-100nm，包括由基质层及脂质包膜包围之螺旋核衣壳，其中一些棒状病毒具有未包膜丝状病毒。10.8-16.1kb之负义、单链RNA大部分未经分割。编码至少5种基因之基因组，所述基因编码结构蛋白核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)及糖蛋白(G)。
如本文中所使用，棒状病毒可属以下属：硬膜炎病毒(almendravirus)、库里欧病毒(curiovirus)、细胞质棒状病毒(cytorhabdovirus)、双角病毒(dichorhavirus)、流行热病毒(ephemerovirus)、哈帕病毒(Hapavirus)、莱达特病毒(ledantevirus)、丽沙病毒(lyssavirus)、诺拉棒状病毒(novirhabdovirus)、胞核棒状病毒(nucleorhabdovirus)、鲈鱼棒状病毒(perhabdovirus)、西格马病毒(sigmavirus)、斯普维病毒(sprivivirus)、思瑞普病毒(sripuvirus)、蒂布鲁病毒(tibrovirus)、土帕病毒(tupavirus)、巨脉病毒(varicosavirus)或水疱病毒。
在本文所提及之属内，棒状病毒可属所列示物种中的任一者。硬膜炎病毒属包含：树木硬膜炎病毒(arboretum almendravirus)、轻木硬膜炎病毒(balsa almendravirus)、库特湾硬膜炎病毒(Coot Bay almendravirus)、普埃尔托阿尔门德拉斯硬膜炎病毒(Puerto Almendras almendravirus)、里约奇科硬膜炎病毒(Rio Chico almendravirus)；库里欧病毒属包含：库里奥波利斯库里欧病毒(curionopolis curiovirus)、伊里里库里欧病毒(Iriri curiovirus)、依他纳斯库里欧病毒(Itacaiunas curiovirus)、罗尚博库里欧病毒(Rochambeau curiovirus)；细胞质棒状病毒属包含：苜蓿矮缩细胞质棒状病毒(Alfalfa dwarf cytorhabdovirus)、大麦黄条点花叶细胞质棒状病毒(Barley yellowstriate mosaic cytorhabdovirus)、硬花甘蓝坏死性黄化细胞质棒状病毒(Broccolinecrotic yellows cytorhabdovirus)、芋属疾病相关细胞质棒状病毒(Colocasia bobone disease-associated cytorhabdovirus)、羊茅属叶线条细胞质棒状病毒(Festuca leaf streak cytorhabdovirus)、莴苣坏死性黄化细胞质棒状病毒(Lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus)、生菜黄斑驳细胞质棒状病毒(Lettuceyellow mottle cytorhabdovirus)、北方禾谷花叶细胞质棒状病毒(Northern cerealmosaic cytorhabdovirus)、苦苣菜细胞质棒状病毒1型(Sonchus cytorhabdovirus 1)、草莓皱缩细胞质棒状病毒(Strawberry crinkle cytorhabdovirus)、美洲小麦条点花叶细胞质棒状病毒(Wheat American striate mosaic cytorhabdovirus)；双角病毒属包含：咖啡环斑双角病毒(Coffee ringspot dichorhavirus)、兰花斑点双角病毒(Orchid fleckdichorhavirus)；流行热病毒属包含：阿德莱德河流行热病毒(Adelaide Riverephemerovirus)、贝里马流行热病毒(Berrimah ephemerovirus)、牛流行热病毒(Bovinefever ephemerovirus)、金伯利流行热病毒(Kimberley ephemerovirus)、库尔平耶流行热病毒(Koolpinyah ephemerovirus)、科通考讷流行热病毒(Kotonkan ephemerovirus)、奥博德希延流行热病毒(Obodhiang ephemerovirus)、亚塔流行热病毒(Yataephemerovirus)；哈帕病毒属包含：法兰德斯哈帕病毒(Flanders hapavirus)、格雷洛奇哈帕病毒(Gray Lodge hapavirus)、哈特公园哈帕病毒(Hart Park hapavirus)、约英杰卡卡哈帕病毒(Joinjakaka hapavirus)、卡梅斯哈帕病毒(Kamese hapavirus)、拉霍亚哈帕病毒(La Joya hapavirus)、兰德几亚哈帕病毒(Landjia hapavirus)、马尼托巴哈帕病毒(Manitoba hapavirus)、马可哈帕病毒(Marco hapavirus)、莫斯奎里哈帕病毒(Mosqueirohapavirus)、莫苏里哈帕病毒(Mossuril hapavirus)、恩盖恩加哈帕病毒(Ngainganhapavirus)、奥得河哈帕病毒(Ord River hapavirus)、帕里湾哈帕病毒(Parry Creekhapavirus)、沃格贝尔哈帕病毒(Wongabel hapavirus)；莱达特病毒属包含：巴鲁莱达特病毒(Barur ledantevirus)、菲基里尼莱达特病毒(Fikirini ledantevirus)、福冈莱达特病毒(Fukuoka ledantevirus)、金屋原莱达特病毒(Kanyawara ledantevirus)、克恩峡谷莱达特病毒(Kern Canyon ledantevirus)、库拉利巴莱达特病毒(Keuralibaledantevirus)、科伦特莱达特病毒(Kolente ledantevirus)、库马西莱达特病毒(Kumasiledantevirus)、勒当泰克氏莱达特病毒(Le Dantec ledantevirus)、埃尔岗蝙蝠莱达特病毒(Mount Elgon bat ledantevirus)、西莫罗莱达特病毒(Nishimuro ledantevirus)、恩科尔比松莱达特病毒(Nkolbisson ledantevirus)、大分莱达特病毒(Oitaledantevirus)、莱达特病毒(Ledantevirus)、永嘉莱达特病毒(Yongjia ledantevirus)；丽沙病毒属包含：阿拉万丽沙病毒(Aravan lyssavirus)、澳洲蝙蝠丽沙病毒(Australianbat lyssavirus)、波克罗蝙蝠丽沙病毒(Bokeloh bat lyssavirus)、达温黑格丽沙病毒(Duvenhage lyssavirus)、欧洲蝙蝠1型丽沙病毒(European bat 1lyssavirus)、欧洲蝙蝠2型丽沙病毒(European bat 2lyssavirus)、甘瑙鲁瓦蝙蝠丽沙病毒(Gannoruwa batlyssavirus)、伊科马丽沙病毒(Ikoma lyssavirus)、伊尔库特丽沙病毒(Irkutlyssavirus)、苦盏丽沙病毒(Khujand lyssavirus)、拉各斯蝙蝠丽沙病毒(Lagos batlyssavirus)、莱里达蝙蝠丽沙病毒(Lleida bat lyssavirus)、莫科拉丽沙病毒(Mokolalyssavirus)、狂犬病丽沙病毒(Rabies lyssavirus)、希莫尼蝙蝠丽沙病毒(Shimoni batlyssavirus)、西高加索蝙蝠丽沙病毒(West Caucasian bat lyssavirus)；诺拉棒状病毒属包含：海勒姆诺拉棒状病毒(Hirame novirhabdovirus)、鱼类诺拉棒状病毒(Piscinenovirhabdovirus)、鲑鱼诺拉棒状病毒(Salmonid novirhabdovirus)、乌鳢诺拉棒状病毒(Snakehead novirhabdovirus)；胞核棒状病毒属包含：曼陀罗黄脉胞核棒状病毒(Daturayellow vein nucleorhabdovirus)、茄斑驳矮缩胞核棒状病毒(Eggplant mottled dwarfnucleorhabdovirus)、玉米细条纹胞核棒状病毒(Maize fine streaknucleorhabdovirus)、伊朗玉米花叶胞核棒状病毒(Maize Iranian mosaicnucleorhabdovirus)、玉米花叶胞核棒状病毒(Maize mosaic nucleorhabdovirus)、马铃薯黄矮胞核棒状病毒(Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus)、水稻黄矮胞核棒状病毒(Rice yellow stunt nucleorhabdovirus)、苦苣菜黄网胞核棒状病毒(Sonchus yellownet nucleorhabdovirus)、苦苣菜黄脉胞核棒状病毒(Sowthistle yellow veinnucleorhabdovirus)、芋叶脉缺绿胞核棒状病毒(Taro vein chlorosisnucleorhabdovirus)；鲈鱼棒状病毒属包含：鳗鱼鲈鱼棒状病毒(Anguillidperhabdovirus)、鲈鱼棒状病毒(Perch perhabdovirus)、海鳟鱼鲈鱼棒状病毒(Sea troutperhabdovirus)；西格马病毒属包含：果蝇西格马病毒(Drosophila affinissigmavirus)、菠萝果蝇西格马病毒(Drosophila ananassae sigmavirus)、伊米果蝇西格马病毒(Drosophila immigrans sigmavirus)、伊米果蝇西格马病毒(Drosophilamelanogaster sigmavirus)、暗果蝇西格马病毒(Drosophila obscura sigmavirus)、特立蒂斯果蝇西格马病毒(Drosophila tristis sigmavirus)、厩腐蝇西格马病毒(Muscinastabulans sigmavirus)；斯普维病毒属包含：鲤春斯普维病毒(Carp sprivivirus)、狗鱼幼鱼斯普维病毒(Pike fry sprivivirus)；思瑞普病毒属包含：阿尔姆皮瓦思瑞普病毒(Almpiwar sripuvirus)、查科思瑞普病毒(Chaco sripuvirus)、尼亚卡思瑞普病毒(Niakha sripuvirus)、塞纳-马恩省-马杜雷拉思瑞普病毒(Sena Madureirasripuvirus)、斯里布尔思瑞普病毒(Sripur sripuvirus)；蒂布鲁病毒属包含：下刚果蒂布鲁病毒(Bas-Congo tibrovirus)、比阿特丽斯山蒂布鲁病毒(Beatrice Hilltibrovirus)、卡森平原蒂布鲁病毒(Coastal Plains tibrovirus)、库波热1型蒂布鲁病毒(Ekpoma 1tibrovirus)、库波热2型蒂布鲁病毒(Ekpoma 2tibrovirus)、斯威特沃特布兰奇蒂布鲁病毒(Sweetwater Branch tibrovirus)、蒂布鲁加尔冈蒂布鲁病毒(tibrogargantibrovirus)；土帕病毒属包含：达勒姆土帕病毒(Durham tupavirus)、克拉马斯土帕病毒(Klamath tupavirus)、图帕伊阿土帕病毒(Tupaia tupavirus)；巨脉病毒属包含：莴苣巨脉伴随巨脉病毒(Lettuce big-vein associated varicosavirus)；水疱病毒属包含：阿拉戈斯水疱病毒(Alagoas vesiculovirus)、美洲蝙蝠水疱病毒(American batvesiculovirus)、卡拉加斯水疱病毒(Carajas vesiculovirus)、章地埔拉水疱病毒(Chandipura vesiculovirus)、科卡尔水疱病毒(Cocal vesiculovirus)、印第安纳水疱病毒(Indiana vesiculovirus)、伊斯法罕水疱病毒(Isfahan vesiculovirus)、朱罗讷水疱病毒(Jurona vesiculovirus)、马尔佩斯泉水疱病毒(Malpais Spring vesiculovirus)、马拉巴水疱病毒(Maraba vesiculovirus)、莫雷顿水疱病毒(Morreton vesiculovirus)、新泽西水疱病毒(New Jersey vesiculovirus)、佩里内特水疱病毒(Perinetvesiculovirus)、皮理病毒水疱病毒(Piry vesiculovirus)、拉迪水疱病毒(Radivesiculovirus)、尤格波格丹诺夫奇水疱病毒(Yug Bogdanovac vesiculovirus)或穆萨病毒(Moussa virus)。
优选地，本发明的重组棒状病毒系溶瘤棒状病毒。就此而言，溶瘤具有业内已知之常规含义且系指棒状病毒能够感染并裂解(分解)癌细胞，但不能感染并裂解(分解)正常细胞(以任何显著程度)。优选地，溶瘤棒状病毒能够复制于癌细胞内。可在本领域技术人员已知之不同分析系统中测试溶瘤活性(一实施例性活体外分析阐述于Muik等人，CancerRes.,74(13),3567-78,2014中)。应理解，溶瘤棒状病毒可感染并裂解仅特定类型之癌细胞。同样，溶瘤效应可端视癌细胞类型而有所变化。
在一优选实施方案中，棒状病毒属水疱病毒属。水疱病毒物种主要系通过血清学方式以及基因组谱系学分析来定义。亦使用生物特性(例如宿主范围及传播机制)来区分该属内之病毒物种。因此，水疱病毒属形成由自完整L序列推断出之最大似然树充分支持之独特单系群。
水疱病毒属内指派至不同物种之病毒可具有下列特性中之一或多者：A)L中之最小氨基酸序列分歧度为20％；B)N中之最小氨基酸序列分歧度为10％；C)G中之最小氨基酸序列分歧度为15％；D)可在血清学测试中予以区分；及E)占据不同生态区位，如通过宿主及或节肢动物载体中之差异所证实。
优选者系水疱性口炎病毒(VSV)及尤其VSV-GP(具有LCMV之GP的重组体)。VSV-GP之有利性质包含下列中之一或多者：极强力及迅速之杀手(<8h)；溶瘤病毒；可全身性施加；向神经性/神经毒性较小；其裂解性地繁殖且诱导免疫原性细胞死亡；因干扰素(IFN)反应而不复制于健康人类细胞中；强烈激活先天性免疫性；约3kb之用于免疫调节负荷及抗原之空间；与来自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之沙粒病毒糖蛋白重组；关于神经毒性及对中和抗体反应及补体破坏之敏感性小于野生型VSV(VSV-G)之有益安全特征；特异性复制于已不能建立且响应于抗病毒先天性免疫反应(例如I型IFN信号传导)之肿瘤细胞中；不能复制于“健康细胞”中以便自正常组织快速排除；肿瘤细胞中之病毒复制使得可诱导免疫原性细胞死亡、释放肿瘤相关抗原、局部发炎且诱导抗肿瘤免疫性。
本发明进一步包括一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中至少编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21。
在一优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中至少编码以下各项：水疱性口炎病毒核蛋白(N)，其包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体；磷蛋白(P)，其包括如SEQ IDNO:8中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体；大蛋白(L)，其包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体；及基质蛋白(M)，其包括如SEQID NO:10中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
本领域技术人员应理解，可修饰水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)或糖蛋白(G)序列而不损失所述蛋白质之基本功能。本文所用之所述功能变体保留其基本功能或活性之全部或一部分。举例而言，蛋白质L系聚合酶且具有病毒转录及复制期间之必需功能。其功能变体必须保留此能力之至少一部分。保留基本功能或活性之一个良好指征系成功产生仍能够复制且感染肿瘤细胞之病毒(包含所述功能变体)。可在本领域技术人员已知之不同分析系统中测试病毒产生及肿瘤细胞中之感染及复制(一实施例性活体外分析阐述于Muik等人，Cancer Res.,74(13),3567-78,2014中)。
在一优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中至少编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21，其中大蛋白(L)包括与SEQ ID NO:9具有≥80％序列一致性之氨基酸序列。
在一优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中至少编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21，其中核蛋白(N)包括与SEQ ID NO:7具有≥90％序列一致性之氨基酸序列。
在另一优选实施方案中，重组水疱性口炎病毒在其基因组中至少编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21，其中大蛋白(L)包括与SEQ ID NO:9具有相等或大于80％之序列一致性之氨基酸序列且核蛋白(N)包括与SEQ ID NO:7具有≥90％序列一致性之氨基酸序列。
在本发明之一优选实施方案中，本发明的重组棒状病毒之RNA基因组包括如SEQID NO:24中所展示之序列或由其组成。另外，本发明的重组棒状病毒之RNA基因组亦可由其中RNA基因组之核酸根据基因代码简并发生交换(此并不改变各别氨基酸序列)之彼等序列组成或包括彼等序列。在另一优选实施方案中，本发明的重组棒状病毒之RNA基因组包括与SEQ ID NO:24相同或至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之编码序列或由其组成。
应理解，本发明的重组棒状病毒可在其基因组中编码其他负荷，例如肿瘤抗原、其他趋化介素、细胞介素或其他免疫调节组件。
在另一实施方案中，本发明的重组棒状病毒另外在其基因组中编码碘化钠协同载体蛋白(NIS)。表达NIS且与(例如)125I一起共培育可容许使用NIS作为成像报告基因(Carlson等人，Current Gene Therapy,12,33-47,2012)。
重组棒状病毒
众所周知，某些野生型棒状病毒菌株(例如野生型VSV菌株)可视为具有神经毒性。亦报导，感染个体能够以主要针对糖蛋白之高抗体效价快速建立强体液反应。靶向一般棒状病毒及具体而言VSV之糖蛋白G之中和抗体能够限制病毒传播且由此保护个体免于病毒再感染。然而，病毒中和限制了棒状病毒至癌症患者之重复施加。
为消除所述缺点，棒状病毒野生型糖蛋白G可经来自另一病毒之糖蛋白代替。就此而言，代替糖蛋白系指(i)使用编码另一病毒之糖蛋白GP之基因代替编码野生型糖蛋白G之基因，及/或(ii)使用另一病毒之糖蛋白GP代替野生型糖蛋白G。
在一优选实施方案中，使用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、优选地菌株WE-HPI之糖蛋白GP代替棒状病毒糖蛋白G。在一甚至更佳实施方案中，棒状病毒是具有淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、优选地菌株WE-HPI之糖蛋白GP之水疱性口炎病毒。该VSV(例如)阐述于WO2010/040526中且命名为VSV-GP。所提供优点系(i)去除了VSV-G介导之神经毒性及(ii)并无载体性抗体中和(如小鼠中所展示)。
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP可为GP1或GP2。本发明包含来自不同LCMV菌株之糖蛋白。特定而言，LCMV-GP可衍生自野生型LCMV或LCMV菌株LCMV-WE、LCMV-WE-HPI、LCMV-WE-HPlopt。在一优选实施方案中，编码LCMV之糖蛋白GP之基因编码具有如SEQ ID NO:11中所展示氨基酸序列或与SEQ ID NO:11之氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列一致性之氨基酸序列的蛋白质，而包括编码如SEQ ID NO:11中所展示之氨基酸序列之糖蛋白GP的重组棒状病毒的功能性质得以维持。
在另一实施方案中，使用丹德农病毒(DANDV)或莫佩亚(MOPV)病毒之糖蛋白GP代替重组棒状病毒糖蛋白G。在一更佳实施方案中，重组棒状病毒系水疱性口炎病毒，其中糖蛋白G经丹德农病毒(DANDV)或莫佩亚(MOPV)病毒之糖蛋白GP代替。所提供优点系(i)去除了VSV-G介导之神经毒性及(ii)并无载体性抗体中和(如小鼠中所展示)。
丹德农病毒(DANDV)系旧世界沙粒病毒(old world arenavirus)。迄今为止，仅存在本领域技术人员已知之单一菌株，其包括糖蛋白GP且可在本发明内用作本发明的重组棒状病毒中所包括糖蛋白GP之供体。本发明的重组棒状病毒中所包括之DANDV糖蛋白GP具有6个以上糖基化位点、尤其7个糖基化位点。实施例性优选糖蛋白GP系如包括于DANDV中且可以基因库编号EU136038获得者。在一实施方案中，编码DNADV之糖蛋白GP之基因编码如SEQID NO:12中所展示氨基酸序列或与SEQ ID NO:12之氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％序列一致性的序列，而包括编码如SEQ ID NO:12中所展示之氨基酸序列之糖蛋白GP的重组棒状病毒的功能性质得以维持。
莫佩亚病毒(MOPV)系旧世界沙粒病毒。存在本领域技术人员已知之若干菌株，其包括糖蛋白GP且可在本发明内用作本发明的重组棒状病毒中所包括糖蛋白GP之供体。本发明的重组棒状病毒中所包括之MOPV糖蛋白GP具有6个以上糖基化位点、尤其7个糖基化位点。实施例性优选糖蛋白GP系如包括于莫佩亚病毒中且可以基因库编号AY772170获得者。在一实施方案中，编码MOPV之糖蛋白GP之基因编码如SEQ ID NO:13中所展示氨基酸序列或与SEQ ID NO:13之氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列一致性的序列，而包括编码如SEQ ID NO:13中所展示之氨基酸序列之糖蛋白GP的重组棒状病毒的功能性质得以维持。
CCL21及CCL21之功能变体
令人吃惊地发现，在基因组中编码CCL21蛋白的重组棒状病毒能够诱导肿瘤细胞裂解以及免疫原性细胞死亡且刺激肿瘤微环境中之先天性免疫细胞。另外，在所建立经该武装有CCL21的重组棒状病毒处理之小鼠肿瘤模型中观察到延长存活率。
CCL21属CC趋化介素家族且亦称为二级淋巴样组织趋化介素(SLC)、exodus-2、ckb9、scya21、TCA4或6Ckine。CCL21含有结合细胞外基质的C-末端区域。CCL21亦结合至CCR7细胞表面受体且由此施加其功能(例如吸引T细胞及树突状细胞以及活化后者)。CCR7表达于健康者及癌症患者中之各种周边T细胞及树突状细胞上。
因此，在一方面中，在基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体的重组棒状病毒能够增强T细胞及树突状细胞向肿瘤环境之募集。
在另一方面中，高效趋化介素CCL21之局部表达进一步增强优先地T淋巴细胞及树突状细胞向肿瘤微环境之免疫细胞募集且改良重组棒状病毒之效能。
在又一方面中，在基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体的重组棒状病毒用作先天性免疫刺激剂。
在一方面中，在基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体的重组棒状病毒将冷肿瘤转变成热肿瘤。特定而言，所得促发炎性肿瘤微环境将非T细胞浸润(“冷”)肿瘤转变成T细胞发炎(“热”)肿瘤且同时在肿瘤引流淋巴结中生成适应性抗肿瘤免疫反应。
人类CCL21蛋白阐述于(例如)M.Nagira等人，The Journal of BiologicalChemistry,272,19518-19524(1997年8月1日)中，且系总共具有134个氨基酸且具有23个氨基酸之假定信号肽之高碱性多肽：
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP(SEQ ID NO:1)
CCL21蛋白尤其包含包括下列序列或由其组成的CCL21：
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP(SEQ ID NO:2)
优选地，CCL21蛋白包括具有下列序列的蛋白质或由其组成：
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCR(SEQ ID NO:4)
或该蛋白质与SEQ ID NO:4具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一致性。
更佳地，CCL21蛋白包括具有下列序列的蛋白质或由其组成：
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG(SEQ ID NO:3)
或该蛋白质与SEQ ID NO:3具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一致性。
术语“信号肽”或“信号肽序列”系指长度通常为10至30个氨基酸且存在于新合成分泌或膜多肽之N-末端之肽序列，其引导多肽穿过或进入细胞之细胞膜中(原核生物中之浆膜及真核生物中之内质网膜)。通常其随后会被去除。特定而言，信号肽可能能够将多肽引导至细胞之分泌路径中。
应理解，在本发明中，其他(亦即除野生型外)信号肽序列可与CCL21蛋白一起使用。所述其他信号肽序列可代替原始野生型信号肽序列。信号肽包含将核糖体中之新合成蛋白质引向ER且进一步引向高尔基复合体(Golgi complex)以转运至浆膜或转运至细胞外之肽。其通常包含一串疏水性氨基酸且包含免疫球蛋白前导序列以及本领域技术人员已知之其他序列。信号肽尤其包含能够由信号肽酶(位于内质网之池面上之特异性蛋白酶)施加作用之肽。信号肽为本领域技术人员所充分理解且可包含任一已知信号肽。信号肽纳入蛋白质之N-末端且通过信号肽酶处理CCL21蛋白可产生活性生物形式。
在一优选实施方案中，信号肽具有如SEQ ID NO:6中所示之序列。在一相关优选实施方案中，CCL21蛋白包括具有下列序列的蛋白质或由其组成：
MGWSCIILFLVATATGVHSSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG(SEQ ID NO:5)
或该蛋白质与SEQ ID NO:5具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％之一致性。
在一相关实施方案中，CCL21蛋白包含含有SEQ ID No:2、3或4之氨基酸或由其组成或分别与SEQ ID No:2、3或4具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性且进一步包括信号肽序列的蛋白质。在一优选实施方案中，信号肽序列包括SEQ ID NO:5之氨基酸1-19或由其组成。
CCL21蛋白亦包含含有SEQ ID No:2、3或4之氨基酸或由其组成或分别与SEQ IDNo:2、3或4具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97、98％、99％或100％一致性且进一步包括包括SEQ ID NO:1之氨基酸1-23或由其组成之信号肽序列的蛋白质。
