CN109085361B - 一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法。利用带标签的选定重组核受体蛋白选择性地吸附到磁珠载体上,再根据核受体与小分子亲和结合的原理,利用重组核受体蛋白特异性地从复杂环境介质中捕获具有结合活性的效应物质,再结合超高效液相色谱‑四级杆静电场轨道阱高分辨质谱技术进行高通量、非靶向效应物质的分析。本发明提高了物质鉴定的特异性和效率,能够应用于环境中与核受体结合的效应物质的快速筛选和结构鉴定,也可以用于药物开发。
Description
技术领域
本发明属于生物化学检测领域,涉及一种筛查与重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质的方法,特别涉及一种重组核受体蛋白固定于镍磁珠上的亲和结合筛选方法及其基础上建立的高通量非靶向效应物质鉴定方法。
背景技术
全球化学品正在以爆炸性的速度增长,迄今为止美国化学文摘社登记了超过1.087亿个商用化学品,这些物质在给人们生活带来便利的同时也以各种形式进入环境介质,如室内灰尘,饮用水等。大量研究表明环境中一些化学物质会干扰内分泌系统,从而影响生态与人类健康,但是对于导致这些问题的特定的效应物质,知之甚少。
鉴定复杂环境介质中有毒的化合物组成主要障碍在于环境基质的复杂性,目前环境中生物效应物质的鉴定主要是利用效应导向的化学物质鉴定方法(Effects directedanalysis,EDA,可参见Brack W.Effect-directed analysis:a promising tool for theidentification of organic toxicants in complex mixtures.Anal BioanalChem.2003.377(3):397-407.)。但是该方法耗时耗力,需要采用气相或液相色谱进行多步馏分分割实验,化学分析和生物活性测试相互独立,特异性差,选择性低,因此复杂环境基质中痕量生物效应物质鉴定的成效非常低下。
发明内容
为了从环境样品中特异性地高通量筛选和鉴定生物效应物质的目的,本发明提供了一种基于核受体蛋白与小分子亲和结合原理的生物效应物质的高通量鉴定方法。
本发明采取的技术方案为:
一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质筛查鉴定方法,包括:
将带标签的选定重组核受体蛋白与待测环境介质混合,使上述重组核受体蛋白结合环境介质中的生物效应物质;
将结合生物效应物质的重组核受体蛋白固定到磁珠载体上;
洗脱得到核受体蛋白与生物效应物质的混合物;
对混合物进行液液萃取得到样品;
采用不表达上述重组核受体蛋白的空载体蛋白,基于上述同样过程得到对照;
筛选样品与对照之间的差异化合物;
通过化学数据库和质谱数据库搜索以鉴定上述差异化合物。
进一步地,本发明通过对样品和对照进行高分辨液相色谱质谱检测,采用Progenesis QI软件对采集到的数据进行设定的预处理,再采用Simca-P软件对预处理后的数据进行多元统计方法分析,筛选出两者之间的差异化合物。
进一步地,上述多元统计方法包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Projections to Latent StructuresDiscriminant Analysis,OPLS-DA),根据变量重要性因子VIP、非参数T检验、样品组与对照组峰面积倍数关系(fold change)(样品组是重组核受体蛋白结合效应物质和非特异性物质,对照组是空载体蛋白结合非特异性物质)来筛选上述差异化合物。
上述筛选条件为:VIP>1,p<0.05,fold change>1和VIP<1,p<0.05,fold change>10,同时排除实验过程背景(将加入环境介质的重组核受体蛋白组和不加入环境介质的重组核受体蛋白组的数据进行比较,将两组物质的峰强度做比值并进行非参数T检验,排除强度显著低于背景的物质(fold change<2且p>0.05))和蛋白本身的影响(按照上述相同的处理,进行了不加入环境介质的重组核受体蛋白以及不加入环境介质的空载体蛋白的实验,排除这部分蛋白本身的差异物质(VIP>1,p<0.05))。进一步地,本发明通过在线化学数据库EPA Toxcast结合质谱数据库(mzCloud质谱数据库和本地质谱数据库)对上述差异化学物的结构进行搜库鉴定。
