TW202413634A - 溶瘤痘瘡病毒及重組病毒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供展現增強的抗腫瘤性質及/或降低的免疫原性之痘瘡病毒之純系株,及衍生自其之重組痘瘡病毒。本文亦提供重組溶瘤病毒株,其包括一或多種病毒基因之不活化突變及/或各自編碼一或多種異源基因產物之一或多種異源核酸。本文所提供之病毒、例如痘瘡病毒、包括重組痘瘡病毒可作為溶瘤病毒療法、例如溶瘤痘瘡病毒療法使用來治療癌症。本文亦提供用於治療癌症之該等病毒、例如痘瘡病毒之醫藥組合物及方法以及用途,以及編碼該等病毒之核酸。
Description
本揭示案提供展現增強的抗腫瘤性質及/或降低的免疫原性之痘瘡病毒之純系株,及衍生自其之重組痘瘡病毒。本揭示案之痘瘡病毒(包括重組痘瘡病毒)可作為溶瘤痘瘡病毒療法使用來治療癌症。本揭示案亦提供用於治療癌症之痘瘡病毒之醫藥組合物及方法以及用途。
痘瘡係溶瘤病毒且在腫瘤中累積。在一些情形下,溶瘤病毒(OV)係在癌細胞中比在非癌細胞中選擇性或更有效複製之病毒。溶瘤痘瘡病毒包括重組病毒,其係藉由基因破壞或基因添加自天然病毒改造而成以改良其抗腫瘤性質,例如腫瘤細胞中之腫瘤選擇性或優先複製、宿主向性、表面附著、溶解及擴散。在該等重組痘瘡病毒中,減毒病毒之一或多個病毒基因經修飾,導致病毒基因之喪失或減少的表現或病毒蛋白之不活化。然而,病毒誘導之強免疫反應會阻礙溶瘤病毒之有效性。諸如抗體之免疫因子藉由直接與病毒結合並防止細胞之成功感染或藉由補體或其他免疫細胞標記其破壞來中和病毒。因此,業內仍需要具有降低的誘導抗病毒防禦之能力且具有增強的抗腫瘤活性之改良的溶瘤痘瘡病毒。
本文提供重組溶瘤痘瘡病毒,其包含:B2R之不活化突變;編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。
在一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸。在一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9之異源核酸及編碼IL-12之異源核酸。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:CXCL9係人類CXCL9且包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,CXCL9係小鼠CXCL9且包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:IL-12係人類單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-12係小鼠單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼IL-2之異源核酸。在一些實施例中,IL-2包含SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2係IL-2超因子。在一些實施例中,IL-2超因子係H9、H9T、MDNA11或MDNA11T。在該等實施例中任一者之一些實施例中,H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,MDNA11 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,MDNA11T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2超因子係MDNA11T,且MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒進一步包含一或多種選自由以下組成之群之異源基因產物:補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,B2R之不活化突變係B2R基因座之全部或一部分缺失。在該等實施例中任一者之一些實施例中,該缺失足以使經編碼之B2R基因產物無功能。在該等實施例中任一者之一些實施例中,B2R之不活化突變之特徵在於編碼IRF3之異源核酸及/或編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸中之至少一者插入B2R基因座中。在該等實施例中任一者之一些實施例中,B2R之不活化突變之特徵在於編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸插入B2R基因座中。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體中之HA、J2R、F14.5L、A56R、痘瘡生長因子、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體係自母體痘瘡病毒修飾而來,該母體痘瘡病毒具有與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列、視情況地SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,母體痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;(ii)變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;(iii)變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;(iv)變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及(v)變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,母體病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);(ii)對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);(iii)對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;(iv)對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;(v)對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);(vi)對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;(vii)對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;(viii)對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);(ix)對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及(x)對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之J2R (胸苷激酶)基因座中;且編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸,其中編碼CXCL9及IL-12之異源核酸插入病毒基因體中之A56R基因座中。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之B2R (病毒cGAMP特異性核酸酶)基因座中;且編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸,其中編碼CXCL9及IL-12之異源核酸插入病毒基因體中之A56R基因座中。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒進一步包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型死亡效應結構域(iDED)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,iDED包含SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼iDED之異源核酸插入病毒基因體中之J2R基因座中或替代該基因座。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒進一步包含編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之異源核酸。在一些實施例中,一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。在一些實施例中,由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含:(i) SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,(ii) SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及(iii) SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 22中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒進一步包含編碼補體抑制劑之異源核酸。在一些實施例中,補體抑制劑係
伯氏疏螺旋體 (Borrelia burgdorferi)補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)。在一些實施例中,編碼CRASP-2之異源核酸與病毒膜基因、視情況地F14.5L融合,以產生編碼融合蛋白之融合基因。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,融合蛋白包含融合至由病毒膜基因編碼之病毒膜蛋白之CRASP-2。在該等實施例中任一者之一些實施例中,病毒膜蛋白係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L之C末端。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之B2R (病毒cGAMP特異性核酸酶)基因座中或替代該基因座;且編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼IL-2之異源核酸,其中IL-2係IL-2超因子,即MDNA11T。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒進一步包含編碼免疫刺激蛋白之異源核酸,及/或編碼一或多種抗血管生成蛋白之異源核酸。在一些實施例中,免疫刺激蛋白係重組LIGHT。在一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:30中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、Versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白包含抗VEGF抗體及/或抗Ang2抗體。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中,雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:23中所述之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼異源基因產物之一或多種異源核酸可操作地連接至啟動子,視情況地其中可操作地連接至啟動子之編碼異源基因產物之一或多種異源核酸中之每一者選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至啟動子,視情況地其中編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係痘病毒啟動子或係其變異體或衍生物。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係痘瘡病毒啟動子。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子具有SEQ ID NO: 29、53、55、68、69、70、71或72中之任一者中所述之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係合成強早期啟動子(SSE)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子包含SEQ ID NO:29中所述之序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子包含SEQ ID NO:55中所述之序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係mH5。在該等實施例中任一者之一些實施例中,mH5啟動子包含SEQ ID NO: 53中所述之序列。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,溶瘤病毒係痘瘡病毒、單純疱疹病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒(Maraba virus,MARAV)、麻疹病毒(MV)、腺病毒、黏液病毒、羊痘病毒、小病毒、浣熊痘病毒、柯沙奇病毒(coxsackievirus)、里奧病毒(reovirus)、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)、塞內卡谷病毒(Seneca valley virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、腮腺炎病毒、流感病毒、埃可病毒(echovirus)及小兒麻痺病毒(PV)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,溶瘤病毒係痘瘡病毒。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體係自母體痘瘡病毒修飾而來,該母體痘瘡病毒具有與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列、視情況地SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫調節蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含:自母體痘瘡病毒修飾而來之核酸基因體,該母體痘瘡病毒基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少99%序列一致性;且包含插入基因體中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,母體痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;(ii)變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;(iii)變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;(iv)變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及(v)變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,母體痘瘡病毒基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);(ii)對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);(iii)對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;(iv)對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;(v)對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶©;(vi)對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;(vii)對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;(viii)對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);(ix)對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及(x)對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,且其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;(ii)變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;(iii)變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;(iv)變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;且(v)變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,且其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);(ii)對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);(iii)對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;(iv)對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;(v)對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);(vi)對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;(vii)對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;(viii)對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);(ix)對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及(x)對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體中之非必需基因或區域中。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。在該等實施例中任一者之一些實施例中,插入病毒基因體中之非必需基因或區域中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之每一者各自獨立地插入病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含一或多種選自由以下組成之群之病毒基因:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L及其任一組合。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含:(i) B2R;(ii) A35R;(iii) A35R及J2R;(iv) J2R;(v) B2R及J2R;(vi) A35R、B2R及J2R;(vii) B2R、J2R及A56R;或(viii) A35R、B2R、J2R及A56R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變獨立地藉由以下方式來實現:納入編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者;至少一種病毒基因之全部或一部分缺失;及/或至少一種病毒基因中之一或多個核酸取代。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。在該等實施例中任一者之一些實施例中:缺失足以使經編碼之病毒基因產物無功能。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變之特徵在於編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因座中。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含B2R。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含J2R。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含A35R。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含A56R。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含B2R、J2R及A35R。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含B2R、J2R、A35R及A56R。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因包含B2R、J2R及A56R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入F14.5L中或替代F14.5L;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入A35R中或替代A35R;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入J2R中或替代J2R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含一或多種免疫刺激蛋白。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含一或多種細胞介素及/或趨化介素。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含一或多種干擾素調節因子,視情況地IRF3。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種干擾素調節因子係或包含干擾素調節因子3 (IRF3)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含干擾素調節因子3 (IRF3)及一或多種細胞介素及/或趨化介素。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含一或多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白。在該等實施例中任一者之一些實施例中:CXCL9係人類CXCL9。在該等實施例中任一者之一些實施例中:CXCL9係人類CXCL9且包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,CXCL9係小鼠CXCL9。在該等實施例中任一者之一些實施例中,CXCL9係小鼠CXCL9且包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:IL-12係人類單鏈IL-12。在該等實施例中任一者之一些實施例中:IL-12係人類單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-12係小鼠單鏈IL-12。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-12係小鼠單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含IRF3。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IRF3係人類IRF3 (hIRF3)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,hIRF3包含SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IRF3係小鼠IRF3 (mIRF3)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,mIRF3包含SEQ ID NO: 52中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含IRF3及一或多種選自由LIGHT、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含IL-2。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含IL-12。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含LIGHT。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含CXCL9。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白係或包含:(i) IRF3;(ii) LIGHT;(iii) IRF3及LIGHT;(iv) IRF3及IL-2;(v) IRF3、CXCL9及IL-12;(vi) IRF3、LIGHT及IL-2;(vii) IRF3及CXCL9;或(viii) IRF3、CXCL9及IL-2。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2係人類IL-2。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2係IL-2超因子。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2超因子係H9、H9T、MDNA11或MDNA11T。在該等實施例中任一者之一些實施例中:H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或MDNA11 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或MDNA11T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2超因子係MDNA11或MDNA11T。在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-2超因子係MDNA11T,且MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,LIGHT係重組LIGHT。在一些實施例中,重組LIGHT係人類LIGHT蛋白或係其突變體。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組LIGHT包含與SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組LIGHT係人類LIGHT突變體(hmLIGHT),其係結合人類及小鼠LTβR及HVEM之人類LIGHT突變體。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組LIGHT包含一或多個選自由以下組成之群之突變:位置138之蘇胺酸、位置160之甘胺酸、位置221之甘胺酸及位置222之離胺酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 25中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25中所述之序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 11、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,IL-12係人類IL-12。在一些實施例中,人類IL-12係人類單鏈IL-12 (hscIL-12)。在一些實施例中,hscIL-12包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,CXCL9係人類CXCL9。在一些實施例中,人類CXCL9包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現。在該等實施例中任一者之一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。在該等實施例中任一者之一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V,視情況地其中FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽(Rimiducid))。在一些實施例中,促細胞凋亡分子係或包含Fas、含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)或半胱天冬酶,視情況地其中半胱天冬酶係半胱天冬酶9。在該等實施例中任一者之一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,iDED包含SEQ ID NO: 27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 27中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8或86中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 8或86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型Fas (iFas)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,iFas包含SEQ ID NO: 28中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 28中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型半胱天冬酶9 (iCas9)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,iCas9包含SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含一組蛋白質,其係或包含CPXV012、CPXV203及CPXV018蛋白。在該等實施例中任一者之一些實施例中,由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含:(i) SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,(ii) SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及(iii) SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 22中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22中所述之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 10、89及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10、89及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸來實現。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種補體抑制劑係
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)及/或最小化補體調節因子H (miniFH)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種補體抑制劑係或包含CRASP-2。在該等實施例中任一者之一些實施例中,CRASP-2包含SEQ ID NO: 18中所述之胺基酸序列,或具有與SEQ ID NO:18中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種補體抑制劑係或包含miniFH。在該等實施例中任一者之一些實施例中,miniFH包含SEQ ID NO: 19中所述之胺基酸序列,或具有與SEQ ID NO:19中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,將編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸引入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因。在一些實施例中,融合蛋白包含融合至由病毒膜基因編碼之病毒膜蛋白之補體抑制劑。在該等實施例中任一者之一些實施例中,病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端。在該等實施例中任一者之一些實施例中,融合蛋白納入細胞內成熟病毒(IMV)之外膜中。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白係VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、Versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或血管生成素抑制劑,視情況地Ang2抑制劑。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白包含抗VEGF抗體及/或抗Ang2抗體。在該等實施例中任一者之一些實施例中,VEGF抑制劑係抗VEGF抗體,視情況地抗VEGF單鏈抗體(scAb)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,血管生成素抑制劑係抗血管生成素-2 (Ang2)抗體,視情況地抗Ang2單鏈抗體(scAb)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。在該等實施例中任一者之一些實施例中,雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含中所述之胺基酸序列SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:23中所述之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白包含Versikine。在該等實施例中任一者之一些實施例中,Versikine包含SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 24中所述之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 13、47、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13、47、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸來實現。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種治療劑或診斷劑尤其選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、用於組織再生及將人類體細胞再程式化成多能性之基因、修飾受質以產生可偵測之產物或信號或可由抗體偵測到之酶、可結合對比劑之蛋白質、用於光學成像或偵測之基因、用於PET成像之基因及用於MRI成像之基因。在該等實施例中任一者之一些實施例中,一或多種治療劑或診斷劑包含尤其選自以下之治療劑:激素、生長因子、細胞介素、趨化介素、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制劑、腫瘤抑制因子、細胞毒性蛋白、細胞生長抑制蛋白及組織因子。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含A35R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 3之核酸序列,或與SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 12之核酸序列,或與SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質,且其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸,將該一或多種異源核酸引入病毒膜基因中以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端,且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 10之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 4之核酸序列,或與SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 11之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 13之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 47之核酸序列,或與SEQ ID NO: 47中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)、誘導型Fas (iFas)或誘導型Cas9 (iCas9),視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 7、8或9之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7、8或9中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50或93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50或93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48之核酸序列,或與SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 80之核酸序列,或與SEQ ID NO: 80中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A35R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;B2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 82之核酸序列,或與SEQ ID NO: 82中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2,視情況地其中IL-2係IL-2超因子,視情況地MDNA11;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 84之核酸序列,或與SEQ ID NO: 84中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED);且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 87之核酸序列,或與SEQ ID NO: 87中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11T,視情況地其中MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子,視情況地MDNA11或MDNA11T;編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將其導入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 89之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將其導入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 91之核酸序列,或與SEQ ID NO: 91中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含B2R、J2R及A56R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 92之核酸序列,或與SEQ ID NO: 92中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼異源基因產物之一或多種異源核酸可操作地連接至啟動子。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,可操作地連接至啟動子之編碼異源基因產物之一或多種異源核酸中之每一者選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在該等實施例中任一者之一些實施例中,編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至啟動子,視情況地其中編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係痘病毒啟動子或係其變異體或衍生物。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係痘瘡病毒啟動子。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子具有SEQ ID NO: 29、53、55、68、69、70、71或72中之任一者中所述之胺基酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係合成強早期啟動子(SSE)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,SSE啟動子包含SEQ ID NO:29中所述之序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,SEL啟動子包含SEQ ID NO:55中所述之序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,啟動子係mH5。在該等實施例中任一者之一些實施例中,mH5啟動子包含SEQ ID NO: 53中所述之序列。
本文亦提供經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;(ii)變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;(iii)變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;(iv)變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及(v)變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i),且變異體017 ORF編碼與SEQ ID NO:57具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i),且變異體017 ORF編碼SEQ ID NO: 57中所述之胺基酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(ii),且核苷酸插入係對應於SEQ ID NO:1之核苷酸位置32135後之插入的鳥嘌呤(G),視情況地其中變異體038 (K5L) ORF闡述於SEQ ID NO: 58中。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(ii),且038 (K5L)基因產物闡述於SEQ ID NO:59中。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(iii),且變異體059 (E2L) ORF編碼與SEQ ID NO:60具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(iii),且變異體059 (E2L) ORF編碼SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(iv),且104 (H4L) ORF編碼與SEQ ID NO:61具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(iv),且其中變異體104 (H4L) ORF編碼SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(v),且兩個核苷酸缺失係對應於SEQ ID NO:2之核苷酸位置165972後之核苷酸的兩個連續核苷酸缺失,視情況地其中變異體182 (A56R)闡述於SEQ ID NO: 62中。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(v),且VACV蛋白闡述於SEQ ID NO:63中。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任兩者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任三者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任四者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之每一者。
本文亦提供經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:(i)對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);(ii)對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);(iii)對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;(iv)對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;(v)對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);(vi)對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;(vii)對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;(viii)對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);(ix)對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及(x)對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任兩者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任三者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任四者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任五者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任六者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任七者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任八者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任九者。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之每一者。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少96%序列一致性。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少97%序列一致性。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少98%序列一致性。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性。
本文亦提供經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.5%序列一致性。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.9%序列一致性。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.95%序列一致性。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體不包含SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體未經修飾以含有非病毒異源核酸,該非病毒異源核酸含有編碼非病毒異源蛋白之開放閱讀框。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,核酸基因體闡述於SEQ ID NO: 1中。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,視情況地如根據EEV之百分比所確定,其中EEV之百分比係藉由下式確定:上清液之病毒效價/ (上清液之病毒效價+細胞溶解物之病毒效價) *100。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,在細胞感染後超過5%之感染性粒子係EEV。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,在細胞感染後超過10%之感染性粒子係EEV。在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,在細胞感染後超過15%之感染性粒子係EEV。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒或純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,如藉由使至少5%、10%或15%百分比之感染性粒子係EEV所確定。
在任一該重組溶瘤病毒或任一該經分離之純系VACV株之該等實施例中任一者之一些實施例中,病毒展現殺傷腫瘤細胞之溶瘤活性。
本文亦提供VACV製劑,其包含本文所提供之任一經分離之純系VACV株之經分離之純系VACV株。
本文亦提供VACV製劑,其包含本文所提供之任一重組溶瘤痘瘡病毒。
本文亦提供重組溶瘤病毒製劑,其包含本文所提供之任一重組溶瘤病毒,其中製劑中至少70%、80%、90%、95%或98%之病毒粒子具有純系重組溶瘤病毒之基因體序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,VACV製劑實質上係均質的,其中製劑中之複數個病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,製劑中至少70%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,製劑中至少80%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,製劑中至少90%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,製劑中至少95%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,製劑中至少98%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
本文亦提供醫藥組合物,其包含本文所提供之任一經分離之VACV純系株。
本文亦提供醫藥組合物,其包含本文所提供之任一VACV。
本文亦提供醫藥組合物,其包含本文所提供之任一重組溶瘤痘瘡病毒。
本文亦提供重組痘瘡病毒(VACV)株,其包含含有至少一種病毒基因之不活化突變之本文所提供之任一VACV純系株之核酸基因體。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。在該等實施例中任一者之一些實施例中,不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因之缺失係病毒基因ORF之一部分缺失,且其中該缺失足以使經編碼之基因產物無功能。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含A35R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:3中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含J2R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:4中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含B2R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:12中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:48中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
本文亦提供核酸,其包含本文所提供之任一重組溶瘤病毒或本文所提供之任一經分離之VACV純系株的基因體。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含本文所提供之任一重組溶瘤病毒之核酸。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
本文亦提供醫藥組合物,其包含本文所提供之任一重組VACV株。
本文亦提供醫藥組合物,其包含本文所提供之任一重組溶瘤病毒,視情況地其中重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,醫藥組合物經調配用於靜脈內投與、腫瘤內投與、腹膜內投與或胸膜內投與。在該等實施例中任一者之一些實施例中,醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。在該等實施例中任一者之一些實施例中,醫藥組合物係液體組合物。在該等實施例中任一者之一些實施例中,醫藥組合物係凍乾的。
本文亦提供治療個體之增生性病症之方法,其包括向個體投與本文所提供之任一重組溶瘤病毒、本文所提供之任一經分離溶瘤病毒、或本文所提供之任一醫藥組合物。
在一些實施例中,增生性病症係腫瘤或轉移。在該等實施例中任一者之一些實施例中,增生性病症係癌症。在該等實施例中任一者之一些實施例中,癌症係胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、直腸癌、腎(腎臟)癌、胃癌、食管癌、肝(肝臟)癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、口癌(例如口腔癌)、子宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤,例如惡性黑色素瘤)、膽管癌(膽道癌)、胸腺上皮癌(例如胸腺瘤)、白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。在該等實施例中任一者之一些實施例中,癌症係微衛星穩定(MSS)結腸直腸癌。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒或經分離溶瘤病毒係以1 × 10
5pfu至1 × 10
14pfu之量投與。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,該方法進一步包括投與用於治療增生性病症之第二治療劑。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,該方法進一步包括尤其選自以下之另一治療:手術、輻射療法、免疫抑制療法及投與抗癌劑。在一些實施例中,另一治療係投與尤其選自以下之抗癌劑:細胞介素、趨化介素、生長因子、光激致效劑、毒素、抗癌抗生素、化學治療化合物、放射性核種、血管生成抑制劑、傳訊調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療劑及其前述任一者之組合。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒或經分離溶瘤病毒係靜脈內投與。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,該方法進一步包括向個體投與AP1903 (利米多賽)。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,投與個體之重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,個體展現重度免疫缺乏且對病毒感染敏感。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
本文亦提供抑制病毒複製之方法,該方法包括使經重組溶瘤病毒感染之細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
本文亦提供抑制病毒複製之方法,該方法包括使細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中細胞經本文所提供之任一重組溶瘤病毒、本文所提供之任一經分離溶瘤病毒、或本文所提供之任一重組溶瘤病毒(例如純系VACV株)感染。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,接觸在個體之活體內進行。在該等實施例中任一者之一些實施例中,已將AP1903 (利米多賽)投與先前投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒的個體。在該等實施例中任一者之一些實施例中,已將AP1903 (利米多賽)投與先前投與本文所提供之任一重組溶瘤病毒或本文所提供之任一經分離溶瘤病毒的個體。
本文亦提供抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中個體先前已投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒。
本文亦提供抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中個體先前已投與本文所提供之任一重組溶瘤病毒或本文所提供之任一經分離溶瘤病毒。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,該方法優先抑制非癌細胞中之病毒複製。在該等實施例中任一者之一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。在該等實施例中任一者之一些實施例中,iDED包含SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:27具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2022年7月8日提出申請之標題為「ONCOLYTIC VACCINIA VIRUSES AND RECOMBINANT VIRUSES AND METHODS OF USE THEREOF」之美國臨時申請案第63/368,029號的優先權,該臨時申請案之內容之全文出於所有目的皆以引用方式併入。
以引用方式併入序列表
本申請案係與電子格式之序列表一起提出申請。序列表以標題為773192000140SeqList.xml之檔案提供,創建於2023年7月6日,大小為6,262,578個位元組。序列表之電子格式中之資訊之全文皆以引用方式併入。
本文提供經分離之純系株,其展現與其他痘瘡病毒相比優異的抗致瘤活性及增強的逃避宿主免疫系統之潛能。具體而言,所提供之純系株係自ATCC®目錄號VR-156™獲得之母體IHD-J之純系分離物。亦提供由該經分離之純系株之繁殖產生之製劑。亦提供衍生自經分離之純系株之重組痘瘡病毒,其藉由修飾以缺失或減少病毒基因之表現或使病毒蛋白不活化來減毒。亦提供重組病毒,其經進一步改良以逃避宿主抗病毒防禦或具有進一步增強的抗腫瘤活性。舉例而言,該等重組病毒包含編碼蛋白質之異源核酸,以避開補體系統之抑制,逃避天然殺手(NK)或T細胞,納入免疫檢查點分子以增強免疫刺激活性,或提供抗血管生成活性。本文所提供之重組病毒亦包括裝備有病毒誘導系統以抑制病毒複製作為安全策略(例如藉由調介某些不期望感染之細胞(例如健康細胞)之細胞凋亡)之彼等病毒。特定而言,本文提供重組溶瘤痘瘡病毒,其包含:B2R之不活化突變;編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。在一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。特定而言,本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
溶瘤病毒(OV)係在癌細胞中比在非癌細胞中選擇性或更有效複製之病毒。在一些情形下,在愛惜健康細胞的同時選擇性感染癌細胞、在癌細胞內複製及破壞癌細胞之能力通常歸因於在感染期間利用健康細胞與轉型細胞之間的生物化學差異之能力。癌細胞之特徵在於經破壞之細胞凋亡路徑、獲得逃避免疫系統之新能力及無限增生之能力,所有特徵皆有利於病毒複製。由於癌症療法之一個主要挑戰係在最小化毒性效應的同時殺傷惡性細胞,故OV因其極少引起脫靶毒性而係吸引人之選擇。
溶瘤病毒可分成三大組:(1)具有優先在癌細胞中複製之天然傾向、同時在人類中無致病性之病毒,例如小病毒、黏液病毒、新城雞瘟病毒及里奧病毒;(2)經遺傳改造以確保在癌細胞中選擇性複製之病毒,例如腺病毒、HSV及水泡性口炎病毒;及(3)已藉由活體外繁殖減毒以在人類中安全使用之病毒。後一組包括衍生自痘瘡之溶瘤病毒,因其有效的複製、細胞溶解、擴散、宿主範圍及對腫瘤組織之天然向性亦係較佳的(Shen等人(2004) Mol. Ther., 11:180)。舉例而言,痘瘡病毒之複製及擴散比腺病毒載體更強效。
正痘病毒屬之原型成員痘瘡病毒(VV)在宿主細胞之細胞質中複製。VV係大的複雜的包膜病毒,其具有長度大約為190,000個鹼基對之線性雙股DNA基因體,由編碼可潛在地表現200多種蛋白質之大約250個基因之單一連續多核苷酸鏈構成。參見例如McCraith等人(1982) PNAS, 97(9):4879-4884。一般而言,非區段化、非感染性基因體經排列,使得位於中心之基因為病毒複製所必需(且因此係保守的),而兩個末端附近之基因實現更多的外圍功能,例如宿主範圍及毒力。痘瘡病毒藉由利用排列成組(一般原則係不重疊)之開放閱讀框(ORF)來實踐差異基因表現。參見例如Traktman, P.,第27章, Poxvirus DNA Replication,第775-798頁, DNA Replication in Eukaryotic Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)。VV快速複製之能力導致經感染之細胞有效溶解以及在連續幾輪複製後擴散至其他腫瘤細胞,從而導致腫瘤之深度局部破壞。VV基因體編碼約250個基因且可接受多達20 kb之外來DNA,使其成為理想的基因遞送媒劑。業內正在開發重組VV載體以將真核基因(例如腫瘤相關抗原)遞送至腫瘤,且因此促進誘導宿主免疫系統定向殺傷癌細胞。然而,使用VV作為癌症治療遞送載體之限制性因素係藉由將VV注射至血流中誘導之強中和抗體反應,此限制病毒持續存在及擴散之能力並防止載體再給藥。在一些情形下,中和抗體以高親和力識別並結合病毒糖蛋白且防止病毒與宿主細胞受體相互作用,從而導致病毒中和。
痘瘡病毒在經感染細胞之細胞質中複製,其中後代之裝配在稱為病毒工廠之特殊區域開始。在複製期間,產生三種形態及抗原性不同之病毒形式:細胞內成熟病毒體(IMV)、細胞內包膜病毒體(IEV)及細胞外病毒體。IMV之亞組係第一個產生之感染性後代,其運輸至跨高基氏體(Golgi)網絡(TGN),其中IMV之亞組經另外兩層膜包膜以產生IEV。IEV經由細胞質轉運至細胞外周,其中最外膜與質膜融合以釋放雙膜形式,稱為EV。保留在細胞表面上之EV稱為細胞相關之包膜病毒體(CEV),而不再附著至細胞表面之EV稱為細胞外包膜病毒體(EEV)。IMV係最豐富之感染形式且認為負責宿主之間的擴散;認為CEV在細胞至細胞擴散中起作用;且認為EEV對於宿主生物體內之長範圍傳播至關重要。具體而言,EEV已參與活體內長範圍病毒擴散傳播。參見例如Blasco等人(1993) Journal of Virology, 67(6):3319-3325。EEV之外部蛋白可誘導針對病毒之保護性免疫(Blaso及Moss (1992) J. Virol., 66:4170-4179)。然而,痘瘡病毒株產生之EEV量存在高度變化。
業內已開發出減毒痘瘡病毒株用於治療及診斷應用。舉例而言,減毒病毒包括一或多個病毒基因經修飾導致病毒基因之喪失或減少的表現或病毒蛋白不活化之重組病毒。然而,儘管痘瘡係經充分研究之具有抗致瘤性質之減毒病毒,但許多痘瘡株(包括重組株)展現毒力及安全性之變化,使得許多株不適用於臨床應用。因此,業內需要具有增強的抗致瘤性質及低細胞毒性之改良之痘瘡株,此乃因該等痘瘡株作為有效的溶瘤療法係高度合意的。本文所述之溶瘤病毒及方法解決了此需要。
已研究多種方法來改良OV抗腫瘤活性,主要集中於病毒複製及擴散,此乃因病毒複製通常與癌細胞殺傷效力相關聯。然而,病毒感染之其他態樣(例如宿主抗腫瘤免疫反應之強化、細胞凋亡之誘導及腫瘤血管生成之控制)亦係癌症病毒療法之重要態樣(Davola, M. E.及K. L. Mossman (2019) Oncoimmunology 8(6): e1581528)。
本文提供衍生自稱為IHD-J之痘瘡病毒株(ATCC®目錄號VR-156™)之經分離之純系病毒。IHD-J係與西方儲備(Western Reserve,WR)株密切相關、但展現比WR大10至40倍之EEV並遠遠有效地擴散至遠端細胞之痘瘡病毒株(Blaso及Moss, 1992)。然而,展現更長範圍擴散之株可能不會展現用於溶瘤病毒療法之足夠抗致瘤活性。
所提供之實施例係基於IHD-J之特定純系分離物(命名為VIP02)之鑑別,該分離物不僅展現高百分比之EEV,且亦在來自同一株之其他純系分離物中展現最高之抗致瘤活性。另外,結果證實,低劑量之純系分離物之單一靜脈內遞送顯著抑制小鼠同基因腫瘤模型中之腫瘤生長,且在2-D及3-D培養物中皆展現針對多種腫瘤細胞之強效的活體外腫瘤細胞殺傷。本文亦提供具有VIP02純系分離物之序列特徵之痘瘡病毒株。
所提供之實施例亦係關於重組病毒,其中可將異源核酸引入具有增強的抗致瘤性質之經分離之純系病毒中以進一步增強經分離之純系病毒的抗致瘤性質,同時最小化其對健康細胞之細胞毒性效應。
在一些實施例中,所選純系株及其重組衍生株係用於腫瘤診斷及治療之溶瘤病毒候選物。在一些實施例中,經分離之痘瘡純系株及其重組衍生株可用作治療病毒,用於治療增生性病症,包括癌症、增生、轉移及腫瘤,且用於如本文所述之其他治療及/或診斷方法。在一些其他實施例中,純系株可用於疫苗接種之方法中。在其他實施例中,經分離之純系株及其重組衍生株可用作母體痘瘡病毒來產生重組溶瘤病毒。
本申請案中所提及之所有出版物(包括專利文件、科學論文及資料庫)之全文出於所有目的皆以引用方式併入,其程度如同每一個別出版物個別地以引用方式併入一般。若本文所述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他出版物中所述之定義相反或以其他方式不一致,則本文所述之定義優先於以引用方式併入本文中之定義。
本文所用之部分標題僅用於組織目的且不應理解為限制所述標的物。
I. 經分離之純系病毒株及其減毒株
本文提供痘瘡病毒株IHD-J (ATCC®目錄號VR-156™)或展現自其分離之純系病毒株之特徵的經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株。母體IHD-J株之序列係異源的。本文發現,具有增強的抗致瘤性質之某些痘瘡病毒純系可自IHD-J母體痘瘡病毒製劑或混合物分離而來。
在一些實施例中,本文所提供之純系株存在於自IHD-J繁殖之病毒製劑中。舉例而言,純系株或其製劑可藉由自其中已繁殖母體IHD-J或其變異體之細胞培養物分離IHD-J衍生純系分離物來獲得。本文所提供之純系分離物係藉由使IHD-J病毒在經痘瘡病毒株之一系列稀釋物感染之6孔板中生長之非洲綠猴腎纖維母細胞培養物之鋪滿CV-1中傳代來獲得。
在一些實施例中,純系株不含非病毒異源核酸,該非病毒異源核酸含有編碼非病毒異源蛋白之開放閱讀框。在其他實施例中,純系株可用作產生經編碼非病毒異源蛋白之異源核酸修飾之重組病毒之母體序列。
在一些實施例中,本文所提供之IHD-J純系株命名為VIP02且具有SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列。
在一些實施例中,本文提供重組溶瘤痘瘡病毒,其包含:B2R之不活化突變;編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。在一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。
在一些實施例中,本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少96%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少97%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少98%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.1%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.2%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.3%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.4%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.5%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.6%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.7%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.8%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少99.9%序列一致性之核酸基因體。
在任何該等實施例之一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株不具含有SEQ ID NO:2 (IHD-W1)中所述之胺基酸序列之核酸基因體。在一些實施例中,所提供之純系株具有與SEQ ID NO:2具有小於100%之序列一致性且與SEQ ID NO:2具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、05%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,所提供之純系株具有與SEQ ID NO:2相差1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個核苷酸之核苷酸序列。本文所提供之該等IHD-J純系病毒包括與具有SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列之IHD-W1株相比一或多個開放閱讀框(ORF)不同之病毒。舉例而言,本文所提供之IHD-J純系病毒包括與具有SEQ ID NO: 2中所述之胺基酸序列之IHD-W1株相比一或多個ORF不同之病毒。本文所提供之IHD-J純系病毒株與SEQ ID NO: 2相比,可在任一ORF中之任一或多個核苷酸中含有核苷酸缺失或突變,或與SEQ ID NO: 2相比,可含有病毒DNA之添加或插入。
在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%序列一致性且展現SEQ ID NO:1之序列特徵的核酸基因體。例如,如本文表E1中所述,例示性VIP02純系分離物之特徵在於與SEQ ID NO:2相比一或多個核苷酸之缺失或突變,包括SEQ ID NO:2之ORF之一或多個突變。關於ORF,ORF係自001開始按順序編號。在其他實施例中,痘瘡病毒開放閱讀框亦可藉由指示HindIII限制性核酸內切酶片段之大寫字母、指示HindIII 片段中之位置之數字及指示轉錄方向之字母(L或R) (例如K5L)來表示。相應蛋白質藉由大寫字母及數字(例如K5)來表示。在一些實施例中,核苷酸變化處於序列之非ORF區域中。
在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株包括或特徵在於變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且含有除丙胺酸外之位置66之胺基酸的胺基酸序列。在一些實施例中,位置66之胺基酸係極性不帶電胺基酸。在一些實施例中,位置66之胺基酸係絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺(N)或麩醯胺酸(E)。在一些實施例中,位置66之胺基酸係T。在一些實施例中,所提供之純系株包括與SEQ ID NO:2中所述之017 ORF相比具有A66T突變之變異體017 ORF。在一些實施例中,變異體017 ORF編碼位置66之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:57具有至少96%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體017 ORF編碼位置66之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:57具有至少97%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體017 ORF編碼位置66之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:57具有至少98%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體017 ORF編碼位置66之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:57具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體017 ORF具有SEQ ID NO:57中所述之序列。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。
在一些實施例中,所提供之純系株包括或特徵在於具有實現框移突變之核苷酸插入之變異體038 (K5L) ORF,其中038 (K5L)基因產物發生變化。在一些實施例中,核苷酸插入係插入對應於SEQ ID NO:1之核苷酸位置32135後之插入的鳥嘌呤(G)。在一些實施例中,038 (K5L)基因產物之全長序列闡述於SEQ ID NO:59中。在一些實施例中,變異體038 (K5L) ORF闡述於SEQ ID NO:58中。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,變異體038 (K5L) ORF之特徵在於與SEQ ID NO: 73中所述之核酸或SEQ ID NO: 74中所述之胺基酸序列相比發生變化。
在一些實施例中,所提供之純系株包括或特徵在於變異體變異體059 (E2L),其編碼與SEQ ID NO: 60具有至少95%序列一致性且含有除白胺酸外之位置419之胺基酸的胺基酸序列。在一些實施例中,位置419之胺基酸係除白胺酸外之疏水胺基酸。在一些實施例中,位置419之胺基酸係丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)。在一些實施例中,位置419之胺基酸係F。在一些實施例中,所提供之純系株包括與SEQ ID NO:2中所述之059 (E2L) ORF相比具有L419F突變之變異體059 (E2L) ORF。在一些實施例中,變異體059 (E2L) ORF編碼含有位置419之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:60具有至少96%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體059 (E2L) ORF編碼含有位置66之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:60具有至少97%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體059 (E2L) ORF編碼含有位置419之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:60具有至少98%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體059 (E2L) ORF編碼含有位置66之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:60具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體059 (E2L) ORF具有SEQ ID NO:60中所述之序列。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。
在一些實施例中,所提供之純系株包括或特徵在於變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO: 61具有至少95%序列一致性且含有除天冬醯胺(N)外之位置591之胺基酸的胺基酸序列。在一些實施例中,位置591之胺基酸係帶負電胺基酸。在一些實施例中,位置591之胺基酸係天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)。在一些實施例中,位置591之胺基酸係D。在一些實施例中,所提供之純系株包括與SEQ ID NO:2中所述之104 (H4L) ORF相比具有N591D突變之變異體104 (H4L) ORF。在一些實施例中,變異體104 (H4L) ORF編碼含有位置591之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:61具有至少96%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體104 (H4L) ORF編碼含有位置591之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:61具有至少97%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體104 (H4L) ORF編碼含有位置591之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:61具有至少98%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體104 (H4L) ORF編碼含有位置591之上述胺基酸變化中之任一者且與SEQ ID NO:61具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,變異體104 (H4L) ORF具有SEQ ID NO:61中所述之序列。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。
在一些實施例中,所提供之純系株包括或特徵在於具有實現框移突變之核苷酸缺失之變異體182 (A56R) ORF,其中182 (A56R)基因產物發生變化。在一些實施例中,核苷酸缺失係對應於SEQ ID NO:2之核苷酸位置165972後之核苷酸的兩個連續核苷酸缺失。在一些實施例中,182 (A56R)基因產物闡述於SEQ ID NO:63中。在一些實施例中,變異體182 (A56R) ORF闡述於SEQ ID NO:62中。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。在一些實施例中,變異體182 (A56R) ORF之特徵在於與SEQ ID NO: 75中所述之核酸或SEQ ID NO: 76中所述之胺基酸序列相比發生變化。
在一些實施例中,所提供之純系株之特徵在於核酸基因體,其包括017 ORF、038 (K5L) ORF、059 (E2L) ORF、104 (H4L) ORF及182 (A56R) ORF中之任一上述突變中之至少一者。在一些實施例中,所提供之純系株之特徵在於核酸基因體,其包括017 ORF、038 (K5L) ORF、059 (E2L) ORF、104 (H4L) ORF及182 (A56R) ORF中之任一上述突變中之至少兩者。在一些實施例中,所提供之純系株之特徵在於核酸基因體,其包括017 ORF、038 (K5L) ORF、059 (E2L) ORF、104 (H4L) ORF及182 (A56R) ORF中之任一上述突變中之至少三者。在一些實施例中,所提供之純系株之特徵在於核酸基因體,其包括017 ORF、038 (K5L) ORF、059 (E2L) ORF、104 (H4L) ORF及182 (A56R) ORF中之任一上述突變中之至少四者。在一些實施例中,至少一個突變處於017 ORF中。在一些實施例中,至少一個突變處於038 (K5L) ORF中。在一些實施例中,至少一個突變處於059 (E2L) ORF中。在一些實施例中,至少一個突變處於104 (H4L) ORF中。在一些實施例中,至少一個突變處於182 (A56R) ORF中。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。
在一些實施例中,所提供之純系株之特徵在於核酸基因體,其包括017 ORF、038 (K5L) ORF、059 (E2L) ORF、104 (H4L) ORF及182 (A56R) ORF中之上述突變中之每一者。在一些實施例中,所提供之純系株之特徵在於核酸基因體,其含有編碼SEQ ID NO:57中所述之胺基酸序列之變異體017 ORF、SEQ ID NO: 58中所述之變異體038 (K5L) ORF、編碼SEQ ID NO:59中所述之胺基酸序列之038 (K5L)變異體、編碼SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列之變異體059 (E2L) ORF、編碼SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列之變異體104 (H4L) ORF、SEQ ID NO: 62中所述之變異體182 (A56R) ORF及編碼SEQ ID NO: 63中所述之胺基酸序列之182 (A56R)變異體。在一些實施例中,該痘瘡病毒純系株具有與SEQ ID NO:1具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%序列一致性之核酸基因體。
在一些實施例中,所提供之痘瘡病毒純系株具有核酸基因體,其與SEQ ID NO:1具有至少95%序列一致性且特徵在於以下中之一或多者:(i)對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);(ii)對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);(iii)對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;(iv)對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;(v)對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);(vi)對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之連續核苷酸序列CACTTATATAT (闡述於SEQ ID NO:77中);(vii)對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA (闡述於SEQ ID NO:78中);(viii)對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);(ix)對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC (闡述於SEQ ID NO:79中);及(x)對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任一者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任兩者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任三者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任四者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任五者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任六者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任七者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任八者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之任九者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
在一些實施例中,本文所提供之痘瘡病毒純系株包括具有特徵在於選自上述(i)-(x)中之每一者之一點突變、插入及/或缺失之核苷酸序列的純系株。
A. 例示性特徵
在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,IHD-J衍生純系在活體外及/或活體內分析中展現更佳之抗致瘤性及更小之致病性/毒性。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,IHD-J衍生純系展現更佳之抗致瘤性質。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,IHD-J衍生純系展現更小之毒性。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,IHD-J衍生純系展現相似之抗致瘤性質及/或相似之毒性。
本文提供IHD-J純系分離株,其與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括不存在插入異源DNA之重組株)相比展現改良之性質。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括不存在插入異源DNA之重組株)相比,IHD-J純系分離株展現更佳之抗致瘤性及更小之毒性。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括不存在插入異源DNA之重組株)相比,IHD-J純系分離株展現改良或更佳之抗致瘤活性。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括不存在插入異源DNA之重組株)相比,IHD-J純系分離株展現更小之毒性。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括不存在插入異源DNA之重組株)相比,IHD-J純系分離株展現相似之毒性及/或抗致瘤活性。
在一些實施例中,在評價指示抗致瘤性之參數之分析或方法中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比展現改良或更佳之抗致瘤活性之純系分離株展現等於或介於參考病毒製劑(起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物,包括重組株)之120%至1000%之間、例如至少120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、1000%或更大之抗致瘤活性。抗致瘤性可使用如本文所述之用於指示抗致瘤性之參數之任一活體外或活體內測試來確定。
在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現增加的細胞外包膜病毒(EEV)產生。痘瘡病毒在細胞中複製且產生細胞內病毒(IMV,細胞內成熟病毒;IEV,細胞內包膜病毒)及細胞外病毒(EEV,細胞外包膜病毒;CEV,細胞相關之細胞外病毒)二者(Smith等人(1998) Adv Exp Med Biol. 440: 395-414)。IMV佔野生型痘瘡病毒株複製後大約99%之病毒產量。IMV病毒形式在外部環境中係相對穩定的,且主要負責在個體之間擴散;然而,IMV病毒在經感染宿主內因自細胞之低效釋放及對補體及/或抗體中和之敏感性而無法有效地擴散。相比之下,EEV形式釋放至細胞外環境中且通常僅佔大約1%之病毒產量(Smith等人(1998) Adv Exp Med Biol.440: 395-414)。EEV負責經感染宿主內之病毒擴散且在宿主外相對容易降解。另外,EEV形式已發展若干機制來抑制其在血流內之中和。EEV相對抗補體(Vanderplasschen等人(1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(13): 7544-9),此歸因於補體之宿主細胞抑制劑納入其外膜包衣中且痘瘡病毒補體控制蛋白(VCP)分泌至局部細胞外環境中。另外,與IMV相比,EEV相對抗中和抗體效應(Smith等人(1997) Immunol Rev. 159: 137-54;Vanderplasschen等人(1997) J Gen Virol. 78 (Pt 8): 2041-8)。EEV比IMV (其僅在細胞死亡期間/之後釋放)在感染後更早之時間點(例如4-6小時)釋放,且因此,EEV形式之擴散更快(Blasco等人(1993) J Virol. 67(6):3319-25)。
由於EEV相對抗補體效應及抗體介導之中和,故當其在來自同一物種之細胞類型中生長時,此病毒形式將具有增強的穩定性,且在靜脈內投與後在血液中保留更長時間之活性(Smith等人(1998) Adv Exp Med Biol.440: 395-414;Vanderplasschen等人(1998) Proc Natl Acad Sci U S A. (13):7544-9)。此在中和抗體水準增加且抗癌療法需要重複投與時對於重複投與尤其重要。因此,增加痘瘡及其他痘病毒之EEV形式可增強全身效力。
在一些實施例中,與衍生自IDH-J或哥本哈根株(Copenhagen strain)之其他純系分離物相比,本文所提供之純系分離物展現增加的細胞外包膜病毒(EEV)產生。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現增加的細胞外包膜病毒(EEV)產生,例如等於或介於120%至1000%之間、例如至少120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、1000%或更大之細胞外包膜病毒(EEV)產生。
