Λ 6 Π 6 2〇θ^5 五、發明説明（） 發明：> 铕城 (請先閲讀背而之注意事項洱碼寫本頁) 本發明供有關可用作抗凝血劑之多元龌化合物及其製 法。 先前抟斯 以酶催方式改質的多醣類傜由D-«萄糖醛酸與N-乙醛 基-D- «萄耱胺單位交替組成者，曾經就其舆肝素及乙醛 肝素硫酸酯之生物合成方面的關俱作徹底研究（例如，參 見“肝素-化學與生物學性質，臨床應用M , D. Lane及 U. Lindahl编輯，Edward Arnold出販，159-190頁，1989 年；及 U. Lindahl等人，TIBS, U, 1986年 5 月，221 頁 )。此種酶催改質包括《萄糖胺單位之N-去乙醛基化，随 後將所得游離胺基進行硫酸化，將D-«萄糖醛酸根殘基 進行C5-差向異構化，而得L-伊杜糖醛酸根殘基；及於各 個位置進行0-硫酸化反應（主要位在伊杜糖醛酸之C-2及 葡萄糖胺單位之C-6)。其他酶催0-硫酸化反應也可影響位 在葡萄糖胺殘基3-位之刖基。 經濟部中央標準局A工消许合作社印製 至今為止，僅能以衹適合供實驗目的使用之徹小規模 進行此一糸列_催步驟.模擬於肝素及乙挺肝素硫酸酯之 生物合成過程中.於哺乳動物肥大細胞内出現的情形。肝 素與乙醛肝素硫酸酯間之化學及生物學差異.示例説明於 B. Casu e_L a_L.,Arz. Forsch. . ϋ. 135, (1983) 〇 文猷中也說明：存在於多醣分子内之N-乙匿基己糖胺 殘基之N-脱乙醒基化方法（L . Thunberg ei a丄.，Carbohydrate Res . , 100 . 393 , [ 1982]及 Shak 1 ee et a_L.. 本紙張尺度边用中SB家標毕(CNS)TM規怙(210X2似公*) 81. 4. 10,000¾ (Η) 2〇92i Λ 6η 6 經濟部屮央榀準而员工消#合作社印製 五、發明説明（） Biochem. J·, m_, 1δ7 [1984]);以及說明 N-及 0-硫酸 化程序（Levy eJL a_L. . Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 109 ,901 [1962])。 EP-A-333243堪示將由大瞄捍豳豳株單離得之K5醏谁 行撤底硫酸化反應所得之各種化合物。 發明夕销铪 提供由K5製得之各種化合物， 血栓活性，且可比較業界現況以更大規棋生産者，乃本發 明之一目的。 描烘由大瞄捍鋪之【5_製備之抗凝血劑/抗血栓劑, 因而可大量生産具有特別良好活性之産物，乃本發明之又 一目的。 本發明提供去乙醯基化K5太.其中之去乙酷 基化反應達天然K5乙醛基之至少35%者。 匾忒：> 簡塱锐明 附圖（第1至32圖）為本發明之各種化合物之NMR光 譜。 發明：> 肆细锐明 本發明又提供如前所定義之經改質的K5醏，其中硫酸 基取代於K5上所有或大體所有己經去乙醛基化的各位置。 此等位置包含通常預期被乙醅基化者，特別葡萄糖胺，尤 其D-葡萄糖胺殘基之胺基。 本發明也提供一種如前所定義之經改質的K5.其中至 少若干葡萄糖醛酸殘基经差向異構化成L-伊杜糖醛酸殘基 用的抗凝血/抗 (請先閲讀背而之注意事項再项寫本頁) 本紙張尺度逍用中ΒΒ家«準（CNS)T4規格(210x297公货) -4- 扪.4.1〇,〇〇〇張（1|) 2〇9^5 Λ 6 η 6 經濟部屮央梂準νίύβ工消许合作社印5i 五、發明説明（） 者。 本發明也提供如前所定義之經改質的K5,其中至少若 干游離羥基，特別位在葡萄糖胺酸殘基之6-位及/或，若 屬適宜，位在伊杜應#酸殘基之2-位，之游離羥基偽經硫 酸化者，較好硫酸彳25%的程度。 本發明又提供一種醣或其衍生物，大體包括葡萄糖醛 酸及葡萄糖胺單位，特別此等單位交替，且如前對K5之定 義般經改質者。 本發明又提供任一種如前所定義之改質化合物，其中 至少若干殘基偽經3-0-硫酸化者。 本發明也提供本發明化合物用於療法之用法。 本發明又提供使用本發明化合物用於製造治療$預防 需要抗血栓或抗凝血活性之病情用之藥物。 本發明也提供一種製備前述任一種化合物之方法，所 述方法包括下列一或一以上之步驟： a) 將適酋起始物料進行N-去乙醛基化過程； b) 將游離NHa基硫酸化，特別為如上a)所産生的游離ΗΗ» 基； c) 將b)産物差向異構化，因而至少若干D-葡萄糖醛酸殘基 被轉成L-伊杜糖醛酸殘基者；及 d) 將所生成之任一化合物内之至少若干游離羥基硫酸化。 較好，所述方法包括將由某些太賭―挥菌齡株抽取得之 具有不等分子量之多醣類（後文稱為K5醏類）進行一連串 化學及酶學過程，此過程可示意舉例説明如下： (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝· 線< 本紙5良尺度边用中β B家楳準(CHS)T4規格(210x297公釐） ⑴.4. 