JP2013528284A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質/プラスミノーゲン活性化因子阻害物質1型タンパク質選択反応モニタリングアッセイ - Google Patents
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質/プラスミノーゲン活性化因子阻害物質1型タンパク質選択反応モニタリングアッセイ Download PDFInfo
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Abstract
病理組織学的に処理されたホルマリン固定組織から調製されたタンパク質溶解物を含む複合タンパク質溶解物試料のこれらのペプチドを直接測定することができるアッセイとともに、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質およびプラスミノーゲン活性化因子阻害物質1型タンパク質の部分配列から得られる特定のペプチドを提供する。被検体由来の試料のこれらのペプチドの存在およびその量は、被検体のがんなどの疾患に関連し、疾患/がんの診断的病期/グレード/状態に関する情報を提供することができる。
Description
本出願は、発明者としてデイビットB.クライツマンの名が挙げられる、「ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質/プラスミノーゲン活性化因子阻害物質1型タンパク質選択反応モニタリングアッセイ」と題した、その全体が引用することにより本発明の開示の範囲とされる、2010年5月26日出願の米国仮出願第61/348,712号の利益を主張する。
序文
uPAと呼ばれるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質の部分配列に由来する特定のペプチド、およびPAI−1と呼ばれるプラスミノーゲン活性化因子阻害物質1型タンパク質の部分配列に由来する特定のペプチドを提供する。ペプチド配列およびフラグメントイオン/移動イオンを含む、質量分析における信頼性があり、正確および一貫した分析のための各ペプチドの具体的な特徴を提供する。さらにこれらのペプチドを、多重反応モニタリング(MRM)アッセイとも呼ばれ得る質量分析系選択反応モニタリング(SRM)に使用することについて記載する。このSRMアッセイを使用し、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の1つ以上の特定のペプチドの相対的または絶対定量濃度を測定することができ、従って、このアッセイは生体試料から得られた所与のタンパク質調製物の質量分析により、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の量を測定する手段を提供することができる。
uPAと呼ばれるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質の部分配列に由来する特定のペプチド、およびPAI−1と呼ばれるプラスミノーゲン活性化因子阻害物質1型タンパク質の部分配列に由来する特定のペプチドを提供する。ペプチド配列およびフラグメントイオン/移動イオンを含む、質量分析における信頼性があり、正確および一貫した分析のための各ペプチドの具体的な特徴を提供する。さらにこれらのペプチドを、多重反応モニタリング(MRM)アッセイとも呼ばれ得る質量分析系選択反応モニタリング(SRM)に使用することについて記載する。このSRMアッセイを使用し、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の1つ以上の特定のペプチドの相対的または絶対定量濃度を測定することができ、従って、このアッセイは生体試料から得られた所与のタンパク質調製物の質量分析により、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の量を測定する手段を提供することができる。
さらに具体的には、SRMアッセイは、ホルマリン固定のがん患者組織などの患者組織試料から得られた細胞から調製した複合タンパク質溶解物試料中のこれらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、その内容全体が引用することにより本発明の開示の範囲とされる、米国特許第7473532号に記載されている。従来、米国特許第7473532号に記載の方法は、エクスプレッション・パソロジー社(メリーランド、ロックビル)から入手可能なLiquid Tissue(商標)を使用して実施され得る。
SRMアッセイの結果を使用し、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の正確および精密な定量濃度と、組織を回収した患者の特定のがんを相関づけることができる。これは、がんの診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療専門家が患者に適切な治療を決定することを可能にさせる。患部組織または他の患者試料のタンパク質発現レベルの診断的に重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイを、がんの病期および程度を診断し、患者の予後の反応が好ましい可能性が高い治療薬または治療経過を決定するよう設計することができる。
本明細書に記載のアッセイは、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の特定の未修飾ペプチドの相対(的)または絶対濃度(値)(level)を測定し、さらにuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の特定の修飾ペプチドの絶対または相対的濃度を測定することができる。修飾の例として、ペプチドに存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基がある。
uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の相対的定量濃度はSRM方法論により決定され、それにより一生体試料のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の個々のペプチドまたは多数のペプチドのクロマトグラフピーク面積(またはピークが十分に解析される場合はピーク高)を、同じ方法論を使用して、さらに1つ以上の様々な生体試料中の同じuPAペプチドおよびPAI−1ペプチド(1つまたは複数)において決定されたクロマトグラフピーク面積と比較する。このように、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の具体的なペプチド(1つまたは複数)の量、従って、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の量が、同じ実験条件下の2つ以上の生体試料における同じuPAペプチドおよびPAI−1ペプチド(1つまたは複数)に対して決定される。さらに、SRM方法論により、このペプチドのクロマトグラフピーク面積と、生体試料由来の同じタンパク質調製物内の様々なタンパク質(1つまたは複数)由来の別の様々なペプチド(1つまたは複数)のクロマトグラフピーク面積を比較することで、単一の試料内のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の所与のペプチド(1つまたは複数)の相対的定量化を決定することができる。このように、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の具体的なペプチドの量、従って、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の量が同じ試料内で互いに決定される。これらの方法により、試料間および試料内の、別のペプチド(1つまたは複数)の量に対するuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の個々のペプチド(1つまたは複数)の定量化が得られ、この場合、生体試料由来のタンパク質調製物中のuPAペプチドおよびPAI−1ペプチドの絶対重量/容積または重量/重量に関わらず、クロマトグラフピーク面積により決定された量は互いに相対している。様々な試料間の個々のクロマトグラフピーク面積に関する相対的質量化データを試料当たりの分析タンパク質量に正規化する。相対的定量化を単一試料中の、および/または多くの試料中の多くのペプチドに同時に行い、相対的タンパク質量、つまり他のペプチド/タンパク質に対する1つのペプチド/タンパク質への理解を得ることができる。
uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の絶対定量濃度を、SRM方法論により決定し、それにより1つの生体試料中のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の個々のペプチドのクロマトグラフピーク面積とスパイクした内部標準物質のクロマトグラフピーク面積を比較するが、この場合、内部標準物質は、1つ以上の重同位体で標識された1つ以上のアミノ酸残基を含有するまさに同一のuPAペプチドおよびPAI−1ペプチドの合成型である。内部標準物質は、質量分析法で分析する場合に天然のuPAおよびPAI−1ペプチドクロマトグラフの特徴的なピークとは異なり、区別される予測可能な一貫した特徴的なクロマトグラフピークを生じるように合成される。従って、内部標準物質が既知の量の生体試料由来のタンパク質調製物にスパイクし、質量分析法により分析される場合、天然ペプチドの特徴的なクロマトグラフピーク面積と内部標準物質の特徴的なクロマトグラフピーク面積を比較し、この数値比較が生体試料由来の元のタンパク質調製物に存在する天然のペプチドの絶対質量または絶対重量のいずれかを示す。フラグメントペプチドの絶対定量データを試料当たりの分析されたタンパク質量に従い表示する。絶対定量化は単一試料中の、および/または多くの試料中の多くのペプチド、従ってタンパク質において同時に行われ、個々の生体試料中の、および個々の試料のコホート中の絶対タンパク質量への理解を得ることができる。
アッセイ法を、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来の組織においてがんの病期の診断に直接役立て、かつ患者の治療に使用するのに最も有利である治療薬および治療方法の決定に役立てるのに使用することができる。疾患の疑いの有無を決定するために行われる、腫瘍の部分的または全体の治療的切除か、バイオプシー方法による外科的手術により患者から切除したがん組織を分析し、特定のタンパク質(1つまたは複数)およびそのタンパク質型が患者組織に存在するかどうかを決定する。さらに、タンパク質(1つまたは複数)の発現レベルを決定し、健常組織または異なるがん病期/グレードを示す組織に見つかる「正常」または基準レベルと比較することができる。次いで、この情報を使用して、特定のがんに対する病期またはグレードを割り当てることができ、決定された特定のタンパク質濃度に基づいて患者の治療方法に適合させることができる。SRMアッセイにより決定されたuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質濃度の特定の情報を患者由来のがん細胞のこれらのタンパク質濃度に基づいた治療方法に適合させることは、疾患を治療するための個別化医療法と呼ばれていたものに定義される。本明細書に記載のアッセイ法は、診断および治療決定のための情報源として患者自身の組織由来のタンパク質分析を使用することにより個別化医療法の基礎を形成する。
uPAおよびPAI−1のこれらのタンパク質はともに、臨床試験で例証され、かつ科学文献で報告されており、乳癌を含む一部の癌の起こり得る疾患過程を予測するのに非常に有用であることが利点である。ELISA法により分析された患者由来の凍結がん組織のどちらかのタンパク質濃度の増加は、腫瘍組織が積極的に成長する細胞を含有する組織を示し、その結果患者のあまり好ましくない予後と関連する。さらに、凍結患者組織に示されたどちらかのタンパク質濃度の増加はまた、アジュバント化学療法で患者を治療、つまりCMF治療法で特に治療する必要があることに関連する。タンパク質の測定濃度が予後の予測および治療決定と関連するという説得力のある科学文献がある。これらのタンパク質を定量的に測定するのに使用される現在のELISA法では、凍結し、−80℃で保存されていた患者組織においてのみのこのような情報が提供される。しかし、このアッセイは、ホルマリン固定の患者組織の比較情報について提供せず、従ってホルマリン固定組織のこれらのタンパク質の直接このような定量的測定を提供できるアッセイは、かなり有利であるだろう。それは圧倒的多数の患者組織が、凍結し、−80℃で保存されることによらず、ホルマリン固定で保存されるためである。