在一些實施例中,在細胞感染後大於或大於約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%之感染性粒子係EEV。在一些實施例中,在細胞感染後大於5%之感染性粒子係EEV。在一些實施例中,在細胞感染後大於10%之感染性粒子係EEV。在一些實施例中,在細胞感染後大於15%之感染性粒子係EEV。在一些實施例中,在細胞感染後大於20%之感染性粒子係EEV。
在其他實施例中,在活體外或活體內分析或模型中,本文所提供之純系分離物展現減少的腫瘤及/或轉移生長或增加的及/或轉移收縮。可自個體收穫腫瘤,稱重,且將重量與自經來自起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)之病毒感染之帶有腫瘤之個體收穫的腫瘤進行比較。腫瘤之重量亦可與在感染後同時自對照治療之個體收穫之腫瘤進行比較。重量可呈現為腫瘤體積/重量及/或腫瘤體積/重量之比率(對照治療之動物之腫瘤重量/純系分離物治療之個體之腫瘤重量)。應理解,例如,1.2或5之腫瘤重量比意指與參考或對照相比,病毒實現降低的腫瘤/轉移重量/生長或及增加的腫瘤/轉移收縮以及120%或500%之抗致瘤活性。
在一些實施例中,本文所提供之純系分離物展現減少的腫瘤及/或轉移生長或增加的腫瘤及/或轉移收縮。在一些實施例中,腫瘤/轉移之體積/重量比大於1.0,例如大於1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更大。在一些實施例中,增加的腫瘤/轉移收縮係至少120%至500%,例如150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或更大。
在一些實施例中,在評價指示毒性之參數之分析或方法中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現相似之抗致瘤活性,例如介於母體病毒製劑或混合物或其他參考病毒株之抗致瘤活性的70%至120%之間,例如至少或約或70%、80%、90%、95%、100%、110%、115%或120%。
在一些實施例中,在活體外或活體內分析或模型中,本文所提供之純系分離物展現減小的腫瘤及/或轉移體積、大小或重量。在一些實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現減小的腫瘤及/或轉移體積,例如等於或介於0%至99%之間、例如小於99%、98%、97%、96%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更小之毒性或更大之腫瘤及/或轉移體積、大小或重量。
指示毒性或毒力之參數包括(但不限於) 2-D (2維)及3-D (3維)細胞培養物中降低的細胞存活百分比、個體之體重減小、存在發熱、潮紅或其他過敏、疲勞或腹痛、病毒之組織分佈、降低或減小的個體存活率、個體中免疫反應之誘導、釋放之腫瘤抗原之量及減小的痘疱形成率。毒性或毒力可使用熟習此項技術者所熟知之任何活體外或活體內測試來確定。
在一些實施例中,在評價指示毒性之參數之分析或方法中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現更小之毒性,例如等於或介於起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)之毒性的0%至99%之間,例如小於99%、98%、97%、96%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更小。在一些實施例中,與衍生自IHD-J或哥本哈根株之其他純系分離物相比,本文所提供之IHD-J純系分離物展現等於或介於0%至99%之間、例如小於99%、98%、97%、96%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更小之毒性。在一些實施例中,評價指示毒性之參數之方法包括量化細胞培養物中細胞存活之百分比。在一些實施例中,評價指示毒性之參數之方法包括量化2-D (二維)及3-D (三維)細胞培養物中細胞存活之百分比。(吾人應提及實例中所用之所有細胞類型嗎?)。
在一些實施例中,在評價指示毒性之參數之分析或方法中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現相似之毒性及/或細胞毒性,例如介於起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)之抗致瘤活性的70%至120%之間,例如至少或約或70%、80%、90%、95%、100%、110%、115%或120%。
在具體實施例中,與起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株)相比,本文所提供之純系分離物展現改良之抗致瘤性且毒性更小(即毒害性更小)。舉例而言,當以可有效地誘導抗致瘤活性之量投與個體時,純系株之毒性更小(即毒害性更小)。為治療人類個體或其他類似大小之個體,純系株之例示性治療量介於以下范圍內:約或介於1×10
6至1×10
14pfu之間、介於1×10
7至1×10
10pfu之間,例如介於1×10
9至1×10
10pfu之間,例如至少或約1×10
6、1×10
7、1×10
8、1×10
9、2×10
9、3×10
9、4×10
9或5×10
9pfu。為治療小鼠或其他類似大小之個體,純系株之例示性治療量介於以下范圍內:約或介於1×10
3至1×10
9pfu之間,例如介於1×10
5至1×10
7pfu之間,例如至少或約或1×10
3、1×10
4、1×10
5、1×10
6、2×10
6、3×10
6、4×10
6或5×10
6pfu。該等有效量可由熟習此項技術者憑經驗確定且取決於多種因素,包括個體、所治療之疾患或疾病、疾病之時期或進展、癌症、腫瘤、轉移或增生之類型及其他因素。劑量方案可發生變化。在一些實施例中,本文所提供之純系分離物在治療方案之過程中展現100%之個體存活率且與在治療過程中實現減小或降低的個體體重無關。在一個實施例中,本文所提供之純系株在投與個體時展現與投與相同或相似治療量之其他純系分離物之個體之存活率相比增加的存活率。在一些實施例中,本文所提供之純系分離物在治療方案之過程中展現100%之腫瘤生長抑制。
本文所提供之經分離之純系病毒可衍生自經由在細胞株中重複傳代繁殖之IHD-J株之噬菌斑分離。在一些實施例中,本文所提供之純系分離物可藉由使病毒在受精雞蛋培養物、雞胚纖維母細胞(CEF)、Hela S3細胞、鋪滿CV-1細胞或BHK-21細胞中傳代來獲得。在一些實施例中,本文所提供之純系分離物可藉由使病毒在經痘瘡病毒株之一系列稀釋物感染之6孔板中生長之非洲綠猴腎纖維母細胞培養物(即鋪滿CV-1)中傳代來獲得。本文所提供之純系分離物之序列係同源的。本文所提供之例示性純系病毒係展現增強的抗致瘤性質及降低的毒性之純系分離物。
II. 減毒痘瘡病毒株
本文亦提供重組痘瘡病毒,其與野生型或母體病毒株相比,例如與部分I中所述之任一經分離之純系病毒株相比,展現使病毒毒性減毒之一或多個修飾。在一些實施例中,本文提供與痘瘡病毒株VIP02相比減毒(例如具有降低的毒性)之重組痘瘡病毒。在一些實施例中,本文提供與SEQ ID NO:1中所述之痘瘡病毒株相比減毒(例如具有降低的毒性)之重組痘瘡病毒。在一些實施例中,減毒病毒係對正常細胞具有低毒性(例如對正常細胞(例如非腫瘤細胞)之低或減少的病毒複製、細胞溶解活性或細胞毒性)之病毒。
在一些實施例中,減毒病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,其包含:B2R之不活化突變;編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。在一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。
在一些實施例中,減毒病毒係重組溶瘤病毒,其包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
在一些實施例中,可藉由修飾痘瘡病毒以使以下基因之功能缺陷來使任一所提供之痘瘡病毒減毒:痘瘡生長因子(VGF) (McCart等人(2001) Cancer Research 61:8751);胸苷激酶(TK)基因(WO 2005/047458);血球凝集素(HA)基因(WO 2005/047458,及Zhang等人(2007) Cancer Research 67:10038);F3基因(亦稱為F14.5L;WO 2005/047458,及Zhang等人(2007) Cancer Research 67:10038);核糖核苷酸還原酶(Gammon等人(2010) PLoS Pathogens 6:e1000984);絲胺酸蛋白酶抑制劑(例如SPI-1、SPI-2) (Guo等人(2005) Cancer Research 65:9991,及Yang等人(2007) Gene Therapy 14:638);核糖核苷酸還原酶基因F4L或I4L (Child等人(1990) Virology 174:625;Potts等人(2017) EMBO Mol. Med.9:638);B2R (Eaglesham等人(2019) Nature 566:259-263);B18R (Symons等人(1995) Cell 81:551;Kirn等人(2007) PLoS Medicine 4:e353);A48R (Hughes等人(1991) J. Biol.Chem.266:20103);B8R (Verardi等人(2001) J. Virol. 75:11);B15R (Spriggs等人(1992) Cell 71:145);A41R (Ng等人(2001) Journal of General Virology 82:2095);A52R (Bowie等人(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10162);F1L (Gerlic等人(2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:7808);E3L (Chang等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4825);A44R-A46R (Bowie等人(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10162);K1L (Bravo Cruz等人(2017) Journal of Virology 91:e00524);A48R、B18R、C11R及TK (Mejias-Perez等人(2017) Molecular Therapy: Oncolytics 8:27)。在一些實施例中,已知若干非必需基因(例如J2R (胸苷激酶TK) (Buller等人,1985)、C11R (分泌性表皮生長因子樣) (Buller等人,1988)、A56R (血球凝集素HA) (Shida等人,1988)、B8R (可溶性干擾素-γ受體樣) (Verardi等人,2001)及F14.5L (WO 2005/047458,及Zhang等人(2007) Cancer Research 67:10038))在缺失或破壞時產生降低的毒力。
在一些實施例中,本文提供重組痘瘡病毒株,其具有以下基因體:任一上述基因具有使基因不活化且由此使病毒減毒之不活化突變。在一些實施例中,病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。在一些實施例中,不活化突變係病毒基因之一部分之全部缺失。在一些實施例中,不活化突變係病毒基因之整個ORF缺失。在一些實施例中,不活化突變係病毒基因ORF之一部分缺失,從而使經編碼之基因產物無功能。在一些實施例中,ORF之缺失部分係至少10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個或更多個核苷酸之連續序列直至病毒基因ORF之整個序列。
在一些實施例中,可藉由熟習此項技術者已知之多種方法中之任一者使基因區域或經編碼之基因產物之功能缺陷。在一些實施例中,基因區域或基因產物可因基因區域之一或多個突變(例如取代)、截短或缺失而變得缺陷。在一些實施例中,基因區域或基因產物可因控制基因區域表現之啟動子區域之突變、截短或缺失而變得缺陷。在一些實施例中,基因區域或基因產物可藉由多腺苷酸化序列之突變、截短或缺失而變得缺陷,使得減少或消除由基因區域編碼之多肽之轉譯。
在一些實施例中,給定痘瘡病毒基因缺陷之本揭示案之減毒重組痘瘡病毒展現基因之基因產物(例如mRNA基因產物;多肽基因產物)之降低的產生及/或活性。在一些實施例中,基因產物之量及/或活性小於由野生型痘瘡病毒或由不包含遺傳變化之對照痘瘡病毒產生之相同基因產物之量及/或活性的75%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%或小於1%。舉例而言,在一些實施例中,基因產物之量及/或活性小於由具有SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體之VIP02或痘瘡病毒產生之相同基因產物之量及/或活性的75%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%或小於1%。在一些實施例中,基因產物之量及/或活性小於由具有SEQ ID NO:2中所述之核酸基因體之IHD-W1株或痘瘡病毒產生之相同基因產物之量及/或活性的75%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%或小於1%。
在一些實施例中,病毒基因缺陷之本揭示案之減毒重組痘瘡病毒可具有由指定基因區域組成之區域中之缺失或包含指定基因區域之相鄰基因區域中之缺失。作為實例,啟動子區域之減少基因區域轉錄之突變及/或截短及/或缺失可導致缺陷。亦可經由納入轉錄終止元件使基因區域缺陷,使得減少或消除由基因區域編碼之多肽之轉譯。亦可經由使用基因編輯酶或基因編輯複合物來減少或消除基因區域之轉錄,使基因區域缺陷。亦可經由使用競爭性反向啟動子/聚合酶佔據來減少或消除基因區域之轉錄,使基因區域缺陷。亦可藉由將核酸插入基因區域中使基因區域缺陷,藉此剔除基因區域。在一些情形下,可將異源核酸插入例如部分III中針對例示性重組痘瘡病毒株所述之病毒基因中。
在一些實施例中,本揭示案所提供之OVV係痘瘡病毒胸苷激酶(TK)缺陷的。在一些情形下,本揭示案之OVV包含痘瘡病毒TK編碼區之全部或一部分缺失,使得複製勝任之重組溶瘤痘瘡病毒係TK缺陷的。舉例而言,在一些情形下,本揭示案之OVV包含J2R基因(即,編碼病毒胸苷激酶之基因)之缺失。參見例如Mejia-Perez等人,(2018) Mol. Ther. Oncolytics 8:27。在一些情形下,本揭示案之OVV包含插入J2R區域中,由此降低痘瘡病毒TK表現或活性。
在一些實施例中,可進一步修飾部分I中所述之任一純系痘瘡病毒株(例如SEQ ID NO:1中所述之VIP02或痘瘡病毒株)之基因體以使病毒減毒。在一些實施例中,痘瘡病毒株之TK (J2R)、血球凝集素(HA)、A35R或B2R基因中之一或多者經修飾。在一些實施例中,修飾使得由基因座編碼之基因產物無功能或缺陷。在一些實施例中,使TK、HA、A35R或B2R ORF中之全部或一部分缺失。
在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有編碼胸苷激酶(TK;SEQ ID NO: 66)之J2R基因之不活化突變,例如插入、突變或缺失。在一些實施例中,據報導,TK基因座並非病毒複製所必需,使得其修飾可降低病毒毒力,導致病毒無法在腦或卵巢中複製並保留優先在腫瘤組織中複製之能力(例如Buller等人(1985) Nature, 317:813-815)。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:4中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體具有SEQ ID NO:4中所述之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒係命名為VIR13之痘瘡病毒。
在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有編碼胞質cGAMP核酸酶(poxin) (SEQ ID NO: 54)之B2R基因座之不活化突變,例如插入、突變或缺失。在一些實施例中,據報導,B2R基因座在皮膚刺傷模型中導致痘瘡病毒減毒(Eaglesham等人,2019, Nature 566:259-263)。在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有B2R基因之不活化突變(例如插入、突變或缺失)及J2R基因之不活化突變(例如插入、突變或缺失)。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:48中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體具有SEQ ID NO:48中所述之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒係命名為VIR94之痘瘡病毒。
在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有A35R基因座之不活化突變,例如插入、突變或缺失。A35R係調節適應性免疫反應之毒力基因,且其不活化(例如藉由缺失)可導致病毒複製能力降低且降低病毒毒力(Brennan等人,2015, J. Virol., 89:9986-9997)。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:3中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體具有SEQ ID NO:3中所述之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒係命名為VIR11之痘瘡病毒。在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有A35R基因之不活化突變(例如插入、突變或缺失)及J2R基因之不活化突變(例如插入、突變或缺失)。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:12中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒株之核酸基因體具有SEQ ID NO:12中所述之核苷酸序列。在一些實施例中,重組痘瘡病毒係命名為VIR52之痘瘡病毒。
在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有編碼血球凝集素(HA;SEQ ID NO: 67)之A56R基因座之不活化突變,例如插入、突變或缺失。在一些實施例中,據報導,HA基因座並非病毒複製所必需,使得其修飾可降低病毒毒力,導致病毒無法在腦或卵巢中複製並保留優先在腫瘤組織中複製之能力(例如Shida等人(1988) J. Virol., 62:4474-4480)。
在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有F14.5L基因(SEQ ID NO: 65)之不活化突變,例如插入、突變或缺失。在一些實施例中,本文所提供之減毒重組痘瘡病毒具有由F14.5L基因編碼之F3基因產物(SEQ ID NO: 64)之插入、突變或缺失。在一些實施例中,據報導,F14.5L基因(亦稱為F3)並非病毒複製所必需,使得其修飾可降低病毒毒力,導致病毒無法在腦或卵巢中複製並保留優先在腫瘤組織中複製之能力(例如美國專利公開案第US2005/0031643號)。
可使用多種方法來評價或確定病毒之減毒水準。該等量測減毒水準之方法可在活體外或活體內實施,且可包括評價病毒之以下性質中之任一者或全部之變化:a)病毒mRNA合成,b)病毒蛋白表現,c)病毒DNA複製,d)病毒噬菌斑大小,e)病毒效價或f)活體內毒性。藉由活體外及活體內方法評價病毒之減毒水準之方法為此項技術中已知且包括(但不限於)諸如噬菌斑分析及小鼠病毒致病性模型之方法。用於研究痘瘡早期、中期及晚期轉錄之例示性方法可參見Broyles等人,Methods Mol Biol. (2004) 269:135-142及Wright等人,Methods Mol. Biol. (2004) 269:143-150。用於分析病毒RNA轉錄物及蛋白質之方法包括(但不限於)熟知之技術,如RNA雜交及印跡技術以及免疫組織化學。
III. 含有異源核酸之重組病毒株
本文提供其基因體序列經修飾之重組病毒株。在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸。異源基因產物不受特定限制且在一些實施例中可為補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。因此,在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
本文提供重組溶瘤痘瘡病毒,其包含:B2R之不活化突變;編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。在一些實施例中,編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白(例如一或多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白)之一或多種異源核酸;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼細胞凋亡誘導蛋白(例如iDED、iFas或iCas9)之一或多種異源核酸;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白(例如由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質)之一或多種異源核酸;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑(例如CRASP-2或miniFH)之一或多種異源核酸;及/或將編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸引入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種抗血管生成蛋白(例如VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑或Versikine)之一或多種異源核酸;及/或編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸。
不活化突變包括改變由不活化(例如藉由基因破壞)之病毒基因表現之基因產物的表現及/或功能之若干方式中之任一者。基因破壞可藉由例如基因缺失、核酸插入、核酸突變或取代、基因剔除、早熟終止密碼子、轉錄啟動子修飾、RNAi或基因編輯(例如CRISPR)來達成。在一些實施例中,不活化突變係藉由編碼一或多種基因產物之異源核酸之基因缺失及/或插入(亦稱為引入)來實現。在具體實施例中,不活化突變將異源核酸之基因缺失及插入組合至該等基因座中。例如,在實現不活化突變(例如藉由同源重組及其他方法)之一些方法中,異源核酸可插入已缺失之基因區域內。因此,應理解,在一些實施例中,對異源核酸插入其中之基因座之提及係藉由基因之全部或一部分之基因缺失不活化之基因的缺失基因座。在一些實施例中,基因缺失去除基因之整個序列。在其他實施例中,基因缺失係部分缺失,亦即去除基因序列之一部分之部分缺失。在一個實施例中,基因缺失係去除基因序列之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%之部分缺失。在一個實施例中,基因缺失係去除基因之蛋白質編碼序列之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之部分缺失。在其他實施例中,基因缺失去除基因序列之100%。在其他實施例中,基因缺失去除基因之蛋白質編碼序列之100%。在一個實施例中,基因缺失去除基因序列之至少50個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個或至少1000個核苷酸。在另一實施例中,基因缺失係去除基因序列之至少50個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個或至少1000個核苷酸之部分缺失。在具體實施例中,基因之部分缺失產生部分基因。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫調節蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
本文亦提供重組溶瘤病毒,其包含:與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少99%序列一致性之核酸基因體;及插入基因體中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸。
例示性異源蛋白闡述於以下子部分中。除重組病毒株外,任一所述異源蛋白亦可納入基因治療載體(例如AAV、慢病毒及反轉錄病毒)或基於細胞之療法(例如表現嵌合抗原受體之T細胞(CAR-T)、天然殺手(NK) NK細胞或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)療法)中。
尤其提供之病毒株係包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸之重組病毒株。在一些實施例中,重組病毒包括(但不限於)痘瘡病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒(MARAV)、麻疹病毒(MV)、黏液病毒、羊痘病毒、小病毒、浣熊痘病毒、柯沙奇病毒、里奧病毒、新城雞瘟病毒、塞內卡谷病毒、塞姆利基森林病毒、流感病毒、埃可病毒、小兒麻痺病毒(PV)、腺病毒(例如哺乳動物腺病毒及禽腺病毒)、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒1、單純疱疹病毒2、單純疱疹病毒5、單純疱疹病毒6、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、HHV6-HHV8及巨細胞病毒)、輕小病毒屬(例如輕小病毒、腸道細菌MS2期、異型小核病毒)、痘病毒(例如超家族脊索痘病毒、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒、豬痘病毒、軟疣病毒、昆蟲痘病毒)、乳多泡病毒(例如脊髓灰質炎病毒及乳頭瘤病毒)、副黏液病毒屬(例如副黏液病毒、副流感病毒1 (例如麻疹風疹病毒)、腮腺炎病毒屬(例如腮腺炎病毒)、肺炎病毒屬(肺炎病毒、(肺炎病毒)人類)、人類呼吸道融合病毒及間質肺炎病毒(例如禽肺炎病毒及人類間質肺炎病毒))、小核糖核酸病毒(例如腸病毒、鼻病毒、肝炎病毒(例如人類A型肝炎病毒)、心病毒及擬病毒)、里奧病毒(例如正呼腸孤病毒、環狀病毒、輪狀病毒、質型多角體病毒、斐濟病毒(fijivirus)、植物水稻呼腸孤病毒及水稻皺縮矮化病毒)、反轉錄病毒(例如哺乳動物B型反轉錄病毒、C型哺乳動物反轉錄病毒、D型反轉錄病毒群、BLV-HTLV反轉錄病毒、慢病毒(例如1型人類免疫缺乏病毒及2型人類免疫缺乏病毒(例如HIV gp 160)、泡沫病毒)、黃病毒(例如C型肝炎病毒、登革熱病毒(Dengue fever virus)及西尼羅河熱病毒(West Nile fever virus))、肝炎病毒(例如B型肝炎病毒)、披衣病毒(例如α病毒(例如辛得比病毒(Sindbis virus))及風疹病毒屬(例如風疹病毒))、棒狀病毒(例如水泡性口炎病毒、勒索病毒(lissavirus)、牛流行熱病毒及胞質體病毒)、沙狀病毒屬(例如沙狀病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、伊派病毒(Ippy virus)及拉沙病毒(lassavirus))及冠狀病毒屬(例如冠狀病毒及環曲病毒)。
在一些實施例中,重組病毒包括溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒係重組溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)係痘瘡病毒、單純疱疹病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒(MARAV)、麻疹病毒(MV)、腺病毒、黏液病毒、羊痘病毒、小病毒、浣熊痘病毒、柯沙奇病毒、里奧病毒、新城雞瘟病毒、塞內卡谷病毒、塞姆利基森林病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、埃可病毒或小兒麻痺病毒(PV)。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)係痘瘡病毒。
在一些實施例中,重組病毒係不為溶瘤病毒之病毒。在一些實施例中,重組病毒係不為痘瘡病毒之病毒。在一些實施例中,重組病毒包括痘瘡病毒。在一些實施例中,重組病毒衍生自哥本哈根株。
在具體實施例中,重組病毒係IHD-J衍生病毒。在一些實施例中,重組病毒係VIP02衍生病毒。在一些實施例中,本文提供重組病毒,例如重組溶瘤病毒,其包含核酸之一或多個突變、插入、缺失或取代(替代)或病毒基因體序列之其他修飾。在一些實施例中,本文提供經修飾之VIP02株,其基因體序列與SEQ ID NO: 1中所述之基因體序列相比經修飾。在一些實施例中,重組病毒係衍生自具有SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體之病毒之病毒,其中該基因體藉由插入編碼異源基因產物之核酸來修飾。
使用重組DNA技術產生重組病毒之方法為此項技術中所熟知(例如參見美國專利第4,769,330號、美國專利第4,603,112號、美國專利第4,722,848號、美國專利第4,215,051號、美國專利第5,110,587號、美國專利第5,174,993號、美國專利第5,922,576號、美國專利第6,319,703號、美國專利第5,719,054號、美國專利第6,429,001號、美國專利第6,589,531號、美國專利第6,573,090號、美國專利第6,800,288號、美國專利第7,045,313號;He等人(1998) PNAS U S A. 95(5): 2509-2514;Racaniello等人(1981) Science 214: 916-919)。產生用於該等方法之重組痘瘡病毒之方法亦可參見本文所述之實例。
在一些實施例中,重組病毒具有大的攜帶其中可插入外源DNA片段之外來基因之能力。例如,痘瘡病毒基因體具有大的攜帶外來基因之能力,其中可插入高達25 kb之外源DNA片段。若干痘瘡株之基因體已經完全測序,且鑑別出許多必需及非必需基因。由於不同株之間的高序列同源性,可使用一個痘瘡株之基因體資訊在其他株中設計及產生經修飾之病毒。最後,業內已充分建立藉由遺傳改造產生經修飾痘瘡株之技術(Moss, Curr.Opin. Genet. Dev. 3: 86-90 (1993);Broder及Earl, Mol.Biotechnol.13: 223-245 (1999);Timiryasova等人,Biotechniques 31: 534-540 (2001)。
用於插入異源核酸分子之位點為此項技術中已知且已針對各種病毒載體進行闡述(參見例如5,166,057、5,266,489、6,338,846、6,248,320、6,221,646、6,841,158、7,101,685、7,001,760及其中之參考文獻)。通常將異源核酸分子插入非編碼區或病毒複製非必需基因之編碼區中。舉例而言,在痘瘡病毒中,用於插入異源DNA分子之位點可處於基因間區域、非編碼區及或非必需基因或基因區域中,包括(但不限於)胸苷激酶(TK)基因、血球凝集素(HA)基因、F14.5L (參見例如美國專利公開案第2005-0031-643號)、VGF基因(參見例如美國專利公開案第2003-0031681號)、Hind III F、F13L或Hind III M (參見例如美國專利第6,548,068號);出血區或A型包涵體區域(ATI) (參見例如美國專利第6,265,189號及美國專利第6,596,279號);A33R、A34R、A36R或B5R基因(參見例如Katz等人(2003) J. Virology 77:12266-12275);SalF7L (參見例如Moore等人(1992) EMBO J. 11:1973-1980);N1L (參見例如Kotwal等人(1989) Virology 171:579-587);M1 λ (參見例如Child等人(1990) Virology. 174:625-629);HR、HindIIII-MK、HindIII-MKF、HindIII-CNM、RR或BamF (參見例如Lee等人(1992) J Virol.66:2617-2630);C21L (參見例如Isaacs等人(1992) Proc Natl Acad Sci USA.89:628-632)、宿主範圍區域基因K1L及C7L、A35R (參見例如美國專利第6,265,189號、美國專利第7,045,313號;美國專利公開案第2005-0244428號、美國專利公開案第2006-0159706號;Coupar等人,J. Gen. Virol. (2000) 81: 431-439;Smith等人(1993) Vaccine 11(1): 43-53)。若插入一個以上之基因表現盒,則插入可處於同一插入位點或不同插入位點。替代地,可將異源核酸分子插入必需基因中,且用於包裝病毒之細胞株可用於產生病毒。
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入病毒基因體中之非必需基因或區域中或替代該基因或區域。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入以下基因座中或替代以下基因座:病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座或其任一組合。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入F14.5L基因座中或替代該基因座。F14.5基因座編碼病毒膜蛋白。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入A35R基因座中或替代該基因座。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入J2R基因座中或替代該基因座。在一些實施例中,插入基因座中係其中基因座含有部分缺失且異源核酸替代缺失部分之插入。在一些實施例中,插入基因座中係插入基因座中,但其中內源基因座之一部分缺失。在一些實施例中,替代基因座之插入係使得所有基因座缺失且由異源核酸替代之插入。
非必需痘瘡基因之突變亦可有助於增加病毒之減毒。因此,將異源表現盒插入非必需基因(例如TK基因)中可在兩個態樣中使病毒減毒:藉由基因突變及藉由添加轉錄及/或轉譯負載。對於本文所述之方法,不需要非必需基因之突變;然而,一或多個非必需基因可經修飾以增強基因表現盒之減毒效應。隨後可藉由去除表現盒並將其用非編碼序列替代以使得基因保持無活性來降低病毒之減毒(即,病毒展現增加的複製)。因此,去除或替代基因表現盒會減少病毒上之轉錄及/或轉譯負載,從而降低病毒之減毒。
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸與病毒基因體中編碼病毒膜蛋白之基因融合。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸與編碼病毒膜蛋白之基因融合以產生融合蛋白。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸與病毒膜蛋白融合以產生融合蛋白。在一些實施例中,與編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸融合之編碼病毒膜蛋白之基因係F14.5L。在一些實施例中,病毒膜蛋白係F14.5L。在一些實施例中,病毒膜蛋白係F14.5L且融合物處於F14.5L之C末端。在一些實施例中,融合蛋白納入細胞內成熟病毒(IMV)、例如痘瘡病毒之外膜中。預期包含病毒膜蛋白F14.5L之該等融合蛋白納入IMV病毒粒子之外膜中,此可向其提供對血液中之補體不活化之抗性。
修飾可包括核酸之突變、插入、缺失或取代(替代)或病毒基因體序列之其他修飾。舉例而言,本文所提供之病毒可經修飾以含有插入或替代病毒基因體之一或多個異源核酸分子。病毒基因可經來自另一病毒之同源基因或經不同基因替代。在一個實施例中,修飾包括一或多個核苷酸、例如至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、1000個、2000個、3000個或更多個核苷酸之插入或替代。在一些實施例中,修飾包括一或多個核苷酸、例如至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、1000個、2000個、3000個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中,修飾包括一或多個核苷酸、例如至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、1000個、2000個、3000個或更多個核苷酸之取代。
修飾包括核酸之插入及/或取代(替代)或使用異源核酸對病毒基因體序列之其他修飾。通常,異源基因係編碼非病毒蛋白之基因。舉例而言,可插入編碼異源基因之異源核酸分子。在一些實施例中,異源核酸替代病毒基因之全部或一部分。在其他實施例中,本文所提供之病毒可藉由插入一或多個異源核酸分子來修飾。舉例而言,可插入1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個異源核酸分子。異源核酸分子可含有開放閱讀框或可為非編碼序列。通常,插入之異源核酸係含有開放閱讀框且對應於基因編碼區之連續核苷酸序列。插入或替代之基因可在感染宿主細胞(例如腫瘤細胞)後自病毒基因體轉錄及/或轉譯。如下文所述,異源核酸可含有調節序列以控制基因之表現。舉例而言,異源核酸可操作地連接至用於表現開放閱讀框之啟動子。在一些實施例中,啟動子與SEQ ID NO: 68、69、70、71或72中所述之序列具有70%、80%、90%、100%序列一致性。在一些實施例中,啟動子與SEQ ID NO: 68、69、70、71或72中所述之序列具有序列一致性。
對本文所提供之病毒基因體之修飾可產生病毒特徵或性質之變化。實例變化包括指示抗致瘤性及/或毒性之參數之變化。舉例而言,插入、突變或缺失可降低純系株之致病性,例如降低感染性、毒性、複製能力或痘瘡病毒可累積之非腫瘤器官或組織之數量。核酸之例示性插入、缺失、突變及/或取代係相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),產生具有更佳抗致瘤性質及更小毒性之痘瘡病毒的彼等插入、缺失、突變及/或取代。在一些實施例中,核酸之插入、缺失、突變及/或取代係相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),產生具有相似抗致瘤性質及毒性之痘瘡病毒的彼等插入、缺失、突變及/或取代。在一些實施例中,相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),對病毒基因體之修飾會降低毒性。在一些實施例中,插入、突變或缺失包括(但不限於)相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),增加抗致瘤性且降低病毒毒性之彼等插入、突變或缺失。
在一些實施例中,插入、突變或缺失包括(但不限於)相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),增加純系病毒株逃避宿主免疫系統之能力之彼等插入、突變或缺失。在一些實施例中,插入、突變或缺失包括(但不限於)相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),增加純系病毒株刺激宿主免疫系統之能力之彼等插入、突變或缺失。在一些實施例中,插入、突變或缺失包括(但不限於)相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),增加宿主之抗血管生成活性之彼等插入、突變或缺失。在一些實施例中,插入、突變或缺失包括(但不限於)相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),增加宿主之細胞凋亡活性之彼等插入、突變或缺失。
在一些實施例中,一或多個異源核酸分子可編碼例如抗細胞凋亡基因產物或其片段,例如可改質宿主之細胞凋亡反應之基因產物;血管生成基因產物或其片段,例如可改質宿主之血管生成反應之基因產物;免疫系統基因產物或其片段,例如可改質宿主之免疫反應之基因產物。在一些實施例中,相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),可改質宿主免疫反應之基因產物或其片段可增加宿主之免疫系統避開補體抑制之能力。在一些實施例中,相對於不含修飾之純系株及/或起始病毒製劑或混合物或其他參考株或分離物(包括重組株),可改質宿主免疫反應之基因產物增加宿主免疫系統之活性。
在一些實施例中,重組病毒係基因體序列與SEQ ID NO: 1中所述之基因體序列或與SEQ ID NO:1具有至少99%序列一致性之序列相比經修飾之痘瘡病毒。在一些實施例中,重組病毒係基因體序列與SEQ ID NO: 1中所述之基因體序列相比經修飾之痘瘡病毒。本文所提供之痘瘡病毒之大基因體大小允許異源DNA之大及/或多個核苷酸序列插入病毒基因體中(Smith及Moss (1983) Gene 25(1):21-28)。本文所提供之病毒可藉由插入或取代一或多個核苷酸來修飾。在一個實施例中,修飾包括一或多個核苷酸、例如至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、1000個、2000個、3000個、4000個、5000個或更多個核苷酸之插入或取代。在一些實施例中,一或多個異源DNA分子插入病毒基因體之基因座(例如如本文所述之任一者)中。在一些實施例中,一或多個異源DNA分子插入病毒基因體之非必需區域中;例如,DNA分子插入增生細胞(例如腫瘤細胞)中之病毒複製非必需之基因座中。例示性插入位點為此項技術中已知且提供於本文中。在一些實施例中,本文所提供之重組痘瘡病毒可含有病毒基因(例如如所述之任一者)之不活化突變,例如病毒基因之全部或一部分之基因缺失。在該等實施例中,一或多個異源核酸可插入該等基因座中或替代該等基因座。在一些實施例中,重組病毒係與SEQ ID NO:1中所述之基因體序列相比經修飾之病毒,其中插入一或多個異源核酸且一或多個病毒基因座不活化(例如藉由基因缺失)。經修飾之重組病毒可為具有SEQ ID NO: 1中所述之基因體或與SEQ ID NO: 1至少99%一致之基因體之本文所提供之任一病毒,或藉由引入本文所述之異源DNA產生之任何其他病毒。在一些實施例中,重組病毒之基因體序列與SEQ ID NO:1中所述之基因體序列相比經修飾且具有與SEQ ID NO:1中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中,重組病毒可經修飾以表現外源或異源基因。例示性外源基因產物包括參與細胞凋亡、血管生成及/或免疫系統調節之蛋白質。在一些實施例中,基因產物包括影響宿主之細胞凋亡路徑之蛋白質,例如半胱天冬酶-9、FADD (Fas相關死亡結構域蛋白)之DED (死亡效應結構域)及Fas。在一些實施例中,基因產物包括影響宿主之血管生成路徑之蛋白質,例如血管內皮生長因子(VEGF)及Versikine(VK)。在一些實施例中,基因產物包括影響宿主之免疫系統之蛋白質,例如最小化補體調節因子H (miniFH)、
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)、牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)及人類LIGHT突變體(hmLIGHT)。該等基因產物之特徵闡述於本文及別處。
具體而言,本文所提供之病毒可經修飾以在活體內及活體外表現基因。在一些實施例中,病毒可經修飾以表現兩種或更多種基因產物,例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種基因產物,其中兩種或更多種基因產物之任一組合可為一或多種可偵測之基因產物。在一個實施例中,病毒可經修飾以表現細胞凋亡相關之基因產物。在另一實例中,病毒可經修飾以表現兩種或更多種基因產物用於產生融合蛋白。在一些實例中,參與血管生成之一或多種蛋白質可一起表現。當引入兩個或更多個異源基因時,該等基因可在相同或不同之調節序列下進行調節,且該等基因可在單一或複數個遺傳操縱步驟中插入病毒基因體之相同或不同區域中。在一些實施例中,一個基因可處於組成型啟動子之控制下,而第二基因可處於誘導型啟動子之控制下。用於將兩個或更多個基因插入病毒中之方法為此項技術中已知且可容易地對眾多種病毒使用眾多種外源基因、調節序列及/或其他核酸序列實施。
本文所提供之病毒可藉由如本文所述之插入、缺失、取代或突變來修飾。藉由插入、缺失、取代及突變核酸來修飾病毒之標準方法為此項技術中所熟知。該等方法包括活體外重組技術、合成方法、直接選殖及活體內重組方法。參見例如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor N.Y.(1989)及本文所揭示之實例。用於產生重組病毒之技術包括核酸轉移方案、各種核酸操縱技術、核酸擴增方案,且通常涉及使用分子生物學中之標準技術產生基因盒或轉移載體。參見例如美國專利第5,494,807號及美國專利第5,185,146號,其闡述產生重組痘瘡病毒之例示性方法及此項技術中已知之其他分子生物學技術。使用重組DNA技術產生重組病毒之方法為此項技術中所熟知(例如參見美國專利第4,769,330號;美國專利第4,603,112號;美國專利第4,722,848號;美國專利第4,215,051號;美國專利第5,110,587號;美國專利第5,174,993號;美國專利第5,922,576號;美國專利第6,319,703號;美國專利第5,719,054號;美國專利第6,429,001號;美國專利第6,589,531號;美國專利第6,573,090號;美國專利第6,800,288號;美國專利第7,045,313號;He等人(1998) PNAS 95(5): 2509-2514;Racaniello等人(1981) Science 214: 916-919;及Hruby等人(1990) Clin Micro Rev. 3:153-170)。用於產生重組痘瘡病毒之方法為此項技術中所熟知(例如參見Hruby等人(1990) Clin Micro Rev. 3:153-170;美國專利公開案第2005-0031643號,現為美國專利第7,588,767號、美國專利第7,588,771號、美國專利第7,662,398號及美國專利第7,045,313號)。
在一些實施例中,可使用同源重組將核酸分子之插入或缺失引入所關注之靶序列中。核酸工具(例如載體、質體、啟動子及其他調節序列)於眾多種病毒及細胞生物體之用途為此項技術中所熟知。核酸擴增方案包括(但不限於)聚合酶鏈反應(PCR)或經由病毒或生物體(例如但不限於酵母、細菌、昆蟲或哺乳動物細胞)擴增。核酸轉移方案包括電穿孔、氯化鈣轉型/轉染、脂質體介導之核酸轉移及其他方案。修飾核酸之眾多種工具可自許多不同來源獲得,包括各種商業來源。舉例而言,可經由使用寡核苷酸介導之定點誘變將點突變或小插入或缺失引入所關注之基因中。在另一實例中,可使用同源重組將突變引入核酸序列中,或將核酸分子插入所關注之靶序列中或使該核酸分子缺失。在一些實例中,可使用正或負選擇壓力來選擇特定基因中核酸之突變、插入或缺失。參見例如Current Techniques in Molecular Biology (Ausubel等人編輯)。根據此項技術中之知識及設計選擇,熟習此項技術者將能夠容易地選擇適於任一特定病毒之遺傳修飾之工具及方法。在一些實施例中,將質體用於同源重組以構造重組病毒。在一些實施例中,質體係使用基因剪接連結兩個片段來構造。在一些實施例中,用於擴增兩個片段之引子包含SEQ ID NO: 14、15、16、17、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、94、95、96或97之70%、80%、90%或100%。
插入、缺失、取代或突變可特異性地針對病毒基因體中之特定序列。病毒基因體中之該等序列包括(但不限於)基因間序列、調節序列、不具已知作用之序列、基因編碼序列或病毒基因體之非必需區域。對於許多病毒,可用於修飾之病毒基因體區域為此項技術中所熟知。
在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含至少一種病毒基因之不活化突變。不活化突變不受特定限制,且在一些實施例中可為導致病毒基因之基因產物與不具不活化突變相比具有較少功能或不具功能之任一突變。在一些實施例中,不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。在一些實施例中,至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。在一些實施例中,至少一種病毒基因之缺失係病毒基因ORF之一部分缺失。在一些實施例中,至少一種病毒基因之缺失係足以使經編碼之基因產物無功能之病毒基因ORF之一部分缺失。在一些實施例中,至少一種病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。在一些實施例中,至少一種病毒基因包含兩種或更多種選自由以下組成之群之病毒基因:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。在一些實施例中,至少一種病毒基因係A35R。在一些實施例中,至少一種病毒基因係J2R。在一些實施例中,至少一種病毒基因係B2R。在一些實施例中,至少一種病毒基因係B2R。在一些實施例中,至少一種病毒基因係B2R。在一些實施例中,至少一種病毒基因包含A35R及J2R。在一些實施例中,至少一種病毒基因係B2R。在一些實施例中,至少一種病毒基因包含B2R及J2R。
通常將異源核酸分子插入病毒基因體中之基因間區域或編碼非必需病毒基因產物之基因座中。將異源核酸插入該等位點通常不會顯著影響靶組織中之病毒感染或複製。插入位點之實例包括(但不限於) J2R (胸苷激酶(TK))、A56R (血球凝集素(HA))、F14.5L、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、N1L、E2L/E3L、K1L/K2L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C7-K1L (宿主範圍基因區域)、B13R+B14R (出血區)、A26L (A型包涵體區域(ATI))或I4L (大次單元、核糖核苷酸還原酶)基因座。本文所提供病毒之插入位點亦包括對應於其他痘病毒中所述之基因內區域之位點,例如經修飾之安卡拉痘瘡(Modified Vaccinia Ankara,MVA)病毒) (美國專利第7,550,147號中所述之例示性位點)、NYVAC (美國專利第5,762,938號中所述之例示性位點)。在一些實施例中,插入、缺失、取代及/或突變位點包括J2R、F14.5L及/或A35R。
舉例而言,產生表現異源基因產物之重組痘瘡病毒通常包括使用重組質體,其含有視情況地可操作地連接至啟動子之異源核酸,且痘瘡病毒DNA序列側接異源核酸以促進基因同源重組並插入病毒基因體中。通常,側接異源基因之病毒DNA與痘瘡病毒DNA之非必需區段互補,使得該基因插入非必需位置或任何其他位置中。重組質體可生長於大腸桿菌中且自大腸桿菌純化並引入適宜宿主細胞(例如但不限於CV-1、BSC-40、BSC-1及TK-143細胞)中。然後用痘瘡病毒超感染經轉染之細胞,從而起始複製週期。可經由同源重組將異源DNA痘瘡病毒基因體中,且包裝至感染後代中。可藉由此項技術中已知之方法、例如藉由偵測異源基因產物之表現或藉由使用正或負選擇方法來鑑別重組病毒(美國專利第7,045,313號)。在一些實施例中,藉由將質體同源納入對應於J2R基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將質體同源納入對應於A35R基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將質體同源納入對應於F14.5L基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將一種質體同源納入對應於J2R基因之病毒基因體區域中並將另一質體納入對應於F14.5L基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將一種質體同源納入對應於J2R基因之病毒基因體區域中並將另一質體納入對應於F14.5L基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將一種質體同源納入對應於J2R基因之病毒基因體區域中並將另一質體納入對應於A35R基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將一種質體同源納入對應於F14.5L基因之病毒基因體區域中並將另一質體納入對應於A35R基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。在一些實施例中,藉由將一種質體同源納入對應於J2R基因之病毒基因體區域中並將另一質體納入對應於A35R基因之病毒基因體區域中、且將另一質體納入對應於F14.5L基因之病毒基因體區域中來產生重組病毒。
在另一實例中,表現異源基因產物之重組痘瘡病毒可藉由直接選殖來產生(參見例如美國專利第6,265,183號及Scheiflinger等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9977-9981)。在該等方法中,視情況地可操作地連接至啟動子之異源核酸側接有限制性核酸內切酶裂解位點以插入靶病毒中之獨特限制性核酸內切酶位點中。使用標準技術純化病毒DNA且用序列特異性限制性核酸內切酶裂解,其中該序列係病毒基因體中之獨特位點。可採用病毒基因體中之任一獨特位點,條件係該位點之修飾不會干擾病毒複製。通常,插入處於位於病毒基因體之非必需區域中之位點中。舉例而言,本文之例示性修飾包括將外來DNA序列插入NotI消化之病毒DNA中。
在一些實例中,異源核酸亦可含有一或多個調節序列來調節編碼異源RNA及/或蛋白質之開放閱讀框之表現。例如在哺乳動物宿主細胞中有功能之適宜調節序列為此項技術中所熟知。由病毒表現之一或多種蛋白質或RNA分子亦可影響表現。基因調節元件(例如啟動子及增強子)具有細胞類型特異性活性且可經由反應元件由某些誘導因子(例如激素、生長因子、細胞介素、細胞生長抑制劑、照射、熱休克蛋白)活化。該等基因之受控及限制性表現可使用諸如內部啟動子之調節元件來達成以驅動病毒載體構造體中之基因之表現。
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之異源核酸可操作地連接至啟動子。在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之一或多種異源核酸可操作地連接至啟動子用於異源RNA及/或蛋白質之表現。舉例而言,可操作地連接至啟動子之異源核酸亦稱為表現盒。因此,本文所提供之病毒可具有表現一或多個異源基因之能力。基因表現可包括由基因編碼之蛋白質之表現及/或由基因編碼之RNA分子之表現。在一些實施例中,本文所提供之病毒可以足夠高至允許自腫瘤收穫外源基因產物之水準表現外源基因。異源基因之表現可由組成型啟動子或誘導型啟動子控制。在其他實例中,器官或組織特異性表現可由調節序列控制。為僅在靶器官(例如欲處理腫瘤)中達成表現,外來核苷酸序列可連接至組織特異性啟動子並用於基因療法。該等啟動子為熟習此項技術者所熟知(參見例如Zimmermann等人,Neuron 12: 11-24 (1994);Vidal等人,EMBO J. 9: 833-840 (1990);Mayford等人,Cell 81: 891-904 (1995);及Pinkert等人,Genes & Dev.1: 268-76 (1987))。
用於表現異源基因之例示性啟動子為此項技術中已知。異源核酸可操作地連接至天然啟動子或不為病毒天然之異源啟動子。可使用任何適宜啟動子,包括合成、天然及經修飾之啟動子。例示性啟動子包括合成啟動子,包括合成病毒及動物啟動子。天然啟動子或異源啟動子包括(但不限於)病毒啟動子,例如痘瘡病毒及腺病毒啟動子。
在一些實施例中,啟動子係痘病毒啟動子,例如痘瘡病毒啟動子。因此,在一些實施例中,啟動子係痘病毒啟動子或係其變異體或衍生物,例如痘瘡病毒啟動子。在一些實施例中,啟動子係痘瘡病毒啟動子。用於表現一或多個異源基因之痘瘡病毒啟動子可為合成或天然啟動子,且包括痘瘡早期、中期、早期/晚期及晚期啟動子。用於控制異源基因表現之例示性痘瘡病毒啟動子包括(但不限於) 7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5、LEO、P7.5k、P11k、PSE、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或K1啟動子。因此,在一些實施例中,編碼異源基因產物之核酸可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5、LEO、P7.5k、P11k、PSE、PSEL、PSL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1 L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b及K1啟動子。其他病毒啟動子包括(但不限於)腺病毒晚期啟動子、牛痘ATI啟動子或T7啟動子。可使用強晚期啟動子來達成異源基因之高表現水準。亦可使用早期及中期啟動子。在一個實例中,啟動子含有早期及晚期啟動子元件,例如經修飾之H5啟動子PmH5,其含有痘瘡病毒之天然早期及晚期痘瘡啟動子區域、合成早期/晚期痘瘡PSEL啟動子及PSE合成早期啟動子(Hammond等人,Journal of Virological Methods 66:1, 135-138 (1997);Stritzker等人,Journal of Virology 88:19, 11556-11567 (2014);Kugler等人,Virol J. 16: 100 (2019))。在一些實施例中,啟動子係合成強早期啟動子(SSE)。在一些實施例中,啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)。
在一些實施例中,啟動子選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。在一些實施例中,啟動子具有SEQ ID NO: 29、53、55、68、69、70、71或72中之任一者中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,啟動子具有SEQ ID NO: 29中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,啟動子係合成強早期啟動子(SSE)且包含SEQ ID NO: 29中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,啟動子具有SEQ ID NO: 55中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)且包含SEQ ID NO: 55中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,啟動子係痘病毒啟動子,且痘病毒啟動子係mH5。在一些實施例中,痘病毒啟動子係mH5且包含SEQ ID NO: 53中所述之胺基酸序列。
可使用不同啟動子之組合在相同病毒或兩種不同病毒中表現不同之基因產物。由於使用較強啟動子對較弱啟動子,本文所提供之病毒可展現特徵之差異,例如減毒。舉例而言,在痘瘡中,合成早期/晚期及晚期啟動子係相對較強之啟動子,而痘瘡合成早期啟動子係相對較弱之啟動子(參見例如Chakrabarti等人(1997) BioTechniques 23(6) 1094-1097)。
如此項技術中已知,調節序列可允許外源基因之組成型表現或可允許外源基因之誘導型表現。另外,調節序列可允許控制外源基因之表現水準。在一些實例(例如基因產物製造及收穫)中,調節序列可產生組成型高水準之基因表現。在一些實例(例如抗(基因產物)抗體收穫)中,調節序列可產生組成型較低水準之基因表現。在腫瘤療法實例中,治療性蛋白質可處於內部誘導型啟動子或外部誘導型啟動子之控制下。
因此,異源基因之表現可由組成型啟動子或誘導型啟動子控制。誘導型啟動子可用於提供異源基因之組織特異性表現或可藉由添加調節分子來誘導以提供啟動子之時間特異性誘導。在一些實例中,誘導型表現可處於細胞或存在於腫瘤細胞中或存在於病毒感染之腫瘤細胞中之其他因子之控制下。在其他實例中,誘導型表現可處於可投與物質(包括IPTG、RU486或其他已知誘導化合物)之控制下。可使用其他調節序列來控制插入病毒之一或多個異源基因之表現。熟習此項技術者根據已知因素及設計偏好可獲得多個調節序列中之任一者。
在一些實施例中,一或多種異源基因產物包含治療劑或診斷劑。在一些實施例中,一或多種異源基因產物(例如治療劑或診斷劑)尤其選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、用於組織再生及將人類體細胞再程式化成多能性之基因、修飾受質以產生可偵測之產物或信號或可由抗體偵測到之酶、可結合對比劑之蛋白質、用於光學成像或偵測之基因、用於PET成像之基因及用於MRI成像之基因。在一些實施例中,一或多種異源基因產物(例如治療劑或診斷劑)包含尤其選自以下之治療劑:激素、生長因子、細胞介素、趨化介素、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制劑、腫瘤抑制因子、細胞毒性蛋白、細胞生長抑制蛋白及組織因子。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含含有至少一種異源核酸之核酸序列,該至少一種異源核酸編碼一或多種異源基因產物,例如本文、例如部分III之部分A、B、C及D中所述之任一異源基因產物,包括例如一或多種選自由以下組成之群之異源基因產物:補體抑制劑、T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或其任一組合,及視情況地至少一種病毒基因(例如病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座)中之一或多者之不活化突變,視情況地其中一或多種病毒基因係B2R、J2R、A35R及A56R及其任一組合中之一或多者。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 80中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 80中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 82中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 82中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 84中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 84中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 86中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 87中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 87中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 88中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 88中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 89中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 91中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 91中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 92中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 92中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 93中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含A35R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 3之核酸序列,或與SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 12之核酸序列,或與SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質,且其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸,將該一或多種異源核酸引入病毒膜基因中以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端,且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 10之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 4之核酸序列,或與SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 11之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 13之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 47之核酸序列,或與SEQ ID NO: 47中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)、誘導型Fas (iFas)或誘導型Cas9 (iCas9),視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 7、8或9之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7、8或9中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50或93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50或93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48之核酸序列,或與SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 80之核酸序列,或與SEQ ID NO: 80中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A35R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;B2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 82之核酸序列,或與SEQ ID NO: 82中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2,視情況地其中IL-2係IL-2超因子,視情況地MDNA11;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 84之核酸序列,或與SEQ ID NO: 84中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED);且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 87之核酸序列,或與SEQ ID NO: 87中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11T,視情況地其中MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子,視情況地MDNA11或MDNA11T;編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將其導入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 89之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質;B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將其導入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 91之核酸序列,或與SEQ ID NO: 91中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含B2R、J2R及A56R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 92之核酸序列,或與SEQ ID NO: 92中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒包含:至少一種病毒基因之不活化突變;及編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,視情況地其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合;且其中:至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;且特徵在於以下中之一或多者:(i)變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;(ii)變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;(iii)變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;(iv)變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及(v)變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
在該等實施例中任一者之一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;且特徵在於以下中之一或多者:(i)對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);(ii)對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);(iii)對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;(iv)對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;(v)對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);(vi)對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;(vii)對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;(viii)對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);(ix)對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及(x)對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
A. 隱形病毒
在多個實施例中,本文提供重組病毒,其包含編碼可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現之「隱形蛋白」之異源核酸。該等隱形蛋白可增加病毒逃避宿主之免疫系統攻擊(例如藉由T細胞,例如細胞毒性T淋巴球(CTL)或天然殺手(NK)細胞)之能力。在一些實施例中,該等隱形蛋白可增加重組病毒逃避宿主之補體級聯/系統活化之能力。
因此,在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含補體抑制劑或T細胞或NK細胞逃避劑(有時亦稱為隱形蛋白)。
在一些實施例中,重組病毒包括溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒不包括溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒包括本文所述或以引用方式併入本文中之任何病毒。在一些實施例中,重組病毒包括痘瘡病毒。在一些實施例中,重組病毒包括VIP02衍生病毒。
溶瘤病毒(OV)可產生有利於免疫系統抵抗獨特癌細胞決定簇之作用之微環境;然而,在基於OV之療法期間,針對來自所得感染之病毒抗原觸發之抗病毒免疫性亦起關鍵作用。實際上,所誘導之抗病毒免疫性可能對癌症病毒療法有害,此乃因預期針對病毒本身之免疫系統活化會限制病毒複製及擴散,從而導致治療效力降低。Lemos de Matos等人,Mol Ther Methods Clin Dev.2020年6月12日; 17: 349-358。補體系統保持對病毒之持續監視。其識別病毒及病毒感染細胞以及觸發免疫反應之能力導致病毒之中和及經感染細胞之殺傷。補體對病毒發揮之此選擇壓力已使該等病毒進化出多種對策。Agrawal等人,Front Microbiol. 2017; 8: 1117。
在一些實施例中,隱形蛋白包括(但不限於)伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)、最小化補體調節因子H (miniFH)以及牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)。關於隱形蛋白及參與宿主免疫系統逃避(例如逃避宿主之補體或NK或T細胞毒性)之機制之其他細節可參見Monrat Chulanetra及Wanpen Chaicumpa, Front. Cell. Infect. Microbiol., 2021, Front. Cell. Infect. Microbiol.11:702125,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
補體系統係先天性免疫之重要組分,其幫助消除病原體且因此在進化過程中,病原體已發展出多種策略來避免補體活化之破壞。一種策略係能夠獲得允許病原體控制參與宿主感染時之免疫反應活化之步驟的蛋白質,下文稱為「隱形蛋白」。參見Kraiczy等人,Infect Immun.2001年12月; 69(12): 7800-7809。
補體系統採用30種以上之血漿及細胞膜蛋白之蛋白水解裂解之複雜級聯,且導致發炎反應之誘導、吞噬細胞及嗜中性球趨化性、病原體中和及後續調理作用以及經感染細胞之溶解。活化可經由三條獨立路徑來起始:(i)經典路徑,級聯C1q中之第一種組分與抗體-抗原複合物結合;(ii)替代路徑,下游補體組分3 (C3)轉化酶之自發水解及其與病原體表面之相互作用;(iii)藉由MBL與病原體表面上之甘露糖殘基結合觸發之甘露糖結合凝集素(MBL)路徑。所有三條路徑在C3裂解成C3a、抗微生物肽及C3b (結合至病原體且標記其降解之調理素)之時期匯聚。由於在補體級聯中產生之效應化合物可遞送至包括宿主膜在內之任一表面,完整宿主細胞藉由表現多種補體調節蛋白來保護自身。Janeway等人,Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 第5版。
對補體系統之控制不足係許多人類疾病之潛在或惡化因素。補體之替代路徑(AP)具有保持持續且無區別地活化之獨特性質,儘管水準較低。在AP中,C3b經由正反饋擴增環路自我繁殖,此需要由兩種關鍵可溶性AP調節因子H (FH)及其剪接產物FH樣1 (FHL-1)介導之非常緊密的調節。隱形蛋白係FH之經改造形式miniFH,其僅含藉由最佳化肽連接之FH之N末端及C末端部分且顯示與FH相比高約10倍之抑制補體活化之離體功效。Markus J. Harder,*J Immunol. 作者手稿;於2017年1月15日在PMC獲得. J Immunol. 2016年1月15日; 196(2): 866-876。及Christoph Q. Schmidt / J Immunol. 作者手稿;於2014年6月1日在PMC獲得.J Immunol. 2013年6月1日; 190(11): 10.4049/jimmunol.1203548. 於2013年4月24日在線公開. doi: 10.4049/jimmunol.1203548。
已在進化期間發展出藉由產生隱形蛋白避免補體之能力之微生物係伯氏疏螺旋體,其係導致萊姆病(Lyme disease,LD)之螺旋體,萊姆病係北半球最常見之由蜱傳播之媒傳疾病。在蜱進食時,螺旋體暴露於宿主血液且因此暴露於先天性免疫之第一線,其必須克服該第一線才能存活。伯氏疏螺旋體已發展出之關鍵逃避機制係產生補體或CRP結合蛋白,包括CRASP,其係可促進補體不活化之隱形蛋白。參見Yi-Pin Lin等人,Front Cell Infect Microbiol.2020; 10: 1.US20120142023A1。CRASP-2 (亦稱為CspZ)結合至FH/FHL-1以藉由抑制螺旋體表面上之補體活化來賦予功能獲得性伯氏疏螺旋體中之血清抗性。Infect Immun.2001年12月; 69(12): 7800-7809. Peter Kraiczy。US20200323972A1。用於產生針對伯氏疏螺旋體之免疫性之組合物及方法。
細胞表面上I類MHC之下調係由許多DNA病毒(包括牛痘病毒)共享之免疫逃避機制。CPXV係正痘病毒屬之成員,該正痘病毒屬包括天花病毒、駱駝痘病毒及猴痘病毒且編碼詳盡的免疫逃避蛋白庫。CPXV感染寬范圍之哺乳動物宿主之能力可能歸因於以下事實:在正痘病毒中,CPXV編碼預期編碼免疫調節蛋白之最完整的開放閱讀框集合。經編碼之蛋白質尤其係CPXV012及CPXV203,其可藉由干擾MHC I介導之抗原呈遞來防止細胞毒性T細胞識別。儘管CPXV012抑制細胞液至ER之抗原肽轉運,但CPXV203阻斷MHCI運輸至細胞表面。Dina Alzhanova及Klaus Früh* Microbes Infect.2010年11月; 12(12-13): 900-909。McCoy等人,Molecular Immunology 55 (2013) 156-158。另外,Birghton Red株產生OMCP (亦稱為CPXV018),其係自經感染細胞大量分泌且可在活體外阻斷天然殺手細胞對NKG2D介導之靶細胞之殺傷的171個殘基之蛋白質。Cell Host & Microbe第6卷,第5期,2009年11月19日,第422-432頁/ Journal home page for Cell Host & Microbe / Two Mechanistically Distinct Immune Evasion Proteins of Cowpox Virus Combine to Avoid Antiviral CD8 T Cells。
在一些實施例中,一或多種異源基因產物包含補體抑制劑。在一些實施例中,補體抑制劑係
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)或最小化補體調節因子H (miniFH)。在一些實施例中,補體抑制劑係CRASP-2基因產物(UniProtKB-050665)。CRASP-2蛋白可增加重組病毒逃避宿主補體之能力。特定而言,在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有在痘瘡F14.5L基因啟動子控制下融合至F14.5L基因座之CRASP-2 cDNA。在一些實施例中,CRASP-2分子包括全長CRASP-2。在一些實施例中,補體抑制劑係CRASP-2且具有與SEQ ID NO:18中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,補體抑制劑具有SEQ ID NO:18中所述之序列。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼CRASP-2分子之異源核酸,該分子包含融合至F14.5L基因座之CRASP-2 cDNA,其中CRASP-2包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列小於100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中,編碼CRASP-2基因產物之異源核酸可操作地連接至F14.5L基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼CRASP-2基因產物(例如包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列)之異源核酸之重組病毒衍生自純系VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株且包括與SEQ ID NO: 5 (亦稱為VIR27)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,異源基因產物係CRASP-2且可操作地連接至病毒基因體中之F14.5L基因啟動子。在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 5之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 5之核酸序列小於100%一致之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:5中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,異源基因產物係CRASP-2並可操作地連接至病毒基因體中之F14.5L基因啟動子,且重組病毒包含與SEQ ID NO: 5之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,異源基因產物係CRASP-2並可操作地連接至病毒基因體中之F14.5L基因啟動子,且重組病毒包含SEQ ID NO: 5之核酸序列。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含SEQ ID NO: 5之核酸序列。包含SEQ ID NO: 5之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR27。
在多個實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的逃避宿主補體之能力。在一些實施例中,本文所提供之重組病毒可避開活體內及活體外系統中之補體抑制。在具體實施例中,在將有效劑量之VIR27 (包含SEQ ID NO: 5之核酸序列)與人類及/或BABL/c小鼠血清一起培育時,VIR27 (包含SEQ ID NO: 5之核酸序列)可避開活體外補體抑制系統中之補體抑制(
圖 6)。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR27 (包含SEQ ID NO: 5之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長(
圖 7)。
在一些實施例中,補體抑制劑係miniFH基因產物。特定而言,在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其包含在痘瘡F14.5L基因啟動子控制下融合至F14.5L基因座之miniFH cDNA。關於minFH之其他細節可參見Schmidt等人,J Immunol.2013年6月1日; 190(11): 10.4049/jimmunol.1203548.,其出於所有目的以引用方式併入本文中。在一些實施例中,補體抑制劑係miniFH基因產物,其包含與SEQ ID NO:19中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,補體抑制劑係miniFH基因產物,其包含SEQ ID NO:19中所述之胺基酸序列。
在一些實施例中,隱形蛋白包括基於FH之抑制劑miniFH。在一些實施例中,miniFH基因產物可增加重組病毒逃避宿主補體之能力。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼miniFH基因產物之多核苷酸,包括融合至F14.5L基因座之miniFH cDNA,其中miniFH多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含多肽,其包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列小於100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:6中所述之核酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,異源基因產物係miniFH並可操作地連接至病毒基因體中之F14.5L基因啟動子,且重組病毒包含與SEQ ID NO: 6之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,異源基因產物係miniFH並可操作地連接至病毒基因體中之F14.5L基因啟動子,且重組病毒包含SEQ ID NO: 6之核酸序列。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含SEQ ID NO: 6之核酸序列。包含SEQ ID NO: 6之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR37。
在一些實施例中,編碼miniFH分子之多核苷酸可操作地連接至F14.5L基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼miniFH分子(例如包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列)之多核苷酸之重組病毒衍生自純系VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列)株且包括與SEQ ID NO: 6 (亦稱為VIR37)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 6之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 6小於100%一致之核酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含核酸序列,其包含SEQ ID NO: 6之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:6中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 6之核酸序列。
在多個實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的逃避宿主補體之能力。在一些實施例中,本文所提供之重組病毒可避開活體內及活體外系統中之補體抑制。在具體實施例中,在將有效劑量之VIR37 (包含SEQ ID NO: 6之核酸序列)與人類及/或BABL/c小鼠血清一起培育時,VIR37 (包含SEQ ID NO: 6之核酸序列)可避開活體外補體抑制系統中之補體抑制(
圖 6)。
在一些實施例中,一或多種異源基因產物係T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑。T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑基因產物可增加病毒逃避宿主免疫系統攻擊(例如藉由T細胞,例如細胞毒性T淋巴球(CTL)或天然殺手(NK)細胞)之能力。具體而言,該等T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑基因產物可增加重組病毒逃避宿主補體級聯/系統活化之能力。
在一些實施例中,T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑係由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。CPXV012-203-018係合成DNA片段。ORF 012、203及018單獨在其自身啟動子下在CPXV012-203-018合成DNA片段內表現以編碼CPXV012、CPXV203及CPXV018蛋白。牛痘病毒藉由CPXV012及CPXV203逃避CTL。儘管CPXV012抑制細胞液至內質網(ER)之抗原肽轉運,CPXV203藉由利用KDEL-受體再循環路徑來阻斷MHC I運輸至細胞表面。CPXV018編碼可溶性NKG2D配位體,稱為正痘病毒I類主要組織相容性複合物(MHC)樣蛋白(OMCP),其可阻斷NKG2D介導之細胞毒性。
表現CRASP-2基因產物(UniProtKB-050665)之重組病毒以及牛痘病毒開放閱讀框(ORF) 012、203及018 (CPXV012-203-018)已在本文之多個實施例中產生。特定而言,在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含表現盒,其含有在痘瘡F14.5L基因啟動子控制下融合至F14.5L基因座之CRASP-2 cDNA及連續多核苷酸序列,包括開放閱讀框(ORF) 012、203及018及其插入J2R基因座中之自身啟動子(CPXV012-203-018)。
在一些實施例中,隱形蛋白包括伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)。在一些實施例中,CRASP-2蛋白之表現可增加重組病毒逃避宿主補體之能力。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼CRASP-2分子之多核苷酸,該分子包括融合至F14.5L基因座之CRASP-2 cDNA,其中CRASP-2多肽包含與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,隱形蛋白包含牛痘病毒開放閱讀框(ORF) 012、203及018及其自身啟動子(CPXV012-203-018)。在一些實施例中,牛痘病毒開放閱讀框(ORF) 012、203及018 (CPXV012-203-018)之表現可增加重組病毒逃避宿主T及NK細胞之能力。在一些實施例中,包括CRASP-2及牛痘病毒開放閱讀框(ORF) 012、203及018之隱形蛋白之表現可增加重組病毒逃避宿主補體以及T及NK細胞之能力。
在一些實施例中,T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑係由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質,其包含SEQ ID NO: 20、21及22之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20、21及22之胺基酸序列具有至少70%、80%、85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含編碼CPXV012之多肽,其具有與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列小於100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含編碼CPXV203之多肽,其具有與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列小於100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含編碼CPXV018之多肽序列,其具有與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列小於100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