进一步地,上述搜库鉴定的限制条件为:一级精确质量数小于5ppm,二级碎片质量数小于5ppm,同位素相似度大于80%,元素组成限制(C:0-100;H:0-150;O:0-40;N:0-20;P:0-10;S:0-10;Br:0-30;Cl:0-30;F:0-30)。
进一步地,上述重组核受体蛋白包括:AR,ERα,ERβ,ERγ,PR,GR,ERR,PPARα,PPARδ,PPARγ,RXRα,RXRβ,RXRγ,RARα,RARβ,RARγ,TRα,TRβ,VDR,PXR,CAR,LXRα,LXRβ,FXR,AhR重组核受体蛋白。
进一步地,上述重组核受体蛋白是带有组氨酸(His)标签的人核受体蛋白,所述磁珠为Ni2+鳌合的磁珠。
进一步地,所述核受体蛋白与环境介质的反应优选条件为:蛋白与环境介质混匀后在4℃下,静置孵育1h。蛋白固定于磁珠上的优选条件为:1ml的磁珠悬浮液与小于3mg的结合生物效应物质后的蛋白在4℃下,旋转混合1h。洗脱是采用500μL洗脱缓冲液(20mMTris-HCl,500mM NaCl,250mM咪唑,pH 8.0),洗脱4次。液液萃取是采用3倍体积的甲酸和乙酸乙酯(体积比1:200)为萃取剂,萃取3次。
本发明原理是先利用带标签的选定重组核受体蛋白选择性地吸附到磁珠载体上,再根据核受体与小分子亲和结合的原理,利用核受体蛋白特异性地从复杂环境介质中捕获具有结合活性的效应物质,再结合超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱技术(UHPLC-QE-MS/MS)进行高通量、非靶向生物效应物质的分析。
与传统EDA方法相比,本发明弥补了效应导向的化学物质鉴定方法特异性差、化合物鉴定通量低的缺陷,提高了物质鉴定的特异性和效率,能够应用于环境中与核受体结合的效应物质的快速筛选和结构鉴定,也可以用于药物开发。
本发明还通过特定的方法来筛选差异化合物:
通过OPLS-DA分析筛选差异物质是代谢组学研究中寻找生物标志物质的重要手段,但是应用到环境领域之后则显示出了一些方法本身的不足之处。首先VIP值的大小只表征变量的差异程度而不表征这种变量的可信度,因此在后续处理中需要对变量进行非参数T检验来确保数据的可信度。另外VIP值对于变量本身的绝对值大小较为敏感,也就是说通过VIP值筛选的差异物质往往都是平均浓度较高的物质,而对于浓度较低的物质,即使其在实验组和对照组中浓度差异很大也无法被筛选出来,而对于环境污染物来说,即使极低的浓度也可能对人体健康产生较大影响,因此不能仅仅考虑浓度较高的物质。本发明方法中,根据VIP值是否大于1将色谱-质谱峰分为两类进行数据处理:VIP>1,p<0.05,fold change>1和VIP<1,p<0.05,fold change>10,确保差异物质能够全部筛选出来。具体筛选策略如附图3所示。
本发明还选用特定的数据库来对差异化合物进行搜库鉴定:
首先,EPA ToxCast毒性预测数据库是作为21世纪毒理学研究计划的一部分,该计划对目前常见的1万种化合物进行了受体活性的筛选,因此这个数据库包含的主要是环境领域关注的污染物,而其他类型的在线化合物库(如Metlin,HMDB,KEGG等)主要针对很多内源性代谢小分子,因此通过在EPA ToxCast数据库中进行分子式的确定可以提高化合物的命中率,避免了筛选的盲目性。
其次,为了进一步鉴定上述已知分子式的物质的分子结构,需要将物质的二级质谱在质谱谱库中进行搜索和匹配。随着高分辨液相色谱质谱串联技术和互联网的飞速发展,已经出现了许多在线质谱库如Massbank、mzCloud、HMDB、KEGG、MetFrag等。与气质联用技术不同,液相色谱质谱串联的质谱数据普适性较差,不同的质谱仪器以及不同的碎片离子采集参数,均能导致二级质谱碎片离子种类及响应强度的巨大差异。同时,绝大部分这些数据库中包含的二级质谱的信息是通过计算机模拟预测的物质的二级谱图,不是基于标准样品实际检测的结果,相比于依据实际的谱图建成的谱库有一定差距。目前只有由ThermoFisher Scientific公司构建的在线质谱数据库(称为mzCloud数据库)是基于标准样品实际检测得到的一级、二级质谱库。截止目前mzCloud数据库收录了7788种化合物(还在更新),包含2700947张质谱图,并且该数据库免费开放使用,主要包含了如生命科学、代谢组学、药物研究、毒理学、法医调查、环境分析等领域在内的常见的化合物分析,同时mzCloud还提供了同一物质在不同二级质谱采集参数下的质谱信息,较大程度的减少了由于仪器条件不同导致错误的匹配。同时本地质谱数据库包含的物质都是环境领域需要关注监测的化合物,可以构建基于不同仪器类型的采集的质谱图。基于这些原因,本发明选择在mzCloud数据库和本地质谱数据库上进行物质结构的检索确定。