10,000張（H) 經濟部中央榀準局员工消^-合作社印製 五、發明説明（） a) 主要由D-葡萄糖醛酸及N-乙醛基-D-葡萄糖胺之交替直 線序列所組成的K5醏類進行N-去乙酷基化之化學反應過 程； b) 將a)所得産物之游離NHa基利用適當硫酸化劑硫酸化； c) b)所得産物與由牛肝臓抽取得之D-葡萄糖醛醛基-L-伊 杜糖醛醛基-C5-差向異搆酶共同培育，而將某一定量之 D-葡萄糖醛酸殘基轉成L-伊杜糖醛酸殘基； d) c)所得産物舆適當的硫酸化劑反應，因而將某待定量之 多醣鐽中游離羥基之氳以硫酸基取代。 至於較佳具塍例，本發明提供由糖醛酸及《萄糖胺殘 基之交替序列所組成的新穎多醏類，其特擻在於此等多_ 類具有H-硫酸化基之百分含量由約35變化至約100 , N-乙 醯化基之百分含量由約0變化至約65, L-伊杜糖醛酸之百 分含量由約10變化至約25, 6-0-硫酸化基之最低百分含置 為約25,此等化合物又有特撤在於：其餘糖醛酸主要為D- 葡萄糖醛酸殘基。此等化合物可藉由下述方法製備： a) 主要由D-葡萄糖醛酸與N-乙醛基-D-葡萄糖胺殘基之交 替線性序列所組成的一種K5醏使用胼/胼硫酸酯混合物 ，於介於約80至約110亡之溫度，處理由約30分嫌至約 6小時時間； b) a)所得化合物使用，選自三氣化硫與含氮有機«類所組 成之錯合物中選出的硫酸化劑.於約45至約65Ό之溫度 處理至多長逹24小時之時間； c) b)所得化合物為主要由含有不等比例之乙匿胺基及硫酸 Λ 6 Η 6 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度遑用中8 B家糅準（CNS)T4規格(210x297公;it) —6 — 81. 4. 10,000張（H) Λ 6 Π 6 五、發明説明（） 胺基之D-«萄耱醛酸與D-«萄糖胺殘基交替所組成的多 醣類，於約室溫使用酶D-葡萄糖醛醯基-L-伊杜糖醛醯 基-C5-差向異構鼸作用，經歴至多長逹2日之時間； d)c)所得化合物轉成含有機m齡之對應鹽類，随後使用選 自三氧化硫與有嫌m齡所生成之錯合物之硫酸化劑，於 惰性有機溶劑内，於介於約-5至60υ之溫度處理一段至 多長逹24小時之時間； 所述方法又有特撤在於：d)所得化合物可任意進行步驟b) 之硫酸化程序。 前述方法較好進一步包括將原先所定義之産物進行3-0-硫酸基轉移酶作用。 本發明又提供主要由D-葡萄糖醛酸舆N-乙醛基-D-葡 萄耱胺殘基之交替線性序列所組成的K5醣類，可由如下式 代表之： (請先閲讀背而之注意事項再堝寫本頁)
經濟部屮央楛準^β工消"合作社印製 L _π 其平均分子量由約1,0.00變化至約100,000道爾頓或以上 .於13C-NMR光譜於104 , 98及55ΡΡΠ顯示特擻佶號；本 發明也提供主要由D-葡萄糖醛酸與D-葡萄糖胺單位之交替 序列所組成的多醣類，其待擻在於：其含有約35至約100 %卜硫酸化基，約0至約65%N-乙醛基化基，且於13C-NMR 光譜之104, 60及24ppm顯示特擻性倍號。 本紙张尺度遑用中《 Β家揉準(CNS) Τ4規格(210X29·/公釐) —7 — 81. 4. ](),〇〇〇張（Η) % 〇9找5 Λ 6 Β6 經濟部中央梂準而A工消費合作杜印3i 五、發明説明（） 本發明之其他多醏類包含主要由D-葡萄糖醛酸與D-葡 萄糖胺單位之交替序列所组成的多醏類，其特徽在於：其 中含有約35至約100% N-硫酸化基，約0至約65%H-乙醯 基化基，6-0-硫酸化基之最低百分含量約為25;所述化合 物又有特徴在於：硫酸基/羧酸基之比由約1.0變化至約 2.7，旋光度由約+55°變化至約+65β,及對抗凝血酶H[具 有親和力。此等化合物可以適當順序.例如a)與b), a), b)與d),等，藉由前述方法製備。 依此顒序所得之新穎多醏類，及各反應步驟之中間産 物可呈游雔酸或其鹽形式回收；鹽類例如無機齡鹽包含納 ，鉀，鈣或鎂鹽；由此鹽又可藉由使用無機酸或有機酸（ 舉例）處理而製得化合物本身。 本發明之化學及酶學步驟之组合傜屬新穎，且為先前 未曾由細菌來源之多醏類起始而進行者。 依前述步驟a), K5醏類（通常藉HPLC測得分子量傺於 約1,000至約100,000道爾頓或以上之範圍）可使用含胼 硫酸酯，較好約10%重量比胼硫酸酯之肼.較好於密封管 内，於介於約80至約1101：(舉例）之溫度處理一段時間， 適合由約30分鏡變化至約6小時。 藉此程序，可去除葡萄糖胺單位之某種百分比的N-乙 醯基；及依據步费(b),所得化合物使用適當硫酸化劑處理 ,俾將游離胺基轉成硫酸胺基。適宜的硫酸化劑可選自三 氣化硫與含St有機齡之錯合物，例如三-(Ci-4烷基）胺 •三氣化硫，吡啶•三氣化硫及其類似物。通常較好，但 (請先閲讀背而之注意亊項再填寫本頁) 裝- 訂 線· 本紙張尺度遑用中β國家糅準（CNS)T4規怙（2丨0x297公;it) 81. 4. 10,〇〇〇張（||) A 6 Π 6 2093^5 五、發明説明（） (請先閲讀背而之注意事項再塥¾本頁) 非必要，使用無水劑，嫌因於卽使小置水存在也可能影響 終産物之性質。