BR112021013876A2 - Codificação de rhabdovírus recombinante para ccl21 - Google Patents

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Klaus Erb
Patrik ERLMANN
Tobias NOLDEN
John Edward Park
Guido Wollmann
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Abstract

codificação de rhabdovírus recombinante para ccl21. a presente invenção refere-se ao campo dos vírus oncolíticos e em particular a um rhabdovírus recombinante, tal como vírus da estomatite vesicular codificando em seu genoma uma proteína ccl21. a invenção ainda se refere ao uso do vírus recombinante no tratamento de câncer, e também aos métodos para produção dos referidos vírus.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CODIFI- CAÇÃO DE RHABDOVÍRUS RECOMBINANTE PARA CCL21". Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se ao campo de vírus oncolíti- cos e em particular a uma codificação de rhabdovírus recombinante no seu genoma para uma proteína CCL21. A invenção ainda se refere ao uso do rhabdovírus recombinante no tratamento de câncer, e também aos métodos para produzir os referidos vírus. Antecedentes da Invenção
[002] Vírus oncolíticos são uma classe emergente de biológicos que seletivamente se replicam e matam células cancerosas e são ca- pazes de se espalhar dentro dos tumores. Os esforços para fazer com que os vírus oncolíticos aumentem o seu potencial terapêutico levaram ao desenvolvimento dos assim chamados vírus armados, que codifi- cam no seu genoma antígenos tumorais ou transgenes moduladores imunes para melhorar a sua eficácia no tratamento do tumor.
[003] Em muitos casos em que há uma escassez de células T em tumores e assim existem lá o que se tornou conhecido como "desertos imunológicos" – um microambiente tumoral onde as células T do sis- tema imune não podem ou não penetram no tumor para matar as célu- las que crescem fora de controle. Foi postulado que para evadir a vigi- lância imunológica, os tumores criam um microambiente imunossu- pressor recrutando células supressores derivadas mieloides ou secre- tam fatores que incluem TGFβ, que tem um papel duplo na indução da expressão de genes de matriz extracelular e supressão da expressão de quimiocinas e citoquinas necessárias para facilitar a infiltração de células T nos tumores (Pickup M, Novitskiy S, Moses HL. The roles of TGFbeta in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer 2013;13:788–99). Além disso, estudos verificaram que tumores que exibem alta expressão de genes que correspondem a um microambi-
ente imunossupressor estão associados com fracos resultados em al- guns tipos de câncer, incluindo câncer de ovário e câncer colorretal (Calon A, Lonardo E, Berenguer-Llergo A, Espinet E, Hernando- Momblona X, Iglesias M, et al. Stromal gene expression defines poor- prognosis subtypes in colorectal cancer. Nat Genet 2015;47:320–9; Ryner L, Guan Y, Firestein R, Xiao Y, Choi Y, Rabe C, et al. Upregula- tion of periostin and reactive stroma is associated with primary chemo- resistance and predicts clinical outcomes in epithelial ovarian cancer. Clin Cancer Res 2015;21:2941–51; Tothill RW, Tinker AV, George J, Brown R, Fox SB, Lade S, et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clin Can- cer Res 2008;14:5198–208.)
[004] Uma abordagem recente pressupõe um vírus oncolítico que codifica no seu genoma a proteína IFN-ß como uma carga. Em uma abordagem adicional a expressão do antígeno tumoral MAGE-A3 foi contemplada. Além de identificar uma carga adequada e eficaz, a ex- pressão de cargas adicionais a partir da estrutura principal viral sem- pre carrega o risco que não apenas potencializará a eficácia antitumo- ral, mas também a imunidade antiviral. Deve se tomar cuidado para que a carga não restrinja o potencial oncolítico do vírus até um grau onde o benefício ganho pela expressão da carga terapêutica seja ne- gado pela perda da potência oncolítica. Sendo assim, há uma neces- sidade na técnica por vírus oncolíticos adicionalmente mais armados que possam ser usados no tratamento eficaz dos tumores. Existe uma necessidade adicional na técnica em melhorar seletivamente a infiltra- ção da célula T e/ou célula dendrítica nos microambientes tumorais imunossupressores. Sumário da Invenção
[005] A presente invenção aborda as necessidades acima ao prover um rhabdovírus recombinante, tal como um vírus da estomatite vesicular, que codifica no seu genoma uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana.
[006] Deve-se compreender que qualquer modalidade que se re- fere a um aspecto específico também deve estar combinada com uma outra modalidade que também se refere àquele aspecto específico, mesmo em múltiplas camadas e combinações compreendendo várias modalidades àquele aspecto específico.
[007] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um rhabdovírus recombinante que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma.
[008] Em uma modalidade que se refere ao primeiro aspecto, a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) proteína CCL21 processada com plasmi- na, (ii) proteína CCL21 c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identi- dade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo adicionalmente uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:1, ou (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:5.
[009] Em uma modalidade que se refere ao primeiro aspecto, o rhabdovírus recombinante é um vesiculovírus.
[0010] Em uma modalidade que se refere ao primeiro aspecto, o vesiculovírus é selecionado a partir do grupo compreendendo: vírus alagoas da estomatite vesicular (VSAV), vírus carajás (CJSV), vírus de chandipura (CHPV), vírus cocal (COCV), vírus de estomatite vesicular de Indiana (VSIV), vírus isfahan (ISFV), vírus maraba (MARAV), vírus da estomatite vesicular de New Jersey (VSNJV), ou vírus piry (PIRYV), preferivelmente um vírus de estomatite vesicular de Indiana (VSIV) ou preferivelmente um vírus de estomatite vesicular de New Jersey (VSNJV).
[0011] Em uma modalidade que se refere ao primeiro aspecto, o rhabdovírus recombinante é competente na replicação.
[0012] Em uma modalidade que se refere ao primeiro aspecto, a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é CCL21 humana.
[0013] Em uma modalidade que se refere ao primeiro aspecto, o rhabdovírus recombinante carece de uma codificação de gene funcio- nal para glicoproteína G, e/ou carece de uma glicoproteína G funcio- nal; ou, a codificação genética para a glicoproteína G é substituída pe- la codificação genética para a glicoproteína GP de um outro vírus, e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de um outro ví- rus; ou, a codificação genética para a glicoproteína G é substituída pe- la codificação genética para a glicoproteína GP de um arenavírus, e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de um arenaví- rus. Em uma modalidade adicionalmente preferida, a codificação gené- tica para a glicoproteína G é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP de um vírus Dandenong ou vírus Mopeia, e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de vírus Dande- nong ou vírus Mopeia. Ainda mais preferida, a codificação genética para a glicoproteína G é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP da LCMV.
[0014] Em uma modalidade preferida que se refere ao primeiro aspecto, a invenção provê um vírus de estomatite vesicular recombi- nante codificando no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) proteína CCL21 pro- cessada por plasmina, (ii) proteína CCL21 c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que com- preende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que com- preende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:1, ou (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que a codificação genética para a glicoprote- ína G do vírus da estomatite vesicular recombinante é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningi- te linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glico- proteína GP do LCMV.
[0015] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um vírus da estomatite vesicular recombinante, codificando no seu ge- noma pelo menos uma nucleoproteína do vírus de estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), glico- proteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante fun- cional da mesma, preferivelmente CCL21 humana.
[0016] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, a nucleoproteína (N) compreende uma sequência de aminoácido con- forme apresentada na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7.
[0017] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, a fosfoproteína (P) compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentada na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:8.
[0018] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, a proteína grande (L) compreende uma sequência de aminoácido con- forme apresentada na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:9.
[0019] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, a proteína matriz (M) compreende uma sequência de aminoácido con- forme apresentada na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
[0020] Em uma modalidade preferida que se refere ao segundo aspecto, a nucleoproteína (N) compreende uma sequência de aminoá- cido conforme apresentada na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7, a fosfoproteína (P) compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentada na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:8, a proteína grande (L) compreende uma sequência de aminoáci- do conforme apresentada na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:9, e a proteína matriz (M) compreende uma sequência de aminoá-
cido conforme apresentada na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcio- nal pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
[0021] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, o vírus da estomatite vesicular recombinante é competente na replica- ção.
[0022] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, o vírus da estomatite vesicular recombinante carece de uma codificação genética funcional para glicoproteína G, e/ou carece de uma glicopro- teína funcional G; ou, a codificação genética para a glicoproteína G é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP de um outro vírus, e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de um outro vírus; ou, a codificação genética para a glicoproteína G é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substi- tuída pela glicoproteína GP do LCMV.
[0023] Em uma modalidade que se refere ao segundo aspecto, a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) proteína CCL21 processada por plasmi- na, (ii) proteína CCL21c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identida- de com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma se- quência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, ou uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identi-
dade com a SEQ ID NO:5.
[0024] Em uma modalidade preferida que se refere ao segundo aspecto, a invenção provê um vírus de estomatite vesicular recombi- nante codificando no seu genoma uma nucleoproteína do vírus de es- tomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, em que a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é selecio- nada a partir do grupo compreendendo: (i) proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) proteína CCL21 c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma pro- teína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, ou (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que, a codificação genética pa- ra a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningi- te linfocitária(LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glico- proteína GP do LCMV, e em que a nucleoproteína (N) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7, a fosfoproteína (P) compreende um aminoácido con- forme apresentado na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID
NO:8, a proteína grande (L) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:9, e a proteína matriz (M) compreende um aminoácido conforme apresenta- do na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
[0025] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que a composi- ção compreende um rhabdovírus recombinante de acordo com o pri- meiro aspecto ou qualquer uma das suas modalidades, ou um vírus de estomatite vesicular recombinante de acordo com o segundo aspecto ou qualquer uma das suas modalidades.
[0026] Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um rhabdovírus recombinante de acordo com o primeiro aspecto ou qual- quer uma das suas modalidades, ou um vírus de estomatite vesicular recombinante de acordo com o segundo aspecto ou qualquer uma das suas modalidades, ou uma composição farmacêutica de acordo com o terceiro aspecto ou qualquer uma das suas modalidades, para uso como um medicamento.
[0027] Em uma modalidade que se refere ao quarto aspecto, a in- venção provê um rhabdovírus recombinante, um vírus de estomatite vesicular recombinante, ou uma composição farmacêutica para o uso no tratamento de câncer, preferivelmente cânceres sólidos. Em uma modalidade preferida, o câncer sólido é selecionado a partir da lista compreendendo: tumor reprodutivo, um tumor ovariano, um tumor pancreático, um tumor testicular, um tumor endócrino, um tumor gas- trointestinal, um tumor hepático, um tumor renal, um tumor no cólon, um tumor colorretal, um tumor de bexiga, um tumor de próstata, um tumor de pele, melanoma, um tumor respiratório, um tumor de pulmão, um tumor de mama, um tumor de cabeça e pescoço, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) e um tumor ósseo.
[0028] Em uma modalidade que se refere ao quarto aspecto, o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinan- te, ou a composição farmacêutica deve ser administrado de forma in- tratumoral ou intravenosa. Em uma outra modalidade relacionada, o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinan- te ou a composição farmacêutica deve ser administrado pelo menos uma vez de forma intratumoral e subsequentemente de forma intrave- nosa. Em uma modalidade adicionalmente relacionada, a administra- ção intravenosa subsequente do rhabdovírus recombinante, vírus da estomatite vesicular recombinante ou a composição farmacêutica é dada 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias ou 31 dias depois da adminis- tração intratumoral inicial.
[0029] Em um quinto aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo um rhabdovírus recombinante de acordo com o primeiro aspecto ou qualquer uma das suas modalidades, ou um vírus de estomatite vesicular recombinante de acordo com o se- gundo aspecto ou qualquer uma das suas modalidades e adicional- mente um inibidor, em que o inibidor é um inibidor da via PD-1 ou um mimético de SMAC.
[0030] Em uma modalidade que se refere ao quinto aspecto, o ini- bidor da via PD-1 é um anticorpo antagonista, que é direcionado con- tra PD-1 ou PD-L1. Em uma modalidade adicionalmente relacionada, o mimético de SMAC é selecionado a partir do grupo consistindo em qualquer um dos compostos 1 a 26 a partir da tabela 2 ou um sal far- maceuticamente aceitável de um desses compostos. Em uma outra modalidade relacionada, o inibidor da via PD-1 é um antagonista sele-
cionado a partir do grupo consistindo em pembrolizumabe, nivoluma- be, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 (conforme mostrado na tabela 1).
[0031] Em um sexto aspecto, a presente invenção provê um kit de partes compreendendo: um rhabdovírus recombinante, um vírus de estomatite vesicular recombinante ou uma composição farmacêutica conforme definida em qualquer um dos primeiro ao terceiro aspectos ou qualquer uma das suas modalidades, e um inibidor da via PD-1 ou Mimético de SMAC conforme definido em qualquer uma das modali- dades que se refere ao quinto aspecto.
[0032] Em um sétimo aspecto, a presente invenção provê um tra- tamento de combinação compreendendo: a) um rhabdovírus recombi- nante de acordo com o primeiro aspecto ou qualquer uma das suas modalidades, ou um vírus de estomatite vesicular recombinante de acordo com o segundo aspecto ou qualquer uma das suas modalida- des, ou uma composição farmacêutica de acordo com o terceiro as- pecto ou qualquer uma das suas modalidades, e b) um inibidor da via PD-1 ou um mimético de SMAC. Em uma modalidade que se refere ao sétimo aspecto a) e b) podem ser administrados de forma concomitan- te, sequencial ou alternada. Em uma modalidade relacionada, a) e b) são administrados através de diferentes vias de administração. Em uma modalidade adicionalmente relacionada, a) é administrado de forma intratumoral b) é administrado de forma intravenosa.
[0033] Em uma modalidade que se refere ao sétimo aspecto, o inibidor da via PD-1 é um anticorpo antagonista, que é direcionado contra PD-1 ou PD-L1. Em uma modalidade relacionada, o inibidor da via PD-1 é selecionado a partir do grupo consistindo em pembrolizu- mabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalu- mabe, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 (vide tabela 1).
Em uma modalidade adicionalmente relacionada, o mimético de SMAC é selecionado a partir do grupo consistindo em qualquer um dos com- postos 1 a 26 de acordo com a tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável de um desses compostos.
[0034] Em um oitavo aspecto, a invenção provê uma célula que produz vírus, caracterizada pelo fato de que a célula produz um rhab- dovírus recombinante de acordo com o primeiro aspecto ou qualquer uma das suas modalidades, ou um vírus de estomatite vesicular re- combinante de acordo com o segundo aspecto ou qualquer uma das suas modalidades.
[0035] Em uma modalidade que se refere ao oitavo aspecto, a cé- lula que produz vírus é uma célula Vero, uma célula HEK, uma célula HEK293, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), ou uma célu- la renal de hamster bebê (BHK).
[0036] Em um nono aspecto, a invenção provê um método de pro- dução de um rhabdovírus recombinante em uma cultura celular: (i) Infectar uma célula hospedeira com um rhabdovírus re- combinante, preferivelmente um vírus de estomatite vesicular, (ii) Cultivar a célula hospedeira sob condições que permi- tem a replicação do rhabdovírus recombinante, (iii) coletar o rhabdovírus recombinante da cultura celular, (iv) Opcionalmente, o tratamento enzimático da coleta de vírus, preferivelmente com benzonase, (v) Capturar a coleta de rhabdovírus através do carrega- mento em um adsorvedor de membrana de monólito de troca catiônica ou resina seguido pela eluição, (vi) Polir rhabdovírus ao submeter o eluato da etapa (v) à exclusão de tamanho, exclusão de tamanho multimodal/troca iônica ou filtração de fluido tangencial, (vii) troca de tampão do rhabdovírus polido através de ultra-
filtração/diafiltração, (viii) filtração estéril do rhabdovírus.
[0037] Em uma modalidade que se refere ao nono aspecto, a célu- la hospedeira é uma célula HEK293.
[0038] Em uma modalidade que se refere ao nono aspecto, a célu- la hospedeira é cultivada em suspensão.
[0039] Em uma modalidade que se refere ao nono aspecto, o rhabdovírus recombinante é formulado em uma composição farmacêu- tica. Em uma modalidade preferida, o rhabdovírus recombinante de acordo com o primeiro aspecto ou qualquer uma das suas modalida- des, ou um vírus de estomatite vesicular recombinante de acordo com o segundo aspecto ou qualquer uma das suas modalidades é formula- do em uma composição farmacêutica.
[0040] Em um aspecto adicional, o rhabdovírus recombinante codi- fica no seu genoma do RNA em pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, em que o genoma do RNA do rhabdovírus recombinante compreende ou consiste em uma sequência codificadora idêntica ou pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 24. Breve Descrição dos Desenhos
[0041] FIG.1: Análise de expressão dos tumores LLC1-IFNARKO (RNA total) a partir de camundongos controle ou camundongos trata- dos com VSV-GP para os genes indicados.
[0042] FIG.2A-D: Curvas únicas do crescimento tumoral dos ca- mundongos que carregam tumor CT26.CL25-IFNARKO. (A) camun- dongos controle (tratados mock), (B) camundongos tratados com anti- PD-1, (C) camundongos tratados com VSV-GP i.v. ou (D) camundon- gos tratados com uma combinação de VSV-GP e anti-PD-1.
[0043] FIG.3A-C: Análise da (re)-introdução dos camundongos curados que foram pré-tratados com VSV-GP (vide FIG.2C) ou a com- binação de VSV-GP e anti-PD1 (vide FIG.2D). (A) camundongos puros com células tumorais CT26.CL25-IFNARKO foram usados como con- trole. Para a (re-)introdução tumoral as células CT26Cl25 IFNAR-/- fo- ram injetadas tanto com (B) camundongos livres de tumor tratados a longo prazo com VSV-GP (curados) a partir dos experimentos confor- me mostrado na FIG.2C, ou (C) camundongos livres de tumor tratados a longo prazo com combinação de VSV-GP e anti-PD-1 (curados) a partir dos experimentos conforme mostrado na FIG.2D.
[0044] FIG.4: Análise de expressão dos tumores LLC1-IFNARKO (RNA total) a partir de camundongos controle ou camundongos trata- dos com VSV-GP para as quimiocinas indicadas.
[0045] FIG.5A-B: (A) Desenho ilustrando o sítio de inserção do (transgene) CCL21 dentro do genoma de VSV-GP. (B) desenho ilus- trando o resgate viral.
[0046] FIG.6: (A) Análise da CCL21 de murino nos sobrenadan- tes das células HEK293 infectadas com VSV-GP-muCCL21 (CCL21 de murino de comprimento total que codifica VSP-GP). (B) Análise funcional da migração de células T de murino usando uma configura- ção Transwell e CCL21 de murino recombinante ou sobrenadantes a partir de células HEK293 infectadas com VSV-GP resp. VSV-GP- muCCL21.
[0047] FIG.7A-C: Análise do crescimento tumoral única dos ca- mundongos que carregam tumor CT26.CL25-IFNARKO. Os camun- dongos que carregam tumor foram tratados com (A) VSV-GP, (B) SMACm (Mimético de SMAC), ou (C) VSV-GP em combinação com um SMACm (Mimético de SMAC). As linhas pretas escuras mostram o volume tumoral dos camundongos controle não tratados enquanto as linhas cinza claro mostram o volume tumoral de camundongos trata-
dos tanto com (A) VSV-GP, (B) SMACm ou (C) VSV-GP + SMACm.
[0048] FIG.8A-C: Análise do crescimento tumoral única dos ca- mundongos que carregam tumor CT26.CL25-IFNARKO. Os camun- dongos que carregam tumor foram tratados com (A) VSV-GP-CCL21, (B) SMACm (Mimético de SMAC), ou (C) VSV-GP-CCL21 em combi- nação com um SMACm (Mimético de SMAC). As linhas pretas escuras mostram o volume tumoral dos camundongos controle não tratados enquanto as linhas cinza claro mostram o volume tumoral de camun- dongos tratados tanto com (A) VSV-GP-CCL21, (B) SMACm ou (C) VSV-GP-CCL21 + SMACm.
