CN111896670A - 一种郁金的微提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物的分离富集领域，尤其是涉及一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：（1）将郁金经粉碎后过筛得到郁金粉末；（2）将葫芦脲研磨后烘干得到葫芦脲粉末；（3）将葫芦脲粉末与郁金粉末混合研磨后得到混合粉末；（4）在混合粉末中加入提取溶剂萃取；（5）离心、过滤取上清后用HPLC进样分析。本发明采用葫芦脲作为吸附剂用于基质固相分散萃取郁金的有效成分，吸附能力强，选择性好，提取效率高，并且无毒不污染环境；并且可以同时分析并提取郁金中多种有效成分，快速便捷，整个提取过程操作简易，一步完成预提取和纯化，无论是样品提取还是进样分析都比较快速，大大节省了时间和劳动成本。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的分离富集领域，尤其是涉及一种郁金的微提取方法。
背景技术
郁金是姜科植物温郁金、姜黄、广西莪术或者蓬莪术的干燥块根，主要分布在浙江、四川、广东、广西、台湾、江西等地，多生长在湿润的向阳坡或田地。郁金作为一种常用的中草药，在医学上被广泛应用于气滞血瘀、黄疸、胆石症的治疗。郁金中含有莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮、呋喃二烯等活性成分。这些活性成分已被证明在促进肝细胞再生、杀菌、抗病毒、抗炎镇痛、抑制癌细胞再生等方面是有效的。由于郁金具有很强的药理作用，提取郁金样品中的活性成分也是有意义的。
到目前为止，已经有许多已发表的文献报道了各种检测方法，如气相色谱-质谱(GC-MS)、核磁共振(NMR)、毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC)，并与超声提取法(UE)、加压液体萃取法(PLE)、水蒸馏萃取法和煎煮萃取法等传统的提取技术相结合。例如公开号为CN104193715A的“一种从郁金里提取山姜素的方法”，步骤如下：取郁金原料粉碎，加入等体积水和生物酶，保温酶解3-5小时，然后加入饱和石灰水溶液超声提取2-3次，提取液调节ph5-6后加入大孔树脂中吸附，乙醇溶液梯度洗脱，洗脱液浓缩放置结晶，结晶物用碱水溶解加适量乙醇，过滤后，调节ph1-3放置结晶，结晶物再用乙醇溶液结晶，干燥即得。
该方法使用了大量有毒有机溶剂，提取时间较长，提取效率较低。而水蒸馏法和煎煮法操作复杂，需要较高的提取温度，且耗费时间长。并且上述提取方法一次只能提取一种活性物质，提取效率低。
发明内容
本发明是为了克服传统的UE法和PLE法使用了大量有毒有机溶剂、提取时间长、提取效率低，而水蒸馏法和煎煮法操作复杂、需要较高的提取温度、且耗费时间长、只能提取一种活性物质的缺点，提供一种郁金的微提取方法，能够同时提取郁金中多种活性物质，同时兼具绿色、简便、高效的优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金经粉碎后过筛得到郁金粉末；
(2)将葫芦脲研磨后烘干得到葫芦脲粉末；
(3)将葫芦脲粉末与郁金粉末按照质量比30-80:70混合研磨40-160s后得到混合粉末；
(4)在混合粉末中加入提取溶剂萃取；
(5)离心、过滤取上清后用HPLC进样分析。
本发明采用葫芦脲作为吸附剂用于基质固相分散萃取郁金的有效成分，其具有疏水内腔和由极性羰基形成的两个亲水端口，因此可以高度选择性地和郁金中的有效成分通过疏水、氢键和离子偶极相互作用反应形成稳定的包合物，从而将郁金中有效成分提取出来，并通过后续的萃取过程将有效成分分离，并之后进行HPLC的进样与分析。整个过程操作简便，一步就可以完成预提取多种有效成分并纯化，无论是样品提取还是进样分析都比较快速，大大节省了时间和劳动成本。
本发明的方法应用范围广泛，无论是郁金还是其他中药材，均能使用本发明方法进行可挥发性活性成分的检测，即本发明提供了一种环境友好的新技术，该技术将两性离子表面活性剂提取技术与葫芦脲吸附特性巧妙结合起来，能快速高效地提取天然产物中的可挥发性有效成分。
作为优选，所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、曲拉通、十二烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、3-磺丙基十二烷基二甲基铵、3-磺丙基十四烷基二甲基铵和3-磺丙基十六烷基二甲基铵中一种或多种。
作为优选，所述的提取溶剂为3-磺丙基十六烷基二甲基铵。
本发明采用新型绿色的提取体系，长链两性离子表面活性剂、尤其是3-磺丙基十六烷基二甲基铵作为提取溶剂用于提取郁金有效成分，由于3-磺丙基十六烷基二甲基铵与目标分子之间的静电相互作用和氢键比目标分子与吸附剂之间的分子间相互作用强得多，因此其提取效率与甲醇等有机溶剂相比甚至更为优越，并且其几乎无毒，避免了甲醇等有毒试剂的使用，大大提高了实验的安全性与环境友好性。
作为优选，所述的提取溶剂浓度为50-250mM。
作为优选，所述的提取溶剂浓度为150-250mM。
由于分析物与3-磺丙基十六烷基二甲基铵水溶液之间较强的氢键和静电相互作用，3-磺丙基十六烷基二甲基铵洗脱溶剂能够适当地抵抗吸附剂与目标分子之间比较轻微的相互作用，因此适当增加的3-磺丙基十六烷基二甲基铵浓度可以提高萃取效率，然而当3-磺丙基十六烷基二甲基铵水溶液的浓度超过250mM时，洗脱溶剂的粘度增加，因此要把目标分子从吸附剂转移到溶剂中变得更加困难，分析物的提取回收率开始降低，因此优选提取溶剂的浓度为150-250Mm。
作为优选，所述步骤(3)中葫芦脲粉末与郁金粉末质量比为60-80:70。
随着分散剂用量的增加，葫芦脲与样品之间的静电相互作用和氢键作用均有所增强，因此较高质量的葫芦脲可以提高郁金中有效成分的萃取效率；然而过多的吸附剂会对郁金中的有效成分表现出过度的吸附能力，使提取溶剂难以抵抗强大的分子间作用力，郁金中的有效成分无法完全洗脱，因此选择葫芦脲粉末与郁金粉末质量比为60-80:70。