CCL21蛋白进一步包含对应于CCL21之胞浆素处理形式的蛋白质。CCL21含有具有净正电荷之独特延伸C-末端(例如约30aa之人类CCL21)，从而有助于结合细胞外基质组分(例如肝素样糖胺聚糖)。截短/缺失C-末端可显著减小与糖胺聚糖(如肝素)之结合。CCL21在人体内由在一些人类癌症中具有缺陷之胞浆素处理。已展示，可通过将CCL21之生物活性(亦即生物学活性)N-末端片段(其类似于CCL21之胞浆素处理形式)编码至重组棒状病毒中来克服胞浆素裂解之必要性。CCL21之胞浆素处理形式之特征在于C-末端之截短/缺失，此可减小结合至肝素及/或硫酸乙酰肝素之能力，该能力可通过本领域技术人员已知之方法来测量。在此背景中，减小之结合至肝素及/或硫酸乙酰肝素之能力系指与具有SEQ ID NO:1或2的CCL21蛋白的对比，且在相同分析中及相同条件下测试时，结合能力减小至具有如SEQ ID NO:1或2(分别含有或不含信号肽序列)中所展示序列的CCL21蛋白之结合能力之95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或更低。
胞浆素系用于溶解纤维蛋白血液凝块之丝胺酸蛋白酶。除纤维蛋白溶解外，胞浆素亦蛋白水解各种其他系统中的蛋白质：其活化胶原酶(补体系统之一些媒介)，且弱化格拉夫卵泡(Graafian follicle)之壁以促使排卵。其裂解纤维蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层黏蛋白及血管性血友病因子(von Willebrand factor)。胞浆素属丝胺酸蛋白酶家族。胞浆素以称为纤维蛋白溶酶原之酶原形式自肝释放至全身性循环中。纤维蛋白溶酶原至活性胞浆素之转化涉及通过(例如)组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、激肽释放素及因子XII(哈格曼因子(Hageman factor))裂解Arg-561与Val-562之间之肽键。
可在结合细胞表面的CCL21中或在活体外通过胞浆素裂解CCL21蛋白，在任一情形下，将CCL21蛋白与胞浆素一起培育。经胞浆素处理的CCL21蛋白由此包含含有对应于SEQID NO:2之氨基酸1-88或与SEQ ID NO:2之氨基酸1-88具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性之序列或由其组成的CCL21。另外，CCL21蛋白包含含有对应于SEQ ID NO:2之氨基酸1-91或与SEQ ID NO:2之氨基酸1-91具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性之序列或由其组成的CCL21。CCL21蛋白亦包含含有对应于SEQ ID NO:2之氨基酸1-104或与SEQ ID NO:2之氨基酸1-104具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性之序列或由其组成的CCL21。
C-末端截短的CCL21蛋白之特征在于CCL21蛋白之延伸c-末端中之氨基酸的缺失及/或突变。通过缺失延伸c-末端中之氨基酸及/或使其突变，与糖胺聚糖(如肝素)之结合由此有所减小。在一优选实施方案中，c-末端截短的CCL21蛋白包括SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2之氨基酸1-79具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一致性，条件系该蛋白质缺乏位置80-111所指示之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸残基，或其中所述残基中之一或多者发生突变。在另一优选实施方案中，c-末端截短的CCL21系包括SEQ ID NO:2或由其组成或与SEQ ID NO:2之氨基酸1-79具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的CCL21，其中SEQ IDNO:2之氨基酸80-111皆缺失(亦即32个缺失)。
在每一情形下，经胞浆素处理的CCL21或c-末端截短的CCL21可进一步包括信号肽序列。尤佳之信号肽序列包括SEQ ID NO:1之氨基酸1-23或SEQ ID NO:5之氨基酸1-19或由其组成。亦可使用其他信号肽序列代替原始信号肽序列。因此，在一优选实施方案中，经胞浆素处理或c-末端截短的CCL21蛋白包括具有下列序列的蛋白质或由其组成：
MGWSCIILFLVATATGVHSSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQ EPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG(SEQ ID NO:5)
或该蛋白质与SEQ ID NO:5具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一致性。
CCL21蛋白亦可包含具有截短信号肽序列的CCL21。在此背景中，截短系指，信号肽序列短于原始信号肽序列，但仍保留用作信号肽之其功能性之至少一部分。举例而言，人类信号肽序列包括SEQ ID NO:1之氨基酸1-23或由其组成。具有截短信号肽序列的CCL21可具有SEQ ID NO:1之氨基酸1-23中之22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个。在另一实施例中，信号肽可包括如SEQ ID NO:6中所展示之序列或由其组成。具有截短信号肽序列的CCL21可具有SEQ ID NO:6之氨基酸1-18中之18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个。
具有截短信号肽序列的CCL21蛋白亦可为包括SEQ ID No:2-4中之任一序列以及短于原始信号肽序列之信号肽序列的蛋白质。同样，举例而言，信号肽序列可具有SEQ IDNO:1之氨基酸1-23中之22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个，或在另一实施例中，信号肽可包括如SEQ ID NO:6中所展示之序列或由其组成。具有截短信号肽序列的CCL21可具有SEQ ID NO:6之氨基酸1-18中之18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个。
CCL21蛋白可为任何来源，包含来自小鼠及大鼠。优选地，CCL21蛋白系来自人类来源。
CCL21蛋白之功能变体包含前述CCL21蛋白之生物活性变体及生物活性片段。变体可在特定阐述的CCL21蛋白之某一位置具有一或多个不同氨基酸。变体可与此一CCL21蛋白共有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高之氨基酸一致性。片段与特定阐述之既定CCL21蛋白具有相同氨基酸，但可缺乏CCL21蛋白之特定部分或区域。
如本文中所使用，在两个或更多个核酸或多肽序列之背景中，术语“一致”或“一致性百分比”系指在针对最大对应性比较及比对时，两个或更多个序列或子序列相同或指定百分比之核苷酸或氨基酸残基相同。为测定一致性百分比，出于最佳对比目的来比对序列(举例而言，可将空位引入第一氨基酸序列或核酸序列中以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置之氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中之某一位置由第二序列中相应位置之相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置一致。两个序列之间之一致性百分比随由所述序列共有之相同位置数而变化(亦即，一致性％＝相同位置数/总位置数(例如重迭位置)×100)。在一些实施方案中，所比较之两个序列在将空位适当地引入所述序列内之后具有相同长度(例如排除延伸超出所比较序列之其他序列)。
可使用数学算法来测定两个序列之间之一致性百分比或类似性百分比。用于比较两个序列之数学算法之一优选非限制性实施例系Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268中之算法，且在Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中加以改进。将此一算法纳入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403-410之NBLAST及XBLAST程序中。可使用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)实施BLAST核苷酸搜索以获得与编码所关注蛋白质之核酸同源之核苷酸序列。可使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)实施BLAST蛋白质搜索以获得与所关注蛋白质同源之氨基酸序列。为获得加空位比对以用于对比目的，如Altschul等人，1997，Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所阐述利用加空位BLAST。或者，可使用PSI-Blast实施迭代搜索以检测分子之间之距离关系(同上)。在利用BLAST、加空位BLAST及PSI-Blast程序时，可使用各别程序(例如XBLAST及NBLAST)之预设参数。用于比较序列之数学算法之另一优选非限制性实施例系Myers及Miller,CABIOS(1989)中之算法。将此一算法纳入ALIGN程序(2.0版)中，该ALIGN程序系GCG序列比对软件包之一部分。在利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12及空位罚分4。用于序列分析之其他算法为业内所已知且包含如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所阐述之ADVANCE及ADAM；及如Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所阐述之FASTA。在FASTA内，ktup系设定搜索之敏感性及速度之控制选项。若ktup＝2，则通过观察之比对残基对来发现所比较两个序列中之类似区域；若ktup＝1，则检验单一比对氨基酸。ktup可设定于2或1(用于蛋白质序列)或1至6(用于DNA序列)。在未指定ktup时之预设为2(用于蛋白质)及6(用于DNA)。或者，可使用CLUSTAL W算法实施蛋白质序列比对，如由Higgins等人，1996,Methods Enzymol.266:383-402所阐述。
在两种情形系下，功能变体皆仅包含CCL21之生物活性变体及片段。在本发明中，在表达于各别细胞或肿瘤细胞中之后，测定编码于重组棒状病毒之基因组中的CCL21变体或CCL21片段之生物活性。此意指，在编码CCL21变体或CCL21片段的重组棒状病毒之背景中(例如在Transwell分析或活体外肿瘤模型中)来测定生物活性。优选地，使用编码CCL21变体或CCL21片段之水疱病毒来测定生物活性。更佳地，使用编码CCL21变体或CCL21片段之VSV-GP来测定生物活性。
生物活性可包含下列能力中之一或多者：化学吸引活性、抗肿瘤活性、调节细胞介素表达(例如增加干扰素-γ(IFN-γ)多肽在同基因哺乳动物细胞群体(包含CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、抗原呈递细胞及肿瘤细胞)中之表达或降低转变生长因子-β(TGF-β)多肽在所述细胞中之表达)。可(例如)根据如实施例中所展示之方案无限制地测试生物活性。出于本发明目的，在相同分析中及相同条件下测试时，若CCL21蛋白之功能变体或片段展示具有如SEQ ID NO:1或2(分别含有或不含信号肽序列)中所展示序列的CCL21蛋白之至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的活性，则其系生物活性的。
不期望受限于理论，发明者已发现，在使用VSV-GP处理肿瘤细胞之后，若干趋化介素及细胞介素因应性上调。CCL21系在VSV-GP处理之后于肿瘤细胞中未上调之趋化介素之一。本发明数据展示，在基因组中编码CCL21蛋白之VSV-GP可尤其有效地治疗癌症且适于进一步改良免疫细胞在感染溶瘤病毒之肿瘤中之浸润，且由此进一步增强抗肿瘤免疫性。
更令人吃惊地，与全长CCL21蛋白相比，编码包括或含有SEQ ID NO:3或4及尤其SEQ ID NO:5之序列的CCL21蛋白的重组棒状病毒甚至可更强力且更有效地用于肿瘤治疗且无需蛋白水解处理即具有活性。
所述CCL21蛋白另外因其较小大小而优于全长CCL21蛋白。较大或多个转基因可负面地影响棒状病毒以及转基因本身之活力、稳定性、溶瘤能力、可制造性或表达。利用较小转基因亦可向容纳其他转基因之能力可能有限之棒状病毒中添加其他转基因。
棒状病毒具有负义单链RNA(ssRNA)作为其基因材料(基因组)。负义ssRNA病毒需要RNA聚合酶来形成正义RNA。正义RNA用作病毒mRNA，其转译成用于产生新病毒材料的蛋白质。使用新形成病毒可产生更多负义RNA分子。
典型棒状病毒基因组编码至少5个呈顺序3’-N-P-M-G-L-5’之结构蛋白。基因组可在结构蛋白之间含有其他短基因间区域或其他基因且由此其长度及架构可有所变化。
根据本发明，CCL21基因可引入棒状病毒基因组之任一位置。端视插入位点，CCL21基因之转录效率可受到影响。一般而言，CCL21基因之转录效率自3′插入至5′先导插入(prime insertion)有所降低。CCL21基因可插入下列基因组位置：3’-CCL21-N-P-M-G-L-5’、3’-N-CCL21-P-M-G-L-5’、3’-N-P-CCL21-M-G-L-5’、3’-N-P-M-CCL21-G-L-5’、3’-N-P-M-G-CCL21-L-5’或3’-N-P-M-G-L-CCL21-5’。在一优选实施方案中，将CCL21基因插入G蛋白与L蛋白之间。
在感染肿瘤细胞之后，编码于重组棒状病毒之基因组中的CCL21基因转录成正义RNA且然后由肿瘤细胞转译成CCL21蛋白。术语“编码(encoding或coding)”系指核酸中之特定核苷酸序列用作模板来合成生物过程中具有界定核苷酸(例如RNA分子)或氨基酸序列及源于其之生物性质之其他聚合物及大分子的固有性质。因此，若在细胞或另一生物系统中通过转录mRNA且随后转译来产生期望蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致)及非编码链二者皆可用作转录基因之模板且可称为编码蛋白质或该基因之另一产物。编码蛋白质之核酸及核苷酸序列可包含内含子。
CCL21基因之转录优选地不受其自有启动子之控制且仅与病毒复制严格相关，由此确保CCL21靶向表达于病毒复制及传播之位置(肿瘤)。因此，CCL21基因之转录不受其他组件(例如启动子或可诱导基因表达组件)之控制。
应了解，核酸序列可在改变或不改变所编码多肽之主要序列下有所变化。编码蛋白质之核酸包含具有不同核苷酸序列但编码蛋白质之相同氨基酸序列(因基因代码之简并性)之任何核酸。本领域技术人员应熟知如何选择表达CCL21蛋白及尤其如本文所揭示之任何特定CCL21蛋白之核酸序列。通过业内已知之各种方法来制备编码CCL21蛋白之氨基酸序列之核酸分子。所述方法包含(但不限于)自天然来源分离或通过早期制备的CCL21蛋白之寡核苷酸调介之(或定点)诱变、PCR诱变及盒式诱变来制备。
药物组合物
实际医药有效量或治疗剂量当然应取决于本领域技术人员已知之因素，例如患者之年龄及体重、给予途径以及疾病之严重程度。在任何情形下，重组棒状病毒应以使得基于患者独特之病状递送医药有效量之剂量及方式来给予。
通常，为治疗及/或缓解本文所提及之疾病、病症及病状且端视拟治疗之特定疾病、病症或病状、拟使用之本发明之特定重组棒状病毒之功效、特定给予途径及所使用之特定医药调配物或组合物，本发明的重组棒状病毒通常将(例如)每周两次、每周一次或以每月剂量来给予，但可尤其端视前述参数而显著变化。因此，在一些情形下，使用低于上文给出之最低剂量可能已足矣，而在其他情形下可能不得不超出上限。在大量给予时，可适当地将其分成众多较小剂量在一天中不同时间给予。
为用于疗法中，将本发明的重组棒状病毒调配成适于促进给予动物或人类之药物组合物。可通过混合重组病毒与生理上可接受之载剂、赋形剂或稳定剂以水溶液或水性或非水性悬浮液形式来制备典型调配物。载剂、赋形剂、改良剂或稳定剂在所采用之剂量及浓度下无毒。其包含缓冲液系统，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其他无机或有机酸及盐其；抗氧化剂，包含抗坏血酸及甲硫胺酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮或聚乙二醇(PEG)；氨基酸，例如甘胺酸、麸酰胺酸、天门冬酰胺、组胺酸、精胺酸或离胺酸；单糖、二糖、寡糖或多糖及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或右旋糖酐；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐相对离子，例如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；及/或离子化或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM(聚山梨醇酯)、PLURONICSTM或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。赋形剂亦可具有释放改良或吸收改良功能。
在一实施方案中，将本发明的重组棒状病毒调配成包括Tris、精胺酸及任选柠檬酸盐之药物组合物。Tris优选地以约1mM至约100mM之浓度来使用。精胺酸优选地以约1mM至约100mM之浓度来使用。柠檬酸盐可以最高100mM之浓度存在。优选调配物包括约50mM Tris及50mM精胺酸。
药物组合物可以液体、冷冻液体或冻干形式来提供。冷冻液体可储存于介于约0℃与约-85℃之间之温度下，包含介于-70℃与-85℃之间之温度及约-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或约-25℃。
本发明的重组棒状病毒或药物组合物不必(但任选)与一或多种当前用于预防或治疗所论述病症之药剂一起调配。所述其他药剂之有效量取决于调配物中存在的重组抗体之量、病症或治疗之类型及上文所论述之其他因素。所述药剂一般以与本文所阐述相同之剂量及如本文所阐述之给予途径来使用，或以本文所阐述剂量之约1％至99％来使用，或以凭经验/临床确定适宜之任一剂量及任一途径来使用。
对于疾病之预防或治疗而言，本发明的重组棒状病毒或药物组合物之合适剂量(在单独使用或与一或多种其他额外治疗剂组合使用时)应取决于拟治疗疾病之类型、重组棒状病毒之类型、疾病之严重程度及病程、给予重组棒状病毒系用于预防目的抑或治疗目的、先前疗法、患者之临床病史及对重组棒状病毒之反应以及主治医师之判断。将本发明的重组棒状病毒或药物组合物适宜地一次性或经一系列治疗给予患者。
端视疾病之类型及严重程度，不论(例如)通过一或多次分开给予抑或通过连续输注来给予，约108至1013个感染性颗粒(通过重组棒状病毒之TCID50所测量)可为给予患者之初始候选剂量。对于经若干天或更长时间重复给予，端视病状而定，治疗通常将持续至对疾病症状之期望抑制出现为止。重组棒状病毒之一实施例性剂量在约108至1013个感染性颗粒(通过TCID50所测量)之范围内。因此，可向患者给予约108、109、1010、1011、1012或1013个感染性颗粒(通过TCID50所测量)(或其任一组合)之一或多个剂量。可间歇性给予所述剂量，例如每周或每三周(例如以使得患者接受约2个至约20个或例如约6个剂量的重组棒状病毒)。可在开始时给予较高负载剂量，随后给予一或多个较低剂量，或反之亦然。然而，可使用其他剂量方案。此疗法之进展可易于通过习用技术及分析来监测。
端视所涉及之具体疾病而定，可使用任一适宜活体外分析、基于细胞之分析、活体内分析及/或本身已知之动物模型或其任一组合来测试本发明的重组棒状病毒及包括其的组合物之效能。适宜分析及动物模型将为本领域技术人员所明了，且包含(例如)下文实施例中所使用之分析及动物模型。
实际医药有效量或治疗剂量当然应取决于本领域技术人员已知之因素，例如患者之年龄及体重、给予途径以及疾病之严重程度。在任何情形下，本发明的重组棒状病毒皆应以使得基于患者独特之病状递送医药有效量之剂量及方式来给予。
或者，端视拟治疗区域之大小、所用病毒效价、给予途径及期望方法效应，可以约50μl至约100ml之体积(包含该范围内之所有数值)来递送本发明的重组棒状病毒或药物组合物。
对于肿瘤内给予而言，体积优选地介于约50μl至约5ml之间，包含约100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、1000μl、1100μl、1200μl、1300μl、1400μl、1500μl、1600μl、1700μl、1800μl、1900μl、2000μl、2500μl、3000μl、3500μl、4000μl或约4500μl之体积。在一优选实施方案中，体积为约1000μl。
对于全身性给予(例如通过输注重组棒状病毒)而言，体积自然可较高。或者，可在即将输注之前将重组棒状病毒之浓溶液稀释成较大体积之输注溶液。
特定而言，对于静脉内给予而言，体积优选地介于1ml于100ml之间，包含约2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、55ml、60ml、70ml、75ml、80ml、85ml、90ml、95ml或约100ml之体积。在一优选实施方案中，体积介于约5ml与15ml之间，更佳地，体积为约6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml或约14ml。
优选地，将相同调配物用于肿瘤内给予及静脉内给予。肿瘤内给予与静脉内给予之间之剂量及/或体积比率可为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或约1:20。举例而言，1:1之剂量及/或体积比率意指，经肿瘤内以及经静脉内给予相同剂量及/或体积，而(例如)约1:20之剂量及/或体积比率意指，静脉内给予剂量及/或体积高于肿瘤内给予剂量及/或体积20倍。优选地，肿瘤内给予与静脉内给予之间之剂量及/或体积比率为约1:9。
期望地，重组棒状病毒之有效浓度介于约108载体基因组/毫升(vg/mL)与1014vg/mL之间。可如McLaughlin等人，J Virol.；62(6):1963-73(1988)中所阐述来测量感染单位。优选地，浓度为约1.5×109至约1.5×1013及更佳地约1.5×109至约1.5×1011。在一实施方案中，有效浓度为约1.5x109。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×1010。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×1011。在又一实施方案中，有效浓度为约1.5×1012。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×1013。在另一实施方案中，有效浓度为约1.5×1014。可期望使用最低有效浓度以减小不期望效应之风险。主治医师可考虑以下因素来选择所述范围中之其他剂量：所治疗个体、优选地人类之身体状态、个体年龄、特定癌症类型及癌症(若为进展性)已发生之程度。
可使用TCID50来表示重组棒状病毒之有效靶浓度。可(例如)通过使用Spearman-
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方法来测定TCID50。期望范围包含介于1×108/ml与1x1014/ml TCID50之间之有效靶浓度。优选地，有效靶浓度为约1×109至约1×1012/ml及更佳地约1×109至约1×1011/ml。在一实施方案中，有效靶浓度为约1×1010/ml。在一优选实施方案中，靶浓度为5×1010/ml。在另一实施方案中，有效靶浓度为约1.5×1011/ml。在一实施方案中，有效靶浓度为约1×1012/ml。在另一实施方案中，有效靶浓度为约1.5×1013/ml。
亦可使用TCID50来表示重组棒状病毒之有效靶剂量。期望范围包含介于1×108与1×1014TCID50之间之靶剂量。优选地，靶剂量为约1×109至约1×1013及更佳地约1×109至约1×1012。在一实施方案中，有效浓度为约1×1010。在一优选实施方案中，有效浓度为约1×1011。在一实施方案中，有效浓度为约1×1012。在另一实施方案中，有效浓度为约1×1013。
在另一方面中，提供含有用于治疗、预防及/或诊断上文所阐述病症之材料之试剂盒或部分试剂盒。该试剂盒或部分试剂盒包括容器及位于该容器上或与该容器相连之标记或包装插页。适宜容器包含(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳组合物自身或该组合物与另一有效治疗、预防及/或诊断病症的组合物之组合，且可具有无菌存取埠(举例而言，容器可为静脉内溶液袋或小瓶，其具有可通过皮下注射针刺穿之塞子)。组合物中之至少一种活性剂系本发明的重组棒状病毒或药物组合物。标记或包装插页指示，组合物用于治疗所选病状。
此外，试剂盒或部分试剂盒可包括(a)其中含有组合物之第一容器，其中该组合物包括本发明的重组棒状病毒或药物组合物；及(b)其中含有组合物之第二容器，其中该组合物包括另一细胞毒性剂或另外治疗剂(例如PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物)。本发明之此实施方案之试剂盒或部分试剂盒可进一步包括包装插页，该包装插页指示所述组合物可用于治疗特定病状、尤其癌症。替代地或另外，试剂盒或部分试剂盒可进一步包括第二(或第三)容器，该容器包括药学上可接受之缓冲剂(例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液)。其可进一步包含自商业及使用者角度考虑期望之其他材料(包含其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器)。
在另一方面中，将本发明的重组棒状病毒与可用于给予重组棒状病毒之装置(例如注射器、注射笔、微型帮浦或其他装置)组合使用。优选地，本发明的重组棒状病毒包括部分试剂盒中，该部分试剂盒(例如)亦包含具有关于使用重组棒状病毒之说明书之包装插页。
医学应用
本发明之另一方面提供在基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体的重组棒状病毒，其用于医学中。
本发明的重组棒状病毒有效诱导肿瘤细胞裂解以及免疫原性细胞死亡且刺激肿瘤微环境中之先天性免疫细胞。因此，本发明的重组棒状病毒可用于治疗及/或预防癌症。
在另一方面中，本发明的重组棒状病毒可用于治疗及/或预防癌症之方法中，该方法包括向患有癌症之个体给予治疗有效量的重组棒状病毒，由此改善一或多种癌症症状。
在又一方面中，本发明另外提供本发明的重组棒状病毒之用途，其用以制造用于治疗及/或预防癌症之药剂。
在又一方面中，本发明的重组棒状病毒可用于治疗及/或预防胃肠道癌、肺癌或头颈癌之方法中，该方法包括向患有胃肠道癌、肺癌或头颈癌之个体给予治疗有效量的重组棒状病毒，由此改善胃肠道癌、肺癌或头颈癌之一或多种症状。
为预防或治疗疾病，重组棒状病毒之适当剂量取决于多种因素，例如上文所定义拟治疗疾病之类型、疾病之严重程度及病程、给予重组棒状病毒之目的系预防性抑或治疗性、先前疗法、患者临床史及对重组棒状病毒之反应以及主治医师之决定。重组棒状病毒适于向患者一次性地或经一系列治疗给予。