在一些實施例中,T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑係由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質,且由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含與SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列、與SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列、及與SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22中所述之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼CRASP-2之多肽,其具有與SEQ ID NO: 18具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含編碼多肽之核酸序列,該多肽與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性,但與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列小於100%一致。在一些實施例中,重組病毒包含編碼SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之核酸序列。在一些實施例中,編碼CRASP-2分子之多核苷酸可操作地連接至F14.5L基因啟動子。在一些實施例中,編碼CPXV012、CPXV203及CPXV018之核苷酸序列插入J2R基因體區域中。
在一些實施例中,包含編碼CRASP-2 (例如SEQ ID NO: 18)、CPXV012 (例如SEQ ID NO: 20)、CPXV203 (例如SEQ ID NO: 21)及CPXV018 (例如SEQ ID NO: 22)之核酸序列之重組病毒衍生自VIR27 (包含SEQ ID NO: 5之核酸序列)株且包含與SEQ ID NO: 10 (亦稱為VIR46)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 10之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 10之核酸序列小於100%一致之核酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 10之核酸序列。包含SEQ ID NO: 10之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR46。
在多個實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的逃避宿主補體之能力。在一些實施例中,本文所提供之重組病毒可避開活體內及活體外系統中之補體抑制。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR46 (包含SEQ ID NO: 10之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長(
圖 8)。
B. 免疫調節病毒
在多個實施例中,本文提供重組病毒,其包含編碼可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現之免疫調節蛋白之異源核酸。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括細胞介素、趨化介素、免疫受體、免疫受體之抗原、免疫細胞活化路徑中之蛋白質、免疫細胞內刺激免疫細胞活化或細胞介素自免疫細胞分泌之傳訊蛋白及抗原。在一些實施例中,免疫調節蛋白包含一或多種細胞介素及/或趨化介素。在一些實施例中,一或多種細胞介素及/或趨化介素包含趨化介素配位體9 (CXCL9)、IL-2及IL-12中之一或多者。在一些實施例中,免疫調節蛋白係腫瘤壞死因子超家族成員14 (LIGHT)。在一些實施例中,免疫調節蛋白係活化類鐸受體3 (TLR3)-干擾素調節因子3 (IRF3)傳訊路徑之干擾素調節因子。在一些實施例中,免疫調節蛋白係介白素12 (IL-12)。在一些實施例中,免疫調節蛋白係趨化介素配位體9 (CXCL9)。在一些實施例中,免疫調節蛋白係IL-2或IL-2超因子。在一些實施例中,免疫調節蛋白係介白素2 (IL-2)超因子。在一些實施例中,免疫調節蛋白係MDNA11。在一些實施例中,MDNA11已突變以增加重組病毒抗腫瘤功效且免疫調節蛋白係MDNA11T。在一些實施例中,重組病毒包含編碼以下免疫調節蛋白中之一或多者之異源核酸:LIGHT、IRF3、IL-12、CXCL9、MDNA11、MDNA11T及其他免疫調節蛋白。在一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白係免疫刺激蛋白,例如LIGHT。
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸。在一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白係或包含一或多種細胞介素及/或趨化介素。在一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白係或包含一或多種干擾素調節因子,例如IRF3。在一些實施例中,一或多種免疫調節蛋白包含一或多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,例如下文進一步詳細論述之彼等蛋白質中之任一者。
1. 腫瘤壞死因子超家族成員 14 (LIGHT)
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸,其中一或多種免疫調節蛋白包含LIGHT。
LIGHT已在臨床前開發中存在十多年且已證實係治療各種類型之癌症之有希望的方式。LIGHT已成功地用於清除已建立之實體腫瘤以及治療轉移事件。當在腫瘤中表現時,LIGHT分子引起腫瘤微環境之顯著變化,該等變化主要係經由血管正常化及產生三級淋巴結構(TLS)來驅動。該等淋巴結構之形成可藉由活化淋巴毒素β-受體(LTBR/TNFRSF3)來誘導,該受體係可由LIGHT活化之TNF超家族之受體。參見Schrama等人,Immunity 14:111-121 (2001);Tang等人,Cell. Mol. Immunol. 14:809-18 (2017)。腫瘤微環境中TLS之存在通常與免疫浸潤相關聯且其與較佳預後相關,此表明TLS參與抗腫瘤免疫反應。參見Dieu-Nosjean等人,J. Clin. Oncol. 26:4410-17 (2008)以及Weinstein及Storkus, Adv. Cancer Res. 128:197-233 (2015)。舉例而言,具有改良之穩定性以及人類及小鼠交叉反應性之同源三聚體單鏈LIGHT變異體(稱為3×hmLIGHT)融合至EGFR特異性腫瘤靶向抗體,在小鼠及人類腫瘤模型中藉由增加淋巴球浸潤來誘導抗腫瘤免疫性。因此,LTBR之活化具有促進腫瘤微環境中之TLS形成、誘導抗腫瘤免疫反應及改良目前癌症免疫療法之潛能。關於LIGHT之抗致瘤性質之其他細節可參見美國公開案第2021/0188990號,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫刺激蛋白。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼免疫刺激蛋白之至少一種異源核酸,該等免疫刺激蛋白可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現。該等免疫刺激蛋白可增加病毒之抗致瘤性質。具體而言,該等免疫刺激蛋白可增加重組病毒誘導宿主免疫系統之腫瘤淋巴球浸潤之能力。在一些實施例中,重組病毒包括溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒不包括溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒包括本文所述或以引用方式併入本文中之任何病毒。在一些實施例中,病毒包括痘瘡病毒。在一些實施例中,病毒包括衍生自VIP02病毒株之重組病毒。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼免疫刺激蛋白之至少一種異源核酸,該等免疫刺激蛋白可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現且增加病毒之抗致瘤性質。因此,在一些實施例中,免疫刺激蛋白增加或增強病毒之抗致瘤性質。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括(但不限於)腫瘤壞死因子超家族成員14 (LIGHT),例如hmLIGHT。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括(但不限於)以引用方式納入本文中之任何免疫調節蛋白。
在一些實施例中,重組病毒表現hmLIGHT基因產物(NP_001363816 XP_016882906)。特定而言,一些實施例之所產生重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡PSE基因啟動子之控制下且插入A35R基因體區域中之全長hmLIGHT cDNA。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括hmLIGHT。在一些實施例中,hmLIGHT蛋白可增加重組病毒之抗腫瘤性質。
在一些實施例中,免疫刺激蛋白係LIGHT。在一些實施例中,免疫刺激蛋白係重組LIGHT。在一些實施例中,重組LIGHT係人類蛋白或係其突變體。
在一些實施例中,重組LIGHT包含與SEQ ID NO:30中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。在一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組LIGHT係hmLIGHT,其係結合人類及小鼠LTβR及HVEM之人類LIGHT突變體。在一些實施例中,重組LIGHT包含一或多個選自由以下組成之群之突變:位置138之蘇胺酸、位置160之甘胺酸、位置221之甘胺酸及位置222之離胺酸。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼hmLIGHT之核酸序列,其中hmLIGHT包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 25之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組LIGHT包含與SEQ ID NO:25中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組LIGHT包含SEQ ID NO:25中所述之序列。
在一些實施例中,重組病毒包含多肽,其具有與SEQ ID NO: 25之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,編碼hmLIGHT分子之多核苷酸可操作地連接至PSE基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼hmLIGHT基因產物(例如包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列)之多核苷酸之重組病毒衍生自VIR13 (包含SEQ ID NO: 4之核酸序列)株且包括與SEQ ID NO: 11 (亦稱為VIR49)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 11之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 11小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 11之核酸序列。包含SEQ ID NO: 11之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR49。
在一些實施例中,本文所提供之重組病毒、例如VIR49 (包含SEQ ID NO: 11之核酸序列)或包含與SEQ ID NO: 11之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列的重組病毒展現增加或增強的抗致瘤性質。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR49 (包含SEQ ID NO: 11之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在一些實施例中,向個體投與有效劑量之重組病毒(包含與SEQ ID NO: 11之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列)抑制腫瘤、增生及/或轉移生長。
在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含干擾素調節因子。如本文所述,溶瘤痘瘡病毒(VACV)之臨床有用性不僅與病毒直接破壞經感染癌細胞之能力相關,且亦與病毒活化針對腫瘤抗原之免疫反應之能力相關。引發強健的抗腫瘤免疫反應之一種方式係經由活化類鐸受體3 (TLR3)-干擾素調節因子3 (IRF3)傳訊路徑。因此,表現IRF3之病毒可增加病毒活化細胞抗腫瘤免疫性之能力。Riederer等人(2021) Molecular Therapy: Oncolytics, 22: (399-409)。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼一或多種免疫刺激蛋白(例如一或多種干擾素調節因子)之一或多種異源核酸,該等免疫刺激蛋白可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現且增加病毒之抗致瘤性質。在一些實施例中,免疫調節蛋白(例如干擾素調節因子)包括(但不限於)干擾素調節因子3 (IRF3)。因此,在一些實施例中,一或多種異源基因產物包含干擾素調節因子。在一些實施例中,干擾素調節因子係干擾素調節因子3 (IRF3)。在一些實施例中,IRF3係人類IRF3。在一些實施例中,IRF3係人類IRF3 (hIRF3)且hIRF3包含與SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,hIRF3包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。
2. 干擾素調節因子 3 (IRF3)
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸,其中一或多種免疫調節蛋白包含干擾素調節因子3 (IRF3)。
在一些實施例中,干擾素調節因子係小鼠IRF3。在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡基因啟動子之控制下且插入J2R基因體區域中之全長小鼠IRF3 cDNA。在一些實施例中,干擾素調節因子係人類IRF3。在一些實施例中,小鼠IRF3蛋白可增加重組病毒之抗腫瘤性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼小鼠IRF3分子之多核苷酸,其中IRF3多肽包含與SEQ ID NO: 52具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,IRF3係小鼠IRF3 (mIRF3),且mIRF3包含與SEQ ID NO: 52中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,mIRF3包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含多肽,其編碼與SEQ ID NO: 52具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含核苷酸序列,其編碼與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 52小於100%一致之多肽。在一些實施例中,重組病毒包含核苷酸序列,其編碼包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之多肽。
在一些實施例中,編碼IFR3分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼mIRF3基因產物(例如包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列)之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。
在一些實施例中,干擾素調節因子係mIRF3且重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含與SEQ ID NO: 50之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO: 50中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含SEQ ID NO: 50之核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 50之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR96。
在一些實施例中,所產生之重組病毒包括表現盒,其含有處於痘瘡基因啟動子之控制下且插入J2R基因體區域中之全長人類IRF3 cDNA。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括人類IRF3。在一些實施例中,人類IRF3蛋白可增加重組病毒之抗腫瘤性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼人類IRF3分子之多核苷酸,其中IRF3多肽包含與SEQ ID NO: 51具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含多肽,其具有與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 49、80、81、82、84、85、86、88、87、89、90、91、92或93之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 49、80、81、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 49、80、81、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93之核酸序列。包含SEQ ID NO: 49、80、81、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92或93之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦分別稱為VIR93、VIR100、VIR102、VIR103、VIR105、VIR106、VIR109、VIR111、VIR113、VIR114、VIR115、VIR123、VIR127或VIR128。
本文所提供之重組病毒展現增加的抗致瘤性質。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR93 (包含SEQ ID NO: 49之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在一些實施例中,向個體投與有效劑量之重組病毒(包含與SEQ ID NO: 49之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列)抑制腫瘤、增生及/或轉移生長。
3. 介白素 12 (IL-12)
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸,其中一或多種免疫調節蛋白包含IL-12。
介白素12 (IL-12)係在塑造先天性及適應性免疫反應方面起作用且可在控制癌症及腫瘤生長方面起作用之細胞介素。在一些實施例中,IL-12係人類IL-12。在一些實施例中,IL-12係小鼠IL-12。在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡基因啟動子之控制下且插入A56R基因體區域中之全長小鼠IL-12 cDNA。在一些實施例中,小鼠IL-12蛋白可增加重組病毒之抗腫瘤性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼小鼠單鏈IL-12 (mscIL-12)分子之多核苷酸,其中重組病毒包含與SEQ ID NO: 85、86或90具有至少90%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中,IL-12係單鏈IL-12。在一些實施例中,單鏈IL-12係人類單鏈IL-12 (hscIL-12)。在一些實施例中,人類單鏈IL-12包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,IL-12 (例如人類IL-12)包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,單鏈IL-12係小鼠單鏈IL-12 (mscIL-12)。在一些實施例中,小鼠單鏈IL-12包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,IL-12 (例如小鼠IL-12)包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 85、86或90具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 85、86或90之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 85、86或90小於100%一致之序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 85、86或90之序列之核苷酸序列。在一些實施例中,包含mscIL-12之重組病毒稱為VIR106、VIR109及/或VIR115。
在一些實施例中,編碼mscIL-12分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼mscIL-12基因產物之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。在一些實施例中,mscIL-12插入A56R基因體區域。在一些實施例中,mscIL-12可操作地連接至經修飾之H5 (mH5)啟動子。
在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼人類單鏈IL-12 (hscIL-12)分子之多核苷酸,其中重組病毒包含與SEQ ID NO: 92具有至少90%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 92具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 92之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 92小於100%一致之序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 92之序列之核苷酸序列。在一些實施例中,包含hscIL-12之重組病毒稱為VIR 115。
在一些實施例中,編碼hscIL-12分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼hscIL-12基因產物之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。在一些實施例中,hscIL-12插入A56R基因體區域。在一些實施例中,hscIL-12可操作地連接至經修飾之H5 (mH5)啟動子。
在一些實施例中,重組病毒包含hscIL-12及/或mscIL-12及其他免疫調節基因。在一些實施例中,其他免疫調節基因可包含本申請案中之任一免疫調節基因。在一些實施例中,其他免疫調節基因可包含其他細胞介素或趨化介素或抗原。
在一些實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的抗致瘤性質。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR106、VIR109、VIR115及/或VIR127 (分別包含SEQ ID NO: 85、86、90及92之核酸序列)抑制 活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在一些實施例中,向個體投與有效劑量之重組病毒(包含與SEQ ID NO: 85、86、90及92之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列)抑制腫瘤、增生及/或轉移生長。
4. 趨化介素配位體 9 (CXCL9)
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸,其中一或多種免疫調節蛋白包含CXCL9。
趨化介素配位體9 (CXCL9)係能夠協調細胞遷移且可能對塑造腫瘤微環境至關重要之趨化介素。在一些實施例中,CXCL9係人類CXCL9。在一些實施例中,CXCL9係小鼠CXCL9。在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡基因啟動子之控制下且插入A56R基因體區域中之全長小鼠CXCL9 cDNA。在一些實施例中,小鼠CXCL9蛋白可增加重組病毒之抗腫瘤性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼小鼠CXCL9 (mCXCL9)分子之多核苷酸,其中重組病毒包含與SEQ ID NO: 85、86或90具有至少90%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中,CXCL9係人類CXCL9 (hCXCL9)。在一些實施例中,人類CXCL9包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列具有至少85%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,CXCL9係小鼠CXCL9 (mCXCL9)。在一些實施例中,小鼠CXCL9包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列具有至少85%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 85、86或90具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 85、86或90之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 85、86或90小於100%一致之序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 85、86或90之序列之核苷酸序列。在一些實施例中,包含mCXCL9之重組病毒稱為VIR106、VIR109及/或VIR115。
在一些實施例中,編碼mCXCL9分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼mCXCL9基因產物之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。在一些實施例中,mCXCL9插入A56R基因體區域。在一些實施例中,mCXCL9可操作地連接至經修飾之H5 (mH5)啟動子。
在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼人類CXCL9 (hCXCL9)分子之多核苷酸,其中重組病毒包含與SEQ ID NO: 92具有至少90%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 92具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 92之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 92小於100%一致之序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 92之序列之核苷酸序列。在一些實施例中,包含hCXCL9之重組病毒稱為VIR 115。
在一些實施例中,編碼hCXCL9分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼hCXCL9基因產物之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。在一些實施例中,hCXCL9插入A56R基因體區域。在一些實施例中,hCXCL9可操作地連接至經修飾之H5 (mH5)啟動子。
在一些實施例中,重組病毒包含hCXCL9及/或mCXCL9及其他免疫調節基因。在一些實施例中,其他免疫調節基因可包含本申請案中之任一免疫調節基因。在一些實施例中,其他免疫調節基因可包含其他細胞介素或趨化介素或抗原。
在一些實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的抗致瘤性質。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR106、VIR109、VIR115及/或VIR127 (分別包含SEQ ID NO: 85、86、90及92之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在一些實施例中,向個體投與有效劑量之重組病毒(包含與SEQ ID NO: 85、86、90及92之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列)抑制腫瘤、增生及/或轉移生長。
5. IL-2 、 H9 、 H9T 、 MDNA11 及 MDNA11T
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸,其中一或多種免疫調節蛋白包含IL-2。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼免疫調節蛋白IL-2之一或多種異源核酸。在一些實施例中,IL-2包含SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,IL-2係IL-2超因子,例如H9、H9T、MDNA11或MDNA11T。因此,在一些實施例中,重組病毒編碼免疫調節蛋白,其係IL-2超因子。在一些實施例中,IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98、100、101及104中之任一者之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98、100、101及104中之任一者之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,IL-2超因子係H9 IL-2超因子。在一些實施例中,H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。如
圖 23B中所繪示,H9 IL-2超因子係野生型人類IL-2之經修飾變異體,其係藉由將以下胺基酸取代引入野生型人類IL-2來產生:L80F、R81D、L85V、I86V及I92F。在一些實施例中,野生型人類IL-2包含SEQ ID NO: 105中所述之胺基酸序列。
在一些實施例中,IL-2超因子係H9T IL-2超因子。H9T IL-2超因子係藉由將Q126T胺基酸取代引入H9 IL-2超因子中來產生,如
圖 23B中所繪示。在一些實施例中,H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,免疫調節蛋白(例如IL-2超因子)係MDNA11。
參見例如Merchant等人,Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2022; 10: e003155。在一些實施例中,免疫調節蛋白係IL-2超因子,其係MDNA11 IL-2超因子。在一些實施例中,MDNA11包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。如
圖 23B中所繪示,MDNA11 IL-2超因子係藉由將以下胺基酸取代引入H9 IL-2超因子中來產生:F42A及E62A。
在一些實施例中,免疫調節蛋白(例如IL-2超因子)係MDNA11T。在一些實施例中,免疫調節蛋白係IL-2超因子,其係MDNA11T IL-2超因子。MDNA11T係藉由將Q126T胺基酸取代引入MDNA11之胺基酸序列中來產生,如
圖 23B中所繪示。
參見例如Mo等人,Nature, 2021, 597(7877): 544-548。在一些實施例中,MDNA11T包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,IL-2超因子係H9、MDNA11或MDNA11T。
在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡基因啟動子之控制下且插入A56R基因體區域中之全長MDNA11 cDNA。在一些實施例中,小鼠MDNA11蛋白可增加重組病毒之抗腫瘤性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼MDNA11分子之多核苷酸,其中重組病毒包含與SEQ ID NO: 84、87或89具有至少90%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 84、87或89具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 84、87或89之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 84、87或89小於100%一致之序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 84、87或89之序列之核苷酸序列。在一些實施例中,包含MDNA11之重組病毒稱為VIR105、VIR111及/或VIR114。
在一些實施例中,編碼MDNA11分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼MDNA11基因產物之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。在一些實施例中,MDNA11插入A56R基因體區域。在一些實施例中,MDNA11可操作地連接至11K啟動子。
在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼突變MDNA11分子之多核苷酸。在一些實施例中,突變MDNA11分子係MDNA11T。在一些實施例中,突變處於胺基酸126處且胺基酸變成蘇胺酸。在一些實施例中,MDNA11T包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列。在一些實施例中,MDNA11T包含與SEQ ID NO: 98具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,與編碼非突變MDNA11之重組痘瘡病毒相比,編碼突變MDNA11之重組痘瘡病毒增加重組痘瘡病毒之抗腫瘤功效。在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 88具有至少90%序列一致性之核酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 88具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 88之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 88小於100%一致之序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 88之序列之核苷酸序列。在一些實施例中,包含MDNA11T之重組病毒稱為VIR 113。
在一些實施例中,編碼MDNA11T分子之多核苷酸可操作地連接至基因啟動子。在一些實施例中,包括編碼MDNA11T基因產物之多核苷酸之重組病毒衍生自VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株。在一些實施例中,MDNA11T插入A56R基因體區域。在一些實施例中,MDNA11T可操作地連接至11K啟動子。
在一些實施例中,重組病毒包含MDNA11T及/或MDNA11及其他免疫調節基因。在一些實施例中,其他免疫調節基因可包含本申請案中之任一免疫調節基因。在一些實施例中,其他免疫調節基因可包含其他細胞介素或趨化介素或抗原。
在一些實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的抗致瘤性質。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR105、VIR111、VIR114及/或VIR113 (分別包含SEQ ID NO: 84、87、89及88之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在一些實施例中,向個體投與有效劑量之重組病毒(包含與SEQ ID NO: 84、87、89及88之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列)抑制腫瘤、增生及/或轉移生長。
C. 血管生成調節病毒
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種抗血管生成蛋白(例如VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑及/或Versikine)之一或多種異源核酸。
因此,在多個實施例中,本文提供重組病毒,其包含編碼可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現之血管生成調節蛋白之異源核酸。血管生成係導致新血管形成及生長之多步過程,其由若干促血管生成及抗血管生成因子緊密調節。該等促血管生成因子與抗血管生成因子之間的平衡通常由癌細胞改變且係惡性腫瘤之進展及轉移期間之必需步驟,此乃因血管生成可提供腫瘤生長所需之氧及營養素。腫瘤血管生成之機制係複雜的且因此涉及不同之信號路徑,包括許多促血管生成及抗血管生成因子,例如尤其纖維母細胞生長因子(FGF)、血小板反應蛋白、血管抑素及內皮抑素。關於抗血管生成及促血管生成因子之其他細節可參見Huang及Bao, World J Gastroenterol.10(4): 463-470 (2004),其出於所有目的以引用方式併入本文中。
許多促血管生成因子中之一者、即血管內皮生長因子(VEGF)由腫瘤細胞及周圍基質分泌,刺激內皮細胞之增生及存活,且導致支持腫瘤及轉移發展及生長之新血管形成。參見Rivera-Soto及Damania, Front. Microbiol.10:1544 (2019)。另一促血管生成因子、即血管生成素-2 (Ang-2)係血管重塑及成熟之關鍵調節劑,通常在腫瘤中上調且係不利的預後因子。因此,已嘗試許多抑制VEGF及Ang-2之策略作為癌症治療方案之一部分,包括產生針對VEGF及Ang-2之抗體。關於抑制VEGF及Ang-2之策略之其他細節可參見Scheuer等人,MAbs, 8(3): 562-573 (2016),其出於所有目的以引用方式併入本文中。
諸如癌症之發炎性疾病之進展與腫瘤周圍之細胞外基質之組成密切相關。許多發炎性疾病常見之一種細胞外基質蛋白係多功能蛋白聚糖(Versican)。Papadas等人,Journal of Histochemistry & Cytochemistry 68(12) 871-885 (2020)。除多功能蛋白聚糖之各種亞型外,來自其在腫瘤微環境內之蛋白水解裂解之產物(稱為Versikine)參與例如藉由促進癌症中之腫瘤細胞凋亡來產生抗腫瘤免疫性。另外,多功能蛋白聚糖蛋白水解亦可驅動新血管形成(血管生成)。Hirani等人,Front. Oncol.11:712807(2021)。本文已闡述且包括Versikine之各種修飾(包括點突變、插入、缺失及取代)以及可能影響Versikine抗致瘤能力之Versikine與各種多肽之融合物。關於Versikine修飾及融合物之其他細節可參見美國專利公開案第2017/0258898號,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
因此,在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含一或多種抗血管生成蛋白。
在一些實施例中,一或多種異源核酸編碼可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現之抗血管生成蛋白。該等抗血管生成蛋白可抑制有利於腫瘤生長及發展之宿主血管生成路徑。具體而言,重組病毒(包括本文所提供之抗血管生成蛋白)可增加重組病毒抑制腫瘤血管生成並減少宿主中之腫瘤及轉移生長的能力。在一些實施例中,重組病毒包括溶瘤病毒。在一些實施例中,重組病毒不包括溶瘤病毒。在一些實施例中,病毒包括痘瘡病毒。在一些實施例中,重組病毒包括VIP02衍生之重組病毒。在一些實施例中,重組病毒包括本文所述或以引用方式併入本文中之任何病毒。
在一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白係VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、Versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。在一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或血管生成素-2 (Ang2)抑制劑。在一些實施例中,抗血管生成蛋白包括(但不限於)抗VEGF單鏈抗體(抗VEGF scAb)、抗血管生成素-2單鏈抗體(抗Ang2 scAb)及/或Versikine。在一些實施例中,VEGF抑制劑係抗VEGF抗體,視情況地抗VEGF單鏈抗體(scAb)。在一些實施例中,VEGF抑制劑係抗VEGF單鏈抗體(scAb)。在一些實施例中,血管生成素抑制劑係抗血管生成素-2 (Ang2)抗體,視情況地抗Ang2單鏈抗體(scAb)。在一些實施例中,血管生成素抑制劑係抗Ang2單鏈抗體(scAb)。在一些實施例中,抗血管生成蛋白包括本文包括或以引用方式併入本文中之蛋白質及/或因子中之任一者。參見Huang及Bao., World J Gastroenterol.10(4): 463-470 (2004)。
在一些實施例中,包括編碼抗血管生成蛋白之異源核酸之重組病毒編碼抗VEGF scAb及抗Ang2 scAb。在一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中,雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含與SEQ ID NO:23中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO:23中所述之序列。
在一些實施例中,一或多種抗血管生成蛋白進一步包含Versikine。在一些實施例中,Versikine係人類Versikine。在一些實施例中,Versikine具有與SEQ ID NO:24中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,Versikine具有SEQ ID NO:24中所述之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼抗血管生成蛋白(例如抗VEGF scAb、抗Ang2 scAb及/或Versikine)之異源核酸。在一些實施例中,包括編碼抗血管生成蛋白之異源核酸之重組病毒編碼抗VEGF scAb。在一些實施例中,包括編碼抗血管生成蛋白之異源核酸之重組病毒編碼抗Ang2 scAb。在一些實施例中,包括編碼抗血管生成蛋白之異源核酸之重組病毒編碼Versikine。在一些實施例中,包括編碼抗血管生成蛋白之異源核酸之重組病毒編碼抗Ang2 scAb及Versikine。在一些實施例中,包括編碼抗血管生成蛋白之異源核酸之重組病毒編碼抗VEGF scAb及Versikine。
在一些實施例中,重組病毒表現抗VEGF單一scAb基因產物、抗Ang2基因產物及Versikine基因產物(NP_001157569)。特定而言,在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡經修飾之H5 (mH5)基因啟動子控制下之抗VEGF scAb基因產物及抗Ang2 scAb基因產物cDNA、及處於痘瘡PSEL啟動子控制下之包括Versikine基因產物之cDNA。包括包含抗VEGF scAb基因產物、抗Ang2基因產物及Versikine基因產物之cDNA之全盒插入痘瘡J2R基因體區域中。另外,表現抗VEGF scAb基因產物、抗Ang2 scAb基因產物及Versikine基因產物之重組病毒包括A35R基因體區域之缺失。
在一些實施例中,抗血管生成蛋白包括抗VEGF-抗Ang2 scAb融合單鏈抗體多肽及Versikine多肽。在一些實施例中,抗VEGF-抗Ang2 scAb多肽可增加重組病毒抑制血管生成之能力。在一些實施例中,Versikine多肽可增加重組病毒抑制血管生成之能力。在一些實施例中,Versikine多肽可增強抗VEGF-抗Ang2 scAb多肽之抗致瘤及/或抗血管生成性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼抗VEGF-抗Ang2 scAb分子之多核苷酸,其中抗VEGF-抗Ang2 scAb分子包含與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼Versikine分子之多核苷酸,其中Versikine分子包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼抗VEGF-抗Ang2 scAb分子之多核苷酸,其中抗VEGF-抗Ang2 scAb分子包含與SEQ ID NO: 23具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及編碼Versikine分子之多核苷酸,其中Versikine分子包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒表現抗VEGF單鏈抗體(scAb)基因產物、血管生成素-2 (Ang-2)基因產物及Versikine基因產物(NP_001157569)。特定而言,在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於痘瘡經修飾之H5 (mH5)基因啟動子控制下之抗VEGF單鏈抗體(scAb)基因產物及血管生成素-2 (Ang-2)基因產物cDNA、及處於痘瘡PSEL啟動子控制下之包括Versikine基因產物之cDNA。包括包含抗VEGF單鏈抗體(scAb)基因產物、血管生成素-2 (Ang-2)基因產物及Versikine基因產物之cDNA之全盒插入痘瘡J2R基因體區域中。另外,表現抗VEGF單鏈抗體(scAb)基因產物、血管生成素-2 (Ang-2)基因產物及Versikine基因產物之重組病毒包括A35R基因體區域之缺失。
在一些實施例中,抗血管生成蛋白包括抗VEGF-Ang-2單鏈抗體多肽及Versikine多肽。在一些實施例中,抗VEGF-Ang-2單鏈抗體多肽可增加重組病毒抑制血管生成之能力。在一些實施例中,Versikine多肽可增加重組病毒抑制血管生成之能力。在一些實施例中,Versikine多肽可增強抗VEGF-Ang-2單鏈抗體多肽之抗致瘤及/或抗血管生成性質。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼抗VEGF-Ang-2單鏈抗體分子之多核苷酸,其中抗VEGF-Ang-2單鏈抗體分子包含與SEQ ID NO: 23具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼Versikine分子之多核苷酸,其中Versikine分子包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼抗VEGF-Ang-2單鏈抗體分子之多核苷酸,其中抗VEGF-Ang-2單鏈抗體分子包含與SEQ ID NO: 23具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及編碼Versikine分子之多核苷酸,其中Versikine分子包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含多肽,其具有與SEQ ID NO: 23具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列小於100%一致的核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含多肽,其具有與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含核苷酸序列,其編碼與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 24小於100%一致之多肽。在一些實施例中,重組病毒包含編碼SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之核苷酸序列。
在一些實施例中,包括編碼抗VEGF-Ang-2單鏈抗體分子(例如包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列)及Versikine分子(例如包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列)之多核苷酸之重組病毒衍生自VIR11 (包含SEQ ID NO: 3之核酸序列)株且包括與SEQ ID NO: 13 (VIR71)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 13之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 13小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含含有SEQ ID NO: 13之核酸序列之核苷酸序列。在一些實施例中,VIR71病毒(包含SEQ ID NO: 13之核酸序列)包括對應於A35R基因之基因體區域之缺失。在一些實施例中,編碼抗VEGF-Ang-2單鏈抗體分子(包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列)之多核苷酸可操作地連接至mH5基因啟動子。在一些實施例中,編碼Versikine分子(包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列)之多核苷酸可操作地連接至PSEL基因啟動子。
在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)之核酸基因體包含與SEQ ID NO:13中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)之核酸基因體包含SEQ ID NO: 13之核酸序列。包含SEQ ID NO: 13之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR71。
在一些實施例中,本文所提供之重組病毒衍生自VIR11 (包含SEQ ID NO: 3之核酸序列)株且包含與SEQ ID NO: 12 (亦稱為VIR52)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 12之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 12之核酸序列小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,VIR52病毒(包含SEQ ID NO: 12之核酸序列)包括對應於A35R基因之基因體區域之缺失及對應於J2R基因之基因體區域之缺失。
在一些實施例中,本文所提供之重組病毒展現增加的抗腫瘤性質,例如藉由改良的抗血管生成抑制性質。在一些實施例中,本文所提供之重組病毒可抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR71 (包含SEQ ID NO: 13之核酸序列)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。在一些實施例中,向個體投與有效劑量之重組病毒(包含與SEQ ID NO: 13之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列)抑制腫瘤、增生及/或轉移生長。
本文亦提供重組病毒,其包括編碼可穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現且增加病毒之抗致瘤性質之免疫刺激蛋白及血管生成調節蛋白之異源核酸。因此,在一些實施例中,重組溶瘤病毒包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物包含一或多種免疫刺激蛋白及一或多種抗血管生成蛋白。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括(但不限於) hmLIGHT。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括(但不限於)抗VEGF單鏈抗體(scAb)及血管生成素-2 (Ang-2)。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括(但不限於) hmLIGHT,且血管生成調節蛋白包括(但不限於)抗VEGF單鏈抗體(scAb)及血管生成素-2 (Ang-2)。在一些實施例中,免疫調節蛋白包括(但不限於)以引用方式納入本文中之任何免疫調節蛋白。在一些實施例中,血管生成調節蛋白包括(但不限於)以引用方式納入本文中之任何血管生成調節蛋白。
本文已在多個實施例中產生表現hmLIGHT基因產物(NP_001363816 XP_016882906)、抗VEGF單鏈抗體(scAb)基因產物及血管生成素-2 (Ang-2)基因產物之重組病毒。特定而言,所產生之重組病毒包括兩種表現盒;一種表現盒插入A35R基因體區域中並含有處於痘瘡SSE基因啟動子控制下之全長hmLIGHT cDNA;且第二種盒插入J2R基因體區域中並含有處於痘瘡經修飾之H5 (mH5)基因啟動子控制下之抗VEGF單鏈抗體(scAb)基因產物及血管生成素-2 (Ang-2)基因產物cDNA以及處於痘瘡SEL啟動子控制下之包括Versikine基因產物之cDNA。
在一些實施例中,免疫調節蛋白包括hmLIGHT且血管生成調節蛋白包括抗VEGF單鏈抗體(scAb)及血管生成素-2 (Ang-2)。在一些實施例中,hmLIGHT蛋白、抗VEGF單鏈抗體(scAb)蛋白及/或血管生成素-2 (Ang-2)基因產物可增加重組病毒之抗腫瘤性質及/或抑制宿主之血管生成。在一些實施例中,提供重組病毒,其包括編碼hmLIGHT分子、抗VEGF單鏈抗體(scAb)分子、血管生成素-2 (Ang-2)分子及Versikine分子之多核苷酸,其中hmLIGHT多肽包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列一致性之胺基酸序列,抗VEGF單鏈抗體(scAb)血管生成素-2 (Ang-2)多肽包含與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列一致性之胺基酸序列,且Versikine多肽包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包括多肽,其具有與SEQ ID NO: 25具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,重組病毒具有與SEQ ID NO: 25具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包括多肽,其具有與SEQ ID NO: 23具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,重組病毒具有與SEQ ID NO: 23具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包括多肽,其具有與SEQ ID NO: 24具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,重組病毒具有與SEQ ID NO: 24具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中,編碼hmLIGHT分子之多核苷酸可操作地連接至SSE基因啟動子,且編碼抗VEGF單鏈抗體(scAb)-血管生成素-2 (Ang-2)分子之多核苷酸可操作地連接至mH5啟動子,且Versikine分子可操作地連接至SEL啟動子。在一些實施例中,包括編碼hmLIGHT分子(例如包含SEQ ID NO: 25之序列)、抗VEGF單鏈抗體(scAb)/血管生成素-2 (Ang-2)分子(例如包含SEQ ID NO: 23之序列)及Versikine分子(例如包含SEQ ID NO: 24之序列)之多核苷酸之重組病毒衍生自VIR49 (包含SEQ ID NO: 11之核酸序列)株且包括與SEQ ID NO: 47 (亦稱為VIR86)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,重組病毒具有與SEQ ID NO: 47具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:47中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 47之核苷酸序列。
本文所提供之重組病毒展現增加的抗致瘤性質及抗血管生成性質。在具體實施例中,向個體投與有效劑量之VIR86 (SEQ ID NO: 47)抑制活體內模型中之腫瘤、增生或轉移生長。
D. 細胞凋亡調節病毒
在一些實施例中,編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼細胞凋亡誘導蛋白(例如iDED、iFas及/或iCas9)之一或多種異源核酸。
因此,本文提供重組病毒,其包括編碼可在用誘導劑誘導時穩定且有效地在許多類型之病毒感染細胞中表現之誘導型「安全開關」機制之異源核酸。
病毒療法為人類疾病之治療帶來巨大的希望。來自病毒本身或其攜帶之異源基因產物之顯著毒性已阻礙臨床研究。因此,業內對開發「安全開關」相當關注,一旦該等安全開關之使用出現問題,即可藉由其除去或「關閉」經治療病毒感染之細胞。安全開關系統已在多種細胞中進行了研究。安全開關基因已用於例如T淋巴球中來治療病毒感染及惡性病且用於T細胞輸注中來治療復發性惡性病。另一選擇係基於活化人類T細胞中之細胞凋亡路徑之基因的誘導;參見Straathof等人,Blood (2005), 105:11, 4247-4254。
消除不期望細胞之一種方式係藉由誘導細胞凋亡,其係一種類型之程式化細胞死亡或細胞自殺,係多個細胞過程(包括正常細胞更新、免疫系統之適當發育及功能、激素依賴性萎縮、胚胎發育及化學誘導之細胞死亡)之重要組分。不適當的細胞凋亡(過少或過多)係許多人類疾患之因素,包括神經變性疾病、缺血性損傷、自體免疫病症及許多類型之癌症。因此,細胞凋亡之調節似乎係在打開系統時意欲殺傷細胞之「安全開關」系統之方便的候選者。參見S. Elmore, Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516。
在人類中,可經由刺激Fas受體從而引起起始劑半胱天冬酶8募集、經由與轉接分子Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)相互作用藉助其死亡結構域(DD)及死亡效應結構域(DED)來誘導細胞凋亡。另外,可藉由破壞粒線體膜、從而引起半胱天冬酶9活化來活化細胞凋亡。減少及增加的細胞凋亡皆可導致多種病理。另外,影響細胞凋亡路徑之突變係癌症發展之一個標誌。參見Hanahan等人,Cell (2011) 144:5, 646-674。
誘導系統包括已闡述之細胞凋亡效應蛋白;例如,已在人類T淋巴球中使用半胱天冬酶9、Fas或含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)探究誘導系統。然而,認為包括細胞凋亡效應物之「安全開關」系統尚未改造至病毒系統中。
本文提供重組病毒,其包括編碼誘導型「安全開關」機制之異源核酸,該機制包括誘導型半胱天冬酶9及誘導型Fas或融合至F36V-FKBP (人類FK506結合蛋白(FKBP12)之突變體形式)之誘導型DED基因。此誘導型「安全開關」允許在用FDA批準之用於人類中之藥物AP1903誘導時進行條件化二聚化。參見Straathof等人,Blood (2005) 105:11, 4247-4254。此誘導系統之優點在於可使其成為病毒療法之良好候選者:其包括具有潛在低免疫原性之人類基因產物,且投與AP1903不具除選擇性消除靶向細胞外之效應。投與此小分子使得促細胞凋亡融合分子iCasp9 (半胱天冬酶9融合至F36V-FKBP)、iDED (DED融合至F36V-FKBP)及iFas (Fas融合至F36V-FKBP)交聯並活化。
因此,在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含細胞凋亡誘導蛋白。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V,且FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽)。在一些實施例中,促細胞凋亡分子係Fas、含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)或半胱天冬酶,視情況地其中半胱天冬酶係半胱天冬酶9。
在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白允許誘導系統包括嵌合多肽,該嵌合多肽包括融合至促細胞凋亡多肽之多聚化區域。該誘導系統可在多聚體配位體與多聚化區域結合時活化或「打開」。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白包含融合至促細胞凋亡多肽之多聚化區域。在一些實施例中,多聚化區域包括以下中之任一者:FKBP12、F36V-FKBP、親環素受體、類固醇受體、四環素受體、重鏈抗體次單元、輕鏈抗體次單元、包含藉由撓性連接體結構域分開之串聯重鏈及輕鏈可變區之單鏈抗體及其突變序列。在一些實施例中,多聚化區域係F36V-FKBP區域。在一些實施例中,多聚化區域係FKBP12區域。在一些實施例中,FKBP12區域係FKBP12v36區域。在一些實施例中,多聚化區域係Fv′Fvls。在一些實施例中,多聚化區域結合選自由FK506二聚體及二聚體FK506類似物配位體組成之群之配位體。在一些實施例中,配位體係AP1903 (利米多賽)。在一些實施例中,配位體係AP20187。
在一些實施例中,多聚化區域包括配位體結合結構域。該配位體結合結構域可為將允許誘導使用天然或非天然配位體(例如非天然合成配位體)之誘導系統之任一方便結構域。配位體結合結構域之實例包括(但不限於)親環素受體配位體結合結構域、類固醇受體配位體結合結構域、親環素受體配位體結合結構域及四環素受體配位體結合結構域。在一些實施例中,配位體結合結構域包括FK506結合蛋白(FKBP12)之配位體結合結構域。在一些實施例中,配位體結合結構域包括FKBP12變異體FK506-BP12之配位體結合結構域。關於使用配位體結合結構域之誘導系統之其他細節可參見美國專利公開案第2020/0230216號,其出於所有目的以引用方式併入本文中。在一些實施例中,FKB12變異體包括(但不限於) i半胱天冬酶9、iCasp9、iC9、CaspaClDe。關於使用配位體結合結構域之誘導系統之其他細節可參見WIPO專利公開案WO 2016/100241,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
在一些實施例中,誘導系統可在投與多聚體配位體時活化或「打開」,從而引起多聚化區域多聚化及誘導系統活化。在一些實施例中,配位體係小分子。在一些實施例中,配位體係二聚體。在一些實施例中,配位體係二聚體FK506或二聚體FK506樣類似物。在某些實施例中,多聚體配位體係AP1903,其係已證實在健康志願者中安全之合成藥物。在一些實施例中,AP1903投與引起促細胞凋亡多肽之二聚化及交聯以及誘導系統之活化。在一些實施例中,多聚體配位體係AP20187 (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA),其係已經修飾以減少與內源FKBP12之相互作用、同時增強與此FK506-BP12變異體結合之無毒合成FK506類似物。投與多聚體配位體引起誘導型促細胞凋亡多肽聚集,從而導致其活化。
在多個實施例中,本文提供重組病毒,其包括編碼誘導型「安全開關」機制之異源核酸,該機制包括誘導型半胱天冬酶9及誘導型Fas或融合至F36V-FKBP (人類FK506結合蛋白(FKBP12)之突變體形式)之誘導型DED基因。此誘導型「安全開關」允許在用FDA批準之用於人類之藥物AP1903誘導時進行條件化多聚化。參見Straathof等人,Blood (2005) 105:11, 4247-4254。此誘導系統之優點在於可使其成為病毒療法之良好候選者:其包括具有低免疫原性潛能之人類基因產物,且投與AP1903不具除選擇性消除靶向細胞外之效應。投與此小分子使得促細胞凋亡融合分子iCasp9 (半胱天冬酶9融合至F36V-FKBP)、iDED (DED融合至F36V-FKBP)及iFas (Fas融合至F36V-FKBP)交聯並活化。
6. Casp9 誘導系統
在一些實施例中,本文提供Casp9誘導系統。在一些實施例中,Casp9誘導型「安全開關」機制包含融合至F36V-FKBP之誘導型半胱天冬酶9基因,該F36V-FKBP係在用FDA批準之用於人類之藥物AP1903誘導系統時允許F36V-FKBP條件化二聚化之人類FK506結合蛋白(FKBP12)之突變形式。參見Straathof等人,Blood (2005) 105:11, 4247-4254。投與此小分子使得促細胞凋亡融合分子iCasp9 (半胱天冬酶9融合至F36V-FKBP)交聯並活化。使用半胱天冬酶-9系統、使用配位體介導之嵌合半胱天冬酶-9多肽二聚化及活化來誘導選擇性細胞凋亡之方法論述於於2011年5月20日提出申請且標題為METHODS FOR INDUCING SELECTIVE APOPTOSIS、將Malcolm K. Brenner命名為發明者之美國專利公開案第13/112,739號中,該公開案之全文出於所有目的以引用方式併入本文中。亦參見Straathof等人,Blood (2005), 105:11, 4247-4254)。關於使用配位體結合結構域之誘導系統之其他細節可參見美國專利第9,434,935號,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V,且FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列。
在一些實施例中,二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽)。
在一些實施例中,促細胞凋亡分子係Fas、含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)或半胱天冬酶,視情況地其中半胱天冬酶係半胱天冬酶9。
在一些實施例中,促細胞凋亡分子係半胱天冬酶且半胱天冬酶係半胱天冬酶9。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型半胱天冬酶9 (iCasp9)。在一些實施例中,重組病毒表現誘導型iCasp9系統。在一些實施例中,iCasp9包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。特定而言,在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於插入J2R基因座中之痘瘡合成早期啟動子PSE控制下之誘導型Casp9 cDNA分子。iCasp9分子包括不具連接至F36V-FKBP之其半胱天冬酶活化及募集結構域(CARD;GenBank NM001 229)之半胱天冬酶9 (aa 135-416),該F36V-FKBP係含有F36V突變之人類FK506結合蛋白(FKBP12;GenBank AH002 818)之突變體形式(F36V-FKBP)。
在一些實施例中,提供重組病毒,其包含編碼iCasp9分子之多核苷酸,該iCasp9分子包含連接至F36V-FKBP之半胱天冬酶9之一部分(胺基酸殘基135-416),其中iCasp9多肽包含與SEQ ID NO: 26之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,半胱天冬酶9之該部分含有全長半胱天冬酶9之胺基酸殘基135至416。因此,在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型半胱天冬酶9 (iCas9),其包含SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:26之胺基酸序列具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包括多肽,其具有與SEQ ID NO: 26具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。舉例而言,重組病毒具有與SEQ ID NO: 26具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,編碼iCasp9分子之多核苷酸可操作地連接至PSE啟動子。
在一些實施例中,包含編碼iCasp9分子(例如包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列)之多核苷酸之重組病毒衍生自純系VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株,且重組病毒包含與SEQ ID NO: 7 (亦稱為VIR40)之核酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,重組病毒包含與SEQ ID NO: 7之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 7之核酸序列小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO: 7中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含SEQ ID NO: 7之核酸序列。包含SEQ ID NO: 7之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR40。
在一些實施例中,重組病毒衍生自純系VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株且包括J2R基因之缺失。在一些實施例中,重組病毒衍生自純系VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株且病毒包括與SEQ ID NO: 4 (亦稱為VIR13)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 4具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,與用媒劑溶液感染之個體相比,用有效劑量之VIR13感染之個體展現腫瘤進展之顯著減少,如
圖 20中所顯示。
在一些實施例中,重組病毒衍生自VIR13 (SEQ ID NO: 4)株且包括J2R基因之缺失及B2R基因之缺失。在一些實施例中,重組病毒衍生自VIR13 (SEQ ID NO: 4)株且病毒包括與SEQ ID NO: 48 (亦稱為VIR94)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,重組病毒具有與SEQ ID NO: 48具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、但小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,與用媒劑溶液感染之個體相比,用有效劑量之VIR94感染之個體展現腫瘤進展之顯著減少。
在一些實施例中,在用有效劑量之利米多賽誘導後,VIR40展現與VIR13相比增強的抗致瘤活性。在一些實施例中,在用有效劑量之利米多賽誘導後,VIR40展現與VIR13相比較小之抗致瘤活性。在一些實施例中,在用有效劑量之利米多賽誘導後,VIR40展現與VIR13相比相似之抗致瘤活性。
在一些實施例中,重組病毒包括具有編碼嵌合蛋白之核苷酸序列之核酸,該嵌合蛋白包含多聚體配位體結合區域及經修飾之半胱天冬酶-9多肽,且包含至少一個選自由以下組成之群之胺基酸取代:N405Q、D330A、F404Y、F406L、F406T、F404W、T317A、S144A、S144D、S196A、S183A、S195A、F404T、F404W、N405F、F406T、D315A、A316G、T3175、F319W、5307A、Y153A及Y153F。在一些實施例中,嵌合蛋白具有小於野生型半胱天冬酶-9多肽之活性之基底活性。在一些實施例中,包含經修飾之半胱天冬酶-9多肽之嵌合蛋白具有小於包含未經修飾之半胱天冬酶-9之嵌合蛋白活性之5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的基底活性。關於使用配位體結合結構域之誘導系統之其他細節可參見美國專利第9,932,572號,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
除半胱天冬酶-9外之可由當前技術之嵌合多肽編碼之半胱天冬酶多肽包括例如半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-3及半胱天冬酶-8。該等半胱天冬酶多肽之論述可參見例如MacCorkle, R. A.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95:3655-3660;及Fan, L. 等人(1999) Human Gene Therapy 10:2273-2285。關於使用配位體結合結構域之誘導系統之其他細節可參見美國專利第10,525,110號,其出於所有目的以引用方式併入本文中。
7. iDED 誘導系統
死亡效應結構域(DED)發現於無活性之半胱天冬酶原(半胱胺酸蛋白酶)及調節細胞凋亡級聯中之半胱天冬酶活化之蛋白質(例如含FAS相關死亡結構域之蛋白質(FADD))中。FADD係傳訊轉接蛋白,其在死亡受體誘導之細胞凋亡期間調介半胱天冬酶8之活化。除其在細胞凋亡及癌症中之作用外,已顯示該等蛋白質在調節其他形式之細胞死亡(包括細胞壞死)及調節其他重要細胞過程(包括自噬及發炎)方面具有重要作用。另外,該等蛋白質亦在先天性及適應性免疫方面及胚胎發育期間具有重要作用。參見J S Riley、A Malik、C Holohan及D B Longley Cell Death & Disease,第6卷,第e1866頁(2015)及Imtiyaz等人,J Immunol.2006年6月1日; 176(11): 6852-6861。
因此,在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含細胞凋亡誘導蛋白。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V,且FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽)。在一些實施例中,促細胞凋亡分子係含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)。
在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。在一些實施例中,iDED包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼誘導型「安全開關」機制之異源核酸,該機制包含融合至兩個拷貝之F36V-FKBP (人類FKBP506結合蛋白之突變體形式)及v-src (胺基酸殘基1-14)之誘導型DED,由此提供可在添加二聚化化學誘導劑(例如AP1903,其係FDA批準之用於人類之藥物)時觸發之誘導機制。關於iDED誘導系統之其他細節論述於Junker等人(2003) Gene Therapy, 10, 1189-1197中,該文獻出於所有目的以引用方式併入本文中。
本文已產生表現誘導型iDED系統之重組病毒。特定而言,在一些實施例中,所產生之重組病毒包含表現盒,其含有處於插入J2R基因座中之痘瘡合成早期啟動子PSE控制下之誘導型DED (含有死亡結構域之Fas相關蛋白(FADD)之死亡效應結構域(DED)) cDNA分子。iDED分子包括含有死亡結構域之Fas相關蛋白(FADD)之死亡效應結構域(DED),其融合至兩個拷貝之F36V-FKBP (含有F36V突變之人類FKBP12 (例如GenBank AH002 818)之突變形式)及v-src (胺基酸殘基1-14)。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼iDED分子之多核苷酸,該iDED分子包含含有死亡結構域之Fas相關蛋白(FADD)之死亡效應結構域(DED),其連接至2個F36V-FKBP,及人類FKBP12之突變形式,其中iDED多肽包含與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED),其包含SEQ ID NO:27中所述之序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED),其包含SEQ ID NO:27中所述之序列。在一些實施例中,重組病毒包含多肽,例如細胞凋亡誘導蛋白,其包含與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,編碼iDED分子之多核苷酸可操作地連接至PSE啟動子。
在一些實施例中,包含編碼iDED分子之多核苷酸之重組病毒衍生自純系VIP02 (包含SEQ ID NO: 1之核酸序列)株且包括與SEQ ID NO: 8 (亦稱為VIR41)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。舉例而言,在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 8之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 8小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 8之核酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8之核酸序列。在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含iDED,且重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 8之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR41。
病毒療法為人類疾病(包括癌症)之治療帶來巨大的希望;然而,來自病毒本身或其攜帶之異源基因產物之顯著毒性水準仍係該等療法之臨床應用之挑戰。因此,「安全開關」允許在「安全開關」活化時健康細胞中之病毒複製及繁殖選擇性不活化、但在感染時在惡性細胞中展現強抗致瘤性質,儘管此係出人意料的,但將構成現有治療方法之重要改良,不僅對癌症,且亦對其他疾患。在多個實施例中,本文提供重組病毒,在用利米多賽處理時,感染該等病毒之健康細胞展現病毒複製之顯著抑制,而癌細胞並未顯示病毒介導之細胞毒性之顯著抑制。
具體而言,如實例6中所論述,在用利米多賽誘導iDED時,感染VIR41之健康細胞展現病毒複製之顯著抑制,而癌細胞並未顯示病毒介導之細胞毒性之顯著抑制。因此,在多個實施例中,本文所述之病毒及具體而言VIR41係對用於治療癌症、增生、腫瘤、轉移及其其他病狀之當前方法之改良。
特定而言,在一些實施例中,在人類原代支氣管/氣管上皮細胞、人類原代乳腺上皮細胞及鼠類原代乳腺上皮細胞之培養物中誘導iDED介導之細胞凋亡導致感染VIR41之細胞之病毒複製之顯著抑制,此指示iDED抑制健康細胞中之病毒複製(實例6.A.及
圖 14)。另外,利米多賽處理並未顯著抑制感染VIR41之乳癌、肺癌、黑色素瘤及微衛星不穩定(MSI)結腸直腸癌細胞中之病毒複製(實例6.B),如藉由BT-549乳癌細胞(
圖 15A)、Hs578T乳癌細胞(
圖 15B)、MCF-7及4T1乳癌細胞(
圖 15C)、A549及M14肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 15D)、HCT-15 MSI結腸癌細胞(
圖 15E)、HCT-116 MSI結腸癌細胞(
圖 15F)及KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 15G)所展示。因此,活化乳癌、肺癌、黑色素瘤及MSI結腸癌細胞中之iDED介導之細胞凋亡並不抑制病毒複製。
微衛星穩定(MSS)結腸癌係對檢查點抑制劑無反應之一種類型之難治性癌症。如實例6中所論述及
圖 16中所顯示,在用利米多賽誘導iDED介導之細胞凋亡時,感染VIR41之MSS結腸細胞之反應不同於MSI結腸癌細胞。利米多賽處理顯著抑制感染VIR41之MSS結腸直腸細胞中之病毒複製,如藉由COLO205癌細胞(
圖 16A)、HCC-2998癌細胞(
圖 16B)及HT-29癌細胞(
圖 16C)所展示,此指示在用利米多賽處理後,iDED介導之細胞凋亡活化抑制MSS結腸直腸癌細胞中之病毒複製,此係出人意料的發現。儘管確切機制係未知的,但MSS結腸直腸癌細胞可能含有相對完整之細胞凋亡路徑,此乃因已知MSS結腸直腸癌細胞具有遠少於MSI結腸直腸癌細胞之基因體突變。與此一致,
圖 19中所述之細胞毒性實驗顯示,VIR41對MSS結腸直腸癌細胞之殺傷可能遠優於對照病毒VIR13。此乃因在利米多賽不存在下,低水準之活化iDED可導致MSS結腸直腸癌細胞之細胞凋亡。
另外,如實例6中所顯示,在利米多賽不存在下,VIR41亦展示針對MSS結腸直腸癌之出人意料的強溶瘤活性。由於MSS結腸直腸癌對免疫檢查點抑制劑無反應,故除適用於治療各種其他類型之癌症外,VIR41係治療MSS結腸直腸癌之理想劑。在利米多賽存在下,VIR41之複製在健康細胞中經選擇性抑制,但在癌細胞中未經選擇性抑制,亦如實例6中所顯示。此支持VIR41可用於安全地治療對來自痘瘡病毒或其他類型之病毒之感染敏感之具有重度免疫缺乏之癌症患者。在該情況下,VIR41及利米多賽可同時投與該等患者中。
8. iFas 誘導系統
Fas受體(Fas)係在其由Fas配位體(FasL)聚集後調介死亡信號之膜傳訊蛋白,該Fas配位體係腫瘤壞死因子家族之成員,其藉由活化半胱天冬酶並自粒線體釋放細胞色素c來起始細胞凋亡,從而導致額外半胱天冬酶活化,然後細胞降解及死亡。參見Savurma等人,Cell Death & Differentiation第10卷,第36-44頁(2003)。
在多個實施例中,本文提供重組病毒,其包括編碼誘導型「安全開關」機制之異源核酸,該機制包括融合至F36V-FKBP之誘導型iFas基因,該F36V-FKBP係在用FDA批準之用於人類之藥物AP1903誘導系統時允許F36V-FKBP之條件化二聚化之人類FK506結合蛋白(FKBP12)之突變形式。參見Straathof等人,Blood (2005) 105:11, 4247-4254。投與此小分子使得促細胞凋亡融合分子iFas (Fas融合至F36V-FKBP)交聯及活化。關於iFas誘導系統之其他細節論述於Belshaw等人,Chemistry & Biology 1996年9月, 3:731-738中,該文獻出於所有目的以引用方式併入本文中。
因此,在一些實施例中,本文提供重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含細胞凋亡誘導蛋白。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V。在一些實施例中,FKBP變異體係FKBP-F36V,且FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列。在一些實施例中,二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽)。在一些實施例中,促細胞凋亡分子係Fas。
在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係誘導型Fas (iFas)。在一些實施例中,iFas包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。在一些實施例中,細胞凋亡誘導蛋白係包含SEQ ID NO:28中所述之序列之誘導型Fas (iFas),或係與SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
因此,在一些實施例中,重組病毒表現誘導型iFas系統。特定而言,在一些實施例中,重組病毒包含表現盒,其含有處於插入J2R基因座中之痘瘡合成早期啟動子PSE控制下之誘導型Fas (Fas受體) cDNA分子。iFas分子包括連接至2個F36V-FKBP之Fas受體蛋白,該F36V-FKBP係含有F36V突變之人類FK506結合蛋白(FKBP12;GenBank AH002 818)之突變形式。
在一些實施例中,重組病毒包含編碼連接至2個F36V-FKBP之Fas分子之多核苷酸,其中iFas多肽包含與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,重組病毒包括多肽,其具有與SEQ ID NO: 28具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中,重組病毒包含與SEQ ID NO: 9之核酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性、但與SEQ ID NO: 9小於100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中,重組病毒包含SEQ ID NO: 9之核苷酸序列。在一些實施例中,編碼iFas分子之多核苷酸可操作地連接至PSE啟動子。
在一些實施例中,包括編碼iFas分子(SEQ ID NO: 28)之多核苷酸之重組病毒衍生自純系VIP02 (SEQ ID NO: 1)株且包括與SEQ ID NO: 9 (亦稱為VIR42)具有至少70%、例如至少75%、80%、85%或90%序列一致性之核苷酸序列。
在一些實施例中,重組病毒(例如重組溶瘤病毒)包含iFas,且重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:9中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。包含SEQ ID NO: 9之核酸序列之重組溶瘤病毒在本文中亦稱為VIR42。
在一些實施例中,在用有效劑量之利米多賽誘導後,VIR42展現與VIR13相比增強的抗致瘤活性。在一些實施例中,在用有效劑量之利米多賽誘導後,VIR42展現與VIR13相比較小之抗致瘤活性。在一些實施例中,在用有效劑量之利米多賽誘導後,VIR42展現與VIR13相比相似之抗致瘤活性。
IV. 病毒之繁殖及產生
本文所提供之純系病毒株或其重組病毒株可在適當宿主細胞中進行繁殖。該等細胞可為一組單一類型之細胞或不同類型之細胞之混合物。宿主細胞可包括經培養之細胞株、原代細胞及增生細胞。該等宿主細胞可包括對病毒(例如痘瘡病毒)感染敏感之多種動物細胞(例如哺乳動物、禽及昆蟲細胞)及組織中之任一者,包括雞胚、兔、倉鼠及猴腎細胞。適宜宿主細胞包括(但不限於)造血細胞(全能細胞、幹細胞、白血球、淋巴球、單核球、巨噬細胞、APC、樹突細胞、非人類細胞及諸如此類)、肺細胞、氣管細胞、肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、肌細胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、纖維母細胞及細胞株,包括例如CV-1、BSC40、Vero及BSC-1及人類HeLa細胞。通常,病毒在可以單層或懸浮液生長之細胞株中進行繁殖。舉例而言,用於繁殖痘瘡病毒之例示性細胞株包括(但不限於) CV-1、BSC40、Vero、BGM、BSC-1及RK-13細胞。用於繁殖腺病毒之例示性細胞株包括(但不限於) HeLa、MK、HEK 293及HDF細胞。用於繁殖疱疹病毒之例示性細胞株包括(但不限於) WI-38及HeLa細胞。適於繁殖多種病毒之其他細胞株為此項技術中所熟知。自系統培養之株之純化可使用標準方法來實現。
溶液中病毒之濃度或病毒效價可藉由此項技術中已知之多種方法來測定。在一些方法中,測定感染性病毒粒子(通常稱為噬菌斑形成單位或PFU)之數量,而在其他方法中,測定感染性或非感染性病毒粒子之總數。計算感染性病毒體數量之方法包括(但不限於)終點稀釋法,其測定某一範圍(例如一個對數)內之效價,及噬菌斑分析,其中使病毒之滴定在細胞單層上生長且在幾天至幾週後對噬菌斑數量進行計數。測定病毒粒子(包括感染性及非感染性粒子)總數之方法包括(但不限於)利用抗體識別病毒抗原且可藉由顯微術或FACS™分析可視化之免疫組織化學染色法;例如260 nm處之光學吸光度;及例如藉由PCR、RT-PCR或藉由用螢光染料標記量化來量測病毒核酸。
一旦病毒已經純化(或純化至期望純度)且已確定效價,便立即可將病毒儲存在最佳地維持其感染完整性之條件中。通常,將病毒儲存在黑暗中,此乃因光照用於使病毒隨時間不活化。病毒儲存穩定性通常取決於溫度。儘管一些病毒係熱穩定的,但大多數病毒在室溫下無法穩定長於一天,從而展現降低的活力(Newman等人(2003) J. Inf. Dis. 187:1319-1322)。對於病毒之短期儲存,例如1天、2天、4天或7天,通常建議大約4℃之溫度。對於長期儲存,大多數病毒可保持在-20℃、-70℃或-80℃下。當在該等溫度下冷凍於簡單溶液(例如PBS或Tris溶液(20 mM Tris pH 8.0、200 NaCl、2%-3%甘油或蔗糖))中時,病毒可穩定6個月至一年或甚至更長時間。然而,通常避免重複冷凍-解凍循環,此乃因其可能導致病毒效價降低。病毒亦可冷凍於含有儲存溶液中之其他補充物之培養基中,此可進一步保持病毒之完整性。舉例而言,將血清或牛血清白蛋白(BSA)添加至儲存在-80℃下之病毒溶液中可幫助病毒活力保持更長時間段及若干冷凍-解凍循環。在其他實例中,將病毒樣品乾燥用於長期儲存在環境溫度下。病毒可使用各種技術來乾燥,包括(但不限於)冷凍乾燥、泡沫乾燥、噴霧乾燥及脫水。在環境、冷藏或冷凍溫度下儲存病毒之其他方法為此項技術中已知,且包括(但不限於)美國專利第5,149,653號;美國專利第6,165,779號;美國專利第6,255,289號;美國專利第6,664,099號;美國專利第6,872,357號;及美國專利第7,091,030號;及美國專利公開案第2003-0153065號及美國專利公開案第2005-0032044號中所述之彼等方法。
病毒對每一儲存方法之反應可能不同。舉例而言,脊髓灰質炎病毒在室溫下在水性懸浮液中容易降解,在0℃下僅穩定兩週,且因凍乾而破壞。對於此特定病毒,儲存方法通常涉及在-70℃下冷凍或在4℃下冷藏。相比之下,認為痘瘡病毒非常穩定,且可在4℃溶液中儲存,在例如-20℃、-70℃或-80℃下冷凍,或凍乾且損失極小活力(Newman等人(2003) J. Inf. Dis.187:1319-1322;Hruby等人(1990) Clin. Microb. Rev. 3:153-170)。適於儲存特定病毒之方法及條件為此項技術中已知,且可用於儲存本文所呈現方法中所用之病毒。