附图说明
图1.方法特异性评价示意图:AM580和罗格列酮与RARα重组核受体蛋白(以下有时也简称为“RARα蛋白”)和空载体蛋白的结合。
图2.方法准确性评价示意图:RARα蛋白对不同浓度AM580的回收率。
图3.差异未知化合物的筛选鉴定策略示意图。
图4.室内灰尘分别与RARα蛋白、空载体蛋白结合后的总离子流色谱图。
图5.方法特异性评价示意图:罗格列酮和TPrP与PPARγ重组核受体蛋白(以下有时也简称为“PPARγ蛋白”)和空载体蛋白的结合。
图6.方法准确性评价示意图:PPARγ蛋白对不同浓度罗格列酮的回收率。
图7.方法准确性评价示意图:LXRα重组核受体蛋白(以下有时也简称为“LXRα蛋白”)对不同浓度TO901317的回收率。
具体实施方式
以下将以鉴定常见环境介质中的生物效应物质为例对本发明的技术方案进行更为详细的说明。
一、检测室内灰尘中与RARα重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质
1、基于亲和结合原理的特异性捕获化学物方法
A.称取0.1g灰尘,依次用5mL正己烷、5mL二氯甲烷/正己烷(1:4,v/v)、5mL二氯甲烷/正己烷(1:1,v/v)、5mL甲醇超声20min,震荡萃取30min,再离心4000rpm,10min,吸取上清液,合并萃取液,氮气吹干,100μLDMSO定容。
B.1ml 10%的Ni2+鳌合的磁珠悬浮液,用1ml S3缓冲液清洗磁珠3次,再加入100μLS3缓冲液。
C.取500μg带有组氨酸(His)标签的人的RARα蛋白(可通过市场购得或自制)与10μL浓缩后的灰尘提取液(有机溶剂小于总反应体积的0.5%)于4℃,孵育1h,再往反应体系中加入准备好的磁珠,再于4℃,旋转混合孵育1h。
D.将反应体系置于磁力架上,静置10s,吸掉上清,再加入清洗缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,10mM咪唑,pH 8.0)500μL,清洗3次。再加入洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mM咪唑,pH 8.0)500μL,洗脱4次,合并洗脱液。
E.往上述合并洗脱液中,加入甲酸50μL,乙酸乙酯6ml,震荡20min,萃取3次,最后高纯氮吹干,并用甲醇定容100μL,进行高分辨质谱分析,得到待测生物效应物质的质谱图,以备后续的数据分析和结构鉴定。
F.对照组实验过程和条件与此相同,只是将目标蛋白换成不表达RARα蛋白的空载体蛋白。
G.为了研究磁珠蛋白亲和结合方法的特异性,本实施例以RARα蛋白为研究对象,以RARα的激动剂AM580为阳性对照物,罗格列酮为阴性对照物,替代浓缩灰尘样品,每种物质分别与RARα蛋白以及空载体蛋白反应,按照上述步骤,进行相同的实验,实验结果见附图1,RARα蛋白能够结合AM580,而不会保留罗格列酮。同时,在空载体蛋白上,AM580和罗格列酮的吸附都很少,表明空载体蛋白对这两种物质没有或非常低的亲和力。为了研究方法的准确性,保证该方法能够捕获到浓度范围比较宽的物质,采用添加不同浓度(0.4-250ppb)的AM580,替代浓缩灰尘样品,分别与RARα蛋白结合,按照上述步骤,进行相同的实验,实验结果见附图2,蛋白实际结合的AM580浓度与添加的AM580浓度有很好的相关性,呈现一个线性依赖关系,随着阳性物质浓度的增加,蛋白捕获到的物质的浓度也在增加。
2、高通量物质结构鉴定
A.采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC-QE-MS/MS进行样品分析,检测条件为色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm,Waters),流动相采用超纯水(A)和甲醇(B),梯度洗脱条件:0-0.1min,95%A;0.1-3min,95%-40%A;3-13min,40%-0%A;13-16min,0%A;16-16.1min,0-95%A;16.1-20min,95%A。进样量:5μL;流速0.3mL/min;柱箱及样品盘温度分别保持在40℃和10℃。采用热电离喷雾H-ESI离子化方式;电喷雾电压为3500v;离子传输管温度为320℃;辅助气温度为350℃;载气流量为30bar;辅助气流为10bar;正离子与负离子扫描模式为Full MS dd MS2,质量数采集范围为100-1200m/z;采集模式分开,一级质谱扫描分辨率为70,000FWHM;二级质谱扫描分辨率为17,500FWHM;碰撞能量NCE为梯度10,30,50ev。