在一方面中，癌症系实体癌。实体癌可为脑癌、结肠直肠癌、口咽鳞状细胞癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、食管癌、肝细胞癌、胰脏腺癌、胆管癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、前列腺癌、乳癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶母细胞瘤、非小细胞肺癌、脑肿瘤或小细胞肺癌。优选系治疗胃肠道癌、肺癌及头颈癌。
通过任一适宜方式来给予重组棒状病毒，包含口服、非经肠、皮下、肿瘤内、静脉内、真皮内、腹膜腔内、肺内及鼻内。非经肠输注包含肌内、静脉内、动脉内、腹膜腔内或皮下给予。另外，重组棒状病毒适于通过脉冲输注来给予。在一方面中，通过注射来实施投药，最佳地通过静脉内或皮下注射来投药，此部分地取决于给予系短期抑或长期给予。
端视本发明之具体重组棒状病毒及其具体药物动力学及其他性质而定，其可每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每六天、每周、每月及诸如此类来给予。给予方案可包括长期、每周治疗。“长期”意指持续至少两周且优选若干月或若干年。
治疗时间表可包含各种方案且通常需要经一周、两周、三周或四周之时段向患者给予多个剂量，且任选随后进一步进行一或多轮治疗。在一方面中，以最多1、2、3、4、5或6个剂量在既定时间段内向患者给予本发明的重组棒状病毒。优选地，在三周内达成第一轮治疗。在三周治疗之过程期间，可如下列方案中所阐述向患者给予重组棒状病毒：(i)在第0天一次；(ii)在第0天及第3天；(iii)在第0天、第3天及第6天；(iv)在第0天、第3天、第6天及第9天；(v)在第0天及第5天；(vi)在第0天、第5天及第10天；(vii)在第0天、第5天、第10天及第15天。可重复所述方案且可端视第一轮治疗之结果需要第二或第三轮治疗。基于第一轮治疗来计算，第二轮治疗优选地包含进一步在第21天、第42天及第63天进行治疗。在一优选实施方案中，根据下列方案向患者给予本发明的重组棒状病毒：在第0天、第3天、第21天、第42天及第63天。
本文所用之术语“抑制”在与“改善”及“减轻”相同之背景中意指减弱或减少疾病之一或多个特征。本发明的重组棒状病毒或药物组合物应以符合良好医疗实践之方式来调配、投用及给予。在此背景中需考虑之因素包含所治疗之具体病症、所治疗之具体哺乳动物、个体患者之临床病状、病因、药剂之递送位点、给予方法、给予时间安排及从业医师所知之其他因素。拟给予重组棒状病毒之“治疗有效量”取决于所述考虑，且系预防、改善或治疗临床癌症症状所需之最小量，尤其系有效用于所述病症之最小量。
在另一方面中，可多次且以若干剂量来给予本发明的重组棒状病毒。在一方面中，经肿瘤内给予第一剂量的重组棒状病毒且经静脉内给予后续剂量的重组棒状病毒。在另一方面中，经肿瘤内给予第一剂量及至少一个或多个随后剂量的重组棒状病毒且经静脉内给予后续剂量的重组棒状病毒。可在初始肿瘤内给予之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给予后续剂量。
在另一方面中，经静脉内给予第一剂量的重组棒状病毒且经肿瘤内给予后续剂量的重组棒状病毒。后续剂量可在初始静脉内给予之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给予。
在另一方面中，经静脉内给予重组棒状病毒且经肿瘤内给予后续剂量的重组棒状病毒。
在另一方面中，在每一时间点经静脉内且经肿瘤内给予重组棒状病毒。
如上文所陈述，本发明的重组棒状病毒具有用于刺激针对癌细胞之免疫反应之较大用途。据观察，强免疫活化潜力限于肿瘤微环境。因此，在一优选方面中，可向患者全身性给予本发明的重组棒状病毒。全身性可施加性系关键属性，此乃因许多癌症高度转移且其允许治疗难以到达以及不可到达之肿瘤病灶。因该独特免疫刺激性质，本发明的重组棒状病毒尤其可用于治疗转移性肿瘤。.
一些患者对检查点抑制剂疗法产生抗性且据观察所述患者似乎在IFN路径中累积突变。因此，在一方面中，本发明的重组棒状病毒及尤其本发明的重组水疱性口炎病毒可用于治疗对检查点抑制剂疗法产生抗性之患者。因本发明的重组棒状病毒及尤其重组水疱性口炎病毒之独特免疫促进性质，所述经治疗患者可适于继续检查点抑制剂疗法。
在一优选实施方案中，本发明的重组棒状病毒及尤其本发明的重组水疱性口炎病毒可用于治疗已完成使用PD-1或PD-L1抑制剂(例如PD-1或PD-L1的拮抗性抗体)之检查点抑制剂疗法的非小细胞肺癌患者。
应理解，可使用任一本发明重组棒状病毒或药物组合物来实施上述医药调配物或治疗方法中的任一者。
组合
本发明亦提供组合治疗/方法以较当前使用及/或先前技术中已知之治疗/方法提供某些优点。所述优点可包含活体内效能(例如改良之临床反应、反应延长、反应率增加、反应持续时间、疾病稳定率、稳定化持续时间、疾病进展时间、无进展存活(PFS)及/或整体存活(OS)、后期抗性出现及诸如此类)、安全且充分耐受之给予以及减小之不良事件频率及严重程度。
本发明的重组棒状病毒可与其他药理学活性成分组合使用，所述成分系(例如)当前最新技术或标准护理化合物，例如细胞生长抑制或细胞毒性物质、细胞增殖抑制剂、抗血管生成物质、类固醇、免疫调节剂/检查点抑制剂及诸如此类。
可与本发明的重组棒状病毒组合给予之细胞生长抑制及/或细胞毒性活性物质包含(但不限于)激素、激素类似物及抗激素、芳香酶抑制剂、LHRH激动剂及拮抗剂、生长因子(诸如血小板源生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、人类表皮生长因子(HER，例如HER2、HER3、HER4)及肝细胞生长因子(HGF)等生长因子)抑制剂、诸如(抗)生长因子抗体、(抗)生长因子受体抗体等抑制剂及酪胺酸激酶抑制剂(例如西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼达尼布(nintedanib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠单抗(trastuzumab))；抗代谢物(例如抗叶酸盐，例如胺甲喋呤(methotrexate)、雷替曲塞(raltitrexed)；嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)、多柔比星(doxorubicin)、TAS-102、卡培他滨(capecitabine)及吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤及腺苷类似物，例如巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)(ara C)、氟达拉滨(fludarabine))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类)；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin))；烷基化剂(例如雌二醇氮芥(estramustin)、美罗利他胺(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达喀尔巴嗪(dacarbazin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(例如卡莫司汀(carmustin)及卡莫司汀(lomustin))、噻替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱，例如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesin)、长春瑞滨(vinorelbin)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷(taxane)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel))；血管生成抑制剂，包含贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)及阿柏西普(aflibercept)；微管蛋白抑制剂；DNA合成抑制剂、PARP抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(例如依托泊苷(etoposide)及依托泊苷磷酸盐(etopophos))、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone))、丝胺酸/苏胺酸激酶抑制剂(例如PDK1抑制剂、Raf抑制剂、A-Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、C-Raf抑制剂、mTOR抑制剂、mTORC1/2抑制剂、PI3K抑制剂、PI3Kα抑制剂、双重mTOR/PI3K抑制剂、STK33抑制剂、AKT抑制剂、PLK1抑制剂(例如伏拉塞替(volasertib))、CDK抑制剂(包含CDK9抑制剂)、Aurora激酶抑制剂)、酪胺酸激酶抑制剂(例如PTK2/FAK抑制剂)、蛋白质蛋白质相互作用抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、FLT3抑制剂、BRD4抑制剂、IGF-1R抑制剂、Bcl-xL抑制剂、Bcl-2抑制剂、Bcl-2/Bcl-xL抑制剂、ErbB受体抑制剂、BCR-ABL抑制剂、ABL抑制剂、Src抑制剂、雷帕霉素(rapamycin)类似物(例如依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus))、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂、DNMT抑制剂、HDAC抑制剂、ANG1/2抑制剂、CYP17抑制剂、放射性药剂、免疫治疗剂(例如免疫检查点抑制剂(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3结合分子/免疫球蛋白，例如伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗、派姆单抗)及各种化学治疗剂(例如阿米福汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、罗多耐(clodronat)、非尔司亭(filgrastin)、干扰素、干扰素α、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、利妥昔单抗(rituximab)、丙卡巴肼(procarbazine)、左旋咪唑(levamisole)、美司钠(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸盐(pamidronate)及卟菲尔钠(porfimer)))；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(Bortezomib))；Smac及BH3模拟物；恢复p53功能性之药剂，包含mdm2-p53拮抗剂；Wnt/β-连环蛋白信号传导路径抑制剂；及/或细胞周期蛋白依赖性激酶9抑制剂。
本发明的重组棒状病毒可与使用PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂之治疗组合使用。非固定此一组合治疗可以非固定(例如自由)物质组合形式以固定组合(包含部分试剂盒)形式给予。
非固定在此背景中，本发明含义内之“组合(combination或combined)”包含(但不限于)源自混合或组合一种以上活性剂之产物，且包含固定及非固定(例如自由)组合(包含试剂盒)及应用(例如组分或药剂之同时、并行、依序、连续、交替或分开应用)。术语“固定组合”意指，活性剂皆以单一实体或剂量之形式同时给予患者。术语“非固定组合”意指，活性剂皆以分开实体形式同时、并行或依序给予患者且并无具体时间限制，其中该给予在患者之身体中提供治疗有效量之两种化合物。后者亦适用于鸡尾酒疗法，例如给予三种或更多种治疗剂。
本发明提供重组棒状病毒与PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂之组合，其用于治疗如本文所阐述之癌症、优选地用于治疗实体癌。
本发明亦提供重组棒状病毒与PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂之组合之用途，其用以制造用于治疗及/或预防如本文所阐述之癌症、优选地用于治疗实体癌之药剂。
本发明另外提供治疗及/或预防癌症之方法，其包括向患有癌症之个体给予治疗有效量之本发明的重组棒状病毒及PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂，由此改善一或多种癌症症状。本发明的重组棒状病毒及PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂可同时、依序或交替给予。
本发明的重组棒状病毒及PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂可通过相同给予途径或经由不同给予途径给予。优选地，经静脉内给予PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂且经肿瘤内给予本发明的重组棒状病毒。在另一实施方案中，经静脉内给予PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂且经肿瘤内给予本发明的重组棒状病毒至少一次，且经静脉内给予后续剂量的重组棒状病毒。可在初始肿瘤内给予之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给予后续剂量。在一优选实施方案中，在初始肿瘤内给予之后21天给予PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂。
尤佳地，使用本发明的重组棒状病毒与以下各项之组合进行治疗：
(i)SMAC模拟物(SMACm)/IAP拮抗剂，
(ii)免疫治疗剂，包含抗PD-1及抗PD-L1药剂以及抗LAG3药剂，例如派姆单抗及纳武单抗及如WO2017/198741中所揭示之抗体。
如本文所提供之组合包括(i)本发明的重组棒状病毒及(iia)PD-1路径抑制剂、优选地针对PD-1或PD-L1的拮抗性抗体或(iib)SMACm/IAP拮抗剂。另外提供此一包括(i)及(iia)或(i)及(iib)之组合之用途，其用于治疗如本文所阐述之癌症。
在另一方面中，提供组合治疗，其包括使用(i)本发明的重组棒状病毒及(iia)PD-1路径抑制剂或(iib)SMACm/IAP拮抗剂。在该组合治疗中，本发明的重组棒状病毒可与PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂同时、依序或交替给予。
举例而言，“同时”给予包含在相同之一般时间段内(例如在同一天，但未必同时)给予活性剂。交替给予包含在某一时间段期间(例如经几天或一周之过程)给予一种药剂，随后在后续时间段期间(例如经几天或一周之过程)给予另一药剂，且然后重复该模式一或多个循环。依序或连续给予包含在第一时间段期间(例如经几天或一周之过程)使用一或多个剂量给予一种药剂，随后在第二时间段期间(例如经几天或一周之过程)使用一或多个剂量给予另一药剂。亦可采用重迭时间表，其包含在不同日期于治疗期内给予活性剂且未必根据规则序列。亦可(例如)根据所用药剂及个体病状采用所述一般导则之变化形式。
依序治疗时间表包含给予本发明的重组棒状病毒且随后给予PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂。依序治疗时间表亦包含给予PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂且随后给予本发明的重组棒状病毒。依序治疗时间表可包含在彼此之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给予。
本发明及所有其实施方案之含义内之PD-1路径抑制剂系抑制PD-1与其受体之相互作用的化合物。PD-1路径抑制剂能够削弱优选地由PD-1受体调介之PD-1路径信号传导。PD-1抑制剂可为任一针对能够拮抗PD-1路径信号传导之任一PD-1路径成员之抑制剂。该抑制剂可为靶向任一PD-1路径成员、优选地针对PD-1受体、PD-L1或PD-L2的拮抗性抗体。同样，PD-1路径抑制剂可为PD-1受体或阻断PD1配体活性之PD-1受体之片段。
PD-1拮抗剂在业内已众所周知，如由Li等人，Int.J.Mol.Sci.2016,17,1151(以引用方式并入本文中)中所综述。任一PD-1拮抗剂、尤其抗体(例如由Li等人所揭示者以及下文所揭示之其他抗体)可用于本发明中。优选地，本发明及所有其实施方案之PD-1拮抗剂系选自下列抗体组成之群：
·派姆单抗(抗PD-1抗体)；
·纳武单抗(抗PD-1抗体)；
·匹利珠单抗(抗PD-1抗体)；
·PDR-001(抗PD-1抗体)；
·如下文所揭示之PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5(抗PD-1抗体)
·阿替珠单抗(抗PD-L1抗体)；
·阿维鲁单抗(抗PD-L1抗体)；
·德瓦鲁单抗(抗PD-L1抗体)。
派姆单抗(先前亦称为兰布鲁珠单抗(lambrolizumab)；商品名：Keytruda；亦称为MK-3475，揭示于(例如)Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44中)系结合至PD-1之人类化IgG4单株抗体；其在C228P处含有经设计以防止Fc介导之细胞毒性之突变。派姆单抗(例如)揭示于US 8,354,509及WO2009/114335中。其由FDA批准用于治疗患有不可切除性或转移性黑色素瘤之患者及患有转移性NSCLC之患者。
纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4；BMS-936558或MDX1106b)系特异性阻断PD-1之全人类IgG4单株抗体，其并无可检测之抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。纳武单抗(例如)揭示于US 8,008,449及WO2006/121168中。其已由FDA批准用于治疗患有不可切除性或转移性黑色素瘤、转移性NSCLC及晚期肾细胞癌之患者。
匹利珠单抗(CT-011；Cure Tech)系结合PD-1之人类化IgG1k单株抗体。匹利珠单抗(例如)揭示于WO2009/101611中。
PDR-001或PDR001系阻断PD-L1及PD-L2结合至PD-1之高亲和力、配体阻断性、人类化抗PD-1IgG4抗体。PDR-001揭示于WO2015/112900及WO2017/019896中。
抗体PD1-1至PD1-5系通过如表1中所展示之序列定义之抗体分子，其中HC表示(全长)重链且LC表示(全长)轻链：
表1：
Figure GDA0003323684110000391
Figure GDA0003323684110000401
Figure GDA0003323684110000411
具体而言，上文所阐述之抗PD-1抗体分子具有：
(PD1-1:)包括SEQ ID NO:14之氨基酸序列之重链及包括SEQ ID NO:15之氨基酸序列之轻链；或
(PD1-2:)包括SEQ ID NO:16之氨基酸序列之重链及包括SEQ ID NO:17之氨基酸序列之轻链；或
(PD1-3:)包括SEQ ID NO:18之氨基酸序列之重链及包括SEQ ID NO:19之氨基酸序列之轻链；或
(PD1-4:)包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列之重链及包括SEQ ID NO:21之氨基酸序列之轻链；或
(PD1-5:)包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列之重链及包括SEQ ID NO:23之氨基酸序列之轻链。
阿替珠单抗(Tecentriq，亦称为MPDL3280A)系靶向PD-L1之噬菌体源人类IgG1k单株抗体且阐述于(例如)Deng等人，mAbs 2016；8:593-603中。其已由FDA批准用于治疗患有尿路上皮癌之患者。
阿维鲁单抗系全人类抗PD-L1 IgG1单株抗体且阐述于(例如)Boyerinas等人，Cancer Immunol.Res.2015；3:1148-1157中。
德瓦鲁单抗(MEDI4736)系对PD-L1具有高特异性之人类IgG1k单株抗体且阐述于(例如)Stewart等人，Cancer Immunol.Res.2015；3:1052-1062或Ibrahim等人，Semin.Oncol.2015；42:474-483中。
可使用由Li等人(见上文)揭示或在临床试验中已知之其他PD-1拮抗剂(例如AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、REGN2810、BMS-936559、JS001-PD-1、SHR-1210、BMS-936559、TSR-042、JNJ-63723283、MEDI4736、MPDL3280A及MSB0010718C)来替代或补充上文所提及之拮抗剂。
本文所用之INN意欲亦涵盖所有与原始抗体具有相同或实质上相同之氨基酸序列之生物类似抗体，包含(但不限于)彼等根据美国42USC§262分款(k)及其他管辖区中之等效法规授权之生物类似抗体。
业内已知上文所列示之PD-1拮抗剂以及其各别制造、治疗用途及性质。
在一实施方案中，PD-1拮抗剂系派姆单抗。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系纳武单抗。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系匹利珠单抗。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系阿替珠单抗。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系阿维鲁单抗。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系德瓦鲁单抗。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系PDR-001。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系PD1-1。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系PD1-2。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系PD1-3。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系PD1-4。
在另一实施方案中，PD-1拮抗剂系PD1-5。
本发明及所有其实施方案之含义内之SMAC模拟物系结合至IAP蛋白且诱导其降解之化合物。优选地，本发明及所有其实施方案内之SMAC模拟物选自由下列组成之群(A0)：
·如WO 2013/127729中所(一般地及/或特定地)揭示之SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；
·如WO 2015/025018中所(一般地及/或特定地)揭示之SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；
·如WO 2015/025019中所(一般地及/或特定地)揭示之SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；
·如WO 2016/023858中所(一般地及/或特定地)揭示之SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；
·如WO 2008/0016893中所(一般地及/或特定地)揭示之SMAC模拟物(亦即化合物)或其药学上可接受的盐；
·WO 2008/016893(第28/29页；[122])之实施例1中之LCL161(亦即化合物A)或其药学上可接受的盐；
·称为Debio-1143之SMAC模拟物或其药学上可接受的盐；
·称为比利庞特(birinapant)之SMAC模拟物或其药学上可接受的盐；·称为ASTX-660之SMAC模拟物或其药学上可接受的盐；
·称为CUDC-427之SMAC模拟物或其药学上可接受的盐
·表2中之SMAC模拟物1至26中的任一者或其药学上可接受的盐：
表2：
Figure GDA0003323684110000441
Figure GDA0003323684110000451
Figure GDA0003323684110000461
Figure GDA0003323684110000471
Figure GDA0003323684110000481
表2中之实施例化合物1至10揭示于WO 2013/127729中。表2中之实施例化合物11至26揭示于WO 2016/023858中。
本文所用之术语“SMAC模拟物/IAP拮抗剂”亦包含呈互变异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物(包含药学上可接受的盐之水合物或溶剂合物)之形式之上文所列示之SMAC模拟物。其亦包含呈所有其固体、优选地结晶形式及呈其药学上可接受的盐之所有结晶形式、水合物及溶剂合物(包含药学上可接受的盐之水合物及溶剂合物)形式之SMAC模拟物。
业内已知上文所列示之所有SMAC模拟物以及各别合成及性质。上文所提及之所有专利申请案之全部内容皆以引用方式并入本文中。
在一实施方案中，SMAC模拟物系LCL161或其药学上可接受的盐(A1)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物1或其药学上可接受的盐(A2)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物2或其药学上可接受的盐(A3)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物3或其药学上可接受的盐(A4)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物4或其药学上可接受的盐(A5)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物5或其药学上可接受的盐(A6)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物6或其药学上可接受的盐(A7)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物7或其药学上可接受的盐(A8)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物8或其药学上可接受的盐(A9)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物9或其药学上可接受的盐(A10)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物10或其药学上可接受的盐(A11)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物11或其药学上可接受的盐(A12)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物12或其药学上可接受的盐(A13)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物13或其药学上可接受的盐(A14)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物14或其药学上可接受的盐(A15)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物15或其药学上可接受的盐(A16)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物16或其药学上可接受的盐(A17)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物17或其药学上可接受的盐(A18)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物18或其药学上可接受的盐(A19)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物19或其药学上可接受的盐(A20)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物20或其药学上可接受的盐(A21)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物21或其药学上可接受的盐(A22)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物22或其药学上可接受的盐(A23)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物23或其药学上可接受的盐(A24)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物24或其药学上可接受的盐(A25)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物25或其药学上可接受的盐(A26)。
