CN107656006A - 用于检测血清或者血浆中α‑羟基丁酸浓度的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测血清或者血浆中α‑羟基丁酸浓度的试剂盒，包括流动相A、流动相B，标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液，流动相A为体积百分比浓度为0.01%的甲酸水溶液，流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1：1组成的溶液，标准物储备液为10mg/mL 的α‑羟基丁酸溶液，同位素标记物储备液为10mg/mL 的d3‑α‑羟基丁酸钠溶液，样本萃取液为甲醇、乙腈和甲酸按照50:50:0.01的体积比组成的溶液，稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效监测α‑羟基丁酸代谢异常相关性疾病的有效工具。

Description

用于检测血清或者血浆中α-羟基丁酸浓度的试剂盒和方法

技术领域：

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测试剂盒，具体来是一种用于检测血清或者血浆中α-羟基丁酸(a-hydroxybutyrate，α-HB)浓度的试剂盒和方法。

背景技术：

1999年WHO制定的代谢综合征(Metabolic Syndrome,Mets)工作定义为2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2D)或糖调节异常(impaired glucose tolerance,IGT)及/或胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)，并伴有血脂异常、高血压、中心性肥胖的任两项。Mets现已成为继心血管病和肿瘤之后，第3位威胁人们健康和生命的非传染性疾病。IR是指脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞对正常浓度的胰岛素(Insulin,In)产生反应不足的现象。在脂肪细胞内，IR导致储存的甘油三酸酯水解，进而提高血浆内游离脂肪酸水平、促进肝内脂肪沉积；在肌肉细胞内，IR降低肌细胞对葡萄糖的吸收；而在肝细胞内，降低葡萄糖的储备、促进糖异生。三者共同促进高In血症并导致糖和脂肪代谢紊乱，是导致高脂血症、高血压、IGT、T2D和非酒精性脂肪肝(NAFLD)的共同病理生理基础，贯穿整个疾病的全过程，并在上述疾病临床症状出现前很长一段时间，IR就已经存在。在我国及欧美非酒精性NAFLD诊疗指南中均明确指出，NAFLD是一种与IR和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，NAFLD是2l世纪全球重要的公共健康问题之一，亦是我国愈来愈重视的慢性肝病问题。但遗憾的是NAFLD至今没有有效的实验室诊断指标。另外IR可能不仅仅是代谢综合征发生、发展的核心病理机制，还可能是阿尔茨海默氏病的危险因素。对已出现IR人群，在早期通过改善生活方式或采用抑制胰岛素分泌、胰岛素增敏剂等综合疗法及时改善机体IR状况，将有效预防糖耐量异常、高脂血症、NAFLD的发生、发展。

现有的IR的评价方法均为非直接测定IR的评估方法，包括动态评估法和静态评估法。动态评估法主要有高胰岛素正常血糖钳夹试验(hyperinsulinemic euglycemicclamp，HI-clamp)、72小时动态血糖检测和口服糖耐量试验(OGTT)。HI-clamp被认为是测定IR的金标准，但是需要昂贵的特殊设备和患者抽血次数过多而无法临床开展。72小时动态血糖检测同样存在检测时间过长、患者抽血次数过多的问题。OGTT实验虽然目前临床开展，但耗时3小时、抽血5次，患者不易接受。静态评估法，通常只需测量单次空腹血糖(Fastingglycemia，FSG)、空腹胰岛素(Fasting insulin,FSI)水平计算出IR，例如目前临床上最常用的稳态模式评估法(Homeostatic model Assessment，HOMA)评价HOMA-IR及胰岛β细胞基础功能(HOMA-βcel1)，该指数同时反映肝脏胰岛素抵抗及外周胰岛素抵抗。尽管HOMA-IR指数应用广泛且实施方便，但临床研究证实其可靠性欠佳，测量变异可大于30％，受体重指数及种族影响较大，且缺乏统一分界标准。因此，目前尚无准确、可靠，同时操作简单、患者易接受的IR评价方法。

