CN108535400B - 一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法 - Google Patents

一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种褪黑素原料药中杂质5‑甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，采用该方法可简便快捷的确定褪黑素原料药中相关杂质的浓度是否超标，具有节省时间、检测成本低、操作方便、设备简单、显色容易、结果直观可靠等优点。

Description

一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测 方法
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体涉及褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法。
背景技术
褪黑素(Melatonin)，又名美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，为白色或类白色结晶粉末，微溶于水，能溶于丙酮、乙酸乙酯和甲醇。自1959年科学家Lerner从牛大脑松果腺内发现并得到Melatonin后，近年来关于褪黑素的研究越来越多。通过不断探索，人们逐渐发现褪黑素具有调节昼夜节律、改善睡眠质量、抗氧化、抗炎、抑制肿瘤细胞的生长、增强人体免疫功能、提高记忆和延缓衰老等多种作用。关于这方面的研究虽然才开始没多久，但进展非常可观，已被广泛运用于临床治疗以及保健品、催眠药物和毛皮兽养殖业等方面。现如今，人工合成褪黑素已成为可能，其工业化生产也在不断加大。褪黑素在改善睡眠质量、提高人体免疫力方面具有显著效果，因此将其作为保健品已被人们广泛接受。但是该药物在合成和制备过程中，极易混入合成原料、中间体、副产物等杂质，例如中间体5-甲氧基色胺，其为褪黑素原料药中常见的杂质。这就需要我们在生产过程中严格控制其质量标准，能实现对褪黑素的纯度和有关物质的检测。因此探索出一种简便、快速、有效的褪黑素色谱分析方法很有必要。
薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)，是层析分离技术的一种。它是将适宜的固定相涂布于支持板上，用合适的溶剂配制流动相进行展开，达到对混合样品进行分离、鉴定和定量的目的。长期以来，薄层色谱法由于偶尔的分析结果不能使人满意，导致很多人认为这是一种陈旧、过时、不准确的分析手段，应该用更加准确、可靠的其他色谱方法取代，比如高效液相/气相色谱。但这其实是一种偏见，只要在实际操作中严格遵守操作规范并充分考虑到一切可能的重要影响因素，就能保证检验结果的准确性，提高工作效率和质量。此外，薄层色谱法还具有操作方便、设备简单、显色容易、结果直观、展开速率快、兼具分离和鉴定双重功能，以及节省时间、成本低、检测手段多、信息来源广等优点，这是其他色谱方法所不具有的。
本申请建立了一种利用TLC技术确定褪黑素原料药中有关物质(5-甲氧基色胺)的检测方法，该方法具有操作简便、成本低等诸多优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，该方法具体包括以下步骤：
(a)利用待测的褪黑素原料药和有机溶剂配制浓度为X的标准溶液A，取适量标准溶液A，分别将其稀释100倍、1000倍，依次得到样品溶液B和样品溶液C；
(b)利用5-甲氧基色胺标准品和有机溶剂配制浓度为X的标准溶液I，取适量标准溶液I，分别将其稀释100倍、1000倍，依次得到杂质对照溶液II和杂质对照溶液III；
(c)分别取等量的标准溶液A、样品溶液B、样品溶液C、杂质对照溶液II、杂质对照溶液III，在同一块薄层板上点样，接着展开、显色，得到薄层色谱图；
(d)结果判定
如果薄层色谱图中标准溶液A在杂质对照溶液Ⅱ和杂质对照溶液Ⅲ出现斑点的平行位置也出现了杂质斑点，同时在标准溶液A主斑点下方还出现了若干(一连串)未知成分的杂质斑点，并且这些杂质斑点颜色均浅于样品溶液C和杂质对照溶液III的主斑点颜色，则待测褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的含量低于千分之一；如果这些杂质斑点颜色比样品溶液C和杂质对照溶液III的主斑点颜色深，则待测褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的含量高于千分之一。
进一步的，X的取值范围为2～12g/L，优选为10g/L。
进一步的，步骤(c)中各个样品的取样量为5-50μL，优选为20μL。该最佳点样量通过多次试验确定。
进一步的，配制各样品所使用的有机溶剂为二氯甲烷或甲醇，优选为二氯甲烷。二氯甲烷相对甲醇来说毒性较小，所以更适合作为配制各样品的有机溶剂。
进一步的，所述展开剂选自体积比为10:1或20:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液、体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液中的一种，展开时间为10-15min，显色剂为碘。