在另一实施方案中，SMAC模拟物系表2中之化合物26或其药学上可接受的盐(A27)。
就SMAC模拟物之性质而言，所有实施方案(A1)至(A27)皆系实施方案(A0)之优选实施方案。
在关于组合治疗之一优选实施方案中，重组棒状病毒系在基因组中编码至少一种选自包括以下之群的CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21,的重组水疱性口炎病毒：(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白；(ii)c-末端截短的CCL21蛋白；(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；(iv)包括SEQ IDNO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；(v)包括SEQID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；(vi)如(i)-(v)中任一者之进一步包括信号肽序列的蛋白质；(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ IDNO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；或(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质，其中编码重组水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由LCMV之糖蛋白GP代替。
在另一关于组合治疗之优选实施方案中，重组棒状病毒系在基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21的重组水疱性口炎病毒，其中CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白；(ii)c-末端截短的CCL21蛋白；(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；(vi)如(i)-(v)中任一者之进一步包括信号肽序列的蛋白质；(vii)包括SEQ IDNO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质；或(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的蛋白质，其中编码水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由LCMV之糖蛋白GP代替，且其中核蛋白(N)包括如SEQ IDNO:7中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体，磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体，大蛋白(L)包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体，且基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体。
在关于组合治疗之一更佳实施方案中，重组棒状病毒系在基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体、优选地人类CCL21的重组水疱性口炎病毒，其中CCL21蛋白或其功能变体包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，其中编码重组水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由LCMV之糖蛋白GP代替。
尽管本发明的重组棒状病毒及尤其本发明之水疱性口炎病毒以及PD-1抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂之组合可格外有效地治疗癌症，但发明者发现，不编码额外负荷(亦即不编码CCL21蛋白)之水疱性口炎病毒在与PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂组合时之组合亦系有效的。特定而言，VSV-GP(具有LCMV之糖蛋白之水疱性口炎病毒)与PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂(二者皆如本文所阐述)之组合治疗可有效治疗癌症、优选地实体癌。因此，本文亦提供包括不编码CCL21蛋白之VSV-GP及PD-1路径抑制剂(优选是针对PD-1或PD-L1的拮抗性抗体)或SMACm/IAP拮抗剂之组合。另外提供此一组合用于治疗如本文所阐述之癌症之用途。另外提供一种组合治疗，其包括使用不编码CCL21蛋白之VSV-GP及PD-1路径抑制剂或SMACm/IAP拮抗剂。
对于不编码CCL21蛋白之VSV-GP之组合治疗而言，优选地，重组棒状病毒系重组水疱性口炎病毒，其中编码重组水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由LCMV之糖蛋白GP代替。
另外，对于不编码CCL21蛋白之VSV-GP之组合治疗而言，优选地，重组棒状病毒系在基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)的重组水疱性口炎病毒，其中编码水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或糖蛋白G由LCMV之糖蛋白GP代替，且其中核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体，磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸或与SEQID NO:8至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体，大蛋白(L)包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体，且基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致之功能变体。
病毒生成、产生及产病毒细胞
本发明亦提供产病毒细胞，其特征在于该细胞产生本发明的重组棒状病毒或重组水疱性口炎病毒。
细胞可为任一来源且可以经分离细胞形式或以包括于细胞群体中之细胞形式存在。优选地，产生重组棒状病毒或重组水疱性口炎病毒之细胞系哺乳动物细胞。在一更佳实施方案中，本发明之产病毒细胞之特征在于，哺乳动物细胞系多能成体祖细胞(MAPC)、神经干细胞(NSC)、间叶系干细胞(MSC)、HeLa细胞、HEK细胞、任一HEK293细胞(例如HEK293F或HEK293T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠肾(BHK)细胞或Vero细胞或骨髓源肿瘤浸润细胞(BM-TIC)。
或者，产病毒细胞可为人类细胞、猴细胞、小鼠细胞或仓鼠细胞。本领域技术人员熟知适用于测试既定细胞是否产生病毒及由此特定细胞是否属本发明范围内之方法。就此而言，由本发明细胞产生之病毒之量并无特定限制。在感染之后且在并未进一步进行下游处理下，既定细胞培养物之粗制上清液中之优选病毒效价为≥1×107TCID50/ml或≥1×108个基因组拷贝/ml。
在一特定实施方案中，本发明之产病毒细胞之特征在于，该细胞包括一或多个用于表达至少一种选自由以下组成之群之基因之表达盒：编码VSV的蛋白质N、L、P及M之基因n、l、p及m以及编码LCMV-GP、丹德农-GP或莫佩亚-GP糖蛋白之基因gp。
本发明含义中之产病毒细胞包含用于自不可复制型载体产生重组棒状病毒之经典包装细胞以及用于自能够复制之载体产生重组棒状病毒的产生细胞。包装细胞通常包括一或多个用于表达在拟包装各别载体中缺乏及/或系产生病毒所需之必需基因之质体。本领域技术人员已知所述细胞且可选择适用于期望目的之适当细胞系。
本发明的重组棒状病毒可根据本领域技术人员已知之方法来产生，且包含(但不限于)使用(1)转染至细胞中的CDNA，或(2)转染至辅助细胞中的CDNA之组合，或(3)转染至细胞中的CDNA，该细胞进一步利用辅助病毒/微型病毒感染以反式提供产生感染性或非感染性重组棒状病毒所需之剩余组分或活性。使用所述方法(例如辅助病毒/微型病毒、辅助细胞系或仅cDNA转染)中的任一者，所需之最少组分系含有用于(1)通过棒状病毒N蛋白、P蛋白及L蛋白衣壳化基因组(或反基因组)RNA及(2)复制基因组或反基因组(复制中间体)RNA等效物之顺式作用信号之DNA分子。
复制组件或复制子系在5'及3'端最少含有棒状病毒之前导序列及尾随序列之RNA链。在基因组意义上，前导体位于3'端处且尾随体位于5'端处。任一位于该两个复制信号之间之RNA继而发生复制。前导区及尾随区另外必须含有引发转录及复制所需之用于N蛋白衣壳化及聚合酶结合之目的最少顺式作用组件。为制备重组棒状病毒，含有G基因之微型病毒亦含有前导区、尾随区及具有用于产生G蛋白mRNA之适当起始及终止信号之G基因。若微型病毒进一步包括M基因，则必须亦存在用于产生M蛋白mRNA之适当起始及终止信号。
对于任一含于重组棒状病毒基因组内之基因而言，该基因侧接有容许表达彼等基因且产生蛋白质产物之适当转录起始及终止信号(Schnell等人，Journal of Virology,p.2318-2323,1996)。为产生“非感染性”重组棒状病毒，重组棒状病毒必须具有最少复制子组件及N、P及L蛋白且其必须含有M基因。此产生源自细胞、但系非感染性颗粒之病毒颗粒。为产生“感染性”颗粒，病毒颗粒必须另外包括可(例如)经由使用附接蛋白或受体配体调介病毒颗粒结合及融合的蛋白质。棒状病毒之天然受体配体系G蛋白。
可使用任一允许组装重组棒状病毒之细胞。制备感染性病毒颗粒之一种方法包括感染编码T7 RNA聚合酶或其他适宜噬菌体聚合酶(例如T3或SP6聚合酶)之质体之适当细胞系。然后可使用含有编码G、N、P、L及M棒状病毒蛋白之基因之个别cDNA转染细胞。所述cDNA将提供用于构建重组棒状病毒颗粒的蛋白质。可通过业内已知之任一方法来转染细胞。
亦将含有棒状病毒基因组RNA等效物之“多顺反子cDNA”转染至细胞系中。若感染性重组棒状病毒颗粒意欲溶解于感染细胞中，则必须存在编码N、P、M及L蛋白之基因以及任一异源性核酸区段。若感染性重组棒状病毒颗粒并不意欲溶解，则编码M蛋白之基因并不包含于多顺反子DNA中。“多顺反子cDNA”意指至少包括含有编码N、P及L蛋白之基因之转录单元的CDNA。重组棒状病毒多顺反子DNA亦可含有编码蛋白质变体或其多肽片段之基因或治疗性核酸或蛋白质。或者，可反式供应任一拟最初与首先产生之病毒颗粒缔合的蛋白质或其片段。
亦涵盖包括编码CCL21之基因之多顺反子cDNA。所涵盖多顺反子cDNA可含有编码蛋白质变体之基因、编码报告基因之基因、治疗性核酸及/或N-P-L基因或N-P-L-M基因。生成重组棒状病毒之第一步骤系表达作为cDNA之基因组或反基因组等效物之RNA。然后，该RNA由N蛋白包装且然后由P/L蛋白复制。可回收由此产生的重组病毒。若G蛋白不存在于重组RNA基因组中，则其通常反式供应。若G蛋白及M蛋白二者皆不存在，则二者皆反式供应。对于制备“非感染性棒状病毒”颗粒而言，程序可与上文相同，只是转染至细胞中之多顺反子cDNA将仅含棒状病毒之N、P及L基因。非感染性棒状病毒颗粒之多顺反子cDNA可另外含有编码蛋白质之基因。
通常将经转染细胞在期望温度、通常约37℃下培育至少24hr。对于非感染性病毒颗粒而言，收集上清液且分离病毒颗粒。对于感染性病毒颗粒，收获含有病毒之上清液且转移至新鲜细胞中。将新鲜细胞培育大约48小时，且收集上清液。
自下文藉助实施例阐释本发明原理之更详细实施例将易知本发明之其他特征及优势。
实施例
实施例1
VSV-GP感染肿瘤中之免疫浸润/活化及免疫检查点表达之诱导
表达分析/NanoString(图1)
为更佳地理解使用VSV-GP平台之治疗性干预之影响，在对照或VSV-GP感染肿瘤中分析免疫细胞浸润(T细胞：CD3ε、CD4及CD8)、活化(CD69、颗粒酶B(GzmB)及穿孔素(Prf1))以及免疫检查点(PD-L1(CD274)、PD-1(Pdcd1)、Ctla-4、Tigit及Lag3)表达。为此，使用具有确立LLC1-IFNARKO(缺失干扰素α受体之LLC1肿瘤细胞)肿瘤的C57BL/6小鼠作为对照或使用1×108TCID50 VSV-GP之单一静脉内注射进行治疗。在治疗后7天，切除肿瘤；提取全RNA并使用来自NanoString之“Pan Cancer Immune Profiling Panel”根据制造商说明书来进行分析。如图1中所绘示，VSV-GP治疗可强烈上调所分析基因(包含PD-L1及PD-1基因)之表达。
实施例2
效能：VSV-GP与抗PD-1之组合
肿瘤生长(图2A-D)
基于PD-1或PD-L1阻断抗体在癌症患者中之临床成功及阐释使用VSV-GP平台进行治疗可活化肿瘤浸润性T细胞且同时上调免疫检查点(例如PD-1及PD-L1)之自有数据(参见图1)，使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型(缺失干扰素α受体的CT26.CL25肿瘤细胞)分析组合VSV-GP源治疗剂与PD-1阻断抗体之治疗潜力。
皮下注射的CT26Cl25 IFNAR-/-肿瘤细胞之植入率为100％(50/50小鼠)。在第8天(病毒施加之日)，中值肿瘤大小为0.05cm3。以60天间隔追踪肿瘤生长。仿真(＝未治疗)对照显示10％之自发性缓解(1/10)且一个肿瘤生长地极慢。在仅使用静脉内VSV-GP治疗之小鼠中，观察到30％(3/10小鼠)之完全缓解。始于植入后第11天之单独PD-1治疗对肿瘤生长并无效应。VSV-GP与抗PD-1之组合产生高肿瘤缓解率。当在VSV-GP治疗之后施加抗PD-1时，可看到70％(7/10小鼠)之完全缓解。小鼠保持无肿瘤至少60天。总而言之，在组合组中达成高存活率(未展示)。
实施例3
记忆形成：VSV-GP及VSV-GP/抗PD-1组合
肿瘤生长/再攻击(图3A-C)
对来自VSV-GP/抗PD-1组合实验之治愈小鼠进行保护以免于再攻击。对来自VSV-GP/抗PD-1组合组(n＝7)或仅VSV-GP(低剂量，n＝3)组之小鼠进行再攻击。简言之，将CT26Cl25 IFNAR-/-细胞经皮下注射至小鼠之左侧腹中且随时间监测肿瘤生长。作为阳性对照，向年龄及性别匹配之幼稚小鼠(n＝10)中经皮下植入CT26Cl25 IFNAR-/-且肿瘤生长与如先前所观察之一个自发性缓解一致。在VSV-GP/抗PD-1组合组(n＝7)或仅VSV-GP(低剂量，n＝3)组中未观察到肿瘤过度生长，从而指示治愈小鼠产生一定免疫学记忆。
实施例4
CCL21负荷之选择及肿瘤中之VSV-GP诱导之趋化介素表达
Figure GDA0003323684110000571
表达分析(图4)
通过测量多种趋化介素之表达来分析使用VSV-GP平台之治疗性干预在临床前肿瘤模型中之影响(图4)。在使用1×108TCID50 VSV-GP之单一静脉内治疗之后3或7天，LLC1-IFNARKO肿瘤中的CCL5、CXCL9、CXCL10及其他趋化介素之表达强烈上调。另一方面，CCR7配体CCL19及CCL21之表达并未因VSV-GP感染而上调。
实施例5
VSV-CCL21重组体之生成
病毒拯救(图5)
基于实施例4中所阐述之发现，改造溶瘤病毒VSV-GP之基因组以编码CCL21基因(参见图5)，从而在病毒复制期间之肿瘤位点处局部表达CCL21趋化介素且填充VSV-GP之“免疫治疗间隙”(VSV-GP不能上调CCR7配体CCL19及CCL21)，并进一步改良溶瘤病毒VSV-GP之免疫细胞浸润以及治疗效能。
藉助反向基因学(选殖所关注基因(GOI)、病毒拯救及重复斑块纯化)自含有用于完整VSV-GP病毒基因组的CDNA及鼠类或人类CCL21形式之细菌质体来生成可复制型VSV-GP-CCL21病毒变体。pVSV-GP-CCL21质体系基于质体pVSV-XN1(Schnell等人]，后者含有在T7启动子控制下之VSV印第安纳血清型之完整cDNA基因组。为生成pVSV-GP-CCL21变体，通过来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV，WE-HPI菌株)之GP套膜蛋白之密码子优化序列代替VSV G套膜蛋白之整个序列。另外，通过吉布森组装(Gibson assembly)将编码CCL21基因之合成核酸插入糖蛋白GP与病毒聚合酶L之间。通过CCL21开放阅读框中3’端处之额外VSV起始信号序列及5’端处之额外终止信号序列来确保病毒感染背景中的CCL21基因转录(图5A)。
通过使用标准转染方法(例如CaPO4沈淀、脂质体DNA递送)转染HEK293T或任一其他VSV允许细胞系自质体cDNA回收(或拯救)感染性病毒。简言之，使用编码VSV蛋白N、P及L以及密码子优化T7-聚合酶之基于pSF-CAG-amp之表达质体转染HEK293T细胞。另外，共转染编码VSV-GP、VSV-GP-CCL21或其变体之病毒基因组cDNA之质体(图5B)。在拯救过程之第一步骤中，T7聚合酶自质体代码之病毒cDNA转录病毒RNA基因组。在第二步骤中，自共转染质体外源性表达之VSV-L及-P蛋白进一步扩增病毒RNA基因组。通过VSV-N蛋白使病毒RNA基因组共转录性地衣壳化。另外，P/L聚合酶复合物容许转录整组病毒基因产物N、P、M、GP及L以及所插入CCL21变体。随后将病毒RNA基因组包装至含有核糖核蛋白、基质蛋白及病毒套膜GP之感染性VSV颗粒中。病毒颗粒通过出芽自细胞释放。
首先使拯救病毒在允许细胞系(例如HEK293T、BHK21Cl.13或VERO)上传代。实施数轮斑块纯化，然后通过标准方法生成病毒种储备液。简言之，使用经拯救之初步种子(pre-seed)之连续10倍稀释液感染HEK293T、BHK21Cl.13或VERO细胞。在大约两小时之后，将细胞单层洗涤两次且用含有0.8％低熔点琼脂糖之培养基覆盖。在感染后24h至48h，挑选斑块且使用病毒进行再一轮之斑块纯化或生成病毒种储备液。
实施例5.1
活体外病毒适应性之验证
TCID50(图19A-C)
在感染之前一天，将Vero、BHK21及HEK293细胞接种至6孔板中。相应培养基如下：(a)Vero细胞：DMEM(Gibco，第31966-021号)+5％热灭活FBS(Gibco，第10500-064号)，(b)BHK21细胞：GMEM(Life Technologies，第21710-082/025号)+10％热灭活FBS(Gibco，第10500-064号)+5％TPB胰蛋白磷酸盐培养液(Life Technologies，第18050-039号)，(c)HEK293细胞：FreestyleTM 293表达培养基(ThermoFisher Scientific，第12338018号)。
在感染当天，所有细胞系皆具有60-70％之铺满度。针对每一细胞系对一个孔进行计数(CountessTM细胞计数器，Invitrogen)，然后使用0.005MOI病毒构筑体VSV-GP(GP)、VSV-GP-huCCL21(21)或VSV-GP-huCCL21(1-79)(21k)中的一者感染其他孔。
在感染后0h、24h或48h收获培养上清液(3mL总体积)以通过测量TCID50/mL来测定病毒复制能力。
在接种于感染之前一天之VERO细胞之96孔板上测定TCID50(中值组织培养感染剂量)。对于所有上清液，制备22个连续半对数稀释(介于1E-1.0至1E-11.5之间)且一式四份进行滴定。在感染之后6天时，通过微观检查板来读出致细胞病变效应(CPE)。
根据Spearman-Karber式M＝x+d[0.5-(1/n)(r)]来计算TCID50/mL，其中x：所测试最高稀释度之正指数；d＝稀释间隔；n＝孔数/稀释液；r＝阴性反应之总数。
实施例5.2
活体外负荷表达
ELISA/西方墨点(图6A-B及图12A-B及图18)
为证实及量化病毒CCL21负荷(转基因)之表达且更佳地表征不同CCL21变体，实施CCL21特异性ELISA以及西方墨点分析。如图6A及图12A所绘示，在病毒感染后于不同时间点使用小鼠或人类特异性ELISA分析分别来自VSV-GP-muCCL21(图6A；表达全长鼠类CCL21之VSV-GP)感染之HEK293细胞或VSV-GP-huCCL21(图12A；表达全长人类CCL21之VSV-GP)之上清液。另外，亦使用人类CCL21特异性西方墨点表征人类CCL21变体，亦即全长人类CCL21及类似于人类CCL21之前79个氨基酸(不含信号序列)的C-末端截短形式＝CCL21(1-79)。如图18(自左侧)中所绘示，分析来自经质体转染之HEK293细胞(其编码CCL21(1-79)或全长CCL21蛋白)之上清液以及来自感染指示病毒之HEK293细胞之上清液。趋化介素变体充分表达于两种系统(质体及病毒)中。尽管全长CCL21试样含有多种CCL21物质或分解/裂解产物，但CCL21(1-79)蛋白呈现为清洁单带。
实施例5.3
活体外负荷活性
Transwell(T细胞/DC)(图6A及12A及16及17)
为证实且进一步表征病毒CCL21负荷(转基因)之生物功能性，在Transwell迁移分析中分析其吸引T细胞或单核球源树突状细胞(moDCs)之能力。为此，将实施例5.2(图6A及12A)中分别所阐述含有小鼠及人类CCL21之上清液、仅迁移介质(背景对照)、重组CCL21(阳性对照)或来自经VSV-GP感染之HEK293细胞之匹配上清液(VSV-GP背景对照)添加至Transwell迁移分析设置之底部孔中，且将CD3/28刺激小鼠(图6；右侧)或人类(图12；右侧)T细胞添加至上部室(Transwell Insert)中。在培育后，使用
Figure GDA0003323684110000591
CellTiter-
Figure GDA0003323684110000592
细胞活力分析来量化底部孔中之细胞。结果绘示为相对于仅迁移介质对照之“倍数增加”。其他实验包含短负荷形式的CCL21、CCL21(1-79)(人类CCL21之aa 1-79)及源自胞浆素调介性处理之最短天然CCL21片段；使用上述分析的CCL21(1-81)(人类CCL21之aa 1-81)(参见图15)。出于此目的，生成来自经表达质体转染之HEK293细胞之上清液并分析(参见图16)。在最后步骤中，通过使用上述Transwell迁移分析及moDC(作为反应细胞)比较来自经VSV-GP、VSV-GP-huCCL21(全长)及VSV-GP-huCCL21(1-79)感染之HEK293细胞之上清液。在此分析中，全长人类CCL21及CCL21(1-79)皆产生相当之moDC迁移(参见图17)。
实施例5.4
活体外物种交叉反应性(人类与小鼠及大鼠)
Transwell(T细胞)(图13)
为证实人类CCL21与小鼠及大鼠CCL21受体(CCR7)之交叉物种反应性，使用上述Transwell迁移分析以及小鼠(左)或大鼠(右)T细胞(作为反应者)(参见图13)。使用人类对小鼠(左)及人类对大鼠(右)重组趋化介素在指示浓度下(底部孔)实施迁移分析。总而言之，人类CCL21在小鼠及大鼠系统中之活性分别与相应小鼠及大鼠趋化介素相同，从而指示可在临床前啮齿类动物(小鼠/大鼠)模型中测试人类分子。
实施例6：
活体内负荷CCL21表达
RNAseq(图10)
在啮齿类动物肿瘤(对照或VSV-GP或VSV-GP-muCCL21感染肿瘤)中分析/证实病毒性编码的CCL21表达。为此，使用具有确立LLC1-IFNARKO肿瘤的C57BL/6小鼠作为对照或使用1×108TCID50之VSV-GP或VSV-GP-muCCL21之单一静脉内注射进行治疗。在治疗后7天，切除肿瘤；提取全RNA并使用RNAseq进行分析。使用CD3ε及CXCL10作为对比物。使用密码子优化DNA序列作为读出来特异性检测病毒性编码的CCL21(参见图10)。
实施例6.1：
VSV-GP及VSV-GP-CCL21之神经毒性之缺乏
存活(图11)
在病毒进入脑中时，野生型VSV感染可引起神经学症状。所述神经学并发症包含可导致感染个体死亡之严重脑炎。使用嵌合VSV-GP之优点在于，神经元感染已展示几乎完全不存在，从而使得VSV骨架成为安全溶瘤药剂。认为表型减毒之原因系由于经由病毒套膜糖蛋白促进了病毒向性之变化。尽管在脑中未看到VSV-GP之神经元感染及传播，但尚不明了在其他细胞类型(例如神经胶质细胞或星形细胞)中是否(例如)完全没有病毒基因表达。VSV GP对CCL21转基因之偶然表达可吸引免疫细胞而在脑内引起不良效应，由此进行VSV-GP-muCCL21之神经毒性评价。
经由立体定位性注射至右纹状体中使Swiss CD-1小鼠接受含有1×106TCID50之3μl单一颅内注射。将PBS经颅内给予对照组中。每天监测动物之神经毒性及总体幸福感之体征。将PBS(点)、VSV-G DsRed(菱形)、VSV-GP(正方形)及VSV-GP muCCL21实验组之小鼠存活绘示为卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)(图11B)。卡普兰-迈耶分析指示，所测试病毒变体在小鼠中皆不展示神经毒性。仅VSV-G DsRed对照组(其在病毒表面上含有野生型VSV糖蛋白)展示增加之失重(图11A)，且发生神经学体征，从而在颅内感染之后第一周内实施安乐死。
实施例6.2
VSV-GP及VSV-GP-CCL21之活体内效能
肿瘤生长(图14)
使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型评价/比较VSV-GP及VSV-GP-huCCL21之治疗潜力。为此，使用2×107TCID50 VSV-GP或VSV-GP-huCCL21之两个静脉内注射(第0天及第3天)处理所确立肿瘤。如所指示进行治疗小鼠之存活绘示于图14中。
实施例6.3
VSV-GP-huCCL21及VSV-GP-CCL21(1-79)之活体内效能
肿瘤生长/存活(图20/21)
