KR20160096213A - 인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청 내 단백질의 동정 - Google Patents

인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청 내 단백질의 동정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의사 진단시에, 비소세포 폐암 및 천식이 있는 것으로 알려진 환자 및 정상 개체간에 차등 발현되는, 인간 혈청에 존재하는 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다. 각 인간 개체군의 인간 혈청 표본을 트립신 또는 임의의 다른 적절한 엔도프로테아제로 분해하고 액상 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 각 개체군의 질량 스펙트럼 데이타를 비교하여 정상, 천식 및 폐암 개체군간에 유의하게 차등 발현되는 발현 강도를 갖는 단백질을 결정한다. 11종의 단백질이 상기 개체군 간에 유의하게 차등 발현되는 발현 강도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 상기 11종 단백질의 정체는 상기 질량 스펙트럼 데이타를 공지 단백질의 질량 스펙트럼 데이타 라이브러리를 갖는 공지 데이타베이스와 비교하여 획득하였다.

Description

인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청 내 단백질의 동정{IDENTIFICATION OF PROTEINS IN HUMAN SERUM INDICATIVE OF PATHOLOGIES OF HUMAN LUNG TISSUES}
본 발명은 2007년 9월 11일에 출원된 미국 가출원 제60/971,422호를 우선권으로 주장하는 특허 출원이다.
본 발명은 대체로 인간 폐조직 병변의 진단에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 폐조직 및 인간 호흡계와 연관된 병변의 지표가 되는 인간 혈청에 존재하는 단백질을, 정상 개체군에서 발견되는 이와 동일한 단백질의 상대적 발현 강도가 인간 혈청내에서 변화된 경우에, 동정하기 위해 액상 크로마토그래피-질량 분광계를 사용하여, 비소세포 폐암 및 천식을 진단하는 것에 관한 것이다. 이러한 병변과 관련된 단백질을 동정하고, 대표적인 발현 강도를 확인한 후, 상기 발현 강도를 환자 혈청에 존재하는 발현 강도와 비교함으로써, 간단한 혈액 검사를 통해 진행중인 병변의 존재를 초기에 발견하고 병변들을 구별하는 것이 가능하다.
수백만 미국인이 호흡계 병변, 예컨대 천식 및 폐암을 앓고 있다. 사실, 미국 폐 협회 보고에 따르면 거의 2천만 미국인이 천식을 앓고 있다. 미국 암 학회는 2007년 한해 동안 호흡계의 새로운 암 환자가 229,400명, 호흡계 암 사망률은 164,840명으로 추정하고 있다. 국부적인 상태에서 암이 발견된 경우 암 환자의 5년간 생존률은 46%인데 반해, 폐암 환자의 5년간 생존률은 겨우 13%이다. 유사하게, 폐암의 16%만이 이 질환이 확산되기 전에 발견된다. 폐암은 대체로 암세포 병변을 기초로 2가지 주 유형으로 분류된다. 각 유형은 암성으로 형질전환된 세포 유형에 따라 명명된다. 소세포 폐암은 인간 폐조직의 소세포에서 유래한 것인 반면, 비소세포 폐암은 대체로 소세포 유형이 아닌 모든 폐암을 포괄한다. 비소세포 폐암은 대체로 그 치료가 모든 소세포 유형에 대해 동일하기 때문에 함께 분류된다. 또한, 비소세포 폐암, 또는 NSCLC는 전체 폐암의 약 75%를 차지한다.
폐암 환자의 생존률을 단축시키는 주요 원인은 폐암을 초기에 진단하는 것이 어렵다는 것이다. 인간에서 폐암을 진단하거나 그 존재를 확인하는 현행 방법은 X 선, CT 스캔 및 종양 존재 유무를 물리적으로 확인하기 위한 폐의 유사 검사법 등에 제한된다. 따라서, 폐암 진단은 종종 물리적으로 검출가능한 질량이 생성되기에 충분한 시간 동안 상기 질환이 인간 체내에 존재한 후에, 그리고 상당한 기간 동안 존재한 증상에만 반응하여 이루어진다.
유사하게, 천식을 검출하는 현행 방법은 통상 반복적인 천명, 기침 및 흉부 압박감 등의 증상이 나타나고 오래된 후에 수행된다. 현행의 천식 검출 방법은 대체로 폐기능 검사 예컨대 폐활량 측정법 또는 챌린지 검사법 등에 제한된다. 게다가, 이들 검사법은 의사가, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 기관지염, 폐렴 및 울혈성 심부전 등의 다른 병변 또는 질환을 제거하기 위한 다수의 다른 검사법과 함께 수행하기 위해 지시하는 것이다.
종래에는 발병 초기에 인간 폐조직 병변을 진단하는 간단하고, 신뢰할 만한 방법이 존재하지 않았다. 또한, 오늘날 특정 폐조직 병변의 존재를 보여줄 수 있는 이용가능한 혈액 검사법이 존재하지 않는다. 따라서, 질환 진행 초기에 폐암의 존재를 확인할 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구된다. 마찬가지로, 증상의 최초 출현시에 천식 및 비소세포 폐암을 진단하고, 이들을 상호간에 그리고 감염 등과 같은 다른 폐 질환과 구별하기 위한 방법을 개발하는 것이 요구된다. 또한, 상대적인 발현 강도의 관점에서 변경된 경우에, 비소세포 폐암 및/또는 천식 존재의 지표가 되는 인간 혈액에 존재하는 특이적 단백질을 동정하는 것이 요구된다.
본 발명은 액상 크로마토그래피 전자 분무 이온화 질량 분광계("LC-ESIMS")를 사용하여, 의사가 진단시, 비소세포 폐암 및 천식이 있는 것으로 알려진 환자와 정상 개체간에 차등적으로 발현되는 인간 혈청에 존재하는 단백질을 동정하는 새로운 방법을 제공한다. 비소세포 폐암 및/또는 천식의 지표가 되는 단백질의 선별은 질량 스펙트럼 데이타, 즉 펩티드의 질량 및 시간에 따라 발현되는 단백질 강도의 1차 그래프를 비교하여 수행하였다. 수천종의 단백질을 비교하여, 의사 진단시 비소세포 폐암이 있는 개체군, 의사 진단시 천식이 있는 개체군 및 어떠한 폐조직 병변도 없는 개체군 간에 실질적으로 다른 강도로 발현되는 11종의 단백질을 선별하였다.
구체적으로, 인간 혈청은 "정상 개체군", "천식 개체군", 및 "폐암 개체군"에서 얻었다. "정상 개체군"은 여기서 천식 또는 폐암이 없는 것으로 알려진 개체로 정의된다. 본 명세서에서 "천식 개체군"은 의사가 진단하고 천식이 있는 것으로 알려진 개체로 정의된다. 본 명세서에서 "폐암 개체군"은 의사가 진단하고 비소세포 폐암이 있는 것으로 알려진 개체로 정의된다.
정상 개체군, 천식 개체군 및 폐암 개체군의 혈청을 얻은 후, 각 혈청 표본을 분취액으로 나누고 분해제 또는 프로테아제, 즉 트립신 등에 노출시켜 혈청 표본에 존재하는 단백질을 규명되고 예측가능한 절단부 또는 펩티드로 분해하였다. 통상 트립신성 펩티드로 알려진, 트립신 효소 작용으로 생성된 펩티드는 이후에 상기 표본에 대해 원심분리를 수행하여 불용성 물질을 침전시켜 트립신 분해된 불용성 물질과 분리시켰다. 다음으로, 트립신성 펩티드를 함유하는 상등액에 대해 모세관 액상 크로마토그래피를 수행하여 트립신성 펩티드의 시공간적 분리를 실시하였다.
이후, 상기 트립신성 펩티드에 대해 LC-ESIMS를 실시하였다. 각d 펩티드는, 층길이가 18 cm이고 내경이 0.375 mm인 Supelcosil ABZ+ 5 ㎛ 패킹재 고정층을 함유하는 크로마토그래피 컬럼 상에서 소수성 유체, 즉 0.1 부피%의 포름산을 함유하는 아세토니트릴, 물의 컬럼을 통해 상기 펩티드를 통과시켜 시간에 맞춰 분리하였다. 분리된 펩티드는 컬럼 용리액을 통해 운반하였다. 상기 컬럼은, 그라운드에 비해 양성 바이어스를 갖는 컬럼 첨단에 고압이 인가되고, 인가된 전기장력에 의해 LC-ESIMS의 입구쪽으로 추진되는 하전된 액적 빔이 형성되어 상기 분리된 펩티드가 전기분무되는 말단을 가지고 있다. 형성된 최종 분무액은 용해된 트립신성 펩티드를 함유하는 용매의 소액적으로 이루어진다. 상기 액적을 전기분무원의 대기압 영역을 통과시켜 탈용매화시킨 후 LC-ESIMS의 가열된 모세관 입구로 보낸다.
상기 액적의 탈용매화는 펩티드 상에 양으로 하전된 이온, 가장 일반적으로는 수소(H+)를 침착시켜, 펩티드에 전하가 부여된다. 이러한 가스층 내의 하전된 펩티드를 당분야에서는 "유사-분자 이온(pseudo-molecular ions)"이라고 한다. 이러한 유사-분자 이온은 다양한 전위를 통해서 LC-ESIMS의 질량 분석기로 유인되며, 여기서 이들은 질량 대 전하 비율에 따라서 공간 및 시간적으로 분리된다. 질량 대 전하 비율에 따라 분리되면, 이 유사-분자 이온은 추가의 전기장 구배에 의해서 LC-ESIMS의 검출기로 이동하고, 여기서 유사-분자 이온 빔은 전기 임펄스로 변환되어 데이타 기록 장치에 의해 기록된다.
