CN113740472A - 一种温郁金中杀螨剂的微提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杀螨剂类农残分析物的提取富集领域，为解决现有现有技术下萃取中草药中残留杀螨剂的方法溶剂用量大、萃取时间长、操作复杂的问题，公开了一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，包括以下步骤：将温郁金粉末溶解于溶剂中，超声后离心，将上清液加入固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；将含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合后调节pH，然后震荡，再将混合溶液用滤膜过滤；将滤膜上残留颗粒用洗脱剂洗脱，洗脱得到的溶液中即包含提取后的杀螨剂。本发明提取操作简单，提取时间短，富集效率高，提取富集后杂质含量少，整体提取过程中使用的有机溶液用量少。

Description

一种温郁金中杀螨剂的微提取方法
技术领域
本发明涉及杀螨剂类农残分析物的提取富集领域，尤其涉及一种温郁金中杀螨剂的微提取方法。
背景技术
在果树和草药的种植中，常用杀螨剂控制昆虫和螨虫的生长，以最大程度地减少疾病、害虫给作物带来的不良影响。但杀螨剂的广泛使用已导致环境及食物的污染，在食物及中草药中的杀螨剂残留物会损害公众的健康。因此，有必要建立一种灵敏的、有效的和合适的分析方法来检测中草药中的杀螨剂含量。常用的检测杀螨剂的方法为仪器分析法，由于中草药样品中成分复杂，并且杀螨剂含量较低，因此在仪器分析之前需要将中草药样品中的杀螨剂进行萃取富集。目前使用的萃取方法为分散液-液萃取、磁性固相萃取、单滴微萃取和固相萃取法，这些方法存在溶剂用量大、操作复杂等缺点。
例如，在中国专利文献上公开的“一种磁性吸附材料及其在苯甲酰脲类杀虫剂检测中的应用”，其公告号为CN111495332A，该发明制备了一种的磁性共价有机骨架材料(NH2-Fe3O4@COFs)。该材料可用于萃取茶饮料中的苯甲酰脲类杀虫剂，具有吸附剂用量少，萃取时间短，磁分离速度快等优点，检测精度高，但是该材料制备过程复杂，需要使用专用磁性固相萃取仪器，成本较高。
发明内容
本发明为了克服现有技术下萃取中草药中残留杀螨剂的方法溶剂用量大、萃取时间长、操作复杂的问题，提供一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，该发明的提取操作简单，有机溶液用量少，提取时间短，富集效果好。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，所述温郁金中杀螨剂微提取方法包括以下步骤：
A、将温郁金粉末溶解于溶剂中，超声后离心，将上清液加入固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、将含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合后调节pH，然后震荡，再将混合溶液用滤膜过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用洗脱剂洗脱，洗脱得到的溶液中即包含提取后的杀螨剂。
本发明利用了分散微固相萃取前处理技术，将超分子化学葫芦脲作为吸附剂，提取温郁金中残留的杀螨剂。分散微固相萃取前处理技术将吸附剂分散到样品中并使吸附剂紧密接触目标分子，从而提高了吸附动力学和萃取效率，与传统固相萃取相比，它利用了吸附剂颗粒的分散作用，缩短了萃取时间，具有消耗的有机溶剂少、萃取时间短、操作简单且成本低廉的优点。葫芦脲是继冠醚、环糊精和杯芳烃之后的代表性大环超分子之一，其结构中较大的疏水腔和多电子羰基端口使其具有优异的客体识别能力，葫芦脲空腔与分子之间的疏水相互作用可识别和结合小分子的疏水部分。
作为优选，所述杀螨剂为四特嗪、苯螨特、唑螨酯、丁醚脲、哒螨灵、伊维菌素和多拉菌素中的一种或几种。
温郁金是我国著名道地药材“浙八味”之一，在大规模地种植中易受病虫害。四特嗪、苯螨特、唑螨酯、丁醚脲、哒螨灵、伊维菌素和多拉菌素是广谱杀螨剂，普遍地应用于温郁金的生产中。
作为优选，所述步骤A中，溶剂为乙腈，温郁金粉末与溶剂的质量体积比为(0.5-2mg):(5-20mL)，超声时间为20-40min。
作为优选，所述步骤A中，溶剂为溶解有NaCl和MgSO4的乙腈，其中NaCl的浓度为0.1-0.15mol/L，MgSO4的浓度为0.2-0.3mol/L。
使用含有NaCl和MgSO4的乙腈溶解温郁金粉末可降低杂质的溶解度，减少杂质的量有利于后续杀螨剂的分离与萃取。
作为优选，所述步骤A中，固相萃取柱中的吸附剂为含有用乙腈预洗的C18吸附剂。
C18吸附剂可吸附温郁金中的活性物质而不吸附温郁金中的杀螨剂，可将温郁金中的活性物质与杀螨剂分离。
作为优选，所述步骤B中，葫芦脲水溶液中葫芦脲的浓度为0.2-1.0μg/mL，洗脱溶液与葫芦脲水溶液的体积比为1:100。
杀螨剂与葫芦脲相互作用，被富集在吸附材料上，与其他杂质分离。葫芦脲对杀螨剂的吸附能力随葫芦脲的浓度提升而提高，因此选用高浓度的葫芦脲可提高萃取效率；但萃取效率提高的同时，杀螨剂越来越难被洗脱液洗脱，因此提取效率会降低。
作为优选，所述步骤B中，pH调节为2-7。
溶液的pH会影响葫芦脲的表面电荷性质，从而影响葫芦脲与杀螨剂之间的结合力，因此酸性环境可使葫芦脲表面带正电荷，对杀螨剂的吸附效果较好，从而提升对杀螨剂的提取效果。