使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型评价/比较VSV-GP-huCCL21及VSV-GP-huCCL21(1-79)之治疗潜力。为此，使用2×107TCID50 VSV-GP-huCCL21或VSV-GP-huCCL21(1-79)之两个静脉内注射(第0天及第3天)处理所确立肿瘤。如所指示进行治疗之小鼠之累积肿瘤生长以及30天存活绘示于图20/21中。与具有全长CCL21之VSV-GP变体相比，使用短CCL21变体(CCL21(1-79))(对应于人类CCL21之完全胞浆素处理(较少aa80/81)及自由扩散形式)进行治疗能够更佳地控制肿瘤生长且改良存活。
实施例6.4
MoA：由VSV-GP-huCCL21及VSV-GP-huCCL21(1-79)诱导之T细胞浸润
IHC(图22/23)
分析如实施例6.3下处理之肿瘤之T细胞浸润。将FFPE肿瘤切片针对CD4及CD8以及VSV-N及裂解半胱天冬酶(Caspase)3进行染色。量化活(非坏死)肿瘤区域中之总T细胞(CD4+及CD8+细胞)。如图22中所绘示，短CCL21变体(CCL21(1-79))(对应于人类CCL21之完全胞浆素处理(较少aa80/81)及自由扩散形式)能够将更多T细胞吸引至肿瘤中，从而阐释所观察之效能增加(实施例6.3)。
另外，病毒性表达的CCL21能够将树突状细胞(CD11c阳性)吸引至经感染CT26.CL25肿瘤中。在第0天及第3天，向所确立CT26.CL25肿瘤经局部(i.t.)注射2×107TCID50 VSV-GP或VSV-GP-muCCL21。分析各别肿瘤之FFPE切片之树突状细胞浸润(具有活跃病毒复制之肿瘤区域＝坏死边缘)(参见图24)。
实施例7
效能：VSV-GP及VSV-GP-CCL21与SMACm之组合
肿瘤生长/存活(图7-9)
基于来自VSV-GP及PD-1阻断抗体之组合之令人鼓舞之数据(实施例2)，测试VSV-GP(图7/9)及VSV-GP-muCCL21(图8/9)与SMAC模拟物(SMACm，致使肿瘤细胞更易感于细胞死亡诱导性刺激物/药剂)之其他组合之细胞死亡路径调节剂。使用CT26.CL25-IFNARKO肿瘤模型分析化合物之治疗性相互作用。为此，使具有确立CT26.CL25-IFNARKO肿瘤之Balb/c小鼠接受4×106TCID50 VSV-GP或VSV-GP-muCCL21之单一静脉内治疗及/或100mg/kg SMACm(每天(经口)给予且持续两周时段，与VSV-GP或VSV-GP-muCCL21治疗始于同一天)。与相应单一疗法相比，VSV-GP及SMACm之组合可产生改良效能。在组合VSV-GP-muCCL21与SMACm时，组合效应甚至更为明显，从而治愈所有治疗动物。
序列表
<110> 勃林格殷格翰国际有限公司
威锐治疗股份有限公司
<120> 编码CCL21的重组棒状病毒
<130> 01-3349-WO
<150> EP19153668.9
<151> 2019-01-25
<160> 24
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe
1 5 10 15
Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys
20 25 30
Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr
35 40 45
Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe
50 55 60
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu
65 70 75 80
Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro
85 90 95
Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr
100 105 110
Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser
115 120 125
Gln Thr Pro Lys Gly Pro
130
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys
1 5 10 15
Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu
20 25 30
Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln
35 40 45
Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met
50 55 60
Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys
65 70 75 80
Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser
85 90 95
Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro
100 105 110
<210> 3
<211> 79
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys
1 5 10 15
Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu
20 25 30
Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln
35 40 45
Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met
50 55 60
Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly
65 70 75
<210> 4
<211> 81
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys
1 5 10 15
Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu
20 25 30
Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln
35 40 45
Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met
50 55 60
Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys
65 70 75 80
Arg
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser
20 25 30
Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu
35 40 45
Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys
50 55 60
Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln
65 70 75 80
Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala
85 90 95
Gln Gly
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 7
<211> 422
<212> PRT
<213> 水疱性口炎病毒
<400> 7
Met Ser Val Thr Val Lys Arg Ile Ile Asp Asn Thr Val Val Val Pro
1 5 10 15
Lys Leu Pro Ala Asn Glu Asp Pro Val Glu Tyr Pro Ala Asp Tyr Phe
20 25 30
Arg Lys Ser Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Ile Asn Thr Thr Lys Ser Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Asn Val
50 55 60
Ser Ile Ile His Val Asn Ser Tyr Leu Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile
65 70 75 80
Arg Gly Lys Leu Asp Lys Asp Trp Ser Ser Phe Gly Ile Asn Ile Gly
85 90 95
Lys Ala Gly Asp Thr Ile Gly Ile Phe Asp Leu Val Ser Leu Lys Ala
100 105 110
Leu Asp Gly Val Leu Pro Asp Gly Val Ser Asp Ala Ser Arg Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asp Lys Trp Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Arg Val
130 135 140
Gly Arg Thr Gln Met Pro Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Met Asp Gly Leu
145 150 155 160
Thr Asn Gln Cys Lys Met Ile Asn Glu Gln Phe Glu Pro Leu Val Pro
165 170 175
Glu Gly Arg Asp Ile Phe Asp Val Trp Gly Asn Asp Ser Asn Tyr Thr
180 185 190
Lys Ile Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe His Met Phe Lys Lys His
195 200 205
Glu Cys Ala Ser Phe Arg Tyr Gly Thr Ile Val Ser Arg Phe Lys Asp
210 215 220
Cys Ala Ala Leu Ala Thr Phe Gly His Leu Cys Lys Ile Thr Gly Met
225 230 235 240
Ser Thr Glu Asp Val Thr Thr Trp Ile Leu Asn Arg Glu Val Ala Asp
245 250 255
Glu Met Val Gln Met Met Leu Pro Gly Gln Glu Ile Asp Lys Ala Asp
260 265 270
Ser Tyr Met Pro Tyr Leu Ile Asp Phe Gly Leu Ser Ser Lys Ser Pro
275 280 285
Tyr Ser Ser Val Lys Asn Pro Ala Phe His Phe Trp Gly Gln Leu Thr
290 295 300
Ala Leu Leu Leu Arg Ser Thr Arg Ala Arg Asn Ala Arg Gln Pro Asp
305 310 315 320
Asp Ile Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Thr Ala Gly Leu Leu Tyr Ala Tyr
325 330 335
Ala Val Gly Ser Ser Ala Asp Leu Ala Gln Gln Phe Cys Val Gly Asp
340 345 350
Asn Lys Tyr Thr Pro Asp Asp Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala
355 360 365
Pro Pro Gln Gly Arg Asp Val Val Glu Trp Leu Gly Trp Phe Glu Asp
370 375 380
Gln Asn Arg Lys Pro Thr Pro Asp Met Met Gln Tyr Ala Lys Arg Ala
385 390 395 400
Val Met Ser Leu Gln Gly Leu Arg Glu Lys Thr Ile Gly Lys Tyr Ala
405 410 415
Lys Ser Glu Phe Asp Lys
420
<210> 8
<211> 265
<212> PRT
<213> 水疱性口炎病毒
<400> 8
Met Asp Asn Leu Thr Lys Val Arg Glu Tyr Leu Lys Ser Tyr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Asp Gln Ala Val Gly Glu Ile Asp Glu Ile Glu Ala Gln Arg Ala
20 25 30
Glu Lys Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Gln Glu Asp Gly Val Glu Glu His
35 40 45
Thr Lys Pro Ser Tyr Phe Gln Ala Ala Asp Asp Ser Asp Thr Glu Ser
50 55 60
Glu Pro Glu Ile Glu Asp Asn Gln Gly Leu Tyr Ala Pro Asp Pro Glu
65 70 75 80
Ala Glu Gln Val Glu Gly Phe Ile Gln Gly Pro Leu Asp Asp Tyr Ala
85 90 95
Asp Glu Glu Val Asp Val Val Phe Thr Ser Asp Trp Lys Gln Pro Glu
100 105 110
Leu Glu Ser Asp Glu His Gly Lys Thr Leu Arg Leu Thr Ser Pro Glu
115 120 125
Gly Leu Ser Gly Glu Gln Lys Ser Gln Trp Leu Ser Thr Ile Lys Ala
130 135 140
Val Val Gln Ser Ala Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Glu Cys Thr Phe Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gly Glu Gly Val Ile Met Lys Glu Arg Gln Ile Thr Pro Asp
165 170 175
Val Tyr Lys Val Thr Pro Val Met Asn Thr His Pro Ser Gln Ser Glu
180 185 190
Ala Val Ser Asp Val Trp Ser Leu Ser Lys Thr Ser Met Thr Phe Gln
195 200 205
Pro Lys Lys Ala Ser Leu Gln Pro Leu Thr Ile Ser Leu Asp Glu Leu
210 215 220
Phe Ser Ser Arg Gly Glu Phe Ile Ser Val Gly Gly Asp Gly Arg Met
225 230 235 240
Ser His Lys Glu Ala Ile Leu Leu Gly Leu Arg Tyr Lys Lys Leu Tyr
245 250 255
Asn Gln Ala Arg Val Lys Tyr Ser Leu
260 265
<210> 9
<211> 2109
<212> PRT
<213> 水疱性口炎病毒
<400> 9
Met Glu Val His Asp Phe Glu Thr Asp Glu Phe Asn Asp Phe Asn Glu
1 5 10 15
Asp Asp Tyr Ala Thr Arg Glu Phe Leu Asn Pro Asp Glu Arg Met Thr
20 25 30
Tyr Leu Asn His Ala Asp Tyr Asn Leu Asn Ser Pro Leu Ile Ser Asp
35 40 45
Asp Ile Asp Asn Leu Ile Arg Lys Phe Asn Ser Leu Pro Ile Pro Ser
50 55 60
Met Trp Asp Ser Lys Asn Trp Asp Gly Val Leu Glu Met Leu Thr Ser
65 70 75 80
Cys Gln Ala Asn Pro Ile Pro Thr Ser Gln Met His Lys Trp Met Gly
85 90 95
Ser Trp Leu Met Ser Asp Asn His Asp Ala Ser Gln Gly Tyr Ser Phe
100 105 110
Leu His Glu Val Asp Lys Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asp Val Val Glu
115 120 125
Thr Phe Ile Arg Gly Trp Gly Asn Lys Pro Ile Glu Tyr Ile Lys Lys
130 135 140
Glu Arg Trp Thr Asp Ser Phe Lys Ile Leu Ala Tyr Leu Cys Gln Lys
145 150 155 160
Phe Leu Asp Leu His Lys Leu Thr Leu Ile Leu Asn Ala Val Ser Glu
165 170 175
Val Glu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Thr Phe Lys Gly Lys Val Arg Arg
180 185 190
Ser Ser His Gly Thr Asn Ile Cys Arg Ile Arg Val Pro Ser Leu Gly
195 200 205
Pro Thr Phe Ile Ser Glu Gly Trp Ala Tyr Phe Lys Lys Leu Asp Ile
210 215 220
Leu Met Asp Arg Asn Phe Leu Leu Met Val Lys Asp Val Ile Ile Gly
225 230 235 240
Arg Met Gln Thr Val Leu Ser Met Val Cys Arg Ile Asp Asn Leu Phe
245 250 255
Ser Glu Gln Asp Ile Phe Ser Leu Leu Asn Ile Tyr Arg Ile Gly Asp
260 265 270
Lys Ile Val Glu Arg Gln Gly Asn Phe Ser Tyr Asp Leu Ile Lys Met
275 280 285
Val Glu Pro Ile Cys Asn Leu Lys Leu Met Lys Leu Ala Arg Glu Ser
290 295 300
Arg Pro Leu Val Pro Gln Phe Pro His Phe Glu Asn His Ile Lys Thr
305 310 315 320
Ser Val Asp Glu Gly Ala Lys Ile Asp Arg Gly Ile Arg Phe Leu His
325 330 335
Asp Gln Ile Met Ser Val Lys Thr Val Asp Leu Thr Leu Val Ile Tyr
340 345 350
Gly Ser Phe Arg His Trp Gly His Pro Phe Ile Asp Tyr Tyr Thr Gly
355 360 365
Leu Glu Lys Leu His Ser Gln Val Thr Met Lys Lys Asp Ile Asp Val
370 375 380
Ser Tyr Ala Lys Ala Leu Ala Ser Asp Leu Ala Arg Ile Val Leu Phe
385 390 395 400
Gln Gln Phe Asn Asp His Lys Lys Trp Phe Val Asn Gly Asp Leu Leu
405 410 415
Pro His Asp His Pro Phe Lys Ser His Val Lys Glu Asn Thr Trp Pro
420 425 430
Thr Ala Ala Gln Val Gln Asp Phe Gly Asp Lys Trp His Glu Leu Pro
435 440 445
Leu Ile Lys Cys Phe Glu Ile Pro Asp Leu Leu Asp Pro Ser Ile Ile
450 455 460
Tyr Ser Asp Lys Ser His Ser Met Asn Arg Ser Glu Val Leu Lys His
465 470 475 480
Val Arg Met Asn Pro Asn Thr Pro Ile Pro Ser Lys Lys Val Leu Gln
485 490 495
Thr Met Leu Asp Thr Lys Ala Thr Asn Trp Lys Glu Phe Leu Lys Glu
500 505 510
Ile Asp Glu Lys Gly Leu Asp Asp Asp Asp Leu Ile Ile Gly Leu Lys
515 520 525
Gly Lys Glu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Phe Phe Ser Leu Met
530 535 540
Ser Trp Lys Leu Arg Glu Tyr Phe Val Ile Thr Glu Tyr Leu Ile Lys
545 550 555 560
Thr His Phe Val Pro Met Phe Lys Gly Leu Thr Met Ala Asp Asp Leu
565 570 575
Thr Ala Val Ile Lys Lys Met Leu Asp Ser Ser Ser Gly Gln Gly Leu
580 585 590
Lys Ser Tyr Glu Ala Ile Cys Ile Ala Asn His Ile Asp Tyr Glu Lys
595 600 605
Trp Asn Asn His Gln Arg Lys Leu Ser Asn Gly Pro Val Phe Arg Val
610 615 620
Met Gly Gln Phe Leu Gly Tyr Pro Ser Leu Ile Glu Arg Thr His Glu
625 630 635 640
Phe Phe Glu Lys Ser Leu Ile Tyr Tyr Asn Gly Arg Pro Asp Leu Met
645 650 655
Arg Val His Asn Asn Thr Leu Ile Asn Ser Thr Ser Gln Arg Val Cys
660 665 670
Trp Gln Gly Gln Glu Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gln Lys Gly Trp
675 680 685
Ser Ile Leu Asn Leu Leu Val Ile Gln Arg Glu Ala Lys Ile Arg Asn
690 695 700
Thr Ala Val Lys Val Leu Ala Gln Gly Asp Asn Gln Val Ile Cys Thr
705 710 715 720
Gln Tyr Lys Thr Lys Lys Ser Arg Asn Val Val Glu Leu Gln Gly Ala
725 730 735
Leu Asn Gln Met Val Ser Asn Asn Glu Lys Ile Met Thr Ala Ile Lys
740 745 750
Ile Gly Thr Gly Lys Leu Gly Leu Leu Ile Asn Asp Asp Glu Thr Met
755 760 765
Gln Ser Ala Asp Tyr Leu Asn Tyr Gly Lys Ile Pro Ile Phe Arg Gly
770 775 780
Val Ile Arg Gly Leu Glu Thr Lys Arg Trp Ser Arg Val Thr Cys Val
785 790 795 800
Thr Asn Asp Gln Ile Pro Thr Cys Ala Asn Ile Met Ser Ser Val Ser
805 810 815
Thr Asn Ala Leu Thr Val Ala His Phe Ala Glu Asn Pro Ile Asn Ala
820 825 830
Met Ile Gln Tyr Asn Tyr Phe Gly Thr Phe Ala Arg Leu Leu Leu Met
835 840 845
Met His Asp Pro Ala Leu Arg Gln Ser Leu Tyr Glu Val Gln Asp Lys
850 855 860
Ile Pro Gly Leu His Ser Ser Thr Phe Lys Tyr Ala Met Leu Tyr Leu
865 870 875 880
Asp Pro Ser Ile Gly Gly Val Ser Gly Met Ser Leu Ser Arg Phe Leu
885 890 895
Ile Arg Ala Phe Pro Asp Pro Val Thr Glu Ser Leu Ser Phe Trp Arg
900 905 910
Phe Ile His Val His Ala Arg Ser Glu His Leu Lys Glu Met Ser Ala
915 920 925
Val Phe Gly Asn Pro Glu Ile Ala Lys Phe Arg Ile Thr His Ile Asp
930 935 940
Lys Leu Val Glu Asp Pro Thr Ser Leu Asn Ile Ala Met Gly Met Ser
945 950 955 960
Pro Ala Asn Leu Leu Lys Thr Glu Val Lys Lys Cys Leu Ile Glu Ser
965 970 975
Arg Gln Thr Ile Arg Asn Gln Val Ile Lys Asp Ala Thr Ile Tyr Leu
980 985 990
Tyr His Glu Glu Asp Arg Leu Arg Ser Phe Leu Trp Ser Ile Asn Pro
995 1000 1005
Leu Phe Pro Arg Phe Leu Ser Glu Phe Lys Ser Gly Thr Phe Leu Gly
1010 1015 1020
Val Ala Asp Gly Leu Ile Ser Leu Phe Gln Asn Ser Arg Thr Ile Arg
1025 1030 1035 1040
Asn Ser Phe Lys Lys Lys Tyr His Arg Glu Leu Asp Asp Leu Ile Val