原則として、例えば、特異性が知られているプロテアーゼ(例えば、トリプシン)で消化することによるuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来の予測ペプチドを代理レポーターとして使用し、質量分析系SRMアッセイに使用して、試料中のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の豊富さを決定することができる。同様に、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の修飾の可能性のあることが知られている部位にアミノ酸残基を含有する予測ペプチド配列を試料中のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の修飾範囲をアッセイするために使用し得る可能性もある。しかし、本発明者らは、多くの潜在的ペプチド配列が質量分析系SRMアッセイの使用に適切でないまたは効果がないことを発見したことに驚いている。ペプチドは、例えば、質量分析法による検出が困難であり、または親タンパク質由来のペプチドを得るために使用された条件に不安定であり得る。これは特に、米国特許第7473532号にあるLiquid Tissue(商標)プロトコールを使用してホルマリン固定組織から調製されたタンパク質溶解物を調べる場合に見出される。uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の信頼性があり、正確なSRMアッセイを開発するために、実際のLiquid Tissue(商標)溶解物中の好ましい修飾および非修飾ペプチドを実験的に同定することが有利であるとわかったことは予想外であった。ホルマリン固定組織のタンパク質の存在(または非存在)および/またはタンパク質の量を同定するなど本明細書に記載の質量分析法(例えば、SRM)の使用に好ましい修飾および非修飾ペプチドを、最適ペプチドと以下で称する。
一般に、ペプチドは、ホルマリン固定の患者組織から得られた細胞から調製された複合Liquid Tissue(商標)溶解物内のタンパク質のプロテアーゼ消化の経過において、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質から得られる。次いで、Liquid Tissue(商標)溶解物を質量分析法により分析し、質量分析法で検出、分析に好ましいuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来のこのようなペプチドを決定した(すなわち、最適化された好ましい修飾および非修飾ペプチド)。その結果を使用し、質量分析の適合性において選択された好ましいペプチドの特定の部分集合を同定する。使用される手法により、最も効率よくイオン化するペプチドまたはペプチドフラグメントの実験による決定が可能となり、得られたペプチド移動フラグメントイオンに適したデータが提供され、また、このイオンはホルマリン固定の患者組織由来のLiquid Tissue(商標)調製物において同定および定量されることができる。次いで、好ましい、または最適なペプチドおよび得られた移動フラグメントの存在を確認するために、これらの結果と、同じプロテアーゼ(1つまたは複数)で消化している組み換えタンパク質の質量分析により得られた結果を比較することができる。
質量分析の適合性に加え、標識型の好ましい(または、より具体的に最適な)ペプチドの、Liquid Tissue(商標)調製物プロトコールに使用される条件に耐えるための能力は、質量分析(例えば、SRM)により組織を定性的または定量的に分析するためにどのペプチドが好ましい(またはホルマリン固定の組織を使用する場合、最適である)かを決める重要な決定因子である。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、試料調製中の修飾形態におけるペプチド内の修飾残基の生存能にも依存する。以下に記載のアッセイ法を使用し、uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来のペプチドを同定することができ、これらのペプチドは、患者試料、より具体的にはホルマリン固定組織由来の患者試料のタンパク質発現または修飾を質量分析系SRMアッセイにより同定および定量化するために好ましく、または最適である。
uPAおよび/またはPAI−1由来のペプチドを同定するアッセイ法
1.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質ともに好ましい(または最適な)フラグメントペプチド(1つまたは複数)の同定
a.プロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して(トリプシンを含み得る、または含まない)、Liquid Tissue(商標)試薬およびプロトコールで精製uPAタンパク質を処理し、uPAタンパク質を消化する。タンデム質量分析法により、一部の(例えば、10、20、30または40%)、ほとんどの(例えば、50、60、70、80、90、95、98または99%)または全ての得られたタンパク質フラグメントを分析し、uPAタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。
b.プロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して(トリプシンを含み得る、または含まない)、Liquid Tissue(商標)試薬およびプロトコールで精製PAI−1タンパク質を処理し、PAI−1タンパク質を消化する。タンデム質量分析法により、一部の、ほとんどの、または全ての得られたタンパク質フラグメントを分析し、PAI−1タンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。