[0049] FIG.9: Análise de sobrevivência dos experimentos apre- sentados na FIG.7A-C e FIG.8A-C.
[0050] FIG.10: Análise de expressão dos tumores LLC1- IFNARKO (RNA total) a partir de camundongos controle, camundon- gos tratados com VSV-GP ou VSV-GPmuCCL21 para CD3epsilon, CXCL10 e a sequência códon-otimizada de CCL21 de murino codifi- cada por VSV-GP-muCCL21.
[0051] FIG.11A-B: Avaliação de neurotoxicidade induzida pela injeção intracerebral de VSV-G DsRed (wt VSV neurotóxica),VSV-GP, VSV-GP-muCCL21 ou PBS. O painel (A) mostra a porcentagem de ganho/perda de peso em camundongos com o tempo depois das res- pectivas injeções. O painel (B) mostra a porcentagem de sobrevivência de camundongos com o tempo depois das respectivas injeções.
[0052] FIG.12A-B: (A) Análise da CCL21 humana nos sobrena- dantes de células HEK293 infectadas com VSV-GP-huCCL21 (CCL21 humana de comprimento total codificando VSV-GP). (B) análise funci- onal da migração de células T humanas usando uma configuração Transwell e CCL21 humana recombinante ou sobrenadantes a partir de células HEK293 infectadas com VSV-GP resp. VSV-GP-huCCL21.
[0053] FIG.13A-B: Análise funcional da migração de células T de camundongos (A, painel esquerdo) e ratos (B, painel direito) usando uma configuração Transwell e CCL21 de camundongo recombinante vs. CCL21 humana ou CCL21 de rato vs. CCL21 humana respectiva- mente, para testar quanto à reatividade cruzada das espécies.
[0054] FIG.14: análise do crescimento tumoral única de camun- dongos controle que carregam tumor CT26.CL25-IFNARKO ou ca- mundongos tratados com VSV-GP ou VSV-GP-huCCL21.
[0055] FIG.15: Desenho ilustrando processamento de CCL21 pela plasmina para gerar o fragmento n-terminal curto e difundível.
[0056] FIG.16: Análise funcional da migração de células T huma- nas usando uma configuração Transwell e CCL21 humana recombi- nante (rec. CCL21) ou sobrenadantes a partir de células HEK293 transfectadas com plasmídeo expressando as versões c- terminalmente truncadas de CCL21 indicadas.
[0057] FIG.17: Análise funcional da migração de (moDC) célula dendrítica derivada de monócito humano usando uma configuração Transwell e CCL21 humana recombinante ou sobrenadantes a partir de células HEK293 infectadas com VSV-GP resp. VSV-GP-huCCL21 ou VSV-GP-huCCL21(1-79).
[0058] FIG.18: Análise Western Blot (WB) de CCL21 em sobrena- dantes a partir de células HEK293 transfectadas com plasmídeos ex- pressando a versão de comprimento total resp. c-terminalmente trun- cada de CCL21 indicada ou sobrenadantes a partir de células HEK293 infectadas com VSV-GP resp. VSV-GP-huCCL21(1-79) ou VSV-GP- huCCL21.
[0059] FIG.19A-C: Tituladores virais de VSV-GP (GP), VSV-GP- huCCL21 (21) ou VSV-GP-huCCL21(1-79) (21k) em sobrenadantes das células indicadas foram medidos nos momentos indicados depois da infecção viral para determinar a competência da replicação viral. Os diferentes painéis mostram da esquerda para a direita (A) células Ve-
ro, (B) células BHK21, e (C) células HEK293. Em cada painel, os titu- ladores de VSV-GP (GP), VSV-GP-huCCL21 (21) ou VSV-GP- huCCL21(1-79) (21k) foram medidos em 0h, 24h e 48h.
[0060] FIG.20: Crescimemto tumoral cumulativo em camundon- gos controle que carregam tumor CT26.CL25-IFNARKO ou camun- dongos tratados com VSV-GP-huCCL21 ou VSV-GP-huCCL21(1-79).
[0061] FIG.21: Sobrevivência de 30 dias dos camundongos a partir da FIG.20.
[0062] FIG.22: Quantificação baseada em IHC da infiltração de células T (segmento tumoral viável, não necrótico) em camundongos controle que carregam tumor CT26.CL25-IFNARKO ou camundongos tratados com VSV-GP-huCCL21 ou VSV-GP-huCCL21(1-79).
[0063] FIG.23: Desenho ilustrando o impacto de VSV-GP, VSV- GP-CCL21 (CCL21 de comprimento total) e VSV-GP-CCL21(1-79) (CCL21 c-terminalmente truncada) na infiltração imune dos tumores infectados por vírus.
[0064] FIG.24: Quantificação baseada em IHC da infiltração de células dendríticas (CD11c positivas) (áreas tumorais com replicação viral ativa = margem necrótica) em camundongos controle que carre- gam tumor CT26.CL25 ou camundongos tratados com VSV-GP ou VSV-GP-muCCL21. Descrição Detalhada da Invenção
[0065] Na descrição detalhada a seguir, numerosos detalhes es- pecíficos são apresentados para prover um entendimento completo da presente invenção. Ficará aparente, no entanto, a um versado na téc- nica que a presente tecnologia pode ser praticada sem alguns dos de- talhes específicos. Em outros casos, estruturas e técnicas bem conhe- cidas não foram mostradas em detalhes de modo a não atrapalhar a presente invenção. Os títulos são incluídos meramente por conveniên- cia para auxiliar na leitura e não devem ser entendidos como limitantes da invenção em aspectos ou modalidades específicas. Rhabdovírus
[0066] A família de rhabdovírus inclui 18 gêneros e 134 espécies com genomas de RNA filamento único, sentido negativo de aproxima- damente 10-16 kb (Walke et al., ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhab- doviridae, Journal of General Virology, 99:447–448 (2018)).
[0067] A caracterização dos traços de membros da família de rhabdovírus inclui um ou mais dos que seguem: Uma partícula na for- ma de bala ou partícula baciliforme com 100–430 nm de comprimento e 45–100 nm de diâmetro compreendida de um nucleocapsídeo heli- coidal circundado por uma camada matriz e um envelope lipídico, em que alguns rhabdovírus têm vírus filamentosos não envelopados. Um RNA de filamento único, de sentido negativo de 10.8-16.1 kb, que é na maioria não segmentado. Um genoma codificando pelo menos 5 ge- nes que codificam as proteínas estruturais nucleoproteína (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), e glicoproteína (G).
[0068] Conforme usado no presente documento, um rhabdovírus pode pertencer ao gênero de: almendravirus, curiovirus, citorhabdovi- rus, dichorhavirus, efemerovirus, Hapavirus, ledantevirus, lyssavirus, novirhabdovirus, nucleorhabdovirus, perhabdovirus, sigmavirus, sprivi- virus, sripuvirus, tibrovirus, tupavirus, varicosavirus ou vesiculovirus.
[0069] Dentro do gênero mencionado no presente documento, o rhabdovírus pode pertencer a qualquer uma das espécies listadas. O gênero de almendravirus inclui: vírus arboretum, vírus balsa, vírus Coot Bay, vírus Puerto Almendras, vírus Rio Chico; o gênero de curio- virus inclui: vírus curionopólis, vírus Iriri, vírus Itacaiunas, vírus Ro- chambeau; o gênero de citorhabdovirus inclui: vírus da alfalfa anã, vírus do mosaico amarelo estriado da cevada, vírus dos amarelos ne- cróticos do brocólis, vírus associado à doença Colocasia bobone, vírus da estria das folhas de Festuca, vírus necrótico dos amarelos da alfa-
ce, vírus da mancha amarela do alface, vírus de mosaico dos cereais do Norte, vírus sonchus 1, vírus do encrespamento do morangueiro, vírus do mosaico estriado do trigo americano; o gênero de dichorhavi- rus inclui: vírus da mancha anelar do café, vírus da mancha da orquí- dea; o gênero de ephemerovirus inclui: vírus do Adelaide River, vírus Berrimah, vírus da febre efêmera bovina, vírus Kimberley, vírus Kool- pinyah, vírus Kotonkan, vírus Obodhiang, vírus Yata; o gênero de ha- pavirus inclui: vírus da Flanders, vírus Gray Lodge, vírus Hart Park, vírus Joinjakaka, vírus Kamese, vírus La Joya, vírus Landjia, vírus Ma- nitoba, vírus de Marco, vírus Mosqueiro, vírus Mossuril, vírus Ngain- gan, vírus Ord River, vírus Parry Creek, vírus Wongabel; o gênero de ledantevirus inclui: vírus Barur, vírus Fikirini, vírus Fukuoka, vírus Kanyawara, vírus Kern Canyon, vírus Keuraliba, vírus Kolente, vírus Kumasi, vírus Le Dantec, vírus do morcego de Mount Elgon, vírus Nishimuro, vírus Nkolbisson, vírus Oita, vírus da mosca de piolho de Wuhan, vírus de Yongjia; o gênero de lyssavirus inclui: vírus Aravan, vírus do morcego Australiano, vírus do morcego Bokeloh, vírus de Du- venhage, vírus do morcego Europeu 1, vírus do morcego Europeu 2, vírus do morcego Gannoruwa, vírus Ikoma, vírus Irkut, vírus Khujand, vírus do morcego de Lagos, vírus do morcego de Lleida, vírus Mokola, vírus da raiva, vírus do morcego de Shimoni, vírus do morcego do Cáucaso Ocidental; o gênero de novirhabdovirus inclui: Hirame rhab- dovírus, vírus da septicemia hemorrágica viral, vírus da necrose he- matopoietica infecciosa, rhabdovírus Snakehead; o gênero de nucle- orhabdovirus inclui: nucleorhabdovírus da veia amarela de Datura, ví- rus anão mosqueado da berinjela, vírus da estria fina do milho, vírus do mosaico iraniano do milho, vírus do mosaico do milho, vírus anão da batata amarela, vírus amarelo do arroz, vírus amarelo de Sonchus, nucleorhabdovírus de veia amarela do sowthistle, vírus da clorose ve- nosa do taro; o gênero de perhabdovirus inclui: perhabdovírus anguilí-
deo, rhabdovírus de poleiro, rhabdovírus da truta marinha; o gênero de sigmavirus inclui: Drosophila affinis sigmavirus, Drosophila ananassae sigmavirus, Drosophila immigrans sigmavirus, Drosophila melanogas- ter sigmavirus, Drosophila obscura sigmavirus, Drosophila tristis sig- mavirus, Muscina stabulans sigmavirus; o gênero de sprivivirus inclui: sprivivírus da carpa, Pike fry sprivivirus; o gênero de Sripuvirus inclui: vírus Almpiwar, vírus de Chaco, vírus Niakha, vírus Sena Madureira, vírus Sripur; o gênero de tibrovirus inclui: vírus Bas-Congo, vírus Bea- trice Hill, vírus das planícies costeiras, vírus Ekpoma 1, vírus Ekpoma 2, vírus Sweetwater Branch, vírus tibrogargan; o gênero de tupavirus inclui: vírus Durham, vírus Klamath, vírus Tupaia; o gênero de varico- savirus inclui: varicosavírus associado a grandes veias da alface; o gênero de vesiculovirus inclui: vesiculovírus alagoano, vesiculovírus de morcego americano, vesiculovírus carajás, vesiculovírus chandipura, vesiculovírus cocal, vesiculovírus da estomatite vesicular Indiana, ve- siculovírus Isfahan, vesiculovírus Jurona, vesiculovírus Malpais Spring, vesiculovírus Maraba, vesiculovírus Morreton, vesiculovírus de Nova Jersey, vesiculovírus Perinet, vesiculovírus Piry, vesiculovírus Radi, vesiculovírus Yug Bogdanovac ou vírus Moussa.
[0070] Preferivelmente, o rhabdovírus recombinante da invenção é um rhabdovírus oncolítico. Neste sentido, oncolítico tem seu significa- do regular conhecido na técnica e se refere à capacidade de um rhab- dovírus para infectar e lisar (romper) as células cancerosas mas não as células normais (em qualquer grau significativo). Preferivelmente, o rhabdovírus oncolítico é capaz de replicação dentro das células cance- rosas. A atividade oncolítica pode ser testada em diferentes sistemas de ensaio conhecidos pelo técnico versado (um exemplar no ensaio in vitro é descrito em Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014). Deve ser compreendido que um rhabdovírus oncolítico pode infectar e lisar apenas tipos específicos de células cancerosas. Além disso, o efeito oncolítico pode variar dependendo do tipo de células cancero- sas.
[0071] Em uma modalidade preferida, o rhabdovírus pertence ao gênero de vesiculovirus. A espécie de vesiculovirus foi definida prima- riamente por meios sorológicos acoplados com a análise filogenética dos genomas. As características biológicas tais como gama de hospe- deiros e mecanismos de transmissão também são usados para distin- guir espécies virais dentro do gênero. Como tal, o gênero de vesiculo- virus forma um grupo monofilético distinto bem suportado por árvores de probabilidade máxima inferidas a partir de sequências L completas.
[0072] Os vírus que pertencem a diferentes espécies dentro do gênero vesiculovirus podem ter uma ou mais das seguintes caracterís- ticas: A) uma divergência da sequência de aminoácido mínima de 20% em L; B) uma divergência da sequência de aminoácido mínima de 10% em N; C) uma divergência da sequência de aminoácido mínima de 15% em G; D) podem ser distinguidos em testes sorológicos; e E) ocupam diferentes nichos ecológicos conforme evidenciado pelas dife- renças em hospedeiros e ou vetores artrópodes.
[0073] Prefere-se o vírus da estomatite vesicular (VSV) e em parti- cular o VSV-GP (recombinante com GP de LCMV). As propriedades vantajosas do VSV-GP incluem um ou mais dos que seguem: vírus oncolítico muito potente e rápido exterminador (<8h); aplicação sistê- mica possível; neurotropismo/neurotoxicidade reduzidos; ele se repro- duz liticamente e induz a morte celular imunogênica; não se replica em células humanas saudáveis, devido à resposta do interferon (IFN); for- te ativação da imunidade inata; cerca de 3kb de espaço para cargas e antígenos imunomoduladores; recombinante com uma glicoproteína de arenavírus a partir do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV); ca- racterísticas favoráveis de segurança em termos de neurotoxicidade reduzida e menos sensível a respostas do anticorpo neutralizante e destruição complementar conforme comparado com o VSV de tipo sel- vagem (VSV-G); especificamente se replica em células tumorais, as quais perderam a capacidade de montar e responder às respostas imunes inatas antivirais (por exemplo, sinalização IFN do tipo1); repli- cação abortiva em "células saudáveis" de modo a serem rapidamente excluídas dos tecidos normais; replicação viral em células tumorais leva à indução da morte celular imunogênica, liberação dos antígenos associados ao tumor, inflamação local e a indução da imunidade anti- tumoral.
[0074] A invenção ainda inclui um vírus de estomatite vesicular recombinante, codificando em seu genoma pelo menos uma nucleo- proteína do vírus da estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fos- foproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivel- mente CCL21 humana.
[0075] Em uma modalidade preferida, o vírus da estomatite vesicu- lar recombinante codifica em seu genoma pelo menos uma nucleopro- teína do vírus da estomatite vesicular (N) compreendendo uma se- quência de aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7, a fosfoproteína (P) compreendendo uma sequência de aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:8, a proteína grande (L) compreendendo uma sequência de aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:9, e a proteína matriz (M) compreen- dendo uma sequência de aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
[0076] É entendido pelo versado na técnica que as modificações na nucleoproteína do vírus da estomatite vesicular (N), proteína gran- de (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), ou sequência de glico- proteína (G) podem ser feitas sem perder as funções básicas daquelas proteínas. As referidas variantes funcionais conforme usadas no pre- sente documento retêm toda ou parte de sua função ou atividade bási- ca. A proteína L por exemplo é a polimerase e tem uma função essen- cial durante a transcrição e replicação do vírus. Uma variante funcional da mesma deve reter pelo menos parte desta capacidade. Uma boa indicação para retenção da funcionalidade ou atividade básica é a pro- dução bem-sucedida de vírus, incluindo essas variantes funcionais, que ainda são capazes de se replicar e infectar células tumorais. A produção de vírus e a verificação quanto à infecção e replicação em células tumorais pode ser testada em diferentes sistemas de ensaio conhecidos do versado na técnica (um ensaio in vitro exemplificador é descrito em Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014).
[0077] Em uma modalidade preferida, o vírus da estomatite vesicu- lar recombinante codifica no seu genoma pelo menos uma nucleopro- teína de vírus da estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfo- proteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, em que a proteína grande (L) compreende uma se- quência de aminoácido tendo uma identidade sequencial ≥ 80% da SEQ ID NO:9.
[0078] Em uma modalidade preferida, o vírus da estomatite vesicu- lar recombinante codifica no seu genoma pelo menos uma nucleopro- teína de vírus da estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfo- proteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, em que a nucleoproteína (N) compreende uma se-
quência de aminoácido tendo uma identidade sequencial≥ 90% da SEQ ID NO:7.
[0079] Em uma modalidade preferida adicional, o vírus da estoma- tite vesicular recombinante codifica no seu genoma pelo menos uma nucleoproteína de vírus da estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo me- nos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, prefe- rivelmente CCL21 humana, em que a proteína grande (L) compreende uma sequência de aminoácido tendo uma identidade sequencial igual ou maior do que 80% da SEQ ID NO:9 e a nucleoproteína (N) compre- ende uma sequência de aminoácido tendo uma identidade sequencial≥ 90% da SEQ ID NO:7.
[0080] Em uma modalidade preferida da invenção, o genoma do RNA do rhabdovírus recombinante da invenção compreende ou con- siste em uma sequência conforme mostrada na SEQ ID NO: 24. Além disso, o genoma do RNA do rhabdovírus recombinante da invenção também pode consistir de ou compreender aquelas sequências, em que ácidos nucleicos do genoma do RNA são trocados de acordo com a geração do código genético, sem levar a uma alteração da respecti- va sequência de aminoácido. Em uma modalidade preferida adicional, o genoma do RNA do rhabdovírus recombinante da invenção compre- ende ou consiste em uma sequência codificadora idêntica ou pelo me- nos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 24.
[0081] Deve ser entendido que um rhabdovírus recombinante da invenção pode codificar em seu genoma cargas adicionais, tais como antígenos tumorais, mais quimiocinas, citocinas ou outros elementos imunomoduladores.
[0082] Em uma modalidade adicional, o rhabdovírus recombinante da invenção adicionalmente codifica no seu genoma uma proteína simporte de iodeto de sódio (NIS). A expressão de NIS e a coincuba- 125 ção com por exemplo I permite o uso de NIS como repórter de ima- gem (Carlson et al., Current Gene Therapy, 12, 33-47, 2012). Rhabdovírus Recombinante
[0083] Sabe-se que certas cepas de rhabdovírus do tipo selvagem tais como cepas de VSV do tipo selvagem são consideradas neurotó- xicas. Também se reportou que indivíduos infectados são capazes de rapidamente montar uma forte resposta humoral com títulos de alta afinidade principalmente contra a glicoproteína. Neutralizar anticorpos que direcionam a glicoproteína G dos rhabdovírus em geral e VSV es- pecificamente é capas de limitar a circulação do vírus e assim mediar a proteção de indivíduos da reinfecção viral. A neutralização do vírus, no entanto, limita a aplicação repetida do rhabdovírus ao paciente com câncer.
[0084] Para eliminar essas desvantagens, a glicoproteína G do rhabdovírus do tipo selvagem pode ser substituída com uma glicopro- teína de um outro vírus. Neste sentido substituir a glicoproteína se re- fere à (i) substituição da codificação genética pela glicoproteína G do tipo selvagem com a codificação genética para a glicoproteína GP de um outro vírus, e/ou (ii) substituição da glicoproteína G do tipo selva- gem com a glicoproteína GP de um outro vírus.