作为优选，所述步骤(3)的研磨时间为100-140s。
随着研磨时间变长，可以增大葫芦脲粉末与郁金粉末的接触面积，使得郁金中的有效成分能够更好地被葫芦脲所吸附，从而提高分析物的萃取效率，但是在两者的吸附率达到峰值后，再次延长研磨时间并不能对萃取效率产生显著影响，并且还会增加由此带来的人工成本与能耗，因此选择100-140的研磨时间。
作为优选，所述步骤(4)中萃取方式为剧烈涡旋萃取。剧烈涡轮萃取的方式简单快速，萃取效率高，可以很好的去除基质干扰；并由于葫芦脲与郁金有效成分吸附在一起，剧烈涡轮萃取的方式可以有利于将吸附于葫芦脲内的郁金有效成分从葫芦脲中脱离出来，提高萃取效率。
作为优选，所述步骤(1)中，郁金经粉碎后经过20-60目筛过筛。
作为优选，所述步骤(5)中，离心条件为10000-15000rpm、3-15分钟，过滤时使用孔径小于等于0.22μm的过滤器过滤。
综上所述，本发明具有以下有益效果：(1)采用葫芦脲作为吸附剂用于基质固相分散萃取郁金的有效成分，吸附能力强，选择性好，提取效率高，并且无毒不污染环境；(2)本发明可以同时分析并提取郁金中多种有效成分，快速便捷，整个提取过程操作简易，一步完成预提取和纯化，无论是样品提取还是进样分析都比较快速，大大节省了时间和劳动成本。
附图说明
图1为郁金的五个活性成分的结构图，分别为：A，莪术二酮；B，呋喃二烯；C，莪术呋喃二烯酮；D，吉马酮；E，异莪术烯醇。
图2为基质固相分散萃取的流程图。
图3为不同研磨时间的提取效果折线图，图中1、2、3、4、5分别为：1、莪术二酮；2、异莪术烯醇；3、莪术呋喃二烯酮；4、吉马酮；5、呋喃二烯。
图4为不同吸附剂样品比例的提取效果折线图，图中1、2、3、4、5分别为：1、莪术二酮；2、异莪术烯醇；3、莪术呋喃二烯酮；4、吉马酮；5、呋喃二烯。
图5为不同洗脱溶剂种类的提取效果柱状图，图中A-F分别对应甲醇、乙醇、十二烷基三甲基氯化铵、3-磺丙基十二烷基二甲基铵、3-磺丙基十四烷基二甲基铵和3-磺丙基十六烷基二甲基铵，每段标号中的五个峰从左往右分别为莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮与呋喃二烯。
图6为不同洗脱溶剂浓度的提取效果折线图，图中1、2、3、4、5分别为：1、莪术二酮；2、异莪术烯醇；3、莪术呋喃二烯酮；4、吉马酮；5、呋喃二烯。
图7为本发明提取得到的郁金有效成分色谱图和10μg/mL标准混合液的对照色谱图，其中图7A为本发明提取得到的郁金有效成分色谱图，图7B为10μg/mL标准混合液的对照色谱图，图中1、2、3、4、5分别为：1、莪术二酮；2、异莪术烯醇；3、莪术呋喃二烯酮；4、吉马酮；5、呋喃二烯。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用20-60目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末30-80mg加入研钵，用杵轻轻研磨40-160s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为50-250mM的提取溶剂，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以10000-15000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5-15分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
色谱柱：Eclipse C18柱(50×2.1mm，1.8μm)。流动相A、B分别为水和乙腈，流速为0.4mL/min，流动梯度为0-3min，60-70％B；3-6min，70-100％B；6-7min，100-60％B。柱温25℃，进样量为2.0μL，检测波长214nm。
本发明涉及的标准混合对照溶液，其制备方法为：分别精密称取适当量莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮、呋喃二烯标准品于1.5mL离心管中，加适量的水超声涡旋溶解，制成1mg/mL的标准品母液，使用前用超纯水稀释成所需浓度的标准对照溶液。
精密称定适当量的提取溶剂，包括曲拉通、十二烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、3-磺丙基十二烷基二甲基铵、3-磺丙基十四烷基二甲基铵和3-磺丙基十六烷基二甲基铵，分别用适量水超声溶解制备得500mM母液，使用前用超纯水稀释至所需要的浓度。
其中HPLC进样条件、标准混合对照溶液的制备、提取溶剂的制备无特殊说明时，在以下实施例中均通用。
提取得到的郁金的五个活性成分的结构图如图1所示，本发明所提取出的活性物质主要为酮类物质，也有部分呋喃类化合物，均有不同的药理或是其他有益作用。本发明的基质固相分散萃取的流程图如图2所示，本发明可以同时分析并提取郁金中多种有效成分，快速便捷，整个提取过程操作简易，一步完成预提取和纯化，无论是样品提取还是进样分析都比较快速，大大节省了时间和劳动成本。
实施例1
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨40s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例2
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨60s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例3
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨80s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例4
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨100s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例5