其他可將s〇3-基引至期望位置的硫酸化劑 也落入本發明之範圍内。 N-硫酸化反應較好於介於約45至65¾之溫度進行，依 據反應進行時間而定，H-硫酸化反應可較為徹底或較不徹 底。槪略而言，由約6至約24小時足夠將大多數游雄胺基 硫酸化。 所得多醣類，通常主要偽由以不等比例含有乙匿胺基 及硫酸胺基之D-葡萄糖醛酸與D-葡萄糖胺單位交替所組成 ;随後，可進行酶催處理，例如，依據前述步驟c)處理， 侔將某種比例的多醣鏈中之D-«萄糖醛酸殘基差向異構成 D-伊杜糖醛酸殘基。差向異構化反應，最好利用得自牛肝 臟之酶，D-«萄耱醛醛基-L-伊杜耱醛醛基-C5-差向異搆 酶，遵照H. Prihar等人之程序（生物化學，L9_, 495 [1980])完成。 經濟部屮央梂準釣β工消份合作杜印製 於較佳實務中，b)所得之多醏類與酶於室溫.於業界 人士顯然易知之條件下培育一段時間.例如由數小時至2 曰。再度，侬據所用酶基類型與培育時間而定，可得其D-葡萄糖醛酸殘基以不等程度轉成L-伊杜糖醛酸殘基之多醏 類。步驟d)可大體如A. Ogano等人（硪水化合物研究.ISJ ,165 [1989])所述，或如下文舉例詋明而進行。 c)所得之多醏類有利地，首先轉成含有機氮鹼之對應 鹽類，例如三甲胺，三乙胺或三丁胺鹽類；随後，使用適 當硫酸化劑.例如.步驟b)之N-硫酸化反應所使用者，處 本紙尺度边用中Β «家楳準（CNS)甲4規格（210x25)7公釐） —9 — 81. 4. 10,〇〇〇張（H) 五、發明説明（） 理。反應轉好於無水惰性的有機溶劑，例如二甲基甲醛胺 .二甲基乙醯胺.二甲亞理或其混合液存在下進行。 0-硫酸化度依據所用酶基及反應條件而定。 供本發明目的之用，此過程偽於介於約-5至約601之 溫度進行長達24小時之時間。 槪略而言，基於N-去乙磨基化-N-硫酸化K5醏之數量 ，使用計算值由約5至約20當量重量比之預定硫酸化劑。 於此反醮過程中，可出現部分N-去硫酸化反應。若屬 合惠，步驟d)産物可進行如步鞣b)所述之相同H-硫酸化程 序。 如此所製備之多醣類可依據業界已知技術回收，例如 藉滲析反應混合物及水後，將滲析後之溶液凍晶乾燥，且 可藉13C-HMR及1H-NMR光譜術決定其特徽，提供耱胺聚糖 類之特定“指紋”特擻U.S. Perlin ,硪水化合物化學 方法 L [1976],94; L, Ayotte e_L a_L. . Carb.Res. [1980] ,267)。也可優異地採用其他特徵化技術，例如 HPLC〇 經濟部屮央標準而A工消#合作社印製 (請先閲讀背而之注意事項#項窍本頁) 更尤其.lH-NMR光譜可藉由第5, 7至11及16圖所報 告的，位在光譜之5.35ppm及4.55ΡΡΠ的倍號，鑑別與定蛋 非硫酸化L-伊杜糖醛酸及D-葡萄糖醛酸殘基（參見B. Casu 於“肝素.化學與生物學性質”，Edward Arnold出販， 编者 E d ’ s D . L a n e 及 U . L i n d a h 1 , 2 5 - 4 9 [ 19 8 6 ])。 其他次要倍號可於端末殘基相關的13C-NMR光譜中檢 得.換言之，位在90-95及95-98ppm之琛狀異構硪數減少 本紙张尺度逍用中明國家標準（CNS)T4規格（210x297公;¢) _1〇_ 81. 4. 10,000¾ (H) Λ 6 Η 6 經濟部屮央標準而A工消伢合作杜印製 五、發明説明（） 的倍號（/\.5.?6「14及8.[3311;多醏類，第1卷，學術 出販社，紐約[1982] , 133之表1 ),及位在ΠΟρρη之 不飽和端末糖醛酸殘基倍號（B. Casu aial, , Biochen. J. ΐ87. 599 [1981]» B. Casu, Houv. Rev. Fr. Haematol, 2^.. 211 [1984] » J. R. Linhardt, J. Biol. Cheei .2JELL. 14448 [1986]) 〇 D-«萄糖醛酸及L-伊杜糖醛酸之相對百分率，也可依 據 J. Jacobsson 等人，Biochen. J.. 179. 77 (1979)所述 程序，藉C5-差向異構化多醏類之去胺割裂反醮所得的雙 醏類，進行紙張層析術而測定。相關層析圈箝示於第13圔 ύ NMR光譜及紙張層析圖譜之分析.指示本發明之新穎 多醣類具有Ν-硫酸化基之百分含量由約35變化至約100% ,乙醛基化基之百分含置由約0變化至約65%. L-伊杜 糖醛酸之百分含量（以绾糖醛酸為基準計箄）佔約10至約 25%,及6-0-硫酸化基之最低含量約為25%。 業界人士顯然易知依雄前述方法也可製得具有較高百 分率之Ν-硫酸化基，較高百分率之Ν-乙醛基化基.伊杜糖 醛酸之百分含量高於25%.及6-0-硫酸化基之最低百分含 量低於25%之該等多醏類。該等化合物.