作为优选，所述步骤B中，震荡速度为400-500rpm，震荡时间为30-150s。
振荡可以使葫芦脲与杀螨剂充分接触，从而提高提取效率，但较长的振荡时间可能导致杀螨剂重新溶解到溶液中，这可能会对提取效率产生不利影响。
作为优选，所述步骤C中，洗脱剂为甲醇、乙醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯中的一种或几种混合。
利用洗脱剂与杀螨剂之间的作用力，将杀螨剂与葫芦脲分离。
作为优选，所述温郁金中杀螨剂微提取方法还包括将步骤C中洗脱得到的溶液，取上清液过滤，取滤液用超高效液相色谱进行分析。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)提取操作简单，提取时间短，富集效率高，提取富集后杂质含量少；(2)使用的有机溶液用量少；(3)本发明的提取方法可实现杀螨剂的快速检测，并且提高了后续超高效液相色谱检测的精密度、准确度。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
图2a是实施例1提取得到的7种杀螨剂色谱图，图2b是2μg/mL标准混合溶液的色谱图，图中1-四特嗪，2-唑螨酯，3-苯螨特，4-哒螨灵，5-丁醚脲，6-多拉菌素，7-伊维菌素。
图3为不同葫芦脲浓度的提取效果折线图。
图4为不同震荡提取时间的提取效果折线图。
图5为不同洗脱剂的提取效果折线图。
图6为不同pH的提取效果折线图。
图7为对比例1步骤A中含有未被吸附成分的溶液的超高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方法对本发明做进一步的描述。
本发明中，检测的温郁金为喷洒了四特嗪、苯螨特、唑螨酯、丁醚脲、哒螨灵、伊维菌素和多拉菌素以模拟杀螨剂残留的温郁金。
总实施例
本发明中提取杀螨剂的流程如图1所示：
A、将温郁金磨成粉末后过筛，取1g温郁金粉末溶解于乙腈中，超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂的3.0mL固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、将含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合后用1.0mol/L HCl或1.0mol/L NaOH调节pH，然后以500rpm的速度震荡30-150s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
本发明中使用的超高效液相色谱仪为配备二元泵和自动进样器的Agilent 1290超高效液相色谱系统，色谱柱柱型号Agilent Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm内径，3.5μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，洗脱梯度为：0-2min，15-50％B；2-4min，50-80％B；4-10min，80-100％B。流动相流速为0.4mL/min，样品进样量为2μL，柱温为30℃，检测器为二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为240nm。
本发明涉及的标准混合对照溶液，其制备方法为：分别精密称取适当量四特嗪、唑螨酯、哒螨灵、丁醚脲、伊维菌素和多拉菌素标准品于1.5mL离心管中，加适量的甲醇涡旋溶解，制成各组分浓度均为1mg/mL的标准品母液，使用前用超纯水稀释成所需浓度的标准对照溶液。
提取溶剂的制备方法为：精密称取葫芦脲1.0mg，加入10mL超纯水中，放入超声波浴中30min，得到浓度为100μg/mL的葫芦脲水溶液。
其中超高效液相色谱的进样条件、标准混合对照溶液的制备、提取溶剂的制备无特殊说明时，在以下实施例中均通用。
实施例1
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.2μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为0.2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析；
D、将各组分浓度均为1mg/mL的标准品母液稀释至各组分浓度为2μg/mL，用0.22μm尼龙滤器过滤后，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例1所得液相色谱图如图2a所示，2μg/mL标准混合溶液的色谱图如图2b所示，实施例1提取得到的溶液出峰位置与标准品溶液相同，这表明本方法有效地从温郁金中分离提取了7种杀螨剂。
实施例2
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.2μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例3
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.4μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例4
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例5