α-羟基丁酸(a-hydroxybutyrate，α-HB)是体内氨基酸代谢中间产物。有研究证实外周血α-HB含量与IR呈正相关。在IGT、空腹血糖异常((impaired fasting glycemia,IFG)，甚至糖耐量正常(normal glucose tolerance，NGT)但已出现胰岛素抵抗患者(NGT-IR)血浆中α-HB含量显著高于NGT、胰岛素敏感者(NGT-IS)。血浆α-HB含量还不受性别、年龄、体重指数的影响，表明血浆α-HB可能是一个极早期可以直接判断IR的血浆标志物。目前在国内外基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)定量检测α-HB的方法和试剂盒尚未见报道。

发明内容：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术用于检测血清或者血浆中α-HB浓度的试剂盒和方法，所述的这种用于检测血清或者血浆中α-HB浓度的试剂盒和方法要解决现有技术中检测血清或者血浆中α-HB浓度的方法复杂，准确性不高的技术问题。

本发明提供了一种用于检测血清或者血浆中α-HB浓度的试剂盒，包括流动相A、流动相B，标准物储备液、同位素标内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相A为体积百分比浓度为0.01％的甲酸水溶液，所述的流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1：1组成的溶液，所述的标准物储备液为10mg/mL的α-HB溶液，所述的同位素内标物储备液为10mg/mL的d3-α-羟基丁酸钠(d3-α-HB)溶液，所述的样本萃取液为甲醇、乙腈和甲酸按照50:50:0.01的体积比组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。

本发明还提供了上述的一种用于检测血清或者血浆中α-羟基丁酸浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)一个制备流动相A的步骤，将甲酸加入超纯水中，加入后甲酸的体积百分比浓度为0.01％，混合均匀并超声脱气备用；

2)一个制备流动相B的步骤，将甲醇加入到乙腈中，甲醇和乙腈的体积比为1：1，混合均匀并超声脱气备用；

3)一个制备标准物储备液的步骤，称取α-HB，加入到质量百分比浓度为0.1％的叠氮钠水溶液中，加入后，α-HB的浓度为10mg/mL，完全溶解后保存备用；

4)一个制备同位素内标物储备液的步骤，称取d3-α-HB加入到质量百分比浓度为0.1％的叠氮钠水溶液中，加入后，d3-α-HB的浓度为10mg/mL，完全溶解后保存备用；

5)一个制备样本萃取液的步骤，量取甲醇、乙腈和甲酸，所述的甲醇、乙腈和甲酸的体积比为50：50：0.01，混合均匀后备用；

6)一个制备稀释液的步骤，称取牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白不含游离脂肪酸，将牛血清白蛋白加入到磷酸缓冲盐溶液中，使得牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。

本发明还提供了采用上述的试剂盒检测血清或者血浆中α-HB浓度的方法，包括如下步骤：

1)一个制备标准工作液和质控品的步骤；取标准品储备液，用稀释液稀释成0.5μg/mL，1μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，36μg/mL，40μg/mL的标准工作液，另外配制成2μg/mL，15μg/mL，30μg/mL的溶液作为质控品；

2)一个制备同位素内标物工作液的步骤，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液将所述的同位素内标物储备液稀释成10μg/mL的工作液；

3)一个超高效液相色谱分析的步骤，色谱参数为：体积百分比浓度为0.01％的甲酸水溶液组成的流动相A；甲醇和乙腈按照体积比1：1组成的流动相B溶液；梯度洗脱，B相起始为5％，在1.5min内增加到40％，保持0.5min，再在0.1min内增加到100％，保持1min，再降至起始比例5％，维持0.8min，总时间为4min,流速为300μl/min，进样体积为1μl；

4)一个质谱分析步骤，质谱参数：自动进样器温度为4℃，柱温为50℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，α-羟基丁酸和同位素内标d3-α-羟基丁酸钠检测的离子质荷比为103.1/57.1、106.1/59.1，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为550℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-40V、-10V、-13V和-4500V；α-羟基丁酸碰撞能量为-18V，d3-α-羟基丁酸钠的碰撞能量为-17V；