c.(トリプシンを含み得る、または含まない)精製uPAタンパク質を調製する場合に利用される同じプロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して、ホルマリン固定の生体試料からLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物を調製し、ほとんどの、または全てのタンパク質を消化する。タンデム質量分析法により混合物の一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質から得られた一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、特にuPAタンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。タンデム質量分析法により一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質から得られる一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化された残基などのペプチド修飾を運ぶuPAタンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定する。
d.(トリプシンを含み得る、または含まない)精製PAI−1タンパク質を調製する場合に利用される同じプロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して、ホルマリン固定の生体試料からLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物を調製し、ほとんどの、または全てのタンパク質を消化する。タンデム質量分析法により一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質から得られた一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、PAI−1タンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。タンデム質量分析法により一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化された残基などのペプチド修飾を運ぶするPAI−1タンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定する。
e.全長、つまり完全長のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質から、特定の消化方法により生成された一部の、ほとんどの、または全てのペプチドを測定することができる可能があるが、好ましいペプチドは、精製タンパク質の分析から質量分析により同定されたペプチドであり、さらに、病理組織学的に固定された生体試料から調製された複合Liquid Tissue(商標)タンパク質溶解物において直接同定されたペプチドである(例えば、最適ペプチドは、組織がホルマリン固定される場合に測定することができる)。
翻訳後修飾されたペプチドおよびそれらの特異的フラグメントの特徴は、好ましい、または最適なペプチドと考えられることができ、修飾ペプチドの相対濃度がuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の未修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定される場合に分析することができる。
1.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質ともに好ましい(または最適な)フラグメントペプチド(1つまたは複数)の同定
a.プロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して(トリプシンを含み得る、または含まない)、Liquid Tissue(商標)試薬およびプロトコールで精製uPAタンパク質を処理し、uPAタンパク質を消化する。タンデム質量分析法により、一部の(例えば、10、20、30または40%)、ほとんどの(例えば、50、60、70、80、90、95、98または99%)または全ての得られたタンパク質フラグメントを分析し、uPAタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。
b.プロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して(トリプシンを含み得る、または含まない)、Liquid Tissue(商標)試薬およびプロトコールで精製PAI−1タンパク質を処理し、PAI−1タンパク質を消化する。タンデム質量分析法により、一部の、ほとんどの、または全ての得られたタンパク質フラグメントを分析し、PAI−1タンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。
c.(トリプシンを含み得る、または含まない)精製uPAタンパク質を調製する場合に利用される同じプロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して、ホルマリン固定の生体試料からLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物を調製し、ほとんどの、または全てのタンパク質を消化する。タンデム質量分析法により混合物の一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質から得られた一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、特にuPAタンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。タンデム質量分析法により一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質から得られる一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化された残基などのペプチド修飾を運ぶuPAタンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定する。
