CN110178795A - 一种猕猴虚寒证候模型的造模方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猕猴虚寒证候模型的造模方法，本发明以猕猴为实验动物，通过肌注氢化可的松制造虚寒证候模型。本方法操作简单，造模成功率高，易于推广应用，可完善中医虚寒证候动物模型，为辨证论治和证候的量化辨识提供客观化的参考标准，促进中医证候动物模型的现代化发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物模型的造模方法，具体涉及一种猕猴虚寒证候模型的造模方法。
背景技术
寒为阴邪，易伤阳气，寒邪初感郁阳则恶寒，寒邪久客伤阳则畏寒。寒主凝滞收引而不通，不通则痛，故寒邪伤人最易出现各类痛症。寒就其部位来说分为表寒和里寒，就虚实来说分为实寒和虚寒。表寒自外而来，里寒由内而生，也有表寒入里而成里寒者。由外而受是为实寒，机体阳气不足，温煦失司是为虚寒。总体来说，虚寒病证以全身畏寒、舌质淡、苔白，脉沉迟为主要表现。
动物模型是医学研究的重要工具。目前西医研究中有多种动物模型，比如炎症模型、肿瘤模型等等。但中医证候模型的建立研究尚在起步阶段，关于虚寒证的动物模型较少。进而有关虚寒证在眼科学、生理学、传染病学、疫苗试验、药理学、毒理学、器官移植和其他疾病的研究中受到一定的限制。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种虚寒证的动物模型。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种虚寒证动物模型的造模方法，它是对猕猴每天注射氢化可的松25～30mg/kg体重，连续注射20～30天，即造模完成。
如前述的造模方法，所述连续注射时间为21天。
如前述的造模方法，每天注射次数为1次。
如前述的造模方法，所述模型造模完成后的，其清醒时的静息状态下，心率为90±12次/分。
如前述的造模方法，所述模型造模完成后的，其视网膜动、静脉血氧饱和度显著高于造模前。
如前述的造模方法，所述模型造模完成后的，其视网膜动、脉管径大于造模前。
如前述的造模方法，所述猕猴年龄为6～12岁。
如前述的造模方法，所述猕猴体重7～12kg。
如前述的造模方法，所述注射为肌肉注射。
前述任一造模方法所得到的虚寒证动物模型。
所述虚寒证动物模型在筛选治疗虚寒证的药物中的用途。
本发明提供的猕猴虚寒证候动物模型的造模方法具有以下优点：
1)本发明的方法可以成功有效构建虚寒证模型，其体征符合虚寒证表现，心率、呼吸频率、肛温和体重比造模前显著降低；本发明的方法得到的模型还在免疫学和代谢组学上被验证为成功的虚寒证模型。
2)本发明的虚寒证模型，其视网膜动、静脉血管血氧饱和度，以及视网膜动脉血管的管径变大，可以很好地用于眼科学研究。
本发明模型可以很好的用于眼科学、生理学、传染病学、疫苗试验、药理学、毒理学、器官移植和其他疾病的研究，以及新药评价和筛选，具有重要的应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例一：猕猴虚寒证候动物模型的造模方法
选择12只6～12岁成年猕猴(体重7～12kg，雌雄各半)，分成对照组和模型组(虚寒组)，每组猕猴6只，正常喂养7日后，第8日开始，每日下午17:00予肌注氢化可的松25mg/(kg.d)，对照组给予注射相同体积的生理盐水，连续注射21天，以制得猕猴虚寒证候动物模型。
备注：氢化可的松的配制：将氢化可的松琥珀酸钠全部溶解于2ml生理盐水中，持续摇晃，待其全部溶解后使用。
肌肉注射：拉紧铁笼，将猕猴固定于两侧铁笼的夹缝中，寻找其臀部肌肉，将2ml氢化可的松琥珀酸钠溶液全部注射到臀部肌肉中。
实施例二：猕猴虚寒证候动物模型的造模方法
选择12只6～12岁成年猕猴(体重7～12kg，雌雄各半)，分成对照组和模型组(虚寒组)，每组猕猴6只，正常喂养7日后，第8日开始，每日下午18:00予肌注氢化可的松30mg/(kg.d)，对照组给予注射相同体积的生理盐水，连续注射21天，以制得猕猴虚寒证候动物模型。
备注：氢化可的松的配制：将氢化可的松琥珀酸钠全部溶解于2ml生理盐水中，持续摇晃，待其全部溶解后使用。