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例6
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨140s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例7
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末50mg加入研钵，用杵轻轻研磨160s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
本发明实施例1至实施例7的不同研磨时间的提取效果折线图如图3所示。结果表明，随着研磨时间从40s增加到120s，莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮的峰面积逐渐增大。只是因为研磨时间变长会导致增大吸附剂与样品的接触面积，从而提高分析物的萃取效率。此外，在图3中还发现，呋喃二烯的含量随研磨时间从40s增加到60s峰面积略有增加，随研磨时间延长到80秒略有下降，这可能是由于过度的机械研磨削弱了呋喃二烯的吸附。但是，研磨时间从120秒到160秒的结果基本上是平行的，这意味着添加研磨时间不能再增加峰面积。这可能是因为延长研磨时间对萃取效率没有显著影响。基于以上分析，最佳的研磨时间选择120s。
实施例8
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末30mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例9
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末40mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例10
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末60mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例11
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例12
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末80mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
本发明实施例8至实施例12与实施例5的不同吸附剂样品比例的提取效果折线图如图4所示，结果表明，随着吸附剂用量从30mg加到60mg，莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮的含量均略有增加。可能的原因是随着分散剂用量的增加，葫芦脲与样品之间的静电相互作用和氢键作用均有所增强。当分散剂用量从60mg增加到80mg时，萃取效率不再提高，反而开始保持不变，甚至开始下降而不是上升。这一现象表明，过多的吸附剂可能会对目标分析物表现出过度的吸附能力，使洗脱液难以抵抗强大的分子间作用力，分析物无法完全洗脱。结果还表明，当吸附剂用量从30mg增加到50mg时，呋喃二烯的峰面积略有减小，然后基本保持不变。因此，70mg是本发明最佳吸附剂用量。
实施例13
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL甲醇，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例14
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL乙醇，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例15
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为150mM的曲拉通，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例16
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为150mM的十二烷基硫酸钠，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例17
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为150mM的十二烷基三甲基氯化铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例18
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为150mM的3-磺丙基十二烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例19
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为150mM的3-磺丙基十四烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例20
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为150mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