[0085] Em uma modalidade preferida, a glicoproteína G do rhab- dovírus é substituída com a glicoproteína GP do vírus da coriomeningi- te linfocitária (LCMV), preferivelmente com a cepa WE-HPI. Em uma modalidade ainda mais preferida, o rhabdovírus é um rhabdovírus da estomatite vesicular com a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV), preferivelmente com a cepa WE-HPI. O referido VSV é por exemplo descrito na publicação internacional WO2010/040526 e denominado VSV-GP. As vantagens oferecidas são (i) a perda da neurotoxicidade mediada por VSV-G e (ii) uma ca- rência da neutralização do vetor por anticorpos (conforme mostrado em camundongos).
[0086] A glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV) pode ser GP1 ou GP2. A invenção inclui glicoproteínas de di- ferentes cepas de LCMV. Em particular, LCMV-GP pode ser derivado de cepas de LCMV do tipo selvagem ou cepas de LCMV como LCMV- WE, LCMV-WE-HPI, LCMV-WE-HPlopt. Em uma modalidade preferi- da, a codificação genética para a glicoproteína GP do LCMV codifica uma proteína com uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:11 ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 98%, 99% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11 enquanto as propriedades funcio- nais do rhabdovírus recombinante compreendendo a glicoproteína GP que codifica uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:11 são mantidas.
[0087] Em uma outra modalidade, a glicoproteína G do rhabdoví- rus recombinante é substituída com a glicoproteína GP do vírus Dan- denong (DANDV) ou vírus Mopeia (MOPV). Em uma modalidade mais preferida, o rhabdovírus recombinante é um vírus da estomatite vesi- cular em que a glicoproteína G é substituída com a glicoproteína GP do vírus Dandenong (DANDV) ou vírus Mopeia (MOPV). As vantagens oferecidas são (i) a perda da neurotoxicidade mediada por VSV-G e (ii) uma carência da neutralização de vetor pelos anticorpos (conforme mostrado nos camundongos).
[0088] O vírus Dandenong (DANDV) é um arenavírus do velho mundo. Até hoje, existe apenas uma única cepa conhecida do versado na técnica, a qual compreende a glicoproteína GP e que pode ser em- pregada dentro da presente invenção como doadora da glicoproteína GP compreendida no rhabdovírus recombinante da invenção. A glico-
proteína GP de DANDV compreendida no rhabdovírus recombinante da invenção tem mais do que 6 sítios de glicosilação, em particular 7 sítios de glicosilação. Uma glicoproteína GP preferida exemplificadora é aquela como compreendida em DANDV conforme acessível sob o número Genbank EU136038. Em uma modalidade, a codificação ge- nética para a glicoproteína GP do DNADV codifica uma sequência de aminoácido conforme mostrada na SEQ ID NO:12 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 enquanto as proprieda- des funcionais do rhabdovírus recombinante compreendendo a glico- proteína GP que codifica uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:12 são mantidas.
[0089] O vírus Mopeia (MOPV) é um arenavírus do velho mundo. Existem várias cepas conhecidas do versado na técnica, as quais compreendem a glicoproteína GP e que podem ser empregadas den- tro da presente invenção como doador da glicoproteína GP compreen- dida no rhabdovírus recombinante da invenção. A glicoproteína GP de MOPV compreendida no rhabdovírus recombinante da invenção tem mais do que 6 sítios de glicosilação, em particular 7 sítios de glicosila- ção. Uma glicoproteína GP preferida exemplificadora é aquela confor- me compreendida no vírus Mopeia conforme acessível sob o número Genbank AY772170. Em uma modalidade, a codificação genética para glicoproteína GP do MOPV codifica uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:13 ou uma sequência tendo pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% de identidade sequencial com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 enquanto as proprie- dades funcionais do rhabdovírus recombinante compreendendo a gli- coproteína GP que codifica uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:13 são mantidas. CCL21 e variantes funcionais de CCL21
[0090] Verificou-se de forma surpreendente que um rhabdovírus recombinante codificando em seu genoma uma proteína CCL21 foi capaz de induzir uma lise da célula tumoral combinada com a morte celular imunogênica e a estimulação das células imunes inatas no mi- croambiente tumoral. Além disso, taxas prolongadas de sobrevivência foram observadas em um modelo de tumor estabelecido no camun- dongo tratado com o referido rhabdovírus recombinante armado com CCL21.
[0091] CCL21 pertence à família de quimiocina CC e também é conhecida como quimiocina de tecido linfoide secundário (SLC), exo- dus-2, ckb9, scya21, TCA4 ou 6Ckine. CCL21 contém uma região C- terminal que se liga à matriz extracelular. CCL21 também se liga ao receptor da superfície celular de CCR7 e com isso exerce a sua fun- ção tal como atração de células T e células dendríticas assim como a ativação das últimas. CCR7 é expressado em uma ampla gama de cé- lulas T periféricas e células dendríticas em ambos os pacientes saudá- veis e pacientes com câncer.
[0092] Sendo assim, em um aspecto, o rhabdovírus recombinante que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma é capaz de aumentar o recrutamento de células T e células dendríticas para o ambiente tumoral.
[0093] Em um outro aspecto, a expressão local da quimiocina CCL21 altamente potente adicionalmente aumenta o recrutamento de células imunes de preferencialmente linfócitos T e células dendríticas no microambiente tumoral e eficácia melhorada do rhabdovírus re- combinante.
[0094] Em ainda um outro aspecto, o rhabdovírus recombinante que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma age como um estimulador imune inato.
[0095] Em um aspecto, o rhabdovírus recombinante que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante fun- cional da mesma torna tumores frios em tumores quentes. Em particu- lar, o microambiente tumoral pró-inflamatório resultante torna tumores ("frios") infiltrados com células não T em tumores ("quentes) inflama- dos com células T e é acompanhado pela geração de uma resposta imune antitumoral adaptativa nos linfonodos de drenagem tumoral.
[0096] A proteína CCL21 humana foi descrita por exemplo em M. Nagira et al, The Journal of Biological Chemistry, 272, 19518-19524 (August 1, 1997) e é um polipeptídeo altamente básico de 134 amino- ácidos totais com um peptídeo de sinal putativo de 23 aminoácidos:
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSY
RKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPS PQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP (SEQ ID NO:1)
[0097] Uma proteína CCL21 em particular inclui CCL21 compre- endendo ou consistindo da sequência a seguir:
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRS
QAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKK GKGSKGCKRTERSQTPKGP (SEQ ID NO:2)
[0098] Preferivelmente, uma proteína CCL21 compreende ou con- siste em uma proteína tendo a sequência a seguir:
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRS QAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCR (SEQ ID NO:4) ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:4.
[0099] Mais preferivelmente, uma proteína CCL21 compreende ou consiste em uma proteína tendo a sequência a seguir:
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRS QAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG (SEQ ID NO:3)
ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:3.
[00100] O termo "peptídeo de sinal" ou "sequência de peptídeo de sinal" descreve uma sequência peptídica geralmente de 10 a 30 ami- noácidos de comprimento e presente na extremidade N-terminal dos polipeptídeos secretores recém-sintetizados ou de membrana que di- recionam o polipeptídeo para ou em uma membrana celular da célula (a membrana plasmática em procariotas e a membrana de retículo en- doplasmático em eucariotas). Ela é geralmente removida de forma subsequente. Em particular, o peptídeo de sinal pode ser capaz de di- recionar o polipeptídeo em uma via secretora celular.
[00101] Deve ser entendido que para a presente invenção, outras sequências de peptídeo de sinal (isto é, diferentes das sequências de tipo selvagem) podem ser usadas com conjunto com a proteína CCL21. As referidas outras sequências de peptídeo de sinal podem substituir a sequência de peptídeo de sinal original do tipo selvagem. Um peptídeo de sinal inclui peptídeos que direcionam proteína recém- sintetizada no ribossomo ao ER e adicionalmente ao complexo de Golgi para transporte à membrana plasmática ou fora da célula. Elas geralmente incluem um filamento de aminoácidos hidrofóbicos e inclu- em sequências líder de imunoglobulina assim como outras conhecidas daqueles versados na técnica. Os peptídeos de sinal incluem em parti- cular peptídeos capazes de serem colocados em prática pela peptida- se de sinal, uma protease específica localizada na face cisterna do re- tículo endoplasmático. Os peptídeos de sinal são bem entendidos por aqueles versados na técnica e podem incluir qualquer peptídeo de si- nal conhecido. O peptídeo de sinal é incorporado ao N-terminal da pro- teína e o processamento da proteína CCL21 pela peptidase de sinal produz a forma biológica ativa.
[00102] Em uma modalidade preferida, o peptídeo de sinal tem uma sequência conforme mostrada na SEQ ID NO:6. Em uma modalidade preferida relacionada, a proteína CCL21 compreende ou consiste em uma proteína tendo a sequência a seguir:
MGWSCIILFLVATATGVHSSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQ
EPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQK PAQG (SEQ ID NO:5) ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:5.
[00103] Em uma modalidade relacionada, uma proteína CCL21 in- clui uma proteína que compreende ou consiste dos aminoácidos da SEQ ID Nos: 2, 3 ou 4 ou respectivamente tendo pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID Nos:2, 3 ou 4 e compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal. Em uma modalidade preferida, a sequência de peptídeo de sinal compreende ou consiste dos aminoácidos 1-19 da SEQ ID NO:5.
[00104] Uma proteína CCL21 também inclui uma proteína que compreende ou consiste dos aminoácidos das SEQ ID Nos: 2, 3 ou 4 ou respectivamente tendo pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID Nos: 2, 3 ou 4 e compre- endendo ainda uma sequência peptídica de sinal compreendendo ou consistindo dos aminoácidos 1-23 da SEQ ID NO:1.
[00105] Uma proteína CCL21 ainda inclui uma proteína que corres- ponde às formas processadas de plasmina de CCL21. CCL21 contém um C-terminal único estendido (por exemplo, CCL21 humana com cer- ca de 30aa) com uma carga pura positiva que contribui para a ligação dos componentes de matriz extracelular tais como glicosaminoglicanos do tipo heparina. A truncação/deleção do C-terminal reduz dramatica-
mente a ligação aos glicosaminoglicanos do tipo heparina. CCL21 é processada dentro do corpo humano pela plasmina que é defeituosa em alguns cânceres humanos. Foi mostrado que a necessidade da clivagem da plasmina pode ser superada pela codificação do fragmen- to N-terminal bioativo, isto é biologicamente ativo de CCL21, o qual lembra as formas processadas de plasmina de CCL21 em um rhabdo- vírus recombinante. As formas processadas de plasmina de CCL21 são caracterizadas por uma truncação/deleção do C-terminal resultan- do em uma capacidade reduzida de se ligar à heparina e/ou sulfato de heparano que pode ser medido por métodos conhecidos do versado na técnica. Neste contexto, uma capacidade reduzida de se ligar à he- parina e/ou sulfato de heparano se refere a uma comparação com uma proteína CCL21 tendo a SEQ ID NO:1 ou 2 e uma capacidade de liga- ção que é reduzida para até 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou menos da capa- cidade de ligação da proteína CCL21 com a sequência conforme mos- trada na SEQ ID NO:1 ou 2 (respectivamente com ou sem a sequência de peptídeo de sinal) caso testado no mesmo ensaio e sob as mesmas condições.
[00106] Plasmina é uma protease serina que age para dissolver co- águlos sanguíneos de fibrina. Além da fibrinólise, as proteínas das pro- teólises da plasmina em vários outros sistemas: ela ativa colagenases, alguns mediadores do sistema complementar, e enfraquece a parede do folículo graafiano, levando à ovulação. Ele cliva fibrina, fibronectina, trombospondina, laminina e fator von Willebrand. A plasmina pertence à família das proteases serinas. A plasmina é liberada como uma pro- enzima chamada plasminogênio a partir do fígado na circulação sistê- mica. A conversão de plasminogênio em plasmina ativa envolve a cli- vagem da ligação peptídica entre Arg-561 e Val-562 através de, por exemplo, ativador de plasminogênio no tecido (tPA), ativador de plas-
minogênio de uroquinase (uPA), calicreína e fator XII (fator Hageman).
[00107] A clivagem da proteína CCL21 pela plasmina pode tanto ocorrer em CCL21 ligada à superfície celular ou in vitro em ambos os casos através da incubação da proteína CCL21 com plasmina. A pro- teína CCL21 processada por plasmina inclui assim CCL21 compreen- dendo ou consistindo em uma sequência que corresponde aos amino- ácidos 1-88 da SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a aminoácidos 1-88 da SEQ ID NO:2. Além disso, uma proteína CCL21 inclui CCL21 compre- endendo ou consistindo em uma sequência que corresponde aos ami- noácidos 1-91 da SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a aminoácidos 1-91 da SEQ ID NO:2. Uma proteína CCL21 também inclui CCL21 compre- endendo ou consistindo em uma sequência que corresponde aos ami- noácidos 1-104 da SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a aminoácidos 1- 104 da SEQ ID NO:2.
[00108] A proteína CCL21 c-terminalmente truncada é caracteriza- da pela deleção e/ou mutação de aminoácido(s) no c-terminal estendi- do de uma proteína CCL21. Ao deletar e/ou mutar aminoácidos no c- terminal estendido, a ligação aos glicosaminoglicanos do tipo heparina é assim reduzida. Em uma modalidade preferida, a proteína CCL21 c- terminalmente truncada compreende ou consiste da SEQ ID NO:2 ou tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com os aminoácidos 1- 79 da SEQ ID NO:2 com a condição de que a proteína careça de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 resíduo(s) de aminoáci- do nas posições 80-111, ou em que um ou mais dos referidos resíduos é mutado. Em uma modalidade preferida adicional, CCL21 c- terminalmente truncada CCL21 é uma CCL21 compreendendo ou consistindo da SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a aminoácidos 1-79 da SEQ ID NO:2, em que todos os aminoácidos de 80-111 da SEQ ID NO:2 são deletados (isto é, 32 de- leções).
[00109] Em cada caso, tanto a CCL21 processada por plasmina ou a CCL21 c-terminalmente truncada podem ainda compreender uma sequência de peptídeo de sinal. São particularmente preferidas as se- quências de peptídeo de sinal compreendendo ou consistindo dos aminoácidos 1-23 da SEQ ID NO:1 ou os aminoácidos 1-19 da SEQ ID NO:5. Além disso, outras sequências de peptídeo de sinal podem ser usadas as quais substituem a sequência de peptídeo de sinal original. Sendo assim, em uma modalidade preferida, a proteína CCL21 pro- cessada por plasmina ou proteína CCL21 c-terminalmente truncada compreende ou consiste em uma proteína tendo a sequência a seguir:
MGWSCIILFLVATATGVHSSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQ
EPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQK PAQG (SEQ ID NO:5) ou que tem pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:5.
[00110] Uma proteína CCL21 também pode incluir CCL21 com uma sequência de peptídeo de sinal truncada. Neste contexto, truncada se refere a uma sequência de peptídeo de sinal que é mais curta do que a sequência de peptídeo de sinal original mas ainda retém pelo menos uma porção de sua funcionalidade para agir como um peptídeo de si- nal. Por exemplo, a sequência de peptídeo de sinal humana compre- ende ou consiste em aminoácidos 1-23 da SEQ ID NO:1. Uma CCL21 com uma sequência de peptídeo de sinal truncada poderia ter 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 dos aminoácidos 1-23 da SEQ ID NO:1. Em um exemplo adicional, o pep- tídeo de sinal poderia compreender ou consistir da sequência confor- me mostrada na SEQ ID NO:6. Uma CCL21 com uma sequência de peptídeo de sinal truncada poderia ter 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 dos aminoácidos 1-18 da SEQ ID NO:6.
[00111] Uma proteína CCL21 com uma sequência de peptídeo de sinal truncada também poderia ser uma proteína que compreende qualquer uma das sequências das SEQ ID Nos: 2-4 e além disso uma sequência de peptídeo de sinal que é mais curta do que a sequência de peptídeo de sinal original. Novamente, a título de exemplo, a se- quência de peptídeo de sinal poderia ter 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 dos aminoácidos 1-23 da SEQ ID NO:1 ou em um exemplo adicional, o peptídeo de sinal pode- ria compreender ou consistir da sequência conforme mostrado na SEQ ID NO:6. Uma CCL21 com uma sequência de peptídeo de sinal trun- cada poderia ter 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 dos aminoácidos 1-18 da SEQ ID NO:6.
[00112] A proteína CCL21 pode ser de qualquer origem incluindo de camundongos e ratos. Preferivelmente, a proteína CCL21 é de origem humana.
[00113] As variantes funcionais de uma proteína CCL21 incluem variantes biologicamente ativas e fragmentos biologicamente ativos das proteínas CCL21 descritas anteriormente. As variantes podem ter um ou mais aminoácidos diferentes em uma posição de uma proteína
CCL21 especificamente descrita. As variantes podem compartilhar pe- lo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade do aminoácido com uma referida proteína CCL21. Os frag- mentos têm os mesmos aminoácidos como uma dada proteína CCL21 especificamente descrita mas podem carecer de uma porção específi- ca ou área da proteína CCL21.
[00114] Conforme usado no presente documento, os termos "idênti- ca" ou "identidade percentual", no contexto de duas ou mais sequên- cias de ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparados e alinhados para máxima correspondência. Para determinar a identidade percen- tual, as sequências são alinhadas para finalidades de comparação ideais (por exemplo, gaps podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácido ou ácido nucleico para alinha- mento ideal com uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nu- cleico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácido ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênti- cas naquela posição. A identidade percentual entre as duas sequên- cias é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % identidade=# de posições idênticas/total # de posições (por exemplo, posições sobrepostas)x100). Em algumas modalidades, as duas sequências que são comparadas têm o mesmo comprimento depois que os gaps são introduzidos dentro das sequên- cias, conforme apropriado (por exemplo, excluindo a sequência adicio-
nal que se estende além das sequências sendo comparadas).
[00115] A determinação de identidade percentual ou similaridade percentual entre as duas sequências pode ser alcançada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante, preferido de um al- goritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Um referido algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Bi- ol. 215:403-410. As buscas por nucleotídeos BLAST podem ser reali- zadas com o programa NBLAST, escore=100, comprimento da palavra =12, para obter sequências nucleotídicas homólogas a um ácido nu- cleico que codifica uma proteína de interesse. As buscas por proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore=50, comprimento da palavra=3, para obter sequências de aminoácido ho- mólogas à proteína de interesse. Para obter alinhamentos com gaps para finalidades de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para reali- zar uma busca iterativa que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI- Blast, os parâmetros padronizados dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Um outro exemplo não limitante, preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers and Miller, CABI- OS (1989). Um referido algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento se- quencial GCG. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de gap de 12, e uma penalidade de gap de 4 podem ser usadas. Algoritmos adicionais para análise se- quencial são conhecidos na técnica e incluem ADVANCE e ADAM conforme descrito em Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; e FASTA descrito em Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup é uma opção de controle que configura a sensibilidade e velocidade da busca. Se ktup=2, regiões similares nas duas sequências sendo comparadas são encontradas ao buscar nos pares de resíduos alinhados; se ktup=1, os aminoácidos alinhados únicos são examinados. Ktup pode ser configu- rado em 2 ou 1 para sequências de proteína, ou de 1 a 6 para sequên- cias de DNA. O padrão caso ktup não esteja especificado é 2 para pro- teínas e 6 para DNA. Alternativamente, o alinhamento da sequência de proteína pode ser realizado usando o algoritmo CLUSTAL W, confor- me descrito em Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.
[00116] Em ambos os casos, as variantes funcionais apenas inclu- em variantes e fragmentos de CCL21 que são biologicamente ativos. Para a invenção, a atividade biológica da variante de CCL21 ou do fragmento de CL21 – a qual é codificada no genoma de um rhabdoví- rus recombinante– é determinada depois de sua expressão em uma respectiva célula ou célula tumoral. Isto significa que a atividade bioló- gica é determinada no contexto de um rhabdovírus recombinante que codifica a variante de CCL21 ou fragmento de CCL21 (por exemplo em um ensaio Transwell ou em um modelo tumoral in vitro). Preferivel- mente, a atividade biológica é determinada com uma codificação do vesiculovírus para a variante de CCL21 ou o fragmento de CCL21. Mais preferivelmente, a atividade biológica é determinada com uma codificação de VSV-GP para a variante de CCL21 ou o fragmento de CCL21.