获得的原始质谱数据如图4所示,其中(a)正离子模式;(b)负离子模式。
B.采集的数据通过Progenesis QI软件预处理:峰提取,峰匹配,峰对齐和归一化,再采用Simca-P软件对预处理后的数据进行多元统计方法分析,包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OrthogonalProjections to Latent Structures Discriminant Analysis,OPLS-DA),根据变量重要性因子VIP、非参数T检验、样品组与对照组峰面积倍数关系(fold change)来筛选出样品组与对照组之间的差异的未知化合物。筛选条件为:VIP>1,p<0.05,fold change>1和VIP<1,p<0.05,fold change>10,同时排除实验背景和蛋白的影响。流程见附图3。
具体来说,对于VIP>1的物质,首先进行非参数T检验,排除p>0.05的数据。由于这样筛选出来的差异物质有可能是由于RARα蛋白以及空载体蛋白本身造成的差异,造成假阳性。因此本实施例进行了不加入灰尘样品的RARα蛋白以及空载体蛋白的空白实验,进行相同处理后发现在只有RARα蛋白以及空载体蛋白的情况下依然有许多差异分子被筛选了出来,将这部分蛋白本身的差异物质做了排除处理。同时考虑到实验过程背景的原因,本发明将加入灰尘样品的RARα蛋白组数据和RARα蛋白的空白组数据进行比较,将两组物质的峰强度做比值并进行非参数T检验,只保留强度显著高于背景的物质(fold change>2且p<0.05)。最后得到了目标差异物质426个,其中正离子模式下筛选出343个和负离子模式下筛选出83个。
另一方面,VIP<1的物质大部分都是浓度较低的差异分子,在这类数据中仪器噪声以及波动等情况对物质的响应的影响非常大,因此本实施例采取了保守的筛选条件。通过样品组与对照组峰面积倍数变化值(fold change)的大小来衡量,只有在RARα样品组中的物质响应远高于空载体蛋白样品组(fold change>10)、在非参数T检验中p<0.05且物质响应强度显著高于背景(fold change>2且p<0.05)的物质才将其列入目标差异物质清单。最终,筛选出199个差异物质,其中正离子模式下筛选出103个和负离子模式下筛选出96个。
这样在灰尘中确定了625个差异物质,其中正离子筛选的质谱峰446个,负离子筛选的质谱峰179个。由于Progenesis QI软件在进行峰匹配时,是考虑了一级质谱的信息,仅有一级离子信息无法鉴定化合物结构。为了剔除没有二级碎片离子的化合物,进一步在原始谱图中排除没有二级碎片的离子最终有282个离子需要进行下一步的鉴定。
C.为了鉴定上述282个物质的结构,本实施例同时利用了化学数据库EPA ToxCast和质谱数据库(mzCloud和本地质谱库)进行综合鉴定。
EPA ToxCast毒性预测数据库包含的主要是环境领域关注的污染物,其他类型的在线化合物库(如Metlin,HMDB,KEGG等)主要包含内源性代谢小分子,为了提高化合物鉴定的准确性和避免筛选的盲目性,本方法首先采用Progenesis QI软件对筛选的差异未知物进行在线化学数据库EPA Toxcast中分子式的检索,数据库搜索限制条件为:一级精确质量数小于5ppm,二级碎片质量数小于5ppm,同位素相似度大于80%,元素组成限制(C:0-100;H:0-150;O:0-40;N:0-20;P:0-10;S:0-10;Br:0-30;Cl:0-30;F:0-30)。
从ToxCast数据库中,鉴定出136个物质的化学分子式,如下表1所示。
表1室内灰尘中初步筛选出来具有RARα活性的物质的分子式
D.由于mzcloud质谱数据库和本地质谱数据库中提供了化学物质真实的二级碎片质谱图信息,同时较大程度的减少了由于仪器条件不同导致错误的匹配,因此本实施例进一步返回原始质谱数据,根据质荷比找到每种物质的质谱图,再通过mzcloud质谱数据库和本地质谱数据库对上述具有分子式和质谱图的潜在物质进行数据库中的质谱图匹配,得到物质的结构。
根据搜索结果,上述136种化合物在mzCloud数据库和本地质谱库中发现有27种物质能匹配到相应的结构,具体结构等信息如下表2所示。