따라서, 트립신 분해물에 존재하는 펩티드가 LC-ESIMS의 질량 분석기를 통과하면 여기서 각 펩티드에 대한 분자량이 측정되고, 샘플 유래 펩티드가 컬럼을 통과해서 나오는 전체 시간 동안 반복적으로 획득된 시간 누적 질량 스펙트럼이 생성된다. 이러한 질량 스펙트럼 판독치는 대체로 LC-ESIMS에 의해 확인된 펩티드의 그래프로 표시되며, 여기서 x축은 전하 비율에 따른 측정 질량이고, y축은 펩티드의 신호 강도이다. 이러한 질량 스펙트럼을 3차원 디스플레이로 시간에 맞춰 어셈블리할 수 있는데, 여기서 x축은 크로마토그래피 분리 시간이고, z축은 질량 스펙트럼의 질량 축이며, y축은 질량 스펙트럼 신호 강도인데, LC-ESIMS에 의해 검출된 소정의 유사-분자 이온의 양에 비례한다.
다음으로, 천식 개체군 및 폐암 개체군 유래의 검사된 각 표본의 질량 스펙트럼 판독치를 정상 개체군에서 검사한 각 표본과 비교하여 비교 분석을 수행하였다. LC-ESIMS에서 검출된 추정적으로 동정된 단백질과 연관있는 각 트립신성 펩티드 유사-분자 이온 신호("피크")를 천식, 폐암 및 정상 병변에 걸쳐서 비교하였다. 정상 개체군과 천식 개체군 또는 폐암 개체군을 비교했을 때 펩티드 양이 실질적으로 변화되지 않은 것으로 나타난 질량 스펙트럼 피크 강도를 갖는 펩티드는 유의하지 않은 것으로 판단하여 제외시켰다. 대체로, 사용한 제외 기준은 각 병변에서 얻은 개별 환자의 분석값에서 유도된 10 이상의 데이타 세트에 걸쳐, 소정 단백질에 대해 동정된 특징적 펩티드의 절반 이상에 대한 펩티드 피크 강도를 비교하는 것이 포함된다. 소정 단백질에서 유도된 대부분의 펩티드 피크의 강도가 혈청 데이타 세트의 80%에 대한 강도보다 10배 이상 더 높다면, 그 단백질은 2 병변 부류간에 차등적으로 조절되는 것으로 분류하였다.
비교 분석 결과, 11종의 단백질이 천식 개체군, 폐암 개체군 및 정상 개체군간에 일관성있게 차등적으로 발현되는 것으로 확인되었다. 상기 11종의 단백질은 공지된 단백질 및 펩티드 데이타베이스 또는 라이브러리를 참조하여 동정하였다. 이러한 데이타베이스의 예에는 미국 국립 생명공학 정보 센터("NCBInr")에서 운영하는 Entrez Protein, 스위스 바이오인포메틱스 인스티튜트("SwissProt")에서 운영하는 ExPASy 및 임페리얼 칼리지 오브 런던의 의학 연구 위원회 임상 과학 센터에서 운영하는 Mass Spectral Database("MSDB") 등이 포함된다.
각각의 정상, 폐암 및 천식 개체군에서 얻은 각 표본에 대한 질량 스펙트럼 판독치를 Mascot라고 불리는 공지의 검색 엔진에 입력하였다. Mascot는 4개의 주요한 서열분석 데이타베이스, 즉 MSDB, NCBInr, SwissProt 및 dbEST 데이타베이스로부터 단백질을 확인하기 위해 질량 분광분석 데이타를 사용하는 당분야에 공지된 검색 엔진이다. 검색 기준 및 변수를 Mascot 프로그램에 입력하고 각 표본에 대해 Mascot 프로그램을 실행하였다. 다음으로, Mascot 프로그램을 서열분석 데이타베이스에 대해 입력한 펩티드에 대해 실행하여, 각 펩티드의 질량 및 피크 강도를 공지의 펩티드 및 단백질의 질량 및 피크 강도와 비교하였다. 이후, Mascot는 실행한 각 펩티드에 대해 통상 "유의한 대응물(significant matches)"로 알려진 가능한 대응물의 후보 목록을 작성하였다.
유의한 대응물은 검사한 각 표본에 대해 "모우스 스코어(Mowse score)"라고 불리는 스코어를 지정하여 Mascot 프로그램을 통해 결정하였다. 모우스 스코어는 -10*LOG10(P)의 알고리즘이고, 여기서 P는 관찰된 대응물이 무작위 사건일 확률로서, 유의도 p값과 관련이 있으며, p 값은 0.05보다 낮고, 이는 과학계에서 허용되는 표준 유의도이다. 대략 55 내지 대략 66 또는 그 이상의 모우스 스코어가 대체로 유의한 것으로 여겨진다. 유의도는 특정한 검색 고려사항 및 데이타베이스 변수에 의해 어느정도 다양하다. 유의한 대응물은 각 펩티드 실행을 위해 복귀되어, 단백질 후보 목록을 생성한다.
이후, Mascot 프로그램을 통해 실행시킨 펩티드의 정체를 결정하기 위해 유의한 대응물 유래의 단백질과 대응시켰다. 상기 유의한 대응물 유래의 각 단백질 및 Mascot 프로그램으로 동정된 각 펩티드에 대해 매뉴얼 분석을 수행하였다. 화학적 또는 전자적, "노이즈" 결과로 결정된 피크 강도 대응물은 제외시켰다. 질량 스펙트럼 판독치로부터의 데이타를 유의한 대응물과 교차 검토하여 미편집 데이타, 피크 정체, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접한 전하 상태를 검증하였다.
Mascot 프로그램을 통한 자동 검색에 의해 누락되었을 수 있는 펩티드를 후보 목록에 첨가하기 위해 역 검사를 수행하였다. 추가된 펩티드는, 비교한 펩티드의 각 변수와 실질적으로 대응되는 단일 단백질을 의미하는 "최고 대응물"을 선별하고, 인 실리코(in silico) 분해를 수행하는데, 여기서 트립신성 펩티드 및 이들 각각의 분자 질량을 단백질의 공지 아미노산 또는 유전자 서열을 기초로 산출하여 동정된 것이다. 이렇게 예측된 펩티드 질량을 미편집 질량 스펙트럼 데이타에 대해 검색하고 동정된 임의의 피크를 상기 기술한 바와 같이 조사하고 검정하였다. 다음으로, Moscot에 의해 자동 동정된 것 및 매뉴얼 조사로 동정된 것을 비롯하여 모든 펩티드를 Mascot가 사용한 질량 목록에 입력하였다. 이후, 상세한(refined) 대응물을 사용하여 하기 기술하는 바와 같이 상세한 모우스 스코어를 도출하였다.
동정 결과, 천식 개체군, 폐암 개체군 및/또는 정상 개체군 간에 유의하게 차등 발현되는 것으로 확인된 11종의 단백질은 BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1, CAC69571, FERM 도메인 함유 단백질 4, JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스(JC1445 proteasome endopeptidase complex chain C2 long splice), 신택신(syntaxin) 11, AAK13083 및 AAK13049로 확인되었다. BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1은 유전적 서열분석 결과로서 동정된 단백질이다. FERM 도메인 함유 단백질 4는 세포질내 단백질 막 앵커리지에 관여하는 것으로 알려져 있다. JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스는 알려진 프로테아솜이다. 신택신 11은 세포 면역 반응에서 활성이 있다. BAC04615, AAK13083 및 AAK13049는 MHC(major histocompatibility complex) 연관된 단백질이다.
도 1은 단백질 BAC04615에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응도를 도시한 표를 개시한 것이다.
도 2는 단백질 Q6NSC8에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 3은 단백질 CAF17350에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 4는 단백질 Q6ZUD4에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 5는 단백질 Q8N7P1에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 6은 단백질 CAC69571에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 7은 단백질 FERM 4 도메인 함유 단백질 4에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 8은 단백질 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 9는 단백질 신택신 11에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
도 10은 단백질 AAKl 3083 및 AAKl 3049에 대한 모우스 스코어 및 유의한 대응물을 도시한 표를 개시한 것이다.
본 발명은 액상 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 스펙트럼을 사용하여, 의사가 진단시, 비소세포 폐암 및 천식이 있는 것으로 알려진 환자와 정상 개체간에 차등적으로 발현되는 인간 혈청에 존재하는 단백질을 동정하는, 동정 방법을 제공한다. 인간 폐조직의 임의 병변을 갖지 않는 인간 개체군, 천식 진단받은 인간 개체군, 및 비소세포 폐암 진단받은 인간 개체군 간에 실질적으로 일관되게 차등적으로 발현되는 단백질을 결정하고, 이러한 단백질의 정체를 확인하여, 그 동일 단백질을 확인하고 이 단백질의 발현도를 정량하는 혈액 검사를 통해 환자에서 병변의 존재를 확인하고, 천식 또는 비소세포 폐암의 각 질환이 진행된 매우 초기에 이들 각 질환을 식별하고 진단하는 것이 가능하다.