肌肉注射：拉紧铁笼，将猕猴固定于两侧铁笼的夹缝中，寻找其臀部肌肉，将2m1氢化可的松琥珀酸钠溶液全部注射到臀部肌肉中。
实施例三：猕猴虚寒证候动物模型的造模方法
选择12只6～12岁成年猕猴(体重7～12kg，雌雄各半)，分成对照组和模型组(虚寒组)，每组猕猴6只，正常喂养7日后，第8日开始，每日下午18:00予肌注氢化可的松30mg/(kg.d)，对照组给予注射相同体积的生理盐水，连续注射19天，以制得猕猴虚寒证候动物模型。
备注：氢化可的松的配制：将氢化可的松琥珀酸钠全部溶解于2ml生理盐水中，持续摇晃，待其全部溶解后使用。
肌肉注射：拉紧铁笼，将猕猴固定于两侧铁笼的夹缝中，寻找其臀部肌肉，将2ml氢化可的松琥珀酸钠溶液全部注射到臀部肌肉中。
实施例四：猕猴虚寒证候动物模型的造模方法
选择12只6～12岁成年猕猴(体重7～12kg，雌雄各半)，分成对照组和模型组(虚寒组)，每组猕猴6只，正常喂养7日后，第8日开始，每日下午18:00予肌注氢化可的松30mg/(kg.d)，对照组给予注射相同体积的生理盐水，连续注射30天，以制得猕猴虚寒证候动物模型。
备注：氢化可的松的配制：将氢化可的松琥珀酸钠全部溶解于2ml生理盐水中，持续摇晃，待其全部溶解后使用。
肌肉注射：拉紧铁笼，将猕猴固定于两侧铁笼的夹缝中，寻找其臀部肌肉，将2ml氢化可的松琥珀酸钠溶液全部注射到臀部肌肉中。
以下将以实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明；涉及的模型组的造模方法同实施例一。
实验例一：模型建立成功的判定
1.中医诊断理论相关方法验证
“中医诊断学/邓铁涛主编.-3版.-上海：上海科学技术出版社，2013.8(2017.1重印)”记载虚寒证具有精神萎靡、纳呆、便溏、小便清长、舌质淡白的表现。“黄帝内经素问[M].田代华整理.北京；人民卫生出版社，2005：15.”记载“阳气者，精则养神，柔则养筋”说明虚寒则会出现精神萎靡、活动度降低的表现。“伤寒论讲义/李赛美等主编.-2版.-北京：人民卫生出版社，2012.6”记载“少阴之为病，脉微细，但欲寐也”也说明虚寒证会出现精神萎靡、活动度降低的表现。
基于此，本实验例对模型组和对照组进行精神状态、进食反应、排便等体征观测，发现模型组具有典型的虚寒证表现(表1)。
表1对照组和模型组证候观测对照表
对模型组和对照组造模/实验前后进行肛温(清醒时，静息状态)、体重、心率(清醒时，静息状态)、呼吸频率(清醒时，静息状态)的检测，发现模型组的肛温、体重、心率、呼吸频率都显著降低(表2)，尤其是心率由142次/分降低至90次/份，降幅巨大。
从纯中医角度看，心为君主之官，统摄十二脏腑，各脏腑阳虚最终都会累及心阳，而心主血脉，心阳虚则对血脉的推动乏力，最直观的表现就是心率的下降。从中西医结合的角度分析，虚寒证必然要具备寒的特性，寒最主要的特性就是主凝滞收引，猕猴在虚寒状态下血管收缩，脉压增大，进而导致心脏在收缩射血的过程中后负荷明显增加，最直观的表现就是猕猴心率的明显降低。模型组心率大幅降低，是十分典型的虚寒证表现。
表2肛温、体重、心率、呼吸的比较(N＝12)
注：&：与对照组实验后比较，P＞0.05；#：与虚寒组造模后比较，P＞0.05
以上实验结果表明造模成功。
实验例二：生化指标的测定
下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)相关激素水平与机体代谢密切相关。有研究[杨万斌，文彬，张凌杭，刘红.大鼠胃寒证阳虚造模方法探索[J].中国中药杂志，2015，40(20)：4031-4036.]认为这类激素在虚寒证的检测结果较一致均表现为：三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲腺原氨酸(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、反-三碘甲腺原氨酸(rT3)水平升高。
(1)方法
在使用实施例一的方法(模型组注射氢化可的松，对照组是注射生理盐水)前后，检测血液中的代谢组学指标——FT3和FT4，以及免疫学指标——IgG、IgM、C3和C4的水平。
(2)结果
由表3可知，虚寒组造模后相比造模前，其FT3和FT4(尤其是FT4)的含量显著升高。