表2室内灰尘样品具有RARα效应的目标物质结构信息
E.通过标准样品进一步确证上述鉴定的物质的结构。
经过与各现有方法所得生物效应物质的实物对比,可以确定,按照本发明方法所测定的生物效应物质是最全面且准确的。
二、检测饮用水水源中与PPARγ重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质
参照上述过程,进行实验,可以检测到饮用水水源中与PPARγ重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质,其中:
(1)基于亲和结合原理的特异性捕获化学物方法与实施例1中第1部分实验步骤相同,不同之处在于:
A.饮用水水源样品采用Oasis HLB固相萃取柱(500mg,6cc,waters)进行富集。HLB柱依次用6mL甲醇和12mL水活化,再取2L水样经过玻璃纤维滤膜过滤后,控制水样以5-10mL/min的流速通过活化好的HLB柱。水样全部通过HLB柱后,用氮气流吹干柱子,除尽柱床中的水分。再依次用5mL正己烷,5mL正己烷:二氯甲烷(体积比4:1),5mL正己烷:二氯甲烷(体积比1:1),5mL二氯甲烷,5mL甲醇洗脱目标物质,洗脱液合并,并在微弱的高纯氮气流下吹干,之后用甲醇定容至0.1mL,再取出0.05mL吹干重溶在DMSO中,保存于-20℃。
G.为了验证磁珠蛋白亲和结合方法的特异性,本实施例以带有组氨酸(His)标签的人的PPARγ蛋白(可通过市场购得或自制)为研究对象,以PPARγ的激动剂罗格列酮为阳性对照物,有机磷酸三丙酯(TPrP)为阴性对照物,替代浓缩饮用水水源样品,每种物质分别与PPARγ蛋白以及空载体蛋白反应,按照实施例1中的步骤,进行相同的实验,实验结果见附图5,PPARγ蛋白能够结合罗格列酮,而不会保留TPrP。同时,在空载体蛋白上,罗格列酮和TPrP的吸附都很少,表明空载体蛋白对这两种物质没有或非常低的亲和力。为了研究方法的准确性,保证该方法能够捕获到浓度范围比较宽的物质,采用添加不同浓度(0.5ppb-500ppb)的罗格列酮,替代浓缩灰尘样品,分别与PPARγ蛋白结合,按照上述步骤,进行相同的实验,实验结果见附图6,蛋白实际结合的罗格列酮浓度与添加的罗格列酮浓度有很好的相关性,呈现一个线性依赖关系,随着阳性物质浓度的增加,蛋白捕获到的物质的浓度也在增加。
(3)高通量物质结构鉴定与实施例1中第3部分实验步骤相同,实验结果如下:按照VIP>1,非配对T检验有显著p<0.05,样品组大于对照组(fold change>1),排除蛋白本身差异以及背景差异的原则,饮用水水源中与PPARγ重组核受体蛋白特异性结合的物质筛选出100个m/z,剔除没有二级碎片的离子后,最后有43个潜在的目标差异物质。按照VIP<1,foldchange>10,p<0.05,排除蛋白本身差异以及背景差异的原则,筛选出125个m/z,再进一步返回原始谱图排除没有二级碎片的离子,最终找到50个潜在的目标差异物质。
综上,本实施例中筛选到93个潜在的PPARγ生物效应物质,通过EPA Toxcast数据库进行搜索,最终有58个潜在的生物效应物质(表3)能够找到分子式,需要再进行进一步的结构鉴定。
表3饮用水源水中58个潜在的具有PPARγ活性的物质
经过mzcloud质谱库和本地质谱库搜索鉴定能明确结构式的化合物有8个化合物,具体结构表4所示。
表4饮用水源水样品具有PPARγ效应的目标物质的结构信息
三、检测室内灰尘中与LXRα重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质
参照上述过程,进行实验,可以检测到室内灰尘中与LXRα重组核受体蛋白特异性结合的生物效应物质,其中:
(1)基于亲和结合原理的特异性捕获化学物方法与实施例1中第1部分实验步骤相同,不同之处在于:
G.为了研究本实施方法的准确性,保证本方法能够捕获到浓度范围比较宽的物质,本实施例以带有组氨酸(His)标签的人的LXRα蛋白(可通过市场购得或自制)为研究对象,采用添加不同浓度(0.25-250ppb)的LXRα的阳性激动剂TO901317,替代浓缩灰尘样品,分别与LXRα蛋白结合,按照实施例1中的步骤,进行相同的实验,实验结果见附图7,蛋白实际结合的TO901317浓度与添加的TO901317浓度有很好的相关性,呈现一个线性依赖关系,随着阳性物质浓度的增加,蛋白捕获到的物质的浓度也在增加。