인간 혈액 샘플은 지원자로부터 채취하였다. 30개의 샘플을 비소세포 폐암 또는 천식이 없는 것으로 알려진 개체에서 채취하였다. 이러한 비소세포 폐암 또는 천식이 없는 것으로 알려진 개체는 "정상 개체군"을 포함하고, 이를 의미하는 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어, "폐암"은 비소세포 폐암을 설명하는 것이다. 천식이 있는 것으로 알려지고 의사가 천식으로 진단한 개체에서 28개의 혈액 샘플을 채취하였다. 천식이 있는 것으로 알려진 개체는, "천식 개체군"을 포함하고, 본 명세서에서 이와 같이 표시한다. 비소세포 폐암이 있는 것으로 알려지고 의사가 비소세포 폐암으로 진단한 개체에서 30개의 혈액 샘플을 채취하였다. 비소세포 폐암이 있는 것으로 알려진 개체는 "폐암 개체군"을 포함하고, 본 명세서에서 이와 같이 표시한다. 대체로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "폐암" 또는 "폐암들"은 비소세포 폐암을 의미한다. 마지막으로, 의사 기록에 흡연 이력으로 인해 폐암 위험성이 있는 것으로 알려진 개체에서 71개의 혈액 샘플을 채취하였다. 이들 71개 샘플은 진행중인 연구 및 실험의 대상이므로 본 명세서에서는 기술하지 않았다.
상기 혈액 샘플은 IRB 승인 프로토콜 하에, 고지에 입각한 동의 후, 지원자로부터, 표준 정맥천자를 사용하여 멸균된 10 mL BD Vacutainer® 유리 혈청 적색 탑튜브에 채취하였다. 다음으로, 혈액 샘플들을 30분 동안 실온에서 정치시켜 혈액 이 응고되도록 하였다. 샘플을 10분간 2000 rpm에 실온에서 표준 벤치탑 원심분리기로 원심분리하여 이 혈액 샘플에서 혈청을 분리하였다. 각 샘플의 혈청을 피펫팅을 통해 분리하여 제2 튜브에 혈청을 옮겼다. 제2 튜브를 얼음 상에서 사전 냉각시켜 단백질분해 및 변성으로 인한 분해를 제한하여 각 혈청 표본의 보전을 확보하였다. 채취한 각 샘블의 혈청 표본을 이어서 얼음에서 사전 냉각시킨 냉동바이알 튜브에 1.0 mL 분취액으로 나누었다. 혈청 표본 분취액을 적어도 -80℃만큼 낮은 온도에 보관하였다. 이 처리 시간은 방혈부터 -80℃에 보관하기까지 1 시간을 넘기지 않았다.
천식 개체군, 정상 개체군 및 폐암 개체군 각각에서 8 내지 10개의 혈청 표본을 무작위로 선택하여 검사하였다. 각 개체군 유래의 각 혈청 표본에 대해서 프로테아제 또는 분해제, 이 경우에는 트립신을 처리하였다. 트립신을 프로테아제로 사용하였는데, 트립신은 프롤린이 리신 또는 아르기닌 직후에 존재하는 경우를 제외하고, 리신 및 아르기닌의 카르복실 측면에서 펩티드 사슬을 절단하는 것으로 알려져 있어 고도로 특이적이고 고도로 예측가능한 절단부를 만들 수 있는 능력덕분에 프로테아제로서 사용하기에 바람직하다. 트립신을 사용하였지만, 다른 프로테아제 또는 분해제를 사용하는 것도 가능하다. 적어도 트립신처럼 특이적으로 절단하는 프로테아제 또는 프로테아제 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.
절단후에 트립신에 의해 남겨진 펩티드인, 트립신성 펩티드는 원심분리와 모세관 액상 크로마토그래피를 수행하여 불용성 물질로부터 분리하였는데, 상기 크로마토그래피는 생성된 트립신성 펩티드의 크로마토그래피 분해(resolution)을 실시하기 위해 Eksient 2D 모세관 HPLC 상에 0.375 X 180 mm Supelcosil ABZ+ 컬럼을 사용하고, 0.1% 포름산과 수성 아세토니트릴 농도구배를 사용하였다. 이러한 펩티드 분리 과정은 필수적인데, 전기분무 이온화 과정이 이온 공동억제(co-suppression)를 겪기 때문으로서, 상기 경우에는 HPLC 컬럼의 말단과 공동 말단인 전자분무 이미터로부터 동시에 용리되면 양자 친화력이 보다 높은 이온 유형이 양자 친화력이 보다 낮은 이온의 이온 형성을 억제하게 된다.
이러한 방법론은 트립신 분해로 생성된 다수의 펩티드를 분리가능하게 하고 공동억제 문제를 최소화하는데 도움이 되므로, 유사-분자 이온 공동 억제의 형성 기회가 최대화되어, 이온 샘플링이 최대화된다. 이후, 각 표본에 대한 트립신성 펩티드에 대해 LC-ESIMS를 수행한다. LC-ESIMS는 상기 기술한 바와 같이 물, 아세토니트릴 및 포름산으로 이루어진 용매계 컬럼을 통해서 각 표본 내 펩티드를 통과시켜 시간에 맞게 각 표본의 각 펩티드를 분리하였다.
다음으로, 상기 기술한 바와 같이 펩티드를 전자분무 이온화 소스에서 분무하여 펩티드를 이온화하고 펩티드 유사-분자 이온을 생성하였다. 상기 펩티드를 LC-ESIMS의 질량 분석기를 통과시켰는데 여기서는 각 펩티드 유사-분자 이온에 대한 분자 질량을 측정하였다. LC-ESIMS을 통과시킨 후, 상기 질량 스펙트럼 데이타, 즉 강도 분자량 및 크로마토그래피 컬럼으로부터의 펩티드 용리 시간으로부터, 각 샘플에 존재하는 펩티드에 대한 질량 스펙트럼 판독치를 생성하였다. 대체로, 상기 질량 스펙트럼 판독치는 LC-ESIMS에 의해 기록된 펩티드 유사-분자 이온 신호의 그래프로서, x-축은 전하 비율에 대한 질량 측정치이고, y-축은 유사-분자 이온 신호의 강도이다. 다음으로 이들 데이타를 LC-ESIMS를 제어하는 소프트웨어 시스템으로 처리하여 최종 데이타를 얻어 저장하였다.
질량 스펙트럼 데이타를 획득하여 질량 스펙트럼 판독치로 정렬되면, 비교 분석을 수행하였으며, 여기서 각 개체군에 대해 LC-ESIMS에서 검사한 각 혈청 표본의 질량 스펙트럼 판독을 병변간 및 병변내 둘 모두에서 수행하였다. 정상 개체군에서 검사한 각 표본간에 질량 스펙트럼 피크를 비교하였다. 다음으로 천식 개체군 및 폐암 개체군에서 검사한 각 표본 간에 질량 스펙트럼 피크를 비교하였다. 병변내 비교를 수행하면, 병변간 비교를 비교하였는데 이때 천식 개체군에 대한 LC-ESIMS에서 검사한 각 표본에 대한 질량 스펙트럼 판독치를 정상 개체군에서 검사한 각 표본과 비교하였다. 유사하게, 폐암 개체군에 대해 LC-ESIMS에서 검사한 각 표본에 대한 질량 스펙트럼 판독치를 정상 개체군에서 검사한 각 표본에 대한 것과 비교하였다.
정상 개체군과 천식 개체군 또는 폐암 개체군을 비교했을 때 펩티드 강도가 병변내에서 비일관적으로 차등 발현되거나 또는 실질적으로 변화되지 않은 것(강도 편차가 10배 미만)으로 나타나는 질량 스펙트럼 판독치를 갖는 펩티드는 유의하지 않은 것으로 판단하여 제외시켰다. 대체로, 사용된 제외 기준은 각 병변 유래의 개별 환자의 분석으로 유도된 10 이상의 데이타 세트에 걸쳐, 소정 단백질에 대해 동정된 특징적인 펩티드의 절반 이상의 펩티드 피크 강도를 비교하는 것을 포함한다. 주어진 단백질에서 유도된 대부분의 펩티드 피크의 강도가 혈청 데이타 세트의 80%에 대한 강도보다 10배 이상 높다면, 이 단백질은 2 병변 부류 간에 차등적으로 조절되는 것으로 분류하였다.
그러나, 차등 조절되는 것으로 관찰된 펩티드를 생성하는 단백질의 정체는 알려진 것이 아니었으므로 동정할 필요가 있었다. 단백질 동정을 위해서, 펩티드 유사-분자 이온 신호 강도를 공지 단백질 및 펩티드 및 의심되는 단백질 및 펩티드의 라이브러리를 포함하는 공지의 데이타베이스에서 비교하였다.
각각의 정상, 폐암 및 천식 개체군 유래의 각 표본에 대한 트립신성 분해물의 질량 스펙트럼 판독치를 Mascot라고 불리는 공지의 검색 엔진에 입력하였다. Mascot는 단백질을 동정하기 위해 4개의 주요한 서열분석 데이타베이스, 즉 MSDB, NCBInr, SwissProt 및 dbEST 데이타베이스로부터의 질량 분광분석 데이타를 사용하는 당분야에 공지된 검색 엔진이다. 이들 데이타베이스는 유전자 서열에서 유도된 특징적인 단백질 전사 개시 영역의 관찰 결과를 기준으로 모든 추정 단백질 및 공지 서열의 모든 단백질에 대한 정보를 보유하고 있다. 상기 데이타베이스들은 연속적으로 정확성 및 중복성을 검토하고 새로운 단백질을 계속 부가하며 유전자 서열을 확인하고 과학 및 특허 문헌에 공개한다.
비교 분석 결과 11종의 단백질이 천식 개체군, 폐암 개체군 및 정상 개체군 간에 일관적으로 차등 발현되는 것으로 확인되었다. 검색 기준 및 매개변수를 Mascot 프로그램에 입력하였고 각 개체군에 대한 질량 스펙트럼 판독치 유래 질량 스펙트럼 데이타를 Mascot 프로그램을 통해 실행시켰다. Mascot 프로그램에 입력된 질량 스펙트럼 데이타는 각 병변의 모든 표본에 대한 것이다. 다음으로, 서열분석 데이타베이스에 대해 입력된 펩티드의 질량 스펙트럼 데이타를 실행시켜, 각 펩티드의 피크 강도 및 질량을 공지 펩티드와 단백질의 질량 및 피크와 비교하였다. 이어 Mascot는 분석한 각 샘플에 대해 통상 "유의한 대응물(significant matches)"로 알려진, 가능한 단백질 동정 대응물의 후보 목록을 보고한 검색 결과를 작성하였다.