本发明实施例13至实施例20的不同洗脱溶剂的提取效果柱状图如图5所示，其中两种为有机溶剂：甲醇和乙醇，其余均为相同浓度的水溶液，包括曲拉通、十二烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、3-磺丙基十二烷基二甲基铵、3-磺丙基十四烷基二甲基铵和3-磺丙基十六烷基二甲基铵，标号A-F分别对应甲醇、乙醇、十二烷基三甲基氯化铵、3-磺丙基十二烷基二甲基铵、3-磺丙基十四烷基二甲基铵和3-磺丙基十六烷基二甲基铵。实验结果表明，当以十二烷基硫酸钠和曲拉通为洗脱溶剂时，目标分子均无峰，这是因为它们本身都有很强的吸收峰，覆盖了目标分析物的峰。从图5可以看出，以3-磺丙基十六烷基二甲基铵为代表的两性离子表面活性剂是洗脱能力最佳的溶剂，明显优于甲醇和乙醇等有机溶剂。十二烷基三甲基氯化铵的提取效率也不理想。以3-磺丙基十六烷基二甲基铵为萃取溶剂时，目标分子的萃取效率最高。这可能是3-磺丙基十六烷基二甲基铵与目标分子之间的静电相互作用和氢键比目标分子与吸附剂之间的分子间相互作用强得多的原因。因此，3-磺丙基十六烷基二甲基铵最适合用作洗脱溶剂。
实施例21
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为50mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例22
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为100mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例23
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例24
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用40目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为250mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
本发明实施例20至实施例24的不同洗脱溶剂浓度的提取效果折线图如图6所示，随着3-磺丙基十六烷基二甲基铵水溶液浓度从50mM增加到200mM，5种目标分析物包括莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮、呋喃二烯的含量均逐渐增加。当3-磺丙基十六烷基二甲基铵的浓度为200mM时，提取效率达到最大值。这种现象可能是由于分析物与3-磺丙基十六烷基二甲基铵水溶液之间较强的氢键和静电相互作用，3-磺丙基十六烷基二甲基铵洗脱溶剂能够适当地抵抗吸附剂与目标分子之间比较轻微的相互作用。然而，当3-磺丙基十六烷基二甲基铵水溶液的浓度超过250mM时，分析物的提取回收率开始降低。可能的原因是洗脱溶剂的粘度增加，因此要把目标分子从吸附剂转移到溶剂中变得更加困难。因此选择200mM的浓度作为最合适的3-磺丙基十六烷基二甲基铵的浓度。
实施例25
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用20目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以15000rpm的转速将离心管放入离心机中离心3分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例26
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用60目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以10000rpm的转速将离心管放入离心机中离心15分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实施例27
一种郁金的微提取方法，包括以下步骤：
(1)将郁金药材干燥，粉碎成粉末，用20目筛进行过滤；
(2)将吸附剂葫芦脲白色颗粒研磨成粉，并放入烘箱烘干；
(3)精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后精密称取葫芦脲粉末70mg加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合粉末，研磨好后，将混合物转移至2毫升的离心管中；
(4)加入1mL浓度为200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵，剧烈涡旋萃取2分钟；
(5)以15000rpm的转速将离心管放入离心机中离心10分钟，并收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、日间精密度、重复性、检测限、定量限以及加样回收率。
日内精密度
精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后再精密称取70mg葫芦脲加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合物。研磨好后，将混合物转移至2mL的离心管中。然后加入1mL200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵洗脱溶剂，剧烈涡旋萃取2分钟，然后以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，再收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。将同一样本在同一天内不同的时间段重复进样6次来评估日内精密度(n＝6)。
日间精密度
精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后再精密称取70mg葫芦脲加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合物。研磨好后，将混合物转移至2mL的离心管中。然后加入1mL200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵洗脱溶剂，剧烈涡旋萃取2分钟，然后以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，再收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。将同一样本溶液连续三天的同一时间连续进样2次来评估日间精密度(n＝6)。