1045 1050 1055
Arg Ser Glu Val Ser Ser Leu Thr His Leu Gly Lys Leu His Leu Arg
1060 1065 1070
Arg Gly Ser Cys Lys Met Trp Thr Cys Ser Ala Thr His Ala Asp Thr
1075 1080 1085
Leu Arg Tyr Lys Ser Trp Gly Arg Thr Val Ile Gly Thr Thr Val Pro
1090 1095 1100
His Pro Leu Glu Met Leu Gly Pro Gln His Arg Lys Glu Thr Pro Cys
1105 1110 1115 1120
Ala Pro Cys Asn Thr Ser Gly Phe Asn Tyr Val Ser Val His Cys Pro
1125 1130 1135
Asp Gly Ile His Asp Val Phe Ser Ser Arg Gly Pro Leu Pro Ala Tyr
1140 1145 1150
Leu Gly Ser Lys Thr Ser Glu Ser Thr Ser Ile Leu Gln Pro Trp Glu
1155 1160 1165
Arg Glu Ser Lys Val Pro Leu Ile Lys Arg Ala Thr Arg Leu Arg Asp
1170 1175 1180
Ala Ile Ser Trp Phe Val Glu Pro Asp Ser Lys Leu Ala Met Thr Ile
1185 1190 1195 1200
Leu Ser Asn Ile His Ser Leu Thr Gly Glu Glu Trp Thr Lys Arg Gln
1205 1210 1215
His Gly Phe Lys Arg Thr Gly Ser Ala Leu His Arg Phe Ser Thr Ser
1220 1225 1230
Arg Met Ser His Gly Gly Phe Ala Ser Gln Ser Thr Ala Ala Leu Thr
1235 1240 1245
Arg Leu Met Ala Thr Thr Asp Thr Met Arg Asp Leu Gly Asp Gln Asn
1250 1255 1260
Phe Asp Phe Leu Phe Gln Ala Thr Leu Leu Tyr Ala Gln Ile Thr Thr
1265 1270 1275 1280
Thr Val Ala Arg Asp Gly Trp Ile Thr Ser Cys Thr Asp His Tyr His
1285 1290 1295
Ile Ala Cys Lys Ser Cys Leu Arg Pro Ile Glu Glu Ile Thr Leu Asp
1300 1305 1310
Ser Ser Met Asp Tyr Thr Pro Pro Asp Val Ser His Val Leu Lys Thr
1315 1320 1325
Trp Arg Asn Gly Glu Gly Ser Trp Gly Gln Glu Ile Lys Gln Ile Tyr
1330 1335 1340
Pro Leu Glu Gly Asn Trp Lys Asn Leu Ala Pro Ala Glu Gln Ser Tyr
1345 1350 1355 1360
Gln Val Gly Arg Cys Ile Gly Phe Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Tyr Arg
1365 1370 1375
Lys Ser Thr His Ala Glu Asp Ser Ser Leu Phe Pro Leu Ser Ile Gln
1380 1385 1390
Gly Arg Ile Arg Gly Arg Gly Phe Leu Lys Gly Leu Leu Asp Gly Leu
1395 1400 1405
Met Arg Ala Ser Cys Cys Gln Val Ile His Arg Arg Ser Leu Ala His
1410 1415 1420
Leu Lys Arg Pro Ala Asn Ala Val Tyr Gly Gly Leu Ile Tyr Leu Ile
1425 1430 1435 1440
Asp Lys Leu Ser Val Ser Pro Pro Phe Leu Ser Leu Thr Arg Ser Gly
1445 1450 1455
Pro Ile Arg Asp Glu Leu Glu Thr Ile Pro His Lys Ile Pro Thr Ser
1460 1465 1470
Tyr Pro Thr Ser Asn Arg Asp Met Gly Val Ile Val Arg Asn Tyr Phe
1475 1480 1485
Lys Tyr Gln Cys Arg Leu Ile Glu Lys Gly Lys Tyr Arg Ser His Tyr
1490 1495 1500
Ser Gln Leu Trp Leu Phe Ser Asp Val Leu Ser Ile Asp Phe Ile Gly
1505 1510 1515 1520
Pro Phe Ser Ile Ser Thr Thr Leu Leu Gln Ile Leu Tyr Lys Pro Phe
1525 1530 1535
Leu Ser Gly Lys Asp Lys Asn Glu Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Ser
1540 1545 1550
Ser Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gly Trp Glu Asp Ile His Val Lys Phe
1555 1560 1565
Phe Thr Lys Asp Ile Leu Leu Cys Pro Glu Glu Ile Arg His Ala Cys
1570 1575 1580
Lys Phe Gly Ile Ala Lys Asp Asn Asn Lys Asp Met Ser Tyr Pro Pro
1585 1590 1595 1600
Trp Gly Arg Glu Ser Arg Gly Thr Ile Thr Thr Ile Pro Val Tyr Tyr
1605 1610 1615
Thr Thr Thr Pro Tyr Pro Lys Met Leu Glu Met Pro Pro Arg Ile Gln
1620 1625 1630
Asn Pro Leu Leu Ser Gly Ile Arg Leu Gly Gln Leu Pro Thr Gly Ala
1635 1640 1645
His Tyr Lys Ile Arg Ser Ile Leu His Gly Met Gly Ile His Tyr Arg
1650 1655 1660
Asp Phe Leu Ser Cys Gly Asp Gly Ser Gly Gly Met Thr Ala Ala Leu
1665 1670 1675 1680
Leu Arg Glu Asn Val His Ser Arg Gly Ile Phe Asn Ser Leu Leu Glu
1685 1690 1695
Leu Ser Gly Ser Val Met Arg Gly Ala Ser Pro Glu Pro Pro Ser Ala
1700 1705 1710
Leu Glu Thr Leu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Cys Val Asn Gly Glu Thr
1715 1720 1725
Cys Trp Glu Tyr Pro Ser Asp Leu Cys Asp Pro Arg Thr Trp Asp Tyr
1730 1735 1740
Phe Leu Arg Leu Lys Ala Gly Leu Gly Leu Gln Ile Asp Leu Ile Val
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Met Asp Met Glu Val Arg Asp Ser Ser Thr Ser Leu Lys Ile Glu Thr
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Asn Val Arg Asn Tyr Val His Arg Ile Leu Asp Glu Gln Gly Val Leu
1780 1785 1790
Ile Tyr Lys Thr Tyr Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ser Glu Lys Asn Ala
1795 1800 1805
Val Thr Ile Leu Gly Pro Met Phe Lys Thr Val Asp Leu Val Gln Thr
1810 1815 1820
Glu Phe Ser Ser Ser Gln Thr Ser Glu Val Tyr Met Val Cys Lys Gly
1825 1830 1835 1840
Leu Lys Lys Leu Ile Asp Glu Pro Asn Pro Asp Trp Ser Ser Ile Asn
1845 1850 1855
Glu Ser Trp Lys Asn Leu Tyr Ala Phe Gln Ser Ser Glu Gln Glu Phe
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Ala Arg Ala Lys Lys Val Ser Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Gly Ile Pro
1875 1880 1885
Ser Gln Phe Ile Pro Asp Pro Phe Val Asn Ile Glu Thr Met Leu Gln
1890 1895 1900
Ile Phe Gly Val Pro Thr Gly Val Ser His Ala Ala Ala Leu Lys Ser
1905 1910 1915 1920
Ser Asp Arg Pro Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Met Ala
1925 1930 1935
Ile Ile Ser Tyr Tyr Asn Ile Asn His Ile Arg Val Gly Pro Ile Pro
1940 1945 1950
Pro Asn Pro Pro Ser Asp Gly Ile Ala Gln Asn Val Gly Ile Ala Ile
1955 1960 1965
Thr Gly Ile Ser Phe Trp Leu Ser Leu Met Glu Lys Asp Ile Pro Leu
1970 1975 1980
Tyr Gln Gln Cys Leu Ala Val Ile Gln Gln Ser Phe Pro Ile Arg Trp
1985 1990 1995 2000
Glu Ala Val Ser Val Lys Gly Gly Tyr Lys Gln Lys Trp Ser Thr Arg
2005 2010 2015
Gly Asp Gly Leu Pro Lys Asp Thr Arg Ile Ser Asp Ser Leu Ala Pro
2020 2025 2030
Ile Gly Asn Trp Ile Arg Ser Leu Glu Leu Val Arg Asn Gln Val Arg
2035 2040 2045
Leu Asn Pro Phe Asn Glu Ile Leu Phe Asn Gln Leu Cys Arg Thr Val
2050 2055 2060
Asp Asn His Leu Lys Trp Ser Asn Leu Arg Arg Asn Thr Gly Met Ile
2065 2070 2075 2080
Glu Trp Ile Asn Arg Arg Ile Ser Lys Glu Asp Arg Ser Ile Leu Met
2085 2090 2095
Leu Lys Ser Asp Leu His Glu Glu Asn Ser Trp Arg Asp
2100 2105
<210> 10
<211> 229
<212> PRT
<213> 水疱性口炎病毒
<400> 10
Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys
1 5 10 15
Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser
20 25 30
Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val
35 40 45
Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile
85 90 95
Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln
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Pro Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg
130 135 140
Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg
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Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr
165 170 175
Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His
180 185 190
Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe
195 200 205
Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser
210 215 220
Ile Gly His Phe Lys
225
<210> 11
<211> 498
<212> PRT
<213> 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒
<400> 11
Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile
20 25 30
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Val Ser
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly Met Tyr Gly Leu Asn Gly
50 55 60
Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Gln Phe Lys Ser Val Glu Phe Asp
65 70 75 80
Met Ser His Leu Asn Leu Thr Met Pro Asn Ala Cys Ser Ala Asn Asn
85 90 95
Ser His His Tyr Ile Ser Met Gly Ser Ser Gly Leu Glu Leu Thr Phe
100 105 110
Thr Asn Asp Ser Ile Leu Asn His Asn Phe Cys Asn Leu Thr Ser Ala
115 120 125
Phe Asn Lys Lys Thr Phe Asp His Thr Leu Met Ser Ile Val Ser Ser
130 135 140
Leu His Leu Ser Ile Arg Gly Asn Ser Asn His Lys Ala Val Ser Cys
145 150 155 160
Asp Phe Asn Asn Gly Ile Thr Ile Gln Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Asp
165 170 175
Pro Gln Ser Ala Ile Ser Gln Cys Arg Thr Phe Arg Gly Arg Val Leu
180 185 190
Asp Met Phe Arg Thr Ala Phe Gly Gly Lys Tyr Met Arg Ser Gly Trp
195 200 205
Gly Trp Ala Gly Ser Asp Gly Lys Thr Thr Trp Cys Ser Gln Thr Ser
210 215 220
Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn Arg Thr Trp Glu Asn His Cys Arg
225 230 235 240
Tyr Ala Gly Pro Phe Gly Met Ser Arg Ile Leu Phe Ala Gln Glu Lys
245 250 255
Thr Lys Phe Leu Thr Arg Arg Leu Ala Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu
260 265 270
Ser Asp Ser Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Lys
275 280 285
Trp Met Ile Leu Ala Ala Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Lys Cys Asn Val Asn His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg
305 310 315 320
Leu Ile Asp Tyr Asn Lys Ala Ala Leu Ser Lys Phe Lys Gln Asp Val
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Glu Ser Ala Leu His Val Phe Lys Thr Thr Val Asn Ser Leu Ile Ser
340 345 350
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355 360 365
Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp Tyr Leu Glu His Ala Lys Thr Gly
370 375 380
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385 390 395 400
Asn Glu Thr His Phe Ser Asp Gln Ile Glu Gln Glu Ala Asp Asn Met
405 410 415
Ile Thr Glu Met Leu Arg Lys Asp Tyr Ile Lys Arg Gln Gly Ser Thr
420 425 430
Pro Leu Ala Leu Met Asp Leu Leu Met Phe Ser Thr Ser Ala Tyr Leu
435 440 445
Ile Ser Ile Phe Leu His Leu Val Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile
450 455 460
Lys Gly Gly Ser Cys Pro Lys Pro His Arg Leu Thr Asn Lys Gly Ile
465 470 475 480
Cys Ser Cys Gly Ala Phe Lys Val Pro Gly Val Lys Thr Ile Trp Lys
485 490 495
Arg Arg
<210> 12
<211> 498
<212> PRT
<213> 丹德农病毒
<400> 12
Met Gly Gln Leu Ile Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Val Ile Ile Thr Ser Ile
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Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Ile Ala Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Cys Leu Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly Leu Tyr Gly Val Thr Gly
50 55 60
Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Leu Tyr Gln Phe Lys Ser Val Glu Phe Asn
65 70 75 80
Met Ser Gln Leu Asn Leu Thr Met Pro Asn Ala Cys Ser Ala Asn Asn
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Phe Lys Lys Lys Thr Phe Asp His Thr Leu Met Ser Ile Val Ala Ser
130 135 140
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Ala Gln Ser Ala Ile Asn Gln Cys Arg Thr Phe Arg Gly Arg Val Leu
180 185 190
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195 200 205
Gly Trp Lys Gly Ser Asp Gly Lys Thr Thr Trp Cys Ser Gln Thr Ser
210 215 220
Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn Arg Thr Trp Glu Asn His Cys Glu
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Tyr Ala Gly Pro Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Phe Ala Gln Glu Lys
245 250 255
Thr Lys Phe Leu Thr Arg Arg Leu Ala Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu
260 265 270
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275 280 285
Trp Met Leu Ile Ala Ala Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Lys Cys Asn Ile Asn His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg
305 310 315 320
Leu Ile Asp Tyr Asn Lys Ala Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Asp Val
325 330 335
Glu Ser Ala Leu His Leu Phe Lys Thr Thr Val Asn Ser Leu Ile Ser
340 345 350
Asp Gln Leu Leu Met Arg Asn His Leu Arg Asp Leu Met Gly Val Pro
355 360 365
Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp Tyr Leu Glu His Val Lys Thr Gly
370 375 380
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385 390 395 400
Asn Glu Thr His Phe Ser Asp Gln Ile Glu Gln Glu Ala Asp Asn Met
405 410 415
Ile Thr Glu Met Leu Arg Lys Asp Tyr Ile Lys Arg Gln Gly Ser Thr
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435 440 445
Ile Ser Val Phe Leu His Leu Met Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile
450 455 460
Lys Gly Gly Thr Cys Pro Lys Pro His Arg Leu Thr Ser Lys Gly Ile
465 470 475 480
Cys Ser Cys Gly Ala Phe Lys Val Pro Gly Val Lys Thr Val Trp Lys
485 490 495
Arg Arg
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<212> PRT
<213> 莫佩亚哺乳病毒
<400> 13
Met Gly Gln Ile Val Thr Phe Phe Gln Glu Val Pro His Ile Leu Glu
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Glu Val Met Asn Ile Val Leu Met Thr Leu Ser Ile Leu Ala Ile Leu
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Lys Gly Ile Tyr Asn Val Met Thr Cys Gly Ile Ile Gly Leu Ile Thr
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Cys Gly Arg Ser Cys Ser Ser Ile Tyr Lys Asp Asn
50 55 60
Tyr Glu Phe Phe Ser Leu Asp Leu Asp Met Ser Ser Leu Asn Ala Thr
65 70 75 80
Met Pro Leu Ser Cys Ser Lys Asn Asn Ser His His Tyr Ile Gln Val
85 90 95
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115 120 125
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Asn His Cys Gly Thr Ile Ala Asn Gly Ile Met Asp Val Phe Arg Arg