及各反應步驟中 之對應中間物皆落入本發明之範圍内。 如前所述.此等新穎多醏類具有令人感興趣且有用的 生物性質.特別作為抗血栓劑及抗凝血劑.本發明之特定 化合物之活性見實施例14及15。 (請先閲讀背而之注意事項孙塥寫本頁) 本紙張尺度遑用中a國家榣準（CNS)T4規格（210x297公iit) -11- 81. 4. 10,000張（Η) Λ 6 Π 6 經濟部屮央標準A工消仰合作社印製 五、發明説明（） 本發明化合物可以由約30變化至約300ing (舉例）之單 位注射劑量.毎日投藥一次或一次以上。 本發明待別提供一種可以經濟可行之規棋製造的産物 。本發明僳關可應用於工業規模，與産物之用法相期.由 本發明所得産物供人龌治療應用，例如作抗血栓劑及抗凝 血劑之所有主題有鼷。供此目的之用，腸於本發明之目的 之化合物可藉習知技術，使用適酋賦形劑及其他適合供非 經腸道投蕖（舉例）之藥物組成物用之成分一起諝製。 非經賜道投藥用之調配劑之例，包含無菌溶掖容纳於 安瓿内，也可含有可使溶液與體液呈等張性之物質（舉例 )〇 於本發明方法之各步驟中呈中間物獲得之化合物.通 常係经單離與特擞化，但也可就此用於随後之轉化反應中 。若經特擻化，偽藉UMR及13C-NMR光譜術，或任何其 他適當手段，如上對終産物多醏類作舉例説明者進行。 如此.舉例言之，步驟b)製得之物質可為主要由D-葡 萄糖醛酸與D-葡萄糖胺之殘基交替組成的多醣類，含有約 35至約100%N-硫酸化基.及約0至約65%N-乙醛基化基 。其"C-HHR光譜於104ppm顯示特擻倍號，此乃D-葡萄糖 醛酸之典型倍號；及於60ppm及24ρριπ顯示待擻信號，此乃 N-硫酸化基及N-乙醛基化基之典型倍號（第4, 5及7至 11圖）〇 於前述光譜中可檢知之其他次要倍號出現於109及103 PPm .而與端末糖醛酸殘基有關（第4, 5及7圖）。 (請先聞讀背而之注意事項再填窩本頁) 本紙張尺度逍用中明國家標iMCNS)T4規格(210x297公址） -12- 81. 4. 10,〇〇〇張⑻ Λ 6 Π 6 2〇9 放 5 五、發明説明（） 各反應步驟之中間物具有抗血栓及抗凝血性霣，且落 入本發明之範圍内。 特別，步骤b)所得之多醣類又可進行0-硫酸化反窿. 大鱧如步»d)所述進行。 再度，偶爾於此反鼴過程中可能出現部分N-去硫酸化 反應。若靨合惠，0-硫酸化反應可趙以再度硫酸化反應 ，進行方式如前述。出人意外地，發現所得化合物對抗凝 血酶Μ具有親和力。此種結果乃出乎意外者，歸因於存在 有L-伊杜糖醛酸殘基過去視為其具有活性所必要者。如此 ，未經差向異構化，但對抗凝血酶ϋ具有親和力之此等化 合物構成本發明之一特佳特質。 此類多醏類之特歡在於具有交替的D-葡萄耱醛酸及D-葡萄糖胺殘基，Ν-硫酸化基之百分含量由約35變化至約 100 . Ν-乙醯基化基之百分含置由約0變化至約65,及6-0-硫酸化基之最低百分含量為25。 此再度可由"C-NMR光譜（參見第17至32圖）顯示. 光諶中於60至69ppiq具有特擞倍號，此乃D-Μ萄糖胺殘基 之及6-0-硫酸化基之典型倍號。 此等化合物又有特徼在於硫酸基/羧酸基之比由約 1.0變化至約2.7 ,及旋光度由約+55°變化至約+65°。再 度，業界人士顯然易知：也可製得具有D-Μ萄糖醛酸及D-葡萄糖胺交替殘基，又有較低Η-硫酸化基百分率，較高Ν-乙醯基化基百分率.6-0-硫酸化基之百分含量低於25,及 對抗凝血酶Μ具有親和力之該等多醣類.且落入本發明之 本紙Λ尺度遑用中Ββ家楳毕(CNS)T4規格(210父297公龙) 一 13_ 81. 4. 10,000¾ (H) (請先閲讀背而之注意事項再蜞寫本頁) 裝· 訂_ 經濟部屮央標準局β工消费合作社印製 A 6 Π 6 叻9你 五、發明説明（） 範圍内。 如此，須了解本發明提供廣泛有用的多醣類範圍，及 其便利製法。 «取天然多醣類之抽取程序經常繁瑣且昂貴，而獲得 絰純化的天然物質之各種分段與解聚合技術也经常無法提 供可再現性的産物。 此等缺點包含仰仗粗製動物抽取物（此等抽取物可能 有動物疾病，流行病等危險）可藉由本發明而克服，结因 於撤生物可提供實際上幾乎無限的原料來源，且可於經小 心控制的條件下仍舊可合成大量期望的産物。 本發明化合物，任意包含額外經Ν-硫酸化者，可作為 随後酶催反應之起始物料，由於在D-«萄糖胺殘基之3-位 的某些羥基被轉成對_的0-硫酸化基。此等化合物也如前 文定義。 此等反應較好於酶3-0-硫酸基轉移酶存在下進行，此 酶可如下文製備例1所述而製備。 然後.多_類可與酶於業界己知之條件下培育.俥進 行3-0-硫酸化反應。 本發明中用作起始物料之Κ5醏類，可藉由於適當發酵 培養基内，於有氣條件下，培育大賭捍齠窗株而製備。發 現雖然無法正確預測所得醏之性質，但較高濃度之碩源， 特別葡萄糖，可獲得較高分子量形式之Κ5多醣。 可供本發明之目的之用的大腸捍鍤睹株，為存在有Κ5 被囊體多醏抗原者，可由若干不同來源獲得，包含美國種 (請先閲ΐίί背而之注意事項4·项寫本頁) 裝- 線·