重复性
参照下列实验步骤，平行做3组，作为重复性考察。
精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后再精密称取70mg葫芦脲加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合物。研磨好后，将混合物转移至2mL的离心管中。然后加入1mL200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵洗脱溶剂，剧烈涡旋萃取2分钟，然后以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，再收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
将五个分析物(莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮、呋喃二烯)标准品用甲醇配制成1000μg/mL的混合标准溶液，再依次用甲醇稀释得到一系列不同浓度的混标溶液(0.01,0.05,0.1,0.5,1,2.5,5,10μg/mL)。将8个不同浓度的混标溶液分别用HPLC进样，得到8张5个分析物的高效液相色谱图。以分析物的浓度为横坐标，以分析物色谱峰的峰面积为纵坐标绘制5条标准曲线。
加样回收率
参照下列实验步骤，每个浓度平行做3组。
精确称取50mg的郁金粉末，将其转移至玛瑙研钵中，然后再精密称取70mg葫芦脲加入研钵，用杵轻轻研磨120s，获得均匀分布的混合物。研磨好后，将混合物转移至2mL的离心管中。然后加入1mL200mM的3-磺丙基十六烷基二甲基铵洗脱溶剂，剧烈涡旋萃取2分钟，然后以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，再收集上清液即样品溶液。
将五个分析物(莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮、呋喃二烯)标准品用甲醇配制成1000μg/mL的混合标准溶液，再用甲醇稀释得到0.1μg/mL和1μg/mL的混标溶液。
在样品溶液中分别加0.1μg/mL和1μg/mL的混标溶液，涡旋得到均匀加标混合溶液，再以13000rpm的转速将离心管放入离心机中离心5分钟，收集上清液通过0.22μm的过滤器过滤，最后用HPLC进样分析。
实验结果汇总如下表1和表2：
表1目标分析物的线性回归数据，检出限和定量限
表2郁金样品的含量、加标回收率和重复性数据
结果表明，本发明方法操作简单，不需要复杂的样品前处理，重复性良好，回收率高，检测准确性高。图7为本发明提取得到的郁金有效成分色谱图与10μg/mL标准混合液的对照色谱图，其中图7A为本发明提取得到的郁金有效成分色谱图，图7B为10μg/mL标准混合液的对照色谱图，从图中可以看到，本发明提取得到的郁金有效成分分别为莪术二酮、异莪术烯醇、莪术呋喃二烯酮、吉马酮、呋喃二烯，并且含量较高、纯度也较好。
Claims (10)
1.一种郁金的微提取方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将郁金经粉碎后过筛得到郁金粉末；
（2）将葫芦脲研磨后烘干得到葫芦脲粉末；
（3）将葫芦脲粉末与郁金粉末按照质量比30-80:70混合研磨40-160s后得到混合粉末；
（4）在混合粉末中加入提取溶剂萃取；
（5）离心、过滤取上清后用HPLC进样分析。
2.根据权利要求1所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、曲拉通、十二烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、3-磺丙基十二烷基二甲基铵、3-磺丙基十四烷基二甲基铵和3-磺丙基十六烷基二甲基铵中一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述的提取溶剂为3-磺丙基十六烷基二甲基铵。
4.根据权利要求3所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述的提取溶剂浓度为50-250mM。
5.根据权利要求4所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述的提取溶剂浓度为150-250mM。
6.根据权利要求1所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述步骤（3）中葫芦脲粉末与郁金粉末质量比为60-80:70。
7.根据权利要求1或6所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述步骤（3）的研磨时间为100-140s。
8.根据权利要求1所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述步骤（4）中萃取方式为剧烈涡旋萃取。
9.根据权利要求1所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述步骤（1）中，郁金经粉碎后经过20-60目筛过筛。
10.根据权利要求1所述的一种郁金的微提取方法，其特征是，所述步骤（5）中，离心条件为10000-15000rpm、3-15分钟，过滤时使用孔径小于等于0.22μm的过滤器过滤。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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