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Leu Leu Ser Gln Arg Thr Arg Asn Phe Tyr Ile Ser Arg Arg Leu
245 250 255
Leu Gly Leu Phe Thr Trp Thr Leu Ser Asp Ser Glu Gly Asn Asp Met
260 265 270
Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Arg Ser Met Leu Ile Gly Leu Asp Leu
275 280 285
Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Ile Ala Lys Cys Asn Gln Ala His Asp
290 295 300
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305 310 315 320
Ile Ser Lys Leu Arg Ser Glu Val Gln Gln Ser Ile Asn Leu Ile Asn
325 330 335
Lys Ala Val Asn Ala Leu Ile Asn Asp Gln Leu Val Met Arg Asn His
340 345 350
Leu Arg Asp Leu Met Gly Ile Pro Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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Val Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Leu Ile Ser Val Phe Leu His Leu Ile
435 440 445
Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile Lys Gly Lys Pro Cys Pro Lys Pro
450 455 460
His Arg Leu Asn His Met Ala Ile Cys Ser Cys Gly Phe Tyr Lys Gln
465 470 475 480
Pro Gly Leu Pro Thr Gln Trp Lys Arg
485
<210> 14
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
<210> 15
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
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100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ser
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100 105 110
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 17
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
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65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
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Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 19
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
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115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 20
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser
20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<210> 21
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
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<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
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290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
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<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser
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<210> 24
<211> 11520
<212> RNA
<213> 水疱性口炎病毒
<400> 24
ugcuucuguu uguuugguaa uaauaguaau uuuccgaguc cucuuugaaa uugucauuag 60
uuuuacagac aaugucaguu cucuuaguaa cuguuguguc agcaucaagg uuuugaagga 120
cguuuacucc uaggucaccu uaugggccgu cuaaugaagu cuuuuaguuu ccucuaagga 180
gaaauguagu uaugauguuu uucaaacagu cuagauucuc cuauacagau gguuccggag 240
uuuaggccuu uacauaguua guauguacag uugucgauga acauaccucg uaauuuccug 300
uaggccccau ucaaccuauu ucuaaccagu ucaaagccuu auuuguagcc cuuucguccc 360
cuauguuagc cuuauaaacu ggaacauagg aacuuucggg accugccgca ugaaggucua 420
ccucauagcc uacgaagguc uuggucgcgu cuacuguuua ccaacggaaa cauagaugaa 480
ccgaauaugu cucacccguc uuguguuuac ggacuuaugu cuuuuuucga guaccuaccc 540
gacuguuuag uuacguuuua cuaguuacuu gucaaacuug gagaacacgg ucuuccagca 600
cuguaaaaac uacacacccc uuuacuguca uuaauguguu uuuaacagcg acgucaccug 660
uacaagaagg uguacaaguu uuuuguacuu acacggagca agucuaugcc uugauaacaa 720
aggucuaagu uucuaacacg acguaaccgu uguaaaccug uggagacguu uuauuggccu 780
uacagauguc uucuacauug cuggaccuag aacuuggcuc uucaacgucu acuuuaccag 840
guuuacuacg aagguccggu ucuuuaacug uuccggcuaa guauguacgg aauaaacuag 900
cugaaaccua acagaagauu cagagguaua agaaggcagu uuuugggacg gaaggugaag 960
acccccguua acugucgaga agacgagucu agguggucuc guuccuuacg ggcugucgga 1020
cuacuguaac ucauauguag agaaugaugu cguccaaaca acaugcgaau acgucauccu 1080
aggagacggc ugaaccgugu ugucaaaaca caaccucuau uguuuaugug aggucuacua 1140
ucauggccuc cuaacugcug auuacguggc gguguuccgu cucuacacca gcuuaccgag 1200
ccuaccaaac uucuaguuuu gucuuuuggc ugaggacuau acuacgucau acgcuuuucu 1260
cgucaguaca gugacguucc ggauucucuc uucuguuaac cguucauacg auucagucuu 1320
aaacuguuua cugggauauu aagagucuag uggauaauau auaauacgau guauacuuuu 1380
uuugauuguc uauaguaccu auuagagugu uuucaagcac ucauagaguu caggauaaga 1440
gcagaccuag uccgccaucc ucucuaucua cucuagcuuc guguugcucg acuuuucagg 1500
uuaauacuca acaagguucu ccuaccucac cuucucguau gauucgggag aauaaaaguc 1560
cgucgucuac uaagacugug ucuuagacuu ggucuuuaac uucuguuagu uccgaacaua 1620
cguggucuag gucuucgacu cguucaacuu ccgaaauaug uccccggaaa ucuacugaua 1680
cgucuacucc uucaccuaca acauaaauga agccugaccu uugucggacu cgaacuuaga 1740
cugcucguac cuuucuggaa ugccaacugu agcggucucc caaauucacc ucucgucuuu 1800
agggucaccg aaagcugcua auuucgucag cacguuucac gguuuaugac cuuagaccgu 1860
cucacgugua aacuucguag cccucuuccc caguaauacu uccucgcggu cuauugaggc 1920
cuacauauau uccagugagg ucacuacuug uguguaggca ggguuagucu ucgucauagu 1980
cuacaaacca gagagaguuu cuguagguac ugaaagguug gguucuuucg uucagaaguc 2040
ggagaguggu auaggaaccu acuuaacaag aguagaucuc cucucaagua gagacagccu 2100
ccacugccug cuuacagagu auuucuccgg uaggacgagc cggacucuau guuuuucaac 2160
auguuagucc gcucucaguu uauaagagac aucugauacu uuuuuucauu gucuauagug 2220
cuagauucac aauaggguua gguaaguagu acucaaggaa uuucuucuaa gagccagacu 2280
uccccuuucc auucuuuaga uucuuuaauc ccuagcgugg ugggggaaua cuucuccugu 2340
gaucguaccu cauacgaggc ucgcgagguu aacuguuuag gauaaaaccu caacugcucu 2400
accuguggau acuaggcuua guuaauucua uacucuuuaa gaagaaaugu cacuuuuacu 2460
gccaaucuag auuagcaggc aagucuugua ugagucuaca ccgucggcga cauaggguaa 2520
cccuagugua cauguagccu uaccgucccu uugcagggaa gauguuuuag aaccgaaaaa 2580
acccaagaag auuagauuuc cggugagguc gccauaaccg ucuaguucca guuggucuca 2640
uagugcgagu gacgcuuccg ucccgaauaa acgguguauc cuaccccuuc uggggagggu 2700
acgaguuaca uggucucgug aagucuucug guaaguuaua uccagaaaug uucccuugcu 2760
aacucgagug uuacugguag augcuacuac ucagugaccu ucgucgagga uacuagaccc 2820
uaguaaaguu aagaagguuu aaaagacuaa agucucucuu ccggaauuac aaaccggacu 2880
aacagcucuu uuuccguaga ccucgcaccc aggaccugag auagccggug aaguuuacuc 2940
gaucagauug aagaucgaag acuuguuagg ggccaaauga gucagagggg auuaaggucg 3000
gagagcuugu ugauuauagg acagaaaaga uagggauacu uuuuuugauu gucucuagcu 3060
agacaaaugc gcagugccua gggggcccga cguccuuaag cggugguacc cggucuagca 3120
cugguacaag cuccgggacg ggguguagua gcugcuccac uaguuguagc acuaguagca 3180
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ggaccacucg aaggacaagg accggccguc uucgacgccg uacaugccgg acuuaccggg 3300
gcuauagaug uucccgcaca uggucaaguu cucgcaccuc aagcuguacu cgguggacuu 3360
ggagugguac ggguugcgga cgucgcgguu guuaucggug gugauguagu cguacccguc 3420
gucgccggac cucaacugga agugguugcu gucguaggac uugguguuga agacguugga 3480
guggucgcgg aaguuguucu uuuggaagcu ggugugggag uacucguagc acucgucgga 3540
cguggacucg uagucuccgu ugucguuggu guuccggcac ucgacgcuga aguuguugcc 3600
guagugguag gucauguugg acucgaaguc gcuaggaguc ucgcgguagu cggucacguc 3660
uuggaagucu ccgucucacg accuguacaa gucuuggcgg aagccgccgu ucauguacuc 3720
uucgccgacc ccgacccggc cgucgcugcc guucuggugg accacgucgg ucuggucgau 3780
ggucauggag uaguaggucu ugucuuggac ccucuuggug acgucuaugc ggccuggaaa 3840
gccguacucg ucuuaggaca agcggguccu cuuuugguuc aaggaguggu ccucugaccg 3900
gccguggaag uggaccuggg acucgcuguc gucgccgcac cucuugggac cgccgaugac 3960
ggagugguuc accuacuagg accggcggcu cgacuucacg aagccguugu ggcggcaccg 4020
guucacguug cacuuggugc ugcuccucaa gacgcuguac gacucugagu agcugauguu 4080
guuccggcgg gacucguuca aguucguccu gcaccucucg cgggacgugc acaaguucug 4140
guggcacuug ucggaguagu cgcuggucga cgaguacucu uugguggacu cucuggagua 4200
cccgcacggg augacguuga ugucguucaa gaccauagac cucgugcggu ucuggccgcu 4260
cuggucgcac ggguucacga ccgaccacug guuaccgucg auggacuugc ucugggugaa 4320
gucgcugguc uagcucgucc uucggcuguu guacuagugg cucuacgacu ccuuccugau 4380
guaguucucu gucccgucgu ggggggaccg ggaguaccua gacgaguaca agucgugguc 4440
gcggauggag uagucguaga aggacgugga ccacuucuag gggugggugu cuguguaguu 4500
cccgccgucg acgggguucg gggugucuga gugguuguuc ccguagacgu cgacgccgcg 4560
gaaguuccac gggccgcacu uuugguagac cuucuccucu auucgccggc gaugcuggag 4620
cugauacuuu uuuugauugu cuauaggagc ugcgguggua cccgaccagg acguaguaag 4680
acaaagacca ccggugucgg uggccacagg uaucaagacu accgccgcga guccugacga 4740
cggacuucau gagagucucu uucuaggggc gguuccagca cgccucgaug ucuuucguuc 4800
ucggaagaga cccgacgaga uagggacggu aggacaaaga cggggccuuc ucuagugucc 4860
ggcuugacac gcggcuagga uuucuugaca cccacgucgu cgacuacguc guagaccugu 4920
ucugggguag aggagucuuc ggacgaguuc cgacuacuaa aaauaugauc ggucuaagaa 4980
guacaaaccu gguuuaguug aacacuaugg uacgaguuuc uccggaguua auauaaacuc 5040
aaaaauuaaa aauacuuuuu uugauugucg uuaguaccuu caggugcuaa aacucuggcu 5100
gcucaaguua cuaaaguuac uucuacugau acgguguucu cuuaaggacu uagggcuacu 5160
cgcguacugc augaacuuag uacgacuaau guuggacuua agaggagauu aaucacuacu 5220
auaacuguua aauuaguccu uuaaguuaag agaagguuaa gggagcuaca cccuaucauu 5280
cuugacccua ccucaagaac ucuacaauug caguacaguu cgguuagggu aggguuguag 5340
agucuacgua uuuaccuacc cuucaaccaa uuacagacua uuaguacuac ggucaguucc 5400
cauaucaaaa aauguacuuc accuguuucu ccgucuuuau uguaaacugc accaccucug 5460
gaaguaggcg ccgaccccgu uguuugguua acuuauguag uuuuuccuuu cuaccugacu 5520
gaguaaguuu uaagagcgaa uaaacacagu uuucaaaaac cugaaugugu ucaacuguaa 5580
uuagaauuua cgacagagac uccaccuuaa cgaguugaac cgcuccugaa aguuuccguu 5640
ucagucuucu ucaagaguac cuugcuugua uacguccuaa ucccaagggu cgaacccagg 5700
augaaaauaa agucuuccua cccgaaugaa guucuuugaa cuauaagauu accuggcuuu 5760
gaaagacaau uaccaguuuc uacacuaaua ucccuccuac guuugccacg auagguacca 5820
uacaucuuau cuguuggaca agagucucgu ucuguagaag agggaagauu uauagauguc 5880
uuaaccucua uuuuaacacc ucuccguccc uuuaaaaaga auacugaacu aauuuuacca 5940
ccuuggcuau acguugaacu ucgacuacuu uaaucguucu cuuaguuccg gaaaucaggg 6000
uguuaaggga guaaaacuuu uaguauaguu cugaagacaa cuacuucccc guuuuuaacu 6060
ggcuccauau ucuaaggagg uacuagucua uuacucacac uuuugucacc uagaguguga 6120
ccacuaaaua ccuagcaagu cuguaacccc aguaggaaaa uaucuaauaa ugugaccuga 6180
ucuuuuuaau guaaggguuc auugguacuu cuuucuauaa cuacacagua uacguuuucg 6240
ugaacguuca cuaaaucgag ccuaacaaga uaaaguuguc aaguuacuag uauuuuucac 6300
caagcacuua ccucugaacg agggaguacu aguagggaaa uuuucaguac aauuucuuuu 6360
auguaccggg ugucgacgag uucaaguucu aaaaccucua uuuaccguac uugaaggcga 6420
cuaauuuaca aaacuuuaug ggcugaauga ucuggguagc uauuauauga gacuguuuuc 6480
aguaaguuac uuauccaguc uccacaacuu uguacaggcu uacuuaggcu ugugaggaua 6540
gggaucauuu uuccacaacg ucugauacaa ccuguguuuc cgaugguuaa ccuuucuuaa 6600
agaauuucuc uaacuacucu ucccgaaucu acuacuacua gauuaauaac cagaauuucc 6660
uuuccucucc cuugacuuca accguccauc uaaaaagagg gauuacagaa ccuuuaacgc 6720
ucuuaugaaa cauuaauggc uuauaaacua uuucugagua aagcagggau acaaauuucc 6780
ggacuguuac cgccugcuag auugacguca guaauuuuuc uacaaucuaa ggaguaggcc 6840
gguuccuaac uucaguauac uccguuaaac guaucgguua guguaacuaa ugcuuuuuac 6900
cuuauuggug guuuccuuca auaguuugcc gggucacaag gcucaauacc cggucaagaa 6960
uccaauaggu aggaauuagc ucucuugagu acuuaaaaaa cucuuuucag aauauaugau 7020
guuaccuucu ggucugaacu acgcacaagu guuguugugu gacuaguuaa guuggagggu 7080
ugcucaaaca accguuccug uucucccacc ugaccuucca gaugccguuu uuccuaccuc 7140
auaggaguua gaugaccaau aaguuucucu ccgauuuuag ucuuugugac gacaguuuca 7200
gaaccguguu ccacuauuag uucaauaaac gugugucaua uuuugcuucu uuagcucuuu 7260
gcaacaucuu aaugucccac gagaguuagu uuaccaaaga uuauuacucu uuuaauacug 7320
acguuaguuu uaucccuguc ccuucaaucc ugaaaacuau uuacugcuac ucugauacgu 7380
uagacgucua augaacuuaa uaccuuuuua uggcuaaaag gcaccucacu aaucucccaa 7440
ucucugguuc ucuaccagug cucacugaac acagugguua cugguuuaug ggugaacacg 7500
auuauauuac ucgagucaaa gguguuuacg agaguggcau cgaguaaaac gacucuuggg 7560
uuaguuacgg uacuauguca uguuaauaaa acccuguaaa cgaucugaga acaacuacua 7620
cguacuagga cgagaagcag uuaguaacau acuucaaguu cuauucuaug gcccgaacgu 7680
gucaagauga aaguuuaugc gguacaacau aaaccuggga agguaaccuc cucacagccc 7740
guacagaaac agguccaaaa acuaaucucg gaagggucua gggcauuguc uuucagagag 7800
uaagaccucu aaguagguac auguacgagc uucacucgua gacuuccucu acucacguca 7860
uaaaccuuug gggcucuauc gguucaaagc uuauugagug uaucuguucg aucaucuucu 7920
agguuggaga gacuuguagc gauacccuua cucaggucgc uugaacaauu ucugacucca 7980
auuuuuuacg aauuagcuua guucuguuug guaguccuug guccacuaau uccuacguug 8040
guauauaaac auaguacuuc uccuagccga gucuucaaag aauaccaguu auuuaggaga 8100
caagggaucu aaaaauucac uuaaguuuag uccgugaaaa aacccucagc gucugcccga 8160
guagucagau aaaguuuuaa gagcaugaua agccuugagg aaauucuuuu ucauaguauc 8220
ccuuaaccua cuaaacuaac acuccucacu ccauaggaga aacuguguaa aucccuuuga 8280