[00117] A atividade biológica pode incluir uma ou mais das seguin- tes capacidades: atividade quimioatraente, atividade antitumoral, mo-
dulação da expressão de citoquinas tal como o aumento na expressão de polipeptídeos de interferon-gamma (IFN-gamma) ou diminuição na expressão dos polipeptídeos beta do fator de crescimento transforma- dor (TGF- beta) em uma população de células mamíferas singeneicas incluindo células T CD8 positivas, células T CD4 positivas, células que apresentam antígeno e células tumorais. A testagem para atividade biológica pode ser feita sem limitação, por exemplo, de acordo com o protocolo conforme mostrado nos exemplos. Para a finalidade da in- venção, a variante ou fragmento funcional da proteína CCL21 é biolo- gicamente ativa caso ela mostre pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% da atividade de uma proteína CCL21 com a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO:1 ou 2 (respecti- vamente com ou sem a sequência de peptídeo de sinal) caso testada no mesmo ensaio e sob as mesmas condições.
[00118] Sem se ater à teoria, os inventores verificaram que após o tratamento de células tumorais com VSV-GP várias quimiocinas e cito- cinas são reguladas em resposta. CCL21 é uma das quimiocinas que não é regulada em células tumorais após o tratamento de VSV-GP. Os presentes dados mostram que uma codificação VSV-GP em seu ge- noma para uma proteína CCL21 é particularmente eficaz no tratamen- to de câncer e é engrenado no sentido de melhorar ainda mais a infil- tração de células imunes em tumores infectados pelo vírus oncolítico e, assim, potencializar ainda mais a imunidade antitumoral.
[00119] Mais surpreendentemente, os rhabdovírus recombinantes que codificam uma proteína CCL21 compreendendo ou contendo as sequências de SEQ ID NO: 3 ou 4 e, em particular, SEQ ID NO: 5 fo- ram ainda mais potentes e mais eficazes no tratamento de tumor com- parados com a proteína CCL21 de comprimento total e são ativos sem a necessidade de processamento proteolítico.
[00120] Tais proteínas CCL21 são ainda preferidas em vez da pro-
teína CCL21 de comprimento total devido a seu tamanho menor. Transgenes maiores ou múltiplos podem impactar negativamente a viabilidade, estabilidade, capacidade oncolítica, capacidade de fabri- cação ou expressão do rhabdovírus assim como o próprio transgene. Utilizar transgenes menores também provê a possibilidade de adicio- nar transgenes adicionais ao rhabdovírus que podem ter limitações na sua capacidade de acomodar mais transgenes.
[00121] Os rhabdovírus têm RNA de fita simples de sentido negati- vo (ssRNA) como seu material genético (genoma). Vírus de ssRNA de sentido negativo necessitam da polimerase de RNA para formar um RNA de sentido positivo. O RNA de sentido positivo atua como um mRNA viral, que é traduzido em proteínas para a produção de novos materiais virais. Com os vírus recém-formados, mais moléculas de RNA de sentido negativo são produzidas.
[00122] Um típico genoma de rhabdovírus codifica pelo menos cin- co proteínas estruturais na ordem de 3′-N-P-M-G-L-5′. O genoma deve conter mais regiões intergênicas curtas ou genes adicionais entre as proteínas estruturais e assim devem variar em comprimento e organi- zação.
[00123] De acordo com a invenção, o gene CCL21 pode ser intro- duzido em qualquer local do genoma do rhabdovírus. Dependendo do sítio de inserção, a eficiência de transcrição do gene CCL21 pode ser influenciada. Em geral, a eficiência de transcrição do gene CCL21 di- minui a partir da inserção 3´ até a inserção principal 5´. O gene CCL21 pode ser inserido nos seguintes locais do genoma: 3′-CCL21-N-P-M- G-L-5′, 3′-N-CCL21-P-M-G-L-5′, 3′-N-P-CCL21-M-G-L-5′, 3′-N-P-M- CCL21-G-L-5′, 3′-N-P-M-G-CCL21-L-5′ ou 3′-N-P-M-G-L-CCL21-5′. Em uma modalidade preferida, o gene CCL21 é inserido entre a proteína G e a proteína L.
[00124] Depois da infecção das células tumorais, o gene CCL21 codificado no genoma do rhabdovírus recombinante é transcrito no RNA de sentido positivo e depois traduzido na proteína CCL21 pela célula tumoral. O termo "codificando" ou "codificação" se refere à pro- priedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um ácido nucleico servirem como modelos para a síntese de outros polí- meros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequên- cia definida de nucleotídeos (por exemplo, moléculas de RNA) ou ami- noácidos e as propriedades biológicas que resultam deles. Conse- quentemente, um gene codifica uma proteína caso a proteína deseja- da seja produzida em uma célula ou um outro sistema biológico atra- vés de transcrição e subsequente tradução do mRNA. Ambos o fila- mento codificador, a sequência nucleotídica que é idêntica à sequên- cia de mRNA e o filamento não codificador podem servir como o mo- delo para a transcrição de um gene e podem ser referidos como codifi- cando a proteína ou outro produto daquele gene. As sequências de ácidos nucleicos e nucleotídeos que codificam proteínas podem incluir íntrons.
[00125] A transcrição do gene CCL21 preferivelmente não está sob o controle do seu próprio promotor e apenas estritamente ligada à re- plicação viral assegurando assim a expressão direcionada de CCL21 ao local de replicação viral e propagação (tumor). Sendo assim, a transcrição do gene CCL21 não é controlada por elementos adicionais tais como promotores ou elementos de expressão genética induzíveis.
[00126] Será observado que uma sequência de ácido nucleico pode ser variada com ou sem a mudança da sequência primária do polipep- tídeo codificado. Um ácido nucleico que codifica uma proteína inclui alguns ácidos nucleicos que têm diferentes sequências nucleotídicas porém codificam a mesma sequência de aminoácidos da proteína de- vido à degeneração do código genético. É de conhecimento do versa- do na técnica escolher uma sequência de ácido nucleico que resultará na expressão de uma proteína CCL21 e em particular em quaisquer proteínas CCL21 específicas conforme divulgado no presente docu- mento. As moléculas de ácido nucleico que codificam sequências de aminoácido da proteína CCL21 são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, porém não se limitam ao isolamento de uma fonte natural ou preparação através da mutagênese (sítio-direcionada) ou mediada por oligonucleotídeos, mutagênese em PCR e mutagênese cassete de uma proteína CCL21 preparada anteriormente. Composições Farmacêuticas
[00127] A real quantidade farmaceuticamente eficaz ou dosagem terapêutica dependerá certamente de fatores conhecidos daqueles versados na técnica tais como idade e peso do paciente, forma de administração e gravidade da doença. De qualquer forma, o rhabdoví- rus recombinante será administrado em dosagens e de uma forma que permita que a quantidade farmaceuticamente eficaz seja liberada com base na condição específica do paciente.
[00128] Em geral, para o tratamento e/ou alívio das doenças, dis- túrbios e condições mencionados no presente documento e depen- dendo da doença, distúrbio ou condição específica a ser tratada, a po- tência do rhabdovírus recombinante específico da invenção a ser usa- do, a forma específica de administração e a formulação farmacêutica específica ou composição usada, o rhabdovírus recombinante da in- venção será em geral administrado, por exemplo, duas vezes na se- mana, semanalmente ou em doses mensais, porém pode variar signi- ficativamente, especialmente, dependendo dos parâmetros menciona- dos antes. Sendo assim, em alguns casos, pode ser suficiente usar menos do que a dose mínima dada acima, enquanto em outros casos o limite superior pode ter que ser excedido. Quando se administram grandes quantidades, pode ser necessário dividi-las em um número de doses menores durante o dia.
[00129] Para ser usado em terapia, o rhabdovírus recombinante da invenção é formulado em composições farmacêuticas apropriadas pa- ra facilitar a administração a animais ou humanos. As formulações típi- cas podem ser preparadas ao se misturar o vírus recombinante com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis, na forma de soluções aquosas ou suspensões aquosas ou não aquosas. Os veículos, excipientes, modificadores ou estabilizadores são não tóxicos em dosagens e concentrações empregadas. Eles incluem sis- temas tampão tais como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos inor- gânicos ou orgânicos e seus sais; antioxidantes incluindo ácido ascór- bico e metionina; conservantes tais como cloreto de octadecildimetil- benzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou benzil álcool; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol; proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imuno- globulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona ou polie- tileno glicol (PEG); aminoácidos tais como glicina, glutamina, aspara- gina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, oli- gossacarídeos ou polissacarídeos e outros carboidratos incluindo gli- cose, manose, sacarose, trehalose, dextrinas ou dextranos; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como, manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos me- tálicos (por exemplo, complexos da proteína Zn); e/ou tensoativos iôni- cos ou não iônicos tais como TWEEN™ (polissorbatos), PLURO- NICS™ ou ésteres de ácido graxo, éteres de ácido graxo ou ésteres de açúcar. Os excipientes também podem ter uma função modificado- ra de liberação ou função modificadora de absorção.
[00130] Em uma modalidade, o rhabdovírus recombinante da in- venção é formulado em uma composição farmacêutica compreenden-
do Tris, arginina e opcionalmente citrato. Tris é preferivelmente usado em uma concentração de cerca de 1 mM até cerca de 100 mM. Argini- na é preferivelmente usada em uma concentração de cerca de 1 mM até cerca de 100 mM. Citrato pode estar presente em uma concentra- ção de até 100 mM. Uma formulação preferida compreende cerca de 50 mM Tris e 50 mM arginina.
[00131] A composição farmacêutica pode ser provida como um lí- quido, um líquido congelado ou em um líquido liofilizado. O líquido congelado pode ser armazenado em temperaturas entre cerca de 0°C e cerca de -85°C incluindo temperaturas entre -70°C e -85°C e de cer- ca de -15°C, -16°C, -17°C, -18°C, -19°C, -20°C, -21°C, -22°C, -23°C, - 24°C ou cerca de -25°C.
[00132] O rhabdovírus recombinante ou composição farmacêutica da invenção não necessita ser, porém é opcionalmente formulada com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a do- ença em questão. A quantidade eficaz de outros referidos agentes de- pende da quantidade de anticorpo recombinante presente na formula- ção, do tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com as formas de administração conforme descrito no presente documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente documento, ou em qualquer dosagem e através de qualquer forma que seja empi- ricamente/clinicamente determinada como apropriada.
[00133] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada do rhabdovírus recombinante ou composição farmacêutica da invenção (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de rhabdovírus recombinante, da gravidade e curso da doença, se o rhabdovírus recombinante é administrado para finali- dades preventivas ou terapêuticas, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e a resposta ao rhabdovírus recombinante, e o critério do médico. O rhabdovírus recombinante ou composição farmacêutica da invenção adequadamente administrados ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos.
[00134] Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 108 a 1013 partículas infecciosas medidas por TCID50 do rhabdovírus recom- binante podem ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, em uma ou mais administrações sepa- radas, ou através da infusão contínua. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplificadora do rhabdovírus recombi- nante estaria na faixa de cerca de 108 a 1013 partículas infecciosas medidas por TCID50. Sendo assim, uma ou mais doses de cerca de 108, 109, 1010, 1011, 1012 ou 1013 partículas infecciosas medidas por TCID50 (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administra- das ao paciente. As referidas doses podem ser administradas de for- ma intermitente, por exemplo a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de forma que o paciente receba de cerca de duas até cerca de vinte, ou por exemplo cerca de seis doses do rhabdovírus recombinante). Uma dose de carga maior inicial, seguida por uma ou mais doses menores ou vice-versa podem ser administradas. No en- tanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas convencionais e ensaios.
[00135] A eficácia do rhabdovírus recombinante da invenção, e de composições compreendendo o mesmo, pode ser testada usando al- gum ensaio in vitro adequado, ensaio de base celular, ensaio in vivo e/ou modelo animal conhecido per se, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença específica envolvida. Os ensaios adequados e modelos animais ficarão claros ao versado na técnica, e por exemplo incluirão os ensaios e modelos animais usados nos exemplos abaixo.
[00136] A quantidade farmaceuticamente eficaz real ou dosagem terapêutica dependerá certamente de fatores conhecidos por aqueles versados na técnica tal como idade e peso do paciente, forma de ad- ministração e gravidade da doença. De qualquer modo, o rhabdovírus recombinante da invenção será administrado em dosagens e de uma forma que permita a quantidade farmaceuticamente eficaz a ser libe- rada com base na condição individual do paciente.
[00137] Alternativamente, o rhabdovírus recombinante ou composi- ção farmacêutica da invenção podem ser liberados em um volume de cerca de 50 µl até cerca de 100 ml incluindo todos os números dentro da faixa, dependendo do tamanho da área a ser tratada, do título viral usado, da forma de administração, e do efeito desejado do método.
[00138] Para a administração intratumoral, o volume está preferi- velmente entre cerca de 50 µl até cerca de 5 ml incluindo volumes de cerca de 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl, 1000µl, 1100 µl, 1200 µl, 1300 µl, 1400 µl, 1500 µl, 1600 µl, 1700 µl, 1800 µl, 1900 µl, 2000 µl, 2500 µl, 3000 µl, 3500 µl, 4000 µl, ou cerca de 4500 µl. Em uma modalidade preferida, o volume é de cerca de 1000 µl.
[00139] Para administração sistêmica, por exemplo, através da in- fusão do rhabdovírus recombinante, os volumes podem ficar natural- mente maiores. Alternativamente, uma solução concentrada do rhab- dovírus recombinante poderia ser diluída em um volume maior de so- lução de infusão diretamente antes da infusão.
[00140] Em particular para administração intravenosa, o volume es- tá preferivelmente entre 1 ml e 100 ml incluindo volumes de cerca de 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 11 ml, 12 ml, 13 ml, 14 ml, 15 ml, 16 ml, 17 ml, 18 ml, 19 ml, 20 ml, 25 ml, 30 ml, 35 ml, 40 ml, 45 ml, 50 ml, 55 ml, 60 ml, 70 ml, 75 ml, 80 ml, 85 ml, 90 ml, 95 ml, ou cerca de 100 ml. Em uma modalidade preferida, o volume está en- tre cerca de 5 ml e 15 ml, mais preferivelmente o volume é de cerca de 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 11 ml, 12 ml, 13 ml, ou cerca de 14 ml.
[00141] Preferivelmente, a mesma formulação é usada para admi- nistração intratumoral e administração intravenosa. As doses e/ou ra- zão de volume entre a administração intratumoral e intravenosa podem ser de cerca de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 ou cerca de 1:20. Por exemplo, uma dose e/ou razão de volume de 1:1 significa que a mes- ma dose e/ou volume é administrado de forma intratumoral assim co- mo de forma intravenosa, enquanto por exemplo uma dose e/ou razão de volume de cerca de 1:20 significa uma dose de administração intra- venosa e/ou volume que é vinte vezes maior do que a dose e/ou volu- me de administração intratumoral. Preferivelmente, as doses e/ou ra- zão de volume entre a administração intratumoral e intravenosa é de cerca de 1:9.
[00142] Uma concentração eficaz de um rhabdovírus recombinante desejavelmente varia entre cerca de 108 e 1014 genomas de vetor por mililitro (vg/mL). As unidades infecciosas podem ser medidas conforme descrito em McLaughlin et al., J Virol.;62(6):1963-73 (1988). Preferi- velmente, a concentração é de cerca de 1,5 x 109 até cerca de 1,5 x 1013, e mais preferivelmente de cerca de 1,5 x 109 até cerca de 1,5 x
1011. Em uma modalidade, a concentração eficaz é de cerca de 1,5 x
109. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é de cerca de 1,5 x 1010. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é de cer- ca de 1,5 x 1011. Em ainda uma outra modalidade, a concentração efi- caz é de cerca de 1,5 x 1012. Em uma outra modalidade, a concentra- ção eficaz é de cerca de 1,5 x 1013. Em uma outra modalidade, a con- centração eficaz é de cerca de 1,5 x 1014. Pode ser desejável usar a menor concentração eficaz de modo a reduzir o risco de efeitos inde- sejáveis. Ainda outras dosagens nestas faixas podem ser seleciona- das pelo médico, levando em consideração o estado físico do indiví- duo, preferivelmente humano, sendo tratado, a idade do indivíduo, o tipo específico de câncer e o grau ao qual o câncer, caso progressivo, se desenvolveu.
[00143] Uma concentração alvo eficaz de um rhabdovírus recombi- nante pode ser expressada com o TCID50. O TCID50 pode ser determi- nado, por exemplo, ao usar o método de Spearman-Kärber. Deseja- velmente as faixas incluem uma concentração alvo eficaz entre 1 x 108 14 / ml e 1 x 10 / ml de TCID50. Preferivelmente, a concentração alvo eficaz é de cerca de 1 x 109 até cerca de 1 x 1012 / ml, e mais preferi- velmente de cerca de 1 x 109 até cerca de 1 x 1011 / ml. Em uma mo- dalidade, a concentração alvo eficaz é de cerca de 1 x 1010 / ml. Em uma modalidade preferida, a concentração alvo é de 5 x 1010 /ml. Em uma outra modalidade, a concentração alvo eficaz é de cerca de 1,5 x 1011 / ml. Em uma modalidade, a concentração alvo eficaz é de cerca de 1 x 1012 / ml. Em uma outra modalidade, a concentração alvo eficaz é de cerca de 1,5 x 1013 / ml.
[00144] Uma dose alvo eficaz de um rhabdovírus recombinante também pode ser expressada com o TCID50. Desejavelmente as faixas incluem uma dose alvo entre 1 x 108 e 1 x 10 14 de TCID50. Preferivel- mente, a dose alvo é de cerca de 1 x 109 até cerca de 1 x 1013, e mais preferivelmente de cerca de 1 x 109 até cerca de 1 x 1012. Em uma modalidade, a concentração eficaz é de cerca de 1 x 1010. Em uma modalidade preferida, a concentração eficaz é de cerca de 1 x 1011. Em uma modalidade, a concentração eficaz é de cerca de 1 x 1012. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é de cerca de 1 x 1013.
[00145] Em um outro aspecto, um kit ou kit-de-partes contendo ma- teriais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúr-
bios descritos no presente documento é provido. O kit ou kit-de-partes compreende um recipiente e um rótulo ou bula dentro ou no recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, se- ringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente reserva uma composição que está pura ou combinada com uma outra composição eficaz para tratamento, prevenção e/ou diag- nóstico do distúrbio e pode ter uma porta de acesso estéril (por exem- plo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodér- mica). Pelo menos um agente ativo na composição é o rhabdovírus recombinante ou composição farmacêutica da invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar a condição de esco- lha.
[00146] Além do mais, o kit ou kit-de-partes pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida nele, em que a composição compreende o rhabdovírus recombinante ou composição farmacêutica da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma com- posição contida nele, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outra forma agente terapêutico, tal como um inibidor da via PD-1or SMAC mimético. O kit ou kit-de-partes nesta modalidade da invenção pode ainda compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição es- pecífica, em particular câncer. Alternativamente ou de forma adicional, o kit ou kit-de-partes pode ainda compreender um segundo (ou tercei- ro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitá- vel, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), tampão fosfato salino, solução de Ringer ou solução de dextrose. Ele pode ainda in- cluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comerci- al e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[00147] Em um aspecto adicional, um rhabdovírus recombinante da invenção é usado em combinação com um dispositivo útil para a ad- ministração do rhabdovírus recombinante, tal como uma seringa, cane- ta injetora, microbomba ou outro dispositivo. Preferivelmente, um rhabdovírus recombinante da invenção é compreendido em um kit de partes, por exemplo também incluindo uma bula com instruções para o uso do rhabdovírus recombinante. Usos médicos
[00148] Um aspecto adicional da invenção provê um rhabdovírus recombinante que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma para uso em medicina.