d.(トリプシンを含み得る、または含まない)精製PAI−1タンパク質を調製する場合に利用される同じプロテアーゼ(1つまたは複数)を使用して、ホルマリン固定の生体試料からLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物を調製し、ほとんどの、または全てのタンパク質を消化する。タンデム質量分析法により一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質から得られた一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、PAI−1タンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定するが、この場合、個々のフラグメントペプチドはリン酸化またはグリコシル化などの何らかのペプチド修飾を含有しない。タンデム質量分析法により一部の、ほとんどの、または全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化された残基などのペプチド修飾を運ぶするPAI−1タンパク質由来の一部の、ほとんどの、または全てのフラグメントペプチドを同定する。
e.全長、つまり完全長のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質から、特定の消化方法により生成された一部の、ほとんどの、または全てのペプチドを測定することができる可能があるが、好ましいペプチドは、精製タンパク質の分析から質量分析により同定されたペプチドであり、さらに、病理組織学的に固定された生体試料から調製された複合Liquid Tissue(商標)タンパク質溶解物において直接同定されたペプチドである(例えば、最適ペプチドは、組織がホルマリン固定される場合に測定することができる)。
翻訳後修飾されたペプチドおよびそれらの特異的フラグメントの特徴は、好ましい、または最適なペプチドと考えられることができ、修飾ペプチドの相対濃度がuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の未修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定される場合に分析することができる。
2. uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
a.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来のLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物において同定されたそれぞれ個々の好ましい、または最適なフラグメントペプチドの選択反応モニタリング(SRM)つまり多重反応モニタリング(MRM)とも知られるアッセイを、三連四重極質量分析計で行い、以下のように進めることができる:
i.ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、等電分離クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない少なくとも1つの適切な分画方法における、uPAおよびPAI−1の各フラグメントペプチドの保持時間を決定する。
ii.適切なフラグメント移動イオンを同定し、病理組織学的に固定された組織(例えば、ホルマリン固定組織)から調製されたLiquid Tissue(商標)試料に使用する、反復分析中の最大信号/ノイズの比および/または最小標準偏差に基づき、1つ以上のフラグメントペプチドをモニターする。
b.SRM/MRM分析を行い、そうしてuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質のフラグメントペプチド(1つまたは複数)の量がSRM/MRM質量分析からの特定のピーク面積の関数として検出され、これが具体的なLiquid Tissue(商標)溶解物の相対的および絶対タンパク質の量をともに反映する。
i.相対的定量化は以下により得られる:フラグメントペプチドの(例えば、電気泳動、クロマトグラフィーの)ピーク面積と、様々な、または別個の生体源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の同じフラグメントペプチドまたは他のフラグメントペプチドのピーク面積を比較するが、この場合、ペプチドフラグメントの試料間のクロマトグラフィーピーク面積比較を、各試料で分析されたタンパク質量に正規化する。所与のフラグメントペプチドの分離ピーク面積と、同じ試料内の様々なタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからの分離ピーク面積の比較を行い、一タンパク質濃度の、様々な条件下(例えば、細胞条件)において発現レベルが変化しない他のタンパク質濃度への変化を正規化することができる。
相対的定量化を未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに行うことができ、この場合、修飾はリン酸化および/またはグリコシル化を含むがそれらに限定されず、修飾ペプチドの相対濃度を未修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定する。
ii.所与のペプチドの絶対定量化は、個々の生体試料中の所与のフラグメントペプチドのピーク面積と、生体試料由来のタンパク質融解物にスパイクしたフラグメントペプチドの内部標準物質のピーク面積を比較することにより得られる。所与のペプチドおよび試料にスパイクした標準物質の分析を同時に行うことができる。