aguaaacucu uccccuagua cauuuuacac cuguacaagu cgaugaguac gacuguguaa 8340
uucuauguuu aggaccccgg caugucaaua acccuguuga caugggguag guaaucuuua 8400
caacccaggu guuguagcuu uucucugagg aacacguggu acauugugua gucccaaguu 8460
aauacaaaga cacguaacag gucugcccua gguacugcag aaaucaagug ccccugguaa 8520
cggacgaaua gaucccagau uuuguagacu uagauguaga uaaaacgucg gaacccuuuc 8580
ccuuucguuu cagggugacu aauuuucucg augugcagaa ucucuacgau agagaaccaa 8640
acaacuuggg cugagauuug aucguuacug auaugaaaga uuguagguga gaaauugucc 8700
gcuucuuacc ugguuuuccg ucguacccaa guuuucuugu cccagacggg aaguauccaa 8760
aagcuguaga gccuacucgg uaccacccaa gcguagaguc ucgugacguc guaacugguc 8820
caacuaccgu ugaugucugu gguacucccu agacccucua gucuuaaagc ugaaaaauaa 8880
gguucguugc aacgagauac gaguuuaaug guggugacaa cguucucugc cuaccuagug 8940
gucaacaugu cuaguaauag uauaacggac auucaggaca aacucugggu aucuucucua 9000
gugggaccug aguucauacc ugaugugcgg gggucuacau aggguacacg acuucuguac 9060
cuccuuaccc cuuccaagca ccccuguucu cuauuuuguc uagauaggaa aucuucccuu 9120
aaccuucuua aaucguggac gacucguuag gauaguucag ccgucuacau auccaaaaga 9180
uauaccucug aaccgcauau cuuuuagaug aguacggcuc cugucaagag auaaaggaga 9240
uagauauguu ccagcauaau cuccagcucc aaagaauuuu cccaacgauc ugccuaauua 9300
cucucguuca acgacgguuc auuauguggc cucuucagac cgaguaaacu ucuccggccg 9360
guugcgucac augccuccaa acuaaaugaa cuaacuauuu aacucacaua guggagguaa 9420
ggaaagagaa ugaucuaguc cuggauaauc ucugcuuaau cuuugcuaag ggguguucua 9480
ggguuggagg auaggcuguu cguuggcacu auacccccac uaacagucuu uaaugaaguu 9540
uaugguuacg gcagauuaac uuuucccuuu uaugucuagu guaauaagug uuaauaccaa 9600
uaagagucua cagaauaggu aucugaagua accugguaag agauaaaggu ggugggagaa 9660
cguuuaggau auguucggua aaaauagacc cuuucuauuc uuacucaacu cucucgaccg 9720
uuuagaaaga aguaacgauu cuaguccucu ccccacccuu cuguauguac acuuuaagaa 9780
gugguuccug uauaauaaca caggucuccu uuagucugua cgaacguuca agcccuaacg 9840
auuccuauua uuauuucugu acucgauagg gggaaccccu ucccuuaggu cucccuguua 9900
auguuguuag ggacaaauaa uaugcuggug gggaaugggu uucuacgauc ucuacggagg 9960
uucuuagguu uuaggggacg acaggccuua guccaacccg guuaaugguu gaccgcgagu 10020
aauauuuuaa gccucauaua auguaccuua cccuuaggua augucccuga agaacucaac 10080
accucugccg aggccucccu acugacgacg uaaugaugcu cuuuuacacg uaucgucucc 10140
uuauaaguua ucagacaauc uuaauagucc cagucaguac gcuccgcgga gaggacucgg 10200
ggggucacgg gaucuuugaa auccuccucu auuuagcucu acacauuuac cacuuuguac 10260
aacccuuaua gguagacuga auacacuggg uuccugaacc cugauaaagg aggcugaguu 10320
ucguccgaac cccgaaguuu aacuaaauua acauuaccua uaccuucaag cccuaagaag 10380
augaucggac uuuuaacucu gcuuacaauc uuuaauacac guggccuaaa accuacucgu 10440
uccucaaaau uagauguucu gaauaccuug uauauaaaca cucucgcuuu ucuuacguca 10500
uuguuaggaa ccaggguaca aguucugcca gcugaaucaa guuugucuua aaucaucaag 10560
aguuugcaga cuucauauau accauacauu uccaaacuuc uuuaauuagc uacuuggguu 10620
agggcuaacc agaagguagu uacuuaggac cuuuuuggac augcguaagg ucaguagucu 10680
uguccuuaaa cggucucguu ucuuccaauc auguaugaaa uggaacuguc cauaagggag 10740
gguuaaguaa ggacuaggaa aacauuugua acucugauac gauguuuaua agccucaugg 10800
gugcccacac agaguacgcc gacggaauuu uaguagacua ucuggacguc uaaauaacug 10860
guaaucggaa aaaauauacc gcuaauauag cauaauauug uaguuaguau agucucaucc 10920
uggcuaugga ggcuuggggg guagucuacc uuaacguguu uuacaccccu agcgauauug 10980
accauauucg aaaaccgacu caaacuaccu cuuucuguaa ggugauauag uugucacaaa 11040
ucgucaauag gucguuagua agggcuaauc cacccuccga caaagucauu uuccuccuau 11100
guucgucuuc accucaugau cuccacuacc cgaggguuuu cuaugggcuu aaagucugag 11160
gaaccggggu uagcccuuga ccuagucuag agaccuuaac caggcuuugg uucaagcaga 11220
uuuagguaag uuacucuaga acaaguuagu cgauacagca ugucaccuau uaguaaacuu 11280
uaccaguuua aacgcuucuu uguguccuua cuaacuuacc uaguuaucug cuuaaaguuu 11340
ucuucuggcc agauaugacu acaacuucuc acuggaugug cuccuuuuga gaaccucucu 11400
aauuuuuuag uacuccucug agguuugaaa uucauacuuu uuuugaaacu aggaauucug 11460
ggagaacacc aaaaauaaaa aauagaccaa aacaccagaa gcaucggacg aguuccgacu 11520

Claims (53)

1.一种重组棒状病毒，其在其基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体，优选地人类CCL21。
2.如权利要求1的重组棒状病毒，其中该CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：
(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白，
(ii)c-末端截短的CCL21蛋白，
(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质，
(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质，
(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质，
(vi)根据(i)至(v)中任一者进一步包括信号肽序列的蛋白质，
(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质，或
(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的蛋白质。
3.如权利要求1至2中任一项的重组棒状病毒，其为水疱病毒(vesiculovirus)。
4.如权利要求3的重组棒状病毒，其中该水疱病毒选自包括以下的群：阿拉戈斯水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis alagoas virus，VSAV)、卡拉加斯病毒(Carajás virus，CJSV)、章地埔拉病毒(Chandipura virus，CHPV)、科卡尔病毒(Cocal virus，COCV)、水疱性口炎印第安纳病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus，VSIV)、伊斯法罕病毒(Isfahan virus，ISFV)、马拉巴病毒(Maraba virus，MARAV)、水疱性口炎新泽西病毒(Vesicular stomatitis New Jersey virus，VSNJV)或皮理病毒(Piry virus，PIRYV)。
5.如权利要求3的重组棒状病毒，其为水疱性口炎病毒，优选地水疱性口炎印第安纳病毒(VSIV)或水疱性口炎新泽西病毒(VSNJV)。
6.如权利要求1至5中任一项的重组棒状病毒，其中该棒状病毒是具有复制能力的。
7.如权利要求1至6中任一项的重组棒状病毒，其中该棒状病毒
(i)缺乏编码糖蛋白G之功能基因，及/或
(ii)缺乏功能糖蛋白G。
8.如权利要求7的重组棒状病毒，其中
(i)编码该糖蛋白G之基因系被编码另一病毒之糖蛋白GP之基因代替，及/或
(ii)该糖蛋白G系被另一病毒之糖蛋白GP代替。
9.如权利要求8的重组棒状病毒，其中
(i)编码该糖蛋白G之基因系被编码沙粒病毒之糖蛋白GP之基因代替，及/或
(ii)该糖蛋白G系被沙粒病毒之糖蛋白GP代替。
10.如权利要求8至9中任一项的重组棒状病毒，其中
(i)编码该糖蛋白G之基因系被编码丹德农病毒(Dandenong virus)或莫佩亚病毒(Mopeia virus)之糖蛋白GP之基因代替，及/或
(ii)该糖蛋白G系被丹德农病毒或莫佩亚病毒之糖蛋白GP代替。
11.如权利要求7至9中任一项的重组棒状病毒，其中
(i)编码该糖蛋白G之基因系被编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或
(ii)该糖蛋白G系被LCMV之糖蛋白GP代替。
12.一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码至少一种选自包括以下之群的CCL21蛋白或其功能变体，优选地人类CCL21：
(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白，
(ii)c-末端截短的CCL21蛋白，
(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质，
(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质，
(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质，
(vi)根据(i)至(v)中任一者进一步包括信号肽序列的蛋白质，
(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质，
(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的蛋白质，
其中编码该重组水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因系被编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或该糖蛋白G系被LCMV之糖蛋白GP代替。
13.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码经胞浆素处理的CCL21蛋白。
14.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码c-末端截短的CCL21蛋白。
15.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质。
16.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质。
17.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质。
18.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包括根据(i)至(v)中任一者进一步包括信号肽序列的蛋白质的蛋白质。
19.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质。
20.如权利要求12的重组水疱性口炎病毒，其中该基因组编码包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的蛋白质。
21.一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中至少编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体，优选地人类CCL21。
22.如权利要求21的重组水疱性口炎病毒，其中该核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
23.如权利要求21或22中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该磷蛋白(P)包括如SEQID NO:8中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
24.如权利要求21至23中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该大蛋白(L)包括如SEQID NO:9中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
25.如权利要求21至24中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
26.如权利要求21至25中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中：
该核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体
其中该磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体
其中该大蛋白(L)包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体，且
该基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
27.如权利要求21至26中任一项的重组水疱性口炎病毒，其为具有复制能力的。
28.如权利要求21至27中任一项的重组水疱性口炎病毒，其
(i)缺乏编码糖蛋白G之功能基因，及/或
(ii)缺乏功能糖蛋白G。
29.如权利要求21至28中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中
(i)编码该糖蛋白G之基因系被编码另一病毒之糖蛋白GP之基因代替，及/或
(ii)该糖蛋白G系被另一病毒之糖蛋白GP代替。
30.如权利要求21至29中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中
(i)编码该糖蛋白G之基因系被编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或
(ii)该糖蛋白G系被LCMV之糖蛋白GP代替。
31.如权利要求21至30中任一项的重组水疱性口炎病毒，其中该CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：
(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白，
(ii)c-末端截短的CCL21蛋白，
(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质，
(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质，
(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质，
(vi)根据(i)至(v)中任一者进一步包括信号肽序列的蛋白质，
(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质，
(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的蛋白质。
32.一种重组水疱性口炎病毒，其在其基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)及至少一种CCL21蛋白或其功能变体，优选地人类CCL21，其中该CCL21蛋白或其功能变体选自包括以下的群：
(i)经胞浆素处理的CCL21蛋白，
(ii)c-末端截短的CCL21蛋白，
(iii)包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％一致性的蛋白质，
(iv)包括SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％一致性的蛋白质，
(v)包括SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％一致性的蛋白质，
(vi)根据(i)至(v)中任一者进一步包括信号肽序列的蛋白质，
(vii)包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％一致性的蛋白质，
(viii)包括SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％一致性的蛋白质，
其中，编码该水疱性口炎病毒之糖蛋白G之基因系被编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之糖蛋白GP之基因代替，及/或该糖蛋白G系被LCMV之糖蛋白GP代替，且其中
该核蛋白(N)包括如SEQ ID NO:7中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:7至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体
其中该磷蛋白(P)包括如SEQ ID NO:8中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:8至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体
其中该大蛋白(L)包括如SEQ ID NO:9中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:9至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体
该基质蛋白(M)包括如SEQ ID NO:10中所示之氨基酸或与SEQ ID NO:10至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％一致之功能变体。
33.一种药物组合物，其中该组合物包括如权利要求1至20中任一项的重组棒状病毒或如权利要求21至32中任一项的重组水疱性口炎病毒。
34.一种如权利要求1至20中任一项的重组棒状病毒、如权利要求21至32中任一项的重组水疱性口炎病毒或如权利要求33之药物组合物，其用作药剂。
35.一种如权利要求1至20中任一项的重组棒状病毒、如权利要求21至32中任一项的重组水疱性口炎病毒或如权利要求33之药物组合物，其用于治疗癌症、优选地实体癌。
36.如权利要求35所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该实体癌选自包括以下之清单：生殖系统肿瘤、卵巢肿瘤、睪丸肿瘤、内分泌肿瘤、胃肠道肿瘤、胰脏肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、结肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、呼吸系统肿瘤、肺肿瘤、乳房肿瘤、头颈肿瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)及骨肿瘤。
37.如权利要求34至36中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组棒状病毒、该重组水疱性口炎病毒或该药物组合物拟经肿瘤内或经静脉内给予。
38.如权利要求35至37中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物拟经肿瘤内给予至少一次且随后经静脉内给予。
39.如权利要求38所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该后续静脉内给予系在该初始肿瘤内给予之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天给予。
40.一种组合物，其包括如前述权利要求中任一项的重组棒状病毒或重组水疱性口炎病毒及另外的PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物。
41.如权利要求40的组合物，其中该PD-1路径抑制剂是针对PD-1或PD-L1的拮抗性抗体。
42.如权利要求40的组合物，其中该SMAC模拟物选自由以下化合物1至26中的任一者组成之群：
Figure FDA0003180227110000061
Figure FDA0003180227110000071
Figure FDA0003180227110000081
Figure FDA0003180227110000091
Figure FDA0003180227110000101
或所述化合物中的一者之药学上可接受的盐。
43.如权利要求40的组合物，其中该PD-1路径抑制剂选自由以下组成之群之拮抗剂：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
44.一种包括以下部分之试剂盒：
a)如前述权利要求中任一项的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，及
b)如前述权利要求中任一项所定义之PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物。
45.如权利要求34至36中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其与PD-1路径抑制剂或SMAC模拟物组合给予。
46.如权利要求45的所用重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物用于与该PD-1路径抑制剂或该SMAC模拟物同时地、依序地或交替地给予。
47.如权利要求45至46中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该SMAC模拟物选自由如权利要求42中的化合物1至26中的任一者或所述化合物中的一者的药学上可接受的盐组成之群。
48.如权利要求45至46中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该PD-1路径抑制剂选自由以下组成之群：派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、阿替珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、PDR-001、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5。
49.如权利要求45至47中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物用于经由与该PD-1路径抑制剂或该SMAC模拟物不同之给予途径给予。
50.如权利要求45至47中任一项所用的重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物，其中该重组棒状病毒、重组水疱性口炎病毒或药物组合物用于经肿瘤内给予至少一次且该PD-1路径抑制剂或该SMAC模拟物系经静脉内给予。
51.一种产病毒细胞，其中该细胞产生如前述权利要求中任一项的重组棒状病毒或重组水疱性口炎病毒。
52.如权利要求51的产病毒细胞，其特征在于该细胞是Vero细胞、HEK细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
53.一种重组棒状病毒，其在其RNA基因组中编码至少一种CCL21蛋白或其功能变体，优选地人类CCL21，其中该重组棒状病毒之RNA基因组包括一编码序列或由该编码序列组成，该编码序列与SEQ ID NO:24相同或与其至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
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