5)一个制备样品的步骤，将40uL待测血清或血浆样本、不同浓度的标准工作液、质控品，分别加20uL同位素内标工作液，室温平衡1h后，加入300uL样本萃取液，涡旋振荡2min，以10000g的转速离心10分钟，转移上层清液至液相色谱专用瓶，等待上样；

6)将步骤5)制备的标准品溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个混合标准品溶液连续进样3次，采用步骤3)和步骤4)的液相色谱串联质谱的方法分析，以α-羟基丁酸与同位素内标物浓度比为X轴，α-羟基丁酸与同位素内标的峰面积比为Y轴，进行线性回归，得到α-羟基丁酸的标准曲线；

7)采用步骤3)和步骤4)的液相色谱串联质谱的方法分析步骤5)的待测样品和质控品，根据标准曲线计算样本浓度。

本发明提供的试剂盒和色谱、质谱分析参数，测定血清或血浆中α-HB线性范围为0.5～40μg/mL，批间精密度≤3.5％、批内CV≤1.1％，同一品牌、型号仪器间CV≤0.6％。试剂盒4℃放置24h、五天和十天后，同一组样本α-HB的浓度与初始值比较，误差为0～5％，表明试剂盒和样品稳定性良好。经过初步临床检测分析，50例健康成人空腹血清α-HB参考范围为4.45±1.95μg/mL，72例T2DM、100例NAFLD患者分别为6.96±2.77μg/mL和5.40±1.96μg/mL，均显著高于健康对照组。在50例健康体检者中，血清α-HB水平与体重、体重指数、空腹血糖(FPG)、空腹血清胰岛素(INS)、HOMA-IR呈显著正相关(P<0.01)。按病例组分开分析，血清α-HB水平仅与T2DM患者FPG呈显著正相关(r＝0.418)，与NAFLD患者年龄、INS、HOMA-IR呈正相关。血清α-HB水平与HOMA-IR辅助诊断胰岛素抵抗的一致率达68.4％，说明血清(血浆)α-HB水平可能是一个早期可以直接判断IR的血浆标志物。此外，初步临床分析证实血清α-HB水平动态监测在辅助诊断NAFLD以及其病情判断中具有重要的临床应用价值。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效监测α-羟基丁酸(α-HB)代谢异常相关性疾病的有效工具，适用于临床常规和大样本流行病学调查的定量检测方法。

附图说明：

图1显示了以流动相A、B进行梯度洗脱，α-HB色谱峰的保留时间为1.62min，分析时间为4min。

图2显示了以流动相A、B进行梯度洗脱，同位素内标物d3-α-HB色谱峰的保留时间为1.62min，分析时间为4min。

图3为空白样本检测图，可见在α-HB及内标通道均无干扰峰存在。

图4显示了α-羟基丁酸(α-HB)的检测线性范围。

具体实施方式：

实施例1血清或者血浆α-羟基丁酸(α-HB)含量的超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测方法的建立

一、仪器：高效液相色谱仪Agilent 1290UPLC(Agilent，USA)、串联三重四极杆质谱仪AB API 5000(AB sciex,USA)，METTLER TOLEDO天平(Max＝220g，d＝0.1mg)(METTLER，Germany)、SB-C18快速分离高通量窄径柱(2.1mm*100mm*1.8μm)(Agilent，USA)，Eppendorf5424R低温高速离心机(Eppendorf,Germany)。

二、商购试剂：α-HB纯物质购自加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)公司，纯度为98.0％；d3-α-羟基丁酸钠(Sodium(±)-2-Hydroxybutyrate-2,3,3-d3，d3-α-HB)同位素标记物购自加拿大C/D/N ISOTopes INC，同位素丰度为98.8％；甲醇(LC//MS/MS级)、乙腈(LC//MS/MS级)、甲酸(LC//MS/MS级)均购自美国Fisher公司。试验用水由Milli-Qintegral超纯水机(德国，默克密理博，MERCK MILLIPORE)制备。