内部標準物質は、調べているフラグメントペプチドの正確なアミノ酸配列からなる標識型(例えば、標識合成型)であってよい。標識された標準物質を既知の量の試料にスパイクし、フラグメントペプチドの内部標準物質の、および生体試料中の天然のフラグメントペプチドの各クロマトグラフィーピーク面積を決定後、各ピーク面積を比較し、スパイクしたペプチド標準物質の絶対量と比較した場合に天然ペプチドの絶対量を得ることができる。
絶対的定量化を未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに行うことができ、この場合、修飾はリン酸化および/またはグリコシル化を含むがそれらに限定されず、修飾ペプチドの絶対濃度を未修飾ペプチドの絶対濃度を決定するのと同じ方法で決定することができる。
a.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質由来のLiquid Tissue(商標)タンパク質溶解物において同定されたそれぞれ個々の好ましい、または最適なフラグメントペプチドの選択反応モニタリング(SRM)つまり多重反応モニタリング(MRM)とも知られるアッセイを、三連四重極質量分析計で行い、以下のように進めることができる:
i.ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、等電分離クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない少なくとも1つの適切な分画方法における、uPAおよびPAI−1の各フラグメントペプチドの保持時間を決定する。
ii.適切なフラグメント移動イオンを同定し、病理組織学的に固定された組織(例えば、ホルマリン固定組織)から調製されたLiquid Tissue(商標)試料に使用する、反復分析中の最大信号/ノイズの比および/または最小標準偏差に基づき、1つ以上のフラグメントペプチドをモニターする。
b.SRM/MRM分析を行い、そうしてuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質のフラグメントペプチド(1つまたは複数)の量がSRM/MRM質量分析からの特定のピーク面積の関数として検出され、これが具体的なLiquid Tissue(商標)溶解物の相対的および絶対タンパク質の量をともに反映する。
i.相対的定量化は以下により得られる:フラグメントペプチドの(例えば、電気泳動、クロマトグラフィーの)ピーク面積と、様々な、または別個の生体源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の同じフラグメントペプチドまたは他のフラグメントペプチドのピーク面積を比較するが、この場合、ペプチドフラグメントの試料間のクロマトグラフィーピーク面積比較を、各試料で分析されたタンパク質量に正規化する。所与のフラグメントペプチドの分離ピーク面積と、同じ試料内の様々なタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからの分離ピーク面積の比較を行い、一タンパク質濃度の、様々な条件下(例えば、細胞条件)において発現レベルが変化しない他のタンパク質濃度への変化を正規化することができる。
相対的定量化を未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに行うことができ、この場合、修飾はリン酸化および/またはグリコシル化を含むがそれらに限定されず、修飾ペプチドの相対濃度を未修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定する。
ii.所与のペプチドの絶対定量化は、個々の生体試料中の所与のフラグメントペプチドのピーク面積と、生体試料由来のタンパク質融解物にスパイクしたフラグメントペプチドの内部標準物質のピーク面積を比較することにより得られる。所与のペプチドおよび試料にスパイクした標準物質の分析を同時に行うことができる。
内部標準物質は、調べているフラグメントペプチドの正確なアミノ酸配列からなる標識型(例えば、標識合成型)であってよい。標識された標準物質を既知の量の試料にスパイクし、フラグメントペプチドの内部標準物質の、および生体試料中の天然のフラグメントペプチドの各クロマトグラフィーピーク面積を決定後、各ピーク面積を比較し、スパイクしたペプチド標準物質の絶対量と比較した場合に天然ペプチドの絶対量を得ることができる。
絶対的定量化を未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに行うことができ、この場合、修飾はリン酸化および/またはグリコシル化を含むがそれらに限定されず、修飾ペプチドの絶対濃度を未修飾ペプチドの絶対濃度を決定するのと同じ方法で決定することができる。
3.フラグメントペプチド定量化とがん診断および/または治療の関連付け
a.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質のフラグメントペプチド濃度の相対的および/または絶対定量化を行い、その結果と患者腫瘍組織のがんの病期/グレード/状態を関連付け、かつ/または、
b.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質のフラグメントペプチド濃度の相対的および/または絶対定量化を行い、特異的および様々な治療方法と相関させるが、この場合、この相関が例証されており、または今後例証され、患者およびこれらの患者由来の組織のコホートにおける相関研究により様々な治療方法に対する予後と相関させることができる。これまでに確立された相関をこのアッセイで確認し、または新たな相関を確立した場合、このアッセイ法を使用して、患者組織のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の定量的結果と、より有効な患者の治療方法を関連付けることができる。
a.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質のフラグメントペプチド濃度の相対的および/または絶対定量化を行い、その結果と患者腫瘍組織のがんの病期/グレード/状態を関連付け、かつ/または、