[00149] O rhabdovírus recombinante da invenção induz de forma eficiente a lise da célula tumoral combinada com a morte celular imu- nogênica e estimulação das células imunes inatas no microambiente tumoral. Consequentemente, o rhabdovírus recombinante da invenção é útil para o tratamento e/ou prevenção de câncer.
[00150] Em um aspecto adicional, o rhabdovírus recombinante da invenção pode ser usado em um método para tratamento e/ou preven- ção de câncer, compreendendo administrar uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um rhabdovírus recombinante a um indivíduo que sofre de câncer, melhorando assim um ou mais sintomas do câncer.
[00151] Em ainda um outro aspecto, a invenção ainda provê o uso de um rhabdovírus recombinante de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de câncer.
[00152] Em ainda um aspecto adicional, o rhabdovírus recombinan- te da invenção pode ser usado em um método para tratamento e/ou prevenção de câncer gastrointestinal, câncer de pulmão ou câncer de cabeça e pescoço, compreendendo administrar uma quantidade tera-
peuticamente eficaz de um rhabdovírus recombinante a um indivíduo que sofre de câncer gastrointestinal, câncer de pulmão ou câncer de cabeça e pescoço, melhorando assim um ou mais sintomas de câncer gastrointestinal, câncer de pulmão ou câncer de cabeça e pescoço.
[00153] Para a prevenção ou tratamento de uma doença, a dosa- gem apropriada de rhabdovírus recombinante dependerá de uma vari- edade de fatores tais como o tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, a gravidade e o curso da doença, se o rhabdovírus re- combinante é administrado para finalidades preventivas ou terapêuti- cas, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e a resposta ao rhabdovírus recombinante, e o critério do médico. O rhabdovírus re- combinante é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos.
[00154] Em um aspecto, o câncer é um câncer sólido. O câncer só- lido pode ser câncer cerebral, câncer colorretal, carcinoma de células escamosas orofaríngeas, câncer gástrico, adenocarcinoma da junção gastroesofágica, carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, ade- nocarcinoma pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma urotelial de bexiga, melanoma metastático, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), glioblastoma, câncer de pulmão de células não pequenas, tumor cerebral ou câncer de pulmão de células pequenas. O tratamen- to de câncer gastrointestinal, câncer de pulmão e câncer de cabeça e pescoço é o preferido.
[00155] O rhabdovírus recombinante é administrado por qualquer meio adequado, incluindo oral, parenteral, subcutâneo, intratumoral, intravenoso, intradérmico, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intrave- nosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o rhab- dovírus recombinante é adequadamente administrado por infusão em pulso. Em um aspecto, a dosagem é dada por injeções, mais preferi- velmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em par- te ou se a administração é breve ou crônica.
[00156] Dependendo do rhabdovírus recombinante específico da invenção e suas propriedades farmacocinéticas específicas e outras propriedades, ele pode ser administrado diariamente, a cada dois, três, quatro, cinco ou seis dias, semanalmente, mensalmente ou de modo similar. Um regime de administração inclui tratamento semanal a longo prazo. Entende-se por "longo prazo, pelo menos duas semanas e pre- ferivelmente meses ou anos de duração.
[00157] A programação de tratamento pode incluir vários regimes e tipicamente necessitará de múltiplas doses administradas ao paciente por um período de uma, duas, três ou quatro semanas opcionalmente seguidas por um ou mais ciclos adicionais de tratamento. Em um as- pecto, o rhabdovírus recombinante da invenção é administrado ao pa- ciente em até 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 doses dentro de um dado período de tempo. Preferivelmente, o primeiro ciclo de tratamento(s) é concluído dentro de três semanas. Durante o curso da terceira semana de trata- mento, o rhabdovírus recombinante pode ser administrado ao paciente conforme descrito nos seguintes esquemas: (i) uma vez no dia 0 (ii) no dia 0 e dia 3; (iii) no dia 0, dia 3 e dia 6; (iv) no dia 0, dia 3, dia 6 e dia 9; (v) no dia 0 e dia 5; (vi) no dia 0, dia 5 e dia 10; (vii) no dia 0, dia 5, dia 10 e dia 15. Esses regimes podem ser repetidos e um segundo ou terceiro ciclo de tratamento pode ser necessário dependendo do resul- tado do primeiro ciclo de tratamento. Calculado com base no primeiro ciclo de tratamentos, segundo ciclo de tratamento preferivelmente in- clui tratamentos adicionais no dia 21, dia 42 e dia 63. Em uma modali- dade preferida, o rhabdovírus recombinante da invenção é administra- do ao paciente de acordo com o seguinte esquema: no dia 0, dia 3, dia 21, dia 42 e dia 63.
[00158] O termo "supressão" é usado no presente documento no mesmo contexto como "melhora" e "alívio" para significar uma redução ou diminuição de uma ou mais características da doença. O rhabdoví- rus recombinante ou composição farmacêutica da invenção será for- mulado, dosado, e administrado de uma forma consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem um distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, a progra- mação de administração e outros fatores conhecidos aos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do rhabdovírus recombinante a ser administrada será administrada pelas referidas considerações, e é a mínima quantidade necessária para prevenir, melhorar ou tratar sin- tomas clínicos de câncer, em particular a quantidade mínima que é eficaz para tratar esses distúrbios.
[00159] Em um outro aspecto, o rhabdovírus recombinante da in- venção pode ser administrado múltiplas vezes e em várias doses. Em um aspecto, a primeira dose do rhabdovírus recombinante é adminis- trada de forma intratumoral e as doses subsequentes do rhabdovírus recombinante são administradas de forma intravenosa. Em um aspec- to adicional, a primeira dose e pelo menos uma ou mais doses seguin- tes do rhabdovírus recombinante é/são administradas de forma intra- tumoral e as doses subsequentes do rhabdovírus recombinante são administradas de forma intravenosa. As doses subsequentes podem ser administradas 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 di- as, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias ou 31 dias depois da administração intratumoral inicial.
[00160] Em um outro aspecto, a primeira dose do rhabdovírus re-
combinante é administrada de forma intravenosa e as doses subse- quentes do rhabdovírus recombinante são administradas de forma in- tratumoral. As doses subsequentes podem ser administradas 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias ou 31 dias depois da administração in- travenosa inicial.
[00161] Em um outro aspecto, o rhabdovírus recombinante é admi- nistrado de forma intravenosa e as doses subsequentes do rhabdoví- rus recombinante são administradas de forma intratumoral.
[00162] Em um outro aspecto, o rhabdovírus recombinante é admi- nistrado em cada momento de forma intravenosa e intratumoral.
[00163] Conforme declarado acima, o rhabdovírus recombinante da invenção tem muita utilidade para estimular uma resposta imune con- tra células cancerosas. O forte potencial de ativação imunológica foi observado como restrito ao microambiente tumoral. Sendo assim, em um aspecto preferido, o rhabdovírus recombinante da invenção pode ser administrado de forma sistêmica a um paciente. A aplicabilidade sistêmica é um atributo crucial, à medida que muito cânceres são al- tamente metastáticos e permitirão o tratamento da dificuldade de acesso assim como lesões tumorais não acessíveis. Devido a essas propriedades de estimulação imunológica únicas, o rhabdovírus re- combinante de acordo com a invenção é especialmente útil para o tra- tamento de tumores metastáticos.
[00164] Alguns pacientes desenvolvem resistência à terapia com inibidor de checkpoint e foi observado que os referidos pacientes pare- cem acumular mutações na via IFN. Deste modo, em um aspecto, o rhabdovírus recombinante da invenção e em particular o vírus da es- tomatite vesicular recombinante da invenção é útil para o tratamento de pacientes que desenvolveram uma resistência à terapia com o ini- bidor de checkpoint. Devido às propriedades de promoção imunológi- cas únicas do rhabdovírus recombinante e em particular do vírus da estomatite vesicular recombinante da invenção, os referidos pacientes tratados podem se tornar elegíveis para continuação da terapia com o inibidor de checkpoint.
[00165] Em uma modalidade preferida, o rhabdovírus recombinante da invenção e em particular o vírus da estomatite vesicular recombi- nante da invenção é útil para o tratamento de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas que completaram a terapia com o inibidor de checkpoint com um inibidor de PD-1 ou PD-L1, por exemplo anticorpos antagonistas ao PD-1 ou PD-L1.
[00166] Entende-se que qualquer uma das formulações farmacêuti- cas ou métodos terapêuticos pode ser realizada usando qualquer um dos rhabdovírus recombinantes da invenção ou composições farma- cêuticas. Combinações
[00167] A presente invenção também provê tratamentos/métodos de combinação provendo certas vantagens comparado com os trata- mentos/métodos usados atualmente e/ou conhecidos na técnica ante- rior. Essas vantagens podem incluir eficácia in vivo (por exemplo, res- posta clínica melhorada, extensão da resposta, aumento da taxa de resposta, duração da resposta, taxa de estabilização da doença, dura- ção da estabilização, tempo para a progressão da doença, sobrevi- vência livre de progressão (PFS) e/ou sobrevivência total (OS), ocor- rência posterior de resistência e similar), administração segura e bem tolerada e frequência reduzida e gravidade dos eventos adversos.
[00168] O rhabdovírus recombinante da invenção pode ser usado com outros ingredientes farmacologicamente ativos, tais como com- postos estado-da-técnica ou padrão-de-cuidado, como por exemplo substâncias citostáticas ou citotóxicas, inibidores da proliferação celu- lar, substâncias antiangiogênicas, esteroides, imunomoduladores/ ini- bidores do checkpoint, e similar.
[00169] As substâncias ativas citostáticas e/ou citotóxicas que po- dem ser administradas em combinação com o rhabdovírus recombi- nante da invenção incluem, sem restrição, hormônios, análogos hor- monais e anti-hormônios, inibidores de aromatase, agonistas e anta- gonistas de LHRH, inibidores de fatores de crescimento (fatores de crescimento tais como por exemplo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epidér- mico (EGF), fatores de crescimento do tipo insulina (IGF), fator de crescimento epidérmico humano (HER, por exemplo HER2, HER3, HER4) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF)), inibidores são por exemplo anticorpos do (anti-) fator de crescimento, anticorpos do receptor do (anti-)fator de crescimento e inibidores da tirosina quinase, tais como por exemplo cetuximabe, gefitinibe, afatinibe, nintedanibe, imatinibe, lapatinibe, bosutinibe e trastuzumabe; antimetabólitos (por exemplo, antifolatos tais como metotrexato, raltitrexed, análogos de pirimidina como 5-fluorouracila (5-FU), gemcitabina, irinotecan, doxo- rubicina, TAS-102, capecitabina e análogos de gemcitabina, purina e adenosina tais como mercaptopurina, tioguanina, cladribina e pentos- tatina, citarabina (ara C), fludarabina); antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas); derivados de platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina); agentes de alquilação (por exemplo, estra- mustina, mecloretamina, melfalan, clorambucil, busulfan, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, temozolomida, nitrosoureias tais como por exemplo carmustina e lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo, Vinca alcaloides tais como por exemplo vinblastina, vindesi- na, vinorelbina e vincristina; e taxanos tais como paclitaxel, docetaxel);
inibidores da angiogênese, incluindo bevacizumabe, ramucirumabe e aflibercept, inibidores de tubulina; inibidores da síntese de DNA, inibi- dores de PARP, inibidores de topoisomerase (por exemplo, epipodofi- lotoxinas tais como por exemplo etoposida e etopofos, teniposida, amsacrina, topotecano, irinotecano, mitoxantrona), inibidores da seri- na/treonina quinase (por exemplo, inibidores de PDK1, inibidores de Raf, inibidores de A-Raf, inibidores de B-Raf, inibidores de C-Raf, ini- bidores de mTOR, inibidores de mTORC1/2, inibidores de PI3K, inibi- dores de PI3Kα, inibidores de mTOR/PI3K duplos, inibidores de STK33, inibidores de AKT, inibidores de PLK1 (tal como volasertibe), inibidores de CDKs, incluindo inibidores de CDK9, inibidores de Aurora quinase), inibidores de tirosina quinase (por exemplo, inibidores de PTK2/FAK), inibidores da interação proteína-proteína, inibidores de MEK, inibidores de ERK, inibidores de FLT3, inibidores de BRD4, ini- bidores de IGF-1R, inibidores de Bcl-xL, inibidores de Bcl-2, inibidores de Bcl-2/Bcl-xL, inibidores do receptor de ErbB, inibidores de BCR-ABL, inibidores de ABL, inibidores de Src, análogos de rapamici- na (por exemplo, everolimus, temsirolimus, ridaforolimus, sirolimus), inibidores da síntese androgênica, inibidores do receptor androgênico, inibidores de DNMT, inibidores de HDAC, inibidores de ANG1/2, inibi- dores de CYP17, radiofármacos, agentes imunoterápicos tais como inibidores do checkpoint imunológico (por exemplo CTLA4, PD1, PD- L1, LAG3, e moléculas de ligação TIM3 / imunoglobulinas, tais como ipilimumabe, nivolumabe, pembrolizumabe) e vários agentes quimiote- rápicos tais como amifostina, anagrelida, clodronato, filgrastina, interfe- ron, interferon alfa, leucovorina, rituximabe, procarbazina, levamisol, mesna, mitotano, pamidronato e porfimer; inibidores de proteassoma (tal como Bortezomibe); Smac e BH3 miméticos; agentes que restau- ram a funcionalidade de p53 incluindo antagonista de mdm2-p53; ini- bidores da via de sinalização da Wnt/beta-catenina; e/ou inibidores da quinase 9 dependente de ciclina.
[00170] O rhabdovírus recombinante da invenção pode ser usado no tratamento de combinação tanto com um inibidor da via PD-1 ou um antagonista de SMACm/IAP. Um referido tratamento combinado pode ser dado como uma combinação não fixada (por exemplo, livre) das substâncias ou na forma de uma combinação fixada, incluindo kit- de-partes.
[00171] Neste contexto, "combinação" ou "combinado" dentro do significado desta invenção inclui, sem limitação, um produto que resul- ta da mistura ou combinação de mais de um agente ativo e inclui am- bas as combinações fixadas e não fixadas (por exemplo, livres) (inclu- indo kits) e usos, tais como por exemplo o uso simultâneo, concomi- tante, sequencial, sucessivo, alternado ou separado dos componentes ou agentes. O termo "combinação fixada" significa que os agentes ati- vos são ambos administrados a um paciente simultaneamente na for- ma de uma única entidade ou dosagem. O termo "combinação não fi- xada" significa que os agentes ativos são ambos administrados a um paciente como entidades separadas seja de forma simultânea, conco- mitante ou sequencial sem nenhum limite de tempo específico, em que a referida administração provê níveis terapeuticamente eficazes dos dois compostos no corpo do paciente. O último também se aplica à terapia com coquetel, por exemplo a administração de três ou mais agentes ativos.
[00172] A invenção provê um rhabdovírus recombinante em combi- nação com um inibidor da via PD-1 ou um antagonista de SMACm/IAP para uso no tratamento de cânceres conforme descrito no presente documento, preferivelmente para o tratamento de cânceres sólidos.
[00173] A invenção também provê o uso de um rhabdovírus recom- binante em combinação com um inibidor da via PD-1 ou um antagonis- ta de SMACm/IAP para a fabricação de um medicamento para o tra-
tamento e/ou prevenção de cânceres conforme descrito no presente documento, preferivelmente para o tratamento de cânceres sólidos.
[00174] A invenção ainda provê um método para tratamento e/ou prevenção de câncer, compreendendo administrar a quantidade tera- peuticamente eficaz de um rhabdovírus recombinante da invenção, e um inibidor da via PD-1 ou um antagonista de SMACm/IAP a um indi- víduo que sofre de câncer, melhorando assim um ou mais sintomas de câncer. O rhabdovírus recombinante da invenção e o inibidor da via PD-1 ou o antagonista de SMACm/IAP podem ser administrados de forma concomitante, sequencial ou alternada.
[00175] O rhabdovírus recombinante da invenção e o inibidor da via PD-1 ou um antagonista de SMACm/IAP podem ser administrados pe- las mesmas formas de administração ou através de diferentes formas de administração. Preferivelmente, o inibidor da via PD-1 ou antago- nista de SMACm/IAP é administrado de forma intravenosa e o rhabdo- vírus recombinante da invenção é administrado de forma intratumoral. Em uma outra modalidade, o inibidor da via PD-1 ou o antagonista de SMACm/IAP é administrado de forma intravenosa e o rhabdovírus re- combinante da invenção é administrado pelo menos uma vez de forma intratumoral e as doses subsequentes do rhabdovírus recombinante são administradas de forma intravenosa. As doses subsequentes po- dem ser administradas 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias ou 31 dias de- pois da administração intratumoral inicial. Em uma modalidade preferi- da, o inibidor da via PD-1 ou os antagonistas de SMACm/IAP são ad- ministrados 21 dias depois da administração intratumoral inicial.
[00176] São particularmente preferidos tratamentos com o rhabdo- vírus recombinante da invenção em combinação com:
(i) antagonistas de SMAC mimético (SMACm) / IAP, (ii) agentes imunoterápicos, incluindo agentes anti-PD-1 e anti-PD-L1 e agentes anti LAG3, tais como pembrolizumabe e nivolu- mabe e anticorpos conforme divulgado na publicação internacional WO2017/198741.
[00177] Uma combinação conforme provida no presente documento compreende (i) um rhabdovírus recombinante da invenção e (iia) um inibidor da via PD-1, preferivelmente um anticorpo antagonista que é direcionado contra PD-1 ou PD-L1 ou (iib) antagonistas de SMACm/IAP. É adicionalmente provido o uso de uma referida combi- nação compreendendo (i) e (iia) ou (i) e (iib) para o tratamento de cân- ceres conforme descrito no presente documento.
[00178] Em um outro aspecto, um tratamento de combinação é pro- vido compreendendo o uso de (i) um rhabdovírus recombinante da in- venção e (iia) um inibidor da via PD-1 ou (iib) antagonistas de SMACm/IAP. No referido tratamento de combinação, o rhabdovírus recombinante da invenção pode ser administrado de forma concomi- tante, sequencial ou alternada com o inibidor da via PD-1 ou antago- nistas de SMACm/IAP.
[00179] Por exemplo, administração "concomitante" inclui adminis- trar os agentes ativos dentro do mesmo período de tempo geral, por exemplo no(s) mesmo(s) dia(s) mas não necessariamente na mesma hora. A administração alternada inclui a administração de um agente durante um período de tempo, por exemplo durante o curso de alguns dias ou uma semana, seguido pela administração do outro agente du- rante um período de tempo subsequente, por exemplo durante o curso de alguns dias ou uma semana, e então repetindo o padrão por um ou mais ciclos. A administração sequencial ou sucessiva inclui a adminis- tração de um agente durante um primeiro período de tempo (por exemplo, durante o curso de alguns dias ou uma semana) usando uma ou mais doses, seguido pela administração do outro agente durante um segundo período de tempo (por exemplo, durante o curso de al- guns dias ou uma semana) usando uma ou mais doses. Uma progra- mação sobreposta também pode ser empregada, a qual inclui a admi- nistração dos agentes ativos em diferentes dias durante o período de tratamento, não necessariamente de acordo com uma sequência regu- lar. As variações nessas orientações gerais também podem ser em- pregadas, por exemplo de acordo com os agentes usados e a condi- ção do indivíduo.
[00180] As programações de tratamento sequencial incluem a ad- ministração do rhabdovírus recombinante da invenção seguido pela administração do inibidor da via PD-1 ou os antagonistas de SMACm/IAP. As programações de tratamento sequencial também in- cluem a administração do inibidor da via PD-1 ou os antagonistas de SMACm/IAP seguido pela administração do rhabdovírus recombinante da invenção. As programações de tratamento sequencial podem incluir administrações 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 di- as, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias ou 31 dias umas depois das outras.