유의한 대응물은 검사한 각 표본에 대해 "모우스 스코어(Mowse score)"로 알려진 스코어를 지정하여 Mascot 프로그램을 통해 결정하였다. 모우스 스코어는 -10*LOG10(P)로 표시되는 알고리즘으로서, 여기서 P는 관찰된 대응물이 무작위 사건일 확률로서, 유의도 p값에 상응하고, 여기서 p는 0.05보다 작은데, 이 값은 과학계에서 대체로 허용되는 표준값이다. 대체로 대략 55 내지 대략 66 또는 그 이상의 모우스 스코어가 유의한 것으로 여겨진다. 유의도는 특수한 검색 고려사항 및 데이타베이스 매개변수에 따라 어느정도 다양하다. 유의한 대응물이 각 펩티드 실행 결과로서 보고되어, 단백질 후보 목록이 생성되었다.
다음으로, 천식 개체군 및 폐암 개체군 유래의 검사한 각 표본에 대한 질량 스펙트럼 판독치를 정상 개체군에서 검사한 각 표본의 판독치와 비교하여 비교 분석을 수행하였다. LC-ESIMS에서 검출한 추정 동정된 단백질과 연관된 각 트립신성 펩티드 유사-분자 이온 신호(피크)를 천식, 폐암 및 정상 병변에 걸쳐 비교하였다. 정상 개체군과 천식 개체군 또는 폐암 개체군을 비교시에 펩티드 양이 유의하게 변화되지 않은 것으로 나타난 질량 스펙트럼 피크 강도를 갖는 펩티드는 유의하지 않은 것으로 판단하여 제외시켰다. 대체로, 사용된 제외 기준은 각 병변으로부터의 개별 환자 혈청을 분석하여 유도된 10이상의 데이타 세트에 걸쳐, 소정 단백질에 대해 동정된 특징적인 펩티드의 절반 이상에 대한 펩티드 피크 강도를 비교하는 것을 포함한다. 소정 단백질에서 유도된 대부분의 펩티드 피크의 강도가 혈청 데이타 세트의 80%에 대한 강도에 적어도 10배 더 높은 경우, 그 단백질은 2 병변 부류간에 차등적으로 조절되는 것으로 분류하였다.
질량 스펙트럼 판독치에 의한 데이타를 유의한 대응물과 교차 검토하여 미편집 데이타, 피크 강도, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접 전하 상태를 검증하였다. 역검색을 수행하여 Mascot 프로그램을 통한 자동 검색으로 누락되었을 수 있는 펩티드를 후보 목록에 추가하였다. 추가 펩티드는 비교한 펩티드의 각 매개변수와 실질적으로 대응하는 단일 단백질을 의미하는 "최고 대응물"을 선별하고, 인 실리코 분해를 수행하는데 여기서 트립신성 펩티드 및 이들 각각의 분자 질량을 공지된 단백질의 유전자 서열 또는 아미노산을 기초로 산출하여 동정하였다. 이들 예측 펩티드 질량은 미편집 질량 스펙트럼 데이타에 대해 검색하고 동정된 임의의 피크를 상기 기술한 바와 같이 조사 및 검정하였다. 다음으로, Mascot로 자동 동정된 것과 매뉴얼 조사로 동정된 것을 비롯하여 모든 펩티드를 Mascot가 사용한 질량 목록에 입력하였다. 상세한(refined) 대응물을 사용하여 이하에 나타낸 바와 같이 상세한 모우스 스코어를 유도하였다.
도 1 내지 도 10을 참조하면, 정상 개체군과 비교한 폐암 개체군 또는 천식 개체군 간에 차등 발현되는 것으로 확인된 각 단백질에 대한 Mascot 검색 결과를 도시하였다. 각 경우에서, 검색 기준 및 매개변수를 입력하고, 유의하게 허용되는 모우스 스코어 역치를 정하였다. 도 1에는 단백질 BAC04615에 대한 Mascot 검색 결과를 도시하였다. 검색을 위해 선택된 데이타베이스는 NCBInr(10)이고, Mascot 프로그램에 입력된 표본 분류는 호모 사피언스(12)로 설정하였다. 유의한 모우스 스코어 역치는 66 또는 그 이상(14)의 모우스 값으로 정하였다. Mascot 검색 결과, 모우스 스코어 그래프에 표시한 바와 같이, 121의 최고 스코어가 얻어졌으며(18), 이 그래프에서 y축은 특정 모우스 스코어를 갖는 동정된 단백질의 개수를 의미한다.
도 1에서, 열(20) 나타낸 바와 같이, 121의 최고 모우스 스코어는 gi/21755032에 주어졌다. 121의 모우스 스코어는 상당히 유의한 것으로서, 대응물이 무작위적일 확률이 매우 낮은 것을 의미한다. 사실 컬럼(28)에 나타낸 바와 같이, 이 대응물이 무작위적으로 발생할 기대값은 Mascot 프로그램에 의해 1.7 × lO-07으로 표시된다. 그러나, 표의 열(22, 24 및 26)에 표시한 단백질도 모우스 스코어가 매우 높아, 이들 3 단백질 역시 유의한 대응물이라는 것을 의미한다. 매뉴얼 분석을 수행하였는데, 여기서는 비유의 및/또는 노이즈 데이타를 제거하고, 미편집 데이타, 피크 정체, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접 전하 상태를 교차 검토하였다. 매뉴얼 분석 결과, 열(22, 24 및 26)에 표시한 단백질이 유의한 대응물일 확률이 상당히 감소하였으며, 따라서, 열(22, 24 및 26)에 표시한 단백질은 대응물에서 제외시켰다. 열(20)에 표시한 단백질, gi/21755032는 도 1에서 Mascot 프로그램에 입력한 질량 스펙트럼 데이타에 의해 나타난 단백질로서 동정되었다. 열(20)에 표시한 단백질 번호, gi/21755032에서, gi 번호(때때로 "GI"로 표기함)는 단순히 NCBI가 처리하는 각 서열 기록에 연속적으로 지정하는 일련의 자릿수이다. gi/21755032는 단백질 BAC04615에 해당된다.
도 2에는 단백질 Q6NSC8에 대한 Mascot 검색 결과를 도시하였다. 유의한 모우스 스코어 역치(29)를 64의 모우스 값으로 정하였고, 모우스 스코어 그래프(30)에 모우스 스코어 막대(36)로 표시한 바와 같이, 117의 최고 모우스 스코어를 얻었다. 모우스 스코어 막대(36)와 상관되는 동정 단백질은 아래 열(32)에 기재한 Q6NSC8이다. 도 2에 도시한 바와 같이, 모우스 스코어 그래프(30)의 음영 부분(34)은 기록되었지만, 유의한 역치 미만이어서, 고려 대상에서 제외시킨 단백질들을 의미한다.
도 3은 단백질 CAF17350에 대한 Mascot 검색 결과를 도시하였다. 유의한 모우스 스코어 역치(38)는 64의 모우스 값으로 정하였고, 모우스 스코어 그래프(40)의 모우스 스코어 막대(42)로 나타낸 바와 같이, 152의 최고 모우스 스코어를 얻었다. 모우스 스코어 막대(42)와 상관된 동정 단백질은 표의 열(46)에 나타낸 바와 같이 CAF17350이다. 도 3에 도시한, 모우스 스코어 그래프(40)의 음영 부분(44)은 기록은 되었지만, 유의한 역치보다 낮아서, 고려 대상에서 제외시킨 단백질을 나타낸다.
도 4는 단백질 Q6ZUD4에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 그래프이다. 유의한 모우스 스코어 역치(48)는 64의 모우스 값으로 정하였고, 모우스 스코어 그래프(50)에서 모우스 스코어 막대(52)로 표시한 바와 같이, 220의 최고 모우스 스코어를 얻었다. 모우스 스코어 막대(52)와 상관된 동정 단백질은 하기 표의 열(56)에 나타낸 바와 같이 Q6ZUD4였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 모우스 스코어 그래프(50)의 음영 부분(54)은 기록은 되었지만, 유의한 역치보다 낮아서 고려 대상에서 제외된 단백질을 나타낸다.
도 5는 단백질 Q8N7P1에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 것이다. 유의한 모우스 스코어 역치(58)는 66의 모우스 값으로 정하였고, 모우스 스코어 그래프(60)의 모우스 스코어 막대(62)로 나타낸 바와 같이, 74의 최고 모우스 스코어가 얻어졌다. 모우스 스코어 막대(62)와 상관된 동정 단백질은 표의 열(64)에 나타낸 바와 같이 gi/71682143이다. 도 1과 유사하게, gi/71682143은 단백질 Q8N7PI에 상응한다. 아래 표의 열(66 및 68)에 기재된 단백질도 매우 높은 모우스 스코어를 나타냈으며, 이들 2 단백질 역시 유의한 대응물임을 시사한다. 이후 매뉴얼 분석을 수행하였고, 여기서 비유의 및/또는 노이즈 데이타를 제거하고, 미편집 데이타, 피크 강도, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접 전하 상태를 교차 검토하였다. 매뉴얼 분석 결과, 아래 표의 열(66 및 68)에 표시한 단백질이 유의한 대응물일 확률이 상당히 감소되어, 열(66 및 68)에 기재된 단백질은 대응물에서 제외시켰다. 도 5에서 Mascot 프로그램에 입력된 질량 스펙트럼 데이타가 나타내는 단백질로서 Q8N7PI가 동정되었다. 단백질 Q8NB22에 대한 표시 70은 이것이 Q8N7PI와 동일한 단백질이기 때문에 표시한 것이다.