經濟部+央標準局貝工消費合作社印M 本紙尺度边用中a B家標準（CNS) T4規格（210><297公釐） -14- 81. 4. 10,〇〇〇張（H) Λ 6 Π 6 五、發明説明（） 型培餐收集會，及丹麥哥本哈根Statens血清研究所國際 埃希氏桿菌中心。 其他可供本發明目的使用之大腸桿M·.菌株，再度可由 數種不同種型收集會獲得，或颶臨床單離株，主要由醫盂 腎炎及尿路感染單離而得。此等菌株可藉API糸統20之待 徴化，且為依據 W. Niataich eiaJL. . Z. Gesamte Hyg.， 也（10), 583 (1989)或 D. S· Dupte aia_L., Sem. Microbiol. Utters, II, 75(1982) 顯示存在有 K5 被囊體多醏 抗原之菌株。若干臨床單離的大睹捍菌菌株遵照布達佩斯 條約之規定，於1991年2月27日託存於Deutsche Sammlung von M i kroorgan i smen und Zellkulturen GmbH, Masche-roder Weg lb, D-3300,徳國。此等菌株之新增缓號分別 為DSM 6371, DSM 6372及DSM 6373。供示例說明之用，將 其特撤報告如下： (請先閲讀背而之注意事項#项寫本頁) 裝· 訂_ 線- 經濟部屮央榀準局ΚΧ工消费合作社印奴 試驗 臨 某 fv m xm DSM DSM DSH 6372 6371 R373 0NPG 〇-硝苯基-召 /3 -半乳糖苷酶 + + + -半乳糖苷 ADH 精胺酸 精胺酸去羥酶 - - - LDC 離胺酸 離胺酸去羧酶 + + 0DC E胺酸 鳥胺酸去羧酶 - + + CIT 摔様酸鈉 榉様酸鹽利用性 - - - H*S 硫代硫酸鈉 産生H»S - - - URE 尿素 尿素酶 一 — 本紙尺度遑用中《«家橒毕（CNS)T4規格（210X297公；«：) -15- 81. 4. 10,〇〇〇張（η) 辦:纳 Λ6 Β 6 五、發明説明（） 經濟部+央榀準杓只工消"合作社印製 TDA 色胺酸 色胺酸去胺酶 - - — IHD 色胺酸 産生蚓跺 + + + VP 丙酮酸銷 産生乙偶姻 - - - GEL Kohn明謬 明ΰ酶 - - - GLU 葡萄糖 發酵 + + + MAN 甘露糖酵 發酵-m化 + + + INO 肌糖酵 發酵-氣化 - - - SOR 山梨糖酵 同上 + + + RHA 鼠李糖 同上 + + + SAC 蔗糖 同上 — + + MEL 蜜二糖 同上 + - + AMY 扁桃糖 同上 - - - ARA 阿拉伯糖 同上 + + + OX 濾紙 細胞色素氣化酶 - - - N〇3 葡萄糖試管 産生N〇a + + + N〇s 韶萄糖試管 N〇a還原成Na - - - MOB APIM(顯撖鏡） 活動性 + + + MAC MacConkey培 養基 發酵培養 + + + OF «萄糖（API OF) (於油下） + OF 葡萄糖（API OF) 發酵（空氣） + + + +=陽性 -=陰性 同上=與前例相同 本紙5k尺度遑用中《國家樣準（CNS)T4規格（2]0x297公龙） -16- 81. 4. 10,000^ (if) (請先閱讀背而之注意I項洱填寫本頁)
經濟部中央標準局只工消费合作社印M ^〇9^b Λ 6___lij_ 五、發明説明（） 此等太株，如前述測定顯示，存在有K5被* 體多醸抗原。本發明有用之大腸捍a菌株可維持於標準瑾 脂（Merck I) , Loeb瓊脂，或仟一樺大腸捍豳搪合的培巷 基上。 K5之製備及太ϋ裎..菌之培育舉例說明於如下之製備例 2 〇 以下各例及製備例僅供更明確的舉例説明本發明之用 ，而不得視為限制本發明之範圍。 製備例1 3-Π-碴敢某鹧務猫：> 分麒 3-0-硫酸基轉移酶可由小鼠抽取得之Furth肥大細胞 腫瘤製備，此酶可得自瑞典.Uppsala, S-751 23, 575倍 箱，生物K學中心.瑞典農業科學大學。如J. Fu「U ei aJL.. Proc. Soc, Exp. Biol., 9i, 824 (1957)所述， Furth肥大細胞腫瘤可於正常小E種条内發展出來。特定 製法如下。 肥大細胞瘤（約70g組織）於200ml 0.05H Tris-1% 1>^〇11父-100,?117.4内均化，1'「丨1:〇11<-100内含有蛋白 醜抑制劑：10/ug/ml pepstatin, 2mM EDTA及 IbM PMSF ( S igma化學公司）。 均化物於4t：溫和攪拌1小時，然後於lOOOOOxg離心 1小時。上清液通過玻瑰纖維過濾器及進行如下純化方案 1)肝素-西法羅斯（Sepharose), 31b1柱，首先使用缓衝 (請先閲讀背而之注意事項洱项窍本頁) 裝- 訂 線- 本紙张尺度遑用中a國家楳準（CNS)甲4規格(210x297公釐） -17- 81. 