水係降解儲存中之病毒之幾乎所有破壞路徑中之反應物。另外,水充當允許蛋白質展開及聚集之塑化劑。由於水係幾乎所有降解路徑之參與者,故將病毒水溶液還原成乾粉提供增強該等樣品之穩定性之替代調配方法。凍乾或冷凍-乾燥係用於儲存病毒之乾燥技術(參見例如Cryole等人(1998) Pharm.Dev. Technol., 3(3), 973-383)。冷凍乾燥存在三個階段:冷凍、一次乾燥及二次乾燥。在該等階段中,材料在高真空下快速冷凍且去水。一旦凍乾,乾燥病毒便可在環境溫度下長時間儲存,且在需要時用水溶液復原。可在冷凍乾燥之前將各種穩定劑納入溶液中以增強病毒之保存。舉例而言,已知高分子量之結構添加劑(例如血清、血清白蛋白或明膠)有助於防止冷凍期間之病毒聚集,且在凍乾或乾燥狀態下提供結構及營養支持。胺基酸(例如精胺酸及麩胺酸)、糖(例如海藻糖)及醇(例如甘露醇、山梨醇及肌醇)可在凍乾期間及凍乾狀態下增強病毒感染性之保存。當在凍乾之前添加至病毒溶液中時,尿素及山梨酸可穩定水合狀態且維持去水時段期間之滲透平衡。通常,在整個凍乾期間維持約7.0之相對恆定之pH。
在即將使用前,病毒可以適當濃度在適宜培養基中製備,且可維持在低溫下,例如維持在冰上,直至使用。若病毒係凍乾的或以其他方式乾燥用於儲存,則其可在適當水溶液中復原。製備病毒之水溶液通常係分析中所用之培養基(例如DMEM或RPMI)或相容性水溶液,例如緩衝鹽水溶液(例如PBS、TBS、Hepes溶液)。對於醫藥應用,可立即在醫藥溶液中製備或復原病毒。所用之多種醫藥學上可接受之溶液為此項技術中所熟知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版),A. Gennaro編輯,1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.)。在一個實例中,可將病毒稀釋於含或不含助劑或載劑之生理上可接受之溶液(例如無菌鹽水或無菌緩衝鹽水)中。在其他實例中,醫藥溶液可含有提供黏度之組分(例如甘油)及/或具有殺菌性質之組分(例如苯酚)。在一些實例中,病毒係在相對較濃之溶液中製備,以使得在分析中僅需要較小體積。舉例而言,若將1×106 pfu之病毒添加至96孔板中之腫瘤細胞中,則病毒可以1×108 pfu/mL之濃度製備,以使得僅向每孔中添加10 μl。具體濃度可由熟習此項技術者根據具體應用憑經驗確定。
在一些實施例中,重組溶瘤病毒或純系VACV株(例如本文所提供重組溶瘤病毒或純系VACV株中之任一者)在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,視情況地如根據EEV之百分比所確定,其中EEV之百分比係藉由下式確定:上清液之病毒效價/ (上清液之病毒效價+細胞溶解物之病毒效價) *100。例如與正常病毒對應部分、野生型病毒對應部分或重組溶瘤病毒之未經修飾之對應部分相比或藉由使至少5%、10%或15%百分比之感染性粒子係EEV,可確定增強的產生。
V. 醫藥組合物及調配物
本文提供含有本文所提供之病毒(例如重組病毒或重組溶瘤病毒)之醫藥組合物、組合及套組。醫藥組合物可包括本文所提供之病毒及醫藥載劑。組合可包括例如兩種或更多種病毒、病毒及可偵測化合物、病毒及治療化合物、病毒及病毒表現調節化合物或其任一組合。套組可包括本文所提供之一或多種醫藥組合物或組合及一或多種組件,例如使用說明書、向個體投與醫藥組合物或組合之裝置、向個體投與治療或診斷化合物之裝置或偵測個體病毒之裝置。
醫藥組合物、組合或套組中所含之病毒可包括本文所提供之任一病毒,包括本文所述之任一經分離之純系病毒株,及任一病毒,例如如部分III中所述之重組病毒或重組溶瘤病毒。醫藥組合物、組合或套組可包括可選自本文所提供之病毒或其他治療或診斷病毒之一或多種額外病毒。
E. 醫藥組合物
本文提供醫藥組合物,其含有本文所提供之病毒及適宜醫藥載劑。醫藥學上可接受之載劑包括充當病毒之媒劑載劑或介質之固體、半固體或液體材料。本文所提供之醫藥組合物可以各種形式、例如以固體、半固體、水性、液體、粉末或凍乾形式調配。含有本文所提供病毒之例示性醫藥組合物包括(但不限於)無菌可注射溶液、無菌包裝粉末、滴眼劑、錠劑、丸劑、粉末、菱形錠劑、藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(呈固體形式或於液體介質中)、軟膏劑、軟及硬明膠膠囊及栓劑。
適宜醫藥載劑之實例為此項技術中已知且尤其包括(但不限於)水、緩衝液、鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水溶液、各種類型之潤濕劑、無菌溶液、醇、阿拉伯樹膠(gum arabic)、植物油、苄基醇、明膠、甘油、碳水化合物(例如乳糖、蔗糖、右旋糖、直鏈澱粉或澱粉)、山梨醇、甘露醇、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、芳香油、脂肪酸單酸甘油酯及二酸甘油酯、新戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、粉末。本文所提供之醫藥組合物可含有其他添加劑,尤其包括例如抗氧化劑、防腐劑、鎮痛劑、黏合劑、崩解劑、著色劑、稀釋劑、賦形劑、增效劑、助流劑、增溶劑、穩定劑、張力劑、媒劑、黏度劑、矯味劑、甜味劑、乳液(例如油/水乳液)、乳化及懸浮劑(例如阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、膨潤土、卡波姆(carbomer)、角叉菜膠、羧甲基纖維素、纖維素、膽固醇、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、辛苯昔醇9、油醇、聚維酮、丙二醇單硬脂酸酯、月桂基硫酸鈉、去水山梨醇酯、硬脂醇、黃蓍膠、黃原膠及其衍生物)、溶劑及混雜成分(例如但不限於結晶纖維素、微晶纖維素、檸檬酸、糊精、液體葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化鎂、偏磷酸鉀、澱粉)。該等載劑及/或添加劑可藉由習用方法調配且可以適宜劑量投與個體。穩定劑(例如脂質、核酸酶抑制劑、聚合物及螯合劑)可防止組合物在體內降解。用於醫藥組合物中之其他適宜調配物可參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005,第21版,Gennaro及Gennaro編輯,Lippencott Williams and Wilkins)。
包括用於注射或黏膜遞送之本文所提供病毒之醫藥調配物通常包括在適用於注射或黏膜投與之緩衝液中提供之病毒水溶液、或在適用於注射或黏膜投與之緩衝液中復原之病毒之凍乾形式。該等調配物可視情況地含有如本文所述或此項技術中已知之一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或添加劑。用於口服投與之液體組合物通常包括水溶液、經適當矯味之糖漿、水性或油性懸浮液及用食用油(例如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)矯味之乳液以及酏劑及類似醫藥媒劑。
本文所提供之醫藥組合物可藉由採用此項技術中已知之程序調配以提供如本文所述病毒之快速、持續或延遲釋放。為製備諸如錠劑之固體組合物,將本文所提供之病毒與醫藥載劑混合以形成固體組合物。視情況地,將錠劑或丸劑包衣或以其他方式化合以提供在個體中提供延長作用優點之劑量形式。舉例而言,錠劑或丸劑包含內劑量及外劑量組分,後者呈前者上之包膜形式。兩種組分可藉由腸溶層分開,例如,該腸溶層用於抵抗胃中之崩解並容許內部組分完整地通入十二指腸中或延遲釋放。可將多種材料用於該等腸溶層或包衣,該等材料包括例如多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及乙酸纖維素之材料之混合物。
用於吸入或吹入之組合物包括醫藥學上可接受之水性或有機溶劑或其混合物中之溶液及懸浮液以及粉末。該等液體或固體組合物可視情況地含有如本文所述或此項技術中已知之適宜醫藥學上可接受之賦形劑及/或添加劑。該等組合物係例如藉由口服或鼻呼吸途徑投與用於局部或全身效應。藉由使用惰性氣體霧化醫藥學上可接受之溶劑中之組合物。例如直接自霧化裝置、自連接之面罩幕或自間歇正壓呼吸機吸入霧化溶液。溶液、懸浮液或粉末組合物係例如自裝置經口或經鼻投與,該等裝置以適當方式、例如使用吸入器來遞送調配物。
本文所提供之醫藥組合物可經調配以經由穿皮遞送裝置(「貼片」)穿皮遞送。該等穿皮貼片用於提供本文所提供病毒之連續或不連續輸注。用於遞送醫藥劑之穿皮貼片之構造及使用係根據此項技術中已知之方法來實施。參見例如美國專利第5,023,252號。該等貼片經構造用於連續、脈衝或按需遞送本文所提供之病毒。
可用於遞送病毒之膠質分散系統包括大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統,包括水包油乳液(混合型)、膠束、脂質體及脂質體複合物。例示性膠質系統係脂質體。可使用器官特異性或細胞特異性脂質體來達成僅至期望組織之遞送。脂質體之靶向可由熟習此項技術者藉由應用通常已知之方法來實施。此靶向包括被動靶向(利用脂質體分佈至含有竇狀毛細血管之器官中之RES細胞之天然趨勢)或主動靶向(例如,藉由熟習此項技術者已知之方法將脂質體偶合至特定配位體,例如抗體、受體、糖、糖脂及蛋白質)。可使用單株抗體經由特定細胞表面配位體使脂質體靶向特定組織,例如腫瘤組織。
F. B. 宿主細胞
提供宿主細胞,其含有本文所提供之病毒。該等細胞可用於活體外用途或活體內用途,例如如本文所提供之診斷或治療方法中所述。宿主細胞可為一組單一類型之細胞或不同類型之細胞之混合物。宿主細胞可包括經培養之細胞株、原代細胞及增生細胞。宿主細胞可包括對病毒感染敏感之多種動物細胞(例如哺乳動物、禽及昆蟲細胞)及組織中之任一者,包括(但不限於)人類、靈長類動物、嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)及雞胚細胞。適宜宿主細胞包括(但不限於)造血細胞(全能細胞、幹細胞、白血球、淋巴球、單核球、巨噬細胞、APC、樹突細胞、非人類細胞及諸如此類)、肺細胞、氣管細胞、肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、肌細胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、纖維母細胞、腫瘤細胞及細胞株,包括例如CV-1、BSC40、Vero、BSC40及BSC-1及人類HeLa細胞。用於感染及/或轉型宿主細胞、在表型上選擇經感染細胞或轉型體之方法及其他該等方法為此項技術中已知。
G. C. 組合
提供本文所提供之病毒及第二劑(例如第二病毒或其他治療或診斷劑)之組合。
因此,在一些實施例中,本文所提供之方法(例如治療方法)進一步包括投與用於治療增生性病症之第二治療劑。
在一些實施例中,本文所提供之方法進一步包括另一治療。在一些實施例中,另一治療尤其選自手術、輻射療法、免疫抑制療法及投與抗癌劑。在一些實施例中,另一(其他)治療係投與尤其選自以下之抗癌劑:細胞介素、趨化介素、生長因子、光激致效劑、毒素、抗癌抗生素、化學治療化合物、放射性核種、血管生成抑制劑、傳訊調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素或免疫治療劑及其前述任一者之組合。
組合可包括本文所提供之病毒與一或多種額外病毒,包括例如一或多種額外診斷或治療病毒。組合可含有醫藥組合物,其含有本文所提供之病毒或含有如本文所述病毒之宿主細胞。根據本文所提供之方法,組合亦可包括用於實現本文所述之抗致瘤及毒性降低活性之任一病毒或試劑。組合亦可含有用於調節由病毒編碼之內源或異源基因之基因表現之化合物。組合亦可含有用於調節蛋白質活化之化合物,例如可誘導蛋白質多聚化之化合物,包括AP1903及AP20187。
本文所提供之組合可含有病毒及治療化合物。用於本文所提供組合物之治療化合物可為例如抗癌或化學治療劑或化合物。例示性治療劑或化合物包括例如細胞介素、生長因子、光激致效劑、放射性核種、毒素、siRNA分子、酶/前藥對、抗代謝物、傳訊調節劑、抗癌抗生素、抗癌抗體、檢查點抑制劑(例如如抗程式化死亡1 (PD-1)受體及抗程式化死亡配位體1 (PD-L1)/L2抑制劑)、血管生成抑制劑、化學治療化合物、抗轉移化合物或其任一者之組合。本文所提供之病毒可與抗癌化合物(例如鉑配位錯合物)組合。例示性鉑配位錯合物包括例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、DWA2114R、NK121、IS 3 295及254-S。例示性化學治療劑亦包括(但不限於)胺甲喋呤(methotrexate)、長春新鹼(vincristine)、阿黴素(adriamycin)、不含糖之氯乙基亞硝基脲、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C (mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、Taxol®、草莓鹼(fragyline)、葡甲胺GLA、戊柔比星(valrubicin)、卡莫司汀(carmustine)、聚苯丙生(polifeprosan)、MM1270、BAY 12-9566、RAS法呢基轉移酶抑制劑、法呢基轉移酶抑制劑、MMP、MTA/LY231514、洛美曲索(lometrexol)/LY264618、Glamolec、CI-994、TNP-470、Hycamtin®/托泊替康(topotecan)、PKC412、戊司泊達(Valspodar)/PSC833、Novantrone®/米托蒽醌(mitoxantrone)、Metaret®/舒拉明(suramin)、BB-94/巴馬司他(batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel™/VX-710、VX-853、ZD0101、IS1641、ODN 698、TA 2516/馬立馬司他(marimastat)、BB2516/馬立馬司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、畢西巴尼(picibanil)/OK-432、戊柔比星/AD 32、鍶-89/Metastron®、Temodal®/替莫唑胺(temozolomide)、葉紫杉醇(Yewtaxan)/太平洋紫杉醇(paclitaxel)、Taxol®/太平洋紫杉醇、Paxex/太平洋紫杉醇、賽羅帕(Cyclopax)/口服太平洋紫杉醇、Xeloda®/卡培他濱(capecitabine)、Furtulon™/去氧氟尿苷(doxifluridine)、口服類紫杉醇、SPU-077/順鉑、HMR 1275/夫拉平度(flavopiridol)、CP-358 (774)/EGFR、CP-609 (754)/RAS致癌基因抑制劑、BMS-182751/口服鉑、UFT(替加氟(Tegafur)/尿嘧啶)、Ergamisol®/左旋咪唑(levamisole)、Campto®/左旋咪唑、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增強子、Camptosar®/伊立替康(irinotecan)、Tomudex®/雷替曲塞(raltitrexed)、Leustatin®/克拉屈濱(cladribine)、Caelyx®/脂質體多柔比星、肌細胞脂質體多柔比星(Myocetliposomal doxorubicin)、脫氧脂質體多柔比星(Doxilliposomal doxorubicin)、Evacet™/脂質體多柔比星、Fludara®/氟達拉濱(fludarabine)、表阿黴素(Pharmorubicin)表柔比星(epirubicin)、DepoCyt®、ZD1839、LU 79553/雙萘醯亞胺、LU 103793/多司坦(Dolastain)、Gemzar®/吉西他濱(gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘種子、CDK4及CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/地西磷醯胺(dexifosfamide)、Ifex®/Mesnex®/異環磷醯胺(ifosfamide)、Vumon®/替尼泊苷(teniposide)、Paraplatin®/卡鉑、Platinol®/順鉑、VePesid®/Eposin®/Etopophos®/依托泊苷(etoposide)、ZD 9331、Taxotere®/多西他賽(docetaxel)、鳥嘌呤阿拉伯糖苷之前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲、烷化劑(例如美法崙(melphalan)及環磷醯胺)、胺魯米特(aminoglutethimide)、天冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、阿糖胞苷(cytarabine) HCl、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin) HCl、雌氮芥磷酸鈉、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺(flutamide)、羥基脲(hydroxycarbamide)、異環磷醯胺、干擾素α-2a、干擾素α-2b、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate,LHRH釋放因子類似物)、洛莫司汀(lomustine,CCNU)、甲基二氯乙胺(mechlorethamine) HCl (氮芥)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、米托坦(mitotane,o,p′-DDD)、米托蒽醌HCl、奧曲肽(octreotide)、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine) HCl、鏈脲黴素(streptozocin)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)、硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、硫酸長春鹼(vinblastine sulfate)、安吖啶(amsacrine,m-AMSA)、阿扎胞苷(azacitidine)、紅血球生成素、六甲蜜胺(hexamethylmelamine,HMM)、介白素2、米托胍腙(mitoguazone,甲基-GAG;甲基乙二醛雙脒腙;MGBG)、噴司他丁(pentostatin,2′去氧助間型黴素)、司莫司汀(semustine,甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)及硫酸長春地辛(vindesine sulfate)。用於本文所提供之醫藥組合物及組合中之其他例示性治療化合物可發現於本文別處(參見例如部分I之例示性細胞介素、生長因子、光激致效劑、放射性核種、毒素、siRNA分子、酶/前藥對、抗代謝物、傳訊調節劑、抗癌抗生素、抗癌抗體、血管生成抑制劑及化學治療化合物)。
在一些實例中,組合可包括其他治療劑或化合物,例如為由病毒編碼及表現之酶之受質之劑或化合物,或本文所提供或此項技術中已知與病毒協同作用之其他治療化合物。舉例而言,病毒可表現將前藥轉化成用於殺傷癌細胞之活性化學治療藥物之酶。因此,本文所提供之組合可含有治療劑或化合物,例如前藥。例示性病毒/治療劑或化合物組合可包括編碼單純疱疹病毒胸苷激酶之病毒與前藥更昔洛韋。用於所提供組合中之其他例示性酶/前藥對包括(但不限於)水痘帶狀疱狀病毒胸苷激酶/更昔洛韋、胞嘧啶去胺酶/5-氟尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸酶/6-甲基嘌呤去氧核糖苷、β內醯胺酶/頭孢菌素-多柔比星、羧肽酶G2/4-[(2-氯乙基)(2-甲磺醯基氧基乙基)胺基]苯甲醯基-L-麩胺酸、細胞色素P450/對乙醯胺基酚、辣根過氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基還原酶/C B1954、兔羧酸酯酶/7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基喜樹鹼(CPT-11)、蘑菇酪胺酸酶/雙-(2-氯乙基)胺基-4-羥基苯基胺基甲酮28、β半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羥基-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚、β葡糖醛酸糖苷酶/表柔比星-葡萄糖醛酸苷、胸苷磷酸酶/5′-去氧-5-氟尿苷、去氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷、β-內醯胺酶及亞麻苦苷酶/亞麻苦苷。用於組合中之其他例示性前藥亦可發現於本文別處(參見例如部分I)。本文所提供或此項技術中另外已知之多種已知組合中之任一者可包括在本文所提供之組合中。
在一些實例中,組合可包括可殺傷或抑制病毒生長或毒性之劑或化合物。該等劑或化合物可用於緩和可由病毒感染引起之一或多種不良副作用(參見例如美國專利公開案第US 2009-016228-A1號)。本文所提供之組合可含有用於治療感染之抗生素、抗真菌、抗寄生蟲或抗病毒化合物。在一些實例中,抗病毒化合物係抑制病毒生長或毒性之化學治療劑。可包括在與本文所提供之病毒之組合中之例示性抗生素包括(但不限於)頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢吡肟(cefepime)、亞胺培南(imipenem)、胺基糖苷、萬古黴素(vancomycin)及抗假單胞菌β-內醯胺。可包括在與本文所提供之病毒之組合中之例示性抗真菌劑包括(但不限於)兩性黴素(amphotericin) B、二胺苯碸(dapsone)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黃黴素(griseofulvin)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)、克氯黴唑(clotrimazole)、制黴菌素(nystatin)及其組合。可包括在與本文所提供之病毒之組合中之例示性抗病毒劑包括(但不限於)西多福韋(cidofovir)、西多福韋(CDV)之烷氧基烷基酯、環狀CDV及(S)-9-(3-羥基-2膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤、5-(二甲氧基甲基)-2′-去氧尿苷、靛紅-β-縮胺基硫脲、N-甲烷基甲基胸苷、溴夫定(brivudine)、7-地沙奈普拉諾星(deazaneplanocin) A、ST-246、Gleevec®、2′-β-氟-2′,3′-二去氧腺苷、茚地那韋(indinavir)、奈非那韋(nelfinavir)、利托那韋(ritonavir)、奈韋拉平(nevirapine)、AZT、ddI、ddC及其組合。通常,與抗病毒劑之組合含有已知對組合之病毒有效之抗病毒劑。舉例而言,組合可含有痘瘡病毒與抗病毒化合物,例如西多福韋、西多福韋之烷氧基烷基酯、更昔洛韋、阿昔洛韋(acyclovir)、ST-246、Gleevec®及其衍生物。
在一些實例中,組合可包括可偵測化合物。可偵測化合物可包括例如可與由病毒編碼及表現之蛋白質或RNA相互作用及/或特異性結合、且可提供可偵測信號(例如可藉由斷層攝影、光譜、磁共振或其他已知技術偵測之信號)之配位體、受質或其他化合物。在一些實例中,蛋白質或RNA係外源蛋白質或RNA。在一些實例中,由病毒表現之蛋白質或RNA修飾可偵測化合物,其中經修飾之化合物發射可偵測信號。例示性可偵測化合物可為或可含有成像劑,例如磁共振、超音波或斷層攝影成像劑,包括放射性核種。可偵測化合物可包括如本文別處提供或以其他方式為此項技術中已知之多種化合物中之任一者。可由用於偵測之病毒及可偵測化合物組合表現之例示性蛋白質包括(但不限於)螢光素酶及螢光素、β-半乳糖苷酶及(4,7,10-三(乙酸)-1-(2-β-哌喃半乳糖基乙氧基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)釓(Egad)及此項技術中已知之其他組合。
在一些實例中,組合可包括調節由病毒編碼之一或多種基因之表現之基因表現調節化合物。調節基因表現之化合物為此項技術中已知,且包括(但不限於)轉錄活化劑、誘導劑、轉錄抑制因子、RNA聚合酶抑制劑及RNA結合化合物(例如siRNA或核酶)。此項技術中已知之多種基因表現調節化合物中之任一者可包括在本文所提供之組合中。通常,與病毒一起包括在本文所提供之組合中之基因表現調節化合物將為可結合、抑制或與在基因表現中有活性之一或多種化合物(例如組合之病毒之轉錄因子或RNA)反應之化合物。例示性病毒/表現調節劑組合可為編碼嵌合轉錄因子複合物之病毒,該複合物具有融合至酵母GAL4 DNA結合結構域(單純疱疹病毒蛋白VP16之活化結構域)之突變人類助孕酮受體,且亦含有含腺病毒主要晚期E1B TATA盒上游之一系列GAL4識別序列之合成啟動子,其中化合物可為RU486 (參見例如Yu等人(2002) Mol Genet Genomics 268:169-178)。此項技術中已知之多種其他病毒/表現調節劑組合亦可包括在本文所提供之組合中。
在一些實例中,組合可含有奈米粒子。奈米粒子可經設計使得其攜帶本文所提供之一或多種治療劑。另外,奈米粒子可經設計以攜帶使奈米粒子靶向腫瘤細胞之分子。在一個非限制性實例中,奈米粒子可用放射性核種、視情況地與腫瘤相關抗原具有免疫反應性之抗體包衣。
在一些實例中,組合可含有用於診斷或治療之一或多種其他治療及/或診斷病毒或其他治療及/或診斷微生物(例如治療及/或診斷細菌)。例示性治療及/或診斷病毒為此項技術中已知且包括(但不限於)治療及/或診斷痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相關病毒及里奧病毒。
H. D. 套組
本文所提供之病毒、細胞、醫藥組合物或組合可包裝為套組。套組可視情況地包括一或多種組件,例如使用說明書、裝置以及其他試劑及組件,例如用於實踐該等方法之管、容器及注射器。例示性套組可包括本文所提供之任一病毒,且可視情況地包括使用說明書、用於偵測個體病毒之裝置、將病毒投與個體之裝置或另一劑或化合物投與個體之裝置。
在一個實例中,套組可含有說明書。說明書通常包括闡述病毒及視情況地套組中所包括之其他組分之有形表述,及用於投與病毒之投與方法,包括確定個體之適當狀態、適當劑量量及適當投與方法之方法。說明書亦可包括用於在治療時間之持續時間內監測個體之指南。
在另一實例中,套組可含有用於偵測個體病毒之裝置。用於偵測個體病毒之裝置可包括用於偵測光(例如自螢光素酶發射之光,或自螢光蛋白、例如綠色或紅色螢光蛋白發出之光)之弱光成像裝置、磁共振量測裝置(例如MRI或NMR裝置)、斷層攝影掃描儀(例如PET、CT、CAT、SPECT或其他相關掃描儀)、超音波裝置或可用於偵測由個體內之病毒表現之蛋白質之其他裝置。通常,套組之裝置將能夠偵測由套組之病毒表現之一或多種蛋白質。含有病毒及偵測裝置之多種套組中之任一者可包括在本文所提供之套組中,例如表現螢光素酶之病毒及弱光成像儀、或表現螢光蛋白(例如綠色或紅色螢光蛋白)之病毒及弱光成像儀。
本文所提供之套組亦可包括將病毒投與個體之裝置。此項技術中已知用於投與藥物、醫藥組合物及疫苗之多種裝置中之任一者可包括在本文所提供之套組中。例示性裝置包括(但不限於)皮下注射針、靜脈內針、導管、無針注射裝置、吸入器及液體分配器(例如滴眼器)。舉例而言,欲例如藉由靜脈內注射全身遞送之病毒可包括在具有皮下注射針及注射器之套組中。通常,用於投與套組病毒之裝置將與套組之病毒相容;例如,無針注射裝置(例如高壓注射裝置)可包括在病毒未經高壓注射損害之套組中,但通常不包括在病毒經高壓注射損害之套組中。
本文所提供之套組亦可包括將另一劑或化合物投與個體之裝置。此項技術中已知用於將藥物投與個體之多種裝置中之任一者可包括在本文所提供之套組中。例示性裝置包括(但不限於)皮下注射針、靜脈內針、導管、無針注射裝置、吸入器及液體分配器(例如滴眼器)。通常,用於投與套組化合物之裝置將與化合物之期望投與方法相容。舉例而言,欲全身或皮下遞送之化合物可包括在具有皮下注射針及注射器之套組中。
VI. 治療、診斷及監測方法
本文所提供之病毒(包括本文所提供之純系病毒株及重組病毒株)可用於診斷、監測及治療方法中。舉例而言,在治療方法中,本文所提供之病毒(包括純系病毒株及重組病毒株)可用於治療增生性病症或疾患,包括治療癌性細胞、增生、贅瘤、腫瘤、轉移及其他免疫優先之細胞或組織,例如受傷或發炎之組織。本文所提供之病毒(包括本文所提供之純系病毒株及重組病毒株)可用於癌性細胞、增生、腫瘤及轉移監測治療之偵測及成像之診斷方法中。在其他實例中,本文所提供之病毒(包括純系病毒株及重組株)可用於診斷或監測方法中來偵測宿主中之病毒活性。本文所提供之診斷及治療方法包括(但不限於)將本文所提供之病毒投與含有腫瘤、增生、癌症及/或轉移之個體。在其他實例中,本文所提供之病毒(包括本文所提供之純系病毒株及重組病毒株)可在疫苗接種方法中用作疫苗。
所投與病毒具有一或多種特徵,包括減弱的致病性、低毒性、增強的抗致瘤性、優先在腫瘤中累積、活化針對腫瘤細胞之免疫反應之能力、複製能力、表現其他外源診斷及/或治療基因之能力、抑制個體之腫瘤、增生、轉移及/或癌症之能力、誘導經感染細胞及/或個體中之細胞凋亡之能力、避免宿主補體之能力、避免個體之免疫原性反應之能力及增強個體對增生、腫瘤、癌症及/或轉移之免疫反應之能力。可投與病毒用於個體(例如但不限於人類及其他哺乳動物,包括(但不限於)嚙齒類動物、狗、貓、靈長類動物及家畜)之診斷、監測(例如監測療法)及/或治療。本文所提供之病毒可用於或經修飾用於已採用或可採用病毒之任何已知方法(或用途)中。任一病毒(包括VIP02、VIR11、VIR13、VIR25、VIR27、VIR37、VIR40、VIR41、VIR42、VIR46、VIR49、VIR52、VIR57、VIR71、VIR86、VIR93、VIR94、VIR96、VIR100、VIR103、VIR105、VIR106、VIR109、VIR111、VIR113、VIR114、VIR115、VIR123、VIR127及/或VIR128病毒及其衍生物,包括包含與選自由VIP02、VIR11、VIR13、VIR25、VIR27、VIR37、VIR40、VIR41、VIR42、VIR46、VIR49、VIR52、VIR57、VIR71、VIR86、VIR93、VIR94、VIR96、VIR100、VIR103、VIR105、VIR106、VIR109、VIR111、VIR113、VIR114、VIR115、VIR123、VIR127及/或VIR128組成之群之病毒之基因體序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列一致性之核酸序列之病毒)可用於及/或經修飾用於下文所述及本文揭示案通篇所論述之治療及診斷方法中。
A. 治療方法
例如,本文所提供之病毒(包括本文所提供之純系病毒株及重組病毒株,包括任一病毒,例如如部分III中所述之重組病毒或重組溶瘤病毒)可用於治療增生性病症或疾患,包括治療(例如抑制)癌性細胞、增生、贅瘤、腫瘤、轉移、癌症幹細胞及其他免疫優先之細胞或組織,例如受傷或發炎之組織。
因此,在一些實施例中,本文提供治療個體之增生性病症之方法,其包括向個體投與如本文所述之病毒,例如重組病毒或重組溶瘤病毒或溶瘤病毒。
在一些實施例中,本文亦提供治療個體之增生性病症之方法,其包括向個體投與如本文所述之任一組合物,例如任一醫藥組合物。
本文亦提供抑制病毒複製之方法,該方法包括使經病毒(例如重組溶瘤病毒)感染之細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。本文亦提供抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中個體先前已投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒。細胞凋亡誘導蛋白可為如本文所述、例如如部分III(D)中所述之任一細胞凋亡誘導蛋白。在一些實施例中,接觸在個體之活體內進行,其中已將AP1903 (利米多賽)投與先前投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒的個體。
在一些實施例中,本文所提供之病毒優先在腫瘤或轉移中累積。在一些實施例中,該方法優先抑制非癌細胞中之病毒複製。在一些實施例中,投與本文所提供之病毒可減緩腫瘤生長,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞。在其他實施例中,投與本文所提供之病毒可減小腫瘤體積而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,包括消除或根除腫瘤。然而,本文所提供之治療方法及用途不需要所投與病毒來殺傷腫瘤細胞或減小腫瘤大小。實際上,在一些實施例中,本文所提供之方法包括向個體投與可引起或增強個體中之抗腫瘤免疫反應而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞之本文所提供之病毒。在一些實施例中,本文所提供之病毒可投與個體而不會在個體中引起病毒誘發之疾病。在一些實施例中,本文所提供之病毒可投與個體而不會在個體中引起病毒誘發之疾病,例如不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞。在一些實施例中,病毒可引發個體之抗腫瘤免疫反應,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中病毒介導之抗腫瘤免疫反應通常可在例如幾天、一週或更長時間、10天或更長時間、兩週或更長時間、或一個月或更長時間內產生。在一些例示性方法中,病毒可存在於腫瘤中,且可引起抗腫瘤免疫反應,而病毒本身不會引起足以防止腫瘤生長之腫瘤細胞死亡。在一些實施例中,腫瘤係單一治療腫瘤或單一治療癌症,其中當僅用病毒或治療劑處理時,腫瘤或癌症之體積並不減小。
在一些實例中,本文所提供之治療方法抑制個體之腫瘤生長,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起或增強抗腫瘤免疫反應之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之抗腫瘤免疫反應可抑制腫瘤生長。
在一些實施例中,本文所提供之治療方法抑制個體中轉移之生長或形成,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起或增強抗腫瘤免疫反應之本文所提供之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之抗腫瘤免疫反應可抑制轉移生長或形成。
在其他實施例中,本文所提供之治療方法減小個體中腫瘤及/或轉移之大小,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起或增強抗腫瘤免疫反應之本文所提供之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之抗腫瘤免疫反應可減小腫瘤及/或轉移之大小。
在一些實施例中,本文所提供之治療方法消除個體之腫瘤及/或轉移,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起或增強抗腫瘤免疫反應之本文所提供之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之抗腫瘤免疫反應可消除個體之腫瘤及/或轉移。在一些實例中,本文所提供之治療方法誘導個體中腫瘤、癌症、增生及或轉移之細胞凋亡,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強細胞凋亡之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增加的細胞凋亡可抑制腫瘤生長。在一些實施例中,本文所提供之治療方法誘導個體中腫瘤、癌症、增生及或轉移之細胞凋亡,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強細胞凋亡之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增加的細胞凋亡可抑制轉移生長或形成。在一些實例中,本文所提供之治療方法誘導個體中腫瘤、癌症、增生及或轉移之細胞凋亡,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強細胞凋亡之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增加的細胞凋亡可減小腫瘤及/或轉移之大小。
在一些實施例中,本文所提供之治療方法抑制個體中腫瘤、癌症、增生及或轉移之血管生成,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或抑制血管生成之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之減少的血管生成可抑制腫瘤生長。在一些實例中,本文所提供之治療方法抑制個體中腫瘤、癌症、增生及或轉移之血管生成,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可抑制血管生成之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之減少的血管生成可抑制轉移生長或形成。在一些實施例中,本文所提供之治療方法抑制個體中腫瘤、癌症、增生及或轉移之血管生成,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可抑制血管生成之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之減少的血管生成可減小腫瘤及/或轉移之大小。
在一些實施例中,本文所提供之治療方法增強個體對腫瘤、癌症、增生及或轉移之免疫反應,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強免疫反應之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增強的免疫反應可抑制腫瘤生長。在一些實例中,本文所提供之治療方法增強個體對腫瘤、癌症、增生及或轉移之免疫反應,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強免疫反應之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增強的免疫反應可抑制轉移生長或形成。在一些實例中,本文所提供之治療方法增強個體對腫瘤、癌症、增生及或轉移之免疫反應,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強免疫反應之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增強的免疫反應可減小腫瘤及/或轉移之大小。在一些實施例中,本文所提供之治療方法增強個體對腫瘤、癌症、增生及或轉移之免疫反應,而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤、癌症、增生及或轉移中累積且可引起或增強免疫反應之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之增強的免疫反應可消除個體之腫瘤及/或轉移。
在一些實施例中,本文所提供之治療方法降低病毒對健康細胞之毒性,同時在個體之腫瘤及/或轉移中實現毒性及/或抗致瘤效應,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起或增強抗腫瘤免疫反應之本文所提供之病毒。由腫瘤或轉移累積之病毒誘導之抗腫瘤免疫反應可消除個體之腫瘤及/或轉移而不會顯著影響非癌性、健康及/或正常細胞。
減少或抑制腫瘤生長、抑制轉移生長及/或形成、減小腫瘤或轉移之大小、消除腫瘤或轉移及/或癌症幹細胞、而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞或本文所提供之其他腫瘤治療方法的方法包括在宿主中引起或增強抗腫瘤免疫反應、誘導細胞凋亡及/或抑制血管生成而不顯著影響宿主中之健康、非癌性及/或正常細胞。宿主之免疫反應本質上係抗腫瘤的,可針對病毒已累積之腫瘤及/或轉移引起,且亦可針對病毒尚未累積之腫瘤及/或轉移(包括在將病毒投與個體後形成之腫瘤及/或轉移)引起。因此,生長或形成受抑制或大小減小或被消除之腫瘤及/或轉移可為病毒已累積之腫瘤及/或轉移,或亦可為病毒尚未累積之腫瘤及/或轉移。因此,本文提供減少或抑制腫瘤生長、抑制轉移生長及/或形成、減小腫瘤或轉移之大小、消除腫瘤或轉移、而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞或本文所提供之其他腫瘤治療方法的方法,其包括在宿主中引起或增強抗腫瘤免疫反應、誘導細胞凋亡及/或抑制血管生成而不顯著影響宿主中之健康、非癌性及/或正常細胞,其中該方法包括向個體投與本文所提供之病毒,其中病毒在至少一個腫瘤或轉移中累積且引起或增強個體之抗腫瘤免疫反應,且免疫反應亦針對病毒細胞並未累積之腫瘤及/或轉移引起。在另一實施例中,提供抑制或預防贅瘤疾病復發、或抑制或預防新腫瘤生長之方法,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起或增強抗腫瘤免疫反應之本文所提供之病毒,且抗腫瘤免疫反應可抑制或預防贅瘤疾病復發、或抑制或預防新腫瘤生長。
本文所提供之腫瘤或贅瘤疾病治療方法(例如減少或抑制腫瘤生長、抑制轉移生長及/或形成、減小腫瘤或轉移之大小、消除腫瘤或轉移、而不會顯著影響健康、非癌性及/或正常細胞或本文所提供之其他腫瘤治療方法的方法)包括引起或增強抗腫瘤免疫反應、誘導細胞凋亡、避免宿主之補體及/或抑制宿主中之血管生成而不顯著影響宿主中之健康、非癌性及/或正常細胞,亦可包括向個體投與可引起腫瘤細胞溶解或腫瘤細胞死亡(包括藉由細胞凋亡之細胞自殺)之本文所提供之病毒。該病毒可為與可引起或增強個體之抗腫瘤免疫反應之病毒相同之病毒。諸如本文所提供病毒之病毒可因內源基因之表現或因外源基因而引起細胞溶解或腫瘤細胞死亡。內源或外源基因可因如此項技術中已知之直接或間接作用(包括溶解通道形成或細胞凋亡路徑之活化)而引起腫瘤細胞溶解或抑制細胞生長。基因產物(例如外源基因產物)可用於將前藥活化成活性細胞毒性形式,從而引起表現該等基因之細胞死亡。
該等腫瘤及/或轉移治療方法可包括投與本文所提供之病毒用於療法,例如用於基因療法、用於癌症基因療法或用於疫苗療法。該病毒可用於刺激體液及/或細胞免疫反應,誘導可能受益於該等反應之個體之強細胞毒性T淋巴球反應。舉例而言,藉由使用表現以下之病毒排斥來自腫瘤或病灶之細胞,該病毒可提供針對病毒感染之腫瘤或其他感染性疾病之預防及治療效應:免疫反應性抗原(Earl等人,Science 234: 728-831 (1986);Lathe等人,Nature (London) 32: 878-880 (1987)), cellular tumor-associated antigens (Bernards等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6854-6858 (1987);Estin等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1052-1056 (1988);Kantor等人,J. Natl. Cancer Inst. 84: 1084-1091 (1992);Roth等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4781-4786 (1996))及/或細胞介素(例如IL-2、IL-12)、共刺激分子(B7-1、B7-2) (Rao等人,J. Immunol.156: 3357-3365 (1996);Chamberlain等人,Cancer Res.56: 2832-2836 (1996);Oertli等人,J. Gen. Virol.77: 3121-3125 (1996);Qin及Chatterjee, Human Gene Ther.7: 1853-1860 (1996);McAneny等人,Ann. Surg. Oncol.3: 495-500 (1996))或其他治療性蛋白質。
如先前所顯示,可用病毒(例如痘瘡病毒)處理實體腫瘤,引起巨大的腫瘤特異性病毒複製,此可導致在腫瘤中產生腫瘤蛋白抗原及病毒蛋白(美國專利公開案第2005-0031643號,現為美國專利第7,588,767號、美國專利7,588,771號、美國專利7,662,398號),其提供並例示GLV-1h68病毒及其衍生物。投與小鼠之痘瘡病毒導致經感染之腫瘤細胞溶解,從而導致腫瘤細胞特異性抗原釋放。該等抗原連續泄露至體內在小鼠中產生針對腫瘤蛋白、病毒蛋白及病毒編碼之經改造蛋白之極高水準之抗體效價(在大約7-14天中)。新合成之抗腫瘤抗體及增強的巨噬細胞、嗜中性球計數經由脈管系統連續遞送至腫瘤,且由此提供針對腫瘤之活化免疫系統之募集。活化免疫系統隨後消除腫瘤之外來化合物,包括病毒粒子。外來抗原之此互連釋放加強抗體產生及抗體對腫瘤蛋白之持續反應,以起與由痘瘡病毒感染及複製起始之自體免疫疫苗接種系統相似之作用,然後進行細胞溶解、蛋白質泄露及增強的抗體產生。因此,本文所提供之病毒及使用本文所提供之方法產生之病毒可在完整過程中投與,該過程可應用於具有免疫優先之腫瘤位點作為優先病毒生長位點之所有腫瘤系統,此可藉由宿主自身之免疫系統消除腫瘤。
在一些實施例中,增生性病症係腫瘤或轉移。在一些實施例中,增生性病症係癌症。在此方面,癌症並不受限,且其他轉移性疾病可藉由本文所提供之組合來治療。在一些實施例中,所治療之腫瘤或轉移可為實體腫瘤,例如肺及支氣管、乳、結腸及直腸、腎臟、胃、食管、肝臟及肝內膽道、尿路膀胱、腦及其他神經系統、頭及頸、口腔及咽、子宮頸、子宮體、甲狀腺、卵巢、睪丸、前列腺之實體腫瘤、惡性黑色素瘤、膽管癌、胸腺瘤、非黑色素瘤皮膚癌,以及血液腫瘤及/或惡性病,例如兒童白血病及淋巴瘤、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、淋巴球性淋巴瘤及皮膚源性淋巴瘤、急性及慢性白血病(例如急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓細胞性白血病或慢性骨髓細胞性白血病)、漿細胞贅瘤、淋巴贅瘤及與AIDS相關之癌症。例示性腫瘤包括例如胰臟腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、結腸腫瘤、前列腺腫瘤、子宮頸腫瘤及乳房腫瘤及其轉移。
在一些實施例中,腫瘤或轉移係選自由以下組成之群之癌症之腫瘤或轉移:胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、直腸癌、腎(腎臟)癌、胃癌、食管癌、肝(肝臟)癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、口癌(例如口腔癌)、子宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤,例如惡性黑色素瘤)、膽管癌(膽道癌)、胸腺上皮癌(例如胸腺瘤)、白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤。
在一些實施例中,癌症係乳癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌或胰臟癌。在一些實施例中,癌症係MSS結腸直腸癌。在一些實施例中,所治療腫瘤或轉移係諸如胰臟癌、非小細胞肺癌、多發性骨髓瘤或白血病之癌症。在一些實施例中,腫瘤係癌瘤,例如卵巢瘤或胰臟瘤。
在其他實例中,提供治療個體之方法,其中該等方法包括向個體投與表現本文所述之一或多種構造物之病毒,該個體將對該等構造物之抗原產生免疫反應。免疫抗原可為病毒之內源性抗原,例如用於免疫天花、麻疹、腮腺炎之痘瘡病毒上之痘瘡抗原,或免疫抗原可為由病毒表現之外源抗原,例如在病毒衣殼表面上表現之流感或HIV抗原。在天花之情形下,例如,腫瘤特異性蛋白抗原可由用於天花疫苗之減毒痘瘡病毒(由病毒基因體編碼)攜帶。因此,本文所提供之病毒(包括經修飾之痘瘡病毒)可用作疫苗。
在一些實例中,本文提供引發或增強個體中針對所選抗原或所選抗原類型之抗體產生之方法,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起所選抗原或所選抗原類型自腫瘤釋放、從而導致針對所選抗原或所選抗原類型之抗體產生的病毒。在本文所提供之方法中可靶向多種抗原中之任一者,包括所選抗原,例如由病毒表現之外源基因產物,或所選抗原類型,例如因腫瘤之病毒感染而自腫瘤釋放之一或多種腫瘤抗原(例如藉由溶解、細胞凋亡、分泌或引起抗原自腫瘤釋放之其他機制)。
在一些實例中,可期望在連續幾天(例如至少一週、至少10天、至少兩週或至少一個月)內維持所選抗原或所選抗原類型之釋放。本文提供在個體內提供持續抗原釋放之方法,其中該等方法包括向個體投與可在腫瘤及/或轉移中累積且可引起抗原之持續釋放、從而導致針對抗原之抗體產生的病毒。抗原之持續釋放可引起病毒感染之宿主之免疫反應,其中宿主可產生針對抗原之抗體,及/或宿主可引起針對表現抗原之細胞之免疫反應,包括針對腫瘤細胞之免疫反應。因此,抗原之持續釋放可引起針對腫瘤細胞之免疫。在一些實例中,病毒介導之持續抗原釋放誘導之針對腫瘤細胞之免疫反應可完全去除或殺傷所有腫瘤細胞。
在一些實施例中,個體患有選自由以下組成之群之癌症:胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、直腸癌、腎(腎臟)癌、胃癌、食管癌、肝(肝臟)癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、口癌(例如口腔癌)、子宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤,例如惡性黑色素瘤)、膽管癌(膽道癌)、胸腺上皮癌(例如胸腺瘤)、白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤。
在一些實施例中,個體展現重度免疫缺乏且對病毒感染敏感。
在一些實施例中,增生性病症係MSS結腸直腸癌且重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中,增生性病症係MSS結腸直腸癌且重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。在一些實施例中,個體展現重度免疫缺乏且對病毒感染敏感,增生性病症係MSS結腸直腸癌,且重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
在一些實施例中,本文所提供之方法(例如治療方法)進一步包括向個體投與AP1903 (利米多賽)。
B. 投與
可將本文所提供之病毒投與個體,包括患有腫瘤、癌症、增生、轉移或具有贅瘤細胞之個體或欲免疫之個體。所投與病毒可為本文所提供之病毒或使用本文所提供之方法產生之任何其他病毒。在一些實例中,所投與病毒係含有諸如以下之特徵之病毒:減弱的致病性、低毒性、優先在腫瘤中累積、活化針對腫瘤細胞之免疫反應之能力、誘導細胞凋亡之能力、高免疫原性、複製能力及表現外源蛋白之能力及其組合。
1. 投與病毒前之步驟
在一些實例中,可在向個體投與病毒之前實施一或多個步驟。可實施多個先前步驟中之任一者,包括(但不限於)診斷患有適於病毒投與之疾患之個體、確定個體之免疫能力、對個體進行免疫、用化學治療劑治療個體、用輻射治療個體或手術治療個體。
關於包括向帶有腫瘤之個體投與病毒用於治療目的之實例,個體通常先前已經診斷患有贅瘤疾患。診斷方法亦可包括確定贅瘤疾患之類型、確定贅瘤疾患之時期、確定個體中一或多個腫瘤之大小、確定個體淋巴結中轉移或贅瘤細胞之存在或不存在、或確定個體轉移之存在。用於向個體投與病毒之治療方法之一些實例可包括確定原發性腫瘤之大小或贅瘤疾病之時期的步驟,且若原發性腫瘤之大小等於或大於臨限體積,或若贅瘤疾病之時期處於或高於臨限時期,則將病毒投與個體。在相似實例中,若原發性腫瘤之大小低於臨限體積,或若贅瘤疾病之時期處於或低於臨限時期,則不將病毒投與個體;該等方法可包括監測個體直至腫瘤大小或贅瘤疾病時期達到臨限量,且然後將病毒投與個體。臨限大小可根據若干因素而變化,包括腫瘤之生長速率、病毒感染腫瘤之能力及個體之免疫能力。通常,臨限大小將為使病毒足以在腫瘤中或附近累積及複製而不會由宿主之免疫系統完全去除之大小,且通常亦將為足以使病毒感染持續足夠長時間以使宿主引起通常約一週或更長時間、約10天或更長時間、或約兩週或更長時間的針對腫瘤細胞之免疫反應之大小。病毒(例如痘瘡病毒)之例示性臨限腫瘤大小係至少約100 mm
3、至少約200 mm
3、至少約300 mm
3、至少約400 mm
3、至少約500 mm
3、至少約750 mm
3、至少約1000 mm
3或至少約1500 mm
3。臨限贅瘤疾病時期亦可根據若干因素而變化,包括對特定贅瘤疾病分期之具體要求、贅瘤疾病生長之侵襲性、病毒感染腫瘤或轉移之能力及個體之免疫能力。通常,臨限時期將為足以使病毒在腫瘤或轉移中累積及複製而不會由宿主之免疫系統完全去除之時期,且通常亦將為足以使病毒感染持續足夠長時間以使宿主引起通常約一週或更長時間、約10天或更長時間或約兩週或更長時間的針對贅瘤細胞之免疫反應之大小。例示性臨限時期係超過最低時期(例如I期或等效期)之任一時期、或原發性腫瘤大於臨限大小之任一時期、或偵測到轉移細胞之任一時期。
在其他實施例中,在向個體投與病毒之前,可確定個體之免疫能力。本文所提供之向個體投與病毒之方法可包括引起或增強個體之免疫反應。因此,在向個體投與病毒之前,可確定個體引起免疫反應之能力。可在本文所提供之方法中實施此項技術中已知之多種免疫能力測試中之任一者。例示性免疫能力測試可檢查ABO血球凝集效價(IgM)、白血球黏附缺乏(LAD)、顆粒球功能(NBT)、T及B細胞量化、破傷風抗體效價、唾液IgA、皮膚測試、扁桃腺測試、補體C3水準、因子B水準及淋巴球計數。熟習此項技術者可根據個體之免疫能力水準、根據病毒之免疫原性及視情況地根據欲治療贅瘤疾病之免疫原性來確定向個體投與病毒之合意性。通常,若熟習此項技術者可確定個體有足夠的能力引起針對病毒之免疫反應,則可認為個體係有免疫能力的。
在一些實施例中,個體可在根據本文所提供之方法向個體投與病毒之前進行免疫。免疫可用於增加個體引起針對病毒之免疫反應之能力,或增加個體可引起針對病毒之免疫反應之速度。免疫亦可用於降低個體之病毒致病性之風險。在一些實施例中,免疫可用與欲投與之治療病毒相似之免疫病毒來實施。舉例而言,免疫病毒可為治療病毒之無複製能力之變異體。在其他實施例中,免疫材料可為欲投與之治療病毒之消化物。用於免疫個體抵抗已知病毒之多種方法中之任一者為此項技術中已知且可用於本文中。在一個實施例中,將痘瘡病毒用例如1毫克補骨脂素及365 nm處之紫外光處理4分鐘可使其無複製能力。在另一實施例中,可選擇與個體先前已對其免疫(例如在兒童疫苗接種中)之病毒相同或相似之病毒。
在另一實施例中,個體可能已向其投與病毒而無任何先前癌症治療步驟,例如化學療法、輻射療法或手術去除腫瘤及/或轉移。本文所提供之方法利用病毒進入或定位於腫瘤附近之能力,其中腫瘤細胞可受保護免於個體之免疫系統;病毒隨後可在該免疫保護區域中增生且亦可導致腫瘤抗原自腫瘤釋放(通常持續釋放)至個體之免疫系統可識別腫瘤抗原並引起免疫反應之位置。在該等方法中,足夠大小或足以產生免疫保護狀態之腫瘤之存在可能有利於成功地將病毒投與腫瘤,且有利於足夠的腫瘤抗原產生。若手術去除腫瘤,則病毒可能無法定位於其他贅瘤細胞(例如小轉移),此乃因該等細胞尚未足夠成熟至產生病毒可存活並增生之免疫保護環境,或即使病毒可定位於贅瘤細胞,細胞數或團塊大小可能因對病毒而言過小而無法引起腫瘤抗原之持續釋放以使宿主引起抗腫瘤免疫反應。因此,例如,本文提供治療腫瘤、癌症、轉移或贅瘤疾病之方法,其中將病毒投與患有腫瘤或贅瘤疾病之個體而不去除原發性腫瘤,或將病毒投與有意地允許至少一些腫瘤或贅瘤細胞保留在個體中之患有腫瘤或贅瘤疾病之個體。在其他典型癌症治療方法(例如化學療法或輻射療法)中,該等方法通常具有削弱個體之免疫系統之副作用。化學療法或輻射療法對個體之此治療可降低個體引起抗腫瘤免疫反應之能力。因此,例如,本文提供治療增生、腫瘤、癌症、轉移或贅瘤疾病之方法,其中將病毒投與患有腫瘤或贅瘤疾病之個體而不用免疫系統削弱療法(例如化學療法或輻射療法)治療個體。
在替代實施例中,在將病毒投與個體之前,可在不會去除原發性腫瘤或不會削弱個體免疫系統之一或多個癌症治療步驟中治療個體。業內正在開發多種更尖端之癌症治療方法,其中腫瘤可在不使用手術去除或免疫系統削弱療法之情況下進行治療。例示性方法包括投與減小腫瘤、癌症、轉移或贅瘤細胞之增生速率而不會削弱免疫系統之化合物(例如,藉由投與腫瘤抑制因子化合物,例如細胞凋亡誘導化合物,或藉由投與腫瘤細胞特異性化合物,例如抗程式化死亡1 (PD-1)受體及抗程式化死亡配位體1 (PD-L1)/L2抑制劑)或投與血管生成抑制化合物。因此,包括向個體投與病毒之組合方法可進一步改良癌症療法。因此,本文提供向個體投與病毒之方法,以及在例如投與減緩腫瘤生長而不會削弱個體之免疫系統之化合物或抑制腫瘤之血管形成之化合物之前或之後,向個體投與病毒之方法。
2. 投與模式
可使用將病毒投與個體之任一投與模式,條件係該投與模式允許病毒進入腫瘤、增生、癌症或轉移。投與模式可包括(但不限於)全身、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、穿皮、真皮內、動脈內(例如肝動脈輸注)、膀胱內灌注、胸膜內、關節內、局部、腫瘤內、病灶內、內視鏡、多穿刺(例如如與天花疫苗一起使用)、吸入、經皮、皮下、鼻內、氣管內、口服、腔內(例如經由導管投與膀胱、藉由栓劑或灌腸劑投與腸)、陰道、直腸、顱內、前列腺內、玻璃體內、耳或眼部投與。在一些實施例中,如本文別處所述之診斷或治療劑亦可以相似之方式投與。在具體實施例中,病毒係靜脈內投與。
熟習此項技術者可選擇與個體及病毒相容且亦可能使得病毒到達腫瘤及/或轉移之任一投與模式。熟習此項技術者可根據多種因素中之任一者來選擇投與途徑,該等因素包括疾病之性質、腫瘤之類別及醫藥組合物中所含之特定病毒。可例如藉由彈道遞送作為膠質分散液系統投與靶位點,或可藉由注射至動脈中實施全身性投與。
3. 劑量及劑量方案
劑量方案可為多種方法及量中之任一者,且可由熟習此項技術者根據已知臨床因素確定。如醫療技術中已知,用於任一患者之劑量可取決於許多因素,包括個體之物種、大小、身體表面積、年齡、性別、免疫能力及一般健康狀況、欲投與之特定病毒、持續時間及投與途徑、疾病之類別及時期(例如腫瘤大小)及同時投與之其他治療或化合物(例如化學治療藥物)。除上述因素外,該等水準可受病毒感染性及病毒性質之影響,如可由熟習此項技術者確定。
在本方法中,病毒之適當最小劑量水準及劑量方案可為足以使病毒在腫瘤或轉移中存活、生長及複製之水準。通常,病毒係以至少或約或1×10
5pfu之量在投與週期內投與至少一次。用於將病毒投與65 kg人類之例示性最小水準可包括至少約1×10
5噬菌斑形成單位(pfu)、至少約5×10
5pfu、至少約1×10
6pfu、至少約5×10
6pfu、至少約1×10
7pfu、至少約1×10
8pfu、至少約1×10
9pfu或至少約1×10
10pfu。舉例而言,在一些實施例中,病毒係以至少或約或1×10
5pfu、1×10
6pfu、1×10
7pfu、1×10
8pfu、1×10
9pfu、1×10
10pfu、1×10
11pfu、1×10
12pfu、1×10
13pfu或1×10
14pfu之量在投與週期內投與至少一次。在一些實施例中,病毒係以1 × 10
5pfu至1 × 10
14pfu之量投與。
在劑量方案中,病毒之量可以單次投與或在投與週期內多次投與。因此,本文所提供之方法可包括將病毒單次投與個體或將病毒多次投與個體。在一些實例中,單次投與足以在腫瘤中建立病毒,其中病毒可增生且可引起或增強個體之抗腫瘤反應;該等方法不需要額外投與病毒來引起或增強個體之抗腫瘤反應,此可例如抑制腫瘤生長、抑制轉移生長或形成、減小腫瘤或大小、消除腫瘤或轉移、抑制或預防贅瘤疾病復發或新腫瘤形成或其他癌症治療效應。
在其他實例中,病毒可在不同之時機投與,在時間上通常相隔至少一天。舉例而言,病毒可投與兩次、三次、四次、五次或六次或更多次,投與間隔一天或更長時間、兩天或更長時間、一週或更長時間、或一個月或更長時間。單獨投與可增加將病毒遞送至腫瘤或轉移之可能性,其中先前投與無法有效地將病毒遞送至腫瘤或轉移。單獨投與可增加腫瘤或轉移上可發生病毒增生之位置,或可以其他方式增加在腫瘤中累積之病毒之效價,此可增加抗原或其他化合物自腫瘤釋放之規模,從而引發或增強宿主之抗腫瘤免疫反應,且亦可視情況地增加基於病毒之腫瘤溶解或腫瘤細胞死亡之水準。病毒之單獨投與可進一步擴大個體對病毒抗原之免疫反應,此可擴大宿主對病毒已累積之腫瘤或轉移之免疫反應,且可增加宿主引起抗腫瘤免疫反應之可能性。
當實施單獨投與時,每一投與可為相對於其他投與劑量量相同或不同之劑量量。在一個實例中,所有投與劑量量係相同的。在其他實例中,第一劑量量可為大於一或多個後續劑量量之劑量量,例如比後續劑量量大至少10×、大至少100×、或大至少1000×。在第一劑量量大於一或多個後續劑量量之單獨投與方法之一個實例中,所有後續劑量量可為相同的、相對於第一次投與較小之量。
單獨投與可包括兩次或更多次投與中之任一數量,包括兩次、三次、四次、五次或六次投與。根據此項技術中已知用於監測治療方法之方法及本文所提供之其他監測方法,熟習此項技術者可容易地確定欲實施之投與次數或實施一或多次額外投與的合意性。因此,本文所提供之方法包括向個體提供一或多次病毒投與之方法,其中投與次數可藉由以下方式來確定:監測個體,並基於監測之結果,確定是否提供一或多次額外投與。可基於多個監測結果決定是否提供一或多次額外投與,該等監測結果包括(但不限於)腫瘤生長或腫瘤生長抑制之指示、新轉移之出現或轉移之抑制、個體之抗病毒抗體效價、個體之抗腫瘤抗體效價、個體之整體健康狀況、個體之體重、僅存在於腫瘤及/或轉移中之病毒、存在於正常組織或器官中之病毒。
投與之間的時間段可為多個時間段中之任一者。投與之間的時間段可隨多種因素(包括監測步驟)中之任一者而變化,如針對投與次數、個體引起免疫反應之時間段、個體自正常組織清除病毒之時間段或病毒在腫瘤或轉移中增生之時間段所述。在一個實例中,時間段可隨個體引起免疫反應之時間段而變化;例如,該時間段可長於個體引起免疫反應之時間段,例如長約一週、長約10天、長約兩週、或長約一個月;在另一實例中,時間段可短於個體引起免疫反應之時間段,例如短約一週、短約10天、短約兩週、或短約一個月。在另一實例中,時間段可隨個體自正常組織清除病毒之時間段而變化;例如,該時間段可長於個體自正常組織清除病毒之時間段,例如長約一天、長約兩天、長約三天、長約五天、或長約一週。在另一實例中,時間段可隨病毒在腫瘤或轉移中增生之時間段而變化;例如,該時間段可長於在投與表現可偵測標記物之病毒後在腫瘤或轉移中出現可偵測信號之時間量,例如約3天、約5天、約一週、約10天、約兩週或約一個月。
舉例而言,將病毒之量在投與週期內投與兩次、三次、四次、五次、六次或七次。病毒之量可在週期之第一天、週期之第一及第二天、週期之連續前三天中之每一天、週期之連續前四天中之每一天、週期之連續前五天中之每一天、週期之連續前六天中之每一天、或週期之連續前七天中之每一天投與。通常,投與週期係7天、14天、21天或28天。端視患者之反應性或預後,投與週期在幾個月或幾年過程內重複。
通常,病毒之適當最大劑量水準或劑量方案係對宿主無毒之水準、不會引起3次或更多次脾腫大之水準、及/或在約1天後或在約3天後或在約7天後不會在正常組織或器官中產生群落或噬菌斑之水準。
4. 共投與
亦提供投與另一治療物質(例如不同之治療病毒或治療化合物)之方法。該等物質可與第一病毒同時、依序或間歇投與。另一治療物質可與病毒或其基因產物相互作用,或另一治療物質可獨立於病毒起作用。
組合療法治療之優點在於:1)其避免單劑抗性;2)在異質腫瘤群體中,其可藉由不同之機制殺傷細胞;及3)藉由選擇具有非重疊毒性之藥物,可以全劑量使用每一劑以引發最大效力及協同效應。組合療法可藉由組合診斷/治療病毒與以下抗癌劑中之一或多者來進行:化學治療劑、治療抗體、siRNA、毒素、酶-前藥對或輻射。
因此,在一些實施例中,本文亦提供治療方法及抑制病毒複製之方法,其進一步包括投與另一治療物質,例如如本文所述之任一治療劑、另一病毒或治療化合物。
a. i. 投與複數種病毒
提供向個體投與兩種或更多種病毒之方法。投與可同時、依序或間歇實現。複數種病毒可以單一組合物或以兩種或更多種組合物投與。兩種或更多種病毒可包括至少兩種病毒。在具體實施例中,當存在兩種病毒時,兩種病毒皆係痘瘡病毒。在另一實施例中,一種病毒係痘瘡病毒且第二種病毒係以下中之任一者:腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、單純疱疹病毒、里奧病毒、腮腺炎病毒、泡沫病毒、流感病毒、黏液病毒、水泡性口炎病毒、或本文所述或此項技術中已知之任何其他病毒。病毒可基於其作用之路徑來選擇。舉例而言,靶向細胞凋亡路徑之病毒可與靶向血管生成路徑之病毒組合。在另一實例中,靶向宿主補體之病毒可與刺激宿主免疫系統之病毒組合。
複數種病毒可提供為含有經包裝用於投與之病毒之組合物之組合,及/或提供為包括該等病毒且視情況地包括其說明書之套組。組合物可含有經調配用於單劑量投與(即,用於直接投與)之病毒且可能需要稀釋或其他添加。
在一個實施例中,至少一種病毒係經修飾之病毒,例如本文所提供之病毒,其具有諸如低致病性、低毒性、優先在腫瘤中累積、活化針對腫瘤細胞之免疫反應之能力、免疫原性、有複製能力、表現外源蛋白之能力及其組合的特徵。病毒可大約同時投與,或可在不同時間投與。病毒可在相同組合物或在相同投與方法中投與,或可在單獨組合物或藉由不同之投與方法投與。
投與之間的時間段可為達成期望效應之任一時間段,如可由熟習此項技術者確定。投與不同病毒之間的時間段之選擇可根據與選擇投與相同病毒之間的時間段之參數相似的參數來確定,包括來自監測步驟之結果、個體引起免疫反應之時間段、個體自正常組織清除病毒之時間段、或病毒在腫瘤或轉移中增生之時間段。在一個實施例中,時間段可隨個體引起免疫反應之時間段而變化;例如,該時間段可長於個體引起免疫反應之時間段,例如長約一週、長約10天、長約兩週、或長約一個月;在另一實施例中,時間段可短於個體引起免疫反應之時間段,例如短約一週、短約10天、短約兩週、或短約一個月。在另一實施例中,時間段可隨個體自正常組織清除病毒之時間段而變化;例如,該時間段可長於個體自正常組織清除病毒之時間段,例如長約一天、長約兩天、長約三天、長約五天、或長約一週。在另一實施例中,時間段可隨病毒在腫瘤或轉移中增生之時間段而變化;例如,該時間段可長於在投與表現可偵測標記物之病毒後在腫瘤或轉移中出現可偵測信號之時間量,例如約3天、約5天、約一週、約10天、約兩週或約一個月。
b. ii. 治療化合物
在本文所提供之組合癌症治療方法中,可使用任一治療或抗癌劑作為第二治療或抗癌劑。該等方法可包括除向個體投與病毒或複數種病毒外,向個體投與一或多種治療化合物。治療化合物可獨立地或與病毒聯合起作用,用於治療效應。
可獨立起作用之治療化合物包括多種已知化學治療化合物中之任一者,其可抑制腫瘤生長、抑制轉移生長及/或形成、減小腫瘤或轉移之大小、消除腫瘤或轉移,而不會降低病毒在腫瘤中累積、在腫瘤中複製及引起或增強個體之抗腫瘤免疫反應的能力。
與病毒聯合起作用之治療化合物包括例如改變病毒表現之化合物、或可與病毒表現基因相互作用之化合物、或可抑制病毒增生之化合物,包括對病毒有毒之化合物。可與病毒聯合起作用之治療化合物包括例如增加病毒之增生、毒性、腫瘤細胞殺傷或免疫反應引發性質之治療化合物,且亦可包括例如降低病毒之增生、毒性或細胞殺傷性質之治療化合物。視情況地,治療劑可展現或表現其他性質,例如允許其用作成像劑之性質,如本文別處所述。
治療化合物亦包括(但不限於)化學治療劑、奈米粒子、輻射療法、siRNA分子、酶/前藥對、光激致效劑、毒素、微波、放射性核種、血管生成抑制劑、有絲分裂抑制蛋白(例如cdc6)、抗腫瘤寡肽(例如抗有絲分裂寡肽、高親和力腫瘤選擇性結合肽)、傳訊調節劑、抗癌抗生素或其組合。
例示性光激致效劑包括(但不限於)例如靛青綠、甲苯胺藍、胺基戊酮酸、特沙弗林(texaphyrin)、苯并卟啉、酚噻嗪、酞青素、卟啉(例如泊芬鈉)、卟吩(例如四(間羥基苯基)卟吩或錫(IV)卟吩e6)、紫紅素(例如錫乙基初紫紅素、紫紅素醯亞胺、菌綠素、脫鎂葉綠酸鹽、焦脫鎂葉綠酸鹽或陽離子染料)。在一個實例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與光激致效劑組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。
取決於放射性核種、量及應用之放射性核種可用於診斷及/或治療。其包括(但不限於)例如含有32磷、60鈷、90釔、99锝、103鈀、106釕、111銦、117鎦、125碘、131碘、137銫、153釤、186錸、188錸、192銥、198金、211砈、212鉍或213鉍之化合物或分子。在一個實例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與放射性核種組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。
毒素包括(但不限於)化學治療化合物,例如(但不限於) 5-氟尿苷、卡奇黴素(calicheamicin)及美坦辛(maytansine)。傳訊調節劑包括(但不限於)例如巨噬細胞抑制因子之抑制劑、類鐸受體促效劑及stat3抑制劑。在一個實施例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與毒素或傳訊調節劑組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。
化學治療劑與治療病毒之間的組合療法可能在單劑治療無效之情況下有效/治癒。化學治療化合物包括(但不限於)烷化劑,例如塞替派及環磷醯胺;磺酸烷基酯,例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,例如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedepa)及烏瑞替派(uredepa);乙烯亞胺及甲基蜜胺,包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲基蜜胺氮芥(例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、甲基二氯乙胺、甲基二氯乙胺氧化物鹽酸鹽、美法崙、新生黴素(novobiocin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥);亞硝基脲,例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素,例如阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素、安曲黴素(anthramycin)、氮雜絲胺酸、博來黴素、放線菌素c、卡奇黴素、卡柔比星(carubicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-二唑-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黴黑素(streptonigrin)、鏈脲黴素、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物,例如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,例如二甲葉酸、胺甲喋呤、喋羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物,例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤;嘧啶類似物,例如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷;雄激素,例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯;抗腎上腺素,例如胺魯米特、米托坦、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,例如亞葉酸;醋葡醛內酯;醛磷醯胺糖苷;胺基戊酮酸;安吖啶;苯巴比妥(bestrabucil);比生群(bisantrene);依達曲沙(edatrexate);地磷醯胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);亞絲醌(diaziquone);依氟鳥胺酸(eflornithine);依利醋銨(elliptinium acetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥基脲;蘑菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);米托胍腙;米托蒽醌;莫哌達醇(mopidamol);硝胺丙吖(nitracrine);噴司他丁;蛋胺氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);鬼臼酸;2-乙基醯肼;丙卡巴肼;多糖-K;雷佐生(razoxane);西佐菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);替奴佐酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2、2′,2″-三氯三乙胺;烏拉坦(urethan);長春地辛;達卡巴嗪;甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌血生(pipobroman);加胞嘧啶(gacytosine);胞嘧啶阿拉伯糖苷;環磷醯胺;塞替派;類紫杉醇,例如太平洋紫杉醇及多西他賽;苯丁酸氮芥;吉西他濱;6-硫鳥嘌呤;巰基嘌呤;胺甲喋呤;鉑類似物,例如順鉑及卡鉑;長春鹼;鉑;依托泊苷(VP-16);異環磷醯胺;絲裂黴素C;米托蒽醌;長春新鹼;長春瑞濱(vinorelbine);Navelbine®;Novantrone®;替尼泊苷;柔紅黴素(daunomycin);胺基喋呤(aminopterin);Xeloda®;伊班膦酸鹽(ibandronate);CPT11;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥胺酸(DMFO);視黃酸;異丙黴素(esperamycin);卡培他濱;及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑,例如抗雌激素,包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene,Fareston®);及抗雄激素,例如氟他胺、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林及戈捨瑞林(goserelin);及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。可用於本文中之該等化學治療化合物包括其毒性使化合物無法用於一般全身性化學治療方法中之化合物。化學治療劑亦包括新型靶向化學治療劑,例如伊馬替尼(imatinib,由Novartis以商標名Gleevec®在美國出售)、吉非替尼(gefitinib,由AstraZeneca以商標名Iressa®開發)及厄洛替尼(erlotinib,由Genentech以商標名Tarceva®開發)。特定化學治療劑包括(但不限於)順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、DWA2114R、NK121、IS 3 295及254-S長春新鹼、普賴松(prednisone)、多柔比星及L-天冬醯胺酶;甲基二氯乙胺、長春新鹼、丙卡巴肼及普賴松(MOPP)、環磷醯胺、長春新鹼、丙卡巴肼及普賴松(C-MOPP)、博來黴素、長春鹼、吉西他濱及5-氟尿嘧啶。例示性化學治療劑係例如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、DWA2114R、NK121、IS 3 295及254-S。在非限制性實例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與鉑配位錯合物(例如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、DWA2114R、NK121、IS 3 295及254-S)組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。腫瘤、癌症及轉移可為本文所提供腫瘤、癌症及轉移中之任一者,且具體而言可為胰臟瘤、卵巢瘤、肺瘤、結腸瘤、前列腺瘤、子宮頸瘤或乳瘤;例示性腫瘤係胰臟瘤及卵巢瘤。腫瘤、癌症及轉移可為單一療法抗性腫瘤,例如對使用單獨病毒或單獨抗癌劑之療法無反應、但確實對療法使用及抗癌劑組合之病毒有反應之腫瘤。通常,將治療有效量之病毒全身性投與個體且病毒在腫瘤中定位且累積。在投與病毒後,向個體投與治療有效量之抗癌劑,例如順鉑。在一個實施例中,順鉑係每天一次連續投與五天。熟習此項技術者可使用例如活體內動物模型確定在病毒後投與抗癌劑之時間。使用本文所提供之方法,投與病毒及抗癌劑(例如順鉑)可導致腫瘤體積減小,可導致腫瘤生長停止或延遲,或可導致腫瘤自個體消除。治療後腫瘤、癌症及轉移之狀態可使用本文所提供之及此項技術中已知之任一方法來監測。
例示性抗癌抗生素包括(但不限於)蒽環(anthracycline,例如多柔比星鹽酸鹽(阿黴素)、伊達比星鹽酸鹽、道諾黴素鹽酸鹽、阿柔比星(aclarubicin)鹽酸鹽、表柔比星鹽酸鹽及吡柔比星鹽酸鹽)、腐草黴素(例如腐草黴素(phleomycin)及硫酸培洛黴素)、絲裂黴素(例如絲裂黴素C)、放線菌素(例如放線菌素D)、淨司他丁斯酯及多肽(例如新制癌菌素(neocarzinostatin))。在一個實施例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與抗癌抗生素組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。
在一個實施例中,奈米粒子可經設計使得其攜帶本文所提供之一或多種治療劑。另外,奈米粒子可經設計以攜帶使奈米粒子靶向腫瘤細胞之分子。在一個非限制性實施例中,奈米粒子可用放射性核種、視情況地與腫瘤相關抗原具有免疫反應性之抗體包衣。在一個實施例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與攜帶本文所提供之任一治療劑之奈米粒子組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。
輻射療法已成為大多數癌症患者之首選治療選擇。輻射治療之廣泛使用源自γ-照射誘導靶向細胞之不可逆損傷並保留正常組織功能之能力。電離輻射觸發細胞凋亡,其係癌細胞中之固有細胞死亡機制,且細胞凋亡之活化似乎係癌細胞在曝露於電離輻射後死亡之主要模式。在一個實施例中,痘瘡病毒(例如本文所提供之痘瘡病毒)係與輻射療法組合投與患有腫瘤、癌症或轉移之個體。
因此,本文提供向個體投與一或多種治療化合物之方法,該等化合物可與病毒聯合起作用以增加病毒之增生、毒性、腫瘤細胞殺傷、宿主之補體逃避或免疫反應引發性質。本文亦提供向個體投與一或多種治療化合物之方法,該等化合物可與病毒聯合起作用以降低病毒之增生、毒性或細胞殺傷性質。欲投與之治療化合物可為本文或此項技術中所提供之彼等化合物中之任一者。
可與病毒聯合起作用以增加病毒之增生、毒性、腫瘤細胞殺傷、宿主之補體逃避或免疫反應引發性質之治療化合物係可改變基因表現之化合物,其中改變的基因表現在個體中可增加腫瘤細胞之殺傷或增加抗腫瘤免疫反應。改變基因表現之化合物可例如導致一或多種病毒基因(包括內源病毒基因及/或外源病毒基因)之表現增加或減少。舉例而言,改變基因表現之化合物可誘導或增加病毒中基因之轉錄,例如可引起細胞溶解或細胞死亡之外源基因,其可引起可催化前藥樣化合物轉化之免疫反應或可抑制腫瘤細胞基因表現。此項技術中已知可改變基因表現之眾多種化合物中之任一者,包括IPTG及RU486。表現可上調之例示性基因包括蛋白質及RNA分子,包括毒素、可將前藥轉化成抗腫瘤藥物之酶、細胞介素、轉錄調節蛋白、siRNA及核酶。在另一實例中,改變基因表現之化合物可抑制或減少病毒中基因之轉錄,例如可降低病毒毒性或減少病毒增生之異源基因。可將可減少或抑制基因表現之多種化合物中之任一者用於本文所提供之方法,包括siRNA化合物、轉錄抑制劑或轉錄活化抑制劑。表現可下調之例示性基因包括蛋白質及RNA分子,包括抑制溶解、核苷酸合成或增生之病毒蛋白或RNA,及抑制細胞死亡、免疫反應性、溶解或病毒複製之細胞蛋白質或RNA分子。
在另一實例中,可與病毒聯合起作用以增加病毒之增生、毒性、腫瘤細胞殺傷、宿主之補體逃避或免疫反應引發性質之治療化合物係可與病毒表現之基因產物相互作用之化合物,且該相互作用在個體中可增加腫瘤細胞之殺傷或增加抗腫瘤免疫反應。可與病毒表現之基因產物相互作用之治療化合物可包括例如在其個體投與形式中具有極小或無毒性或其他生物活性之前藥或其他化合物,但在與病毒表現之基因產物相互作用後,該化合物可發展導致腫瘤細胞死亡之性質,包括(但不限於)細胞毒性、誘導細胞凋亡之能力或觸發免疫反應之能力。在一個非限制性實例中,病毒將酶攜帶至癌細胞中。一旦將酶引入癌細胞中,便立即投與化學治療藥物之無活性形式(即,前藥)。當無活性前藥到達癌細胞時,酶將前藥轉化成活性化學治療藥物,以使得其可殺傷癌細胞。因此,治療僅靶向癌細胞且不會影響正常細胞。前藥可與病毒同時或依序投與。多種前藥樣物質為此項技術中已知且該等化合物之例示性集合揭示於本文別處,其中該等化合物可包括更昔洛韋(gancyclovir)、5-氟尿嘧啶、6-甲基嘌呤去氧核糖苷、頭孢菌素-多柔比星、4-[(2-氯乙基)(2-甲磺醯基氧基乙基)胺基]苯甲醯基-L-麩胺酸、乙醯胺酚(acetaminophen)、吲哚-3-乙酸、CB1954、7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基喜樹鹼、雙-(2-氯乙基)胺基-4-羥基苯基-胺基甲酮28、1-氯甲基-5-羥基-1,2-二氫-3,4-苯并[e]吲哚、表柔比星-葡萄糖醛酸苷、5′-去氧-5-氟尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、亞麻苦苷及核苷類似物(例如氟尿苷、氟去氧尿苷、氟尿苷阿拉伯糖苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、鳥嘌呤阿拉伯糖苷、次黃嘌呤阿拉伯糖苷、6-巰基嘌呤核糖苷、硫鳥苷核糖苷、水粉蕈素(nebularine)、5-碘尿苷、5-碘去氧尿苷、5-溴去氧尿苷、5-乙烯基去氧尿苷、9-[(2-羥基)乙氧基]甲基鳥嘌呤(阿昔洛韋)、9-[(2-羥基-1-羥基甲基)-乙氧基]甲基鳥嘌呤(DHPG)、氮雜尿苷(azauridien)、氮雜胞苷、疊氮胸苷、二去氧腺苷、二去氧胞苷、二去氧肌苷、二去氧鳥苷、二去氧胸苷、3′-去氧腺苷、3′-去氧胞苷、3′-去氧肌苷、3′-去氧鳥苷、3′-去氧胸苷)。
在另一實例中,可與病毒聯合起作用以降低病毒之增生、毒性或細胞殺傷性質之治療化合物係可抑制病毒複製、抑制病毒毒素或引起病毒死亡之化合物。可抑制病毒複製、抑制病毒毒素或引起病毒死亡之治療化合物通常可包括可阻斷病毒生命週期中之一或多個步驟之化合物,包括(但不限於)可抑制病毒DNA複製、病毒RNA轉錄、病毒外殼蛋白組裝、外膜或多糖組裝之化合物。此項技術中已知可阻斷病毒生命週期中之一或多個步驟之多種化合物中之任一者,包括任一已知抗病毒化合物(例如西多福韋)、病毒DNA聚合酶抑制劑、病毒RNA聚合酶抑制劑、調節病毒DNA複製或RNA轉錄之蛋白質之抑制劑。在另一實例中,病毒可含有編碼病毒生命週期蛋白(例如DNA聚合酶或RNA聚合酶)之基因,其可受視情況地對宿主生物體無毒之化合物之抑制。
除化學治療劑與本文所提供病毒之間的組合療法外,亦可應用其他更複雜之組合治療策略。舉例而言,組合療法可包括化學治療劑、治療抗體(包括檢查點抑制劑,例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)及本文所提供之病毒。替代地,另一組合療法可為輻射、治療抗體(例如檢查點抑制劑,例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)及本文所提供病毒之組合。因此,組合療法之概念亦可基於本文所提供之病毒以及一或多種以下治療方式(即化學治療劑、輻射療法、治療抗體(包括檢查點抑制劑,例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)、高溫或低溫療法、siRNA、診斷/治療細菌、診斷/治療性哺乳動物細胞、免疫療法及/或靶向毒素(由抗體、脂質體及奈米粒子遞送))之應用。
組合療法之每一組分之有效遞送係本文所提供方法之重要態樣。根據一個態樣,下文所論述之投與模式利用以下關鍵特徵中之一或多者:(i)藉由投與模式效應將本文所提供之病毒遞送至腫瘤以達成病毒之最高效價及最高治療效應;(ii)藉由投與模式將任何其他所提及之治療方式遞送至腫瘤以達成最佳治療效應。所投與組合療法之劑量方案使得兩種或更多種治療方式之組合係治療有效的。劑量將根據諸如以下之因素而變化:患者之年齡、健康狀況、性別、大小及體重、投與途徑、藥物毒性、治療頻率及癌症對每一治療方式之相對敏感性。
對於與化學治療化合物之組合療法,用於投與該等化合物之劑量為此項技術中已知或可由熟習此項技術者根據已知臨床因素(例如個體之物種、大小、身體表面積、年齡、性別、免疫能力及一般健康狀況、持續時間及投與途徑、疾病之類別及時期(例如腫瘤大小)及其他病毒、治療或化合物(例如同時投與之其他化學治療藥物))來確定。除上述因素外,該等水準可受病毒感染性及病毒性質之影響,如可由熟習此項技術者確定。舉例而言,順鉑(cisplatin,亦稱為順鉑(cis-platinum)、鉑醇(platinol);順式-二胺二氯鉑;及cDDP)係常用於睪丸癌、卵巢瘤及多種其他癌症之療法中之一大類水溶性鉑配位化合物之代表。(參見例如Blumenreich等人,Cancer 55(5): 1118-1122 (1985);Forastiere等人,J. Clin. Oncol.19(4): 1088-1095 (2001))。在臨床上採用順鉑之方法為此項技術中所熟知。舉例而言,順鉑係藉由緩慢靜脈內輸注在一天內在六小時時段內投與,每月一次。對於局部病灶,順鉑可藉由局部注射投與。亦可採用腹膜內輸注。若係多藥物方案之一部分,或若患者對較高給藥具有不良反應,則順鉑可以低至10 mg/m2/治療之劑量投與。一般而言,臨床劑量係約30至約120或150 mg/m2/治療。
通常,含鉑化學治療劑係以非經腸方式、例如藉由緩慢靜脈內輸注或藉由局部注射投與,如上文所論述。病灶內(腫瘤內)及IP投與順鉑之效應闡述於(Nagase等人,Cancer Treat. Rep. 71(9): 825-829 (1987);及Theon等人,J. Am. Vet. Med. Assoc. 202(2): 261-7.(1993))中。
在一個例示性實施例中,投與病毒一次、2-6次或更多次且每次投與間隔0-60天,然後1-30天不進行抗癌治療,隨後每天投與順鉑持續1-5天,然後1-30天不投與抗癌治療。療法(病毒或順鉑治療、或病毒及順鉑組合療法)之每一組分可重複。在另一例示性實例中,每天投與順鉑持續1至5天,然後1-10天不投與抗癌治療,然後間隔0-60天投與病毒一次或2-6次。該治療方案可重複。在另一例示性實例中,每天投與順鉑持續1至5天,然後1-10天不投與抗癌治療,然後間隔0-60天投與病毒一次或2-6次。此後係5-60天不投與抗癌治療,然後再投與順鉑持續1-5天。該治療方案可重複。
吉西他濱(GEMZAR®)係用於乳癌、非小細胞肺癌及胰臟癌療法中之另一化合物。吉西他濱係展現抗腫瘤活性之核苷類似物。在臨床上採用吉西他濱之方法為此項技術中所熟知。舉例而言,吉西他濱係藉由靜脈內輸注以1000 mg/m2之劑量在30分鐘內投與,每週一次持續長達7週(或直至毒性需要減少或保持劑量),然後自胰臟癌治療停藥一週。後續週期可包括每4週連續3週輸注,每週一次。吉西他濱亦與順鉑組合用於癌症療法中。
在一個例示性實例中,間隔0-60天投與病毒一次或2-6次,然後1-30天不投與抗癌治療,隨後間隔0-30天投與吉西他濱1-7次,然後1-30天不投與抗癌治療。該治療方案可重複。在另一例示性實例中,間隔0-30天投與吉西他濱1-7次,然後1-10天不投與抗癌治療,隨後間隔0-60天投與病毒一次或2-6次。此後係5-60天不投與抗癌治療。該治療方案可重複。在另一例示性實施例中,間隔0-30天投與吉西他濱1-7次,然後1-10天不投與抗癌治療,隨後間隔0-60天投與病毒一次或2-6次。此後係5-60天不投與抗癌治療,隨後再間隔0-30天投與吉西他濱1-7次。該治療方案可重複。
如熟習此項技術者應理解,最佳治療方案將發生變化,且在組合療法之一或多個週期之前及之後評估所治療疾病之狀態及患者之一般健康狀況以確定最佳治療組合在治療方法之范圍內。
c. iii. 免疫療法及生物療法
治療化合物亦包括(但不限於)發揮免疫治療效應、刺激或抑制免疫系統、攜帶治療化合物或其組合之化合物。視情況地,治療劑可展現或表現其他性質,例如允許其用作成像劑之性質,如本文別處所述。該等治療化合物包括(但不限於)抗癌抗體、輻射療法、siRNA分子及抑制免疫系統之化合物(即免疫抑制因子、免疫抑制劑)。在一些情形下,期望在投與病毒之前將免疫抑制劑投與個體以抑制免疫系統,從而最小化對病毒之任何不良反應。例示性免疫抑制劑包括(但不限於)糖皮質素、烷化劑、抗代謝物、干擾素及免疫抑制抗體(例如抗CD3及抗IL2受體抗體)。
免疫療法亦包括例如免疫刺激分子(基於蛋白質或基於非蛋白質)、細胞及抗體。免疫療法治療可包括刺激免疫細胞以更有效地起作用或使得腫瘤細胞或腫瘤相關抗原可被免疫系統識別(即,破壞耐受性)。
細胞介素及生長因子包括(但不限於)介白素(例如介白素-1、介白素-2、介白素-6及介白素-12)、腫瘤壞死因子(例如腫瘤壞死因子α (TNF-α))、干擾素(例如干擾素γ (IFN-γ))、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、血管生成素及組織因子。
抗癌抗體包括(但不限於)利妥昔單抗(Rituximab)、ADEPT、曲妥珠單抗(Trastuzumab,Herceptin®)、托西莫單抗(Tositumomab,Bexxar®)、西妥昔單抗(Cetuximab,Erbitux®)、替伊莫單抗(Ibritumomab,Zevalin®)、阿倫珠單抗(Alemtuzumab,Campath®-1H)、依帕珠單抗(Epratuzumab,LymphoCide®)、吉妥珠單抗奧佐米星(Gemtuzumab ozogamicin,Mylotarg®)、貝伐珠單抗(Bevacimab,Avastin®)、Tarceva® (厄洛替尼)、SUTENT® (蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、Panorex® (依決洛單抗(Edrecolomab))、RITUXAN® (利妥昔單抗)、Zevalin® (90Y-替伊莫單抗(ibritumomab tiuexetan))、Mylotarg® (吉妥珠單抗奧佐米星)及Campath® (阿倫珠單抗)。
因此,本文提供向個體投與一或多種治療化合物之方法,該等化合物可與病毒聯合起作用以刺激或增強免疫系統,由此增強病毒之效應。該免疫療法可作為單獨治療方式遞送或可由所投與之病毒編碼(若免疫療法係基於蛋白質的)。
生物療法係使用天然身體物質或自天然身體物質製得之藥物之治療。其可幫助治療癌症並控制由其他癌症治療(例如化學療法)引起之副作用。生物療法有時亦稱為生物反應改質劑(BRM)、生物劑或簡稱為「生物製劑(biologics)」,此乃因其刺激身體對癌症作出生物(或天然)反應。免疫療法係使用身體用於抵抗感染及疾病之天然物質之治療。由於其使用天然物質,鈷免疫療法亦係生物療法。存在若干類型之藥物歸入術語生物療法:該等藥物包括例如單株抗體(mAb)、癌症疫苗、血球生長因子、癌症生長抑制劑、抗血管生成因子、干擾素α、介白素-2 (IL-2)、基因療法及用於膀胱癌之BCG疫苗。
單株抗體(mAb)對於治療癌症尤其受關注,此乃因其特異性結合至獨特的抗原且在實驗室中能夠大量產生用於質量分佈。單株抗體可經改造以與免疫系統蛋白相同之方式起作用:亦即,尋找並殺傷你身體中之外來物質,例如病毒。單株抗體可經設計以識別癌細胞表面上之抗原決定基。抗體靶特異性結合至抗原決定基且殺傷癌細胞或將治療劑遞送至癌細胞。使治療劑與抗體結合之方法為此項技術中所熟知。不同抗體必須係針對不同類型之癌症製得;例如,利妥昔單抗識別非霍奇金氏淋巴瘤細胞外部之CD20蛋白;ADEPT係使用識別腸(結腸)癌之抗體之治療;且曲妥珠單抗(Herceptin®)識別產生過多HER 2蛋白(「HER 2陽性」)之乳癌細胞。其他抗體包括例如托西莫單抗(Bexxar®)、西妥昔單抗(Erbitux®)、替伊莫單抗(Zevalin®)、阿倫珠單抗(Campath®-1H)、依帕珠單抗(LymphoCide®)、吉妥珠單抗奧佐米星(Mylotarg®)及貝伐珠單抗(Avastin®)。因此,本文所提供之病毒可與一或多種單株抗體同時或依序投與來治療癌症。在一個實例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
癌症疫苗係在癌症發展後幫助治療癌症,而非與流感病毒一樣試圖預防感染。癌症疫苗之目的係刺激免疫反應。癌症疫苗包括例如抗原疫苗、全細胞疫苗、樹突細胞疫苗、DNA疫苗及抗個體基因型疫苗。抗原疫苗係自癌細胞中之腫瘤相關抗原製得或由癌細胞產生之疫苗。抗原疫苗刺激個體之免疫系統攻擊癌症。全細胞疫苗係使用整個癌細胞、而非僅使用來自其之特異性抗原來製造疫苗之疫苗。該疫苗係自個體之自身癌細胞、另一個體之癌細胞或在實驗室中生長之癌細胞製得。在實驗室中通常用輻射處理細胞,以使其無法生長,且經由注射或經由靜脈內滴入血流中來投與個體,因此其可刺激免疫系統攻擊癌症。一種類型之全細胞疫苗係樹突細胞疫苗,其幫助免疫系統識別及攻擊異常細胞,例如癌細胞。樹突細胞疫苗係藉由在實驗室中使樹突細胞沿著癌細胞生長來製得。投與該疫苗以刺激免疫系統攻擊癌症。抗個體基因型疫苗係刺激身體製造針對癌細胞之抗體之疫苗。癌細胞製造免疫系統識別為外來之一些腫瘤相關抗原。然而,由於癌細胞與非癌細胞相似,故免疫系統可具有較弱反應。DNA疫苗會加強免疫反應。DNA疫苗係自攜帶腫瘤相關抗原基因之癌細胞之DNA製得。當注射DNA疫苗時,其使得免疫系統之細胞能夠識別腫瘤相關抗原,且活化免疫系統中之細胞(即,破壞耐受性)。使用DNA疫苗之最有希望之結果在於治療黑色素瘤。因此,本文所提供之病毒可與全細胞疫苗同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