도 6은 단백질 CAC69571에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 것이다. 유의한 모우스 스코어 역치(72)는 64의 모우스 값으로 설정하였고, 모우스 스코어 그래프(74)의 모우스 스코어 막대(76)로 표시한 바와 같이, 171의 최고 모우스 스코어를 얻었다. 모우스 스코어 막대(76)와 상관된 동정 단백질은 아래 표의 열(78)에 나타낸 바와 같이 CAC69571이었다. 열(80, 82, 84 및 86)에 표시된 단백질도 매우 높은 모우스 스코어를 가지므로, 이들 4 단백질도 유의한 대응물일 수 있다. 매뉴얼 분석을 수행하여, 비유의 및/또는 노이즈 데이타를 제거하고, 미편집 데이타, 피크 강도, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접 전하 상태를 교차 검토하였다. 매뉴얼 분석 결과, 표의 열(80, 82, 84 및 86)에 기재된 단백질들이 유의한 대응물일 확률이 상당히 감소되었고, 그에 따라, 열(80, 82, 84 및 86)에 기재된 단백질은 대응물에서 제외시켰다. 도 6에서 Mascot 프로그램에 입력된 질량 스펙트럼 데이타에 의해 표시된 단백질로서 CAC69571이 동정되었다.
도 7은 단백질 FERM 4 도메인 함유 단백질 4에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 것이다. 유의한 모우스 스코어 역치(88)는 64의 모우스 값으로 정하고, 모우스 스코어 그래프(90)의 모우스 스코어 막대(92)로 표시한 바와 같이, 335의 최고 모우스 스코어를 얻었다. 모우스 스코어 막대(92)와 상관된 동정 단백질은 표의 열(98)에 나타낸 바와 같이, FERM 4 도메인 함유 단백질 4이다. 열(100, 102, 104 및 106 및 108)에 나타낸 단백질도 모우스 스코어가 매우 높아, 이들 5종의 단백질도 유의한 대응물일 수 있다. 매뉴얼 분석을 수행하여, 비유의 및/또는 노이즈 데이타를 제거하고, 미편집 데이타, 피크 강도, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접 전하 상태를 교차 검토하였다. 매뉴얼 분석 결과, 열(100, 102, 104 및 106 및 108)에 기재한 단백질이 유의한 대응물일 확률이 상당히 감소하여, 열(100, 102, 104 및 106 및 108)에 기재된 단백질은 대응물에서 제외시켰다. 도 7에서 Mascot 프로그램에 입력된 질량 스펙트럼 데이타에 의해 나타낸 단백질로서 FERM 4 도메인 함유 단백질 4가 동정되었다.
도 8은 단백질 JCC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스 형태("JCC 1445")에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 것이다. 유의한 모우스 스코어 역치(110)는 66의 모우스 값으로 정하였고, 모우스 스코어 그래프(112)에서 모우스 스코어 막대(114)로 표시한 바와 같이, 123의 최고 모우스 스코어를 얻었다. 모우스 스코어 막대(114)와 상관된 동정 단백질은 표 열(116)에 기재된 바와 같이 gi/4506179이다. gi/4506179는 단백질 JCC1445에 해당된다. 열(118, 120, 122, 124, 126 및 128)에 나타낸 단백질도 모우스 스코어가 높아, 이들 6종의 단백질도 유의한 대응물일 수 있다. 매뉴얼 분석을 수행하여, 비유의 및/또는 노이즈 데이타를 제거하고, 미편집 데이타, 피크 강도, 전하 다중도, 동위원소 분포도 및 측접 전하 상태를 교차 검토하였다. 매뉴얼 분석 결과, 열(118, 120, 122, 124, 126 및 128)에 기재한 단백질이 유의한 대응물일 확률이 상당히 감소하여, 열(118, 120, 122, 124, 126 및 128)에 기재한 단백질들은 대응물로서는 제외시켰다. 도 8에서 Mascot 프로그램에 입력된 질량 스펙트럼 데이타에 의해 나타난 단백질로서 JCC 1445가 동정되었다.
도 9는 단백질 신택신 11에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 것이다. 유의한 모우스 스코어 역치(130)는 66의 모우스 값으로 정하였고, 모우스 스코어 막대(134), 및 하기 표의 열(136 및 138)에 나타낸 바와 같이, 127의 최고 모우스 스코어를 2회 얻었다. 열(140)에 기재한 바와 같이, 세번째의 95의 모우스 스코어를 신택신 11에 대해 얻었다. 도 9에서 Mascot 프로그램에 입력한 질량 스펙트럼 데이타에 의해 표시된 단백질로서 신택신 11이 얻어졌다.
도 10은 2종의 단백질, AAK13083 및 AAK13049에 대한 Mascot 검색 결과를 도시한 것이다. 유의한 모우스 스코어 역치(142)는 64의 모우스 값으로 정하였고, 표의 열(148) 및 모우스 스코어 막대(146)에 표시한 바와 같이, 273의 최고 모우스 스코어는 단백질 Q5VY82에 대해 얻어졌다. 열(150, 152 및 154)에 기재한 단백질도 모우스 스코어가 매우 높아, 이들 3종의 단백질도 유의한 대응물일 수 있다. 그러나, 매뉴얼 분석을 수행한 결과, 열(150 및 154)에 기재한 단백질은 가능한 대응물에서 제외하였다. Q5VY82은 유의하게 차등 발현 여부를 확인하기 위해 추가 조사 및 실험을 수행중이다. 열(152)에 기재한 AAK13049 및 AAK13083은 둘 모두 도 10에 입력된 질량 스펙트럼 데이타에 의해 나타난 단백질로서 동정되었다.
도 1 내지 도 10은 정상 개체군과 비교시 천식 및/또는 폐암 개체군에서 차등 발현되는 11종의 단백질을 동정하기 위해 수행된 데이타 분석 결과를 도시한 것이다. 본 명세서에서 기술하고, 도 1 내지 도 10에 나타낸 바와 같은 방법을 천식 개체군, 정상 개체군 및 폐암 개체군에 대해서, 상기 11종 단백질 각각에 대해 수행하였다.
동정 결과, 천식 개체군, 폐암 개체군 및/또는 정상 개체군 간에 유의하게 차등 발현되는 것으로 확인된 11종의 단백질은 BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1, CAC69571, FERM 도메인 함유 단백질 4, JCC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스 형태, 신택신 11, AAK13083, 및 AAK13049인 것으로 확인되었다. BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1은 유전자 서열분석 실시 결과 동정된 단백질들이다. FERM 도메인 함유 단백질 4는 세포질내 단백질 막 앵커리지에 관여하는 것으로 알려져 있다. JCC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스 형태는 공지된 프로테아솜이다. 신택신 11은 세포 면역 반응에서 활성이 있다. BAC04615, AAK13083 및 AAK13049는 MHC(major histocompatibility complex) 연관 단백질이다.
천식 및 폐암 환자에서 일관적으로 차등 발현되는 11종의 특이적 단백질을 동정함으로써, 환자 혈청 유래의 상기 단백질 BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1, CAC69571, FERM 도메인 함유 단백질 4, JCC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스 형태, 신택신 11, AAK13083 및 AAK13049에 대해 LC-ESIMS를 수행하고, 이들 단백질로부터, 질량 스펙트럼 데이타를 얻고, 이 질량 스펙트럼 데이타를 정상 개체군의 질량 스펙트럼 데이타와 비교하여, 질환의 진행 초기에 상기 병변들을 진단하는 것이 가능하다. 주어진 병변의 존재를 확증하거나 무효화하기 위해 폐암 개체군 및/또는 천식 개체군 유래의 질량 스펙트럼 데이타를 상기 질량 스펙트럼 데이타와 비교하여 추가 분석을 수행할 수 있다.
물론, 상기 분석을, 방사-면역 분석법, 효소 연결 면역 흡착 분석법, 가시광 또는 자외선광의 흡광을 통한 분광분석 검출, 방사분석 검출을 포함하는 고압 액상 크로마토그래피, 질량 분광분석적 정량 및 정석 분석, 웨스턴 블로팅, 방사성 프로브 또는 핵 검출을 통한 정량적 가시화를 이용한 1차원 또는 2차원 겔 전기영동법, 흡광성 또는 형광성 광도측정법을 이용한 항체 기반 검출법, 다수의 화학발광 리포터 시스템 중 어느 하나의 발광을 통한 정량법, 효소 분석법, 면역침강 또는 면역포획 분석법, 또는 다수의 액상 및 고상 면역 분석법 중 어느 하나 등을 비롯하여, 다수의 추가 기법으로 확대해서 특이적인 단백질 농도를 측정할 수 있다.
질환 발병 초기에 폐암 또는 천식의 존재를 확인하는 것 이외에도, 이러한 병변의 지표로서 본 발명에서 동정된 단백질은 더 나아가서 폐암 및/또는 천식 치료 목적과 관련된 방법에 사용하고 적용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질들에 결합하는 항체를 개발할 수 있다. 이러한 항체를 바이오마커 패널에서 어셈블리할 수 있는데, 여기서 임의의 또는 모든 항체를 단일 비드 기반 패널에 어셈블리하거나 또는 비드 기반 면역분석용 키트에 어셈블리할 수 있다. 다음으로, 상기 단백질들을 비드 기반 기법, 예컨대 Luminex's xMAP 기법을 사용하는 복합 면역분석법을 실시하고, 정량할 수 있다. 또한, 다른 비-비드 기반 분석법을 사용하여 단백질 발현도를 정량할 수 있다. 단백질 발현도 정량을 통해서, 정량 결과를 정상 개체군, 천식 개체군 및/또는 폐암 개체군의 발현도와 비교하여 환자에서 폐암 또는 천식 존재를 더욱 확증하거나 무효화할 수 있다.