4.】0,〇〇〇張（H) 經濟部屮央榀準而A工消赀合作社印製 209 挪 Λ6 ___Π_6_ 五、發明説明（） 液 A (0.05M Tris-O.U Triton X-100, pH 7.4, lwg/ b1 pepstatin, 2mM EDTA. 20X 含 0.15M NaCl 之甘油）洗 _ .然後使用0.15-1.OM NaCl於缓衝掖A之線性梯度溶離 。溶離分體積為4π1,大禮遵照Jansson e±. aJL. . B i ochem .J., Hi, 49 (1975)所述之程序，檢定0-硫酸基轉移酶 活性。0-去硫酸化肝素用作硫酸基之接受劑。10 «g接受 劑· 5w Ci 3aS PAPS.及酶蛋白質於總體積為100« 1之50 bM HEPES, lOmM MnCU, lOmM MgCla, 5mM CaCl*. 3.5 w M NaF, 1% TRITON X-100 , PH 7.4 ,於 37 X：培育 30 分 鐘。藉绅入400 wl乙醇.其中含1.3%乙酸納，連同0.4 mg載劑肝素共间终止反應，樣品於-201C放置隔夜。離心 (13000rpn 10分鏡）後.抛棄上清液，九粒溶解於lOOwl 水中。 如下述，3eS-檫槭之多_經由西法雷斯（Sephdex)離 心，而與其餘未合併的檫幟分離。注射简（内徑5cmX〇.9 cm)内填充以西法雷斯G-25 (超細级）使用0.2M NH4HC〇3 平衡.然後於2000γριπ離心5分鐘及憨浮於錐形離心管内 ，去除大部分液體。樣品（100 wl)施於填充後並離心後之 注射简内.然後以相同方式再度離心。經標幟的多醏類於 流出流内回收.將流出流收集於試管内，同時藉凝膠保有 低分子量經標幟的化合物。藉閃爍光學計量法分析流出流 。匯集活性部分，及對含0.15M NaCl之緩衝液A滲析。 2)西法羅斯藍，41ml柱，流速15ntl/h。於施加樣品後，柱 以含0.15M NaCl之緩衝掖A洗滌，及再度使用由0.15至 (請先閲讀背而之注意事項洱项寫本頁) 裝- 訂_ 本紙張尺度遑用中明明家樣準（CNS)T4規格(210x297公釐） -18- 8i. 4. 10,000¾ 〇{) 經濟部屮央揲準：iT β工消赀合作社印製 五、發明説明（） l.OM NaCl之線性鹽梯度溶離而得酶活性之最末部分。溶 離分髏積為5nl ,如前述檢定0-硫酸基轉移酶活性。匯集 活性溶離分，濃縮至約10π1及對緩衡液Α-0.075Μ HaCl滲 析。随後，樣品中加入/3-氫硫基乙酵至12aM嬝度。 所得純化度為150倍，而0-硫酸基轉移酶活度之回收 率顯然為100% 。通過西法羅斯藍純化所得樣品中含有可 資驗證的葡萄糖胺基-6-0-硫酸基轉移酶，伊杜醛糖酵基 -2-0-硫酸基轉移酶，及葡萄糖胺基-3-0-硫酸基轉移酶 〇 剪備例2 大瞄捏舖：> 捣音苻KS：>牛商 铉蕃甚 欲生産1^_類.可於含可同化之硪。氮及無機鹽類來 源的含水營養介質内.於有氣條件下培育大賜捍閡n培養 基可為發酵業界可用之多種營養介質中之任一種.而其組 成可依據技蓊精湛技術員之經驗加以調整或修改，俾獲得 具有期望的平均分子量之K5酷類及改良發酵産率。較佳硝 源為葡萄糖，甘露糖.半乳糖及蛋白睐。較佳«ί源為氛. 硝酸鹽，大豆粉.蛋白練.肉抽取物，酵母抽取物.胰蛋 白睞及胺基酸類。可摻混入培餐基内之較佳無機鹽類，為 可産生納，鉀，鐵，鋅，鈷.鎂，鈣，銨，氛，硪酸，磷 酸，磷酸氳.磷酸二氳及硝酸陰離子之習知可溶性鹽類。 通常，可産生Κ5酷之菌株於藤搖瓶内預先培育，然後 ，培餐醪置於發酵瓶内生産*質數量之前述醏類。典型的 (請先閲讀背而之注意事項#项寫本頁) 裝- 訂· 線. 本紙尺度遑用中8國家楳毕（CNS)T4規格（210x297公釐） 一 19 — 81. 4. 10,000¾ (II) % Λ 6 η 6 五、發明説明（ 經濟部十央標準而β工消仲合作社印製 代表性發酵培餐基也可用於預培養之用者，1升之组成如 下： KaHP〇4 3.6g KHaP0« 1.2g 卡斯肢基酸（Casaa i no ac i d) 20g 檸嫌酸銷二水合物 〇.5g 硫酸銨 lg 葡萄糖 4g MgSO* 0.15g lOOg酵母抽取物於100ml水之可摻析部分 11 (對水滲析，膜之截留：15000D) 培養基之PH為7.2 發酵 a) 前培養得自Loeb瓊脂平板之一接種環的大腸捍魈撤浮 於5ml Merck標準1培養基内及於PH約7.2 ,於37*C培育 6小時。然後.混合物置於100ml之前述培養基内及於相 同條件下培育隔夜。 b) 發1-發酵偽於有氣條件下於6.8之有效pH,於371C進 行由約1變化至10小時之一段時間。 