生長因子係刺激骨髓製造血球之天然物質。可使用重組技術來產生生長因子,可將該等生長因子投與個體以增加血液中白血球、紅血球及幹細胞之數量。癌症治療中用於加強白血球之生長因子包括顆粒球群落刺激因子(G-CSF) (亦稱為非格司亭(filgrastim,Neupogen®)或來格司亭(lenograstim,Granocyte®))以及顆粒球及巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF) (亦稱為莫拉司亭(molgramostim))。幫助治療貧血之生長因子係紅血球生成素(EPO)。EPO促使身體製造更多紅血球,此進而增加身體組織中之血紅素水準及氧水準。業內正在開發可加強血小板之其他生長因子。因此,本文所提供之病毒可與生長因子(例如GM-CSF)同時或依序投與來治療癌症。在一個實例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
癌症生長抑制劑使用控制細胞(例如癌細胞)生長及擴增之細胞傳訊分子。阻斷該等傳訊分子之藥物可停止癌症生長及分裂。癌症生長因子包括(但不限於)酪胺酸激酶。因此,阻斷酪胺酸激酶之藥物係酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。TKI之實例包括(但不限於)厄洛替尼(Tarceva®, OSI-774)、吉非替尼(Iressa®, ZD 1839)及伊馬替尼(Glivec®, STI 571)。另一類型之生長抑制劑係用於多發性骨髓瘤及用於一些其他癌症之硼替佐米(Bortezomib,Velcade®)。Velcade®係蛋白酶體抑制劑。蛋白酶體發現於所有細胞中且幫助分解細胞中之蛋白質。干擾蛋白酶體之作用導致蛋白質在細胞中累積至毒性水準;由此殺傷癌細胞。癌細胞對Velcade®比正常細胞更敏感。因此,本文所提供之病毒可與癌症生長抑制劑(例如Velcade®)同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
癌症隨著其變大需要血液供應來擴增及生長其自身血管。在無其自身血液供應的情況下,癌症因缺乏營養素及氧而無法生長。抗血管生成藥物停止腫瘤發展其自身血管。該等類型之藥物之實例包括(但不限於)沙利度胺(Thalidomide),其主要用於治療骨髓瘤,但亦用於其他類型之癌症之試驗;及貝伐珠單抗(Avastin®),其係已經研究用於腸癌之一種類型之單株抗體。因此,本文所提供之病毒可與抗血管生成藥物同時或依序投與來治療癌症。在一個實例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
癌症生長抑制劑使用控制細胞(例如癌細胞)生長及擴增之細胞傳訊分子。阻斷該等傳訊分子之藥物可停止癌症生長及分裂。癌症生長因子包括(但不限於)酪胺酸激酶。因此,阻斷酪胺酸激酶之藥物係酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。TKI之實例包括(但不限於)厄洛替尼(Tarceva, OSI-774)、Iressa (吉非替尼,ZD 1839)及伊馬替尼(Glivec, STI 571)。另一類型之生長抑制劑係用於多發性骨髓瘤及用於一些其他癌症之硼替佐米(Velcade)。Velcade係蛋白酶體抑制劑。蛋白酶體發現於所有細胞中且幫助分解細胞中之蛋白質。干擾蛋白酶體之作用導致蛋白質在細胞中累積至毒性水準;由此殺傷癌細胞。癌細胞對Velcade比正常細胞更敏感。因此,本文所提供之病毒可與癌症生長抑制劑(例如Velcade)同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
癌症隨著其變大需要血液供應來擴增及生長其自身血管。在無其自身血液供應的情況下,癌症因缺乏營養素及氧而無法生長。抗血管生成藥物停止腫瘤發展其自身血管。該等類型之藥物之實例包括(但不限於)沙利度胺(Thalidomide),其主要用於治療骨髓瘤,但亦用於其他類型之癌症之試驗;及貝伐珠單抗(Avastin),其係已經研究用於腸癌之一種類型之單株抗體。因此,本文所提供之病毒可與抗血管生成藥物同時或依序投與來治療癌症。在一個實例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
干擾素-α (IFN-α)係身體中產生之極小量之天然物質,作為免疫反應之一部分。IFN-α作為治療投與以加強免疫系統且幫助抵抗癌症,例如腎細胞(腎臟)癌、惡性黑色素瘤、多發性骨髓瘤及一些類型之白血病。IFN-α以若干方式起作用:其可幫助停止癌細胞生長,其亦可加強免疫系統以幫助其攻擊癌症,且其可影響癌細胞之血液供應。因此,本文所提供之病毒可與IFN-α同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
IL-2之投與係生物療法藥物,此乃因其係由免疫系統天然產生。因此,其亦係免疫療法。介白素2用於治療腎細胞(腎臟)癌,且正在若干其他類型之癌症之臨床試驗中進行測試。IL-2藉由干擾細胞生長及增生直接作用於癌細胞;其藉由促進殺手T細胞及攻擊癌細胞之其他細胞生長來刺激免疫系統;且其亦刺激癌細胞分泌吸引免疫系統細胞之化學吸引物。IL-2通常以皮下注射在皮膚下投與,每天一次持續5天,然後停藥2天。將注射週期重複4週,然後一週不進行治療。治療方案及投與之週期數取決於癌症之類型及其對治療有反應之方式。IL-2可自投與或由健康專家投與。替代地,IL-2可經由注射或滴注靜脈內投與。因此,本文所提供之病毒可與IL-2同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
基因療法涉及藉由阻斷癌細胞中之異常基因、修復或替代癌細胞中之異常基因、促使甚至更多之基因在癌細胞中變得異常以使其死亡或變得對治療敏感、使用病毒將治療活化酶攜帶至癌細胞中或其組合來治療癌症。因此,癌細胞因細胞之損傷而死亡。癌細胞因其若干基因之若干類型之突變而發展。靶向基因包括(但不限於)促使細胞擴增之基因(即,致癌基因)、停止細胞擴增之基因(即,腫瘤抑制基因)及修復其他受損基因之基因。基因療法可涉及修復受損的致癌基因或阻斷致癌基因產生之蛋白質。腫瘤抑制基因p53在許多人類癌症中係受損的。多種病毒已用於將未受損之p53基因遞送癌細胞至癌細胞中,且現正在進行早期臨床試驗,尋找用經修飾之p53產生病毒來治療癌症。可使用基因療法來替代受損的DNA修復基因。在替代實例中,增加腫瘤細胞內之DNA損傷之方法可促進腫瘤細胞死亡或導致腫瘤細胞對其他癌症治療(例如放射療法或化學療法)之敏感性增加。因此,本文所提供之病毒可與本文所提供或此項技術中已知之任一基因治療方法同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
早期膀胱癌之治療稱為膀胱內治療,其主要用於治療高級(3級或G3級) T1期膀胱癌或膀胱原位癌(亦稱為T is或CIS)。BCG係用於結核病(TB)之疫苗,亦已發現該疫苗可有效地治療CIS及預防膀胱癌復發。在一些情形下,BCG疫苗已用於治療2級早期膀胱癌。由於膀胱癌可發生在膀胱內襯中之任一處,故其可能無法以與乳頭狀早期膀胱癌相同之方式去除。而是使用膀胱內療法投與BCG疫苗;亦即,首先,將導管(管)插入膀胱中,然後導管內投與BCG疫苗及/或化學療法。每週進行BCG治療持續6週或更長時間,此端視對膀胱癌之效應而定。。膀胱癌之BCG治療可與其他類型之治療組合,例如投與化學療法(膀胱內)、IL-2、用使細胞對光敏感之藥物治療、維生素及光動力療法。因此,本文所提供之病毒可與BCG疫苗同時或依序投與來治療癌症。在一個實施例中,另一療法係以本文所提供之其他治療方式中之任一者中之一或多者之形式投與。
C. 監測
本文所提供之方法可進一步包括監測個體、監測腫瘤及/或監測投與個體之病毒之一或多個步驟。多個監測步驟中之任一者可包括在本文所提供之方法中,包括(但不限於)監測腫瘤大小、監測抗(腫瘤抗原)抗體效價、監測轉移之存在及/或大小、監測個體之淋巴結、監測個體之體重或其他健康指標(包括血液或尿標記物)、監測抗(病毒抗原)抗體效價、監測可偵測基因產物之病毒表現及直接監測個體之腫瘤、組織或器官中之病毒效價。
監測之目的可簡單地用於評價個體之健康狀態或個體之治療性治療之進展,或可用於確定是否需要進一步投與相同或不同之病毒,或用於確定何時或是否向個體投與化合物,其中該化合物可用於增加治療方法之效力,或該化合物可用於降低投與個體之病毒之致病性。
1. 監測病毒基因表現
在一些實施例中,本文所提供之方法可包括監測一或多種病毒表現之基因。病毒可表現一或多種可偵測之基因產物,包括(但不限於)可偵測蛋白質(例如發光或螢光蛋白)或誘導可偵測信號之蛋白質(例如結合或轉運可偵測化合物或修飾受質以產生信號之蛋白質)。因此,可藉由一或多種光學或非光學成像方法使經感染之細胞/組織成像。
如本文所提供,由病毒表現之可偵測基因產物之量測可提供存在於個體中之病毒水準之準確測定。如本文進一步提供,例如藉由成像方法(包括但不限於磁共振、螢光及斷層攝影方法)量測可偵測基因產物之位置可確定病毒於個體中之定位。因此,包括監測可偵測病毒基因產物之本文所提供之方法可用於確定個體之一或多個器官或組織中病毒之存在或不存在,及/或個體之腫瘤或轉移中病毒之存在或不存在。另外,包括監測可偵測病毒基因產物之本文所提供之方法可用於確定存在於一或多個器官、組織、腫瘤或轉移中之病毒之效價。包括監測病毒於個體中之定位及/或效價之方法可用於確定病毒之致病性;由於正常組織及器官之病毒感染且尤其感染水準可指示探針之致病性,故監測病毒於個體中之定位及/或量之方法可用於確定病毒之致病性。由於本文所提供之方法可用於監測個體中任一特定位置之病毒量,故包括監測病毒於個體中之定位及/或效價之方法可在多個時間點實施,且因此可確定個體中之病毒複製速率,包括個體之一或多個器官或組織中之病毒複製速率;因此,監測病毒基因產物之方法可用於確定病毒之複製能力。本文所提供之方法亦可用於量化存在於多個器官或組織及腫瘤或轉移中之病毒之量,且由此可指示病毒在個體中優先累積之程度;因此,本文所提供之病毒基因產物監測方法可用於確定病毒優先於正常組織或器官在腫瘤或轉移中累積之能力。由於本文所提供方法中所用之病毒可在整個腫瘤中累積或可在腫瘤中之多個位點累積,且亦可在轉移中累積,故用於監測病毒基因產物之本文所提供之方法可用於確定存在於個體中之腫瘤大小或轉移數。在一段時間內監測病毒基因產物於腫瘤或轉移中之該存在可用於評價腫瘤或轉移之變化,包括腫瘤之生長或收縮、或新轉移之發展或轉移之消失,且亦可用於確定腫瘤之生長或收縮或新轉移之發展或轉移之消失的速率、或腫瘤之生長或收縮或新轉移之發展或轉移之消失的速率之變化。因此,監測病毒基因產物之方法可用於監個體之測贅瘤疾病,或用於藉由確定腫瘤之生長或收縮或新轉移之發展或轉移之消失的速率、或腫瘤之生長或收縮或新轉移之發展或轉移之消失的速率之變化來確定贅瘤疾病之治療效力。
在本文所提供之監測方法中可偵測到多種可偵測蛋白質中之任一者;該等可偵測蛋白質之例示性、非限制性清單包括多種螢光蛋白中之任一者(例如綠色或紅色螢光蛋白)、多種螢光素酶、運鐵蛋白或其他鐵結合蛋白中之任一者;或受體、結合蛋白及抗體,其中特異性結合受體、結合蛋白或抗體之化合物可為可偵測劑或可用可偵測物質(例如放射性核種或成像劑)標記;或可結合至可偵測分子且將其轉運至細胞中之轉運蛋白(例如hNET或hNIS)。表現可偵測蛋白質之病毒可藉由本文所提供及此項技術中已知之方法之組合來偵測。表現一種以上之可偵測蛋白質之病毒或表現不同可偵測蛋白質之兩種或更多種病毒可藉由雙重成像方法來偵測及區分。舉例而言,表現螢光蛋白及鐵結合蛋白之病毒可在活體外或活體內分別藉由弱光螢光成像及磁共振偵測。在另一實例中,表現兩種或更多種螢光蛋白之病毒可藉由不同波長之螢光成像來偵測。可對已投與表現兩種或更多種可偵測基因產物之病毒或各自表現一或多種可偵測基因產物之兩種或更多種病毒之個體實施活體內雙重成像。
2. 監測腫瘤大小
本文亦提供監測腫瘤及/或轉移大小及位置之方法。腫瘤及或轉移大小可藉由此項技術中已知之多種方法中之任一者來監測,包括外部評價方法或斷層攝影或磁成像方法。除此項技術中已知之方法外,例如監測病毒基因表現之本文所提供之方法可用於監測腫瘤及/或轉移大小。
在若干時間點監測大小可提供關於腫瘤或轉移大小之增加或減小之資訊,且亦可提供關於個體中存在其他腫瘤及/或轉移之資訊。在若干時間點監測腫瘤大小可提供關於個體中贅瘤疾病之發展之資訊,包括個體中贅瘤疾病之治療效力。
VII. 定義
除非另有定義,否則本文所用之所有技術術語、符號以及其他技術及科學術語或技術皆欲具有與熟習所主張標的物所屬技術者通常所理解之含義相同之含義。在一些情形下,出於清楚及/或易於參考,在本文中定義具有通常理解之含義之術語,且在本文中納入該等定義必定不應理解為代表與此項技術中所通常理解之實質性差異。
如本文所用,IHD-J病毒株係指衍生自紐約市衛生局(New York City Department of Health) IHD株之由ATCC®目錄號VR-156™提供之病毒株混合物。參見Gallwitz等人(2003) J Clin Microbiol.41(9): 4068-4070。
如本文所用,VIP02純系株或VIP02純系分離物係指藉由噬菌斑分離或使單一純系繁殖之其他方法自IHD-J病毒株衍生而來且具有序列同源之基因體之病毒。因此,VIP02純系株包括基因體可存在於自IHD-J株混合物繁殖之病毒製劑中之病毒,該混合物由ATCC®目錄號VR-156™提供,衍生自紐約市衛生局IHD株。VIP02純系株不包括藉由重組方式使用重組DNA方法引入異源核酸進行遺傳改造之重組VIP02病毒。具體而言,VIP02純系株具有不含異源核酸之基因體,該異源核酸含有編碼異源蛋白(例如異源基因產物)之開放閱讀框。舉例而言,VIP02純系株具有不含非病毒異源核酸之基因體,該非病毒異源核酸含有編碼非病毒異源蛋白(例如異源基因產物)之開放閱讀框。然而,應理解,如本文所述,本文所提供之任一VIP02純系株之基因體可藉由重組方式進行修飾以產生重組病毒。舉例而言,VIP02純系株可經修飾以產生含有核苷酸插入之重組VIP02病毒,該等核苷酸含有編碼異源蛋白(例如異源基因產物)之開放閱讀框。
如本文所用,VIP02係IHD-J衍生純系株,其含有具有SEQ ID NO:1中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO:1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,經修飾之VIP02病毒株係指與未經修飾之母體VIP02病毒相比,具有包含一或多個修飾(例如一或多個尤其選自一或多個核苷酸之取代、插入及缺失(包括其組合)之修飾)的基因體之VIP02病毒。通常,病毒之基因體係藉由核苷酸之取代(替代)、插入(添加)或缺失(截短)來修飾。修飾可使用熟習此項技術者已知之任一方法(例如遺傳改造及重組DNA方法)來製造。因此,經修飾之病毒係其基因體與母體病毒基因體相比發生變化之病毒。例示性經修飾病毒具有插入病毒基因體中之一或多個異源核酸序列。通常,異源核酸含有編碼異源蛋白(例如異源基因產物)之開放閱讀框。舉例而言,本文之經修飾病毒可含有呈用於表現異源基因之基因表現盒形式之一或多個異源核酸序列。
如本文所用,VIR11係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO:3中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO:3中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR13係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO:4中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO:4中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR37係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 6中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 6中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR40係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 7中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 7中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR41係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR42係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 9中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO:9中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR46係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 10中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 10中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR49係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 11中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 11中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR52係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 12中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 12中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR71係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 13中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 13中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR86係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 47中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 47中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR93係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 49中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 49中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR94係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 48中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 48中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR96係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 50中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 50中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR100係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 80中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 80中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR102係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 81中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 81中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR103係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 82中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 82中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR104係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 83中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 83中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR105係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 84中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 84中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR106係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 85中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 85中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR109係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 86中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 86中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR111係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 87中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 87中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR113係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 88中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 88中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR114係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 89中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 89中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR115係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 90中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 90中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR123係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 91中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 91中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR127係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 92中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 92中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,VIR128係經修飾之VIP02純系株,其含有具有SEQ ID NO: 93中所述之核苷酸序列之基因體,或具有與SEQ ID NO: 93中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核苷酸序列之基因體。
如本文所用,「藉由重組方法產生」或「使用重組DNA方法之方法」或其變化形式係指使用熟知之分子生物學方法來表現由經選殖DNA編碼之蛋白質。
如本文所用,「基因表現盒」或「表現盒」係核酸構造物,其含有能夠實現在與該等序列相容之宿主中表現基因之核酸元件。表現盒包括至少啟動子及視情況地轉錄終止信號。通常,表現盒包括可操作地連接至啟動子之欲轉錄核酸。表現盒可含有編碼例如治療基因產物或可偵測蛋白質或可選擇標記物基因之基因。
如本文所用,病毒製劑(例如IHD-J病毒製劑、VIP02病毒製劑、或重組或經修飾病毒製劑)係指藉由使病毒株(例如IHD-J病毒株、VIP02純系株、或經修飾或重組病毒株)在活體內或活體外培養系統中繁殖獲得之病毒組合物。舉例而言,IHD-J/VIP02病毒製劑係指通常在使用此項技術中已知之標準方法自培養系統純化後,藉由使病毒株在宿主細胞中繁殖獲得之病毒組合物。病毒製劑通常係由多個病毒粒子或病毒體構成。若需要,樣品或製劑中之病毒粒子數可使用噬菌斑分析來確定以計算每樣品單位體積之噬菌斑形成單位數(pfu/mL),假設所形成之每一噬菌斑代表一個感染性病毒粒子。製劑中之每一病毒粒子或病毒體可具有與其他病毒粒子相比相同之基因體序列(即序列同源之製劑)或可具有不同之基因體序列(即序列異源之製劑)。熟習此項技術者應理解,在純系分離不存在下,可在病毒複製時發生病毒基因體之異質性或多樣性,例如藉由在病毒株之自然選擇過程中發生之同源重組事件(Plotkin及Orenstein (編輯)「Recombinant Vaccinia Virus Vaccines」,Vaccines,第3版(1999))。
如本文所用,病毒混合物係含有基因體序列不同之多個病毒粒子之病毒製劑。病毒混合物可藉由以下方式來獲得:用兩種或更多種不同之病毒株、或一種病毒株及基因體DNA或經選殖DNA感染培養系統(例如宿主細胞),然後繁殖並純化所得病毒。出於本文之目的,VIP02病毒製劑可包括藉由使經VIP02株及另一病毒、基因體DNA或經選殖DNA感染之細胞繁殖、然後自培養物分離病毒製劑獲得之病毒混合物,其中該製劑含有藉由感染產生之後代病毒。舉例而言,另一病毒株可為痘病毒,例如禽痘病毒、黏液病毒或其他痘瘡病毒;皰疹病毒,例如單純皰疹病毒(HSV)、巨細胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、嗜肝DNA病毒(例如B型肝炎病毒)、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒及腺相關病毒;及單股DNA病毒,例如小病毒。另一病毒可為減毒病毒、溶瘤病毒或具有已知抗腫瘤活性及/或中度至輕度毒性之其他病毒。
如本文所用,「病毒」係指在沒有宿主細胞之情況下無法生長或複製之一大群感染性實體中之任一者,包括如本文所述之重組病毒及重組溶瘤病毒。病毒通常含有包圍遺傳材料之RNA或DNA核心之蛋白質外殼,但無半透膜,且能夠僅在活細胞中生長及擴增。病毒包括(但不限於)痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、反轉錄病毒、棒狀病毒、乳頭瘤病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、小核糖核酸病毒、辛得比病毒、乳頭瘤病毒、小病毒、里奧病毒、柯沙奇病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、小兒麻痺病毒及塞姆利基森林病毒。
如本文所用,溶瘤病毒係指在腫瘤個體之腫瘤細胞中選擇性複製之病毒。一些溶瘤病毒可在感染腫瘤細胞後殺傷腫瘤細胞。舉例而言,溶瘤病毒可藉由溶解腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞之細胞死亡而導致腫瘤細胞死亡。
如本文所用,提及病毒之
「毒性」(在本文中亦稱為毒力或致病性)係指在投與病毒後對宿主之有害或毒性效應。對於溶瘤病毒,例如IDH-J/VIP02,病毒之毒性與其在非腫瘤器官或組織中之累積相關,該累積可影響宿主之存活或產生有害或毒性效應。毒性可藉由評價指示毒性之一或多個參數來量測。該等參數包括非腫瘤組織中之累積及對已投與其之個體之活力或健康狀況之效應,例如對體重之效應。
如本文所用,「降低的毒性」意指,與未用病毒治療之宿主相比或與投與另一參考或對照病毒之宿主相比,將病毒投與宿主後之毒性或有害效應減弱或減小。出於本文之目的,參考或對照病毒之例示係VIP02病毒株。毒性是否降低或減小可藉由評價病毒及(若需要)對照或參考病毒對指示毒性之參數之效應來確定。應理解,在比較兩種或更多種不同病毒之活性時,
活體外分析中所用或活體內投與之病毒量(例如pfu)係相同或相似的,且
活體外分析或活體內評價之條件(例如活體內劑量方案)係相同或相似的。舉例而言,在比較活體內投與病毒及對照或參考病毒後之效應時,個體係相同的物種、大小、性別且病毒係在相同或相似劑量方案下以相同或相似之量投與。具體而言,毒性降低之病毒可意指,在將病毒投與宿主例如用於治療疾病時,病毒未在宿主之非腫瘤器官及組織中累積至導致宿主損傷或傷害之程度,或對宿主存活之影響程度大於對所治療疾病之影響程度,或大於對照或參考病毒之程度。舉例而言,毒性降低之病毒包括在治療過程中不會導致個體死亡之病毒。
如本文所用,病毒在特定組織中累積係指在將病毒投與宿主後之一時間段後,病毒分佈於宿主生物體之特定組織中,該時間段長至足以使病毒感染宿主之器官或組織。如熟習此項技術者應意識到,感染病毒之時間段將端視病毒、器官或組織、宿主之免疫能力及病毒之劑量而變化。通常,累積可在感染病毒後約不到1天、約1天至約2天、3天、4天、5天、6天或7天、約1週至約2週、3週或4週、約1個月至約2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間之時間點確定。出於本文之目的,病毒優先在免疫優先組織(例如發炎組織或腫瘤組織)中累積,但自宿主中之其他組織及器官(例如非腫瘤組織)清除至病毒毒性係輕度或可耐受且至多係不致命之程度。
如本文所用,「優先累積」係指病毒在第一位置累積之水準高於在第二位置累積之水準(即,第一位置之病毒粒子濃度或效價高於第二位置之病毒粒子濃度)。因此,相對於正常組織或器官,優先在免疫優先組織(避開免疫系統之組織,例如發炎組織及腫瘤組織)中累積之病毒係指在免疫優先組織(例如腫瘤)中累積之水準(即,濃度或病毒效價)高於病毒在正常組織或器官中累積之水準的病毒。
如本文所用,「抗腫瘤活性」或「抗致瘤」係指防止或抑制個體之活體外或活體內腫瘤形成或生長之病毒株。抗腫瘤活性可藉由評價指示抗腫瘤活性之一或多個參數來確定。
如本文所用,提及抗腫瘤活性或抗致瘤性之「更大」或「改良」之活性意指,病毒株能夠防止或抑制個體之活體外或活體內腫瘤之形成或生長,其程度大於參考或對照病毒,或程度大於未用該病毒治療之情況。出於本文之目的,參考或對照病毒之例示係VIP02病毒。抗腫瘤活性是否「更大」或「改良」可藉由評價病毒及(若需要)對照或參考病毒對指示抗腫瘤活性之參數之效應來確定。應理解,在比較兩種或更多種不同病毒之活性時,活體外分析中所用或活體內投與之病毒量(例如pfu)係相同或相似的,且活體外分析或活體內評價之條件(例如活體內劑量方案)係相同或相似的。
如本文所用,異源核酸(亦稱為外源核酸或外來核酸)係指並非由表現其之生物體或病毒在活體內正常產生之核酸,或由生物體或病毒產生但處於不同基因座之核酸,或調介或編碼調介劑之核酸,該等調介劑藉由影響轉錄、轉譯或其他可調節之生物化學過程來改變內源核酸(例如DNA)之表現。因此,異源核酸通常並非引入其之病毒之正常內源。異源核酸可指來自同一生物體或另一生物體(包括同一物種或另一物種)之另一病毒之核酸分子。然而,異源核酸可為內源的,但係自不同基因座表現或其表現或序列(例如質體)發生變化之核酸。因此,異源核酸包括不存在於精確取向或位置中之核酸分子,此乃因在基因體中發現對應核酸分子,例如DNA。通常,儘管並不必要,該核酸編碼並非由病毒正常產生或在表現其之病毒中以相同方式產生之RNA及蛋白質。在本文中,異源核酸涵蓋熟習此項技術者識別或視為表現核酸之病毒之異源、外源或外來之任一核酸,例如DNA。異源核酸之實例包括(但不限於)編碼外源肽/蛋白質(包括診斷及/或治療劑)之核酸。由異源核酸編碼之蛋白質可在病毒內表現,分泌,或在已引入異源核酸之病毒表面上表現。
如本文所用,表述「核酸序列」或「核苷酸序列(nucleotide sequence)」或「核苷酸序列(sequence of nucleotides)」可互換使用。
如本文所用,含有異源核酸之病毒純系株或病毒株製劑係指含有不存在於母體純系株中之核酸之該等株。舉例而言,序列闡述於SEQ ID NO: 1中之病毒(VIP02)係純系株,但SEQ ID NO: 7之病毒(命名為VIR40)含有異源核酸,例如命名為iCasp9之插入物。
如本文所用,異源蛋白或異源基因產物或異源多肽(亦稱為外源蛋白、外源多肽、外來蛋白或外來多肽)係指並非由病毒正常產生之蛋白質。
如本文所用,異源核酸可操作地連接至調節及效應核苷酸序列(例如啟動子、增強子、轉錄及轉譯終止位點及其他信號序列)係指該核酸(例如DNA)與該等核苷酸序列之間的關係。舉例而言,異源DNA可操作地連接至啟動子係指DNA與啟動子之間的物理關係,使得該DNA之轉錄係由特異性識別、結合及轉錄DNA之RNA聚合酶自啟動子起始。因此,可操作地連接或可操作地締合係指核酸(例如DNA)與調節及效應核苷酸序列(例如啟動子、增強子、轉錄及轉譯終止位點及其他信號序列)之功能關係。舉例而言,DNA可操作地連接至啟動子係指DNA與啟動子之間的物理及功能關係,使得該DNA之轉錄係由特異性識別、結合及轉錄DNA之RNA聚合酶自啟動子起始。為最佳化表現及/或轉錄,可能需要去除、添加或改變純系之5′非翻譯部分,以消除額外潛在不適當之替代性轉譯開始(即,起始)密碼子或可在轉錄或轉譯層級上干擾或減少表現之其他序列。另外,一致的核糖體結合位點可插入起始密碼子之緊接5′端且可增強表現(參見例如Kozak J. Biol.Chem.266: 19867-19870 (1991)以及Shine及Delgamo, Nature 254(5495):34-38 (1975))。可憑經驗確定該修飾之合意性(或對其之需要)。
如本文所用,異源啟動子係指並非在野生型生物體或病毒中正常發現或與野生型生物體或病毒相比處於不同基因座之啟動子。異源啟動子通常並非引入其之病毒之內源,而是自另一病毒獲得或以合成方式製備。異源啟動子可指來自同一生物體或另一生物體(包括同一物種或另一物種)之另一病毒之啟動子。然而,異源啟動子可為內源,但係序列發生變化或在不同基因座(例如在基因體中或質體上之不同位置)出現之啟動子。因此,異源啟動子包括不存在於精確取向或位置中之啟動子,此乃因在基因體中發現對應啟動子。
合成啟動子係具有未在自然界中發現之核苷酸序列之異源啟動子。合成啟動子可為具有合成序列或衍生自天然啟動子或其部分之序列的核酸分子。合成啟動子亦可為由衍生自不同天然啟動子之不同元件構成之雜合啟動子。
如本文所用,給藥方案係指所投與劑(例如病毒或另一劑)之量及投與週期過程內之投與頻率。給藥方案隨欲治療之疾病或疾患而變化,且因此可發生變化。
如本文所用,投與頻率係指在投與週期中投與劑之次數。舉例而言,頻率可為幾天、幾週或幾個月。舉例而言,頻率可為在投與週期中投與一次、兩次、三次、四次、五次、六次或七次。頻率可指投與週期中之連續幾天。具體頻率隨所治療之具體疾病或疾患而變化。
如本文所用,「投與週期」係指在連續投與內重複之病毒投與之給藥方案之重複時間表。舉例而言,例示性投與週期係28天週期。
如本文所用,患有疾患、病症或疾病之個體之治療意指疾患、病症或疾病之症狀得到改善或以其他方式發生有益變化之任一治療方式。治療涵蓋本文所述及提供之病毒之任一醫藥用途。
如本文所用,疾病或病症係指生物體中由例如感染或遺傳缺陷引起且特徵在於可鑑別症狀之病理性疾患。如本文所述之例示性疾病係贅瘤疾病,例如癌症。
如本文所用,贅瘤疾病係指涉及癌症之任一病症,包括增生及腫瘤發展、生長、轉移及進展。
如本文所用,癌症係由任一類型之惡性腫瘤(包括轉移癌、淋巴瘤及血液癌)引起或特徵在於其之疾病的術語。例示性癌症包括(但不限於)白血病、淋巴瘤、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、神經膠質瘤、腺癌、肝癌及皮膚癌。人類中之例示性癌症包括膀胱瘤、乳瘤、前列腺瘤、基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌、骨癌、腦及CNS癌(例如神經膠質瘤)、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸及直腸癌、結締組織癌、消化系統癌;子宮內膜癌、食管癌;眼癌;頭頸癌;胃癌;上皮內贅瘤;腎臟癌;喉癌;白血病;肝癌;肺癌(例如小細胞及非小細胞);淋巴瘤,包括霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤;黑色素瘤;骨髓瘤、神經母細胞瘤、口腔癌(例如唇癌、舌癌、口癌及咽癌);卵巢癌;胰臟癌、視網膜母細胞瘤;橫紋肌肉瘤;直腸癌、腎癌、呼吸系統癌;肉瘤、皮膚癌;胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌;子宮癌、尿路系統癌以及其他癌瘤及肉瘤。通常在狗、貓及其他寵物中診斷出之例示性癌症包括(但不限於)淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺腫瘤、肥胖細胞瘤、腦瘤、黑色素瘤、腺鱗狀癌、類癌肺腫瘤、支氣管腺瘤、細支氣管腺癌、纖維瘤、黏液軟骨瘤、肺肉瘤、神經肉瘤、骨瘤、乳頭瘤、視網膜母細胞瘤、依文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、小神經膠質瘤、神經母細胞瘤、破骨細胞瘤、口腔腫瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤及橫紋肌肉瘤、生殖器鱗狀細胞癌、傳染性花柳瘤、睪丸瘤、精原細胞瘤、賽特利氏細胞瘤(Sertoli cell tumor)、血管外皮細胞瘤、組織細胞瘤、綠色瘤(例如顆粒球性肉瘤)、角膜乳頭瘤、角膜鱗狀細胞癌、血管肉瘤、胸膜間皮瘤、基底細胞瘤、胸腺瘤、胃瘤、腎上腺癌、口腔乳突瘤病、血管內皮瘤及囊腺瘤、濾泡性淋巴瘤、腸淋巴肉瘤、纖維肉瘤及肺鱗狀細胞癌。在嚙齒類動物(例如雪貂)中診斷出之例示性癌症包括(但不限於)胰島素瘤、淋巴瘤、肉瘤、神經瘤、胰島細胞瘤、胃MALT淋巴瘤及胃腺癌。侵襲農業家畜之例示性贅瘤形成包括(但不限於)白血病、血管外皮細胞瘤及牛眼贅瘤(在牛中);包皮纖維肉瘤、潰瘍性鱗狀細胞癌、包皮癌、結締組織贅瘤及肥胖細胞瘤(在馬中);肝細胞癌(在豬中);淋巴瘤及肺腺瘤病(在綿羊中);肺肉瘤、淋巴瘤、勞斯肉瘤(Rous sarcoma)、網狀內皮細胞增生症、纖維肉瘤、腎母細胞瘤、B細胞淋巴瘤及淋巴性白血病(在禽物種中);視網膜母細胞瘤、肝贅瘤、淋巴肉瘤(淋巴母細胞性淋巴瘤)、漿細胞樣白血病及鰾肉瘤(在魚中)、乾酪狀淋巴炎(CLA):由假結核棒狀桿菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)引起之綿羊及山羊慢性、感染性、接觸傳染性疾病,及由肺腺瘤病引起之綿羊接觸傳染性肺腫瘤。
如本文所用,「轉移」係指癌症自身體之一部分擴散至另一部分。舉例而言,在轉移過程中,惡性細胞可自惡性細胞出現之原發性腫瘤位點擴散且移動至淋巴管及血管中,該等淋巴管及血管將細胞轉運至生物體別處之正常組織,其中細胞繼續進行增生。由藉由轉移擴散之細胞形成之腫瘤稱為「轉移性腫瘤」、「繼發性腫瘤」或「轉移」。
如本文所用,患有贅瘤疾病(包括腫瘤或轉移)之個體之治療意指贅瘤疾病之症狀得到改善或以其他方式發生有益變化之任一治療方式。通常,個體腫瘤或轉移之治療涵蓋可減緩腫瘤生長、溶解腫瘤細胞、減小腫瘤大小、預防新腫瘤生長或預防原發性腫瘤轉移之任一治療方式,包括抑制腫瘤之血管形成、腫瘤細胞分裂、腫瘤細胞遷移或基底膜或細胞外基質之降解。
如本文所用,例如藉由投與特定醫藥組合物改善或緩和特定病症之症狀係指可歸因於投與組合物或與其相關之任何減輕,無論係永久的抑或暫時的、持久的抑或短暫的。
如本文所用,用於治療特定疾病之病毒或化合物之有效量或治療有效量係改善或以某種方式減輕與疾病相關之症狀之量。量將隨著個體而變化且將取決於多種因素,包括(但不限於)年齡、體重、患者之總體身體狀況及疾病之嚴重程度。治療有效量可作為單一劑量投與,或可根據方案以多個劑量投與,藉此其係有效的。量可治癒疾病,但通常為改善疾病之症狀而投與。可能需要重複投與以達成症狀之期望改善。
如本文所用,用於治療贅瘤疾病(包括腫瘤、增生或轉移)之病毒或化合物之有效量或治療有效量係改善或以某種方式減輕與贅瘤疾病相關之症狀(包括但不限於減緩腫瘤生長、溶解腫瘤細胞、減小腫瘤大小及/或轉移大小、預防新腫瘤生長或預防原發性腫瘤轉移)的量。
如本文所用,腫瘤(亦稱為贅瘤)係在細胞以異常高之速率增生及/或細胞因細胞凋亡信號而失去死亡能力時產生之異常組織團塊。腫瘤可顯示部分或完全缺乏與正常組織之結構組織及功能協調。腫瘤可為良性(非癌性)或惡性(癌性)。如本文所用,腫瘤意欲涵蓋造血腫瘤以及實體腫瘤。
惡性腫瘤可廣泛地分成三個主要類型。癌瘤係源自上皮結構(例如乳房、前列腺、肺、結腸及胰臟)之惡性腫瘤。肉瘤係源自結締組織或間質細胞(例如肌肉、軟骨、脂肪或骨)之惡性腫瘤。白血病及淋巴瘤係侵襲造血結構(與血球形成相關之結構,包括免疫系統之組分)之惡性腫瘤。其他惡性腫瘤包括(但不限於)神經系統腫瘤(例如神經纖維瘤)、生殖細胞瘤及母細胞瘤。
如本文所用,增生性病症包括涉及細胞異常增生(即,細胞增生與正常組織生長相比更快速)之任何病症,例如(但不限於)贅瘤疾病。
如本文所用,「腫瘤細胞」係作為腫瘤之一部分之任一細胞。通常,與正常細胞相比,本文所提供之病毒優先感染個體之腫瘤細胞。
如本文所用,「轉移細胞」係具有可形成轉移之潛能之細胞。轉移細胞具有自個體之第一腫瘤轉移之能力且可定居於個體之不同位點之組織以在該位點形成第二腫瘤。
如本文所用,「致瘤細胞」係在引入個體之適宜位點中時可形成腫瘤之細胞。該細胞可為非轉移或轉移的。
如本文所用,「正常細胞」係並非衍生自腫瘤之細胞。
如本文所用,術語「細胞」係指如生物科學中通常理解之活生物體之基本結構及功能單位。細胞可為自足且可獨立於其他細胞作為功能整體存在之單細胞生物體。細胞亦可為以下細胞:當該細胞未自其在自然界中存在之環境分離時,其係由一種以上類型之細胞構成之多細胞生物體之一部分。該細胞可視為「非生物體」或「非生物體」細胞,其特殊之處通常在於其僅執行由多細胞生物體作為整體執行之功能之亞組。因此,此類型之細胞並非單細胞生物體。該細胞可為原核或真核細胞,包括動物細胞,例如哺乳動物細胞、人類細胞及非人類動物細胞或非人類哺乳動物細胞。動物細胞包括可發現於動物中之動物來源之任一細胞。因此,動物細胞包括例如構成動物之各個器官、組織及系統之細胞。
如本文所用,「經分離細胞」係存在於活體外且自最初衍生出其之生物體分離之細胞。
如本文所用,「細胞株」係衍生自能夠在活體外穩定生長許多代之原代細胞之細胞群體。細胞株通常稱為「永生化」細胞株以闡述其持續活體外繁殖之能力。
如本文所用,「腫瘤細胞株」係最初衍生自腫瘤之細胞群體。該等細胞通常已經受某種活體內變化,使得其理論上在培養中具有無限生長;與原代細胞不同,該等原代細胞僅可培養有限的時間段。另外,該等細胞較佳地可在將其注射至敏感動物中後形成腫瘤。
如本文所用,「原代細胞」係已自個體分離之細胞。
如本文所用,「宿主細胞」或「靶細胞」可互換使用且意指可由病毒感染之細胞。
如本文所用,術語「組織」係指通常用於在生物體內執行特定功能之相似細胞之群、集合或聚集物。
如本文所用,術語免疫優先細胞及免疫優先組織係指與免疫系統隔離之細胞及組織,例如實體腫瘤。通常,向個體投與病毒引發自個體清除病毒之免疫反應。然而,免疫優先位點與免疫反應屏蔽或隔離,此允許病毒存活且通常複製。免疫優先組織包括增生組織,例如腫瘤組織。
如本文所用,治療劑係改善疾病或病症之症狀或改善疾病或病症之劑。治療劑、治療化合物或治療方案包括熟習此項技術者已知及本文別處所述之習用藥物及藥物療法,包括用於治療或預防(即,降低罹患特定疾病或病症之風險)之疫苗。用於治療贅瘤疾病之治療劑包括(但不限於)抑制細胞生長或促進細胞死亡之部分、可經活化以抑制細胞生長或促進細胞死亡之部分、或活化另一劑來抑制細胞生長或促進細胞死亡之部分。用於本文所提供方法之治療劑可為例如抗癌劑。例示性治療劑包括例如治療微生物(例如治療病毒及細菌)、細胞介素、生長因子、光激致效劑、放射性核種、毒素、抗代謝物、傳訊調節劑、抗癌抗生素、抗癌抗體、血管生成抑制劑、輻射療法、化學治療化合物或其組合。
如本文所用,抗癌劑或化合物(可與「抗腫瘤或抗贅瘤劑」互換使用)係指抗癌治療中所用之任何劑或化合物。該等劑包括在單獨或與其他化合物或治療組合使用時可緩和、減輕、改善、預防與贅瘤疾病、腫瘤及癌症相關之臨床症狀或診斷標記物或使其置於或維持緩解狀態、且可用於本文所提供之方法、組合及組合物中之任何劑。抗癌劑包括抗轉移劑。例示性抗癌劑包括(但不限於)化學治療化合物(例如毒素、烷化劑、亞硝基脲、抗癌抗生素、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑)、細胞介素、生長因子、激素、光激致效劑、放射性核種、傳訊調節劑、抗癌抗體、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸(例如反義RNA及siRNA)、血管生成抑制劑、輻射療法或其組合。例示性化學治療化合物包括(但不限於) Ara-C、順鉑、卡鉑、太平洋紫杉醇、多柔比星、吉西他濱、喜樹鹼、伊立替康、環磷醯胺、6-巰基嘌呤、長春新鹼、5-氟尿嘧啶及胺甲喋呤。如本文所用,除非另有指示,否則對抗癌劑或化學治療劑之提及包括抗癌劑或化學治療劑之組合或複數種抗癌劑或化學治療劑。
如本文所用,「化學敏化劑」係調節、減弱、逆轉或影響細胞或生物體對給定化學治療藥物或化合物之抗性之劑。術語「調節劑(modulator)」、「調節劑(modulating agent)」、「減毒劑(attenuator)」、「減毒劑(attenuating agent)」或「化學敏化劑(chemosensitizer)」可互換使用且意指「化學敏化劑(chemosensitizing agent)」。在一些實例中,化學敏化劑亦可為化學治療劑。化學敏化劑之實例包括(但不限於)輻射、鈣通道阻斷劑(例如維拉帕米(verapamil))、鈣調蛋白抑制劑(例如三氟拉嗪)、吲哚生物鹼(例如利血平(reserpine))、喹啉(例如奎寧)、親溶酶體劑(例如氯喹)、類固醇(例如助孕酮)、曲帕拉醇(triparanol)類似物(例如他莫昔芬)、清潔劑(例如Cremophor® EL)、特沙弗林及環狀抗生素(例如環孢素)。
如本文所用,在腫瘤或其他免疫優先位點中產生之化合物係指在腫瘤或腫瘤環境中因表現一或多種基因產物之所引入病毒(通常重組病毒)之存在而產生之任一化合物。舉例而言,在腫瘤中產生之化合物可為例如經編碼之多肽或RNA、代謝物、或由重組多肽及腫瘤或免疫優先組織或細胞之細胞機制產生之化合物。
如本文所用,個體包括任一生物體,包括預期對其進行診斷、篩選、監測或治療之動物。動物包括哺乳動物,例如靈長類動物及家養動物。例示性靈長類動物係人類。患者係指患有疾病病狀或其疾病病狀待確定或疾病病狀之風險待確定之個體,例如哺乳動物、靈長類動物、人類或家畜個體。
如本文所用,用於投與之遞送媒劑係指基於脂質或基於其他聚合物之組合物,例如脂質體、膠束或反膠束,其與劑(例如本文所提供之病毒)締合以遞送至宿主個體中。
如本文所用,載體(或質體)係指含有離散元件之核酸構造物,該等元件用於將異源核酸引入細胞中用於核酸之表現或其複製。載體通常保持游離,但可經設計以實現基因或其部分穩定整合至基因體之染色體中。該等載體之選擇及使用為熟習此項技術者所熟知。表現載體包括能夠表現DNA之載體,該DNA與能夠實現DNA片段表現之調節序列(例如啟動子區域)可操作地連接。因此,表現載體係指在引入適當宿主細胞後使得經選殖DNA表現之重組DNA或RNA構造物,例如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體。適當表現載體為熟習此項技術者所熟知且包括可在真核細胞及/或原核細胞中複製之彼等載體、及保持游離之彼等載體、或整合至宿主細胞基因體中之彼等載體。
如本文所用,核酸包括DNA、RNA及其類似物,包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可為單股或雙股。核酸可編碼基因產物,例如多肽、調節RNA、微小RNA、siRNA及功能RNA。
如本文所用,提及反義寡核苷酸之與RNA之至少一部分互補之序列意指具有足夠互補性以通常在中度或高度嚴格條件下能夠與RNA雜交、形成穩定雙鏈體之核苷酸序列;在雙股反義核酸之情形下,因此可分析雙鏈體DNA (即,dsRNA)之單股,或可分析三鏈體形成。雜交能力取決於互補程度及反義核酸之長度。通常,雜交之核酸越長,其可含之與編碼RNA之鹼基錯配越多,且仍形成穩定雙鏈體(或三鏈體,視情況而定)。熟習此項技術者可藉由使用標準程序確定雜交複合物之熔點來確定可容許之錯配程度。
如本文所用,活體內方法係指在個體之活身體內實施之方法。
如本文所用,遺傳療法或基因療法涉及將異源核酸(例如DNA或RNA)轉移至患有尋找該療法之病症或疾患之哺乳動物、具體而言人類之某些細胞、靶細胞中。如本文所用,遺傳療法或基因療法可涉及將異源核酸(例如DNA)轉移至微生物(例如病毒)中,該微生物可轉移至患有尋找該療法之病症或疾患之哺乳動物、具體而言人類。核酸(例如DNA)係以使得異源核酸(例如DNA)表現且產生由此編碼之治療產物的方式例如直接或間接引入所選靶細胞中。替代地,異源核酸(例如DNA)可以某種方式調介編碼治療產物之DNA之表現,或其可編碼以某種方式係治療產物、或直接或間接調介治療產物之表現的產物,例如肽或RNA (例如RNAi,包括siRNA)。遺傳療法亦可用於遞送編碼基因產物之核酸,以替代缺陷基因或補充由引入其之哺乳動物或細胞產生之基因產物。所引入核酸可編碼治療化合物。編碼治療產物之異源核酸(例如DNA)可在引入患病宿主之細胞中之前經修飾以增強或以其他方式改變產物或其表現。遺傳療法亦可涉及遞送基因表現之抑制劑或阻抑劑或其他調節劑。
如本文所用,調節蛋白質活性或基因或核酸表現之劑或化合物降低或增加或以其他方式改變蛋白質之活性,或以某種方式上調或下調或以其他方式改變核酸在細胞中之表現。
如本文所用,「核酸」包括DNA、RNA及其類似物,包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可為單股或雙股。當提及視情況地例如用可偵測標記(例如螢光或放射性標記)標記之探針或引子時,預期單股分子。該等分子通常具有使得其靶在統計學上獨特之長度或具有用於探測或引發文庫之低拷貝數(通常小於5,通常小於3)。通常,探針或引子含有與所關注基因互補或一致之序列之至少14個、16個或30個連續核苷酸。探針及引子可長10個、20個、30個、50個100個或更多個核酸。
如本文所用,肽係指長度大於或等於2個胺基酸且長度小於或等於40個胺基酸之多肽。
如本文所用,在本文所提供之各個胺基酸序列中出現之胺基酸係根據其已知三字母或單字母縮寫來鑑別(表1)。出現在各個核酸片段中之核苷酸係用此項技術中通常使用之標準單字母命名來命名。
如本文所用,「胺基酸」係含有胺基及羧酸基團之有機化合物。多肽含有兩個或更多個胺基酸。出於本文之目的,胺基酸包括20種天然胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物(即,其中α-碳具有側鏈之胺基酸)。
本文中由式表示之所有胺基酸殘基序列在胺基末端至羧基末端之習用方向上具有左至右取向。另外,片語「胺基酸殘基」經定義以包括對應性表(表1)中所列之胺基酸以及經修飾及異常胺基酸,例如在37 C.F.R. §§ 1.821-1.822中提及並以引用方式併入本文中之胺基酸。另外,應注意,胺基酸殘基序列開頭或結尾之破折號指示與一或多個胺基酸殘基之另一序列、與胺基末端基團(例如NH)或與羧基末端基團(例如COOH)之肽鍵。
如本文所用,「天然α-胺基酸」係在自然界中發現之彼等20個α-胺基酸之殘基,該等殘基藉由帶電之tRNA分子與其人類同源mRNA密碼子之特異性識別納入蛋白質中。因此,非天然胺基酸包括例如除20種天然胺基酸外之胺基酸或胺基酸類似物且包括(但不限於)胺基酸之D-立體異構體。例示性非天然胺基酸闡述於本文中且為熟習此項技術者已知。
如本文所用,DNA構造物係單股或雙股、線性或環狀DNA分子,其含有以在自然界中未發現之方式組合及並列之DNA區段。DNA構造物因人類操縱而存在,且包括經操縱分子之純系及其他拷貝。
如本文所用,DNA區段係具有指定屬性之較大DNA分子之一部分。舉例而言,編碼指定多肽之DNA區段係較長DNA分子之一部分,例如質體或質體片段,其在自5′至3′方向閱讀時編碼指定多肽之胺基酸序列。
如本文所用,術語多核苷酸意指5′末端至3′末端閱讀之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單股或雙股聚合物。多核苷酸包括RNA及DNA,且可自天然來源分離,在活體外合成,或自天然及合成分子之組合製備。多核苷酸分子之長度在本文中係根據核苷酸(縮寫為「nt」)或鹼基對(縮寫為「bp」)給出。在上下文允許時,術語核苷酸用於單股及雙股分子。當將該術語應用於雙股分子時,其用於表示總長度且應理解為等效於術語鹼基對。熟習此項技術者應意識到,雙股多核苷酸之兩個股之長度可稍有不同且其末端可為交錯的;因此,雙股多核苷酸分子內之所有核苷酸可能並非成對的。一般而言,該等不成對末端之長度將不會超過20個核苷酸。
如本文所用,核苷酸或胺基酸「對應於」例如序列表中所述之所揭示序列中之核苷酸或胺基酸的敘述係指在使用標準比對算法(例如GAP算法)與所揭示序列比對以最大化一致性時鑑別出之核苷酸或胺基酸。藉由比對該等序列,例如使用保守及一致胺基酸殘基作為指導,熟習此項技術者可鑑別出相應殘基。一般而言,為鑑別出相應位置,對胺基酸序列進行比對,以使得獲得最高級匹配(參見例如:Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編輯,Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編輯,Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編輯,Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯,M Stockton Press, New York, 1991;Carillo等人(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用,「序列一致性」係指在測試與參考多肽或多核苷酸之間進行比較時,一致或相似胺基酸或核苷酸鹼基之數量。序列一致性可藉由核酸或蛋白質序列之序列比對來確定以鑑別出相似性或一致性之區域。出於本文之目的,序列一致性通常係藉由比對來確定以鑑別出一致之殘基。比對可為局部或全局。可在比較序列之間鑑別出匹配、錯配及空位。空位係插入比對序列之殘基之間的空胺基酸或核苷酸,以使得比對一致或相似之字符。通常,可存在內部及末端空位。序列一致性可藉由將空位考慮為一致殘基數/最短序列長度×100來確定。在使用空位罰分時,可使用無末端空位罰分來確定序列一致性(例如不對末端空位進行罰分)。替代地,序列一致性可在不將空位考慮為一致位置數/總比對序列長度×100之情況下確定。
如本文所用,「局部比對」係自開頭至結尾比對兩個序列、從而使每一序列中之每一字母僅比對一次之比對。無論序列之間是否存在相似性或一致性,皆會產生比對。舉例而言,基於「局部比對」之50%序列一致性意指,在長度各自為100個核苷酸之兩個比較序列之完整序列之比對中,50%之殘基係相同的。應理解,甚至在比對序列之長度不同時,局部比對亦可用於確定序列一致性。除非選擇「無末端空位罰分」,否則在確定序列一致性中將考慮序列末端之差異。通常,局部比對用於在其大部分長度內共享顯著相似性之序列。用於實施局部比對之例示性算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman等人,J. Mol. Biol.48: 443 (1970))。用於實施局部比對之例示性程式可公開獲得且包括可在國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網站(ncbi.nlm.nih.gov/)獲得之局部序列比對工具(Global Sequence Alignment Tool)及可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html獲得之程式。
如本文所用,「局部比對」係比對兩個序列、但僅比對序列之共享相似性或一致性之彼等部分的比對。因此,局部比對確定一個序列之子區段是否存在於另一序列中。若不存在相似性,則將不返回比對。局部比對算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))。舉例而言,基於「局部比對」之50%序列一致性意指,在任一長度之兩個比較序列之完整序列之比對中,長度為100個核苷酸之相似性或一致性之區域具有50%的在該相似性或一致性區域中相同之殘基。
出於本文之目的,序列一致性可藉由與由每一供應商建立之預設空位罰分一起使用之標準比對算法程式來確定。用於GAP程式之預設參數可包括:(1)一元比較矩陣(含有值1 (用於一致性)及0 (用於非一致性))及Gribskov等人,Nucl. Acids Res.14: 6745 (1986)之加權比較矩陣,如Schwartz及Dayhoff編輯,Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,第353-358頁(1979)所述;(2)用於每一空位之罰分3.0及用於每一空位中之每一符號之額外0.10罰分;及(3)無末端空位罰分。任何兩個核酸分子是否具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%「一致」之核苷酸序列(或任何兩個多肽是否具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%「一致」之胺基酸序列)或列舉一致性%之其他相似變化形式可使用已知電腦算法基於局部或全局比對來確定(參見例如wikipedia.org/ wiki/Sequence_alignment_軟體,提供與許多已知及可公開獲得之比對資料庫及程式之鏈接)。通常,出於本文之目的,序列一致性係使用電腦算法基於局部比對來確定,該局部比對係例如可自NCBI/BLAST獲得之Needleman-Wunsch全局序列比對工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE= BlastHome);LAlign (William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357));及可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/ align.html獲得之Xiaoqui Huang之程式。通常,在比較本文之核苷酸序列時,使用無末端空位罰分(例如不對末端空位進行罰分)之比對。
因此,如本文所用,術語「一致性」表示測試與參考多肽或多核苷酸之間的比較或比對。在一個非限制性實例中,「與……至少90%一致」係指相對於參考多肽或多核苷酸90%至100%之一致性%。90%或更大水準之一致性指示以下事實:出於例示目的,假設比較100個胺基酸或核苷酸之測試及參考多肽或多核苷酸長度,測試多肽或多核苷酸中不大於10% (即,100個中有10個)之胺基酸或核苷酸不同於參考多肽之胺基酸或核苷酸。可在測試與多核苷酸之間進行相似之比較。該等差異可表示為在整個胺基酸序列長度內隨機分佈之點突變,或其可聚集在一或多個不同長度之位置,直至最大可允許值,例如10/100胺基酸差異(大約90%一致性)。差異定義為核酸或胺基酸取代、插入或缺失。端視比較序列之長度,在高於約85%-90%之同源性或一致性水準下,結果可獨立於程式及空位參數集;該等高一致性水準可容易地評價,通常不依賴於軟體。
如本文所用,在提及兩個核酸序列時,等效意指所討論之兩個序列編碼相同之胺基酸或等效蛋白質序列。當等效用於提及兩種蛋白質或肽或其他分子時意指,兩種蛋白質或肽具有實質上相同之僅具有胺基酸取代(例如但不限於保守變化)之胺基酸序列或結構,且任何變化不會實質上改變蛋白質或肽之活性或功能。當等效係指性質時,該性質不需要以相同之程度存在(例如,兩種肽可展現同一類型之酶活性之不同速率),但活性通常實質上係相同的。在提及兩個核苷酸序列時,互補意指兩個核苷酸序列能夠雜交,相對核苷酸之間的錯配通常小於25%、15%或5%。若需要,將指定互補性百分比。通常,選擇兩個分子,使得其將在高嚴格性條件下雜交。
如本文所用,實質上純意指足夠均質,似乎不含可容易偵測到之雜質,如藉由熟習此項技術者用於評價該純度之標準分析方法(例如薄層層析(TLC)、凝膠電泳及高效液相層析(HPLC))所確定,或足夠純使得進一步純化不會可偵測地改變物質之物理及化學性質,例如酶及生物活性。用於純化化合物以產生實質上化學純之化合物之方法為熟習此項技術者已知。然而,實質上化學純之化合物可為立體異構物或同分異構物之混合物。在該等情況下,進一步純化可增加化合物之比活性。
如本文所用,在獲得產物活性之絕對值之意義上亦及在獲得指示活性水準之指數、比率、百分比、視覺或其他值之意義上,術語評價或確定意欲包括定量及定性確定。評價可為直接或間接。
如本文所用,術語「不活化突變(inactivating mutation)」及「不活化突變(inactivation mutation)」可互換使用且應解釋為具有相同之含義。
如本文所用,活性係指本文所提供之化合物或病毒之活體外或活體內活性。舉例而言,活體內活性係指在活體內投與其(或組合物或其他混合物)後產生之生理反應。因此,活性涵蓋該等化合物、組合物及混合物之所得治療效應及醫藥活性。活性可在經設計以測試或使用該等活性之活體外及/或活體內系統中觀察到。
如本文所用,「組合物」係指兩種或更多種產品或化合物之任一混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末糊劑、水性、非水性或其任一組合。
如本文所用,「組合」係指兩個或更多個項目或元件之間的任一締合。例示性組合包括(但不限於)兩種或更多種醫藥組合物、含有兩種或更多種活性成分之組合物,例如兩種病毒、或病毒及抗癌劑(例如化學治療化合物)、兩種或更多種病毒、病毒及治療劑、病毒及成像劑、病毒及複數種治療及/或成像劑或其任一締合。該等組合可包裝為套組。
如本文所用,套組係包裝組合,其視情況地包括使用該組合及/或用於該用途之其他反應及組分的說明書。
如本文所用,「對照」或「標準」係指與測試樣品實質上一致之樣品,只是其未用測試參數進行處理,或若其係血漿樣品,則其可來自未患所關注疾患之正常志願者。對照亦可為內部對照。舉例而言,對照可為具有已知性質或活性之樣品,例如病毒。
除非上下文另有明確說明,否則如本文所用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。因此,例如,提及「一」劑包括一或多種劑。
如本文所用,除非明確指示僅指替代物或替代物係互斥的,否則術語「或」用於意指「及/或」。
如本文所用,範圍及量可表示為「約」具體值或範圍。約亦包括精確量。因此,「約5個鹼基」意指「約5個鹼基」亦及「5個鹼基」。
如本文所用,「視情況存在之」或「視情況地」意指,隨後闡述之事件或情況會發生或不會發生,且該描述包括該事件或情況發生之情形及該事件或情況不發生之情形。舉例而言,視情況地經取代之基團意指該基團未經取代或經取代。
如本文所用,除非另有指示,否則任何保護基團、胺基酸及其他化合物之縮寫係根據其通常用法、公認縮寫或IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature) (參見(1972) Biochem.11: 1726)。
VIII. 例示性實施例
尤其提供之實施例係:
1. 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;
(ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;
(iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;
(iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及
(v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
2. 如實施例1之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)且變異體017 ORF編碼與SEQ ID NO:57具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
3. 如實施例1或實施例2之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)且變異體017 ORF編碼SEQ ID NO: 57中所述之胺基酸序列。
4. 如實施例1至4中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(ii)且核苷酸插入係對應於SEQ ID NO:1之核苷酸位置32135後之插入的鳥嘌呤(G),視情況地其中變異體038 (K5L) ORF闡述於SEQ ID NO: 58中。
5. 如實施例1至4中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(ii)且038 (K5L)基因產物闡述於SEQ ID NO:59中。
6. 如實施例1至5中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iii),且變異體059 (E2L) ORF編碼與SEQ ID NO:60具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
7. 如實施例1至6中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iii),且變異體059 (E2L) ORF編碼SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列。
8. 如實施例1至7中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iv),且104 (H4L) ORF編碼與SEQ ID NO:61具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
9. 如實施例1至8中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iv),且其中變異體104 (H4L) ORF編碼SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列。
10. 如實施例1至9中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(v),且兩個核苷酸缺失係對應於SEQ ID NO:2之核苷酸位置165972後之核苷酸的兩個連續核苷酸缺失,視情況地其中變異體182 (A56R) 闡述於SEQ ID NO: 62中。
11. 如實施例1至10中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(v),且VACV蛋白闡述於SEQ ID NO:63中。
12. 如實施例1至11中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任兩者。
13. 如實施例1至11中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任三者。
14. 如實施例1至11中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任四者。
15. 如實施例1至11中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之每一者。
16. 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);
(ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);
(iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;
(iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;
(v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);
(vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;
(vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;
(viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);
(ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及
(x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
17. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任兩者。
18. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任三者。
19. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任四者。
20. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任五者。
21. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任六者。
22. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任七者。
23. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任八者。
24. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任九者。
25. 如實施例16之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之每一者。
26. 如實施例1至25中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少96%序列一致性。
27. 如實施例1至26中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少97%序列一致性。
28. 如實施例1至27中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少98%序列一致性。
29. 如實施例1至28中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性。
30. 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
31. 如實施例1至30中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.5%序列一致性。
32. 如實施例1至31中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.9%序列一致性。
33. 如實施例1至32中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ. ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.95%序列一致性。
34. 如實施例1至33中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體不包含SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列。
35. 如實施例1至34中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體未經修飾以含有非病毒異源核酸,該非病毒異源核酸含有編碼非病毒異源蛋白之開放閱讀框。
36. 如實施例1至35中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體闡述於SEQ ID NO: 1中。
37. 如實施例1至36中任一者之經分離之純系VACV株,其中純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,視情況地如藉由實例1中之分析所確定。
38. 如實施例37之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過5%之感染性粒子係EEV。
39. 如實施例37之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過10%之感染性粒子係EEV。
40. 如實施例37之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過15%之感染性粒子係EEV。
41. 如實施例1至40中任一者之經分離之純系VACV株,其展現殺傷腫瘤細胞之溶瘤活性。
42. 一種VACV製劑,其包含如實施例1至41中任一者之經分離之純系VACV株。
43. 如實施例42之VACV製劑,其實質上係均質的,其中製劑中之複數個病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
44. 如實施例42或實施例43之VACV製劑,其中製劑中至少70%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
45. 如實施例42或實施例43之VACV製劑,其中製劑中至少80%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
46. 如實施例42或實施例43之VACV製劑,其中製劑中至少90%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
47. 如實施例42或實施例43之VACV製劑,其中製劑中至少95%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
48. 如實施例42或實施例43之VACV製劑,其中製劑中至少98%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
49. 一種醫藥組合物,其包含如實施例1至41中任一者之經分離之VACV純系株。
50. 一種醫藥組合物,其包含如實施例42至48中任一者之VACV製劑。
51. 一種重組痘瘡病毒(VACV)株,其包含如實施例1至41中任一者之VACV純系株之核酸基因體,該核酸基因體包含至少一種病毒基因之不活化突變。
52. 如實施例51之重組VACV株,其中病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。
53. 如實施例51或實施例52之重組VACV,其中不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。
54. 如實施例53之重組VACV株,其中至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。
55. 如實施例53之重組VACV株,其中至少一種病毒基因之缺失係病毒基因ORF之一部分缺失,且其中該缺失足以使經編碼之基因產物無功能。
56. 如實施例51至55中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係A35R基因。
57. 如實施例56之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:3中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
58. 如實施例56或實施例57之重組VACV株,其包含SEQ ID NO: 3中所述之核苷酸序列。
59. 如實施例51至55中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係J2R基因。
60. 如實施例59之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:4中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
61. 如實施例59或實施例60之重組VACV株,其包含SEQ ID NO: 4中所述之核苷酸序列。
62. 如實施例51至55中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係B2R。
63. 如實施例51至56及59中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因包含A35R基因及J2R基因。
64. 如實施例63之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:12中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
65. 如實施例63或實施例64之重組VACV株,其包含SEQ ID NO: 12中所述之核苷酸序列。
66. 如實施例51至55及62中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因包含B2R基因及J2R基因。
67. 如實施例66之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含與SEQ ID NO:48中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
68. 如實施例66或實施例67之重組VACV株,其包含SEQ ID NO: 48中所述之核苷酸序列。
69. 一種重組溶瘤病毒,其中重組病毒係重組痘瘡病毒(VACV)株,其包含:
如實施例1至41中任一者之VACV純系株之基因體;及
插入基因體中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸。
70. 一種重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
71. 如實施例70之重組溶瘤病毒,其中溶瘤病毒係痘瘡病毒、單純疱疹病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒(MARAV)、麻疹病毒(MV)、腺病毒、黏液病毒、羊痘病毒、小病毒、浣熊痘病毒、柯沙奇病毒、里奧病毒、新城雞瘟病毒、塞內卡谷病毒、塞姆利基森林病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、埃可病毒及小兒麻痺病毒(PV)。
72. 如實施例70或實施例71之重組溶瘤病毒,其中溶瘤病毒係痘瘡病毒。
73. 如實施例69至72中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入病毒基因體中之非必需基因或區域中或替代該基因或區域。
74. 如實施例69至73中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入或替代病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座。
75. 如實施例69至74中任一者之重組溶瘤病毒,其中插入係插入F14.5L中或替代F14.5L。
76. 如實施例69至74中任一者之重組溶瘤病毒,其中插入係插入A35R中或替代A35R。
77. 如實施例69至74中任一者之重組溶瘤病毒,其中插入係插入J2R中或替代J2R。
78. 如實施例69至72中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸與病毒膜蛋白融合以產生融合蛋白。
79. 如實施例78之重組溶瘤病毒,其中病毒膜蛋白係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L之C末端。
80. 如實施例78或實施例79之重組溶瘤病毒,其中融合蛋白納入細胞內成熟病毒(IMV)之外膜中。
81. 如實施例69至80中任一者之重組溶瘤病毒,其包含至少一種病毒基因之不活化突變。
82. 如實施例81之重組溶瘤病毒,其中不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。
83. 如實施例82之重組VACV,其中至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。
84. 如實施例82之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因之缺失係病毒基因ORF之一部分缺失,且其中該缺失足以使經編碼之基因產物無功能。
85. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。
86. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因係A35R。
87. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因係J2R。
88. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因係B2R。
89. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含A35R及J2R。
90. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含B2R及J2R。
91. 如實施例69至90中任一者之重組溶瘤病毒,其中核酸編碼異源基因產物可操作地連接至啟動子。
92. 如實施例91之重組溶瘤病毒,其中啟動子係痘病毒啟動子或係其變異體或衍生物。
93. 如實施例91或實施例92之重組溶瘤病毒,其中啟動子係痘瘡病毒啟動子。
94. 如實施例91至93中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
95. 如實施例91至94中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子具有SEQ ID NO: 29、53、55、68、69、70、71或72中之任一者中所述之胺基酸序列。
96. 如實施例91至94中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子係合成強早期啟動子(SSE)。
97. 如實施例96之重組VACV株,其中啟動子包含SEQ ID NO:29中所述之序列。
98. 如實施例91至94中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)。
99. 如實施例98之重組溶瘤病毒,其中啟動子包含SEQ ID NO:55中所述之序列。
100. 如實施例91至94中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子係mH5。
101. 如實施例100之重組溶瘤病毒,其中mH5啟動子包含SEQ ID NO: 53中所述之序列。
102. 如實施例69至101中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含治療劑或診斷劑。
103. 如實施例69至102中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物尤其選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、用於組織再生及將人類體細胞再程式化成多能性之基因、修飾受質以產生可偵測產物或信號或可由抗體偵測到之酶、可結合對比劑之蛋白質、用於光學成像或偵測之基因、用於PET成像之基因及用於MRI成像之基因。
104. 如實施例69至103中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含尤其選自以下之治療劑:激素、生長因子、細胞介素、趨化介素、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制劑、腫瘤抑制因子、細胞毒性蛋白、細胞生長抑制蛋白及組織因子。
105. 如實施例69至103中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含補體抑制劑。
106. 如實施例105之重組溶瘤病毒,其中補體抑制劑係
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)或最小化補體調節因子H (miniFH)。
107. 如實施例106之重組溶瘤病毒,其中補體抑制劑係CRASP-2且具有與SEQ ID NO:18中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
108. 如實施例106或實施例107之重組溶瘤病毒,其中補體抑制劑具有SEQ ID NO:18中所述之序列。
109. 如實施例69至108中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:5中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
110. 如實施例69至108中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 5中所述之核苷酸序列。
111. 如實施例106之重組溶瘤病毒,其中補體抑制劑係miniFH。
112. 如實施例105、106或111之重組溶瘤病毒,其中補體抑制劑具有與SEQ ID NO:19中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
113. 如實施例105、106、111或112中任一者之重組溶瘤病毒,其中補體抑制劑具有SEQ ID NO:19中所述之序列。
114. 如實施例69至106及111至113中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:6中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
115. 如實施例69至106及111至114中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 6中所述之核苷酸序列。
116. 如實施例69至115中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑。
117. 如實施例116之重組溶瘤病毒,其中T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑係由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。
118. 如實施例117之重組溶瘤病毒,其中T細胞逃避劑或NK細胞逃避劑係一組蛋白質,其係或包含CPXV012、CPXV203及CPXV018蛋白。
119. 如實施例118之重組溶瘤病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含與SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列、與SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列、及與SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之序列展現至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
120. 如實施例117或實施例118之重組溶瘤病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22中所述之胺基酸序列。
121. 如實施例69至108及117至120中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:10中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
122. 如實施例69至108及117至121中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 10中所述之核苷酸序列。
123. 如實施例69至104中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含免疫刺激蛋白。
124. 如實施例123之重組溶瘤病毒,其中免疫刺激蛋白係重組LIGHT。
125. 如實施例124之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT係人類蛋白或係其突變體。
126. 如實施例125之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含與SEQ ID NO:30中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
127 如實施例124至126中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT係hmLIGHT,其係結合人類及小鼠LTβR及HVEM之人類LIGHT突變體。
128. 如實施例126或實施例127之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含一或多個選自由以下組成之群之突變:位置138之蘇胺酸、位置160之甘胺酸、位置221之甘胺酸及位置222之離胺酸。
129. 如實施例128之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含與SEQ ID NO:25中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
130. 如實施例128之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含SEQ ID NO:25中所述之序列。
131. 如實施例69至104及123至130中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:11中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
132. 如實施例69至104及123至132中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 11中所述之核苷酸序列。
133. 如實施例69至132中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含一或多種抗血管生成蛋白。
134. 如實施例133之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白係VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、Versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。
135. 如實施例134之重組溶瘤病毒,其中VEGF抑制劑係抗VEGF抗體,視情況地抗VEGF單鏈抗體(scAb)。
136. 如實施例134之重組溶瘤病毒,其中血管生成素抑制劑係抗血管生成素-2 (Ang2)抗體,視情況地抗Ang2單鏈抗體(scAb)。
137. 如實施例133至136中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。
138. 如實施例137之重組溶瘤病毒,其中雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含與SEQ ID NO:23中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
139. 如實施例137或實施例138之重組溶瘤病毒,其中雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO:23中所述之序列。