상기 단백질을 또한 약학 분야에서 사용하고 적용하여 약물 치료, 방사선/화학치료법, 또는 수술 치료법 등의 치료 중재법에 대한 환자의 반응을 평가할 수 있다. 또한, 개별 단백질 또는 단백질 패널을 측정하기 위한 키트를 환자에 대한 일상적 검사에 사용하여 상기 병변들의 위험도가 높은 환자, 예컨대 흡연자, 또는 상기 병변의 가족력이 있는 개체 등의 건강 상태를 모니터링할 수 있다.
마지막으로, 본 발명에서 동정된 11종 단백질 각각에 대한 아미노산 서열의 서열 목록을 참조하여 본 발명에 포함시켰다. 서열 목록에서, 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일에 공지된 단백질 BAC04615에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 2에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 Q6NSC8에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 3에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 CAF17350에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 4에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 Q6ZUD4에 대한 아미노산 서열이다. 서열 번호 5에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 FERM 도메인 함유 단백질 4에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 6에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 AAK13083에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 7에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 Q8N7P1에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 8에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 CAC69571에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 9에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 JCC1445프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 10에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 신택신 11에 대한 1차 아미노산 서열이다. 서열 번호 11에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일로 공지된 단백질 AAK13049에 대한 1차 아미노산 서열이다.
본 명세서 및 서열 목록에 개시된 아미노산 서열은 본건 출원일자에 공지된 1차 아미노산 서열이다. 추후 상기 단백질들에 대해 서열 목록에 열거된 서열에 변형을 가할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 열거된 단백질의 프로세싱으로 변화된 번역후 변형이 발견되거나 또는 신체 내에서 그들 기능 중에 일부 지점에서 상기 단백질에 대한 기능성 부가물이 형성될 수 있다. 또한, 서열 목록은 명명된 단백질과 동일한 패밀리의 구조적으로 밀접한 관련 단백질의 발견이나 또는 스플라이싱 차이로 인해 변경될 수 있다. 또한, 열거한 단백질의 분해 또는 프로세싱으로 발생되는 이들 단백질의 모든 변경물(permutation)에서 단백질분해성 단편은, 모 단백질이 의약 및 약학 분야에서 활용되는 모든 방법에서 유용한 마커 단편을 생성할 수 있다. 이러한 변형은 본 명세서에서 개시한 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서, 본 명세서에 개시한 본 발명의 범주에 속하는 것으로 간주된다.
본 발명을 특정 구체예를 참조하여 설명되었지만, 이러한 설명에 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본 발명을 참조하여 본 발명의 대안적인 구체예를 비롯하여, 개시된 구체예를 다양하게 변형할 수 있다는 것은 당분야의 당업자에게 자명하다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 범주에 속하는 이러한 변형을 포괄하는 것으로 간주된다.
<110> Streeper, Robert T.; Izbicka, Elzbieta; Baek, Sung H. <120> Method of Identifying Proteins in Human Serum Indicative of Pathologies of Human Lung Tissues <130> P9286.2 <140> <141> <150> US 60/971,422 <151> 2007-09-11 <160> 11 <210> 1 <211> 319 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 1 Met Val Leu Ser Glu Leu Ala Ala Arg Leu Asn Cys Ala Glu Tyr 5 10 15 Lys Asn Trp Val Lys Ala Gly His Cys Leu Leu Leu Leu Arg Ser 20 25 30 Cys Leu Gln Gly Phe Val Gly Arg Glu Val Leu Ser Phe His Arg 35 40 45 Gly Leu Leu Ala Ala Ala Pro Gly Leu Gly Pro Arg Ala Val Cys 50 55 60 Arg Gly Gly Ser Arg Cys Ser Pro Arg Ala Arg Gln Phe Gln Pro 65 70 75 Gln Cys Gln Val Cys Ala Glu Trp Lys Arg Glu Ile Leu Arg His 80 85 90 His Val Asn Arg Asn Gly Asp Val His Trp Gly Asn Cys Arg Pro 95 100 105 Gly Arg Trp Pro Val Asp Ala Trp Glu Val Ala Lys Ala Phe Met 110 115 120 Pro Arg Gly Leu Ala Asp Lys Gln Gly Pro Glu Glu Cys Asp Ala 125 130 135 Val Ala Leu Leu Ser Leu Ile Asn Ser Cys Asp His Phe Val Val 140 145 150 Asp Arg Lys 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Ala Gly Ala Leu Gly Ser 785 790 795 Ala Ser Ser Gly Ser Met Pro Asn Leu Ala Ala Arg Gly Gly Ala 800 805 810 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Tyr Leu His Ser Gln 815 820 825 Ser Gln Pro Ser Ser Gln Tyr Arg Ile Lys Glu Tyr Pro Leu Tyr 830 835 840 Ile Glu Gly Gly Ala Thr Pro Val Val Val Arg Ser Leu Glu Ser 845 850 855 Asp Gln Glu Gly His Tyr Ser Val Lys Ala Gln Phe Lys Thr Ser 860 865 870 Asn Ser Tyr Thr Ala Gly Gly Leu Phe Lys Glu Ser Trp Arg Gly 875 880 885 Gly Gly Gly Asp Glu Gly Asp Thr Gly Arg Leu Thr Pro Ser Arg 890 895 900 Ser Gln Ile Leu Arg Thr Pro Ser Leu Gly Arg Glu Gly Ala His 905 910 915 Asp Lys Gly Ala Gly Arg Ala Ala Val Ser Asp Glu Leu Arg Gln 920 925 930 Trp Tyr Gln Arg Ser Thr Ala Ser His Lys Glu His Ser Arg Leu 935 940 945 Ser His Thr Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ser Gly Ser Gln Tyr Ser 950 955 960 Thr Ser Ser Gln Ser Thr Phe Val Ala His Ser Arg Val Thr Arg 965 970 975 Met Pro Gln Met Cys Lys Ala Thr Ser Ala Ala Leu Pro Gln Ser 980 985 990 Gln Arg Ser Ser Thr Pro Ser 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Pro Arg Asn Val 530 535 <210> 8 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Asn Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ile Phe Ser Gly 5 10 15 Gly Phe Arg His Gly Ser Leu Ile Ser Ile Asp Ser Thr Cys Thr 20 25 30 Glu Met Gly Asn Phe Asp Asn Ala Asn Val Thr Gly Glu Ile Glu 35 40 45 Phe Ala Ile His Tyr Cys Phe Lys Thr His Ser Leu Glu Ile Cys 50 55 60 Ile Lys Ala Cys Lys Asn Leu Ala Tyr Gly Glu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 Lys Cys Asn Pro Tyr Val Lys Thr Tyr Leu Leu Pro Asp Arg Ser 80 85 90 Ser Gln Gly Lys Arg Lys Thr Gly Val Gln Arg Asn Thr Val Asp 95 100 105 Pro Thr Phe Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Gln Val Ala Pro Ala Gln 110 115 120 Leu Val Thr Arg Gln Leu Gln Val Ser Val Trp His Leu Gly Thr 125 130 135 Leu Ala Arg Arg Val Phe Leu Gly Glu Val Ile Ile Ser Leu Ala 140 145 150 Thr Trp Asp Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gln Ser Phe Arg Trp His 155 160 165 Pro Leu Arg Ala Lys Ala Glu Lys Tyr Glu Asp Ser Val Pro Gln 170 175 180 Ser Asn Gly Glu Leu Thr Val Arg Ala Lys Leu Val Leu Pro Ser 185 190 195 Arg Pro Arg Lys Leu Gln Glu Ala Gln Glu Gly Thr Asp Gln Pro 200 205 210 Ser Leu His Gly Gln Leu Cys Leu Val Val Leu Gly Ala Lys Asn 215 220 225 Leu Pro Val Arg Pro Asp Gly Thr Leu Asn Ser Phe Val Lys Gly 230 235 240 Cys Leu Thr Leu Pro Asp Gln Gln Lys Leu Arg Leu Lys Ser Pro 245 250 255 Val Leu Arg Lys Gln Ala Cys Pro Gln Trp Lys His Ser Phe Val 260 265 270 Phe Ser Gly Val Thr Pro Ala Gln Leu Arg Gln Ser Ser Leu Glu 275 280 285 Leu Thr Val Trp Asp Gln Ala Leu Phe Gly Met Asn Asp Arg Leu 290 295 300 Leu Gly Gly Thr Arg Leu Gly Ser Lys Gly Asp Thr Ala Val Gly 305 310 315 Gly Asp Ala Cys Ser Leu Ser Lys Leu Gln Trp Gln Lys Val Leu 320 325 330 Ser Ser Pro Asn Leu Trp Thr Asp Met Thr Leu Val Leu His <210> 9 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Phe Arg Asn Gln Tyr Asp Asn Asp Val Thr Val Trp Ser Pro 5 10 15 Gln Gly Arg Ile His Gln Ile Glu Tyr Ala Met Glu Ala Val Lys 20 25 30 Gln Gly Ser Ala Thr Val Gly Leu Lys Ser Lys Thr His Ala Val 35 40 45 Leu Val Ala Leu Lys Arg Ala Gln Ser Glu Leu Ala Ala His Gln 50 55 60 Lys Lys Ile Leu His Val Asp Asn His Ile Gly Ile Ser Ile Ala 65 70 75 Gly Leu Thr Ala Asp Ala Arg Leu Leu Cys Asn Phe Met Arg Gln 80 85 90 Glu Cys Leu Asp Ser Arg Phe Val Phe Asp Arg Pro Leu Pro Val 95 100 105 Ser Arg Leu Val Ser Leu Ile Gly Ser Lys Thr Gln Ile Pro Thr 110 115 120 Gln Arg Tyr Gly Arg Arg Pro Tyr Gly Val Gly Leu Leu Ile