b.uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質のフラグメントペプチド濃度の相対的および/または絶対定量化を行い、特異的および様々な治療方法と相関させるが、この場合、この相関が例証されており、または今後例証され、患者およびこれらの患者由来の組織のコホートにおける相関研究により様々な治療方法に対する予後と相関させることができる。これまでに確立された相関をこのアッセイで確認し、または新たな相関を確立した場合、このアッセイ法を使用して、患者組織のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の定量的結果と、より有効な患者の治療方法を関連付けることができる。
Claims (36)
- 生体試料中のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の濃度を測定する方法であり、
質量分析法を使用して前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中にuPA由来の少なくとも1つのフラグメントペプチドおよびPAI−1由来の少なくとも1つのフラグメントペプチドを検出し、および
前記試料中のuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の濃度を算出することを含み、ここで前記uPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の測定濃度が独立して相対的濃度または絶対定量濃度から選択される、方法。 - 前記ペプチドの検出前に前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分画工程が、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、等電分離クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Liquid Tissue(商標)プロトコールおよび試薬により調製される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物が2つ以上のプロテアーゼを含み、前記プロテアーゼの1つがトリプシンであり、またはトリプシンでない、請求項5に記載の方法。
- 質量分析法はタンデム質量分析法を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記使用される質量分析法の様式が、選択反応モニタリング(SRM)、高解像度選択反応モニタリング(hSRM)、多重選択反応モニタリング(mSRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および/または選択イオンモニタリング(SIM)である、請求項1および8に記載の方法。
- uPAフラグメントペプチドが表1に示され、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1または9に記載の方法。
- uPAペプチド同定および特徴がその特定の単同位体質量、特定の前駆体電荷状態、電荷比(m/z)に対する特定の前駆体質量、特定の生成物移動イオン(m/z)および特定のイオン型により表1に示される最適ペプチドにおいて定義される、請求項10に記載の方法。
- PAI−1フラグメントペプチド(1つまたは複数)が表2に示され、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1および9に記載の方法。
- uPAペプチド同定および特徴がその特定の単同位体質量、特定の前駆体電荷状態、電荷比(m/z)に対する特定の前駆体質量、特定の生成物移動イオン(m/z)および特定のイオン型により表2に示されるように定義される、請求項12に記載の方法。
- 生体試料が、血液、尿、血清、腹水、唾液、細胞、または組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 組織がホルマリン固定組織である、請求項14に記載の方法。
- 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項14または15に記載の方法。
- 前記組織が腫瘍から得られる、請求項14に記載の方法。
- 前記腫瘍が原発性腫瘍から得られる、請求項17に記載の方法。
- 前記腫瘍が続発性腫瘍から得られる、請求項17に記載の方法。
- さらにuPAフラグメントペプチド(1つまたは複数)又はペプチドを定量することを含む、請求項1に記載の方法。
- uPAフラグメントペプチドの定量化は、uPAの、約8〜約15、約8〜約25、約8〜約35、約8〜約45、約12〜約15、約12〜約25、約12〜約35、約12〜約45、約15〜約20、約15〜約25、約15〜約35、約15〜約45、約20〜約25、約20〜約35、約20〜約45のuPAのアミノ酸残基からなる群から選択される範囲の長さを有するアミノ酸配列に対応するuPAフラグメントペプチドの量、および1つの試料中の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8に示される各ペプチドの分析において同定された移動イオンと、様々な別個の原発性および/または続発性腫瘍(1つまたは複数)由来の様々な別個の生体試料中の同じuPAフラグメントペプチドの量を比較することを含む、請求項20に記載の方法。
- uPAフラグメントペプチドの定量化は、uPAフラグメントペプチドの量と、既知の量の内部標準物質ペプチドを比較することを含み、前記生体試料中のペプチドおよび前記内部標準物質のペプチドはともに約8〜約15、約8〜約25、約8〜約35、約8〜約45、約12〜約15、約12〜約25、約12〜約35、約12〜約45、約15〜約20、約15〜約25、約15〜約35、約15〜約45、約20〜約25、約20〜約35、約20〜約45のuPAのアミノ酸残基からなる群から選択される範囲の長さを有する同じアミノ酸配列および、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8に示される各最適ペプチドの分析において同定された移動イオンに対応する、請求項20に記載の方法。