(2)基于实际浓缩灰尘样品与LXRα蛋白的结合实验在本实施例中尚未进行,通过(1)中对阳性激动剂TO901317的结合和检测,可以确定,按照本发明方法所测定的灰尘中的LXRα生物效应物质同样是最全面且准确的。
综上所述,仅为本发明具体实施方式,但本发明的保护范围并不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围内,因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质筛查鉴定方法,其步骤包括:
将带标签的选定重组核受体蛋白与待测环境介质混合,使上述重组核受体蛋白结合环境介质中的生物效应物质;
将结合生物效应物质的重组核受体蛋白固定到磁珠载体上;
洗脱得到核受体蛋白与生物效应物质的混合物;
对混合物进行液液萃取得到样品;
采用不表达上述重组核受体蛋白的空载体蛋白,基于上述同样过程得到对照;
筛选样品与对照之间的差异化合物;
通过化学数据库和质谱数据库搜索以鉴定上述差异化合物。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,对差异物质的筛选采用的多元统计方法包括主成分分析和正交偏最小二乘判别分析,根据变量重要性因子VIP、非参数T检验、样品组与对照组峰面积倍数关系(fold change)来筛选上述差异化合物,筛选条件为:VIP>1,p<0.05,fold change>1和VIP<1,p<0.05,fold change>10。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过在线化学数据库EPA Toxcast结合质谱数据库对上述差异化学物的结构进行搜库鉴定,搜库鉴定的限制条件为:一级精确质量数小于5ppm,二级碎片质量数小于5ppm,同位素相似度大于80%,元素组成限制为C:0-100;H:0-150;O:0-40;N:0-20;P:0-10;S:0-10;Br:0-30;Cl:0-30;F:0-30,所述质谱数据库包括mzCloud质谱数据库和本地质谱库。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,上述重组核受体蛋白包括:AR,ERα,ERβ,ERγ,PR,GR,ERR,PPARα,PPARδ,PPARγ,RXRα,RXRβ,RXRγ,RARα,RARβ,RARγ,TRα,TRβ,VDR,PXR,CAR,LXRα,LXRβ,FXR,AhR重组核受体蛋白。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,重组核受体蛋白是带有组氨酸(His)标签的人核受体蛋白,所述磁珠为Ni2+鳌合的磁珠。
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CN201810775059.6A CN109085361B (zh) | 2018-07-13 | 2018-07-13 | 一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法 |
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CN201810775059.6A CN109085361B (zh) | 2018-07-13 | 2018-07-13 | 一种基于重组核受体蛋白的生物效应物质高通量筛查鉴定方法 |
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Citations (5)
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-
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- 2018-07-13 CN CN201810775059.6A patent/CN109085361B/zh active Active
Patent Citations (5)
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核受体超家族及其酵母双杂交检测技术;李剑等;《生态毒理学报》;20081231;第3卷(第6期);第521-532页 * |
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