140. 如實施例137至139中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白進一步包含Versikine。
141. 如實施例134或實施例140之重組溶瘤病毒,其中Versikine具有與SEQ ID NO:24中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
142. 如實施例134、實施例140或實施例141之重組溶瘤病毒,其中Versikine具有SEQ ID NO:24中所述之胺基酸序列。
143. 如實施例69至104及133至142中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:13中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
144. 如實施例69至104及133至143中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 13中所述之核苷酸序列。
145. 如實施例69至104、123至130及133至142中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:47中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
146. 如實施例69至104、123至130、133至142及145中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 47中所述之核苷酸序列。
147. 如實施例69至104中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含干擾素調節因子。
148. 如實施例147之重組溶瘤病毒,其中干擾素調節因子係干擾素調節因子3 (IRF3)。
149. 如實施例148之重組溶瘤病毒,其中IRF3係人類IRF3,視情況地其中hIRF3包含與SEQ ID NO:51中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
150. 如實施例148之重組溶瘤病毒,其中IRF3係小鼠IRF3,視情況地其中mIRF3包含與SEQ ID NO:52中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
151. 如實施例69至104及147至150中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:49中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
152. 如實施例69至104及147至151中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 49中所述之核苷酸序列。
153. 如實施例69至104及147至150中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:50中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
154. 如實施例69至104、147至150及153中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 50中所述之核苷酸序列。
155. 如實施例69至104中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種異源基因產物包含細胞凋亡誘導蛋白。
156. 如實施例155之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。
157. 如實施例156之重組溶瘤病毒,其中FKBP變異體係FKBP-F36V,視情況地其中FKBP-F36V包含SEQ ID NO:56中所述之胺基酸序列。
158. 如實施例156或實施例157之重組溶瘤病毒,其中二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽)。
159. 如實施例156至158中任一者之重組溶瘤病毒,其中促細胞凋亡分子使用Fas、含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)或半胱天冬酶,視情況地其中半胱天冬酶係半胱天冬酶9。
160. 如實施例155至159中任一者之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED),其包含SEQ ID NO:27中所述之序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
161. 如實施例69至104及155至160中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
162. 如實施例69至104及155至161中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。
163. 如實施例155至159中任一者之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型Fas (iFas),其包含SEQ ID NO:28中所述之序列或與SEQ ID NO:28具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
164. 如實施例69至104、155至160及163中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:9中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
165. 如實施例69至104、155至160、163及164中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 9中所述之核苷酸序列。
166. 如實施例155至159中任一者之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型半胱天冬酶9 (iCas9),其包含SEQ ID NO:26中所述之序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
167. 如實施例69至104、155至160及166中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:7中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
168. 如實施例69至104、155至160、166及167中任一者之重組溶瘤病毒,其包含SEQ ID NO: 7中所述之核苷酸序列。
169. 一種醫藥組合物,其包含如實施例51至168中任一者之重組VACV株。
170. 如實施例49、50及169之醫藥組合物,其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
171. 如實施例49、50、169及170之醫藥組合物,其經調配用於靜脈內投與、腫瘤內投與、腹膜內投與或胸膜內投與。
172. 如實施例49、50、169或170之醫藥組合物,其經調配用於靜脈內投與。
173. 如實施例49、50及169至172中任一者之醫藥組合物,其中醫藥組合物係液體組合物。
174. 如實施例49、50及169至172之醫藥組合物,其中醫藥組合物係凍乾的。
175. 一種治療個體之增生性病症之方法,其包括向個體投與如實施例1至41中任一者之溶瘤病毒、如實施例51至168中任一者之重組溶瘤病毒、或如實施例49、50及169至174中任一者之醫藥組合物。
176. 如實施例175之方法,其中增生性病症係腫瘤或轉移。
177. 如實施例175或實施例176之方法,其中增生性疾病係癌症。
178. 如實施例177之方法,其中癌症係胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、直腸癌、腎(腎臟)癌、胃癌、食管癌、肝(肝臟)癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、口癌(例如口腔癌)、子宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤,例如惡性黑色素瘤)、膽管癌(膽道癌)、胸腺上皮癌(例如胸腺瘤)、白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
179. 如實施例177或實施例178之方法,其中癌症係MSS結腸直腸癌。
180. 如實施例179之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
181. 如實施例179或實施例180之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。
182. 如實施例175至181中任一者之方法,其中病毒係以1 × 10
5pfu至1 × 10
14pfu之量投與。
183. 如實施例175至182中任一者之方法,其進一步包括投與用於治療增生性病症之第二治療劑。
184. 如實施例175至183中任一者之方法,其進一步包括尤其選自以下之另一治療:手術、輻射療法、免疫抑制療法及投與抗癌劑。
185. 如實施例184之方法,其中另一治療係投與尤其選自以下之抗癌劑:細胞介素、趨化介素、生長因子、光激致效劑、毒素、抗癌抗生素、化學治療化合物、放射性核種、血管生成抑制劑、傳訊調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療劑及其前述任一者之組合。
186. 如實施例175至185中任一者之方法,其中病毒係靜脈內投與。
187. 如實施例175至186中任一者之方法,其進一步包括向個體投與AP1903 (利米多賽)。
188. 如實施例175至187中任一者之方法,其中投與個體之重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
189. 如實施例187或實施例188之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
190. 如實施例187至189中任一者之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。
191. 如實施例187至190中任一者之方法,其中個體展現重度免疫缺乏且對病毒感染敏感。
192. 一種抑制病毒複製之方法,該方法包括使經重組溶瘤病毒感染之細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
193. 如實施例192之方法,其中接觸在個體之活體內進行,其中已將AP1903 (利米多賽)投與先前投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒的個體。
194. 一種抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中個體先前已投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒。
195. 如實施例187至194中任一者之方法,其中該方法優先抑制非癌細胞中之病毒複製。
196. 如實施例187至195中任一者之方法,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。
197. 如實施例196之方法,其中iDED包含SEQ ID NO:27中所述之序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
198. 如實施例196及實施例197之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核苷酸序列。
199. 如實施例196至198中任一者之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。
亦尤其提供以下實施例:
1. 一種重組溶瘤痘瘡病毒,其包含:
B2R之不活化突變;
編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及
編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。
2. 如實施例1之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。
3. 如實施例1或實施例2之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸。
4. 如實施例1之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9之異源核酸及編碼IL-12之異源核酸。
5. 如實施例1至4中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中:
CXCL9係人類CXCL9且包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
CXCL9係小鼠CXCL9且包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
6. 如實施例1至5中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中:
IL-12係人類單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
IL-12係小鼠單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
7. 如實施例1至6中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼IL-2之異源核酸。
8. 如實施例7之重組溶瘤痘瘡病毒,其中IL-2包含SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
9. 如實施例7或實施例8之重組溶瘤痘瘡病毒,其中IL-2係IL-2超因子。
10. 如實施例9之重組溶瘤痘瘡病毒,其中IL-2超因子係H9、H9T、MDNA11或MDNA11T,且其中:
H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
MDNA11 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
MDNA11T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
11. 如實施例6或實施例7之重組溶瘤痘瘡病毒,其中IL-2超因子係MDNA11T,且MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
12. 如實施例1至11中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含一或多種選自由以下組成之群之異源基因產物:補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
13. 如實施例1至12中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中B2R之不活化突變係B2R基因座之全部或一部分缺失。
14. 如實施例13之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該缺失足以使經編碼之B2R基因產物無功能。
15. 如實施例1至14中任一者之重組溶瘤病毒,其中B2R之不活化突變之特徵在於編碼IRF3之異源核酸及/或編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸中之至少一者插入B2R基因座中。
16. 如實施例1至15中任一者之重組溶瘤病毒,其中B2R之不活化突變之特徵在於編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸插入B2R基因座中。
17. 如實施例1至16中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中:
編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中;及/或
編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體中之HA、J2R、F14.5L、A56R、痘瘡生長因子、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。
18. 如實施例1至17中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體係自母體痘瘡病毒修飾而來,該母體痘瘡病毒具有與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列、視情況地SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
19. 如實施例1至18中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中母體痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;
(ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;
(iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;
(iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及
(v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
20. 如實施例1至19中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中母體病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);
(ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);
(iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;
(iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;
(v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);
(vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;
(vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;
(viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);
(ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及
(x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
21. 如實施例1至20中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
22. 如實施例1至14及17至21中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中:
編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之J2R (胸苷激酶)基因座中;且
編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸,其中編碼CXCL9及IL-12之異源核酸插入病毒基因體中之A56R基因座中。
23. 如實施例1至14及17至22中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
24. 如實施例1至21中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之B2R (病毒cGAMP特異性核酸酶)基因座中;且
編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸,其中編碼CXCL9及IL-12之異源核酸插入病毒基因體中之A56R基因座中。
25. 如實施例1至24中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
26. 如實施例25之重組溶瘤痘瘡病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型死亡效應結構域(iDED)。
27. 如實施例26之重組溶瘤痘瘡病毒,其中iDED包含SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
28. 如實施例26或實施例27之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼iDED之異源核酸插入病毒基因體中之J2R基因座中或替代該基因座。
29. 如實施例1至21及24至28中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
30. 如實施例1至29中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之異源核酸。
31. 如實施例30之重組溶瘤痘瘡病毒,其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。
32. 如實施例31之重組溶瘤痘瘡病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含:
(i) SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,
(ii) SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及
(iii) SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 22中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
33. 如實施例1至32中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼補體抑制劑之異源核酸。
34. 如實施例33之重組溶瘤痘瘡病毒,其中補體抑制劑係
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)。
35. 如實施例34之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼CRASP-2之異源核酸與病毒膜基因、視情況地F14.5L融合,以產生編碼融合蛋白之融合基因。
36. 如實施例35之重組溶瘤痘瘡病毒,其中融合蛋白包含融合至由病毒膜基因編碼之病毒膜蛋白之CRASP-2。
37. 如實施例36之重組溶瘤病毒,其中病毒膜蛋白係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L之C末端。
38. 如實施例1至22、24至28及30至37中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
39. 如實施例1至21、25至28及30至37中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼IRF3之異源核酸插入病毒基因體中之B2R (病毒cGAMP特異性核酸酶)基因座中或替代該基因座;且
編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸包含編碼IL-2之異源核酸,其中IL-2係IL-2超因子,即MDNA11T。
40. 如實施例1至39中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼免疫刺激蛋白之異源核酸,及/或編碼一或多種抗血管生成蛋白之異源核酸。
41. 如實施例40之重組溶瘤痘瘡病毒,其中免疫刺激蛋白係重組LIGHT。
42. 如實施例41之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組LIGHT包含SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:30中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
43. 如實施例40至42中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、Versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。
44. 如實施例43之重組溶瘤痘瘡病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白包含抗VEGF抗體及/或抗Ang2抗體。
45. 如實施例43或實施例44之重組溶瘤痘瘡病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。
46. 如實施例45之重組溶瘤痘瘡病毒,其中雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:23中所述之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
47. 如實施例1至22、24至28、30至37及39至46中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
48. 一種重組溶瘤病毒,其包含:
至少一種病毒基因之不活化突變;及
編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
49. 一種重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中一或多種異源基因產物係或包含補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫調節蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
50. 如實施例48或實施例50之重組溶瘤病毒,其中溶瘤病毒係痘瘡病毒、單純疱疹病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒(MARAV)、麻疹病毒(MV)、腺病毒、黏液病毒、羊痘病毒、小病毒、浣熊痘病毒、柯沙奇病毒、里奧病毒、新城雞瘟病毒、塞內卡谷病毒、塞姆利基森林病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、埃可病毒及小兒麻痺病毒(PV)。
51. 如實施例48至50中任一者之重組溶瘤病毒,其中溶瘤病毒係痘瘡病毒。
52. 如實施例48至51中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體係自母體痘瘡病毒修飾而來,該母體痘瘡病毒具有與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列、視情況地SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
53. 一種重組溶瘤病毒,其包含 自母體痘瘡病毒修飾而來之核酸基因體,該母體痘瘡病毒基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少99%序列一致性,且包含插入基因體中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸。
54. 如實施例52或實施例53之重組溶瘤痘瘡病毒,其中母體痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;
(ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;
(iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;
(iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及
(v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
55. 如實施例52至54中任一者之重組溶瘤病毒,其中母體痘瘡病毒基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);
(ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);
(iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;
(iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;
(v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶©;
(vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;
(vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;
(viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);
(ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及
(x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
56. 如實施例52至55中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
57. 如實施例1至56中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,且其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;
(ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;
(iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;
(iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及
(v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
58. 如實施例1至57中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,且其中重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);
(ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);
(iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;
(iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;
(v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);
(vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;
(vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;
(viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);
(ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及
(x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
59. 如實施例48至58中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體中之非必需基因或區域中。
60. 如實施例48至59中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。
61. 如實施例59之重組溶瘤病毒,其中插入病毒基因體中之非必需基因或區域中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之每一者各自獨立地插入病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。
62. 如實施例48、50至52及54至59中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含一或多種選自由以下組成之群之病毒基因:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L及其任一組合。
63. 如實施例48、50至52、54至59及62中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因係或包含:
(i) B2R;
(ii) A35R;
(iii) A35R及J2R;
(iv) J2R;
(v) B2R及J2R;
(vi) A35R、B2R及J2R;
(vii) B2R、J2R及A56R;或
(viii) A35R、B2R、J2R及A56R。
64. 如實施例48、50至52及54至63中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變獨立地藉由以下來實現:
編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因體之基因座中;
至少一種病毒基因之全部或一部分缺失;及/或
至少一種病毒基因中之一或多個核酸取代。
65. 如實施例48、50至52及54至64中任一者之重組溶瘤病毒,其中不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。
66. 如實施例64或實施例65之重組溶瘤病毒,其中:至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。
67. 如實施例64至66中任一者之重組溶瘤病毒,其中:
缺失足以使經編碼之病毒基因產物無功能。
68. 如實施例64之重組溶瘤病毒,其中一或多個核酸取代足以使經編碼之病毒基因產物無功能。
70. 如實施例48、50至52及54至68中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變之特徵在於編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸中之至少一者插入病毒基因座中。
71. 如實施例70之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含B2R。
72. 如實施例70或實施例71之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含J2R。
73. 如實施例70至72中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含A35R。
74. 如實施例70至73中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含A56R。
75. 如實施例70至74中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含B2R、J2R及A35R。
76. 如實施例70至75中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含B2R、J2R、A35R及A56R。
77. 如實施例70至76中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因包含B2R、J2R及A56R。
78. 如實施例48至77中任一者之重組溶瘤病毒,其中:
編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入F14.5L中或替代F14.5L。
79. 如實施例48至78中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入A35R中或替代A35R。
80. 如實施例48至78中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入J2R中或替代J2R。
81. 如實施例48至80中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸。
82. 如實施例48、50至52及54至81中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現。
83. 如實施例81或實施例82之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含一或多種免疫刺激蛋白。
84. 如實施例81至83中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含一或多種細胞介素及/或趨化介素。
85. 如實施例81至84中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含一或多種干擾素調節因子,視情況地IRF3。
86. 如實施例85之重組溶瘤病毒,其中一或多種干擾素調節因子係或包含干擾素調節因子3 (IRF3)。
87. 如實施例81至86中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含干擾素調節因子3 (IRF3)及一或多種細胞介素及/或趨化介素。
88. 如實施例81至87中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含一或多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白。
89. 如實施例88之重組溶瘤病毒,其中CXCL9係人類CXCL9且包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
90. 如實施例88之重組溶瘤病毒,其中CXCL9係小鼠CXCL9且包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
91. 如實施例88之重組溶瘤病毒,其中IL-12係人類單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
92. 如實施例88之重組溶瘤病毒,其中IL-12係小鼠單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
93. 如實施例81至92中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含IRF3。
94. 如實施例93之重組溶瘤病毒,其中IRF3係人類IRF3 (hIRF3)。
95. 如實施例94之重組溶瘤病毒,其中hIRF3包含SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 51之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
96. 如實施例93之重組溶瘤病毒,其中IRF3係小鼠IRF3 (mIRF3)。
97. 如實施例96之重組溶瘤病毒,其中mIRF3包含SEQ ID NO: 52中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 52之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
98. 如實施例81至97中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
99. 如實施例81至98中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含IRF3及一或多種選自由LIGHT、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白。
100. 如實施例81至99中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含IL-2。
101. 如實施例81至100中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含IL-12。
102. 如實施例81至101中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含LIGHT。
103. 如實施例81至102中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白包含CXCL9。
104. 如實施例81至103中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種免疫調節蛋白係或包含:
(i) IRF3;
(ii) LIGHT;
(iii) IRF3及LIGHT;
(iv) IRF3及IL-2;
(v) IRF3、CXCL9及IL-12;
(vi) IRF3、LIGHT及IL-2;
(vii) IRF3及CXCL9;或
(viii) IRF3、CXCL9及IL-2。
105. 如實施例88至104中任一者之重組溶瘤病毒,其中IL-2係人類IL-2。
106. 如實施例88至105中任一者之重組溶瘤病毒,其中IL-2係IL-2超因子。
107. 如實施例106之重組溶瘤病毒,其中IL-2超因子係H9、H9T、MDNA11或MDNA11T。
108. 如實施例106之重組溶瘤病毒,其中:
H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
MDNA11 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或
MDNA11T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
109. 如實施例106至108中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中IL-2超因子係MDNA11或MDNA11T。
110. 如實施例106至109中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中IL-2超因子係MDNA11T。
MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
111. 如實施例88至110中任一者之重組溶瘤病毒,其中LIGHT係重組LIGHT。
112. 如實施例111之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT係人類LIGHT蛋白或係其突變體。
113. 如實施例111或實施例112之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含與SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
114. 如實施例111至113中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT係人類LIGHT突變體(hmLIGHT),其係結合人類及小鼠LTβR及HVEM之人類LIGHT突變體。
115. 如實施例111至114中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含一或多個選自由以下組成之群之突變:位置138之蘇胺酸、位置160之甘胺酸、位置221之甘胺酸及位置222之離胺酸。
116. 如實施例111至115中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 25中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
117. 如實施例111至116中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25中所述之序列。
118. 如實施例111至117中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 11、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
119. 如實施例88至118中任一者之重組溶瘤病毒,其中IL-12係人類IL-12。
120. 如實施例119之重組溶瘤病毒,其中人類IL-12係人類單鏈IL-12 (hscIL-12)。
121. 如實施例120之重組溶瘤病毒,其中hscIL-12包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
122. 如實施例88至121中任一者之重組溶瘤病毒,其中CXCL9係人類CXCL9。
123. 如實施例122之重組溶瘤病毒,其中人類CXCL9包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
124. 如實施例48至123中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸。
125. 如實施例48、50至52及54至124中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現。
126. 如實施例124或實施例125之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。
127. 如實施例126之重組溶瘤病毒,其中FKBP變異體係FKBP-F36V,視情況地其中FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
128. 如實施例126或實施例127之重組溶瘤病毒,其中二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽)。
129. 如實施例126至128中任一者之重組溶瘤病毒,其中促細胞凋亡分子係或包含Fas、含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)或半胱天冬酶,視情況地其中半胱天冬酶係半胱天冬酶9。
130. 如實施例124至129中任一者之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。
131. 如實施例130之重組溶瘤病毒,其中iDED包含SEQ ID NO: 27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 27中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
132. 如實施例124至131中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8或86中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 8或86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
133. 如實施例124至129中任一者之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型Fas (iFas)。
134. 如實施例133之重組溶瘤病毒,其中iFas包含SEQ ID NO: 28中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 28中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
135. 如實施例124至129、133及135中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
136. 如實施例124至129中任一者之重組溶瘤病毒,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型半胱天冬酶9 (iCas9)。
137. 如實施例136之重組溶瘤病毒,其中iCas9包含SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
138. 如實施例124至129、136及137中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
139. 如實施例48至138中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸。
140. 如實施例48、50至52及54至139中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現。
141. 如實施例139或實施例140之重組溶瘤痘瘡病毒,其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。
142. 如實施例139至141中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含一組蛋白質,其係或包含CPXV012、CPXV203及CPXV018蛋白。
143. 如實施例141或實施例142之重組溶瘤痘瘡病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含:
(i) SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,
(ii) SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及
(iii) SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 22中所述之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
144. 如實施例141至143中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22中所述之胺基酸序列。
145. 如實施例139至144中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 10、89及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10、89及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
146. 如實施例48至145中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸。
147. 如實施例48、50至52及54至146中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸來實現。
148. 如實施例146或實施例147之重組溶瘤病毒,其中一或多種補體抑制劑係
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)及/或最小化補體調節因子H (miniFH)。
149. 如實施例148之重組溶瘤病毒,其中一或多種補體抑制劑係或包含CRASP-2。
150. 如實施例149之重組溶瘤病毒,其中CRASP-2包含SEQ ID NO: 18中所述之胺基酸序列,或具有與SEQ ID NO:18中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
151. 如實施例148至150中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種補體抑制劑係或包含miniFH。
152. 如實施例151之重組溶瘤病毒,其中miniFH包含SEQ ID NO: 19中所述之胺基酸序列,或具有與SEQ ID NO:19中所述之胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
153. 如實施例146至152中任一者之重組溶瘤病毒,其中將編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸引入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因。
154. 如實施例153之重組溶瘤病毒,其中融合蛋白包含融合至由病毒膜基因編碼之病毒膜蛋白之補體抑制劑。
155. 如實施例153或實施例154之重組溶瘤病毒,其中病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端。
156. 如實施例153至155中任一者之重組溶瘤病毒,其中融合蛋白納入細胞內成熟病毒(IMV)之外膜中。
157. 如實施例153至156中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中:
重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
158. 如實施例48至157中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸。
159. 如實施例48、50至52及54至157中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現。
160. 如實施例158或實施例159之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白係VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、Versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。
161. 如實施例158至160中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或血管生成素抑制劑,視情況地Ang2抑制劑。
162. 如實施例158至161中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白包含抗VEGF抗體及/或抗Ang2抗體。
163. 如實施例160至162中任一者之重組溶瘤病毒,其中VEGF抑制劑係抗VEGF抗體,視情況地抗VEGF單鏈抗體(scAb)。
164. 如實施例160至163中任一者之重組溶瘤病毒,其中血管生成素抑制劑係抗血管生成素-2 (Ang2)抗體,視情況地抗Ang2單鏈抗體(scAb)。
165. 如實施例158至164中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。
166. 如實施例165之重組溶瘤病毒,其中雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:23中所述之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
167. 如實施例158至166中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種抗血管生成蛋白包含Versikine。
168. 如實施例167之重組溶瘤病毒,其中Versikine包含SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 24中所述之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
169. 如實施例158至168中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 13、47、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13、47、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
170. 如實施例48至169中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸。
171. 如實施例48、50至52及54至170中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因中之一或多者之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸來實現。
172. 如實施例170或實施例171之重組溶瘤病毒,其中一或多種治療劑或診斷劑尤其選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、用於組織再生及將人類體細胞再程式化成多能性之基因、修飾受質以產生可偵測產物或信號或可由抗體偵測到之酶、可結合對比劑之蛋白質、用於光學成像或偵測之基因、用於PET成像之基因及用於MRI成像之基因。
173. 如實施例170至172中任一者之重組溶瘤病毒,其中一或多種治療劑或診斷劑包含尤其選自以下之治療劑:激素、生長因子、細胞介素、趨化介素、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制劑、腫瘤抑制因子、細胞毒性蛋白、細胞生長抑制蛋白及組織因子。
174. 如實施例48、50至52及54至173中任一者之重組溶瘤病毒,其中:
(i) 至少一種病毒基因係或包含A35R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 3之核酸序列,或與SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(ii) 至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 12之核酸序列,或與SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(iii) 至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質,且
其中編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸,將該一或多種異源核酸引入病毒膜基因中以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端,且視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 10之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(iv) 至少一種病毒基因係或包含J2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 4之核酸序列,或與SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(v) 至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 11之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
175. 如實施例48、50至52及54至173中任一者之重組溶瘤病毒,其中:
(i) 至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 13之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(ii) 至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且
J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 47之核酸序列,或與SEQ ID NO: 47中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(iii) 至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)、誘導型Fas (iFas)或誘導型Cas9 (iCas9),視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 7、8或9之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7、8或9中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(iv) 至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50或93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50或93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(v) 至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48之核酸序列,或與SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
176. 如實施例48、50至52及54至173中任一者之重組溶瘤病毒,其中至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R。
177. 如實施例48、50至52及54至173中任一者之重組溶瘤病毒,其中:
(i) 至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 80之核酸序列,或與SEQ ID NO: 80中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(ii) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A35R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;
B2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且
A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 82之核酸序列,或與SEQ ID NO: 82中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(iii) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2,視情況地其中IL-2係IL-2超因子,視情況地MDNA11;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 84之核酸序列,或與SEQ ID NO: 84中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(iv) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(v) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:
B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;
J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED);且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(vi) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;
B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 87之核酸序列,或與SEQ ID NO: 87中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(vii) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;
B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11T,視情況地其中MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(viii) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質;
B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A56R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子,視情況地MDNA11或MDNA11T;
編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將其導入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 89之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(ix) 至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中:
J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質;
B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;
編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將其導入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中融合物處於F14.5L蛋白之C末端;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(x) 至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 91之核酸序列,或與SEQ ID NO: 91中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(xi) 至少一種病毒基因係或包含B2R、J2R及A56R,且
J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且
A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 92之核酸序列,或與SEQ ID NO: 92中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或
(xii) 至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且
視情況地其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 93中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
178. 如實施例48至173中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
179. 如實施例48至173中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
180. 如實施例48至173中任一者之重組溶瘤痘瘡病毒,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
181. 如實施例48至180中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼異源基因產物之一或多種異源核酸可操作地連接至啟動子。
182. 如實施例181之重組溶瘤病毒,其中可操作地連接至啟動子之編碼異源基因產物之一或多種異源核酸中之每一者選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
183. 如實施例48至182中任一者之重組溶瘤病毒,其中編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至啟動子,視情況地其中編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
184. 如實施例182或實施例183之重組溶瘤病毒,其中啟動子係痘病毒啟動子或係其變異體或衍生物。
185. 如實施例182或實施例183之重組溶瘤病毒,其中啟動子係痘瘡病毒啟動子。
186. 如實施例182至185中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
187. 如實施例182至186中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子具有SEQ ID NO: 29、53、55、68、69、70、71或72中之任一者中所述之胺基酸序列。
188. 如實施例182至187中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子係合成強早期啟動子(SSE)。
189. 如實施例188之重組VACV株,其中SSE啟動子包含SEQ ID NO:29中所述之序列。
190. 如實施例182至189中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)。
191. 如實施例190之重組溶瘤病毒,其中SEL啟動子包含SEQ ID NO:55中所述之序列。
192. 如實施例182至191中任一者之重組溶瘤病毒,其中啟動子係mH5。
193. 如實施例192之重組溶瘤病毒,其中mH5啟動子包含SEQ ID NO: 53中所述之序列。
194. 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列;
(ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化;
(iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列;
(iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及
(v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
195. 如實施例194之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)且變異體017 ORF編碼與SEQ ID NO:57具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
196. 如實施例194或實施例195之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)且變異體017 ORF編碼SEQ ID NO: 57中所述之胺基酸序列。
197. 如實施例194至196中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(ii),且核苷酸插入係對應於SEQ ID NO:1之核苷酸位置32135後之插入的鳥嘌呤(G),視情況地其中變異體038 (K5L) ORF闡述於SEQ ID NO: 58中。
198. 如實施例194至197中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(ii)且038 (K5L)基因產物闡述於SEQ ID NO:59中。
199. 如實施例194至198中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iii),且變異體059 (E2L) ORF編碼與SEQ ID NO:60具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
200. 如實施例194至199中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iii),且變異體059 (E2L) ORF編碼SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列。
201. 如實施例194至200中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iv),且104 (H4L) ORF編碼與SEQ ID NO:61具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
202. 如實施例194至201中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(iv),且其中變異體104 (H4L) ORF編碼SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列。
203. 如實施例194至202中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(v),且兩個核苷酸缺失係對應於SEQ ID NO:2之核苷酸位置165972後之核苷酸的兩個連續核苷酸缺失,視情況地其中變異體182 (A56R)闡述於SEQ ID NO: 62中。
204. 如實施例194至203中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(v),且VACV蛋白闡述於SEQ ID NO:63中。
205. 如實施例194至204中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任兩者。
206. 如實施例194至204中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任三者。
207. 如實施例194-204中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任四者。
208. 如實施例194-204中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之每一者。
209. 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者:
(i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G);
(ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T);
(iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G;
(iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G;
(v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C);
(vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT;
(vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA;
(viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A);
(ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及
(x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
210. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任兩者。
211. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任三者。
212. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任四者。
213. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任五者。
214. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任六者。
215. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任七者。
216. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任八者。
217. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任九者。
218. 如實施例209之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之每一者。
219. 如實施例209至218中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少96%序列一致性。
220. 如實施例209至219中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少97%序列一致性。
221. 如實施例209至220中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少98%序列一致性。
222. 如實施例209至221中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性。
223. 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
224. 如實施例1至193中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例194至223中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.5%序列一致性。
225. 如實施例1至193中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例194至224中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.9%序列一致性。
226. 如實施例1至193中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例194至225中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99.95%序列一致性。
227. 如實施例1至193中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例194至226中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體不包含SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列。
228. 如實施例194至227中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體未經修飾以含有非病毒異源核酸,該非病毒異源核酸含有編碼非病毒異源蛋白之開放閱讀框。
229. 如實施例194至228中任一者之經分離之純系VACV株,其中核酸基因體闡述於SEQ ID NO: 1中。
230. 如實施例1至193中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例194至229中任一者之經分離之純系VACV株,其中重組溶瘤病毒或純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,視情況地如根據EEV之百分比所確定,其中EEV之百分比係藉由下式確定:上清液之病毒效價/ (上清液之病毒效價+細胞溶解物之病毒效價) *100。
231. 如實施例230之重組溶瘤病毒或如實施例244之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過5%之感染性粒子係EEV。
232. 如實施例230之重組溶瘤病毒或如實施例244之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過10%之感染性粒子係EEV。
233. 如實施例230之重組溶瘤病毒或如實施例244之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過15%之感染性粒子係EEV。
234. 如實施例230至233中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例230至233中任一者之經分離之純系VACV株,其中重組溶瘤病毒或純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,如藉由使至少5%、10%或15%百分比之感染性粒子係EEV所確定。
235. 如實施例1至193、224至227及230至234中任一者之重組溶瘤病毒或如實施例194至234中任一者之經分離之純系VACV株,其展現殺傷腫瘤細胞之溶瘤活性。
236. 一種VACV製劑,其包含如實施例194至235中任一者之經分離之純系VACV株。
237. 一種VACV製劑,其包含如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒,其中重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
238. 一種重組溶瘤病毒製劑,其包含如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒,視情況地其中製劑中至少70%、80%、90%、95%或98%之病毒粒子具有純系溶瘤病毒株之基因體序列。
239. 如實施例236或實施例237之VACV製劑,其實質上係均質的,其中製劑中之複數個病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
240. 如實施例236、237及239中任一者之VACV製劑,其中製劑中至少70%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
241. 如實施例236、237及239中任一者之VACV製劑,其中製劑中至少80%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
242. 如實施例236、237及239中任一者之VACV製劑,其中製劑中至少90%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
243. 如實施例236、237及239中任一者之VACV製劑,其中製劑中至少95%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
244. 如實施例236、237及239中任一者之VACV製劑,其中製劑中至少98%之病毒粒子具有純系VACV株之基因體序列。
245. 一種醫藥組合物,其包含如實施例208至248中任一者之經分離之VACV純系株。
246. 一種醫藥組合物,其包含如實施例194至234中任一者之VACV製劑。
247. 一種醫藥組合物,其包含如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒。
248. 一種重組痘瘡病毒(VACV)株,其包含如實施例194至235中任一者之VACV純系株之核酸基因體,該核酸基因體包含至少一種病毒基因之不活化突變。
249. 如實施例248之重組VACV株,其中病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。
250. 如實施例248或實施例249之重組VACV,其中不活化突變係至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。
251. 如實施例250之重組VACV株,其中至少一種病毒基因之缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。
252. 如實施例250之重組VACV株,其中至少一種病毒基因之缺失係病毒基因ORF之一部分缺失,且其中該缺失足以使經編碼之基因產物無功能。
253. 如實施例248至252中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係或包含A35R。
254. 如實施例253之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:3中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
255. 如實施例248至254中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係或包含J2R。
256. 如實施例255之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:4中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
257. 如實施例248至256中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係或包含B2R。
258. 如實施例248至257中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R。
259. 如實施例258之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:12中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
260. 如實施例248至259中任一者之重組VACV株,其中至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R。
261. 如實施例260之重組VACV株,其中重組VACV株之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:48中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
262. 如實施例248至261中任一者之重組VACV株,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
263. 如實施例248至261中任一者之重組VACV株,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
264. 如實施例248至261中任一者之重組VACV株,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
265. 一種核酸,其包含如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒之基因體或如實施例194至234中任一者之經分離之VACV純系株。
266. 一種重組溶瘤病毒,其包含如實施例265之核酸。
267. 如實施例265之核酸,其中重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
268. 如實施例266之重組溶瘤病毒,其係重組溶瘤痘瘡病毒。
269. 一種醫藥組合物,其包含如實施例248至264中任一者之重組VACV株。
270. 一種醫藥組合物,其包含如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒,視情況地其中重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
271. 如實施例245至247、269及270中任一者之醫藥組合物,其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
272. 如實施例245至247及269至271中任一者之醫藥組合物,其經調配用於靜脈內投與、腫瘤內投與、腹膜內投與或胸膜內投與。
273. 如實施例245至247及269至272中任一者之醫藥組合物,其經調配用於靜脈內投與。
274. 如實施例245至247及269至273中任一者之醫藥組合物,其中醫藥組合物係液體組合物。
275. 如實施例245至247及269至273中任一者之醫藥組合物,其中醫藥組合物係凍乾的。
276. 一種治療個體之增生性病症之方法,其包括向個體投與如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒、如實施例194至235中任一者之經分離之純系VACV株、如實施例248至264中任一者之重組VACV株或如實施例245至247及269至275中任一者之醫藥組合物。
277. 如實施例276之方法,其中增生性病症係腫瘤或轉移。
278. 如實施例276或實施例277之方法,其中增生性病症係癌症。
279. 如實施例278之方法,其中癌症係胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、直腸癌、腎(腎臟)癌、胃癌、食管癌、肝(肝臟)癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、口癌(例如口腔癌)、子宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤,例如惡性黑色素瘤)、膽管癌(膽道癌)、胸腺上皮癌(例如胸腺瘤)、白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
280. 如實施例278或實施例279之方法,其中癌症係微衛星穩定(MSS)結腸直腸癌。
281. 如實施例280之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
282. 如實施例276至281中任一者之方法,其中重組溶瘤病毒或經分離溶瘤病毒係以1 × 10
5pfu至1 × 10
14pfu之量投與。
283. 如實施例276至282中任一者之方法,其進一步包括投與用於治療增生性病症之第二治療劑。
284. 如實施例276至283中任一者之方法,其進一步包括尤其選自以下之另一治療:手術、輻射療法、免疫抑制療法及投與抗癌劑。
285. 如實施例284之方法,其中另一治療係投與尤其選自以下之抗癌劑:細胞介素、趨化介素、生長因子、光激致效劑、毒素、抗癌抗生素、化學治療化合物、放射性核種、血管生成抑制劑、傳訊調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療劑及其前述任一者之組合。
286. 如實施例276至285中任一者之方法,其中重組溶瘤病毒或經分離溶瘤病毒係靜脈內投與。
287. 如實施例276至286中任一者之方法,其進一步包括向個體投與AP1903 (利米多賽)。
288. 如實施例276至287中任一者之方法,其中投與個體之重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
289. 如實施例287或實施例288之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
290. 如實施例276至289中任一者之方法,其中個體展現重度免疫缺乏且對病毒感染敏感。
291. 如實施例276至290中任一者之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
292. 一種抑制病毒複製之方法,該方法包括使經重組溶瘤病毒感染之細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