[00181] Um inibidor da via PD-1 dentro do significado desta inven- ção e de todas as suas modalidades é um composto que inibe a inte- ração de PD-1 com o(s) seu(s) receptor(es). Um inibidor da via PD-1 é capaz de enfraquecer a sinalização da via PD-1, preferivelmente me- diada pelo receptor PD-1. O inibidor PD-1 pode ser qualquer inibidor direcionado contra qualquer membro da via PD-1 capaz de antagoni- zar a sinalização da via PD-1. O inibidor pode ser um anticorpo anta- gonista que direciona algum membro da via PD-1, preferivelmente di- recionado contra o receptor de PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Além disso, o inibidor da via PD-1 pode ser um fragmento do receptor de PD-1 ou o receptor de PD-1 bloqueando a atividade dos ligantes de PD1.
[00182] Os antagonistas de PD-1 são bem conhecidos na técnica, por exemplo revistos em Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151 (in- corporados no presente documento a título de referência). Qualquer antagonista de PD-1, especialmente anticorpos, tais como aqueles di- vulgados em Li et al. assim como os anticorpos adicionais divulgados abaixo no presente documento, podem ser usados de acordo com a invenção. Preferivelmente, o antagonista PD-1 desta invenção e todas as suas modalidades é selecionado a partir do grupo consistindo dos seguintes anticorpos: pembrolizumabe (anticorpo anti-PD-1); nivolumabe (anticorpo anti-PD-1); pidilizumabe (anticorpo anti-PD-1); PDR-001 (anticorpo anti-PD-1); PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5 conforme divulgados abaixo no presente documento (anticorpos anti-PD-1) atezolizumabe (anticorpo anti-PD-L1); avelumabe (anticorpo anti-PD-L1); durvalumabe (anticorpo anti-PD-L1).
[00183] Pembrolizumabe (também anteriormente conhecido como lambrolizumabe; nome comercial Keytruda; também conhecido como MK-3475) divulgado por exemplo em Hamid, O. et al. (2013) New En- gland Journal of Medicine 369(2):134-44, é um anticorpo monoclonal humanizado IgG4 que se liga a PD-1; ele contém uma mutação em C228P designado para prevenir citotoxicidade mediada por Fc. Pem- brolizumabe é por exemplo divulgado na Patente Norte-americana US 8,354,509 e publicação internacional WO2009/114335. Ele está apro- vado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de mela- noma irressecável ou metastático e pacientes com NSCLC metastáti-
co.
[00184] Nivolumabe (número de registro CAS: 946414-94-4; BMS- 936558 ou MDX1106b) é anticorpo monoclonal IgG4 totalmente hu- mano que especificamente bloqueia PD-1, carecendo de toxicidade celular dependente de anticorpo detectável (ADCC). Nivolumabe está, por exemplo, divulgado na Patente Norte-americana US 8,008,449 e publicação internacional WO2006/121168. Ele foi aprovado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de melanoma irressecável ou metastático, NSCLC metastático e carcinoma de células renais avançado.
[00185] Pidilizumabe (CT-011; Cure Tech) é um anticorpo monoclo- nal IgG1k humanizado que se liga a PD-1. Pidilizumabe está, por exemplo, divulgado na publicação internacional WO2009/101611.
[00186] PDR-001 ou PDR001 é um anticorpo IgG4 anti-PD-1 hu- manizado, bloqueador do ligante, de alta afinidade que que bloqueia a ligação de PD-L1 e PD-L2 ao PD-1. PDR-001 está divulgado nas pu- blicações internacionais WO2015/112900 e WO2017/019896.
[00187] Os anticorpos PD1-1 a PD1-5 são moléculas de anticorpo definidas pelas sequências conforme mostrado na tabela 1, em que HC denota a cadeia pesada de (comprimento total) e LC denota a ca- deia leve de (comprimento total): Tabela 1: SEQ Nome da se- Sequência de aminoácido ID NO: quência 14 HC de PD1-1 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTF
SASAMSWVRQAPGKGLEWVAYISGGGGD TYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN
SEQ Nome da se- Sequência de aminoácido ID NO: quência
VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG 15 LC de PD1-1 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDT
SGISFMNWYQQKPGQAPKLLIYVASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC 16 HC de PD1-2 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTF
SASAMSWVRQAPGKGLEWVAYISGGGGD TYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARHSNPNYYAMDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG 17 LC de PD1-2 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDT
SEQ Nome da se- Sequência de aminoácido ID NO: quência
SGISFMNWYQQKPGQAPKLLIYVASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC 18 HC de PD1-3 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTF
SKSAMSWVRQAPGKGLEWVAYISGGGGD TYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG 19 LC de PD1-3 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDV
SGISFMNWYQQKPGQAPKLLIYVASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC 20 HC de PD1-4 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTF
SKSAMSWVRQAPGKGLEWVAYISGGGGD TYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR
SEQ Nome da se- Sequência de aminoácido ID NO: quência
AEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG 21 LC de PD1-4 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDV
SGISFMNWYQQKPGQAPKLLIYVASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC 22 HC de PD1-5 EVMLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTF
SKSAMSWVRQAPGKGLEWVAYISGGGGD TYYSSSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARHSNVNYYAMDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
SEQ Nome da se- Sequência de aminoácido ID NO: quência
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG 23 LC de PD1-5 EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASENIDV
SGISFMNWYQQKPGQAPKLLIYVASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQSKEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
[00188] Especificamente, a molécula de anticorpo anti-PD-1 descri- ta no presente documento tem: (PD1-1:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:14 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:15; ou (PD1-2:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:17; ou (PD1-3:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:19; ou (PD1-4:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:20 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:21; ou (PD1-5:) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:22 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:23.
[00189] Atezolizumabe (Tecentriq, também conhecido como MPDL3280A) é um anticorpo monoclonal IgG1k humano derivado de fagos que direciona PD-L1 e é descrito, por exemplo, em Deng et al. mAbs 2016;8:593-603. Ele foi aprovado pelo FDA para o tratamento de pacientes que sofrem de carcinoma urotelial.
[00190] Avelumabe é um anticorpo monoclonal IgG1 anti-PD-L1 to- talmente humano e descrito em, por exemplo, Boyerinas et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1148-1157.
[00191] Durvalumabe (MEDI4736) é um anticorpo monoclonal IgG1k humano com alta especificidade para PD-L1 e descrito em por exemplo Stewart et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1052-1062 ou em Ibrahim et al. Semin. Oncol. 2015;42:474-483.
[00192] Os antagonistas PD-1 adicionais divulgados em Li et al. (supra), ou conhecidos por estarem em ensaios clínicos, tais como AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), REGN2810, BMS-936559, JS001- PD-1, SHR-1210, BMS-936559, TSR-042, JNJ-63723283, MEDI4736, MPDL3280A e MSB0010718C, podem ser usados como alternativa ou além dos antagonistas mencionados acima.
[00193] Os INNs conforme usado no presente documento preten- dem abranger todos os anticorpos biossimilares tem as mesmas, ou substancialmente as mesmas sequências de aminoácido como o anti- corpo de origem, incluindo, porém sem se limitar àqueles anticorpos biossimilares autorizados sob a subseção (k) 42 USC §262 (k) nos Es- tados Unidos da América e regulamentações equivalentes em outras jurisdições.
[00194] Os antagonistas de PD-1 listados acima são conhecidos na técnica com a sua respectiva fabricação, uso terapêutico e proprieda- des.
[00195] Em uma modalidade, o antagonista de PD-1 é pembrolizu- mabe.
[00196] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é nivo- lumabe.
[00197] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é pidili- zumabe.
[00198] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é atezo- lizumabe.
[00199] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é avelu- mabe.
[00200] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é durva- lumabe.
[00201] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PDR-
001.
[00202] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-1.
[00203] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-2.
[00204] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-3.
[00205] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-4.
[00206] Em uma outra modalidade, o antagonista de PD-1 é PD1-5.
[00207] O mimético de SMAC dentro do significado dessa invenção e todas as suas modalidades é um composto que se liga às proteínas IAP e induz a sua degradação. Preferivelmente, o mimético de SMAC dentro desta invenção e todas as suas modalidades é selecionado a partir do grupo consistindo do que segue (A0):  um mimético de SMAC (isto é, um composto) conforme (genericamente e/ou especificamente) divulgado na publicação inter- nacional WO 2013/127729, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  um mimético de SMAC (isto é, um composto) conforme (genericamente e/ou especificamente) divulgado na publicação inter- nacional WO 2015/025018, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  um mimético de SMAC (isto é, um composto) conforme (genericamente e/ou especificamente) divulgado na publicação inter-
nacional WO 2015/025019, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  um mimético de SMAC (isto é, um composto) conforme (genericamente e/ou especificamente) divulgado na publicação inter- nacional WO 2016/023858, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  um mimético de SMAC (isto é, um composto) conforme (genericamente e/ou especificamente) divulgado na publicação inter- nacional WO 2008/0016893, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  LCL161, isto é composto A no exemplo 1 da publicação internacional WO 2008/016893 (página 28/29; [122]), ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo;  o mimético de SMAC conhecido como Debio-1143, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  o mimético de SMAC conhecido como birinapant, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  o mimético de SMAC conhecido como ASTX-660, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;  o mimético de SMAC conhecido como CUDC-427, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo  qualquer um dos miméticos de SMAC 1 a 26 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: Tabela 2: 1 N
O N N N HN H N O
2 O
N N N O N N HN H
N O 3 N
O N N N HN H
N 4 N
O N N N HN H
N 5 N
O N N N HN H
N 6 F
N N O N N HN H
N 7
N N O N N HN H N N N N O N N H N
HN 9
N N O N N
HN H 10 N
N O N N N
HN H 11 N O
N O N N N HN H
N 12 N
N O N N N HN H
N 13 N
N N O N N N HN H N
14 N
N N O N N N HN H N
N 15
N O N N N HN H
N 16 N
N O N N N HN H
N 17 N
N N O N N N HN H
N 18 N
O N O N N N HN H
N 19 O
N N O N N N HN H N
20 N O
N O N N N HN H
N O 21 N
N O N N N
HN H 22 N
N N O N N N HN H
N O 23 N
O N O N N N HN H
N O 24 O
N N O N N N HN H N O
25 N O
N N Cl
O N N HN H
N 26
N O N N O N N HN H N
[00208] Compostos do exemplo 1 a 10 na tabela 2 são divulgados na publicação internacional WO 2013/127729. Os compostos do exemplo 11 a 26 na tabela 2 são divulgados na publicação internacio- nal WO 2016/023858.
[00209] O termo "mimético de SMAC/antagonista de IAP" conforme usado no presente documento também inclui os miméticos de SMAC listados acima na forma de um tautômero, de um sal farmaceuticamen- te aceitável, de um hidrato ou de um solvato (incluindo um hidrato ou solvato de um sal farmaceuticamente aceitável). Ele também inclui o mimético de SMAC em todas as suas formas sólidas, preferivelmente cristalinas e em todas as formas cristalinas dos seus sais farmaceuti- camente aceitáveis, hidratos e solvatos (incluindo hidratos e solvatos de sais farmaceuticamente aceitáveis).
[00210] Todos os miméticos de SMAC listados acima são conheci- dos na técnica com as respectivas sínteses e propriedades. Todos os pedidos de patente referidos acima são incorporados a título de refe- rência em sua totalidade.
[00211] Em uma modalidade, o mimético de SMAC é LCL161 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A1).
[00212] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 1 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A2).
[00213] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 2 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A3).
[00214] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 3 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A4).
[00215] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 4 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A5).
[00216] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 5 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A6).
[00217] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 6 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A7).
[00218] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 7 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A8).
[00219] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 8 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A9).
[00220] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 9 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (A10).
[00221] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 10 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A11).
[00222] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 11 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A12).
[00223] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 12 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A13).
[00224] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 13 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A14).
[00225] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 14 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A15).
[00226] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 15 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A16).
[00227] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 16 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A17).
[00228] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 17 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A18).
[00229] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 18 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A19).
[00230] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 19 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A20).
[00231] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 20 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A21).
[00232] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 21 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A22).
[00233] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 22 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A23).
[00234] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 23 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A24).
[00235] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 24 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A25).
[00236] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 25 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A26).
[00237] Em uma outra modalidade, o mimético de SMAC é o com- posto 26 na tabela 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo (A27).
[00238] Todas as modalidades (A1) a (A27) são modalidades prefe- ridas da modalidade (A0) em respeito da natureza do mimético de SMAC.
[00239] Em uma modalidade preferida que se refere aos tratamen- tos de combinação, o rhabdovírus recombinante é um vírus de esto- matite vesicular recombinante codificando no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivel- mente CCL21 humana, selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) proteína CCL21 c- terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou
99% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que com- preende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:1, or (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que a codificação genética pa- ra a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular recombinante é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária(LCMV), e/ou a glicoproteína G é substitu- ída pela glicoproteína GP do LCMV.
[00240] Em uma modalidade adicional preferida que se refere ao tratamento de combinação, o rhabdovírus recombinante é um vírus de estomatite vesicular recombinante que codifica em seu genoma uma nucleoproteína do vírus de estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo me- nos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, prefe- rivelmente CCL21 humana, em que a proteína CCL21 ou variante fun- cional da mesma é selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) proteína CCL21 c- terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID
NO:2 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que com- preende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:1, ou (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que a codificação genética pa- ra a glicoproteína G do vírus de estomatite vesicular é substituída pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningi- te linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glico- proteína GP do LCMV, e em que a nucleoproteína (N) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:7, a fosfoproteína (P) compreende um aminoá- cido conforme apresentado na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:8, a proteína grande (L) compreende um aminoácido con-
forme apresentado na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:9, e a proteína matriz (M) compreende um aminoácido confor- me apresentado na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo me- nos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:10.
[00241] Em uma modalidade mais preferida que se refere aos tra- tamentos de combinação, o rhabdovírus recombinante é um vírus de estomatite vesicular recombinante que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, pre- ferivelmente CCL21 humana, em que a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma compreende SEQ ID NO:5 ou tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que a codificação genética para a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular recombinante é substituída pela codi- ficação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicopro- teína GP do LCMV.
[00242] Embora a combinação de rhabdovírus recombinante da in- venção e o vírus de estomatite vesicular da invenção junto com inibi- dores de PD-1 ou antagonistas de SMACm/IAP fosse excepcionalmen- te eficaz no tratamento de cânceres, verificou-se pelos inventores que a combinação de um vírus de estomatite vesicular, não codificando uma carga adicional, isto é não codificando uma proteína CCL21 tam- bém foi eficaz quando combinada com um inibidor da via PD-1 ou um antagonista de SMACm/IAP. Em particular, o tratamento de combina- ção de um VSV-GP (vírus da estomatite vesicular com uma glicoprote-
ína de LCMV) com um inibidor da via PD-1 ou antagonista de SMACm/IAP, ambos conforme descritos no presente documento, foi eficiente para o tratamento de câncer, preferivelmente cânceres sóli- dos. Deste modo, também está provida no presente documento uma combinação compreendendo um VSV-GP não codificando uma proteí- na CCL21 e um inibidor da via PD-1, preferivelmente um anticorpo an- tagonista que é direcionado contra PD-1 ou PD-L1 ou um antagonista de SMACm/IAP. É adicionalmente provido o uso de uma referida com- binação para o tratamento de cânceres conforme descrito no presente documento. É adicionalmente provido um tratamento de combinação compreendendo o uso de um VSV-GP não codificando uma proteína CCL21 e um inibidor da via PD-1 ou um antagonista de SMACm/IAP.
[00243] Em relação ao tratamento de combinação de VSV-GP não codificando uma proteína CCL21, prefere-se que o rhabdovírus re- combinante seja um vírus de estomatite vesicular recombinante, em que a codificação genética para a glicoproteína G do vírus da estoma- tite vesicular recombinante é substituída pela codificação genética pa- ra a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP do LCMV.
[00244] Ainda em relação ao tratamento de combinação de um VSV-GP não codificando uma proteína CCL21, prefere-se que o rhab- dovírus recombinante seja um vírus de estomatite vesicular recombi- nante codificando no seu genoma uma nucleoproteína do vírus da es- tomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G), em que a codificação genética para a gli- coproteína G do vírus de estomatite vesicular é substituída pela codifi- cação genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite lin- focitária(LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP do LCMV, e em que a nucleoproteína (N) compreende um aminoá- cido conforme apresentado na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:7, a fosfoproteína (P) compreende um aminoácido con- forme apresentado na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:8, a proteína grande (L) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:9, e a proteína matriz (M) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:10. Geração de vírus, produção e célula produtora de vírus
[00245] A invenção também provê uma célula produtora de vírus, caracterizada pelo fato de que a célula produz um rhabdovírus recom- binante ou vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a invenção.
[00246] A célula pode ser de qualquer origem e pode estar presente como célula isolada ou como uma célula compreendida em uma popu- lação celular. Prefere-se que a célula que produz um rhabdovírus re- combinante ou vírus da estomatite vesicular recombinante seja uma célula de mamífero. Em uma modalidade mais preferida, a célula que produz o vírus da invenção é caracterizada pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula progenitora adulta multipotente (MAPC), uma célula-tronco neural (NSC), uma célula-tronco mesenquimal (MSC), uma célula HeLa, uma célula HEK, qualquer célula HEK293 (por exemplo HEK293F ou HEK293T), uma célula de ovário de hams-
ter chinês (CHO), uma célula renal de hamster bebê (BHK) ou uma célula Vero ou uma célula de infiltração tumoral derivada de medula óssea (BM-TIC).
[00247] Alternativamente, a célula que produz vírus pode ser uma célula humana, célula de macaco, célula de camundongo ou célula de hamster. O versado na técnica está ciente dos métodos adequados para uso na testagem se uma dada célula produz um vírus e, assim, se uma célula específica se enquadra no escopo desta invenção. Nes- te caso, a quantidade de vírus produzida pela célula da invenção não está particularmente limitada. Os títulos virais preferidos são ≥1x107 TCID50/ml ou ≥1x108 de cópias de genoma/ml nos sobrenadantes bru- tos da dada cultura celular depois da infecção sem processamento a jusante adicional.
[00248] Em uma modalidade específica, a célula que produz vírus da invenção é caracterizada pelo fato de que a célula compreende um ou mais cassetes de expressão para a expressão de pelo menos um dos genes selecionados a partir do grupo consistindo da codificação dos genes n, l, p e m para proteínas N, L, P e M do VSV e uma codifi- cação genética gp para glicoproteína LCMV-GP, Dandenong-GP ou Mopeia-GP.
[00249] As células produtoras de vírus no significado da invenção incluem células de empacotamento clássicas para a produção de rhabdovírus recombinante a partir de vetores não replicáveis assim como as células produtoras para a produção de rhabdovírus recombi- nante a partir de vetores capazes de reprodução. As células de empa- cotamento compreendem um ou mais plasmídeos para a expressão de genes essenciais que carecem no respectivo vetor a ser empacotado /ou são necessários para a produção de vírus. As referidas células são conhecidas do versado na técnica que pode selecionar linhagens celu- lares apropriadas adequadas para a finalidade desejada.
[00250] O rhabdovírus recombinante da invenção pode ser produzi- do de acordo com os métodos conhecidos do versado na técnica e in- cluem sem limitação (1) usar cDNAs transfectados em uma célula ou (2) uma combinação de cDNAs transfectados em uma célula auxiliar, ou (3) cDNAs transfectados em uma célula, que é adicionalmente in- fectada com um auxiliar/minivírus provendo em trans os componentes ou atividades restantes necessários para produzir tanto um rhabdoví- rus recombinante infeccioso quanto um rhabdovírus recombinante não infeccioso. O uso de qualquer um desses métodos (por exemplo, auxi- liar/minivírus, linhagem celular auxiliar ou transfecção de cDNA ape- nas), os componentes mínimos necessários são uma molécula de DNA contendo os sinais de ação cis para (1) encapsidação do RNA genômico (ou antigenômico) pela proteína N do rhabdovírus, proteína P e proteína L e (2) replicação de um equivalente de RNA genômico ou antigenômico (intermediário replicativo).