使用一發酵瓶含有10升培養基： Κ ϊ Η P 0 4 36g KH*P〇4 12g 卡斯胺基酸（Casam i no ac i d) 200g 檸様酸納二水合物 5g (請先間讀背而之注意事項再艰筠本頁) 本紙張尺度遑用中β國家«準(CNS) Τ4規格(210x297公:it) 一 20- ⑴.4· ]0,000張（H) Λ6 Π 6 五、發明説明（） 硫酸銨 葡萄糖 40g MgS0« 1. 5g 100g酵母抽取物於1 1水之可滲析部分 1〇1 (對水摻析，膜之截留：15000D) 經濟部屮央榀準而貝工消"合作社印製 也可有利地使用含數量低於前述數量或至多約5% W/V 之葡萄糖或其他硪源的類似發酵培餐基。 夕柚取 抽取--K5糖類偽依據 W, Vann e_L slL.，Eur . J . Biochem,, Ufi_, 359 (1981)所述程序，或如下述由b)所 得之發酵培餐基中回收。 發酵醪於520〇ΓΡΐη離心約35分鐘。所得沈澱懸浮於約 800ml之磷酸盥緩衝液内，所得懸浮液於8000「ραι離心15 分鐘.去除上清液。沈澱懸浮於800rol之50mM Tris 5mM EDTA緩衝液PH 7.3 (預先溫熱至37t!)内，及懸浮液於37 1C之水浴中雒持30分鐘。然後，懸浮液於9000Γριβ離心20 分鐘。移開上清液及重複抽取3次。 合併Tris/EDTA抽取所得之上清液，及加人〗〇%CET-AVL0N(商品名）水液直到不再觀察得任何沈澱為止，混合 物於室溫維持隔夜。混合物於20D及8000「pm離心10分鐘 ,沈澱溶解於約10-20m丨之1M NaCl水液内.溶液使用至 少8倍體稍之乙酵稀釋，離心。收集由粗K5_所組成之固 體及再度溶解於約10-20ml之1Μ NaCl内，並加入至少8 倍體積之乙醇。藉離心收集沈澱，溶解於水中，及於具有 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝· 訂 線· 本紙張尺度逍用中《國家«準(CNS)IM規怙(210x297公釐) 81. 4. 10,000張（H) Λ 6 η 6 經濟部屮央標準;0κχ工消赀合作社印製 五、發明説明（） 截留為3500道爾頓之摻析袋内滲析24小時。滲析所得溶掖 於4t：於9000Γριη離心20分鐘，及抛棄沈澱。將所得上清液 (其組成為經純化的K5醣）冷凍乾燥。 經由將所得純K5醣溶解於水中至濃度為2-3%,及於4 t於45000Γριπ將所得溶掖離心4小時而去除脂多醏類。存 在有撤置殘餘脂多醏，不會影轡起始物料之加工。欲求去 除大腽捍菌之核糖核酸，所得溶液使用核糖核酸酶（Sigma )於含MsCl2(10niM)之磷酸鹽缓衝掖内處理24小時，然後 使用截留為3500道爾頓之滲析袋，對去離子水滲析24小時 ，及凍晶乾燥。此程序對毎101培養醪樓得約0.8-1 g。 依據前述程序製得之代表性K5醏類如下。 A) 藉HPLC測得平均分子量約為5000道爾頓之K5醏。此種K5 醏之"C-NMR光譜報告於第1圖，顯示位在104ρρπι之D-葡 萄糖醛酸之典型主要信號，及位在55及98ρρπι之N-乙醯基 -D- «萄糖胺單位之典型主要倍號，如W. Vann等人於 Eur. J.Biochem,, m., 359 (1991)所教示者；及位在 110 及103ppm之典型次要信號.此倍號傜來自於由D-«萄糖醛 酸衍生而得之端末殘基，如B Casu等人，BUchem. J.m ,599 (1981)所教示者。 B) iiHPLC測得平均分子量約為50000道爾頓之K5醣。此種 K5酷之13C-NMR光譜示於第2圖，顯示位在1〇4ρρπι之D-M 萄糖醛酸之典型主要倍號，及位在55及98ppro之N-乙醛基 -D-葡萄糖胺單位之典型主要佶號。 C) 藉HPLC測得平均分子量約為100000道爾頓之K5醏。此種 (請先閲讀背而之注意事項再埸寫本頁) 本紙5k尺度逍用中BB家標準（CNS)肀4規格（210x297公：Jt) -22- 81. 4. 10,000¾ 〇|) A 6 Π 6_ 五、發明説明（） K5醣之13C-NMR光譜示於第3圖。具有D-葡萄糖醛酸及M-乙醛基-D-葡萄糖胺單位之典型主要倍號，分別位在104 ppm 及55與98ppb 〇 前述测定證實起始K5醣類具有如下重複雙醣單位：
Π 依本^^之多步驟式方法製得之化合物及起始K5醣類 (請先閲讀背而之注意事項Λ-填寫本頁) 經濟部屮央榀準局A工消货合作社印製 之 偽使用 Bruker CXP-300光譜儀；於 D*0二，.* 之溶液記錄贿得；但實施例8D之化合物例外，其13C-NMR 光譜傜使用Bruker光譜儀AMX500, MDs〇之溶掖記錄而得 〇 藉HPLC測定K5醏類之分子量，係使用以1M NaCl於 0.05M TRIS-HC1 PH8缓衝液平衡的Superose 6 (商品名） 及Superose 12(商品名）柱進行。本發明化合物及相關中 間物之純度（多醏含量），偽藉irf：吧唑方法（T. Bitter and H.M. Muir. Anal, Biochem.,企，330 [1962])檢定 。通常純度大於90%。