三、流动相配制：

1.流动相A：0.01％甲酸水溶液

2.流动相B：50％甲醇：50％乙腈溶液

四、储备液和工作标准液的配制

1. 10mg/mLα-HB纯物质储备液的配制：称取α-HB 100mg，准确称量至0.1mg。将其转移至10mL容量瓶中，用自动取样器加入10mL，0.1％叠氮钠水溶液。轻轻摇动锥形瓶，使其完全溶解。用封口膜密封瓶口，置于冰箱4小时，取出后将储备液分别装入1.5mLEp管中，密封并保存于-20℃冰箱中。

2. 10mg/mL d3-α-HB同位素内标物储备液的配制：方法同α-HB纯物质储备液的配制。

五、标准工作液和质控品的制备：

在不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白(50mg/mL in PBS)中加入标准品储备液，稀释成0.5，1，2.5，5，10，20，36，40μg/mL的标准工作液，另外配制成2，15，30μg/mL的溶液作为质控品；用50％甲醇水溶液将同位素内标物储备液稀释成10μg/mL的工作液，存放于4℃冰箱中备用。所有的标准工作液及质控品均按照样本处理。

六、实验步骤：

1.血清样品的制备

40uL待测血清或血浆样本、标准工作液、质控品，分别加20uL同位素内标工作液(10μg/mL)，室温平衡1h后，加入300uL样本萃取液，涡旋振荡2min，以10000g的转速离心10分钟，转移上层清液至液相色谱专用瓶。

2.色谱条件

流动相A组成为0.01％甲酸水溶液，B为甲醇乙腈溶液(1：1)，梯度洗脱，B相起始为5％，在1.5min内增加到40％，保持0.5min，再在0.1min内增加到100％，保持1min，再降至起始比例5％，维持0.8min，总时间为4min,流速为300μl/min，进样体积为1μl。

3.质谱条件

自动进样器温度为4℃，柱温为50℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，α-羟基丁酸和同位素内标d3-α-羟基丁酸钠检测的离子质荷比为103.1/57.1、106.1/59.1，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为550℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-40V、-10V、-13V和-4500V；α-羟基丁酸碰撞能量为-18V，d3-α-羟基丁酸钠的碰撞能量为-17V。

4.方法学验证

1)标准曲线和定量限

对于定量限(lower limit of quantification,LLOQ)的要求是准确度在80～120％之间，精密度(变异系数CV)≤20％。考察方法为将标准工作溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个标准品溶液连续进样3次，以α-羟基丁酸与同位素内标物浓度比为X轴，α-羟基丁酸与同位素内标的峰面积比为Y轴，进行线性回归，得到α-羟基丁酸的标准曲线、相关系数(r)和线性范围。(如图4所示)

Y＝0.133x+0.0193(r＝0.9994)

以最低浓度标准工作溶液采用逐步稀释的方法来考察α-HB的LLOQ，将信噪比S/N(Signal/Noise)为10时的标准品浓度作为待测化合物的LLOQ。

2)精密度(批内、批间)和准确度

一般情况下，不精密度的可接受标准为3倍LLOQ浓度以内，CV<20％；其余浓度点CV<15％。考察方法为在空白血清中分别配制浓度为2，15，30μg/mL的α-HB质控品，重复测定6批，每批每个样品重复测定3次，计算CV以评价批间精密度，计算相对误差以评价准确度。

同时对两个浓度的血清样本平行处理20管以评价批内精密度，另外对两份样本各重复进样15次以考察仪器精密度。

3)稳定性

样品的稳定性可能影响检测结果，由于实验样本一般保存于4℃冰箱或置于液相进样系统(4℃)中，因此本实验通过检测于4℃保存的样品在保存一天、五天及十天后的浓度，并与初始值比较以观察其稳定性。

4)携带污染

先测定低浓度样本0.5μg/mL 10次，再测定高浓度样本40μg/mL 10次，再测定低浓度样本0.5μg/mL 10次，观察两批次低浓度样本均值间是否存在统计学差异。

七、实验结果：

1.UPLC-MS/MS技术测定α-HB方法的建立

检测α-HB时，选择母离子的质荷比为103.1、子离子的质荷比为57.1，测定同位素内标d3-α-HB时，母离子质荷比选定为106.1、子离子质荷比选定为59.1。