Ala 125 130 135 Gly Tyr Asp Asp Met Gly Pro His Ile Phe Gln Thr Cys Pro Ser 140 145 150 Ala Asn Tyr Phe Asp Cys Arg Ala Met Ser Ile Gly Ala Arg Ser 155 160 165 Gln Ser Ala Arg Thr Tyr Leu Glu Arg His Met Ser Glu Phe Met 170 175 180 Glu Cys Asn Leu Asn Glu Leu Val Lys His Gly Leu Arg Ala Leu 185 190 195 Arg Glu Thr Leu Pro Ala Glu Gln Asp Leu Thr Thr Lys Asn Val 200 205 210 Ser Ile Gly Ile Val Gly Lys Asp Leu Glu Phe Thr Ile Tyr Asp 215 220 225 Asp Asp Asp Val Ser Pro Phe Leu Glu Gly Leu Glu Glu Arg Pro 230 235 240 Gln Arg Lys Ala Gln Pro Ala Gln Pro Ala Asp Glu Pro Ala Glu 245 250 255 Lys Ala Asp Glu Pro Met Glu His 260 <210> 10 <211> 287 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Lys Asp Arg Leu Ala Glu Leu Leu Asp Leu Ser Lys Gln Tyr 5 10 15 Asp Gln Gln Phe Pro Asp Gly Asp Asp Glu Phe Asp Ser Pro His 20 25 30 Glu Asp Ile Val Phe Glu Thr Asp His Ile Leu Glu Ser Leu Tyr 35 40 45 Arg Asp Ile Arg Asp Ile Gln Asp Glu Asn Gln Leu Leu Val Ala 50 55 60 Asp Val Lys Arg Leu Gly Lys Gln Asn Ala Arg Phe Leu Thr Ser 65 70 75 Met Arg Arg Leu Ser Ser Ile Lys Arg Asp Thr Asn Ser Ile Ala 80 85 90 Lys Ala Ile Lys Ala Arg Gly Glu Val Ile His Cys Lys Leu Arg 95 100 105 Ala Met Lys Glu Leu Ser Glu Ala Ala Glu Ala Gln His Gly Pro 110 115 120 His Ser Ala Val Ala Arg Ile Ser Arg Ala Gln Tyr Asn Ala Leu 125 130 135 Thr Leu Thr Phe Gln Arg Ala Met His Asp Tyr Asn Gln Ala Glu 140 145 150 Met Lys Gln Arg Asp Asn Cys Lys Ile Arg Ile Gln Arg Gln Leu 155 160 165 Glu Ile Met Gly Lys Glu Val Ser Gly Asp Gln Ile Glu Asp Met 170 175 180 Phe Glu Gln Gly Lys Trp Asp Val Phe Ser Glu Asn Leu Leu Ala 185 190 195 Asp Val Lys Gly Ala Arg Ala Ala Leu Asn Glu Ile Glu Ser Arg 200 205 210 His Arg Glu Leu Leu Arg Leu Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val His 215 220 225 Glu Leu Phe Leu Gln Met Ala Val Leu Val Glu Lys Gln Ala Asp 230 235 240 Thr Leu Asn Val Ile Glu Leu Asn Val Gln Lys Thr Val Asp Tyr 245 250 255 Thr Gly Gln Ala Lys Ala Gln Val Arg Lys Ala Val Gln Tyr Glu 260 265 270 Glu Lys Asn Pro Cys Arg Thr Leu Cys Cys Phe Cys Cys Pro Cys 275 280 285 Leu Lys <210> 11 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Ala Ala Ala Ser Pro Ala Ile Leu Pro Arg Leu Ala Ile 5 10 15 Leu Pro Tyr Leu Leu Phe Asp Trp Ser Gly Thr Gly Arg Ala Asp 20 25 30 Ala His Ser Leu Trp Tyr Asn Phe Thr Ile Ile His Leu Pro Arg 35 40 45 His Gly Gln Gln Trp Cys Glu Val Gln Ser Gln Val Asp Gln Lys 50 55 60 Asn Phe Leu Ser Tyr Asp Cys Gly Ser Asp Lys Val Leu Ser Met 65 70 75 Gly His Leu Glu Glu Gln Leu Tyr Ala Thr Asp Ala Trp Gly Lys 80 85 90 Gln Leu Glu Met Leu Arg Glu Val Gly Gln Arg Leu Arg Leu Glu 95 100 105 Leu Ala Asp Thr Glu Leu Glu Asp Phe Thr Pro Ser Gly Pro Leu 110 115 120 Thr Leu Gln Val Arg Met Ser Cys Glu Cys Glu Ala Asp Gly Tyr 125 130 135 Ile Arg Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp Gly Arg Lys Phe Leu 140 145 150 Leu Phe Asp Ser Asn Asn Arg Lys Trp Thr Val Val His Ala Gly 155 160 165 Ala Arg Arg Met Lys Glu Lys Trp Glu Lys Asp Ser Gly Leu Thr 170 175 180 Thr Phe Phe Lys Met Val Ser Met Arg Asp Cys Lys Ser Trp Leu 185 190 195 Arg Asp Phe Leu Met His Arg Lys Lys Arg Leu Glu Pro Thr Ala 200 205 210 Pro Pro Thr Met Ala Pro Gly Leu Ala Gln Pro Lys Ala Ile Ala 215 220 225 Thr Thr Leu Ser Pro Trp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Cys Phe Ile 230 235 240 Leu Pro Gly Ile

Claims (45)

  1. 폐조직 병변이 없는 인간 유래 혈청에서 동일 단백질의 발현도를 비교시 발현도가 변경된 경우에 인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청내 존재하는 단백질을 동정하는 방법으로서,
    인간 폐조직 병변이 없는 인간 개체군에서 다수의 인간 혈청을 획득하는 제1 획득 단계;
    천식이 있는 인간 개체군에서 다수의 인간 혈청을 획득하는 제2 획득 단계;
    비소세포 폐암이 있는 인간 개체군에서 다수의 인간 혈청을 획득하는 제3 획득 단계;
    상기 제1 획득 단계, 제2 획득 단계 및 제3 획득 단계 동안 획득된 인간 혈청을 분해제에 노출시켜, 상기 분해제가 상기 인간 혈청내 상기 단백질을 예측가능하고 규명된(defined) 펩티드로 절단하는 단계;
    상기 인간 혈청에서 상기 펩티드를 분리하는 단계;
    상기 제1 획득 단계, 제2 획득 단계 및 제3 획득 단계 동안 획득된 상기 다수의 인간 혈청 각각에서 유래된 상기 펩티드에 대해서 액상 크로마토그래피 질량 분광계를 사용하여 분석을 수행하는 단계로서, 상기 질량 분광계는 그 내부에, 상기 펩티드를 분리하는 용매계가 흐르는 소수성 고정층 컬럼, 및 질량 스펙트럼 판독치를 산출하는 검출 기구를 구비하며, 상기 질량 스펙트럼 판독치는 상기 펩티드의 질량, 및 상기 펩티드가 상기 컬럼을 통과하는 시간 동안 상기 펩티드의 강도를 측정한 그래프를 포함하는 것인 단계;
    상기 제1 획득 단계에서 얻은 인간 혈청 유래의 질량 스펙트럼 판독치를 상기 제2 획득 단계에서 얻은 인간 혈청 유래의 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제1 비교 단계;
    상기 제1 획득 단계에서 얻은 인간 혈청 유래의 질량 스펙트럼 판독치를 상기 제3 획득 단계에서 얻은 인간 혈청 유래의 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제2 비교 단계;
    상기 제2 획득 단계에서 얻은 인간 혈청 유래의 질량 스펙트럼 판독치를 상기 제3 획득 단계에서 얻은 인간 혈청 유래의 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제3 비교 단계;
    상기 제1 비교 단계, 제2 비교 단계 및 제3 비교 단계에서 비교한 질량 스펙트럼 판독치를 선별하는 단계로서, 여기서 질량 스펙트럼 판독치는 (a) 상기 천식이 있는 인간 개체군과 상기 폐조직 병변이 없는 인간 개체군 간, (b) 상기 비소세포 폐암이 있는 인간 개체군과 상기 폐조직 병변이 없는 인간 개체군 간, 및 (c) 상기 천식이 있는 인간 개체군과 상기 비소세포 폐암이 있는 인간 개체군 간에 상기 동일 펩티드의 강도를 실질적으로 다양하게 나타낸 것인 선별 단계;
    상기 선별 단계 동안 선별된 질량 스펙트럼 판독치에서 상기 펩티드의 정체성을 얻어 상기 인간 폐조직 병변의 지표가 되는 단백질을 동정하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 인간 폐조직 병변은 천식 및 비소세포 폐암을 포함하는 것인 동정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분해제는 트립신 또는 다른 엔도프로테아제인 동정 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 동정 단계는
    상기 선별 단계 동안 선별된 질량 스펙트럼 판독치를 사전정해진 컴퓨터 프로그램을 통해 분석하는 단계로서, 상기 사전정해진 컴퓨터 프로그램은 상기 펩티드의 질량 스펙트럼 판독치를 사전동정된 단백질의 질량 스펙트럼 판독치의 1 이상의 라이브러리와 비교하고, 상기 질량 스펙트럼 판독치의 상기 펩티드의 질량 및 강도를 상기 사전동정된 단백질의 질량 및 강도와 대응시키는 단계; 및
    상기 사전정해진 컴퓨터 프로그램으로부터 최종 동정된 단백질을 획득하는 단계
    를 더 포함하는 것인 동정 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 동정 단계는
    상기 선별 단계 동안 선별된 질량 스펙트럼 판독치를 사전정해진 컴퓨터 프로그램을 통해 실행시키는 단계로서, 상기 사전정해진 컴퓨터 프로그램은 상기 펩티드의 질량 스펙트럼 판독치를 사전동정된 단백질의 질량 스펙트럼 판독치의 1 이상의 라이브러리와 비교하고, 상기 질량 스펙트럼 판독치의 상기 펩티드의 질량 및 강도를 상기 사전동정된 펩티드의 후보 목록의 질량 및 강도와 대응시키며, 상기 후보 목록은 상기 펩티드의 질량 및 강도와 실질적으로 유사한 질량 및 강도를 갖는 다수의 상기 사전동정된 단백질을 포함하는 것인 단계; 및
    상기 후보 목록으로부터 최종 동정된 단백질을 결정하는 단계
    를 더 포함하는 것인 동정 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 결정 단계는
    상기 펩티드의 강도 및 질량과 실질적으로 가장 유사하지 않은 상기 단백질의 강도 및 질량을 상기 후보 목록에서 제거하는 단계; 및
    상기 펩티드의 강도 및 질량과 실질적으로 가장 유사한 강도 및 질량을 상기 후보 목록에서 선택하는 단계
    를 포함하는 상기 최종 동정된 단백질이 아닌 단백질을 상기 후보 목록에서 제거하는 단계를 포함하는 것인 동정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 CAC69571을 포함하는것인 동정 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 FERM 도메인 함유 단백질 4를 포함하는 것인 동정 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스(JC1445 proteasome endopeptidase complex chain C2 long splice)를 포함하는 것인 동정 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 포함하는 것인 동정 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 FERM 도메인 함유 단백질 4를 더 포함하는 것인 동정 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 더 포함하는 것인 동정 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 더 포함하는 것인 동정 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 더 포함하는 것인 동정 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  20. 제6항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZVD4 및 Q8N7P1로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 동정 단계에서 동정된 단백질은 BAC04615, AK13083 및 AK13490으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질을 더 포함하는 것인 동정 방법.