[00251] Um elemento de replicação ou replicon é uma fita de RNA contendo minimamente as extremidades 5' e 3', a sequência líder e a sequência trailer de um rhabdovírus. No sentido genômico, a líder está na extremidade 3' e a trailer está na extremidade 5'. Qualquer RNA- colocado entre esses dois sinais de replicação serão por sua vez repli- cados. As regiões líder e trailer ainda devem conter os elementos de ação cis mínimos para finalidades de encapsidação pela proteína N e para ligação de polimerase que são necessárias para iniciar a transcri- ção e replicação. Para preparar o rhabdovírus recombinante, um mini- vírus contendo o gene G teria uma região líder, uma região trailer e um gene G com os sinais de iniciação e terminação apropriados para pro- duzir um mRNA de proteína G. Se o minivírus ainda compreender um gene M, os sinais de iniciação e terminação apropriados para produzir o mRNA da proteína M também devem estar presentes.
[00252] Para qualquer gene contido dentro do genoma do rhabdoví-
rus recombinante, o gene seria flanqueado pelos sinais de iniciação e terminação apropriados que permitiriam a expressão daqueles genes e a produção dos produtos de proteína (Schnell et al., Journal of Viro- logy, p.2318-2323, 1996). Para produzir rhabdovírus recombinante "não infeccioso", o rhabdovírus recombinante deve ter os mínimos elementos replicon e as proteínas N, P e L e deve conter o gene M. Isto produz partículas virais que são brotadas a partir da célula, porém são partículas não infecciosas. Para produzir partículas "infecciosas", as partículas virais devem adicionalmente compreender proteínas que podem mediar a ligação e fusão da partícula viral, tal como através do uso de uma proteína de ligação ou ligante receptor. O ligante receptor nativo de rhabdovírus é a proteína G.
[00253] Qualquer célula que permitiria a junção do rhabdovírus re- combinante pode ser usada. Um método para preparar partículas vi- rais infecciosas compreende uma linhagem celular apropriada infecta- da com um plasmídeo codificando uma T7 RNA polimerase ou outra polimerase bacteriófaga tal como as polimerases T3 ou SP6. As célu- las podem ser então transfectadas com cDNA individual contendo os genes codificando as proteínas do rhabdovírus G, N, P, L e M. Esses cDNAs proverão as proteínas para construção de uma partícula de rhabdovírus recombinante. As células podem ser transfectadas por qualquer método conhecido na técnica.
[00254] Também está transfectado na linhagem celular um "cDNA policistrônico" contendo o equivalente do RNA genômico do rhabdoví- rus. Caso infecciosa, a partícula de rhabdovírus recombinante deve ser lítica em uma célula infectada, então os genes codificando as pro- teínas N, P, M e L devem estar presentes assim como qualquer seg- mento de ácido nucleico heterólogo. Caso a partícula de rhabdovírus recombinante infecciosa não for lítica, então o gene codificando a pro- teína M não está incluído no DNA policistrônico. Entende-se por
"cDNA policistrônico" um cDNA compreendendo pelo menos unidades de transcripção contendo os genes que codificam as proteínas N, P e L. O DNA policistrônico do rhabdovírus recombinante também pode conter um gene codificando uma variante de proteína ou fragmento polipeptídico do mesmo, ou um ácido nucleico ou proteína terapêutica. Alternativamente, qualquer proteína a ser inicialmente associada com a partícula viral primeiro produzida ou fragmento da mesma pode ser suprida em trans.
[00255] Também está contemplado um cDNA policistrônico com- preendendo um gene codificando CCL21. O cDNA policistrônico con- templado pode conter um gene codificando uma variante de proteína, um gene codificando um reporter, um ácido nucleico terapêutico, e/ou qualquer um dos genes N-P-L ou genes N-P-L-M. A primeira etapa na geração de um rhabdovírus recombinante é a expressão de um RNA que é um equivalente genômico ou antigenômico a partir de um cDNA. Depois que o RNA é empacotado pela proteína N e então replicado pelas proteínas P/L. O vírus recombinante assim produzido pode ser recuperado. Se a proteína G estiver ausente do genoma de RNA re- combinante, então ela é tipicamente suprida em trans. Se ambas as proteínas G e M estiverem ausentes, então ambas são supridas em trans. Para preparar partículas de "rhabdovírus não infeccioso", o pro- cedimento pode ser o mesmo como acima, exceto pelo fato de que o cDNA policistrônico transfectado nas células conteria os genes N, P e L do rhabdovírus apenas. O cDNA policistrônico das partículas de rhabdovírus não infeccioso pode adicionalmente conter um gene codi- ficando uma proteína.
[00256] As células transfectadas são geralmente incubadas por pe- lo menos 24 h na temperatura desejada, geralmente cerca de 37 graus. Para partículas virais não infecciosas, o sobrenadante é coleta- do e as partículas virais isoladas. Para partículas virais infecciosas, o sobrenadante contendo o vírus é coletado e transferido a células pu- ras. As células puras são incubadas por aproximadamente 48 horas, e o sobrenadante é coletado.
[00257] Outras características e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes a partir dos seguintes exemplos mais detalhados que ilustram, a título de exemplo, os princípios da invenção. Exemplos Exemplo 1
[00258] Indução de infiltração/ativação imune e expressão de che- ckpoint imunológico em tumores infectados por VSV-GP
[00259] Análise da expressão / NanoString (FIG.1)
[00260] Para melhor entender o impacto das intervenções terapêu- ticas com a infiltração celular imune na plataforma VSV-GP (células T: CD3 epsilon, CD4 e CD8), a expressão da ativação (CD69, Granzima B (GzmB) e Perforina (Prf1)) assim como checkpoint imunológico (PD- L1 (CD274), PD-1 (Pdcd1), Ctla-4, Tigit e Lag3) foi analisada em tumo- res controle ou tumores infectados por VSV-GP. Para esta finalidade, os camundongos C57BL/6 com tumores estabelecidos LLC1- IFNARKO (células tumorais LLC1 deletadas para o receptor interferon alfa) foram usados como controles ou tratados com uma única injeção i.v. de 1x108 TCID50 de VSV-GP. Sete dias após o tratamento, os tu- mores foram ressectados; RNA total foi extraído e analisado usando o "Pan Cancer Immune Profiling Panel" da NanoString de acordo com as instruções do fabricante. Conforme apresentado na FIG. 1, o tratamen- to com VSV-GP resultou em uma forte suprarregulação da expressão dos genes analisados, incluindo os genes PD-L1 e PD-1. Exemplo 2
[00261] Eficácia: combo VSV-GP com anti-PD-1
[00262] Crescimento tumoral (FIG.2A-D)
[00263] Baseado no sucesso clínico dos anticorpos do bloqueio de
PD-1 resp. PD-L1 em pacientes com câncer e nossos dados (vide FIG. 1) ilustrando que o tratamento com a plataforma VSV-GP resultou na ativação de células T infiltrantes tumorais, em sintonia com a suprarre- gulação de checkpoints imunológicos, tais como PD-1 e PD-L1 o po- tencial terapêutico da combinação de terapêuticos derivados de VSV- GP com um anticorpo bloqueador de PD-1 foi analisado usando o mo- delo tumoral CT26.CL25-IFNARKO (células tumorais CT26.CL25 dele- tadas para o receptor de interferon alfa).
[00264] As taxas de enxerto de células tumorais CT26Cl25 IFNAR- /- injetadas s.c. foram de 100% (50/50 dos camundongos). No dia 8 (dia da aplicação do vírus), o tamanho médio do tumor era de 0,05cm3. O crescimento tumoral foi seguido durante um intervalo de 60 dias. Os controles mock (=não tratados) exibiram 10% de remissões espontâ- neas (1/10) e um tumor cresceu mais devagar. Os camundongos tra- tados com VSV-GP i.v. sozinho, 30% (3/10 dos camundongos) de re- missões completas foram observadas. O tratamento com PD-1 sozi- nho iniciando no dia 11 pós enxerto não teve nenhum efeito no cres- cimento tumoral. A combinação de VSV-GP com anti-PD-1 resultou em altas taxas de remissão do tumor. As remissões completas foram observadas em 70% (7/10 dos camundongos) quando anti-PD-1 foi aplicado depois do tratamento com VSV-GP. Os camundongos per- maneceram livres do tumor por pelo menos 60 dias. No total, as altas taxas de sobrevivência foram alcançadas nos grupos de combinação (não mostrados). Exemplo 3
[00265] Formação de memória: combo VSV-GP & VSV-GP/anti-PD- 1
[00266] Crescimento tumoral / Reintrodução (FIG.3A-C)
[00267] Os camundongos curados a partir dos experimentos com a combinação de VSV-GP/anti-PD-1 são protegidos da reintrodução. Os camundongos a partir do grupo de combinação de VSV-GP/ anti-PD-1 (n=7) ou grupo VSV-GP sozinho (baixa dose, n=3) foram reintroduzi- dos. Em resumo, as células de CT26Cl25 IFNAR-/- foram injetadas s.c. no flanco esquerdo dos camundongos e o crescimento tumoral foi monitorado com o tempo. Como controle positivo, camundongos puros com idade e sexos correspondentes (n=10) foram enxertados com CT26Cl25 IFNAR-/- s.c. e os tumores cresceram de forma consistente com uma remissão espontânea conforme observado antes. Nenhum crescimento tumoral foi observado no grupo de combinação com VSV- GP/anti-PD-1 (n=7) ou grupo VSV-GP sozinho (baixa dose, n=3), indi- cando que os camundongos curados desenvolveram uma certa memó- ria imunológica. Exemplo 4
[00268] Seleção da carga CCL21 e expressão de quimiocina indu- zida por VSV-GP em tumores
[00269] Análise da expressão NanoString® (FIG.4)
[00270] O impacto das intervenções terapêuticas com a plataforma VSV-GP em modelos tumorais pré-clínicos foi analisado pela medição da expressão de múltiplas quimiocinas (FIG.4). CCL5, CXCL9, CXCL10 e outra expressão de quimiocina foram fortemente suprarre- guladas em tumores LLC1-IFNARKO 3 resp. 7 dias depois de um úni- co tratamento i.v. com 1x108 TCID50 de VSV-GP. Por outro lado, a ex- pressão de ligantes CCR7, CCL19 e CCL21 não foi suprarregulada pela infecção com VSV-GP. Exemplo 5
[00271] Geração de recombinantes de VSV-CCL21
[00272] Resgate viral (FIG.5)
[00273] Baseado nos achados descritos no exemplo 4, o genoma do vírus oncolítico VSV-GP foi engenheirado para codificar o gene CCL21 (vide FIG. 5) para expressar localmente a quimiocina de
CCL21 no sítio tumoral durante a replicação viral e para preencher o "gap imunoterapêutico" de VSV-GP (VSV-GP não foi capaz de suprar- regular os ligantes de CCR7, CCL19 e CCL21) e ainda melhorar a infil- tração de células imunes assim como a eficácia terapêutica do vírus oncolítico VSV-GP.
[00274] As variantes virais VSV-GP-CCL21 competentes na repli- cação foram geradas por meio da genética reversa (clonando o gene de interesse (GOI), resgate viral e repetida purificação das placas) a partir de plasmídeos bacterianos que contêm o cDNA para o genoma viral completo de VSV-GP e versões de CCL21 de murino ou CCL21 humana. Os plasmídeos pVSV-GP-CCL21 foram baseados no plasmí- deo pVSV-XN1 (Schnell et al.) que contém o genoma de cDNA com- pleto do sorotipo VSV Indiana sob o controle do promotor T7. De modo a gerar as variantes pVSV-GP-CCL21, a sequência total para a proteí- na envelope VSV G foi substituída pela sequência de códon otimizado da proteína envelope GP a partir do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV, cepa WE-HPI). De forma adicional, uma codificação de ácido nucleico sintético para um gene CCL21 foi inserida entre a glicoproteí- na GP e a polimerase viral L pela montagem de Gibson. A transcrição do gene CCL21 no contexto de infecção viral é assegurada por uma sequência de sinal inicial VSV extra na extremidade 3’ e de uma se- quência de sinal de parada adicional na extremidade 5’ da fase de lei- tura aberta de CCL21 (Fig.5A).
[00275] Os vírus infecciosos foram recuperados (ou resgatados) dos cDNAs de plasmídeo através da transfecção de HEK293T ou qualquer outra linhagem celular permissiva VSV através de métodos de transfecção padrão (por exemplo, precipitação de CaPO4, liberação de DNA lipossômico). Em resumo, as células HEK293T foram trans- fectadas com plasmídeos de expressão baseados em pSF-CAG-amp codificando as proteínas VSV N, P e L assim como T7-polimerase có-
don-otimizada. Adicionalmente, o plasmídeo codificando o cDNA ge- nômico viral de VSV-GP, VSV-GP-CCL21 ou uma variante do mesmo foi co-transfectado (FIG. 5B). Em uma primeira etapa do processo de resgate, a T7 polimerase transcreve o genoma do RNA viral a partir do cDNA do vírus codificado pelo plasmídeo. Em uma segunda etapa, as proteínas VSV-L e -P, que são expressadas de forma exógena a partir dos plasmídeos co-transfectados, amplificam adicionalmente os ge- nomas de RNA viral. Os genomas de RNA viral são co- transcricionalmente encapsidados pela proteína VSV-N. Adicionalmen- te, o complexo de P/L polimerase permite a transcrição do conjunto completo de produtos genéticos virais e N, P, M, GP e L assim como as variantes de CCL21 inseridas. Os genomas de RNA viral são sub- sequentemente empacotados em partículas de VSV infeccioso con- tendo a ribonucleoproteína, a proteína matriz e a GP de envelope viral. As partículas virais são liberadas a partir das células através de bro- tamento.
[00276] Os vírus resgatados foram inicialmente passados em linha- gens celulares permissivas tais como HEK293T, BHK21Cl.13 ou VE- RO. Várias séries de purificação de placas foram realizadas antes da geração de um estoque de sementes de vírus pelos métodos padrão. Em resumo, as células HEK293T, BHK21Cl.13 ou VERO foram infec- tadas com dez diluições seriais das pré-sementes resgatadas. Depois de aproximadamente duas horas, as monocamadas celulares foram lavadas duas vezes e sobrepostas com meio contendo 0,8% de aga- rose pouco derretida. 24h a 48h depois da infecção, as placas foram coletadas e o vírus foi usado para uma série adicional de purificação de placas ou estoques de semente viral foram gerados. Exemplo 5.1
[00277] Validação da aptidão viral in vitro
[00278] TCID50 (FIG.19A-C)
[00279] Um dia antes da infecção, as células Vero, BHK21 e HEK293 foram semeadas em placas de 6 poços. O meio de cultura correspondente era: (a) células Vero: DMEM (Gibco, #31966-021) + 5% FBS inativado por calor (Gibco, #10500-064), (b) células BHK21: GMEM (Life Technologies, #21710-082/025) + 10% de FBS inativado por calor (Gibco, #10500-064) + 5% TPB de caldo de triptose fosfato (Life Technologies, #18050-039), (c) células HEK293: meio de expres- são Freestyle™ 293 (ThermoFisher Scientific, #12338018).
[00280] No dia da infecção, todas as linhagens celulares tinham uma confluência de 60-70%. Um poço por linhagem celular foi contado (CountessTM cell counter, Invitrogen) antes de infectar os outros po- ços com 0,005 MOI de um dos construtos virais VSV-GP (GP), VSV- GP-huCCL21 (21) ou VSV-GP-huCCL21(1-79) (21k).
[00281] Os sobrenadantes de cultura (3mL do volume total) foram coletados 0h, 24h ou 48h depois da infecção para determinar a com- petência da replicação viral através da medição de TCID50/mL.
[00282] TCID50 (Dose infecciosa de cultura de tecido mediana) foi determinada em placas de 96 poços de células VERO que foram se- meadas um dia antes da infecção. De todos os sobrenadantes, vinte e duas diluições seriais semi-logarítmicas foram preparadas (variando de 1E-1.0 a 1E-11,5) e tituladas em quadruplicatas. Seis dias depois da infecção, o efeito citopático (CPE) foi lido pela inspeção microscó- pica das placas.
[00283] TCID50/mL foi calculada de acordo com a fórmula Spear- man-Karber M = x + d [0.5 – (1/n) (r)] com x: expoente positivo de mai- or diluição testado; d = espaçamento entre as diluições; n = poços por diluição; r = soma do número de respostas negativas. Exemplo 5.2
[00284] Expressão da carga in vitro
[00285] ELISA/Western blot (FIG. 6A-B & FIG.12A-B & FIG.18)
[00286] Para confirmar e quantificar a expressão das cargas de CCL21 viral (transgenes) assim como para melhor caracterizar diferen- tes variantes de CCL21, ELISAS específicos para CCL21 assim como análises western blot foram conduzidos. Conforme apresentado na FIG. 6A e FIG.12A, os sobrenadantes de VSV-GP-muCCL21 (FIG.6A; VSV-GP expressando as células HEK293 infectadas por CCL21 de murino de comprimento total ou VSV-GP-huCCL21 (FIG.12A; VSV-GP expressando a CCL21 humana de comprimento total) foram respecti- vamente analisadas em diferentes momentos em seguida à infecção viral usando ELISAS específicos de camundongos resp. humanos. Além disso, as variantes de CCL21 humana foram caracterizadas, a saber a CCL21 humana de comprimento total e a versão c- terminalmente truncada que parecem os primeiros 79 aminoácidos (sem a sequência de sinal) de CCL21 humana = CCL21(1-79) usando um western blot específico para CCL21 humana. Conforme apresen- tado na FIG.18 (desde o lado esquerdo) os sobrenadantes a partir das células HEK293 transfectadas por plasmídeo, que codificam a CCL21(1-79) ou proteínas CCL21 de comprimento total assim como sobrenadantes a partir das células HEK293 infectadas com os vírus indicados foram analisados. As variantes de quimiocina foram bem ex- pressadas em ambos os sistemas (plasmídeo e vírus). Embora as amostras de CCL21 de comprimento total tivessem múltiplas espécies de CCL21 resp. produtos de ruptura/clivagem da proteína CCL21(1- 79) apresentada como uma faixa única limpa. Exemplo 5.3
[00287] Atividade da carga in vitro
[00288] Transwell (células T/DCs) (FIG., 6A & 12A & 16 & 17)
[00289] Para confirmar e adicionalmente caracterizar a funcionali- dade biológica das cargas virais de CCL21 (transgenes) a sua capaci- dade para atrair células T ou células dendríticas derivadas de monóci-
tos (moDCs) em um ensaio de migração Transwell foi analisada. Para esta finalidade, a CCL21 de camundongo e humana contendo sobre- nadantes resp. descritos no Exemplo 5.2 (FIG. 6A e 12A), meio de mi- gração sozinho (controle de fundo), CCL21 recombinante (controle po- sitivo) ou sobrenadantes correspondentes a partir de células HEK293 infectadas por VSV-GP (controle de fundo VSV-GP) foram adicionados ao fundo do poço da configuração do ensaio de migração Transwell e camundongos estimulados com CD3/28 (Figura 6; lado direito) ou cé- lulas T humanas (Figura 12; lado direito) adicionados à câmara superi- or (Transwell Insert). Em seguida à incubação, as células no fundo do poço foram quantificadas usando ensaio de viabilidade celular Prome- ga® CellTiter-Glo®. Os resultados são apresentados como "coeficiente de aumento" relativo ao meio de migração apenas controle. Os expe- rimentos adicionais incluíram a versão curta de carga de CCL21, CCL21(1-79) (aa 1-79 de CCL21 humana) e o fragmento de CCL21 mais curto, de ocorrência natural que resulta do processamento medi- ado pela plasmina; CCL21(1-81) (aa 1-81 de CCL21 humana) usando os ensaios descritos acima (vide FIG.15). Para esta finalidade, os so- brenadantes a partir de células HEK293 transfectadas pelo plasmídeo de expressão foram gerados e analisados (vide FIG.16). Em uma últi- ma etapa, os sobrenadantes foram comparados a partir de células HEK293 infectadas com VSV-GP, VSV-GP-huCCL21 (comprimento total) e VSV-GP-huCCL21(1-79) ao se usar os ensaios de migração Transwell descritos acima e moDCs como células de resposta. Neste ensaio, ambas CCL21 humana de comprimento total e CCL21(1-79) resultaram em migração comparável de moDC (vide FIG.17). Exemplo 5.4
[00290] Reatividade cruzada das espécies (humana para camun- dongo & rato) in vitro
[00291] Transwell (células T) (FIG.13)
[00292] Para confirmar a reatividade cruzada das espécies da CCL21 humana ao receptor de CCL21 de camundongo e rato (CCR7), o ensaio de migração Transwell descrito acima foi usado com células T de camundongo (esquerda) ou rato (direita) como respondedores (vide FIG.13). Os ensaios de migração foram realizados usando qui- miocinas recombinantes humanas vs. de camundongo (esquerda) e humanas vs. rato (direito) nas concentrações indicadas (fundo do po- ço). Em conclusão, a CCL21 humana estava ativa no sistema de ca- mundongo e rato como as correspondentes quimiocinas de camun- dongo e rato respectivamente, indicando que a molécula humana pode ser testada em modelos pré-clínicos em roedor (camundongo/rato). Exemplo 6:
[00293] Expressão de CCL21 na carga in vivo
[00294] RNAseq (FIG.10)
[00295] A expressão de CCL21 viralmente codificada foi analisa- da/confirmada nos tumores de roedores em controle ou tumores infec- tados com VSV-GP resp. VSV-GP-muCCL21. Para esta finalidade, camundongos C57BL/6 com tumores estabelecidos LLC1-IFNARKO foram usados como controles ou tratados com uma injeção única i.v. de 1x108 TCID50 de VSV-GP ou VSV-GP-muCCL21. Sete dias depois do tratamento, os tumores foram ressectados; RNA total foi extraído e analisado usando RNAseq. CD3epsilon e CXCL10 foram usados como comparadores. A CCL21 viralmente codificada foi especificamente de- tectada usando a sequência de DNA códon-otimizada como uma leitu- ra (vide FIG.10). Exemplo 6.1:
[00296] Carência de neurotoxicidade de VSV-GP e VSV-GP-CCL21
[00297] Sobrevivência (FIG.11)
[00298] As infecções de VSV do tipo selvagem podem causar sin- tomas neurológicos quando o vírus chega ao cérebro. Essas compli-
cações neurológicas incluem uma encefalite grave que pode levar à morte do indivíduo infectado. A vantagem de usar um VSV-GP quimé- rico é que a infecção neuronal se mostrou quase completamente au- sente tornando a estrutura principal de VSV um agente oncolítico se- guro. Entende-se que a razão do fenótipo atenuado seja devido a um tropismo de vírus alterado facilitado pela glicoproteína de envelope vi- ral. Embora a infecção neuronal e a propagação de VSV-GP no cére- bro não seja observada, não está claro que a expressão genética viral em outros tipos celulares como células glia ou astrócitos por exemplo seja completamente faltante. A expressão acidental do transgene de CCL21 por VSV GP deve atrair células imunes causando efeitos ad- versos dentro do cérebro e assim uma avaliação da neurotoxicidade de VSV-GP-muCCL21 foi feita.