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.8μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例6
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为1.0μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例7
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡30s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例8
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡90s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例9
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡120s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例10
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡150s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例11
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL乙醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例12
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL乙腈洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例13
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL氯仿洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例14
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为7.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL乙酸乙酯洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例15
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为2.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例16
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为3.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例17
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为4.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例18
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为10.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例19
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为11.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例20
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，pH调节为12.0，稀释至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，杀螨剂的浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例2-6中葫芦脲浓度不同，其提取效果如图3所示。随着吸附剂浓度从0.2μg/mL增加到0.6μg/mL，峰面积增加，这表明提取过程中杀螨剂的富集因子增加。这是因为高浓度的葫芦脲增强了表面积以及目标提取物与吸附剂之间的相互作用，进而提高了萃取效率。当吸附剂浓度从0.6μg/mL增加到0.8μg/mL时，7种杀螨剂的峰面积减小。这种现象说明葫芦脲浓度越高，对目标提取物的吸附能力越强，目标提取物难以被洗脱液洗脱，提取效率下降。葫芦脲浓度在0.8-1.0μg/mL时，峰面积几乎保持不变。根据以上结果，0.6μg/ml葫芦脲溶液作吸附剂的最佳浓度。
实施例6及7-10中，震荡提取时间不同，最终的提取效果如图4所示。在一定范围内有足够的振荡时间可以使吸附剂与目标提取物充分接触，从而提高提取效率，由图可知，随着振荡时间从30s增加到60s，所有目标提取物的峰面积都有所增加。然而，振荡时间在60-150s时，目标提取物的峰面积随着振荡时间的增加而减小，这由于较长的振荡时间可能导致目标提取物重新溶解到溶液中，对提取效率产生不利影响。因此提取时间为60s时，提取和溶解过程达到动态平衡，提取效果最佳。