利用0.01％甲酸水溶液和50％甲醇:50％乙腈溶液为流动相，α-HB的保留时间为1.62min，分析时间为4min(见图1、图2)。图2为内标峰，可见内标峰也在1.62min左右出现。图3为空白样本检测图，可见在α-HB及内标通道均无干扰峰存在。

2.方法学评价

1)标准曲线和定量限

以α-HB与内标的浓度比为X轴，α-HB与内标的峰面积比为Y轴，进行线性回归，得回归方程为y＝0.133x+0.0193，r＝0.9994，表明α-HB在0.5～40μg/mL血清浓度范围内线性关系良好，方法的LLOQ为0.5μg/mL，线性范围和定量限均满足对人体血清样本的检测。见表1。

表1 α-HB的标准曲线和相关系数

2)精密度(批内、批间)和准确度

本方法的批间精密度≤3.5％，方法精密度好；相对误差≤2.3％，说明准确度好，适合血清样本的测定。结果见表2。

表2批间准确度、精密度

由表3数据可知，批内CV≤1.1％，仪器CV≤0.6％，结果表明本方法批内精密度、仪器精密度良好。

表3批内精密度、仪器精密度

3)稳定性

观察3个浓度血清样本在4℃放置24h、五天和十天后α-HB的浓度与初始值比较，误差为0～5％，表明样品稳定性良好。结果见表4

表4稳定性结果

4)携带污染

先测定低浓度样本0.5μg/mL 10次，再测定高浓度样本40μg/mL 10次，再测定低浓度样本0.5μg/mL 10次，两批次低浓度样本均值间无统计学差异。见表5.

表5携带污染结果

实施例2 α-HB检测临床初步应用

一、研究对象

血清样本采集于上海市东方医院完成。

T2DM组：受试者为2016年12月至2017年2月间在该院内分泌科门诊确诊为T2DM的患者72例，其中男40例，女32例，平均年龄57.8岁。

诊断标准：

(1)糖尿病症状(多饮、多食、多尿、体重减轻)+随机血糖≥11.1mmol/L；

(2)FPG≥7.0mmol/L；

(3)OGTT实验中，2hPG≥11.1mmol/L。

满足以上任意一项，使用任一方法复查确认后，诊断成立。

NAFLD组：受试者为2016年12月至2017年2月间在该院中医科脂肪肝专病门诊确诊为NAFLD的患者100例，其中男43例，女56例，平均年龄55.5岁。

诊断标准：

(1)无饮酒史或饮酒折合乙醇量小于140g/周(女性＜70g/周)；

(2)除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病；

(3)肝脏超声检查符合弥漫性脂肪肝的诊断标准；

(4)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)持续增高半年以上。

NAFLD分级标准：以B超检查为主，结合临床症状，作为分级依据。

(1)轻度脂肪肝：B超表现为近场回声增强，远场声衰减不明显，肝内管状结构仍可见。自觉症状不明显，肝功能基本正常。

(2)中度脂肪肝：B超表现为前场回声增强，后场回声衰减，肝内管状结构模糊。自觉肝区不适，食欲不振，肝功能轻度异常。

(3)重度脂肪肝；B超表现为近场回声显著增强，远场回声明显衰减，肝内管状结构无法辨认。自觉肝区疼痛，腹胀闷满，或见黄疸，蜘蛛痣。肝功能检查中或重度异常

正常对照组：同期于上海市东方医院体检中心的健康体检者50例，其中男22例，女28例，平均年龄53.8岁。明确FPG、肝、肾功能正常，无糖尿病史，无感染性疾病，无恶性肿瘤，无手术外伤史。

血清样本采集后保存于-20℃冰箱中备用。

二、研究方法

1、稳态法评估胰岛素抵抗

根据基础状态下的血糖水平和胰岛素水平，利用稳态模型法(HOMA insulinresistance,HOMA-IR)评价胰岛素抵抗。

HOMA-IR＝空腹胰岛素(1U/mL)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

2、仪器与材料

同实施例1

3、样本α-HB的检测

上述所有血清样本按照实施例1所示操作步骤集中进行检验，每批次检测均设0.5～40μg/mL标准曲线及空白样本、质控样本。

4、常规生化指标检测：采用德国罗氏诊断产品公司全自动生化分析仪及其配套试剂，按照临床检验常规检测上述样本血糖、胰岛素(In)、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、C-反应蛋白(CRP)，应用日本TOSOH G8型糖化血红蛋白分析仪及配套试剂检测糖化血红蛋白(HbA1c)。