优选的，所述展开剂为体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液。根据对比样品溶液和杂质对照溶液在紫外分析仪下的硅胶薄层板的斑点显色情况和比移值的计算结果，展开剂为二氯甲烷-甲醇(体积比为10:1)时，能针对性地对褪黑素所含成分进行充分展开，因此10:1的体积比下展开剂效果最好的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)与其他分析方法相比较，本发明方法操作更加方便、设备简单、显色容易、结果直观、展开速率快、兼具分离和鉴定双重功能；(2)测试所需时间短，成本较低；(3)只需很小的点样量就可以得到很好的监测效果，此外可在同一块薄层板上同时分析多个样品，分离效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同点样量的薄层色谱图。
图2为本发明分析检测方法专属性试验得到的薄层色谱图；
图3为本发明分析检测方法检测限试验得到的薄层色谱图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
本发明所使用的褪黑素原料药来源于湖北金赛药业有限公司；玻璃点样毛细管内径为0.3mm，管长为100mm；层析缸尺寸为100×100mm；所使用的紫外分析仪型号为ZF7，巩义市予华仪器有限责任公司生产。
实施例
(1)不同浓度梯度褪黑素样品溶液的配制
褪黑素原料药来自湖北金赛药业有限公司。利用该褪黑素原料药样品和二氯甲烷配制浓度为10g/L的标准溶液A，取适量标准溶液A，分别将其稀释100倍、1000倍，依次得到样品溶液B和样品溶液C。
(2)不同浓度梯度杂质对照溶液的配制
利用5-甲氧基色胺标准品和二氯甲烷配制10g/L的杂质对照溶液I。取适量杂质对照溶液I，分别将其稀释100倍、1000倍，依次得到杂质对照溶液II和杂质对照溶液III。
(3)取薄层板，在距薄层板底部1厘米左右画一条直线，然后用点样毛细管各取5μL标准溶液A、样品溶液B、样品溶液C、杂质对照溶液Ⅱ和杂质对照溶液Ⅲ，在同一薄层板上的直线位置间隔一定距离依次点样，接着将薄层板放入玻璃层析缸中，展开剂为二氯甲烷-甲醇溶液(体积比为10：1))，展开时间为10-20min。待溶剂前进到适宜位置，将薄层板取出并吹干，然后放入碘缸内静置15-20min，显色完成后取出薄层板在ZF7紫外分析仪下进行观察。
(4)分别取上述5种溶液各10μL、20μL、30μL和40μL重复步骤(3)的操作，进而得到不同点样量的薄层色谱图，如图1所示。
从图1中可以看出，点样量为5μL时，浓度为10g/L的标准溶液A中杂质斑点没有显现，这使得定量检测样品纯度不可能，故需要继续增大点样量。当点样量增加至20μL时，对于浓度为10g/L的标准溶液A，在与杂质对照溶液Ⅱ、杂质对照溶液Ⅲ出现斑点的平行位置上出现了杂质斑点，且在标准溶液A主斑点下方也出现了一连串未知成分的杂质斑点，这些杂质斑点颜色均浅于已稀释1000倍的样品溶液C和杂质对照溶液III的主斑点颜色，这表明待测的样品褪黑素中杂质5-甲氧基色胺含量低于千分之一。为了验证猜想，继续增大点样量，可以发现在所提供的褪黑素原料药样品中的确存在杂质5-甲氧基色胺以及尚未确定的其他杂质。由于该杂质斑点的颜色均不深于已稀释1000倍的样品溶液C和杂质对照溶液Ⅲ的主斑点颜色，根据自身稀释对照法和杂质对照品法的原理，故可知该样品杂质含量低于千分之一。
在用薄层色谱法分析得出上述褪黑素原料药样品中杂质5-甲氧基色胺的含量低于千分之一后，采用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用等检测手段也验证了该褪黑素原料药样品中杂质5-甲氧基色胺的含量都低于千分之一，由此证明薄层色谱法准确可靠。
然而HPLC分析一个褪黑素样品要30-50分钟，其不仅耗时长、操作复杂而且高效液相色谱仪、气相色谱-质谱联用设备价格昂贵，多数基层机构为节省经费，并未配置。相比之下，薄层色谱分析法简单易操作，设备简单，更有优势。
本发明检测方法的专属性试验
(1)供试品溶液的配制：将已配制好的标准溶液A作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的配制：取5-15mL二氯甲烷溶剂作空白对照品备用。
(3)检查方法：取薄层板，在距薄层板底部1厘米左右画一条直线，然后用点样毛细管各取10-30μL的供试品溶液和对照品溶液在同一薄层板上的直线位置间隔点样，以二氯甲烷-甲醇(体积比10：1)为展开剂展开，展开时间为10-20min。待溶剂前进到适宜位置，将薄层板取出并吹干，然后放入碘缸内静置15-20min，显色完成后取出薄层板在ZF7紫外分析仪下进行观察，结果如图2所示。
由图2可以看出，在供试品溶液的薄层色谱中出现了杂质斑点，而在对照品溶液的薄层色谱图的相应位置上并没有显现出类似的斑点，说明二氯甲烷溶剂对样品纯度无任何干扰，表明本发明方法的专属性良好。
本发明检测方法的检测限实验
(1)供试品溶液的配制：
取褪黑素原料药样品和二氯甲烷，配制浓度为10g/L的样品溶液①，取适量标准样品溶液①，分别将其稀释5倍、10倍，得到样品溶液②和样品溶液③；取适量样品溶液③，将其稀释10倍，得到样品溶液④；取适量样品溶液④，将其稀释10倍，得到样品溶液⑤。
(2)检查方法：取薄层板，在距薄层板底部1厘米左右画一条直线，然后用点样毛细管各取30-50μL的上述样品溶液①～⑤，在同一块薄层板上的直线位置间隔一定距离从左到右进行点样，在展开剂为二氯甲烷-甲醇(体积比10：1)的层析缸中进行展开，待溶剂展开到适宜位置取出，将薄层板取出并吹干，然后放入碘缸内静置15-20min，显色完成后取出薄层板在ZF7紫外分析仪下进行观察，结果如图3所示。
①～⑤号样品溶液的浓度依次为10g/L、2g/L、1g/L、0.1g/L、0.01g/L。从图3可以看出，在紫外分析仪下，可检视的样品溶液所形成的5-甲氧基色胺浓度为2g/L，运用检测限公式计算可知，其在样品中的最低检出量为80μg。