实施例6及11-14使用了不同的洗脱剂，不同的洗脱剂带来的提取效果如图4所示。数据表明实施例6的峰面积最大，甲醇的洗脱效果最好，其次是乙酸乙酯、乙醇、乙腈和氯仿。这种现象是因为甲醇具有高极性，因而洗脱能力强。从图5还可以看出，氯仿对四特嗪的洗脱能力强，但对其他杀螨剂的洗脱能力较差，故不选择氯仿作为洗脱溶剂。
实施例6及15-20的pH不同。如图6所示，7种目标提取物的提取效率随着pH值从2.0增加到3.0而显著增加，当pH值超过3.0时，提取效率降低。这是因为pH会对水溶液中吸附剂的表面性质产生影响从而影响吸附效率。当pH值为3.0时，葫芦脲在溶液中被氢离子质子化因此葫芦脲表面带正电荷。目标提取物与吸附剂相互作用强，有利于吸附剂吸附更多的目标提取物，从而提高提取效率，使得后续洗脱液解吸得到的杀螨剂含量和纯度更高。在碱性环境下，哒螨灵的提取效率急剧下降，这归因于哒螨灵会在碱性环境中水解。综上所述，最佳的pH值为3.0。
为了验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、日间精密度、重复性以及加样回收率。
日内精密度
1、将标准品母液与葫芦脲水溶液混合后定容至10.00mL，混合后标准品中各组分浓度为2μg/mL，葫芦脲浓度为0.6μg/mL；
2、将混合溶液用振荡仪以500rpm振荡60s，然后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤；
3、使用100μL甲醇对滤膜上残留颗粒进行洗脱，洗脱液收集到1.5mL的离心管中，置于离心机，13000rpm下离心5min；
4、吸取中间液体通过0.22μm微孔滤膜过滤，用超高效液相色谱分析结果；
5、在同一天内不同的时间段进样6次。
日间精密度
1、将标准品母液与葫芦脲水溶液混合后定容至10.00mL，混合后标准品中各组分浓度为2μg/mL，葫芦脲浓度为0.6μg/mL；
2、将混合溶液用振荡仪以500rpm振荡60s，然后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤；
3、使用100μL甲醇对滤膜上残留颗粒进行洗脱，洗脱液收集到1.5mL的离心管中，置于离心机，13000rpm下离心5min；
4、吸取中间液体通过0.22μm微孔滤膜过滤，用超高效液相色谱分析结果；
5、在三天内相同的时间点进样，每天进2次。
重复性
参照下列实验步骤，平行做3组，作为考察：
1、将标准品母液与葫芦脲水溶液混合后定容至10.00mL，混合后标准品中各组分浓度为2μg/mL，葫芦脲浓度为0.6μg/mL；
2、将混合溶液用振荡仪以500rpm振荡60s，然后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤；
3、使用100μL甲醇对滤膜上残留颗粒进行洗脱，洗脱液收集到1.5mL的离心管中，置于离心机，13000rpm下离心5min；
4、吸取中间液体通过0.22μm微孔滤膜过滤，用超高效液相色谱分析结果。
加样回收率
1、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
2、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，向混合液中加入1μL或10μL标准品母液后定容至10.00mL，混合后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，除去标准品母液引入的量外原各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL；
3、将混合溶液用振荡仪以500rpm振荡60s，然后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤；
4、使用100μL甲醇对滤膜上残留颗粒进行洗脱，洗脱液收集到1.5mL的离心管中，置于离心机，13000rpm下离心5min；
5、吸取中间液体通过0.22μm微孔滤膜过滤，用超高效液相色谱分析结果。
上述实验结果分别如表1、表2所示：
表1.日内精密度、日间精密度检测结果
Figure BDA0003210914950000121
Figure BDA0003210914950000131
表2.回收率、重复性检测结果
Figure BDA0003210914950000132
结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性好。图6为本发明提取得到的7种杀螨剂的色谱图和2μg/mL标准混合溶液的色谱图，由图可知，本发明成功提取富集了7种杀螨剂成分，提取后杂质影响较少。
对比例1
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，定容至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
对比例1中，经过C18吸附剂固相萃取柱后，所得的含有未被吸附成分的溶液成分如图7所示，相较于图2a和2b，图7中出现了大量杂峰，并且在目标提取物的保留时间出现的几个峰，其峰面积的比例与图2a的目标峰之间的比例有较大差别。这表明当用于初提取的乙腈中未添加NaCl和MgSO4时，大量杂质进入初提取的溶液中，这些杂质在后续固相萃取柱的分离过程中难以与目标提取物分离。也表明在本发明使用的液相条件下，溶液中的杂质与目标提取物的保留时间相近，会对液相的定量结果带来干扰，从而造成较大的误差。