三、统计分析

采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差的形式呈现。组间比较使用独立样本t检验，相关分析采用pearson法，曲线下面积的比较使用Z检验，显著性水平为P小于0.05。

四、结果分析

4.1受试者相关参数

4.1.1临床特征

受试者临床特征见表7，除病例组平均年龄较正常对照组稍大，差异有统计学意义(P<0.05)外，两组在身高、体重及BMI上均无明显差异。

表7受试者临床特征

4.1.2生化指标测得值

采用常规方法对受试者生化指标进行检测，测定值见表8，T2DM组FPG及INS均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。α-HB在T2DM组中的测得值显著高于对照组测得值(P<0.001)。NAFLD组AST、ALT均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。FPG、INS、α-HB均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表8受试者生化指标

4.1.3胰岛素抵抗

采用稳态法检测胰岛素抵抗，由表9可见，T2DM组HOMA-IR显著高于对照组(P<0.001)，提示T2DM组存在胰岛素抵抗。NAFLD组HOMA-IR与对照组无显著性差异。

表9稳态法检测胰岛素抵抗结果

4.1.4血清α-HB水平用于评价胰岛素抵抗的价值分析

以α-HB为因变量，以年龄、BMI、体重、FPG、INS、HOMA-IR为自变量进行pearson相关分析，结果见表10-13。结果显示血清α-HB水平与健康对照组BMI、体重、FPG、INS、HOMA-IR均呈显著相关性，与T2DM的FPG、NAFLD组的HOMA-IR、INS呈正相关。血清α-HB和HOMA-IR评价胰岛素抵抗的一致性达68.4％。

表10血清α-HB水平与IR相关指标的相关性(三组合并一起222例)

表11血清α-HB水平与IR相关指标的相关性(健康对照组)

表12血清α-HB水平与IR相关指标的相关性(T2DM组)

表13血清α-HB水平与IR相关指标的相关性(NAFLD组)

表14 222例研究对象以HOMA-IR分组各指标分析

表15. 222例研究对象以血清α-HB水平分组各指标分析

表16.分别以HOMA-IR、α-HB判断IR的一致性分析

诊断一致性：68.4％

4.1.5血清α-HB水平用于辅助诊断NAFLD价值分析

初步临床样本分析虽然没有发现血清α-HB指标辅助诊断NAFLD具有很高的敏感度和特异性，但从表19可看出动态监测血清α-HB水平等胰岛素抵抗指标变化，有助于判断NAFLD的发生、发展。

表17. α-HB用于诊断NAFLD的AUC

表18. HOMA-IR、α-HB辅助诊断NAFLD一致性

诊断一致性：64％

表19. IR相关指标在不同病情NAFLD中水平变化

结论：采用本发明建立的血清(血浆)α-HB检测试剂盒和检测方法，确定了其检测的灵敏度、准确度、重复性和线性范围。在临床初步应用中分析了222例(72例T2DM患者、100例NAFLD和50例正常对照)空腹血液中α-HB含量，发现血清α-HB水平与FPG、INS和HOMA-IR均呈正相关，特别是在健康对照组显示出非常好的正相关性，血清α-HB水平与HOMA-IR辅助诊断胰岛素抵抗的一致率达68.4％，说明血清(血浆)α-HB水平可能是一个早期可以直接判断IR的血浆标志物。此外，初步临床分析证实血清α-HB与HOMA-IR辅助诊断NAFLD的诊断一致率达64％，动态监测血清α-HB、HOMA-IR水平变化在辅助NAFLD的病情进展判断中具有重要的临床应用价值。

本发明的重要意义在于所公开的血清(血浆)α-HB超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测方法，能动态定量监测血液中α-HB含量变化，对于胰岛素抵抗、NAFLD的早期预防研究奠定了实验基础。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效检测α-羟基丁酸(α-HB)相关性疾病的有效工具，适用于临床常规和大样本流行病学调查的定量检测IR的方法。