293. 一種抑制病毒複製之方法,該方法包括使細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中細胞經如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒、如實施例194至235中任一者之經分離之純系VACV株或如實施例248至264中任一者之重組VACV株感染。
294. 如實施例292或實施例293之方法,其中接觸在個體之活體內進行。
295. 如實施例292或實施例294之方法,其中將AP1903 (利米多賽)投與先前投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒的個體。
296. 如實施例293或實施例294之方法,其中將AP1903 (利米多賽)投與先前投與如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒、如實施例194至235中任一者之經分離之純系VACV株或如實施例248至264中任一者之重組VACV株的個體。
297. 一種抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中個體先前已投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒。
298. 一種抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中個體先前已投與如實施例1至193、224至227及230至235中任一者之重組溶瘤病毒、如實施例194至235中任一者之經分離之純系VACV株或如實施例248至264中任一者之重組VACV株。
299. 如實施例287至298中任一者之方法,其中該方法優先抑制非癌細胞中之病毒複製。
300. 如實施例287至299中任一者之方法,其中細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。
301. 如實施例300之方法,其中iDED包含SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:27具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
302. 如實施例300及實施例301之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
303. 如實施例292至302中任一者之方法,其中重組溶瘤病毒之核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
IX. 實例 實例 1 :痘瘡病毒之溶瘤純系分離物之分離及表徵
分離痘瘡病毒之純系分離物且評價癌細胞之溶瘤活性。
A. 具有溶瘤活性之痘瘡病毒純系之分離
自VACV IHD-J (自ATCC - VR-156獲得)及哥本哈根株之混合群體分離痘瘡病毒(VACV)純系。使用VACV母體株感染非洲綠猴腎纖維母細胞(CV-1;自ATCC獲得)。用VACV株之一系列稀釋物感染生長於6孔板中之鋪滿的CV-1細胞培養物。在感染後兩天,為每一VACV株挑選六個充分分離之噬菌斑。在CV-1細胞中使該等噬菌斑經歷兩輪以上之噬菌斑純化。將VACV IHD-J分離純系分別命名為VIP01、VIP02、VIP03、VIP04、VIP05、VIP06,且將哥本哈根純系分別命名為VCP01、VCP02、VCP03、VCP04、VCP05及VCP06 (數據未顯示)。
在純系分離後,評估經每一VIP01-06純系分離物感染之腫瘤細胞之存活以選擇具有最高細胞殺傷活性之純系。人類癌細胞株A549購自ATCC,且癌細胞株BT-549、HCC-2998、LOX-IMVI及COLO205係自國家癌症研究所(National Cancer Institute)獲得。將VIP01、VIP02、VIP03、VIP04、VIP05及VIP06純系分離物與BT-549、A549、HCC-2998細胞(以MOI=0.01)以及與LOX-IMVI及COLO-205 (MOI=0.1)一起培育。在培育96小時後量測細胞活力且表示為存活百分比。
如
圖 1中所繪示,與其他五種純系分離物相比,VIP02顯示最低的細胞存活百分比及最高的活體外細胞殺傷活性。
B. VIP02 純系分離物之測序
選擇VIP02純系分離物作為母體分離物用於進一步分析。使用Wizard基因體DNA純化套組(Promega, Madison, WI)自經純化之病毒體提取VIP02純系分離物之基因體DNA。使用TruSeq® DNA無PCR文庫套組(Illumina, San Diego, CA)製備文庫。使用Illumina Miseq系統進行測序。由Bio Applied Technologies Joint, Inc. (BATJ, San Diego, CA)進行文庫製備、DNA測序及序列組裝。VIP02純系分離物之基因體DNA闡述於SEQ. ID NO: 1中。將VIP02之序列與IHD-W1之基因體DNA (SEQ. ID NO: 2) (登錄號KJ125439.1)進行比較,該IHD-W1之基因體DNA係在資料庫搜索後獲得之最接近匹配。此比較之結果闡述於下
表 E1中。
表 E1
C. 來自純系分離物之細胞外包膜病毒 (EEV) 之表徵
基因體 | 核苷酸變化 | AA 變化 | ORF | |
位置 | 變化 | |||
VIP02 對 IHDW1 | VIP02中之nt 7770;IHDW1中之7891 | 「T」->「G」 | ||
VIP02中之nt 15261;IHDW1中之15382 | 「C」->「T」 | 「Ala66」->「Thr」 | IHDW1_017 | |
VIP02中之nt 32135^32137;IHDW1中之32256…32257 | 「G」插入 | ORF移位 | IHDW1_038 (K5L) | |
VIP02中之nt 49455;IHDW1中之49575 | 「T」->「G」 | 「Leu419」->「Phe」 | IHDW1_059 (E2L) | |
VIP02中之nt 92969;IHDW1中之93089 | 「T」->「C」 | 「Asn591」->「Asp」 | IHDW1_104 (H4L) | |
VIP02中之nt 106873…106874;IHDW1中之106993^106996 | 「TA」缺失 | |||
VIP02中之nt 111272…111273;IHDW1中之111394^111398 | 「ATT」缺失 | |||
VIP02中之nt 162714^162716;IHDW1中之162839…162840 | 「A」插入 | |||
VIP02中之nt 165848…165849;IHDW1中之165972^165975 | 「AC」缺失 | ORF移位 | IHDW1_182 (A56R) | |
VIP02中之nt 187805;IHDW1中之187931 | 「A」->「C」 |
在IHD-J衍生VIP02及哥本哈根衍生VCP02純系分離物中表徵細胞外包膜病毒(EEV)之產生。用VIP02或VCP02以0.01之MOI感染4T1及B16-F10 細胞培養物。在感染後48小時(hpi)收穫上清液及經感染之細胞且在CV-1細胞中進行滴定。藉由下式確定EEV之百分比:上清液之病毒效價/(上清液之病毒效價+細胞溶解物之病毒效價) *100。如
圖 2中所顯示,在經感染之4T1及B16-F10細胞中,衍生自IHD-J母體株之VIP02純系分離物產生之EEV量顯著大於VCP02純系分離物。
不希望受限於理論,與其他純系結果相比產生大量EEV之能力指示,VIP02可具有更高的逃避宿主免疫系統之能力並可較佳地在身體腫瘤內及腫瘤間擴散,且因此VIP02尤其適於作為溶瘤病毒療法。
實例2:VAcv純系分離物對腫瘤生長抑制之評價
在活體內及
活體外測試VACV純系分離物(包括VIP02)對腫瘤生長抑制之溶瘤活性。
A. 同基因小鼠模型中之腫瘤生長抑制
使用4T1小鼠乳腺癌模型活體內評估哥本哈根純系分離物及IHD-J VACV純系分離物之腫瘤抑制活性。
使用穩定表現紅色螢光蛋白(RFP)之4T1細胞(ATCC) (命名為4T1-RFP細胞)來產生4T1小鼠乳腺癌模型。向購自Taconic Biosciences Inc. (Rensselaer, NY)之4-6週齡之雌性BALB/c小鼠之側腹皮下(s.c.)注射100 μL PBS中之2 × 106個4T1-RFP細胞以產生腫瘤儲備溶液。收穫、檢查所得腫瘤儲備溶液組織,且去除任何可疑或嚴重壞死之組織或腫瘤組織。隨後將健康腫瘤組織切成大約1 mm³之小片段且用於原位腫瘤植入。所有手術程序皆係在HEPA過濾之層流櫃下之8×放大倍數顯微鏡下實施。藉由肌內注射氯胺酮混合物來麻醉動物。使用碘及酒精對手術區域進行滅菌。使用手術剪在小鼠之右側第二乳腺中製造大約1 cm長之切口。使乳腺暴露,剝離移植位點之包膜,且移植一個4T1-RFP腫瘤片段(1 mm³)並用8-0手術縫合線(耐綸)固定。用5-0手術縫合線使切口閉合。
當腫瘤體積達到大約100 mm
3時,開始病毒治療。用靜脈內劑量之1 × 10
7PFU之VCP02、VIP01及VIP02治療小鼠(10隻小鼠/組)一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。當腫瘤達到終止標準(腫瘤體積>= 3000 mm
3及/或體重損失>= 20%)時,對小鼠實施安樂死。
如
圖 3中所顯示,在4T1小鼠乳腺癌模型中,與僅媒劑對照相比,單一靜脈內遞送低劑量之VIP02顯著抑制腫瘤生長。相比之下,VIP01及VCP02純系分離物皆不能有效地抑制腫瘤生長。
B. 活體外腫瘤細胞殺傷
為進一步確認溶瘤活性,在不同癌細胞株之2-D及3-D培養物中活體外評價腫瘤細胞殺傷。使用以下多種不同之人類癌細胞株實施分析:BT-549、NCI-H226、SW1990、M14、LOX-IMVI、COLO 205、U-251、786-O或PC-3癌細胞用於2-D培養物分析,及MDA-MB-468、A549、M14、HCC-2998、COLO 205、U-251、786-O、PC-3、4T1及CT26.WT用於3-D細胞培養物分析。人類癌細胞株購自ATCC或自國家癌症研究所獲得。
對於2-D細胞培養物,將細胞以3,000個細胞/孔之濃度接種至96孔微量板(Corning, Kennebunk, ME)中且在37℃下在5% (v/v) CO
2下培育過夜。然後用VIP02以MOI=0.1 (深色條)及MOI=0.01 (淺色條)感染細胞。在感染後96小時,使用CellTiter 96® AQueous One Solution細胞增生分析(Promega, Madison, WI)根據製造商之說明書量測細胞活力。確定活細胞% (存活%)。
對於3-D細胞培養物,將細胞以30,000個細胞/孔之濃度接種至96孔球形微量板(Corning, Kennebunk, ME)中且以500 g離心5分鐘。在37℃下在5% (v/v) CO
2下培育4天後,用VIP02以MOI=0.1 (深色條)及MOI=0.01 (淺色條)感染細胞。在感染後5天(120小時),使用CellTiter-Glo 3D活力分析(Promega, Madison, WI)根據製造商之說明書量測細胞活力。確定活細胞百分比(存活%)。
如
圖 4A (2-D 培養物 ) 及圖 4B (3-D 培養物 )中所顯示,在2-D及3-D培養物培養物中,VIP02具有強效的
活體外腫瘤細胞殺傷活性。
實例3:經改造具有編碼異源隱形蛋白之基因之基於VIP02之重組病毒純系的產生及評價
選擇VIP02純系分離物作為母體病毒用於後續遺傳改造。將編碼隱形蛋白之基因改造至VIP02中。如此實例中所述改造至重組株中之例示性隱形蛋白包括
伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)、最小化補體調節因子H (miniFH)及牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)。
A. 隱形重組痘瘡病毒之產生
重組VIP02 VACV株係藉由同源重組使用標準技術產生。在此方法中,藉由標準重組DNA技術將編碼異源蛋白(或異源基因產物)之基因選殖至含有期望痘瘡DNA區段之轉移載體質體中以靶向VIP02純系分離物中之特定基因座。通常,將DNA插入非必需基因(例如F14.5基因)中,且連接至痘瘡啟動子。然後藉由雙相互交換(double reciprocal crossover)將異源基因插入純系分離物基因體之基因座中。
1. 轉移載體質體構造
如下產生轉移載體質體,其經產生以含有隱形基因:
pIA35R :自VACV IHD-J基因體DNA使用Q5高保真2×主混合物(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)及引子對VACV IHD-J之A35R基因之左及右側接序列進行PCR擴增:5’-GCTGAATTCGTAGGTTTAAGAAGTTGTC GGTGC-3’ (SEQ ID NO: 43)及5’- TTTTTGTTGTCACTTGTAGAATTTTTTAA CACATAGTAC-3’ (左側) (SEQ ID NO: 44)、5’-TACTATGTGTTAAAA AATTCTACAAGTGACAACAAAAACTGCAGCGGCCGCTCGAGAGCTCAGACGGCAATGGATGGATCATAATTGATG-3’ (SEQ ID NO: 45)及5’-GCGAAGC TTATCTTCA TTAAGTACTTTAACAGTC-3’ (右側) (SEQ ID NO: 46)。使用基因剪接方法藉由重疊延伸將兩個片段連結在一起(Horton RM、Ho SN、Pullen JK、Hunt HD、Cai Z、Pease LR. Gene splicing by overlap extension. Methods Enzymol.1993;217:270-9. Epub 1993/01/01. doi: 10.1016/0076-6879(93)17067-f. PubMed PMID: 8474334)。用EcoRI及HindIII消化所得片段且將其選殖至相同切割之質體pVM-1中以產生pIA35R。藉由DNA測序確認A35R之側接序列。
pITK :為產生pITK,自VACV IHD-J基因體DNA使用Q5高保真2×主混合物(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)及引子對VACV IHD-J之J2R (胸苷激酶;
TK)基因之左及右側接序列進行PCR擴增:5’- GCTGAATT CTTTTGCGATCAATAAATGGATCACAACCAG-3’ (SEQ ID NO: 35)及5’- AACTCGTCTAATTAATTCTGTACTTTTACCTG-3’ (左側) (SEQ ID NO: 36)、5’-CCATGTTTTCAGGTAAAAGTACAGAATTAATTAGACGAGTTGGTACC TGCAGCGGCCGCTCGAGAGCTCGGAGGTAATGATATGTATCAATCGGTGTGTAG-3’ (SEQ ID NO: 37)及5’-GCGAAGCTTCGTAATTACTTAGTAAATC CGCCGTACTAGG-3’ (右側) (SEQ ID NO: 38)。使用基因剪接方法藉由重疊延伸將兩個片段連結在一起(Horton等人,1993)。用EcoRI及HindIII消化所得片段且將其選殖至相同切割之質體pVM-1中以產生pITK。藉由DNA測序確認
TK之側接序列。
質體 pIF14.5L-CRASP-2.為構造pIF14.5L-CRASP-2質體,藉由PCR自VACV IHD-J基因體DNA使用Q5高保真2×主混合物(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)及引子對VACV IHD-J之
F14.5L基因之左側接序列進行擴增:5’-GCTCAATTGCTAGCTCGATGCTTTGTTAAAATAGATACTCC TAG-3’ (SEQ. NO ID: 31)及5’-CAACAGTAGTTCTTGCTCCTCCTTGATTC-3’ (SEQ. NO ID: 32)。由IDT (Coralville, IA)合成與
F14.5L之右側接序列融合之
伯氏疏螺旋體補體調節劑獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2,SEQ ID NO: 18) cDNA。使用基因剪接方法藉由重疊延伸(Horton等人,1993)及引子5’-GCTCAATTGCTAGCTCGAT GCTTTGTTAAAATAGATACTCCTAG-3’ (SEQ. NO ID: 33)及5’-GCGAAGCTT GACTTTGTAGCTCTCCCAGATTTCTTTTC-3’ (SEQ. NO ID: 34)將兩個片段連結在一起。
然後將上述片段選殖至質體VM-1 (pVM-1)中。為產生pVM-1,由Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA)合成由VACV早期啟動子p7.5E驅動之人類密碼子最佳化之
大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(gpt)基因且用EcoRI及NdeI消化。將經消化之片段選殖至相同切割之質體pUC19中以產生質體pVM-1。藉由DNA測序確認gpt表現盒之序列。用MfeI及HindIII消化上述CRASP-2融合至
F14.5L之左及右側接序列之片段,然後選殖至用EcoRI及HindIII切割之質體pVM-1中以產生pIF14.5L-CRASP-2。藉由DNA測序確認F14.5L-CRASP-2之DNA序列。
質體 pIF14.5L-miniFH. 為構造質體pIF14.5L-miniFH,自VACV IHD-J基因體DNA使用Q5高保真2×主混合物(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)及引子對VACV IHD-J之F14.5L基因之左側接序列進行PCR擴增:5’-GCTCAATTGCTAGCTCGATGCTTTGTTAAAATAGATACTCCTAG-3’ (SEQ. NO ID: 31)及5’-CAACAGTAGTTCTTGCTCCTCCTTGATTC-3’ (SEQ NO ID: 32)。由IDT (Coralville, IA)合成與
F14.5L之右側接序列融合之最小化補體調節因子H (miniFH,SEQ ID NO: 19) cDNA。使用基因剪接方法藉由重疊延伸(Horton等人,1993)及引子5’-GCTCAATTGCTAGCTCGATGCTTTGTTAAAA TAGATACTCCTAG-3’ (SEQ. NO ID: 33)及5’-GCGAAGCTTGACTTTGTAGCTC TCCCAGATTTCTTTTC-3’ (SEQ. NO ID: 34)將兩個片段連結在一起。用MfeI及HindIII消化所得片段,然後將其選殖至質體pVM-1中並用EcoRI及HindIII切割以產生pIF14.5L-miniFH。藉由DNA測序確認F14.5L-miniFH之DNA序列。
質體 pITK-CPXV012-203-018. 由IDT (Coralville, IA)合成含有牛痘病毒(CPXV)開放閱讀框012 (SEQ ID NO: 20)、203 (SEQ ID NO: 21)及018 (SEQ ID NO: 22)及其自身原始啟動子之DNA片段。
然後將上述片段選殖至質體ITK (pITK)中。用KpnI及SacI消化上述含有CPXV開放閱讀框012、203及018之合成片段且將其選殖至相同切割之質體pITK中以產生pITK-CPXV012-203-018。藉由DNA測序確認CPXV012-203-018之DNA序列。
2. 重組病毒之同源重組及選擇
為產生重組痘瘡病毒,用如
表 E2中所指示之母體病毒以0.1之感染複數(MOI)將CV-1細胞感染1小時,且然後如下
表 E2及
圖 5中所指示,使用jetPRIME活體外DNA及siRNA轉染試劑(Polyplus-transfection Inc., New York, NY)用轉移載體轉染。在感染後兩天,收穫經感染/轉染之細胞且選擇重組病毒並如先前所述((Falkner FG、Moss B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J Virol. 1990;64(6):3108-11. Epub 1990/06/01. PubMed PMID: 2159565)純化噬菌斑。
表 E2及
圖 5匯總所產生之重組VACV株,包括用於其產生之母體病毒及轉移載體。
表 E2
B. 免疫逃避及溶瘤活性之評價 1. 隱形病毒活體外避免宿主免疫反應
重組VACV | 母體病毒 | 轉移載體 | 基因型 |
VIR11 (SEQ ID NO: 3) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pIA35R | A35R被破壞 |
VIR52 (SEQ ID NO: 12) | VIR11 (SEQ ID NO: 3) | pITK | A35R及J2R被破壞 |
VIR27 (SEQ ID NO: 5) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pIF14.5L-CRASP-2 | F14.5L與CRASP-2融合 |
VIR37 (SEQ ID NO: 6) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pIF14.5L-miniFH | F14.5L與miniFH融合 |
VIR46 (SEQ ID NO: 10) | VIR27 (SEQ ID NO: 5) | pITK-CPXV012-203-018 | F14.5L與CRASP-2融合;CPXV012、018及203插入J2R處 |
評價重組病毒株VIR27、VIR37及VIP02避開補體抑制之能力。對於補體抑制分析,將2 µL病毒(10
7pfu/mL)分別與100 µL正常人類血清(Biochemed Services, Winchester, VA)、BALB/c小鼠血清(Biochemed Services, Winchester, VA)或DMEM-2.5以一式兩份混合,且然後將混合物在37℃下培育1小時。藉由在CV-1細胞中滴定來計算培育後之病毒濃度,且藉由比較與血清一起培育後之病毒效價及與DMEM-2.5一起培育後之病毒效價來確定病毒效價之抑制% (
圖 6)。
如
圖 6中所顯示,在人類及小鼠血清中評價時,VIP02及基於VIP02之隱形溶瘤病毒VIR27及VIR37可避開補體抑制。另外,與VIP02相比,基於VIP02之隱形溶瘤病毒VIR27及VIR37中之抑制百分比顯著較低,此指示將CRASP-2及miniFH引入VIP02中顯著增加病毒抑制宿主補體之能力。
2. 隱形病毒活體內誘導小鼠之腫瘤大小減小
使用4T1小鼠乳腺癌模型活體內評估VIP02及表現CRASP-2之經改造之隱形純系VIR27的腫瘤抑制活性,如上文實例2中所述。在本實驗中,當腫瘤體積大約係80 mm
3時,開始病毒治療。用靜脈內劑量之1 × 10
7PFU之VIP02或VIR27治療小鼠(8隻小鼠/組)一次。如
圖 7中所顯示,與媒劑治療之對照相比,注射有VIP02及VIR27株之小鼠在治療後9天時顯示腫瘤體積減小。另外,隱形株VIR27在減少腫瘤生長方面比VIP02更有效,如在治療後7天時腫瘤體積之統計學上顯著減小所顯示。該等結果與以下發現一致:引入外源CRASP-2蛋白強化病毒抑制補體之能力。
在另一相似研究中,使用4T1小鼠乳腺癌模型活體內評估隱形VIR46 (牛痘病毒CPXV開放閱讀框012、203及018及其自身原始啟動子)及VIR52 (A35R及J2R被破壞)之腫瘤抑制活性,如上文實例2中所述。在本實驗中,當腫瘤體積大約係90 mm
3時,開始病毒治療。用靜脈內劑量之1 × 10
7PFU之VIP46或VIR52治療小鼠(6隻小鼠/組)一次。如
圖 8中所顯示,與媒劑治療之小鼠相比,注射有VIR46株之小鼠在治療後20天時顯示腫瘤體積之統計學上顯著減小。另外,與VIR52相比,VIR46顯示顯著改良之減小腫瘤體積之能力。
實例4:經改造具有編碼異源免疫刺激蛋白之基因之基於VIP02之重組病毒純系的產生及評價
選擇VIP02純系分離物作為母體病毒,以使用編碼人類LIGHT突變體(hmLIGHT)之例示性免疫刺激基因進行後續遺傳改造。評估所產生之重組病毒抑制腫瘤生長之能力。
A. 免疫刺激重組痘瘡病毒之產生
藉由將人類LIGHT突變體(hmLIGHT) cDNA在VACV SSE啟動子控制下插入內源病毒J2R基因中來產生具有免疫刺激活性之重組VACV株VIR49。藉由轉移載體及母體基因體之同源重組產生重組VIR49。
如下產生轉移載體:
質體 pIA35R-SSE-hmLIGHT. 由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV SSE啟動子控制下之人類LIGHT突變體(hmLIGHT,SEQ ID NO: 25) cDNA。用PstI及SacI消化合成片段且將其選殖至實例3中所述之相同切割之質體pIA35R中以產生pIA35R-SSE-hmLIGHT。藉由DNA測序確認SSE-hmLIGHT之DNA序列。
藉由用VIP02以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時來產生母體病毒VIR13,且然後用實例3中所述之pITK轉移載體轉染,以產生J2R(TK)基因被破壞之母體重組病毒。為產生重組VIR49,用母體病毒VIR13以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時,且然後用pIA35R-SSE-hmLIGHT轉移載體轉染。為進行比較,亦藉由用母體株VIR11以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時來產生重組痘瘡株VIR52,且然後用實質上如實例3中所述之pITK轉移載體轉染。
表 E3及
圖 9匯總所產生之重組VACV株,包括其產生中所用之母體病毒及轉移載體。
表 E3
B. 溶瘤活性之評價
重組 VACV | 母體病毒 | 轉移載體 | 基因型 |
VIR11 | VIP02 | pIA35R | A35R被破壞 |
VIR52 (SEQ ID NO: 12) | VIR11 (SEQ ID NO: 3) | pITK | A35R及J2R被破壞 |
VIR13 (SEQ ID NO: 4) | VIP02 | pITK | J2R(TK)被破壞 |
VIR49 (SEQ ID NO: 11) | VIR13 (SEQ ID NO: 4) | pIA35R-SSE-hmLIGHT | J2R(TK)被破壞,SSE-hmLIGHT插入A35R處 |
使用4T1小鼠乳腺癌模型活體內評估VIR49 (具有免疫系統刺激活性之突變體hLIGHT)之腫瘤抑制活性,如上文實例2中所述。在本實驗中,當腫瘤體積大約係90 mm
3時,開始病毒治療。用靜脈內劑量之1 × 10
7PFU之VIR49或VIR52治療小鼠(6隻小鼠/組)一次。
如
圖 10中所顯示,與媒劑治療之對照相比,用VIR49及VIR52治療之小鼠顯示腫瘤體積之統計學上顯著減小。另外,與VIR52及媒劑治療之對照相比,用VIR49治療之小鼠在治療後20天顯示顯著改良之減小腫瘤體積之效力,此指示引入hmLIGHT序列增加病毒刺激免疫系統之能力。
實例5:經改造具有編碼抗血管生成蛋白之基因之基於VIP02之重組病毒純系的產生及評價
選擇VIP02純系分離物作為母體病毒,以使用例示性抗血管生成蛋白、即與抗血管生成素-2 scAb (抗VEGF-抗Ang2) (SEQ ID NO: 23)及人類Versikine (VK) (SEQ ID NO: 24) (抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK)融合之抗VEGF單鏈抗體(scab)進行後續遺傳改造。評估所產生之重組病毒抑制腫瘤生長之能力。
A. 抗血管生成重組痘瘡病毒之產生
藉由將mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK構造物插入內源病毒J2R基因中來產生具有抗血管生成活性之重組痘瘡病毒純系VIR71。藉由轉移載體及母體基因體之同源重組產生重組VIR71。
如下產生重組病毒產生中所用之轉移載體:
pITK-mH5-hFGL1 :由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV修飾之H5早期/晚期啟動子(mH5)控制下之人類纖維蛋白原樣1 (hFGL1) cDNA。用KpnI及SacI消化合成片段且將其選殖至實例3中所述之相同切割之質體pITK中以產生pITK-mH5-hFGL。藉由DNA測序確認mH5-hFGL之DNA序列。
pITK-mH5-Versikine :用PstI及SacI消化pITK-mH5-hFGL1。對含有骨架質體及mH5啟動子之片段(pITK-mH5)進行凝膠純化。由IDT (Coralville, IA)合成人類Versikine且用PstI及SacI消化,然後選殖至相同切割之質體pITK-mH5中以產生pITK-mH5-Versikine。藉由DNA測序確認mH5-Versikine之DNA序列。
pITK-mH5- 抗 VEGF- 抗 Ang2:用PstI及SacI消化pITK-mH5-hFGL1。對含有骨架質體及mH5啟動子之片段(pITK-mH5)進行凝膠純化。由IDT (Coralville, IA)合成與抗血管生成素-2 scAb融合之抗VEGF單鏈抗體(scAb)且用PstI及SacI消化,然後選殖至相同切割之質體pITK-mH5中以產生pITK-mH5-抗VEGF-抗Ang2。藉由DNA測序確認mH5-抗VEGF-抗Ang2之DNA序列。
pITK-mH5- 抗 VEGF- 抗 Ang2-SEL-VK:用PstI及SacI消化pITK-mH5-hFGL1。對含有骨架質體及mH5啟動子之片段(pITK-mH5)進行凝膠純化。自pITK-mH5-抗VEGF-抗Ang2使用Q5高保真2×主混合物(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)及引子對含有抗VEGF-抗Ang2之片段進行PCR擴增:5’-CGACTGCAGACCATGGAAACCGACACAC-3’ (SEQ ID NO: 39)及5’-CAATTT TTATAAAAATTAATTAATCATTGTCC-3’ (SEQ ID NO: 40)。自pITK-mH5-Versikine使用Q5高保真2×主混合物(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)及引子對由VACV合成強早期/晚期啟動子(SEL)驅動之含有人類Versikine之片段進行PCR擴增:5’-GGACAATGATTAATTAATTTTTATAAAAA TTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATACTCGAGACCATGTTCATAAACATAAAATCC-3’ (SEQ ID NO: 41)及5’-GCTGAGCTCATAAAAATTAA TTAATCATTCAGC-3’ (SEQ ID NO: 42)。使用基因剪接方法藉由重疊延伸將兩個片段連結在一起(Horton等人,1993)。用PstI及SacI消化所得片段,然後將其選殖至相同切割之質體pITK-mH5中以產生pITK-mH5-抗VEGF-Ang2-SEL-VK。藉由DNA測序確認mH5-抗VEGF-Ang2-SEL-VK之DNA序列。
為產生重組痘瘡病毒VIR71,用母體病毒VIR11以0.1之感染複數(MOI)將CV-1細胞感染1小時,且然後用pITK-mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK轉移載體轉染。為進行比較,亦藉由用母體株VIR11以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時來產生重組痘瘡株VIR52,且然後用實質上如實例3中所述之pITK轉移載體轉染。
為產生重組痘瘡病毒VIR86,用母體病毒VIR49以0.1之感染複數(MOI)將CV-1細胞感染1小時,且然後用pITK-mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK轉移載體轉染。為進行比較,亦藉由用母體株VIR02以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時來產生重組痘瘡株VIR13,且然後用實質上如實例4中所述之pITK轉移載體轉染。
表 E4及
圖 11匯總所產生之重組VACV株,包括其產生中所用之母體病毒及轉移載體。
表 E4
B. 溶瘤活性之評價
重組VACV | 母體病毒 | 轉移載體 | 基因型 |
VIR11 | VIP02 | pIA35R | A35R被破壞 |
VIR52 (SEQ ID NO: 12) | VIR11 (SEQ ID NO: 3) | pITK | A35R及J2R被破壞 |
VIR71 (SEQ ID NO: 13) | VIR11 (SEQ ID NO: 3) | pITK-mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK | A35R被破壞;mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK插入J2R處 |
VIR86 (SEQ ID NO: 47) | VIR49 (SEQ ID NO: 11) | pITK-mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK | SSE-hmLIGHT插入A35R處;mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK插入J2R處 |
使用上文實例2中所述之4T1小鼠乳腺癌模型活體內評估VIR71之腫瘤抑制活性。在本實驗中,當腫瘤體積大約係90 mm
3時,開始病毒治療。用靜脈內劑量之1 × 10
7PFU之VIR71或VIR52治療小鼠(6隻小鼠/組)一次。
如
圖 12A中所顯示,與VIR52及媒劑治療之對照相比,注射有抗血管生成VIR71株之小鼠在治療後14天顯示腫瘤體積之統計學上顯著減小。亦如
圖 12B中所顯示,與媒劑治療之對照及VIR13相比,注射有抗血管生成VIR86之小鼠在治療後7天內顯示腫瘤體積減小。該數據展示,與媒劑治療之對照相比,抗血管生成VIR71及VIR 86株各自顯示腫瘤體積之統計學上顯著減小,且儘管VIR52及VIR13各自減小腫瘤大小,但VIR71及VIR 86株顯示腫瘤體積之減小大於對照VIR52及VIR13株。在單獨評價時,可充當免疫調節劑之分子、即Versikine並未顯著減小腫瘤大小(數據未顯示)。然而,當融合至抗VEGF-抗Ang2時,Versikine顯著增強VEGF-抗Ang2之腫瘤細胞殺傷能力。
實例6:經改造具有編碼細胞凋亡誘導蛋白之基因之基於VIP02之重組病毒純系的產生及評價
選擇VIP02純系分離物作為母體病毒,以使用例示性細胞凋亡誘導蛋白進行後續遺傳改造,從而產生病毒誘導系統,其在用FDA批準之用於人類之藥物利米多賽誘導時可抑制健康細胞、但不抑制癌細胞中之病毒複製。如此實例中所述改造至重組株中之例示性細胞凋亡誘導蛋白包括含有F36V-FKBP之利米多賽誘導型iCasp9、iDED或iFAS構造物,該F36V-FKBP係融合至Casp9、DED或FAS之包括Phe至Val取代之人類FK506結合蛋白12 (FKBP12,亦稱為FKBP)之全長形式(參見Clackson等人,1998 PNAS, 95:10437-10442)。利米多賽治療誘導引起誘導型Casp9、DED及FAS活化之FKBP12二聚化。在原代健康細胞及癌細胞中評估該等重組痘瘡病毒株抑制噬菌斑形成、抑制病毒複製及抑制病毒介導之細胞毒性的能力。
A. 誘導細胞凋亡之痘瘡病毒之產生
藉由用編碼iCasp9、iDED及iFAS蛋白之DNA替代VIP02中之J2R基因來產生具有細胞凋亡誘導活性之重組痘瘡病毒純系。藉由轉移載體及VIP02母體基因體之同源重組產生重組株VIR40、VIR41及VIR42,且使用VIR13作為對照病毒。
如下產生重組病毒產生中所用之轉移載體:
pITK-SSE-hFGL1tm:由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV合成強早期啟動子(SSE)控制下之與人類CD19之跨膜結構域融合之人類纖維蛋白原樣1 (hFGL1) cDNA。用KpnI及SacI消化合成片段且將其選殖至實例3中所述之相同切割之質體pITK中以產生pITK-SSE-hFGLtm。藉由DNA測序確認SSE-hFGLtm之DNA序列。
質體 pITK-SSE-iCasp9. 用PstI及SacI消化pITK-SSE-hFGL1tm。對含有骨架質體及SSE啟動子之片段(pITK-SSE)進行凝膠純化。藉由IDT (Coralville, IA)合成誘導型半胱天冬酶9 (iCasp9,SEQ ID NO: 26)且用PstI及SacI消化,然後選殖至相同切割之質體pITK-SSE中以產生pITK-SSE-iCasp9。藉由DNA測序確認SSE-iCasp9之DNA序列。
質體 pITK-SSE-iDED. 用PstI及SacI消化pITK-SSE-hFGL1tm。對含有骨架質體及SSE啟動子之片段(pITK-SSE)進行凝膠純化。藉由IDT (Coralville, IA)合成含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之誘導型死亡效應結構域(DED,SEQ ID NO: 27)且用PstI及SacI消化,然後選殖至相同切割之質體pITK-SSE中以產生pITK-SSE-iDED。藉由DNA測序確認SSE-iDED之DNA序列。
pITK-SSE-iFAS. 用PstI及SacI消化pITK-SSE-hFGL1tm。對含有骨架質體及SSE啟動子之片段(pITK-SSE)進行凝膠純化。藉由IDT (Coralville, IA)合成誘導型Fas (SEQ ID NO: 28)且用PstI及SacI消化,然後選殖至相同切割之質體pITK-SSE中以產生pITK-SSE-iFAS。藉由DNA測序確認SSE-iFAS之DNA序列。
為產生重組痘瘡病毒,用母體病毒VIP02以0.1之感染複數將CV-1細胞感染1小時,且然後用如
表 E5 中所指示實質上如實例3中所述之轉移載體轉染。
表 E5及
圖 13匯總所產生之重組VACV株,包括其產生中所用之母體病毒及轉移載體。
表 E5
B. 細胞凋亡及溶瘤活性之評價 d. iCasp9、iDED或iFAS蛋白表現
重組VACV | 母體病毒 | 轉移載體 | 基因型 |
VIR13 (SEQ ID NO: 4) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK | J2R(TK)被破壞 |
VIR40 (SEQ ID NO: 7) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK-SSE-iCasp9 | SSE-iCasp9插入J2R處 |
VIR41 (SEQ ID NO: 8) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK-SSE-iDED | SSE-iDED插入J2R處 |
VIR42 (SEQ ID NO: 9) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK-SSE-iFAS | SSE-iFAS插入J2R處 |
在經感染癌細胞中藉由使用抗FKBP12抗體監測F36V-FKBP之表現來評價iCasp9、iDED及iFAS之表現。
在10 nM利米多賽或媒劑對照存在下,用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42以10之MOI感染HCT-116人類結腸癌細胞。在感染後1天,藉由低速離心收穫細胞且使用RIPA溶解緩衝液(VWR, Solon, OH)溶解。將蛋白酶抑制劑混合劑(Promega, Madison, WI)添加至溶解緩衝液中。使用RC DC蛋白質量化套組(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)確定蛋白質量。使正規化蛋白質量經歷SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)且轉移至PVDF膜上用於西方印跡(Western blotting),其用一級抗體進行印跡,然後用辣根過氧化物酶(HRP)結合之二級抗體進行印跡。用化學發光偵測套組(ClarityMax Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)及Azure Biosystems c300 (Azure Biosystems, Dublin, CA)使蛋白質可視化。針對FKBP12之抗體(1:1,000)及針對β-肌動蛋白之抗體(1:2,000)來自Novus Biologicals (Centennial, CO)。
VIR13、VIR40、VIR41及VIR42提取物之西方墨點分析顯示,iCasp9、iDED及iFAS分別在VIR40、VIR41及VIR42感染之細胞中表現(數據未顯示)。在同一分析中,在經VIR13感染之細胞中未觀察到FKB12之可偵測信號,此與未改造此重組病毒之細胞凋亡誘導系統一致。
e. 用利米多賽處理之經感染細胞中之PARP1蛋白表現
可藉由西方墨點使用結合至PARP1蛋白裂解產物(細胞凋亡標記物)之抗體來評價利米多賽對誘導系統之活化。藉由經感染之人類原代乳腺上皮細胞及人類原代結腸上皮細胞之蛋白質之西方墨點使用抗PARP1抗體來評價VIR40、VIR41及VIR42在利米多賽誘導之FKBP12二聚化後誘導細胞凋亡之能力。抗PARP1 (1:2,000)來自OriGene (Rockville, MD)。作為對照,亦在經VIR13感染之細胞中監測PARP1之水準。
西方墨點結果顯示,利米多賽在VIR40及VIR41中但不在VIR13或VIR42中誘導PARP1之裂解,此指示iCasp9及iDED在利米多賽存在下在經感染之人類原代乳腺上皮細胞及結腸上皮細胞中誘導細胞凋亡(數據未顯示)。然而,僅在經VIR40感染之Hs578T人類乳腺管癌細胞中偵測到PARP1裂解,但在用VIR13、VIR41及VIR42感染時未偵測到PARP1裂解,此證實對於癌細胞,iCasp9而非iDED及iFAS誘導細胞凋亡(數據未顯示)。
f. 在利米多賽存在下之噬菌斑形成
作為評價經感染細胞之細胞凋亡之替代方法,評估病毒感染並用利米多賽處理後之噬菌斑形成以研究VIR13、VIR40、VIR41及VIR42病毒株抑制健康及癌細胞中之病毒複製的能力(數據未顯示)。
在各自10 nM利米多賽及媒劑對照存在下,用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42感染細胞。在感染後兩天或三天,用結晶紫對細胞進行染色。使用Azure Biosystems c300 (Azure Biosystems, Dublin, CA)拍照。
表 E6匯總當用重組病毒株感染健康細胞時噬菌斑形成之存在。如預期,在經VIR13對照重組病毒感染之所有細胞中觀察到噬菌斑形成。然而,利米多賽處理抑制經VIR40及VIR41感染之健康細胞中之噬菌斑形成,但在用VIR42感染時並不抑制噬菌斑形成,此指示iCasp9及iDED而非iFAS抑制健康細胞中之噬菌斑形成。
表 E6
細胞類型 | 利米多賽 | 噬菌斑形成 | |||
病毒純系 | VIR13 | VIR40 | VIR41 | VIR42 | |
人類原代乳腺上皮細胞 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | - | + | |
人類原代結腸上皮細胞 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | - | + | |
人類原代支氣管/氣管上皮細胞 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | - | + | |
鼠類原代乳腺上皮細胞 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | - | + |
表 E7匯總當用重組病毒株感染各種癌細胞時噬菌斑形成之存在。如預期,在經VIR13對照重組病毒感染之所有癌細胞中觀察到噬菌斑形成。利米多賽處理抑制經VIR40感染之癌細胞中之噬菌斑形成,但不抑制經VIR41及VIR42感染之癌細胞中之噬菌斑形成,此指示iCasp9而非iDED及iFAS抑制癌細胞中之噬菌斑形成。
總之,該等結果證實,在用利米多賽處理後,iDED (VIR41)誘導系統抑制健康細胞但不抑制癌細胞中之噬菌斑形成。
表 E7
C. 細胞凋亡介導之病毒複製抑制
細胞類型 | 利米多賽 | 噬菌斑形成 | |||
病毒純系 | VIR13 | VIR40 | VIR41 | VIR42 | |
4T1小鼠乳腺癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
DU-145人類前列腺癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
PC-3人類前列腺癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
M14人類無色素黑色素瘤 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
HCT-116人類結腸癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
HCT-15人類結腸腺癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
MC-38鼠類結腸腺癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + | |
CT26.WT小鼠結腸癌 | - | + | + | + | + |
+ | + | - | + | + |
在各種健康原代細胞及癌細胞中評估VIR13、VIR40、VIR41及VIR42重組病毒在用利米多賽處理後抑制病毒複製之能力。在各自10 nM利米多賽及媒劑對照存在下,用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42以0.01或10之MOI以一式兩份感染細胞。在感染後1天,收穫經感染細胞,且在CV-1細胞中滴定病毒濃度。
當在人類原代支氣管/氣管上皮細胞、人類原代乳腺上皮細胞及鼠類原代乳腺上皮細胞之培養物中評價時,利米多賽處理顯著抑制經VIR40及VIR41感染之細胞中之病毒複製,但不抑制經VIR13及VIR42感染之細胞中之病毒複製,此指示iCasp9及iDED而非iFAS抑制健康細胞中之病毒複製(
圖 14)。
在0.01及10之MOI下,利米多賽處理顯著抑制經VIR40感染之乳癌、肺癌、黑色素瘤及微衛星不穩定(MSI)結腸直腸癌細胞中之病毒複製,但不抑制經VIR41、VIR13及VIR42感染之該等癌細胞中之病毒複製,如藉由BT-549乳癌細胞(
圖 15A)、Hs578T乳癌細胞(
圖 15B)、MCF-7及4T1乳癌細胞(
圖 15C)、A549及M14肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 15D)、HCT-15 MSI結腸癌細胞(
圖 15E)、HCT-116 MSI結腸癌細胞(
圖 15F)及KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 15G)所展示。該等結果指示,改造至VIR40中之iCasp9而非iDED及iFAS抑制乳癌、肺癌、黑色素瘤及MSI結腸癌細胞中之病毒複製。
亦在MSS (微衛星穩定)結腸直腸癌細胞(對檢查點抑制劑無反應之一類難以治療之癌症)中評估在用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42感染細胞後利米多賽處理抑制病毒複製之能力。在各自10 nM利米多賽及媒劑對照存在下,用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42以0.01或10之MOI以一式兩份感染MSS結腸直腸癌細胞培養物。在感染後1天,收穫經感染細胞且在CV-1細胞中進行滴定。利米多賽處理顯著抑制經VIR41及VIR40感染之MSS結腸直腸細胞之病毒複製,但不抑制經VIR13及VIR42感染之MSS結腸直腸細胞之病毒複製,如藉由COLO205癌細胞(
圖 16A)、HCC-2998癌細胞(
圖 16B)及HT-29癌細胞(
圖 16C)所展示。該等結果指示,在用利米多賽處理後,iCasp9及iDED而非iFAS抑制MSS結腸直腸癌細胞中之病毒複製。
該等結果與以下發現一致:MSS結腸癌細胞對感染之反應不同於MSI結腸癌細胞。用利米多賽誘導iDED抑制MSS癌細胞、但不抑制MSI癌細胞中之病毒複製。
D. 細胞凋亡誘導 VACV 純系對病毒介導之細胞毒性之抑制
評估在用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42重組病毒感染後,利米多賽處理抑制不同類型之原代健康及癌細胞之病毒介導之細胞毒性的能力。
將不同類型之細胞以3,000個細胞/孔之濃度接種至96孔微量板(Corning, Kennebunk, ME)中且在37℃下在5% (v/v) CO
2下培育過夜。培育後,在10 nM利米多賽及作為對照之DMSO存在下,用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42以0.01及0.1之MOI以一式兩份感染細胞。使用CellTiter 96® AQueous One Solution細胞增生分析(Promega, Madison, WI)根據製造商之說明書量測細胞活力。
在人類原代支氣管/氣管上皮細胞(HBE,圖
17A)、人類原代乳腺上皮細胞(HME,
圖 17B)、鼠類原代乳腺上皮細胞(MME)及人類原代結腸上皮(HCE,
圖 17C)中,在用VIR40及VIR41感染後,利米多賽處理顯著抑制病毒介導之細胞毒性,但在用VIR13及VIR42感染後,利米多賽處理並不抑制病毒介導之細胞毒性。該等結果指示,iCasp9及iDED而非iFAS抑制健康細胞中病毒介導之細胞毒性。
利米多賽處理顯著抑制經VIR40感染之乳癌、前列腺癌、肺癌及黑色素瘤及微衛星不穩定(MSI)結腸癌細胞中,但不抑制經VIR41、VIR13及VIR42感染之該等癌細胞中病毒介導之細胞毒性,如藉由BT-549乳癌細胞(
圖 18A)、Hs578T乳癌細胞(
圖 18B)、4T1乳癌細胞(
圖 18C)、DU-145前列腺癌細胞(
圖 18D)、PC-3前列腺癌細胞(
圖 18E)、A549肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 18F)、M14肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 18G)、COLO 320 DM及HCT-15 MSI結腸癌細胞(
圖 18H)、HCT-116及KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 18I)、KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 18J)及SW48 MSI結腸癌細胞(
圖 18K)所展示。該等結果指示,iCasp9而非iDED及iFAS抑制經感染癌細胞中病毒介導之細胞毒性。
亦評估在用VIR13、VIR40、VIR41及VIR42感染MSS結腸直腸癌細胞後,利米多賽處理抑制病毒介導之細胞毒性之能力。與經VIR13及VIR42或模擬物對照感染之培養物相比,以0.01及0.1之MOI經VIR41及VIR42感染之MSS結腸直腸癌細胞株顯示顯著較低之存活百分比,如COLO205 MSS結腸癌細胞(
圖 19A)、HCC-2998結腸癌細胞(
圖 19B)、HT-29細胞(
圖 19C)、LS123細胞(
圖 19D)、LS174T細胞(
圖 19E)、SW620細胞(
圖 19F)及WiDR細胞(
圖 19G)中所展示。該等結果指示,iDED及iFAS而非iCasp9增強MSS結腸癌細胞中病毒介導之細胞毒性。
實例7:小鼠中VIR13腫瘤生長抑制之評價
藉由在SL-4小鼠結腸腺癌模型中靜脈內注射單一劑量之VIR13後監測活體內腫瘤生長來評價例示性重組株VIR13之溶瘤活性。如
表 E5及
圖 13中所顯示,VIR13衍生自母體VIP02,但缺失TK (J2R)基因且未用任何其他異源蛋白(即,異源基因產物)進行改造。
將100 μL PBS中之大約5 × 10
5個SL-4細胞植入4-6週齡之雌性C57BL/6小鼠之右側腹中。SL-4細胞係C57BL6鼠類結腸腺癌細胞株且自AntiCancer, Inc. (San Diego, CA)獲得。對於所有腫瘤模型,當腫瘤體積係約60 mm
3時,開始病毒治療。用靜脈內劑量之1 × 10
8PFU之VIR13或作為對照之媒劑治療5隻小鼠/組一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。當腫瘤達到終止標準(腫瘤體積>= 3000 mm
3及/或體重損失>= 20%)時,對小鼠實施安樂死。
如
圖 20中所顯示,用VIR13治療小鼠顯著降低腫瘤進展。數據顯示,經VIR13感染之5隻小鼠中之3隻(60%)在注射後19天治癒,而用對照溶液治療之5隻小鼠在治療後19天皆未顯示腫瘤生長抑制之徵象。
實例8:與VIR13相比基於VIP02之重組病毒純系之產生及評價
A. 重組痘瘡病毒之產生
藉由將小鼠干擾素調節因子3 (mIRF3)在VACV SSE啟動子控制下插入內源病毒J2R基因中或藉由破壞病毒基因體中之J2R及B2R來產生具有免疫調節活性之重組VACV株。該等重組株係藉由轉移載體及母體基因體之同源重組產生。
如下產生轉移載體:
質體 pITK-SSE-mIRF3. 由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV SSE啟動子控制下之小鼠IRF3 cDNA。用PstI及SacI消化合成片段且將其選殖至實例3中所述之相同切割之質體pITK-SSE中以產生pITK-SSE-mIRF3。藉由DNA測序確認SSE-mIRF3之DNA序列。
質體 pITK-mH5-mIRF3. 由IDT (Coralville, IA)合成處於mH5啟動子控制下之小鼠IRF3 cDNA。用PstI及SacI消化合成片段且將其選殖至實例3中所述之相同切割之質體pITK-mH5中以產生pITK-mH5-mIRF3。藉由DNA測序確認mH5-mIRF3之DNA序列。
質體 pIB2R. 自VACV IHD-J基因體DNA使用引子對VACV IHD-J之B2R基因之左及右側接序列進行PCR擴增:5’- GCTGAATTCGAGATATT AAAGCGAGTAATATAG-3’ (SEQ ID NO: 94)及5’- AGGAGCTCTCGAGCGGCC GCTGCAGGTACCAGGAAAGGCATGAAGATTCTCGTCG-3’ (SEQ ID NO: 95) (左側)、5’-GGTACCTGCAGCGGCCGCTCGAGAGCTCCTGGTAAAAGTTAAA CTTGGGGAGAATG-3’ (SEQ ID NO: 96)及5’- ACGAAGCTTGGAAGCTGCTGC CGTATACGTGTTCTTAG-3’ (SEQ ID NO: 97) (右側)。使用基因剪接方法藉由如Horton
等人,Methods Enzymol., 1993; 217:270-9中所述之重疊延伸將兩個片段連結在一起,該文獻之全文皆併入本文中。用EcoRI及HindIII消化所得片段且將其選殖至相同切割之質體pVM-1中以產生pIB2R。藉由DNA測序確認B2R之側接序列。
對於VIR94,藉由用VIP02以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時來產生母體病毒VIR13,且然後用實例3中所述之pITK轉移載體轉染,以產生J2R(TK)基因被破壞之母體重組病毒。為產生重組VIR94,用母體病毒VIR13以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時且然後用pIB2R轉移載體轉染。藉由用母體株VIP02以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時來產生重組痘瘡株VIR93及VIR 96,且然後分別用pITK-SSE-mIRF3或pITK-mH5-mIRF3轉移載體轉染,如實例3中所述。
表 E8匯總所產生之重組VACV株,包括其產生中所用之母體病毒及轉移載體。
表 E8
B. 與 VIR13 相比經修飾之重組痘瘡病毒之評價
重組 VACV | 母體病毒 | 轉移載體 | 基因型 |
VIR13 (SEQ ID NO: 4) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK | J2R(TK)被破壞 |
VIR93 (SEQ ID NO: 49) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK-SSE-mIRF3 | SSE-mIRF3插入J2R處 |
VIR94 (SEQ ID NO: 48) | VIR13 (SEQ ID NO: 4) | pIB2R | J2R及B2R被破壞 |
VIR96 (SEQ ID NO: 50) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK-mH5-mIRF3 | mH5-mIRF3插入J2R處 |
使用SL-4 GFP小鼠結腸腺癌模型活體內評估VIR41、VIR86、VIR93、VIR94及VIR96之腫瘤抑制活性。向5-6週齡之雌性C57BL/6小鼠在小鼠之右側腹中植入100 μL PBS中之5 × 10
5個SL-4 GFP細胞。在本實驗中,用靜脈內劑量之1 × 10
8PFU之每一所指示病毒治療小鼠一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。
如
圖 21A-21E中所顯示,與媒劑治療之對照相比,用VIR13治療之小鼠顯示腫瘤體積減小。另外,截至治療後3至7天,與VIR13及媒劑治療之對照相比,用VIR41、VIR86、VIR93、VIR94或VIR 96治療之小鼠顯示改良之減小腫瘤體積之效力,此指示引入IRF3及破壞B2R可增加重組病毒之抗腫瘤活性。另外,如
圖 21F中所顯示,與媒劑治療之對照相比,任一病毒治療之小鼠之間的體重無顯著損失,此指示重組痘瘡病毒之抗腫瘤活性增強不會誘導毒性。
實例9:經改造具有其他免疫調節基因之基於VIP02之重組病毒純系的產生及評價
A. 經改造具有免疫調節基因之重組痘瘡病毒之產生
藉由在各種啟動子控制下插入免疫基因來產生具有免疫基因之重組VACV株。該等免疫基因包括在VACV SSE啟動子控制下插入內源病毒J2R基因中之小鼠干擾素調節因子3 (mIRF3)、在11K啟動子控制下插入A56R基因中之MDNA11插入、在mH5啟動子控制下插入A56R之mCXCL9插入、及/或在11K啟動子控制下插入A56R之mscIL-12插入。該等重組株係藉由轉移載體及母體基因體之同源重組產生。
如下產生轉移載體:
質體 pIB2R. 自VACV IHD-J基因體DNA使用引子對VACV IHD-J之B2R基因之左及右側接序列進行PCR擴增:5’-GCTGAATTCGAGA TATTAAAGCGAGTAATATAG-3’(SEQ ID NO: 94)及5’-AGGAGCTCTCGAG CGGCCGCTGCAGGTACCAGGAAAGGCATGAAGATTCTCGTCG-3’ (SEQ ID NO: 95) (左側)、5’-GGTACCTGCAGCGGCCGCTCGAGAGCTCCTGGTAAAA GTTAAACTTGGGGAGAATG-3’ (SEQ ID NO: 96)及5’-ACGAAGCTTGGAA GCTGCTGCCGTATACGTGTTCTTAG-3’ (SEQ ID NO: 97) (右側)。使用基因剪接方法藉由如Horton
等人,Methods Enzymol., 1993; 217:270-9中所述之重疊延伸將兩個片段連結在一起,該文獻之全文皆併入本文中。用EcoRI及HindIII消化所得片段且將其選殖至相同切割之質體pVM-1中以產生pIB2R。藉由DNA測序確認B2R之側接序列。
pIB2R-SSE-mIRF3. 用KpnI及SacI消化pITK-SSE-mIRF3。對含有SSE-mIRF3之片段進行凝膠純化且將其選殖至相同切割之質體pIB2R中以產生pIB2R-SSE-mIRF3。藉由DNA測序確認SSE-mIRF3之DNA序列。
pIA56R-11K-MDNA11. 由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV 11K啟動子控制下之長效IL-2超因子(MDNA11) (Merchant R
等人,Jounral for immunotherapy of cancer.2022, 10(1),其全文皆併入本文中)。用KpnI及SacI消化合成片段且將其選殖至相同切割之質體pIA56R中以產生pIA56R-11K-MDNA11。藉由DNA測序確認合成11K-MDNA11之DNA序列。
pIA56R-mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12. 用PstI及SacI消化pIA56R-mH5-hFGL1。對含有骨架質體及mH5啟動子之片段(pIA56R-mH5)進行凝膠純化。由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV 11K啟動子控制下之含有小鼠CXCL9 (mCXCL9)及小鼠單鏈IL-12 (mscIL-12)之DNA片段mCXCL9-11K-mscIL-12 (Lieschke GJ
等人,Nature biotechnology.1997, 15(1):35-40,其全文皆併入本文中),且用PstI及SacI消化,然後選殖至相同切割之質體pIA56R-mH5中以產生pIA56R-mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12。藉由DNA測序確認mCXCL9-11K-mscIL-12之DNA序列。
pIA56R-11K-MDNA11T. 使用基因剪接方法藉由重疊延伸突變合成的11K-MDNA11片段以引入「麩醯胺酸-126至蘇胺酸」突變,如Mo F
等人,Nature 2021, 597(7877):544-8中所述,該文獻之全文皆併入本文中。所得片段稱為11K-MDNA11T,然後將其用KpnI及SacI消化且選殖至相同切割之質體pIA56R中以產生pIA56R-11K-MDNA11T。藉由DNA測序確認11K-MDNA11T之DNA序列。
質體 pITK-SSE-mIRF3. 由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV SSE啟動子控制下之小鼠IRF3 cDNA。用PstI及SacI消化合成片段且將其選殖至實例3中所述之相同切割之質體pITK-SSE中以產生pITK-SSE-mIRF3。藉由DNA測序確認SSE-mIRF3之DNA序列。
pITK-SSE-hIRF3. 用PstI及SacI消化pITK-SSE-hFGL1tm。對含有骨架質體及SSE啟動子之片段(pITK-SSE)進行凝膠純化。由IDT (Coralville, IA)合成人類IRF3 (干擾素調節因子3) cDNA且用PstI及SacI消化,然後將其選殖至相同切割之質體pITK-SSE中以產生pITK-SSE- hIRF3。藉由DNA測序確認SSE-hIRF3之DNA序列。
質體 pIA56R-mH5-hCXCL9-11k-hscIL-12. 用PstI及SacI消化pIA56R-mH5-hFGL1。對含有骨架質體及mH5啟動子之片段(pIA56R-mH5)進行凝膠純化。由IDT (Coralville, IA)合成處於VACV 11K啟動子控制下之含有人類CXCL9 (hCXCL9)及人類單鏈IL-12 (hscIL-12)之DNA片段hCXCL9-11K-hscIL-12 (Lieschke GJ
等人,Nature biotechnology.1997, 15(1):35-40,其全文皆併入本文中),且用PstI及SacI消化,然後將其選殖至相同切割之質體pIA56R-mH5中以產生pIA56R-mH5-hCXCL9-11K-hscIL-12。藉由DNA測序確認hCXCL9-11K-hscIL-12之DNA序列。
為產生
表 E9中所列之重組痘瘡病毒,用母體病毒以0.1之MOI將CV-1細胞感染1小時,且然後用其各別轉移載體(參見
表 E9)藉由使用jetPRIME活體外DNA及siRNA轉染試劑(Polyplys-transfection Inc, New Your, NY)轉染。在感染後兩天,收穫經感染/轉染之細胞且選擇重組病毒並如Falkner FG
等人, J. Virol.1990, 64(6):3108-11中所述實施噬菌斑純化,該文獻之全文皆併入本文中。
表 E9匯總所產生之重組VACV株,包括其產生中所用之母體病毒及轉移載體。
表 E9
B. 使用 SL-4 小鼠結腸腺癌模型評價經改造具有免疫基因之重組痘瘡病毒
重組 VACV | 母體病毒 | 轉移載體 | 基因型 |
VIR94 (SEQ ID NO: 48) | VIR13 (SEQ ID NO: 4) | pIB2R | J2R及B2R被破壞 |
VIR100 (SEQ ID NO: 80) | VIR93 (SEQ ID NO: 49) | pIB2R | B2R被破壞;SSE-mIRF3插入J2R處 |
VIR103 (SEQ ID NO: 82) | VIR86 (SEQ ID NO: 47) | pIB2R-SSE-mIRF3 | SSE-hmLIGHT插入A35R處;mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK插入J2R處;SSE-mIRF3插入B2R處 |
VIR105 (SEQ ID NO: 84) | VIR100 (SEQ ID NO: 80) | pIA56R-11K-MDNA11 | B2R被破壞;SSE-mIRF3插入J2R處;11K-MDNA11插入A56R處 |
VIR106 (SEQ ID NO: 85) | VIR100 (SEQ ID NO: 80) | pIA56R-mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12 | B2R被破壞;SSE-mIRF3插入J2R處;mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12插入A56R處 |
VIR109 (SEQ ID NO: 86) | VIR102 (SEQ ID NO:81) | pIA56R-mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12 | SSE-iDED插入J2R處;SSE-mIRF3插入B2R處;mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12插入A56R處 |
VIR111 (SEQ ID NO: 87) | VIR103 (SEQ ID NO: 82) | pIA56R-11K-MDNA11 | SSE-hmLIGHT插入A35R處;mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK插入J2R處;SSE-mIRF3插入B2R處;11K-MDNA11插入A56R處 |
VIR113 (SEQ ID NO: 88) | VIR103 (SEQ ID NO: 82) | pIA56R-11K-MDNA11T | SSE-hmLIGHT插入A35R處;mH5-抗VEGF-抗Ang2-SEL-VK插入J2R處;SSE-mIRF3插入B2R處;11K-MDNA11T插入A56R處 |
VIR114 (SEQ ID NO: 89) | VIR104 (SEQ ID NO: 83) | pIA56R-11K-MDNA11 | F14.5L與CRASP-2融合;CPXV012、018及203插入J2R處;SSE-mIRF3插入B2R處;11K-MDNA11插入A56R處 |
VIR115 (SEQ ID NO: 90) | VIR104 (SEQ ID NO: 83) | pIA56R-mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12 | F14.5L與CRASP-2融合;CPXV012、018及203插入J2R處;SSE-mIRF3插入B2R處;mH5-mCXCL9-11K-mscIL-12插入A56R處 |
VIR123 (SEQ ID NO: 91) | VIR94 (SEQ ID NO: 48) | pITK-SSE-hIRF3 | B2R被破壞;SSE-hIRF3插入J2R處 |
VIR127 (SEQ ID NO: 92) | VIR123 (SEQ ID NO: 91) | pIA56R-mH5-hCXCL9-11K-hscIL-12 | B2R被破壞;SSE-hIRF3插入J2R處;mH5-hCXCL9-11K-hscIL-12插入A56R處 |
VIR128 (SEQ ID NO: 93) | VIP02 (SEQ ID NO: 1) | pITK-SSE-hIRF3 | SSE-hIRF3插入J2R處 |
使用SL-4 GFP小鼠結腸腺癌模型活體內評估VIR 100、VIR103、VIR105、VIR106、VIR109、VIR113、VIR114及VIR115之腫瘤抑制活性。向5-6週齡之雌性C57BL/6小鼠在小鼠之右側腹中植入100 μL PBS中之5 × 10
5個SL-4 GFP細胞。在本實驗中,用靜脈內劑量之1 × 10
8PFU之每一所指示病毒治療小鼠一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。
如
圖 22A-22H中所顯示,與媒劑治療之對照相比,用VIR94治療之小鼠似乎具有輕微的腫瘤體積減小。分別如
圖 22A及
圖 22B中所顯示,與VIR94及媒劑對照相比,VIR100及VIR103具有輕微的腫瘤體積減小。如分別針對VIR105、VIR106、VIR109、VIR113、VIR114及VIR115之
圖 22C-22H中所顯示,與媒劑治療之對照小鼠及VIR94治療之小鼠相比,該等小鼠皆具有腫瘤大小之統計學上顯著減小。(* = p ≤ 0.05;** = p ≤ 0.01;*** = p ≤ 0.001)。另外,VIR106及VIR115接近根除腫瘤。該等結果指示,經改造以含有免疫蛋白(例如IL-12、CXCL9、MDNA11及MDNA11T)之重組痘瘡病毒具有增強及強效的抗腫瘤性質。
C. 經改造具有 MDNA11 或突變體 MDNA11T 之重組痘瘡病毒之比較
MDNA11T (SEQ ID NO: 98)係突變體MDNA11,其係長效IL-2超因子,以增加MDNA11之免疫刺激性質。為測試MDNA11T突變體與母體病毒或具有MDNA11之重組病毒相比是否具有增加的減小腫瘤質量之效力,使用SL-4 GFP小鼠結腸腺癌模型 活體內評估VIR113,與含有MDNA11之VIR111以及VIR111及VIR113之母體株VIR103相比較。向5-6週齡之雌性C57BL/6小鼠在小鼠之右側腹中植入100 μL PBS中之5 × 10
5個SL-4 GFP細胞。在本實驗中,用靜脈內劑量之1 × 10
8PFU之每一所指示病毒治療小鼠一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。
如
圖 23A中所顯示,與母體VIR103相比,VIR111並未減小腫瘤體積。與VIR 111及VIR103相比,VIR113具有腫瘤體積之顯著減小,此指示與含有非突變MDNA11之病毒及不含MDNA11或MDNA11T之重組病毒相比,編碼MDNA11T之病毒具有增加的抗腫瘤功效。
圖 23B顯示自野生型人類IL-2 (wt hIL-2)產生MDNA11及MDNA11T二者之方式之示意圖。
D ,使用路易斯肺癌小鼠模型 (Lewis lung carcinoma mouse model) 評價經改造具有免疫基因之重組痘瘡病毒
使用路易斯肺癌小鼠癌症模型 活體內評估SL-4小鼠模型(VIR106、VIR113及VIR115)中腫瘤體積減小最大之三種株,以評估其對其他癌症之效力。向6-7週齡之雌性C57BL/6小鼠在小鼠之右側腹中植入100 μL PBS中之1 × 10
6個LLC1細胞。在本實驗中,用靜脈內劑量之1 × 10
8PFU之每一所指示病毒治療小鼠一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。
如
圖 24A中所顯示,與在整個測試時段內腫瘤持續生長之媒劑治療之對照相比,VIR106在治療後6天內治癒100%之腫瘤,且無可偵測到之腫瘤體積。VIR106與媒劑治療之對照之間無可偵測到之重量差異,此指示重組痘瘡病毒係無毒的(
圖 24B)。
圖 24C顯示VIR106治療之小鼠在治療後8天不具可偵測到之腫瘤之結果。如
圖 24D中所顯示,VIR113顯示與路易斯肺癌經治癒之小鼠相似之結果,一隻復發之小鼠除外。VIR113亦未顯示對體重之毒性(
圖 24E)。VIR115導致腫瘤體積之統計學上顯著減小,如
圖 23F中所顯示,同時未導致體重中可見之毒性(
圖 24G)。在本研究中,VIR115亦治癒50%之路易斯肺癌小鼠(數據未顯示)。該等結果證實,經改造具有免疫基因之重組痘瘡病毒對多種癌症模型係有效的。
E. 用黑色素瘤小鼠模型評價經改造具有免疫基因之重組痘瘡病毒
使用黑色素瘤小鼠癌症模型活體內進一步評估三種株VIR106、VIR113及VIR115以評估其對其他癌症之效力。向5-6週齡之雄性C57BL/6小鼠在小鼠之右側腹中植入100 μL PBS中之1 × 10
6個B16-F10 RFP細胞。在本實驗中,用靜脈內劑量之1 × 10
8PFU之每一所指示病毒治療小鼠一次。分別使用游標卡尺及電子秤每週兩次量測腫瘤體積及體重。藉由量測垂直次要尺寸(W)及主要尺寸(L)來估計腫瘤體積。用式(W²×L)/2計算近似腫瘤體積。
圖 25A顯示,與媒劑治療之對照小鼠相比,VIR106顯著減小腫瘤體積。與截至治療後10天全部死亡之媒劑治療之小鼠相比,VIR106保護小鼠且在測試時段(24天)內產生100%存活率,如
圖 25B中所顯示。對VIR113觀察到相似之結果,其中腫瘤體積與媒劑治療之對照相比減小,如
圖 25C中所顯示,且與截至治療後10天全部死亡之媒劑治療之小鼠相比,在測試時段(治療後24天)內產生100存活%,如
圖 25D中所顯示。與媒劑治療之對照小鼠相比,VIR115在統計學上顯著減小腫瘤體積方面亦係有效的,如
圖 25E中所顯示,且與截至治療後10天全部死亡之媒劑治療之小鼠相比,在測試時段(治療後24天)內產生100存活%,如
圖 25F中所顯示。
F. 在用重組痘瘡病毒感染後量化免疫蛋白
用各種重組痘瘡病毒各自以10之MOI感染B16-F10及Hela S3癌細胞。在感染後4小時,藉由低速離心收穫細胞且使用RIPA溶解緩衝液(VWR, Solon, OH)溶解。將Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合劑(Thermo Scientific, Rockford, IL)新鮮添加至溶解緩衝液中。使用RC DC蛋白質量化套組(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)確定蛋白質量。使正規化蛋白質量經歷SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)且轉移至PVDF膜上用於西方印跡(Western blotting),其用一級抗體進行印跡,然後用辣根過氧化物酶(HRP)結合之二級抗體進行印跡。用化學發光偵測套組(ClarityMax Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)及Azure Biosystems c300 (Azure Biosystems, Dublin, CA)使蛋白質可視化。針對磷酸-IRF3 (1:1,000)及總IRF3之抗體以及HRP連接之抗兔IgG (1:1000)來自Cell Signaling Technology (Danvers, MA)。抗β-肌動蛋白抗體(1:1,000)來自Novus Biologicals (Centennial, CO)。使用熱不活化VIR13 (iVIR13)作為刺激磷酸-IRF3之陽性對照且使用β肌動蛋白作為負載對照。
如
圖 26A中所顯示,與VIR13相比,表現外生mIRF3 (VIR93)導致磷酸-IRF3之水準稍有增加,而破壞B2R基因(VIR94)導致磷酸-IRF3水準顯著增加,此指示IRF3路徑之活化。表現外生mIRF3及破壞B2R基因之組合(VIR100、VIR106、VIR113及VIR115)產生小鼠磷酸-IRF3之最高水準,甚至高於陽性對照iVIR13。有趣的是,hIRF3 (VIR123及VIR127,其皆具有hIRF3基因)可在小鼠癌細胞中磷酸化。如
圖 26B中所顯示,在人類Hela S3細胞中獲得相似之結果。類似地,表現外生hIRF3及破壞B2R基因之組合(VIR123及VIR127)產生人類磷酸-IRF3之最高水準,甚至高於陽性對照iVIR13。破壞B2R (VIR94)產生高於表現外生人類IRF3 (VIR128)之人類磷酸-IRF3水準。另外,mIRF3 (VIR100、VIR106、VIR113及VIR115)亦可在人類癌細胞中磷酸化。
為進一步量化重組痘瘡病毒對干擾素路徑之誘導,用每一病毒以10之MOI感染B16-F10及Hela S3細胞。在感染後24小時,收穫上清液。分別使用Verikine-HS小鼠干擾素β血清ELISA套組及Verikine-HS人類干擾素β血清ELISA套組(PBL Assay Science, Piscataway NJ)來量化小鼠及人類干擾素-β。分別使用小鼠CXCL9/MIG Duoset ELISA及人類CXCL9/MIG Duoset ELISA (Biotechne/R & D Systems, Minneapolis, MN)來量測小鼠及人類CXCL9。使用HEK-Blue IL-12細胞(InvivoGen, San Diego, CA)來量化人類及小鼠生物活性IL-12。
表 E10顯示干擾素-β(IFN-β)產生之結果。與模擬物處理之細胞相比,VIR100、VIR106、VIR113、VIR115、VIR128、VIR123及VIR127皆具有增加的人類IFN-β水準,且彼等病毒皆具有增加的小鼠IFN-β,VIR128除外,此與IRF3路徑之活化一致,如
圖 26中所顯示。與編碼小鼠IRF3之重組病毒相比,編碼人類IRF3之VIR123及VIR127具有增加的人類IFN-β產生。
表 E10
感染 | B16-F10 | Hela S3 |
小鼠IFN-β(pg/ml) | 人類IFN-β(pg/ml) | |
模擬物 | BLOD* | BLOD |
iVIR13 | 5881.81 | 1428.25 |
VIR13 | BLOD | BLOD |
VIR93 | BLOD | BLOD |
VIR94 | BLOD | BLOD |
VIR100 | 1.40 | 2.23 |
VIR106 | 1.28 | 1.97 |
VIR113 | 1.51 | 5.44 |
VIR115 | 2.39 | 3.17 |
VIR128 | BLOD | 6.19 |
VIR123 | 0.88 | 85.97 |
VIR127 | 0.68 | 51.56 |
*BLOD:低於偵測限值(對於mIFN-β係0.94 pg/ml;對於hIFN-β係1.2 pg/ml)。 |
表 E11顯示量化B16-F10及Hela S3-12細胞中之蛋白質產生之CXCL9 ELISA及IL-12生物分析之結果。編碼小鼠CXCL9基因之病毒(VIR106及VIR115)具有可偵測到之小鼠CXCL9水準,此指示病毒在遞送基因及驅動表現方面係有效的。對VIR127獲得相似之結果,其係唯一表現人類CXCL9之重組病毒及唯一具有可偵測到之人類CXCL9水準之重組病毒。在人類及小鼠細胞之VIR106、VIR115及VIR127中偵測到IL-12產生,其係編碼人類或小鼠IL-12之重組病毒。iVIR 13能夠在人類Hela S3細胞中誘導低水準之IL-12,但不能在小鼠B16-F10細胞中誘導。有趣的是,未攜帶CXCL9或IL-12基因、但會編碼MDNA11T及hmLIGHT之VIR113能夠誘導mCXCL9在B16-F10細胞中之表現及IL-12在B16-F10及Hela S3細胞中之表現,此指示MDNA11T及/或hmLIGHT足以驅動該等路徑之活化。
表 E11
感染 | CXCL9 (ng/ml) | IL-12 (ng/ml) | ||
B16-F10 | Hela S3 | B16-F10 | Hela S3 | |
小鼠CXCL9 | 人類CXCL9 | |||
模擬物 | BLOD* | BLOD | BLOD | BLOD |
iVIR13 | BLOD | BLOD | BLOD | 3.64 |
VIR13 | BLOD | BLOD | BLOD | BLOD |
VIR93 | BLOD | BLOD | BLOD | BLOD |
VIR94 | BLOD | BLOD | BLOD | BLOD |
VIR100 | BLOD | BLOD | BLOD | BLOD |
VIR106 | 664.42 | BLOD | 2790.41 | 3329.36 |
VIR113 | 381.39 | BLOD | 2545.02 | 1811.06 |
VIR115 | 500.09 | BLOD | 3069.89 | 964.81 |
VIR128 | BLOD | BLOD | BLOD | BLOD |
VIR123 | BLOD | BLOD | BLOD | BLOD |
VIR127 | BLOD | 7058.41 | 4519.37 | 1442.08 |
*BLOD:低於偵測限值(對於mCXCL9係15.6 pg/ml;對於hCXCL9係62.5 pg/ml;對於IL-12係1.56 ng/ml)。 |
本發明之范圍不欲限於具體揭示之實施例,提供該等實施例例如欲說明本發明之各個態樣。根據本文之描述及教示將明瞭對所述組合物及方法之各種修改。該等變化可在不背離本揭示案之真實範圍及精神的情況下進行實踐且意欲在本揭示案之范圍內。
圖 1繪示用VIP01-06 VACV純系分離物感染後,BT-549、A549、LOX-IMVI、HCC-2998及COLO-205細胞之細胞存活百分比。對於VIP01、VIP02、VIP03、VIP04、VIP05及VIP06中之每一者,各條自左至右對應於BT-549、A549、LOX-IMVI、HCC-2998及COLO-205細胞。
圖 2顯示4T1及B16-F10感染之細胞中細胞外包膜病毒(EVV)產生之VCP02及VIP02百分比。
圖 3繪示用VCP02 (正方形)、VIP01 (三角形)、VIP02 (菱形)及媒劑(圓形)之單一靜脈內遞送感染後,4T1小鼠乳癌模型中之腫瘤體積。
圖 4繪示以MOI=0.01 (淺色條)及MOI=0.1 (深色條)經VIP02感染之不同癌細胞類型之2-D (
圖 4A)及3-D (
圖 4B)細胞培養物中的細胞存活百分比。
圖 5繪示一系列示意圖,其代表衍生自母體VIP02之隱形重組純系VIR27、VIR37及VIR46之基因體結構。
圖 6繪示與隱形溶瘤病毒純系VIR27、VIR37及VIP02一起培育後,人類及小鼠血清中宿主補體抑制之百分比。
圖 7繪示用VIP02、VIR27及媒劑之單一靜脈內遞送感染後,4T1小鼠乳癌模型中之腫瘤體積。
圖 8繪示用VIR46、VIR52及媒劑之單一靜脈內遞送感染後,4T1小鼠乳癌模型中之腫瘤體積。
圖 9繪示一系列示意圖,其代表免疫刺激溶瘤病毒VIR49及VIR52之基因體結構。
圖 10繪示用VIR49及VIR52之單一靜脈內遞送感染後,4T1小鼠乳癌模型中之腫瘤體積。
圖 11繪示一系列示意圖,其代表抗血管生成溶瘤病毒VIR71之基因體結構。
圖 12A及
圖 12B繪示用VIR71、VIR52及媒劑之單一靜脈內遞送感染後,4T1小鼠乳癌模型中之腫瘤體積(圖12A),及中之腫瘤體積。
圖 13繪示一系列示意圖,其代表細胞凋亡誘導溶瘤病毒VIR40、VIR41及VIR42以及對照病毒VIR13之基因體結構。
圖 14繪示一系列圖,其量化在利米多賽或作為對照之DMSO存在下,細胞凋亡誘導病毒純系VIR13、VIR40、VIR41及VIR42在最初以0.01及/或10之MOI感染之原代健康HBE、HME及MME細胞中之病毒複製。
圖 15繪示一系列圖,其量化在利米多賽或作為對照之DMSO存在下,細胞凋亡誘導病毒純系VIR13、VIR40、VIR41及VIR42在最初以0.01及/或10之MOI感染之BT-549乳癌細胞(
圖 15A)、Hs578T乳癌細胞(
圖 15B)、MCF-7及4T1乳癌細胞(
圖 15C)、A549及M14肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 15D)、HCT-15 MSI結腸癌細胞(
圖 15E)、HCT-116 MSI結腸癌細胞(
圖 15F)及KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 15G)中之病毒複製。
圖 16繪示一系列圖,其量化在利米多賽或作為對照之DMSO存在下,最初以0.01及/或10之MOI感染之COLO205癌細胞(
圖 16A)、HCC-2998癌細胞(
圖 16B)及HT-29癌細胞(
圖 16C)中之病毒複製。
圖 17繪示一系列圖,其量化在利米多賽或作為對照之DMSO存在下,細胞凋亡誘導病毒純系VIR13、VIR40、VIR41及VIR42在最初以0.01及/或0.1之MOI感染之人類原代支氣管/氣管上皮細胞(HBE,
圖 17A)、人類原代乳腺上皮細胞(HME,
圖 17B)、鼠類原代乳腺上皮細胞(MME)及人類原代結腸上皮細胞(HCE,
圖 17C)中之細胞毒性。
圖 18繪示一系列圖,其量化在利米多賽或作為對照之DMSO存在下,細胞凋亡誘導病毒純系VIR13、VIR40、VIR41及VIR42在最初以0.01及/或0.1之MOI感染之BT-549乳癌細胞(
圖 18A)、Hs578T乳癌細胞(
圖 18B)、4T1乳癌細胞(
圖 18C)、DU-145前列腺癌細胞(
圖 18D)、PC-3前列腺癌細胞(
圖 18E)、A549肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 18F)、M14肺癌及黑色素瘤癌細胞(
圖 18G)、COLO 320 DM及HCT-15 MSI結腸癌細胞(
圖 18H)、HCT-116及KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 18I)、KM12 MSI結腸癌細胞(
圖 18J)及SW48 MSI結腸癌細胞(
圖 18K)中之細胞毒性。
圖 19繪示一系列圖,其量化在利米多賽或作為對照之DMSO存在下,細胞凋亡誘導病毒純系VIR13、VIR40、VIR41及VIR42在最初以0.01及/或0.1之MOI感染之COLO205 MSS結腸癌細胞(
圖 19A)、HCC-2998結腸癌細胞(
圖 19B)、HT-29細胞(
圖 19C)、LS123細胞(
圖 19D)、LS174T細胞(
圖 19E)、SW620細胞(
圖 19F)及WiDR細胞(
圖 19G)中之細胞毒性。
圖 20 顯示用VIR13之單一靜脈內注射感染後,SL-4小鼠結腸腺癌模型中腫瘤生長之完全抑制。
圖 21A-E繪示一系列圖,其顯示在投與VIR13、VIR41或對照後(
圖 21A),在投與VIR13、VIR86或對照後(
圖 21B),在投與VIR13、VIR93或對照後(
圖 21C),在投與VIR13、VIR94或對照後(
圖 21D),在投與VIR13、VIR96或對照後(
圖 21E),小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤大小。
圖 21F繪示顯示投與VIR13、VIR41、VIR86、VIR93、VIR94、VIR96或對照之小鼠隨時間(治療後天數)之體重(g)的圖。
圖 22A-H繪示一系列圖,其顯示在投與VIR94、VIR100或對照後(
圖 22A),在投與VIR94、VIR103或對照後(
圖 22B),在投與VIR94、VIR105或對照後(
圖 22C),在投與VIR94、VIR106或對照後(
圖 22D),在投與VIR94、VIR109或對照後(
圖 22E),在投與VIR94、VIR113或對照後(
圖 22F),在投與VIR94、VIR114或對照後(
圖 22G),或在投與VIR94、VIR115或對照後(
圖 22H),小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤體積。* = p ≤ 0.05;** = p ≤ 0.01;*** = p ≤ 0.001。
圖 23A繪示顯示在投與VIR103、VIR111或VIR113後,小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤大小之圖。
圖 23B顯示自野生型人類IL-2 (wt hIL-2)產生MDNA11及MDNA11T二者之方式之示意圖。* = p ≤ 0.05;** = p ≤ 0.01。
圖 24A繪示顯示在投與VIR106或對照後,小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤體積之圖。
圖 24B繪示顯示在投與VIR106或對照後,小鼠隨時間(治療後天數)之體重(g)之圖。*** = p ≤ 0.001。
圖 24C顯示在投與VIR106或對照後第8天時拍攝之小鼠上之腫瘤位置的影像,其顯示在對照小鼠中存在可偵測之腫瘤,但在用VIR106治療之小鼠中缺乏可偵測之腫瘤。
圖 24D-E繪示顯示投與VIR113或對照之小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤體積(
圖 24D)及重量(g) (
圖 24E)之圖。
圖 24F-G繪示顯示投與VIR115或對照之小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤體積(
圖 24F)及重量(g) (
圖 24G)之圖。
圖 25A-F繪示一系列圖,其顯示在投與VIR106或對照後(
圖 25A及
圖 25B),在投與VIR113或對照後(
圖 25C及
圖 25D),或在投與VIR115或對照後(
圖 24E及
圖 25F),小鼠中隨時間(治療後天數)之腫瘤體積及重量(g)。* = p ≤ 0.05;** = p ≤ 0.01;*** = p ≤ 0.001。
圖 26A-B繪示西方墨點(Western blot)分析,其顯示人類磷酸-IRF3、小鼠磷酸-IRF3、人類IRF3、小鼠IRF3及β肌動蛋白在經模擬物、iVIR13、VIR13、VIR93、VIR94、VIR100、VIR106、VIR113、VIR115、VIR123或VIR127感染之B16-F10細胞(
圖 26A)及Hela S3細胞(
圖 26B)中之表現。
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Claims (302)
- 一種重組溶瘤痘瘡病毒,其包含: B2R之不活化突變; 編碼干擾素調節因子3 (IRF3)之異源核酸;及 編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之至少一種異源核酸。
- 如請求項1之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之異源核酸。
- 如請求項1或2之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸。
- 如請求項1之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼CXCL9之異源核酸及編碼IL-12之異源核酸。
- 如請求項1至4中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中: 該CXCL9係人類CXCL9且包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該CXCL9係小鼠CXCL9且包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至5中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中: 該IL-12係人類單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該IL-12係小鼠單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼IL-2之異源核酸。
- 如請求項7之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該IL-2包含SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中之任一者中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98、100、101、104及105中任一者之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項7或8之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該IL-2係IL-2超因子。