Claims (7)

1.一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）利用待测的褪黑素原料药和有机溶剂分别配制浓度为X、0.01X、0.001X的标准溶液A、样品溶液B和样品溶液C；
（b）利用5-甲氧基色胺标准品和有机溶剂分别配制浓度为0.01X、0.001X的杂质对照溶液II和杂质对照溶液III；
（c）分别取等量的标准溶液A、样品溶液B、样品溶液C、杂质对照溶液II、杂质对照溶液III，在同一块硅胶薄层板上点样，接着展开、显色，得到薄层色谱图；
（d）结果判定：如果薄层色谱图中标准溶液A在杂质对照溶液Ⅱ和杂质对照溶液Ⅲ出现斑点的平行位置也出现了杂质斑点，同时在标准溶液A主斑点下方还出现了若干杂质斑点，并且这些杂质斑点颜色均浅于样品溶液C和杂质对照溶液III的主斑点颜色，则待测褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的含量低于千分之一；如果这些杂质斑点颜色比样品溶液C和杂质对照溶液III的主斑点颜色深，则待测褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的含量高于千分之一；
其中配制各样品所使用的有机溶剂为二氯甲烷或甲醇，展开剂选自体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液。
2.如权利要求1所述的一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于：X的取值范围为2-12g/L。
3.如权利要求2所述的一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于：X的取值具体为10g/L。
4.如权利要求1所述的一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于：步骤（c）中各个样品的取样量为(5-50)μL。
5.如权利要求4所述的一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于：步骤（c）中各个样品的取样量具体为20μL。
6.如权利要求1所述的一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于：配制各样品所使用的有机溶剂具体为二氯甲烷。
7.如权利要求1所述的一种褪黑素原料药中杂质5-甲氧基色胺的薄层色谱分析检测方法，其特征在于：展开时间为10-15min，显色剂为碘。
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