  22. 인간 환자의 혈청 표본내 단백질의 발현 강도 변화를 확인하여 상기 환자에서 인간 폐조직 병변을 진단하는 방법으로서,
    상기 단백질의 발현 강도 변화를 검사하려는 상기 환자 혈청 표본을 획득하는 제1 획득 단계;
    상기 환자 혈청 표본을 분해제에 노출시켜, 분해제가 상기 환자 혈청 표본 내 단백질을 규명된 펩티드로 절단하는 단계;
    상기 환자 혈청 표본에서 상기 펩티드를 분리하는 단계;
    상기 제1 획득 단계 동안 획득된 상기 환자 혈청 표본 유래 펩티드에 대해 액상 크로마토그래피 질량 분광계를 사용하여 분석을 수행하는 단계로서, 상기 질량 분광계는 그 내부에, 상기 펩티드를 분리하는 용매계가 흐르는 소수성 고정층 컬럼, 및 질량 스펙트럼 판독치를 산출하기 위한 검출 기구를 구비하며, 상기 질량 스펙트럼 판독치는 상기 펩티드의 질량, 및 상기 펩티드가 상기 컬럼을 통과하는 기간 동안 상기 펩티드의 강도를 측정한 그래프를 포함하는 것인 단계;
    상기 질량 스펙트럼 판독치를 비교하기 위해 상기 인간 혈청 표본 유래의 상기 펩티드 중 1 이상을 선별하는 단계로서, 상기 펩티드의 질량 스펙트럼 판독치는 상기 노출 단계 동안 상기 펩티드가 절단된 단백질의 질량 스펙트럼 판독치를 나타내는 것인 선별 단계;
    상기 선별 단계 동안 선별된 상기 펩티드로 대표되는 동일 단백질 각각에 대해 실질적으로 미변화된 발현 강도의 질량 스펙트럼 판독치를 획득하는 제2 획득 단계로서, 상기 미변화된 발현 강도는 인간 폐조직의 상기 병변이 없는 인간 개체군 혈청 표본으로부터 결정된 것인 단계;
    상기 환자 혈청 표본으로부터 상기 선별 단계에서 선별된 1 이상의 상기 펩티드의 상기 질량 스펙트럼 판독치를 상기 인간 폐조직 병변이 없는 인간 개체군 혈청 표본으로부터의 상기 미변화된 단백질 발현의 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제1 비교 단계;
    상기 환자 혈청 표본의 상기 단백질 발현 강도가 변화되었는지 결정하는 제1 결정 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 단백질 발현의 변화된 강도는 상기 인간 폐조직 병변의 지표가 되며, 상기 인간 폐조직 병변은 비소세포 폐암 및 천식을 포함하는 것인 진단 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 분해제는 트립신 또는 다른 엔도프로테아제인 진단 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 CAC69571을 포함하는 것인 진단 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 FERM 도메인 함유 단백질 4를 포함하는 것인 진단 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 포함하는 것인 진단 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 포함하는 것인 진단 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 FERM 도메인 함유 단백질 4를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  30. 제24항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  33. 제26항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  34. 제28항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 JC1445 프로테아솜 엔도펩티다제 복합체 사슬 C2 장 스플라이스를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 신택신 11을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZVD4 및 Q8N7P1로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 선별 단계에서 선별된 단백질은 BAC04615, AK13083 및 AK13490로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질을 더 포함하는 것인 진단 방법.
  40. 제39항에 있어서, 천식이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본으로부터 상기 선별 단계 동안 선별된 상기 펩티드로 대표되는 동일 단백질 각각에 대해 발현 강도의 질량 스펙트럼 판독치를 획득하는 제3 획득 단계;
    상기 환차 혈청 표본에서 상기 선별 단계 동안 선별된 상기 1 이상의 펩티드의 상기 질량 스펙트럼 판독치를 천식이 있는 상기 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제2 비교 단계;
    상기 환자 혈청 표본의 상기 단백질 발현 강도가 천식이 있는 상기 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 단백질 발현 강도와 실질적으로 유사한지 결정하는 제2 결정 단계로서, 여기서 상기 실질적으로 유사한 단백질 발현 강도가 천식의 지표가 되는 것인 제2 결정 단계
    를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  41. 제39항에 있어서, 비소세포 폐암이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본으로부터 상기 선별 단계 동안 선별된 상기 펩티드로 대표되는 동일 단백질 각각에 대한 신호 강도의 질량 스펙트럼 판독치를 획득하는 제4 획득 단계;
    상기 환자 혈청 표본에서 상기 선별 단계 동안 선별된 상기 1 이상의 펩티드의 상기 질량 스펙트럼 판독치를 비소세포 폐암이 있는 인간 유래 인간 개체군 혈청 표본의 상기 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제3 비교 단계;
    상기 환자 혈청 표본의 상기 단백질 발현 강도가 비소세포 폐암이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 상기 단백질 발현 강도와 실질적으로 유사한지 결정하는 제3 결정 단계로서, 상기 실질적으로 유사한 단백질 발현 강도가 소세포 폐암의 지표가 되는 것인 제3 결정 단계
    를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  42. 제40항에 있어서, 비소세포 폐암이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본으로부터 상기 선별 단계 동안 선별된 상기 펩티드로 대표되는 동일 단백질 각각에 대한 발현 강도의 질량 스펙트럼 판독치를 획득하는 제4 획득 단계;
    상기 환자 혈청 표본에서 상기 선별 단계 동안 선별된 상기 1 이상의 펩티드의 상기 질량 스펙트럼 판독치를 비소세포 폐암이 있는 인간 유래 인간 개체군 혈청 표본의 상기 질량 스펙트럼 판독치와 비교하는 제3 비교 단계;
    상기 환자 혈청 표본의 상기 단백질 발현 강도가 비소세포 폐암이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 상기 단백질 발현 강도와 실질적으로 유사한지 결정하는 제3 결정 단계로서, 상기 실질적으로 유사한 단백질 발현 강도가 소세포 폐암의 지표가 되는 것인 제3 결정 단계
    를 더 포함하는 것인 진단 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 천식이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 단백질 발현 강도의 질량 스펙트럼 판독치는 상기 개체군 유래의 각 인간 혈청 표본을 분해하고, 각각의 상기 인간 혈청 표본에서 펩티드를 분리한 후, 상기 각각의 상기 인간 혈청 표본의 펩티드에 대해 액상 크로마토그래피 질량 분광분석법을 수행하여 획득된 것인 진단 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 비소세포 폐암이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 단백질 발현 강도의 질량 스펙트럼 판독치는 상기 개체군 유래의 각 인간 혈청 표본을 분해하고, 각 인간 혈청 표본에서 펩티드를 분리한 후, 각 인간 혈청 표본의 펩티드에 대해 액상 크로마토그래피 질량 분광분석법을 수행하여 획득된 것인 진단 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 비소세포 폐암이 있는 인간 유래의 인간 개체군 혈청 표본의 단백질 발현 강도의 질량 스펙트럼 판독치는 상기 개체군 유래의 각 인간 혈청 표본을 분해하고, 각 인간 혈청 표본에서 펩티드를 분리한 후, 각 인간 혈청 표본의 펩티드에 대해 액상 크로마토그래피 질량 분광분석법을 수행하여 획득된 것인 진단 방법.
KR1020167020622A 2007-09-11 2008-09-11 인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청 내 단백질의 동정 KR20160096213A (ko)

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