- さらに、PAI−1フラグメントペプチド(1つまたは複数)又はペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- PAI−1フラグメントペプチドの定量化は、約8〜約15、約8〜約25、約8〜約35、約8〜約45、約12〜約15、約12〜約25、約12〜約35、約12〜約45、約15〜約20、約15〜約25、約15〜約35、約15〜約45、約20〜約25、約20〜約35、約20〜約45のPAI−1のアミノ酸残基からなる群から選択される範囲の長さを有するアミノ酸配列に対応するPAI−1フラグメントペプチドの量、および1つの試料中の配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18に示される各ペプチドの分析において同定された移動イオンと、様々な別個の原発性および/または続発性腫瘍(1つまたは複数)由来の様々な別個の生体試料中の同じPAI−1フラグメントペプチドの量を比較することを含む、請求項23に記載の方法。
- PAI−1フラグメントペプチドの定量化は、PAI−1フラグメントペプチドの量と、既知の量の内部標準物質ペプチドを比較することを含み、前記生体試料のペプチドおよび前記内部標準物質のペプチドはともに約8〜約15、約8〜約25、約8〜約35、約8〜約45、約12〜約15、約12〜約25、約12〜約35、約12〜約45、約15〜約20、約15〜約25、約15〜約35、約15〜約45、約20〜約25、約20〜約35、約20〜約45のPAI−1のアミノ酸残基からなる群から選択される範囲の長さを有する同じアミノ酸配列および、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18に示される各最適ペプチドの分析において同定された移動イオンに対応する、請求項23に記載の方法。
- 前記内部標準物質が同位体的に標識されたペプチドである、請求項22または25のいずれかに記載の方法。
- 前記同位体的に標識された内部標準物質ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、2H、またはその組み合わせから選択される1つ以上の重安定同位体を含む、請求項26に記載の方法。
- さらに、被検体から前記生体試料を得ることを含み、前記タンパク質消化物中の前記uPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドの検出がuPAおよびPAI−1の存在および前記被検体のがんとの関連を示す、請求項1に記載の方法。
- さらに、前記uPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドの検出量および定量と、前記がんの診断的病期/グレード/状態とを相関させることを含む、請求項28に記載の方法。
- uPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドを検出および定量し、前記がんの診断的病期/グレード/状態を示すことは、他のタンパク質由来の他のペプチドを検出し、定量化することと多重に組み合わせることができ、そうして組み合わせた場合、前記がんの診断的病期/グレード/状態についてのさらなる情報を提供する、請求項28に記載の方法。
- さらに、前記タンパク質消化物中のuPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドの存在、非存在または定量化濃度に基づき前記被検体の治療を選択することを含む、請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、特にuPAタンパク質および/またはPAI−1タンパク質またはuPAタンパク質およびPAI−1タンパク質の濃度を特異的に標的とした治療有効量の治療薬を投与することを含み、治療に使用される(1つまたは複数の)薬剤または前記(1つまたは複数の)薬剤の量に関する治療決定は、前記生体試料のuPAフラグメントペプチドおよび/またはPAI−1フラグメントペプチドの特定の濃度に基づく、請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 治療薬が、特にuPAタンパク質および/またはPAI−1タンパク質に結合し、前記uPAまたはPAI−1のいずれかの生物活性を阻害するものを含む、請求項32に記載の方法。
- uPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドを検出および定量することは、他のタンパク質由来の他のペプチドを検出し、定量化することと多重に組み合わせることができ、そうして治療に使用される(1つまたは複数の)薬剤および/または前記(1つまたは複数の)薬剤の量に関する治療決定が前記生体試料の他のペプチド/タンパク質と組み合わせてuPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドの特定の濃度に基づく、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料がLiquid Tissue(商標)のプロトコールおよび試薬によるuPAフラグメントペプチドおよびPAI−1フラグメントペプチドの定量分析において処理されているホルマリン固定の腫瘍組織である、請求項14、20、および23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料がホルマリン固定組織の試料であり、Liquid Tissue(商標)のプロトコールが(a)一時期80℃〜100℃、10分〜4時間にてホルマリン固定生体試料および反応緩衝液を含む組成物を加熱し、前記生体試料中に架橋しているタンパク質を反転または放出し、(b)得られた組成物を、トリプシン、キモトリプシン、およびエンドプロテイナーゼLys−Cからなる群から選択される、有効量のタンパク質分解酵素で一時期30分間〜24時間、37℃〜65℃にて処理し、前記生体試料の組織および細胞構造を破壊し、前記試料を溶解し、それによりタンパク質分析に適切な液状、可溶性、希釈可能な生体分子溶解物を生成し、前記溶解物のタンパク質量が前記生体試料のタンパク質総量を表す、請求項4に記載の方法。
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