[00299] Os camundongos suíços CD-1 receberam uma única inje- ção intracraniana de 3μl contendo 1x106 TCID50 através da injeção es- tereotática no estriado direito. PBS foi administrado i.c. no grupo con- trole. Os animais foram monitorados diariamente quanto a sinais de neurotoxicidade e bem-estar em geral. A sobrevivência dos grupos ex- perimentais com PBS (pontos), VSV-G DsRed (losangos), VSV-GP (quadrados), e VSV-GP muCCL21 foi classificada como curvas Ka- plan-Meier (FIG.11B). A análise de Kaplan-Meier indica que nenhuma das variantes virais testadas mostraram neurotoxicidade em camun- dongos. Apenas o grupo controle VSV-G DsRed, que continha a glico- proteína de VSV do tipo selvagem na superfície do vírus mostrou uma perda de peso acentuada (FIG.11A), desenvolveu sinais neurológicos levando à eutanásia dentro da primeira semana depois da infecção i.c.. Exemplo 6.2
[00300] Eficácia in vivo de VSV-GP e VSV-GP-CCL21
[00301] Crescimento tumoral (FIG.14)
[00302] O potencial terapêutico de VSV-GP e VSV-GP-huCCL21 foi avaliado/comparado usando o modelo tumoral CT26.CL25-IFNARKO tumor model. Para esta finalidade, tumores estabelecidos foram trata- dos com duas injeções i.v. (dia 0 e 3) de 2x107 de TCID50 VSV-GP ou VSV-GP-huCCL21. A sobrevivência de camundongos tratados con- forme indicado é apresentada na FIG. 14. Exemplo 6.3
[00303] Eficácia in vivo de VSV-GP-huCCL21 e VSV-GP-CCL21(1- 79)
[00304] Crescimento/sobrevivência do tumor (FIG.20/21)
[00305] O potencial terapêutico de VSV-GP-huCCL21 e VSV-GP- huCCL21(1-79) foi avaliado/comparado usando o modelo tumoral CT26.CL25-IFNARKO. Para esta finalidade, tumores estabelecidos foram tratados com duas injeções i.v. (dia 0 e 3) de 2x107 de TCID50 VSV-GP-huCCL21 ou VSV-GP-huCCL21(1-79). O crescimento tumo- ral cumulativo assim como a sobrevivência de 30 dias dos camundon- gos tratados conforme indicado são apresentados na Figura 20/21. O tratamento com a variante CCL21 curta (CCL21(1-79)), corresponden- do à plasmina totalmente processada (menos aa 80/81) e forma de CCL21 humana livremente difundível, foi capaz de melhor controlar o crescimento tumoral e melhorar a sobrevivência quando comparado com a variante VSV-GP que carrega CCL21 de comprimento total. Exemplo 6.4
[00306] MoA: Infiltração nas células T induzida por VSV-GP- huCCL21 e VSV-GP-huCCL21(1-79)
[00307] IHC (FIG.22/23)
[00308] Os tumores tratados como no Exemplo 6.3 foram analisa- dos quanto à infiltração nas células T. As seções de tumor FFPE foram marcadas por CD4 e CD8 assim como VSV-N e clivadas Caspase3. As células T totais (células CD4+ & CD8+) nas áreas tumorais viáveis
(não necróticas) foram quantificadas. Conforme apresentado na FIG.22, a variante CCL21 curta (CCL21(1-79)), correspondendo à plasmina totalmente processada (menos aa 80/81) e forma livremente difundível de CCL21 humana, foi capaz de atrair mais células T no tu- mor, provendo uma explicação para o aumento observado em eficácia (Exemplo 6.3).
[00309] Adicionalmente, CCL21 expressada viralmente foi capaz de atrair células dendríticas (CD11c positivas) nos tumores CT26.CL25 infectados. Os tumores estabelecidos CT26.CL25 foram localmente injetados (i.t.) com 2x107 TCID50 de VSV-GP ou VSV-GP-muCCL21 no dia 0 e 3. As seções de FFPE dos respectivos tumores foram analisa- das quanto à infiltração da célula dendrítica (áreas tumorais com repli- cação viral ativa = margem necrótica) (vide FIG. 24). Exemplo 7
[00310] Eficácia: combo de VSV-GP e VSV-GP-CCL21 com SMACm
[00311] Crescimento/sobrevivência do tumor (FIG.7-9)
[00312] Baseado nos dados animadores a partir da combinação de VSV-GP e um anticorpo de bloqueio PD-1 (Exemplo 2) as combina- ções adicionais de VSV-GP (FIG.7/9) e VSV-GP-muCCL21 (FIG.8/9) foram testadas com um mimético de SMAC (SMACm), um modulador das vias de morte celular que torna os tumores mais suscetíveis a es- tímulos/agentes de indução da morte celular. A interação terapêutica dos compostos foi analisada usando o modelo tumoral CT26.CL25- IFNARKO. Para esta finalidade, camundongos Balb/c com tumores estabelecidos CT26.CL25-IFNARKO receberam um tratamento i.v. único com 4x106 TCID50 de VSV-GP resp. VSV-GP-muCCL21 e/ou 100mg/kg de um SMACm dado diariamente (p.o.) por um período de duas semanas, iniciando no mesmo dia que o tratamento com VSV- GP resp. VSV-GP-muCCL21. A combinação de VSV-GP e SMACm resultou na eficácia melhorada quando se compara com as monotera- pias correspondentes.
Quando se combina VSV-GP-muCCL21 com um SMACm, os efeitos combinatórios foram ainda mais pronunciados resultando na cura de todos os animais tratados.

Claims (53)

REIVINDICAÇÕES
1. Rhabdovírus recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica no seu genoma pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana.
2. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado pelo fato de que a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) uma proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) uma proteína CCL21c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, ou (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:5.
3. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um vesiculovírus.
4. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 3, caracterizado pelo fato de que o vesiculovírus é selecionado a partir do grupo compreendendo: vírus da estomatite vesicular alagoa- na (VSAV), vírus Carajás (CJSV), vírus Chandipura (CHPV), vírus co- cal (COCV), vírus da estomatite vesicular Indiana (VSIV), vírus Isfahan (ISFV), vírus Maraba (MARAV), vírus da estomatite vesicular de Nova Jersey (VSNJV) ou vírus Piry (PIRYV).
5. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 3, caracterizado pelo fato de que é um vírus da estomatite vesicu- lar, preferivelmente um vírus da estomatite vesicular Indiana (VSIV) ou vírus da estomatite vesicular de Nova Jersey (VSNJV).
6. Rhabdovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o rhab- dovírus é competente na replicação.
7. Rhabdovírus recombinante de acordo com qualquer rei- vindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o rhabdovírus (i) carece de uma codificação genética funcional para glico- proteína G, e/ou (ii) carece de uma glicoproteína funcional G.
8. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 7, caracterizado pelo fato de que (i) a codificação genética para a glicoproteína G é substituí- da pela codificação genética para a glicoproteína GP de um outro ví- rus, e/ou (ii) a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de um outro vírus.
9. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 8, caracterizado pelo fato de que (i) a codificação genética para a glicoproteína G é substituí- da pela codificação genética para a glicoproteína GP de um arenaví- rus, e/ou (ii) a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de um arenavírus.
10. Rhabdovírus recombinante de acordo com a reivindica- ção 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que (i) a codificação genética para a glicoproteína G é substituí- da pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus Dande-
nong ou vírus Mopeia, e/ou (ii) a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de vírus Dandenong ou vírus Mopeia.
11. Rhabdovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que (i) a codificação genética para a glicoproteína G é substituí- da pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da cori- omeningite linfocitária (LCMV), e/ou (ii) a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de LCMV.
12. Vírus de estomatite vesicular recombinante, caracteri- zado pelo fato de que codifica no seu genoma pelo menos uma proteí- na CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) uma proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) uma proteína CCL21 c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que a codificação genética para a glicoproteína G do ví- rus da estomatite vesicular recombinante é substituída pela codifica-
ção genética para a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfo- citária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de LCMV.
13. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica a proteína CCL21 processada por plasmina.
14. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica a proteína CCL21 c-terminalmente truncada.
15. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2.
16. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3.
17. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4.
18. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica uma proteína que compreende uma proteína de acordo com qual- quer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal.
19. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1.
20. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o genoma codi- fica uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:5.
21. Vírus de estomatite vesicular recombinante, caracteri- zado pelo fato de que codifica no seu genoma pelo menos uma nucle- oproteína de vírus da estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fos- foproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21ou uma variante funcional da mesma, preferivel- mente CCL21 humana.
22. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a nucleoproteí- na (N) compreende uma sequência de aminoácido conforme apresen- tada na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7.
23. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a fosfo- proteína (P) compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentada na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:8.
24. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a proteína grande (L) compreende uma sequência de aminoá- cido conforme apresentada na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:9.
25. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que a proteína matriz (M) compreende uma sequência de aminoá- cido conforme apresentada na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcio-
nal pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
26. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que: - a nucleoproteína (N) compreende uma sequência de ami- noácido conforme apresentada na SEQ ID NO:7 ou uma variante fun- cional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7 - em que a fosfoproteína (P) compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentada na SEQ ID NO:8 ou uma varian- te funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idênti- ca à SEQ ID NO:8 - em que a proteína grande (L) compreende uma sequência de aminoácido conforme apresentada na SEQ ID NO:9 ou uma varian- te funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idênti- ca à SEQ ID NO:9, e - a proteína matriz (M) compreende uma sequência de ami- noácido conforme apresentada na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
27. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado pelo fato de que é competente na replicação.
28. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de que (i) carece de uma codificação genética funcional para glico- proteína G, e/ou (ii) carece de uma glicoproteína funcional G.
29. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que (i) a codificação genética para a glicoproteína G é substituí- da pela codificação genética para a glicoproteína GP de um outro ví- rus, e/ou (ii) a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de um outro vírus.
30. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29, caracterizado pelo fato de que (i) a codificação genética para a glicoproteína G é substituí- da pela codificação genética para a glicoproteína GP do vírus da cori- omeningite linfocitária (LCMV), e/ou (ii) a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de LCMV.
31. Vírus da estomatite vesicular recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 30, caracterizado pelo fato de que a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é seleciona- da a partir do grupo compreendendo: (i) uma proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) uma proteína CCL21 c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal,
(vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:5.
32. Vírus de estomatite vesicular recombinante, caracteri- zado pelo fato de que codifica no seu genoma uma nucleoproteína do vírus da estomatite vesicular (N), proteína grande (L), fosfoproteína (P), proteína matriz (M), glicoproteína (G) e pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, em que a proteína CCL21 ou variante funcional da mesma é selecionada a partir do grupo compreendendo: (i) uma proteína CCL21 processada por plasmina, (ii) uma proteína CCL21c-terminalmente truncada, (iii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:2 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2, (iv) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:3 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3, (v) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:4 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:4, (vi) uma proteína de acordo com qualquer uma de (i) – (v) compreendendo ainda uma sequência peptídica de sinal, (vii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:1 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:1, (viii) uma proteína que compreende a SEQ ID NO:5 ou que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:5, em que a codificação genética para a glicoproteína G do ví- rus de estomatite vesicular é substituída pela codificação genética pa- ra a glicoproteína GP do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV), e/ou a glicoproteína G é substituída pela glicoproteína GP de LCMV, em que
- a nucleoproteína (N) compreende um aminoácido confor- me apresentado na SEQ ID NO:7 ou uma variante funcional pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:7 - em que a fosfoproteína (P) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:8 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:8 - em que a proteína grande (L) compreende um aminoácido conforme apresentado na SEQ ID NO:9 ou uma variante funcional pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:9 - a proteína matriz (M) compreende um aminoácido confor- me apresentado na SEQ ID NO:10 ou uma variante funcional pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% idêntica à SEQ ID NO:10.
33. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um rhabdovírus recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 ou um vírus de estomatite vesicular recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 32.
34. Rhabdovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, vírus de estomatite vesicular recombi- nante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zados pelo fato de que são para uso como um medicamento.
35. Rhabdovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, vírus de estomatite vesicular recombi- nante de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zados pelo fato de que são para uso no tratamento de câncer, preferi- velmente cânceres sólidos.
36. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizados pelo fato de que o câncer sóli- do é selecionado a partir da lista compreendendo: tumor reprodutivo, um tumor ovariano, um tumor testicular, um tumor endócrino, um tu- mor gastrointestinal, um tumor pancreático, um tumor hepático, um tumor renal, um tumor de cólon, um tumor colorretal, um tumor de be- xiga, um tumor de próstata, um tumor de pele, melanoma, um tumor respiratório, um tumor pulmonar, um tumor de mama, um tumor de ca- beça e pescoço, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) e um tumor ósseo.
37. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante ou a composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizados pelo fato de que o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinante, ou a composição farmacêutica devem ser administra- dos de forma intratumoral ou intravenosa.
38. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante ou a composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizados pelo fato de que o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinante ou a composição farmacêutica devem ser administrados pelo menos uma vez de forma intratumoral e subsequentemente de forma intravenosa.
39. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizados pelo fato de que a administra- ção intravenosa subsequente é dada 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 di- as, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias ou 31 dias depois da administração intratumoral inicial.
40. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de um rhabdovírus recombinante ou um vírus de estomatite vesicular recombinante como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes e ainda um inibidor da via PD-1 ou um mimético de SMAC.
41. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizada pelo fato de que o inibidor da via PD-1 é um anticorpo antago- nista, que é direcionado contra PD-1 ou PD-L1.
42. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizada pelo fato de que o mimético de SMAC é selecionado a partir do grupo consistindo em qualquer um dos compostos 1 a 26: 1 N
O N
N N
HN H
N O 2 O
N N
N
O
N N
HN H
N O 3 N
O N
N N
HN H
N 4 N
O N
N N
HN H
N
5 N
O N
N N
HN H
N 6 F
N
N
O
N N
HN H
N 7
N
N
O
N N
HN H
N N 8
N
N
O
N N
H N
HN 9
N
N
O
N N
HN H 10 N
N
O N
N N
HN H
11 N O
N
O N
N N
HN H
N 12 N
N
O N
N N
HN H
N 13 N
N
N
O N
N N
HN H
N 14 N
N N
O N
N N
HN H
N
N 15
N
O N
N N
HN H
N 16 N
N
O N
N N
HN H
N
17 N
N
N
O N
N N
HN H
N 18 N
O N
O N
N N
HN H
N 19 O
N
N
O N
N N
HN H
N 20 N O
N
O N
N N
HN H
N O 21 N
N
O N
N N
HN H
22 N
N
N
O N
N N
HN H
N O 23 N
O N
O N
N N
HN H
N O 24 O
N
N
O N
N N
HN H
N O 25 N O
N N Cl
O
N N
HN H
N 26
N O
N
N
O
N N
HN H
N ou um sal farmaceuticamente aceitável de um desses compostos.
43. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizada pelo fato de que o inibidor da via PD-1 é um antagonista seleci-
onado a partir do grupo consistindo em pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5.
44. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreen- de: a) um rhabdovírus recombinante, um vírus de estomatite vesicular recombinante ou uma composição farmacêutica como defini- dos em qualquer uma das reivindicações precedentes, e b) um inibidor da via PD-1 ou mimético de SMAC como de- finidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
45. Rhabdovírus recombinante, um vírus de estomatite ve- sicular recombinante ou uma composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizados pelo fato de que em combinação com um inibidor da via PD-1 ou um mimético de SMAC.
46. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante, ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizados pelo fato de que o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinante, ou a composição farmacêutica são administrados de forma concomitante, sequencial ou alternada com o inibidor da via PD-1 ou o mimético de SMAC.
47. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante, ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizados pelo fato de que o mimé- tico de SMAC é selecionado a partir do grupo consistindo em qualquer um dos compostos 1 a 26 como definidos na reivindicação 42 ou um sal farmaceuticamente aceitável de um desses compostos.
48. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante, ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizados pelo fato de que o inibi- dor da via PD-1 é selecionado a partir do grupo consistindo em pem- brolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 e PD1-5.
49. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante, ou a composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizados pelo fato de que o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinante, ou a composição farmacêutica são administrados atra- vés de uma forma de administração diferente do que o inibidor da via PD-1 ou o mimético de SMAC.
50. Rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesi- cular recombinante, ou a composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizados pelo fato de que o rhabdovírus recombinante, o vírus da estomatite vesicular recombinante, ou a composição farmacêutica são administrados pelo menos uma vez de forma intratumoral e o inibidor da via PD-1 ou o mimético de SMAC é administrado de forma intravenosa.
51. Célula produtora de vírus, caracterizada pelo fato de que a célula produz um rhabdovírus recombinante ou vírus da estoma- tite vesicular recombinante como definidos em qualquer uma das rei- vindicações precedentes.
52. Célula que produz vírus de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula Vero, uma cé- lula HEK, uma célula HEK293, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula renal de hamster bebê (BHK).
53. Rhabdovírus recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica no seu genoma de RNA pelo menos uma proteína CCL21 ou uma variante funcional da mesma, preferivelmente CCL21 humana, em que o genoma do RNA do rhabdovírus recombinante compreende ou consiste em uma sequência codificadora idêntica ou pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 24.
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