Claims (3)

1.一种用于检测血清或者血浆中α-羟基丁酸浓度的试剂盒，其特征在于：包括流动相A、流动相B、标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相A为体积百分比浓度为0.01％的甲酸水溶液，所述的流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的标准物储备液为10mg/mL的α-羟基丁酸溶液，所述的同位素内标物储备液为10mg/mL的d3-α-羟基丁酸钠溶液，所述的样本萃取液为甲醇、乙腈和甲酸按照50：50：0.01的体积比组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。

2.权利要求1所述的一种检测血清或者血浆中α-羟基丁酸浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个制备流动相A的步骤，将甲酸加入超纯水中，加入后甲酸的体积百分比浓度为0.01％，混合均匀并超声脱气备用；

2)一个制备流动相B的步骤，将甲醇加入到乙腈中，甲醇和乙腈的体积比为1：1，混合均匀并超声脱气备用；

3)一个制备标准物储备液的步骤，称取α-羟基丁酸，加入到质量百分比浓度为0.1％的叠氮钠水溶液中，加入后，α-羟基丁酸的浓度为10mg/mL，完全溶解后保存备用；

4)一个制备同位素内标物储备液的步骤，称取d3-α-羟基丁酸钠加入到质量百分比浓度为0.1％的叠氮钠水溶液中，加入后，d3-α-羟基丁酸钠的浓度为10mg/mL，完全溶解后保存备用；

5)一个制备样本萃取液的步骤，量取甲醇、乙腈和甲酸，所述的甲醇、乙腈和甲酸的体积比为50：50：0.01，混合均匀后备用；

6)一个制备稀释液的步骤，称取牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白不含游离脂肪酸，将牛血清白蛋白加入到磷酸缓冲盐溶液中，使得牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。

3.采用权利要求1所述的试剂盒检测血清或者血浆中α-羟基丁酸浓度的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个制备标准工作液和质控品的步骤；取标准品储备液，用稀释液稀释成0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、36μg/mL，40μg/mL的标准工作液，另外配制成2μg/mL、15μg/mL、30μg/mL的溶液作为质控品；

2)一个制备同位素内标物工作液的步骤，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液将所述的同位素内标物储备液稀释成10μg/mL的工作液；

3)一个超高效液相色谱分析的步骤，色谱参数为：体积百分比浓度为0.01％的甲酸水溶液组成的流动相A；甲醇和乙腈按照体积比1：1组成的流动相B溶液；梯度洗脱，B相起始为5％，在1.5min内增加到40％，保持0.5min，再在0.1min内增加到100％，保持1min，再降至起始比例5％，维持0.8min，总时间为4min,流速为300μl/min，进样体积为1μl；

4)一个质谱分析步骤，质谱参数：自动进样器温度为4℃，柱温为50℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，α-羟基丁酸和同位素内标d3-α-羟基丁酸钠检测的离子质荷比为103.1/57.1、106.1/59.1，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为550℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-40V、-10V、-13V和-4500V；α-羟基丁酸碰撞能量为-18V，d3-α-羟基丁酸钠的碰撞能量为-17V；

5)一个制备样品的步骤，将40uL待测血清或血浆样本、不同浓度的标准工作液、质控品，分别加20uL同位素内标工作液，室温平衡1h后，加入300uL样本萃取液，涡旋振荡2min，以10000g的转速离心10分钟，转移上层清液至液相色谱专用瓶，等待上样；

6)将步骤5)制备的标准品溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个混合标准品溶液连续进样3次，采用步骤3)和步骤4)的液相色谱串联质谱的方法分析，以α-羟基丁酸与同位素内标物浓度比为X轴，α-羟基丁酸与同位素内标的峰面积比为Y轴，进行线性回归，得到α-羟基丁酸的标准曲线；

7)采用步骤3)和步骤4)的液相色谱串联质谱的方法分析步骤5)的待测样品和质控品，根据标准曲线计算样本浓度。