对比例2
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl，用超声仪超声30min后离心，将上清液加入装有用乙腈预洗的C18吸附剂固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、取含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合，定容至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
对比例3
A、将1g温郁金粉末溶解于15mL乙腈中，加入2.0g NaCl和4.0g MgSO4，用超声仪超声30min后离心，取上清液与葫芦脲水溶液混合，定容至10.00mL，稀释后葫芦脲浓度为0.6μg/mL，各组分杀螨剂浓度约为2μg/mL，将溶液以500rpm的速度震荡60s，再将混合溶液用0.45μm一次性尼龙过滤器过滤；
B、取滤膜上残留颗粒用100μL甲醇洗脱，将洗脱得到的溶液离心后，取上清液用0.22μm尼龙滤器过滤，取滤液用超高效液相色谱仪进行检测分析。
实施例6、对比例1-3的7种杀螨剂的峰面积如表3所示：
表3.实施例6、对比例1-3的7种杀螨剂的峰面积
项目 四特嗪 苯螨特 唑螨酯 丁醚脲 哒螨灵 多拉菌素 伊维菌素
实施例6 1814.85 7997.18 12776.8 10578.1 12814.4 7347.87 6793.01
对比例1 7915.17 28521.4 12384.2 24145.8 26484.3 7657.39 8983.18
对比例2 5713.36 21394.3 12276.4 15764.5 20369.6 7620.28 7841.91
对比例3 8632.51 30378.7 13680.5 26723.3 28347.1 8163.64 9354.67
对比例1-3的四特嗪、苯螨特、丁醚脲、哒螨灵及伊维菌素的峰面积均高于实施例6的峰面积，并且远超出正常仪器误差范围，这表明对比例1、对比例2和对比例3最终得到的提取液中含有大量杂质。由此可知，葫芦脲对杂质及目标提取物均有吸附作用，无法通过葫芦脲吸附分离提纯目标提取物。因此在初提取溶液中添加NaCl和MgSO4，以及用固相萃取柱吸附温郁金中的药用活性物质均能提升本发明提取纯度。单独添加NaCl对去除杂质的效果没有NaCl和MgSO4共同作用好。

Claims (10)

1.一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述温郁金中杀螨剂微提取方法包括以下步骤：
A、将温郁金粉末溶解于溶剂中，超声后离心，将上清液加入固相萃取柱中混合吸附，收集含有未被吸附成分的溶液；
B、将含有未被吸附成分的溶液与葫芦脲水溶液混合后调节pH，然后震荡，再将混合溶液用滤膜过滤；
C、将滤膜上残留颗粒用洗脱剂洗脱，洗脱得到的溶液中即包含提取后的杀螨剂。
2.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述杀螨剂为四特嗪、苯螨特、唑螨酯、丁醚脲、哒螨灵、伊维菌素和多拉菌素中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤A中，溶剂为乙腈，温郁金粉末与溶剂的质量体积比为(0.5-2 mg):(5-20 mL)，超声时间为20-40min。
4.根据权利要求3所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤A中，溶剂为溶解有NaCl和MgSO4的乙腈，其中NaCl的浓度为0.1-0.15 mol/L，MgSO4的浓度为0.2-0.3 mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤A中，固相萃取柱中的吸附剂为含有用乙腈预洗的C18吸附剂。
6.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤B中，葫芦脲水溶液中葫芦脲的浓度为0.2-1.0 μg/mL，洗脱溶液与葫芦脲水溶液的体积比为1:100。
7.根据权利要求1或6所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤B中，pH调节为2-7。
8.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤B中，震荡速度为400-500 rpm，震荡时间为30-150 s。
9.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述步骤C中，洗脱剂为甲醇、乙醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯中的一种或几种混合。
10.根据权利要求1所述的一种温郁金中杀螨剂的微提取方法，其特征是，所述温郁金中杀螨剂微提取方法还包括将步骤C中洗脱得到的溶液离心，取上清液过滤，取滤液用超高效液相色谱进行分析。
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