表3猕猴虚寒证候动物模型造模前后FT3、FT4(代谢组学)的比较
注：▲表示差异有统计学意义(P＜0.05)
由表4可知，虚寒组造模后，其各项免疫学指标如IgG、IgM、C3、C4，显著下降。
表4猕猴虚寒证候动物模型造模前后IgG、IgM、C3及C4(免疫学)的比较
注：▲表示差异有统计学意义(P＜0.05)
以上结果进一步验证了造模成功。
实施例三：造模后视网膜信息及生化指标检测
1.实验分组：
以实施例一的方法造模得到的猕猴虚寒证候动物模型和对照组。
2.视网膜信息采集
随着越来越多中医学者对中医理论尤其是对中医证候的研究层次的加深，视网膜动静脉血氧饱和度和动静脉管径作为人体生命体征的重要指标被多次引用到中医药的理论研究当中。如“任可；马玲玲；刘美奇等.血液透析后脾肾阳虚型患者血氧饱和度变化的临床观察[J].北京中医药大学学报(中医临床版)，2012，19(01)：31-32.”显示脾肾阳虚证候血氧饱和度较正常人明显升高，而脾肾阳虚证候属于虚寒证候。也有学者将血氧饱和度作为比较中西医结合治疗SARS和单纯用现代医学治疗SARS的疗效对比评估指标。
视网膜作为“机体之窗”，是观测生物体生命状态的活的窗口，通过视网膜动静脉血氧饱和度以及管径的变化为探索虚寒证候动物模型提供了新的思路和方法，同时也丰富了该模型的评价指标。
正是鉴于此，本发明将视网膜动静脉血氧饱和度以及管径引作为中医证候探索的重要指标。
(1)方法
①麻醉：给予盐酸氯氨酮注射液按0.2ml/kg肌肉注射麻醉；
②散瞳、局部麻醉：待猕猴因麻醉而行动减慢时固定猕猴，用复方托吡卡胺散瞳，待瞳孔散大后，给予盐酸丙美卡因滴眼液做局部麻醉；
③开睑：用小型开睑器撑开猕猴上下眼睑，使其眼睑不能闭合并充分暴露角膜；
④眼底视网膜信息采集：利用多波长结构功能偶联视网膜图像仪(MSFRI)分别进行猕猴视网膜信息采集，信息包括动静脉血氧饱和度以及管径变化；
(2)结果
如表5所示虚寒组造模后，视网膜动静脉血氧饱和度均增加。
表5虚寒组造模前后视网膜动、静脉血氧饱和度比较
注：▲：与虚寒组造模后比较，P＜0.05
如表6所示，虚寒组造模后，视网膜动静脉的管径均有增加，其中动脉管径增加明显。
表6虚寒组造模前后视网膜动、静脉管径比较(N＝12)
注：▲：与虚寒组造模后比较，P＜0.05
本实验例表明，本发明造模得到的猕猴虚寒证动物模型相比造模前，视网膜血氧饱和度与动静脉管径增加，说明与“相波.巴马小型猪虚寒模型的建立、评价及视网膜血氧饱和度的特征研究.成都中医药大学2018(02)”报道的虚寒证动物的血氧饱和度、动静脉管径变化相一致；另外，其血氧饱和度变化趋势还与“任可；马玲玲；刘美奇等.血液透析后脾肾阳虚型患者血氧饱和度变化的临床观察[J].北京中医药大学学报(中医临床版)，2012，19(01)：31-32.”报道的一致。
综上，本发明的造模方法可以简单且有效地得到猕猴的虚寒证模型，模型符合中医理论中虚寒证的指标。
Claims (10)
1.一种虚寒证动物模型的造模方法，其特征在于，它是对猕猴每天注射氢化可的松25～30mg/kg体重，连续注射20～30天，即造模完成。
2.如权利要求1所述的造模方法，其特征在于，连续注射时间为21天。
3.如权利要求1所述的造模方法，其特征在于，每天注射次数为1次。
4.如权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述模型造模完成后的，其清醒时的静息状态下，心率为90±12次/分。
5.如权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述模型造模完成后的，其视网膜动、静脉血氧饱和度显著高于造模前；和/或，其视网膜动、脉管径大于造模前。
6.如权利要求1～5任一所述的造模方法，其特征在于，所述猕猴年龄为6～12岁。
7.如权利要求1～5任一所述的造模方法，其特征在于，猕猴体重为7～12kg。
8.如权利要求1～5任一所述的造模方法，其特征在于，所述注射为肌肉注射。
9.由权利要求1～8任一所述造模方法所得到的虚寒证动物模型。
10.权利要求9所述虚寒证动物模型在筛选治疗虚寒证的药物中的用途。
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