- 如請求項9之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該IL-2超因子係H9、H9T、MDNA11或MDNA11T,且其中: 該H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該MDNA11 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該MDNA11T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項6或7之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該IL-2超因子係MDNA11T,且該MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至11中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含一或多種選自由以下組成之群之異源基因產物:補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫刺激蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
- 如請求項1至12中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該B2R之不活化突變係B2R基因座之全部或一部分缺失。
- 如請求項13之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該缺失足以使經編碼之B2R基因產物無功能。
- 如請求項1至14中任一項之重組溶瘤病毒,其中該B2R之不活化突變之特徵在於編碼IRF3之該異源核酸及/或編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸中之至少一者插入該等B2R基因座中。
- 如請求項1至15中任一項之重組溶瘤病毒,其中該B2R之不活化突變之特徵在於編碼趨化介素配位體9 (CXCL9)及/或IL-12之該異源核酸插入該等B2R基因座中。
- 如請求項1至16中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中: 編碼IRF3之該異源核酸插入該病毒基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中;及/或 編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸中之該至少一者插入該病毒之該基因體中之該HA、該J2R、該F14.5L、該A56R、該痘瘡生長因子、該A35R、該A49R、該A55R、該B14R、該C4L、該C6L、該C16L、該NIL/N2L、該E2L/E3L、該K1L/K2L、該K7L、該過氧化物歧化酶基因座、該7.5K、該C2L-F3L、該C4L-F1L、該C7-K1L、該B13R+B14R、該A26L或該I4L基因座中。
- 如請求項1至17中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體係自母體痘瘡病毒修飾而來,該母體痘瘡病毒 具有與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列、視情況地SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
- 如請求項1至18中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該母體痘瘡病毒之該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列; (ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化; (iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列; (iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及 (v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
- 如請求項1至19中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該母體病毒之該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G); (ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T); (iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G; (iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G; (v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C); (vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT; (vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA; (viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A); (ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及 (x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
- 如請求項1至20中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
- 如請求項1至14及17至21中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中: 編碼IRF3之該異源核酸插入該病毒之該基因體中之該J2R (胸苷激酶)基因座中;且 編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸,其中編碼CXCL9及IL-12之該異源核酸插入該病毒之該基因體中之該A56R基因座中。
- 如請求項1至14及17至22中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項1至21中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼IRF3之該異源核酸插入該病毒之該基因體中之該B2R (病毒cGAMP特異性核酸酶)基因座中;且 編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼CXCL9及IL-12之異源核酸,其中編碼CXCL9及IL-12之該異源核酸插入該病毒之該基因體中之該A56R基因座中。
- 如請求項1至24中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
- 如請求項25之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型死亡效應結構域(iDED)。
- 如請求項26之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該iDED包含SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:27中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項26或27之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼iDED之異源核酸插入該病毒之該基因體中之該J2R基因座中或替代該基因座。
- 如請求項1至21及24至28中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項1至29中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之異源核酸。
- 如請求項30之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。
- 如請求項31之重組溶瘤痘瘡病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含: (i) SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列, (ii) SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 21中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及 (iii) SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 22中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至32中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼補體抑制劑之異源核酸。
- 如請求項33之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該補體抑制劑係伯氏疏螺旋體( Borrelia burgdorferi)補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)。
- 如請求項34之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼CRASP-2之該異源核酸與病毒膜基因、視情況地F14.5L融合,以產生編碼融合蛋白之融合基因。
- 如請求項35之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該融合蛋白包含融合至由該病毒膜基因編碼之病毒膜蛋白之該CRASP-2。
- 如請求項36之重組溶瘤病毒,其中該病毒膜蛋白係F14.5L,視情況地其中該融合物處於F14.5L之C末端。
- 如請求項1至22、24至28及30至37中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項1至21、25至28及30至37中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中編碼IRF3之該異源核酸插入該病毒之該基因體中之該B2R (病毒cGAMP特異性核酸酶)基因座中或替代該基因座;且 編碼一或多種細胞介素及/或趨化介素之該至少一種異源核酸包含編碼IL-2之異源核酸,其中該IL-2係IL-2超因子,即MDNA11T。
- 如請求項1至39中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其進一步包含編碼免疫刺激蛋白之異源核酸,及/或編碼一或多種抗血管生成蛋白之異源核酸。
- 如請求項40之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該免疫刺激蛋白係重組LIGHT。
- 如請求項41之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組LIGHT包含SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:30中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項40至42中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。
- 如請求項43之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白包含抗VEGF抗體及/或抗Ang2抗體。
- 如請求項43或44之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。
- 如請求項45之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:23中所述之該序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至22、24至28、30至37及39至46中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 一種重組溶瘤病毒,其包含: 至少一種病毒基因之不活化突變;及 編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中該一或多種異源基因產物係或包含免疫調節蛋白、補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子或細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
- 一種重組溶瘤病毒,其包含編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸,其中該一或多種異源基因產物係或包含補體抑制劑、T細胞或NK細胞逃避劑、免疫調節蛋白、抗血管生成蛋白、干擾素調節因子、細胞凋亡誘導蛋白或前述任一者之組合。
- 如請求項48或50之重組溶瘤病毒,其中該溶瘤病毒係痘瘡病毒、單純疱疹病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒(Maraba virus,MARAV)、麻疹病毒(MV)、腺病毒、黏液病毒、羊痘病毒、小病毒、浣熊痘病毒、柯沙奇病毒(coxsackievirus)、里奧病毒(reovirus)、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)、塞內卡谷病毒(Seneca valley virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、腮腺炎病毒、流感病毒、埃可病毒(echovirus)及小兒麻痺病毒(PV)。
- 如請求項48至50中任一項之重組溶瘤病毒,其中該溶瘤病毒係痘瘡病毒。
- 如請求項48至51中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之核酸基因體係自母體痘瘡病毒修飾而來,該母體痘瘡病毒具有與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少99%序列一致性之核酸基因體,視情況地其中該母體痘瘡病毒具有SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體。
- 一種重組溶瘤病毒,其包含自母體痘瘡病毒基因體修飾而來之核酸基因體,該母體痘瘡病毒基因體與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少99%序列一致性,視情況地其中該母體痘瘡病毒具有SEQ ID NO:1中所述之核酸基因體,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含插入該基因體中之編碼一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸。
- 如請求項52或53之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該母體痘瘡病毒之該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列; (ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化; (iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列; (iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及 (v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
- 如請求項52至54中任一項之重組溶瘤病毒,其中該母體痘瘡病毒基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G); (ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T) ; (iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G; (iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G; (v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶©; (vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT; (vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA; (viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A); (ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及 (x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
- 如請求項52至55中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
- 如請求項1至56中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,且其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列; (ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中該038 (K5L)基因產物發生變化; (iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列; (iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及 (v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中該182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
- 如請求項1至57中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒,且其中該重組溶瘤痘瘡病毒之該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G); (ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T); (iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G; (iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G; (v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C); (vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之該核酸序列CACTTATATAT; (vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之該核酸序列GTTTTCATTA; (viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A); (ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之該核酸序列TACAGACACC;及 (x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
- 如請求項48至58中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼該一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸中之至少一者插入該病毒之該基因體中之非必需基因或區域中。
- 如請求項48至59中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼該一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸中之至少一者插入該病毒之該基因體中之血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或I4L基因座中。
- 如請求項59之重組溶瘤病毒,其中插入該病毒之該基因體中之非必需基因或區域中的編碼該一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸中之每一者各自獨立地插入該病毒之該基因體中之該血球凝集素(HA)、該J2R (胸苷激酶)、該F14.5L、該A56R (血球凝集素)、該B2R、該痘瘡生長因子(VGF)、該A35R、該A49R、該A55R、該B14R、該C4L、該C6L、該C16L、該NIL/N2L、該E2L/E3L、該K1L/K2L、該K7L、該過氧化物歧化酶基因座、該7.5K、該C2L-F3L、該C4L-F1L、該C7-K1L、該B13R+B14R、該A26L或該I4L基因座中。
- 如請求項48、50至52及54至59中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含一或多種選自由以下組成之群之病毒基因:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L及其任一組合。
- 如請求項48、50至52、54至59及62中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因係或包含: (i) B2R; (ii) A35R; (iii) A35R及J2R; (iv) J2R; (v) B2R及J2R; (vi) A35R、B2R及J2R; (vii) B2R、J2R及A56R;或 (viii) A35R、B2R、J2R及A56R。
- 如請求項48、50至52及54至63中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變獨立地藉由以下來實現: 編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸中之至少一者插入該病毒之該基因體之基因座中; 該至少一種病毒基因之全部或一部分缺失;及/或 該至少一種病毒基因中之一或多個核酸取代。
- 如請求項48、50至52及54至64中任一項之重組溶瘤病毒,其中該不活化突變係該至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。
- 如請求項64或65之重組溶瘤病毒,其中: 該至少一種病毒基因之該缺失係病毒基因之完整基因ORF缺失。
- 如請求項64至66中任一項之重組溶瘤病毒,其中: 該缺失足以使該經編碼之病毒基因產物無功能。
- 如請求項64之重組溶瘤病毒,其中該一或多個核酸取代足以使該經編碼之病毒基因產物無功能。
- 如請求項48、50至52及54至68中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變之特徵在於編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸中之至少一者插入該等病毒基因座中。
- 如請求項69之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含B2R。
- 如請求項69或70之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含J2R。
- 如請求項69至71中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含A35R。
- 如請求項69至72中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含A56R。
- 如請求項69至73中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含B2R、J2R及A35R。
- 如請求項69至74中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含B2R、J2R、A35R及A56R。
- 如請求項69至75中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因包含B2R、J2R及A56R。
- 如請求項48至75中任一項之重組溶瘤病毒,其中: 編碼該一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入F14.5L中或替代F14.5L。
- 如請求項48至77中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼該一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入A35R中或替代A35R。
- 如請求項48至77中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼該一或多種異源基因產物之至少一種異源核酸插入J2R中或替代J2R。
- 如請求項48至79中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸。
- 如請求項48、50至52及54至80中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現。
- 如請求項80或81之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含一或多種免疫刺激蛋白。
- 如請求項80至82中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含一或多種細胞介素及/或趨化介素。
- 如請求項80至83中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含一或多種干擾素調節因子,視情況地IRF3。
- 如請求項84之重組溶瘤病毒,其中該一或多種干擾素調節因子係或包含干擾素調節因子3 (IRF3)。
- 如請求項80至85中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含干擾素調節因子3 (IRF3)及一或多種細胞介素及/或趨化介素。
- 如請求項80至86中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含一或多種選自由以下組成之群之免疫調節蛋白:LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9。
- 如請求項87之重組溶瘤病毒,其中該CXCL9係人類CXCL9且包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項87之重組溶瘤病毒,其中該CXCL9係小鼠CXCL9且包含SEQ ID NO: 106中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 106之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項87之重組溶瘤病毒,其中該IL-12係人類單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項87之重組溶瘤病毒,其中該IL-12係小鼠單鏈IL-12且包含SEQ ID NO: 102中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 102之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項80至91中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含IRF3。
- 如請求項92之重組溶瘤病毒,其中該IRF3係人類IRF3 (hIRF3)。
- 如請求項93之重組溶瘤病毒,其中該hIRF3包含SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 51中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項92之重組溶瘤病毒,其中該IRF3係小鼠IRF3 (mIRF3)。
- 如請求項95之重組溶瘤病毒,其中該mIRF3包含SEQ ID NO: 52中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 52中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項80至96中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50、80、82及84-93中之任一者中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項80至97中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含IRF3及一或多種選自由LIGHT、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白。
- 如請求項80至98中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含IL-2。
- 如請求項80至99中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含IL-12。
- 如請求項80至100中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含LIGHT。
- 如請求項80至101中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白包含CXCL9。
- 如請求項80至102中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種免疫調節蛋白係或包含: (i) IRF3; (ii) LIGHT; (iii) IRF3及LIGHT; (iv) IRF3及IL-2; (v) IRF3、CXCL9及IL-12; (vi) IRF3、LIGHT及IL-2; (vii) IRF3及CXCL9;或 (viii) IRF3、CXCL9及IL-2。
- 如請求項87至103中任一項之重組溶瘤病毒,其中該IL-2係人類IL-2。
- 如請求項87至104中任一項之重組溶瘤病毒,其中該IL-2係IL-2超因子。
- 如請求項105之重組溶瘤病毒,其中該IL-2超因子係H9、H9T、MDNA11或MDNA11T。
- 如請求項105之重組溶瘤病毒,其中: 該H9 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 100之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該H9T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 104之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該MDNA11 IL-2超因子包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 101之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列;或 該MDNA11T IL-2超因子包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 98之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項105至107中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該IL-2超因子係MDNA11或MDNA11T。
- 如請求項105至108中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該IL-2超因子係MDNA11T,該MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之該胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 98中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項87至109中任一項之重組溶瘤病毒,其中該LIGHT係重組LIGHT。
- 如請求項110之重組溶瘤病毒,其中該重組LIGHT係人類LIGHT蛋白或係其突變體。
- 如請求項110或111之重組溶瘤病毒,其中該重組LIGHT包含與SEQ ID NO: 30中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項110至112中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組LIGHT係人類LIGHT突變體(hmLIGHT),其係結合人類及小鼠LTβR及HVEM之人類LIGHT突變體。
- 如請求項110至113中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組LIGHT包含一或多個選自由以下組成之群之突變:位置138之蘇胺酸、位置160之甘胺酸、位置221之甘胺酸及位置222之離胺酸。
- 如請求項110至114中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 25中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項110至115中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組LIGHT包含SEQ ID NO: 25中所述之該序列。
- 如請求項110至116中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 11、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11、82、87及88中之任一者中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項87至117中任一項之重組溶瘤病毒,其中該IL-12係人類IL-12。
- 如請求項118之重組溶瘤病毒,其中該人類IL-12係人類單鏈IL-12 (hscIL-12)。
- 如請求項119之重組溶瘤病毒,其中該hscIL-12包含SEQ ID NO: 103中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 103中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項87至120中任一項之重組溶瘤病毒,其中該CXCL9係人類CXCL9。
- 如請求項121之重組溶瘤病毒,其中該人類CXCL9包含SEQ ID NO: 99中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 99中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項48至122中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸。
- 如請求項48、50至52及54至123中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現。
- 如請求項123或124之重組溶瘤病毒,其中該細胞凋亡誘導蛋白包含與能夠結合二聚化化學誘導劑(CID)之FKBP變異體融合之促細胞凋亡分子。
- 如請求項125之重組溶瘤病毒,其中該FKBP變異體係FKBP-F36V,視情況地其中該FKBP-F36V包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 56中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項125或126之重組溶瘤病毒,其中該二聚化化學誘導劑係AP1903 (利米多賽(Rimiducid))。
- 如請求項125至127中任一項之重組溶瘤病毒,其中該促細胞凋亡分子係或包含Fas、含Fas相關死亡結構域之蛋白質(FADD)之死亡效應結構域(DED)或半胱天冬酶,視情況地其中該半胱天冬酶係半胱天冬酶9。
- 如請求項123至128中任一項之重組溶瘤病毒,其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。
- 如請求項129之重組溶瘤病毒,其中該iDED包含SEQ ID NO: 27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 27中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項123至130中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 8或86中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 8或86中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項123至128中任一項之重組溶瘤病毒,其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型Fas (iFas)。
- 如請求項132之重組溶瘤病毒,其中該iFas包含SEQ ID NO: 28中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 28中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項123至128、132及134中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 9中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項123至128中任一項之重組溶瘤病毒,其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型半胱天冬酶9 (iCas9)。
- 如請求項135之重組溶瘤病毒,其中該iCas9包含SEQ ID NO: 26中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 26中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項123至128、135及136中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至137中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸。
- 如請求項48、50至52及54至138中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現。
- 如請求項138或139之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質。
- 如請求項138至140中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含一組蛋白質,其係或包含CPXV012、CPXV203及CPXV018蛋白。
- 如請求項140或141之重組溶瘤痘瘡病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含: (i) SEQ ID NO: 20 (CPXV012)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 20中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列, (ii) SEQ ID NO: 21 (CPXV0203)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 21中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列,及 (iii) SEQ ID NO: 22 (CPXV018)中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO: 22中所述之該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項140至142中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中由CPXV012-203-018編碼之該組蛋白質包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22中所述之該等胺基酸序列。
- 如請求項138至143中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 10、89及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10、89及90中之任一者中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至144中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸。
- 如請求項48、50至52及54至145中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸來實現。
- 如請求項145或146之重組溶瘤病毒,其中該一或多種補體抑制劑係伯氏疏螺旋體補體調節獲得性表面蛋白-2 (CRASP-2)及/或最小化補體調節因子H (miniFH)。
- 如請求項147之重組溶瘤病毒,其中該一或多種補體抑制劑係或包含CRASP-2。
- 如請求項148之重組溶瘤病毒,其中該CRASP-2包含SEQ ID NO: 18中所述之胺基酸序列,或具有與SEQ ID NO:18中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項147至149中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種補體抑制劑係或包含miniFH。
- 如請求項150之重組溶瘤病毒,其中該miniFH包含SEQ ID NO: 19中所述之胺基酸序列,或具有與SEQ ID NO:19中所述之該胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項145至151中任一項之重組溶瘤病毒,其中將編碼該一或多種補體抑制劑之該一或多種異源核酸引入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因。
- 如請求項152之重組溶瘤病毒,其中該融合蛋白包含融合至由該病毒膜基因編碼之病毒膜蛋白之該補體抑制劑。
- 如請求項152或153之重組溶瘤病毒,其中該病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中該融合物處於F14.5L蛋白之C末端。
- 如請求項152至154中任一項之重組溶瘤病毒,其中該融合蛋白納入細胞內成熟病毒(IMV)之外膜中。
- 如請求項152至155中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中: 該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 5中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 6中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 89中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 90中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至156中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸。
- 如請求項48、50至52及54至156中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種抗血管生成蛋白之一或多種異源核酸來實現。
- 如請求項157或158之重組溶瘤病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白係VEGF抑制劑、血管生成素抑制劑、versikine或前述任兩者或更多者之融合蛋白。
- 如請求項157至159中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或血管生成素抑制劑,視情況地Ang2抑制劑。
- 如請求項157至160中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白包含抗VEGF抗體及/或抗Ang2抗體。
- 如請求項159至161中任一項之重組溶瘤病毒,其中該VEGF抑制劑係抗VEGF抗體,視情況地抗VEGF單鏈抗體(scAb)。
- 如請求項159至162中任一項之重組溶瘤病毒,其中該血管生成素抑制劑係抗血管生成素-2 (Ang2)抗體,視情況地抗Ang2單鏈抗體(scAb)。
- 如請求項157至163中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體。
- 如請求項164之重組溶瘤病毒,其中該雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體包含SEQ ID NO: 23中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:23中所述之該序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項157至165中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種抗血管生成蛋白包含versikine。
- 如請求項166之重組溶瘤病毒,其中該versikine包含SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列,或包含與SEQ ID NO: 24中所述之該序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項157至167中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 13、47、82、87及88中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13、47、82、87及88中之任一者中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至168中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸。
- 如請求項48、50至52及54至169中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因中之一或多者之該不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種治療劑或診斷劑之一或多種異源核酸來實現。
- 如請求項169或170之重組溶瘤病毒,其中該一或多種治療劑或診斷劑尤其選自抗癌劑、抗轉移劑、抗血管生成劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、用於組織再生及將人類體細胞再程式化成多能性之基因、修飾受質以產生可偵測產物或信號或可由抗體偵測到之酶、可結合對比劑之蛋白質、用於光學成像或偵測之基因、用於PET成像之基因及用於MRI成像之基因。
- 如請求項169至171中任一項之重組溶瘤病毒,其中該一或多種治療劑或診斷劑包含尤其選自以下之治療劑:激素、生長因子、細胞介素、趨化介素、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義RNA、前藥轉化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制劑、腫瘤抑制因子、細胞毒性蛋白、細胞生長抑制蛋白及組織因子。
- 如請求項48、50至52及54至172中任一項之重組溶瘤病毒,其中: (i) 該至少一種病毒基因係或包含A35R,視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 3之核酸序列,或與SEQ ID NO: 3中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (ii) 該至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R,視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 12之核酸序列,或與SEQ ID NO: 12中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (iii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R,且J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質,且 其中編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑之一或多種異源核酸,將該一或多種異源核酸引入病毒膜基因中以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中該病毒膜基因係F14.5L,視情況地其中該融合物處於該F14.5L蛋白之該C末端,且視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 10之核酸序列,或與SEQ ID NO: 10中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (iv) 該至少一種病毒基因係或包含J2R,視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 4之核酸序列,或與SEQ ID NO: 4中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (v) 該至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且A35R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 11之核酸序列,或與SEQ ID NO: 11中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48、50至52及54至172中任一項之重組溶瘤病毒,其中: (i) 該至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 13之核酸序列,或與SEQ ID NO: 13中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (ii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R及A35R,且該A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且 該J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 47之核酸序列,或與SEQ ID NO: 47中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (iii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R,且該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)、誘導型Fas (iFas)或誘導型Cas9 (iCas9),視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 7、8或9之核酸序列,或與SEQ ID NO: 7、8或9中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (iv) 該至少一種病毒基因係或包含J2R,且該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 49、50或93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 49、50或93中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (v) 該至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 48之核酸序列,或與SEQ ID NO: 48中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48、50至52及54至172中任一項之重組溶瘤病毒,其中該至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R。
- 如請求項48、50至52及54至172中任一項之重組溶瘤病毒,其中: (i) 該至少一種病毒基因係或包含J2R及B2R,且該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3;視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 80之核酸序列,或與SEQ ID NO: 80中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (ii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A35R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體; 該B2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且 該A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係LIGHT;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 82之核酸序列,或與SEQ ID NO: 82中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (iii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IL-2,視情況地其中該IL-2係IL-2超因子,視情況地MDNA11;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 84之核酸序列,或與SEQ ID NO: 84中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (iv) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; 該A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中該兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 85之核酸序列,或與SEQ ID NO: 85中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (v) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中: 該B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; 該A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中該兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9; 該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼細胞凋亡誘導蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED);且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 86之核酸序列,或與SEQ ID NO: 86中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (vi) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體; 該B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; 該A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係LIGHT; 該A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中該一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 87之核酸序列,或與SEQ ID NO: 87中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (vii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R、A35R及A56R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種抗血管生成蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白包含VEGF抑制劑及/或Ang2抑制劑,視情況地其中該一或多種抗血管生成蛋白係雙特異性抗VEGF/抗Ang2抗體; 該B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; 該A35R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之該一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係LIGHT; 該A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,其中該一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子MDNA11T,視情況地其中該MDNA11T包含SEQ ID NO: 98中所述之胺基酸序列;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 88之核酸序列,或與SEQ ID NO: 88中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (viii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質; 該B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; 該A56R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IL-2超因子,視情況地MDNA11或MDNA11T; 編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將該一或多種異源核酸引入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中該融合物處於該F14.5L蛋白之該C末端;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 89之核酸序列,或與SEQ ID NO: 89中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (ix) 該至少一種病毒基因係或包含J2R、B2R及A56R;其中: 該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種T細胞或NK細胞逃避蛋白包含由牛痘病毒ORF 012、203及018 (CPXV012-203-018)編碼之一組蛋白質; 該B2R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3; 該A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中該兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9; 編碼一或多種異源基因產物之該至少一種異源核酸包含各自編碼一或多種補體抑制劑、視情況地CRASP-2之一或多種異源核酸,將該一或多種異源核酸引入病毒膜基因、視情況地F14.5L中,以產生編碼融合蛋白之融合基因,視情況地其中該融合物處於該F14.5L蛋白之該C末端;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 90之核酸序列,或與SEQ ID NO: 90中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (x) 該至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R,且該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 91之核酸序列,或與SEQ ID NO: 91中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (xi) 該至少一種病毒基因係或包含B2R、J2R及A56R,且 該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且 該A56R之不活化突變係藉由插入編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白包含兩種或更多種選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群之免疫調節蛋白,視情況地其中該兩種或更多種免疫調節蛋白包含IL-12及CXCL9;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 92之核酸序列,或與SEQ ID NO: 92中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列;或 (xii) 該至少一種病毒基因係或包含J2R,且該J2R之不活化突變係藉由插入各自編碼一或多種免疫調節蛋白之一或多種異源核酸來實現,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白選自由LIGHT、IRF3、IL-2、IL-12及CXCL9組成之群,視情況地其中該一或多種免疫調節蛋白係IRF3;且 視情況地其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 93之核酸序列,或與SEQ ID NO: 93中所述之該核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至172中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至172中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至172中任一項之重組溶瘤痘瘡病毒,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項48至179中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼異源基因產物之該異源核酸中之一或多者可操作地連接至啟動子。
- 如請求項180之重組溶瘤病毒,其中可操作地連接至啟動子之編碼異源基因產物之該一或多種異源核酸中之每一者選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
- 如請求項48至181中任一項之重組溶瘤病毒,其中編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至啟動子,視情況地其中編碼異源基因產物之每一異源核酸獨立地可操作地連接至選自由以下組成之群之啟動子:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
- 如請求項181或182之重組溶瘤病毒,其中該啟動子係痘病毒啟動子或係其變異體或衍生物。
- 如請求項181或182之重組溶瘤病毒,其中該啟動子係痘瘡病毒啟動子。
- 如請求項181至184中任一項之重組溶瘤病毒,其中該啟動子選自由以下組成之群:7.5E、7.5E/L、SSE、11KL、SSL、SSEL、mH5及LEO。
- 如請求項181至185中任一項之重組溶瘤病毒,其中該啟動子具有SEQ ID NO: 29、53、55、68、69、70、71或72中之任一者中所述之胺基酸序列。
- 如請求項181至186中任一項之重組溶瘤病毒,其中該啟動子係合成強早期啟動子(SSE)。
- 如請求項187之重組VACV株,其中該SSE啟動子包含SEQ ID NO:29中所述之該序列。
- 如請求項181至188中任一項之重組溶瘤病毒,其中該啟動子係強早期/晚期啟動子(SEL)。
- 如請求項189之重組溶瘤病毒,其中該SEL啟動子包含SEQ ID NO:55中所述之該序列。
- 如請求項181至190中任一項之重組溶瘤病毒,其中該啟動子係mH5。
- 如請求項191之重組溶瘤病毒,其中該mH5啟動子包含SEQ ID NO: 53中所述之該序列。
- 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 變異體017開放閱讀框(ORF),其編碼與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性且包含位置66之極性不帶電胺基酸、視情況地位置66之蘇胺酸(T)之胺基酸序列; (ii) 變異體038 (K5L) ORF,其包含實現框移突變之核苷酸插入,其中038 (K5L)基因產物發生變化; (iii) 變異體059 (E2L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:60至少95%序列一致且包含位置419之除白胺酸外之疏水胺基酸、視情況地位置419之苯丙胺酸(F)的胺基酸序列; (iv) 變異體104 (H4L) ORF,其編碼與SEQ ID NO:61具有至少95%序列一致性且包含位置591之帶負電胺基酸、視情況地位置591之天冬胺酸(D)的胺基酸序列;及 (v) 變異體182 (A56R) ORF,其包含實現框移突變之兩個核苷酸缺失,其中182 (A56R) ORF基因產物發生變化。
- 如請求項193之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)且該變異體017 ORF編碼與SEQ ID NO:57具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項193或194之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)且該變異體017 ORF編碼SEQ ID NO: 57中所述之胺基酸序列。
- 如請求項193至195中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(ii)且該核苷酸插入係對應於SEQ ID NO:1之核苷酸位置32135後之插入的鳥嘌呤(G),視情況地其中該變異體038 (K5L) ORF闡述於SEQ ID NO: 58中。
- 如請求項193至196中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(ii)且該038 (K5L)基因產物闡述於SEQ ID NO:59中。
- 如請求項193至197中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(iii)且該變異體059 (E2L) ORF編碼與SEQ ID NO:60具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項193至198中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(iii)且該變異體059 (E2L) ORF編碼SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列。
- 如請求項193至199中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(iv)且該104 (H4L) ORF編碼與SEQ ID NO:61具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項193至200中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(iv)且其中該變異體104 (H4L) ORF編碼SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列。
- 如請求項193至201中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(v)且兩個核苷酸缺失係對應於SEQ ID NO:2之核苷酸位置165972後之核苷酸的兩個連續核苷酸缺失,視情況地其中該變異體182 (A56R)闡述於SEQ ID NO: 62中。
- 如請求項193至202中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(v)且VACV蛋白闡述於SEQ ID NO:63中。
- 如請求項193至203中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任兩者。
- 如請求項193至203中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任三者。
- 如請求項193至203中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之任四者。
- 如請求項193至203中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(v)中之每一者。
- 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少95%序列一致性之核酸基因體,且其中該核酸基因體之特徵在於以下中之一或多者: (i) 對應於SEQ ID NO: 1之位置7770之位置之鳥嘌呤(G); (ii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置15261之位置之胸腺嘧啶(T); (iii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置32136之位置之G; (iv) 對應於SEQ ID NO: 1之位置49455之位置之G; (v) 對應於SEQ ID NO: 1之位置92969之位置之胞嘧啶(C); (vi) 對應於SEQ ID NO: 1之位置106870至106880之位置之核酸序列CACTTATATAT; (vii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置111267至111276之位置之核酸序列GTTTTCATTA; (viii) 對應於SEQ ID NO: 1之位置162715之位置之腺嘌呤(A); (ix) 對應於SEQ ID NO: 1之位置165844至185853之位置之核酸序列TACAGACACC;及 (x) 對應於SEQ ID NO: 1之位置187805之位置之C。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任兩者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任三者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任四者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任五者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任六者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任七者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任八者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之任九者。
- 如請求項208之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體之特徵在於(i)-(x)中之每一者。
- 如請求項208至217中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少96%序列一致性。
- 如請求項208至218中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少97%序列一致性。
- 如請求項208至219中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少98%序列一致性。
- 如請求項208至220中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少99%序列一致性。
- 一種經分離之純系痘瘡病毒(VACV)株,其包含與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列具有至少99%序列一致性之核酸基因體。
- 如請求項1至192中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項193至222中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少99.5%序列一致性。
- 如請求項1至192中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項193至223中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少99.9%序列一致性。
- 如請求項1至192中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項193至224中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體與SEQ ID NO: 1中所述之該核苷酸序列具有至少99.95%序列一致性。
- 如請求項1至192中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項193至225中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體不包含SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列。
- 如請求項193至226中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體未經修飾以含有非病毒異源核酸,該非病毒異源核酸含有編碼非病毒異源蛋白之開放閱讀框。
- 如請求項193至227中任一項之經分離之純系VACV株,其中該核酸基因體闡述於SEQ ID NO: 1中。
- 如請求項1至192中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項193至228中任一項之經分離之純系VACV株,其中該重組溶瘤病毒或該純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,視情況地如根據EEV之百分比所確定,其中該EEV之百分比係藉由下式確定:上清液之病毒效價/ (上清液之病毒效價+細胞溶解物之病毒效價) *100。
- 如請求項229之重組溶瘤病毒或如請求項244之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過5%之感染性粒子係EEV。
- 如請求項229之重組溶瘤病毒或如請求項244之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過10%之感染性粒子係EEV。
- 如請求項229之重組溶瘤病毒或如請求項244之經分離之純系VACV株,其中在細胞感染後超過15%之感染性粒子係EEV。
- 如請求項229至232中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項229至232中任一項之經分離之純系VACV株,其中該重組溶瘤病毒或該純系VACV株在細胞感染後展現增強的細胞外包膜病毒體(EEV)產生,如藉由使至少5%、10%或15%百分比之感染性粒子係EEV所確定。
- 如請求項1至192、223至226及229至233中任一項之重組溶瘤病毒或如請求項193至233中任一項之經分離之純系VACV株,其展現殺傷腫瘤細胞之溶瘤活性。
- 一種VACV製劑,其包含如請求項193至234中任一項之經分離之純系VACV株。
- 一種VACV製劑,其包含如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒,其中該重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
- 一種重組溶瘤病毒製劑,其包含如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒,視情況地其中該製劑中至少70%、80%、90%、95%或98%之病毒粒子具有純系溶瘤病毒株之基因體序列。
- 如請求項235或236之VACV製劑,其實質上係均質的,其中該製劑中之複數個該等該病毒粒子具有該純系VACV株之該基因體序列。
- 如請求項235、236及238中任一項之VACV製劑,其中該製劑中至少70%之該等病毒粒子具有該純系VACV株之該基因體序列。
- 如請求項235、236及238中任一項之VACV製劑,其中該製劑中至少80%之該等病毒粒子具有該純系VACV株之該基因體序列。
- 如請求項235、236及238中任一項之VACV製劑,其中該製劑中至少90%之該等病毒粒子具有該純系VACV株之該基因體序列。
- 如請求項235、236及238中任一項之VACV製劑,其中該製劑中至少95%之該等病毒粒子具有該純系VACV株之該基因體序列。
- 如請求項235、236及238中任一項之VACV製劑,其中該製劑中至少98%之該等病毒粒子具有該純系VACV株之該基因體序列。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項207至247中任一項之經分離之VACV純系株。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項193至233中任一項之VACV製劑。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒。
- 一種重組痘瘡病毒(VACV)株,其包含如請求項193至234中任一項之VACV純系株之核酸基因體,該核酸基因體包含至少一種病毒基因之不活化突變。
- 如請求項247之重組VACV株,其中該病毒基因選自由以下組成之群:血球凝集素(HA)、J2R (胸苷激酶)、F14.5L、A56R (血球凝集素)、B2R、痘瘡生長因子(VGF)、A35R、A49R、A55R、B14R、C4L、C6L、C16L、NIL/N2L、E2L/E3L、K1L/K2L、K7L、過氧化物歧化酶基因座、7.5K、C2L-F3L、C4L-F1L、C7-K1L、B13R+B14R、A26L及I4L。
- 如請求項247或248之重組VACV,其中該不活化突變係該至少一種病毒基因之全部或一部分缺失。
- 如請求項249之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因之該缺失係病毒基因之完整基因ORF之缺失。
- 如請求項249之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因之該缺失係病毒基因之該ORF之一部分之缺失,且其中該缺失足以使經編碼之基因產物無功能。
- 如請求項247至251中任一項之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因係或包含A35R。
- 如請求項252之重組VACV株,其中該重組VACV株之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:3中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項247至253中任一項之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因係或包含J2R。
- 如請求項254之重組VACV株,其中該重組VACV株之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:4中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項247至255中任一項之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因係或包含B2R。
- 如請求項247至256中任一項之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因係或包含A35R及J2R。
- 如請求項257之重組VACV株,其中該重組VACV株之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:12中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項247至258中任一項之重組VACV株,其中該至少一種病毒基因係或包含B2R及J2R。
- 如請求項259之重組VACV株,其中該重組VACV株之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 48中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:48中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項247至260中任一項之重組VACV株,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項247至260中任一項之重組VACV株,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85、86、88及90中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項247至260中任一項之重組VACV株,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 85中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 85中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 一種核酸,其包含如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒之基因體或如請求項193至233中任一項之經分離之VACV純系株。
- 一種重組溶瘤病毒,其包含如請求項264之核酸。
- 如請求項264之核酸,其中該重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
- 如請求項265之重組溶瘤病毒,其係重組溶瘤痘瘡病毒。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項247至263中任一項之重組VACV株。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒,視情況地其中該重組溶瘤病毒係重組溶瘤痘瘡病毒。
- 如請求項244至246、268及269中任一項之醫藥組合物,其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
- 如請求項244至246及268至270中任一項之醫藥組合物,其經調配用於靜脈內投與、腫瘤內投與、腹膜內投與或胸膜內投與。
- 如請求項244至246及268至271中任一項之醫藥組合物,其經調配用於靜脈內投與。
- 如請求項244至246及268至272中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物係液體組合物。
- 如請求項244至246及268至272中任一項之醫藥組合物,其中該醫藥組合物係凍乾的。
- 一種治療個體之增生性病症之方法,其包括向該個體投與如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒、如請求項193至234中任一項之經分離之純系VACV株、如請求項247至263中任一項之重組VACV株、或如請求項244至246及268至274中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項275之方法,其中該增生性病症係腫瘤或轉移。
- 如請求項275或276之方法,其中該增生性病症係癌症。
- 如請求項277之方法,其中該癌症係胰臟癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、直腸癌、腎(腎臟)癌、胃癌、食管癌、肝(肝臟)癌、子宮內膜癌、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、口癌(例如口腔癌)、子宮頸癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、前列腺癌、皮膚癌(例如黑色素瘤,例如惡性黑色素瘤)、膽管癌(膽道癌)、胸腺上皮癌(例如胸腺瘤)、白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
- 如請求項277或278之方法,其中該癌症係微衛星穩定(MSS)結腸直腸癌。
- 如請求項279之方法,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項275至280中任一項之方法,其中該重組溶瘤病毒或該經分離溶瘤病毒係以1 × 10 5pfu至1 × 10 14pfu之量投與。
- 如請求項275至281中任一項之方法,其進一步包括投與用於治療該增生性病症之第二治療劑。
- 如請求項275至282中任一項之方法,其進一步包括尤其選自以下之另一治療:手術、輻射療法、免疫抑制療法及投與抗癌劑。
- 如請求項283之方法,其中該另一治療係投與尤其選自以下之抗癌劑:細胞介素、趨化介素、生長因子、光激致效劑、毒素、抗癌抗生素、化學治療化合物、放射性核種、血管生成抑制劑、傳訊調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療劑及其前述任一者之組合。
- 如請求項275至284中任一項之方法,其中該重組溶瘤病毒或該經分離溶瘤病毒係靜脈內投與。
- 如請求項275至285中任一項之方法,其進一步包括向該個體投與AP1903 (利米多賽)。
- 如請求項275至286中任一項之方法,其中投與該個體之該重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
- 如請求項286或287之方法,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之該核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項275至288中任一項之方法,其中該個體展現重度免疫缺乏且對病毒感染敏感。
- 如請求項275至289中任一項之方法,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
- 一種抑制病毒複製之方法,該方法包括使經重組溶瘤病毒感染之細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中該重組溶瘤病毒包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸。
- 一種抑制病毒複製之方法,該方法包括使細胞與AP1903 (利米多賽)接觸,其中該等細胞經如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒、如請求項193至234中任一項之經分離之純系VACV株或如請求項247至263中任一項之重組VACV株感染。
- 如請求項291或292之方法,其中該接觸在個體之活體內進行。
- 如請求項291或293之方法,其中已將該AP1903 (利米多賽)投與先前投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之該異源核酸之重組溶瘤病毒的個體。
- 如請求項292或293之方法,其中已將該AP1903 (利米多賽)投與先前投與如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒、如請求項193至234中任一項之經分離之純系VACV株或如請求項247至263中任一項之重組VACV株的個體。
- 一種抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中該個體先前已投與包含編碼細胞凋亡誘導蛋白之異源核酸之重組溶瘤病毒。
- 一種抑制個體中之病毒複製之方法,該方法包括向個體投與AP1903 (利米多賽),其中該個體先前已投與如請求項1至192、223至226及229至234中任一項之重組溶瘤病毒、如請求項193至234中任一項之經分離之純系VACV株或如請求項247至263中任一項之重組VACV株。
- 如請求項286至297中任一項之方法,其中該方法優先抑制非癌細胞中之病毒複製。
- 如請求項286至298中任一項之方法,其中該細胞凋亡誘導蛋白係誘導型DED (iDED)。
- 如請求項299之方法,其中該iDED包含SEQ ID NO:27中所述之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:27具有至少85%、90%或95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項299及300之方法,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO:8中所述之該序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之核酸序列。
- 如請求項291至301中任一項之方法,其中該重組溶瘤病毒之該核酸基因體包含SEQ ID NO: 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列,或與SEQ ID NO 48、80、82及84-93中之任一者中所述之核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列。
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