旋光度偽於室溫.於1%於水之濃 度，使用JASC0 0 IP 370偏光儀測定。随後校正測量值， 將試驗樣品之純度考廉進去。 官旃例1 由蘭A斛備N-安7,鹼某化-N-硫酴化多_類（步賺苻h)) A)於小瓶内將lOOmg K5醣A及138mg肼硫酸酯溶解於1.38 裝· 訂_ 線· 本紙張尺度遑用中B «家《毕(CNS)T4規怙(210父297公釐） 81. 4. 10,000張（11) Λ 6 Π 6 經濟部+央標準灼Α工消#合作社印製 五、發明説明（） ml肼内。藉將小瓶放置於液態m中將溶液冷凍，間時將溶 液維持於氮氛圍下。然後密封小瓶且缓慢調整為室溫，随 後於96*0加熱5小時。然後再度以液態氮冷凍小瓶，開啓 小瓶，且缓慢調整至室溫。溶液倒入圚底瓶内，使用5b1 甲苯洗出小瓶内容物。 溶液於減壓下濃縮，此作業重複2次（毎次使用20b1 甲苯）侔（連同甲苯）蒸發去除大部分肼。然後，殘渣加 入50ral蒸皤水中，及利用37%鹽酸水液將所得溶液調整至 中性；然後，通過3500道爾頓截留膜摻析5日，此滲析是 對氛化納溶液及水進行（2X 21, 0.5M NaCl第1日，2X 21, 0,2M NaCl第 2 日，2X 21. 0.1M NaCl第 3 日，2X 21 ，H a〇第4及第5日）。然後於減壓下濃度溶液，及溶解 於65ml蒸餾水中。 所得溶液之PH藉加入固體硪酸氫鈉調整為9,將溫度 升高至55它。於此溫度下，於連鑲搜拌下，將65π1三甲胺 •三氣化硫之加合物加入溶液内，溶液於此溫度維持1小 時，然後又加入65ml相同的加合物，金體又反應5小時。 溶液對如前述含有漸減濃度之氛化納與水之水溶液滲析。 谚析後之溶液經冷凍乾燥，播得8〇rog産物，具有第4圃所 示之〃C-NMR光譜。 産物顯示如下特擻倍號： 強佶號： 60ppid , N-硫酸化基 62pPm .葡萄糖胺殘基之未取代6-羥基 (請先間讀背而之注意事項洱埙寫本頁) 裝_ 本紙張尺度边用中明《家猱準(CNS)甲4規格（210x297公;li) 81. 4. 10,〇〇〇張（1|) 209½5 Λ 6 Π6 經濟部屮央梂準而员工消许合作社印製 五、發明説明（) 98ρρπι ,葡萄糖胺殘基 104ρρ·,葡萄糖轻酸殘基 韶佶號： 109及103ΡΡΠ ,端末葡萄糖醛酸殘基 梅课佶號： 24ρρβ ,殘餘Η-乙醯基化基。 由於24ρρβ之信號面積對在ΙΟΟ-ΠΟρρΒ區域内所有琛 狀異構的（C-1)磺之倍號面積比，藉13C-NMR測知N-乙醛基 化基之百分含置為約5。N-硫酸化基之百分含量為約95。 未觀察得來自游離-NH*基之倍號。 B) 遵照前述製備之相冏程序，始於l〇〇mg K5醏A及限於3 小時，使用胼硫酸酯/阱進行反應，獲得77rag産物，具有 N-乙醯基化基之百分含量約15 (如對實施例1A之産物所述 ，藉"C-NMR測定（第5圖）），及H-硫酸化基之百分含 量為約85。第5圖之13C-NMR光譜顯示如下特擞倍號： 24及55ppn(弱）：N-乙醛基化基 60ppm(強）：N-硫酸化基 62ppb(強）：D-葡萄糖胺殘基之未取代6-羥基 98ppm(強）：D-葡萄糖胺殘基 104ρρπ(強）：D-蕕萄糖醛酸殘基 103及109ppm (弱）：端末D-葡萄糖醛酸殘基 未存在有游離-NHa2倍號。 C) 遵照製備實施例U産物之相同程序，始於lOOmg K5醏A) 及與阱硫酸酯/胼之反應限於1小時•獲得75mg産物，具 (請先閲讀背而之注意事項朴蜞寫本頁) 裝· 訂 線- 本紙張尺度边用中國《家《毕(CNS)T4規格(210x297公#) 81. 4. 10,_張（H) 2〇9::访 Λ 6 Π 6 經濟部+央梂準局κχ工消贽合作社印製 五、發明説明（） 有N-乙醛基化基之百分含量為約30,如藉1H NMR (第6圈 )由於2.1ρριη之Ν-Ζ1Κ基化基之倍號面積輿琛狀異構氫（ 介於5與6 ppm間）之倍號總面積之比測定；及具有第7 圖之13C-NMR光譜顯示與實施例1B之化合物相同的待擻信 號。化合物具有N-硫酸化基之百分含量約為70。不存在有 游離-ΝΗ»基之特擻信號。 官掄例2 由K5醣B餺備N-去7,醅某仆,-H-去碴酴仆.多鑛（步ffi a)及b n 始於lOOrag K5醏B ,及遵照如製備實施例1A産物所述 之相同程序，使用胼硫酸酯/胼進行反應經歴5小時，獲 得75mg産物.産物具有如同例1A産物般藉13C-NMR(第8圈 )測得乙醛基化基之百分含量小於5,及N-硫酸化基之 百分含量高於95。第8圖之13C-NMR光雉顯示與例1A化合 物相同的特擻信號。不存在有游離NHa基之特擞倍號。 官旃俐3 由ί：餺備去7,醅某化-N-硫酴仆.劣麴（击羝a)苻h)) 遵照對製備實施例1A所舉例說明之相同程序，但與肼 硫酸酯/阱之反應時間不同，始於lOOmg K5醏C).可製得 下列各種多醣。 A) 與阱硫酸酯/阱之反鼴時間：5小時。産率：85ffig産物 ，具有乙醛基化基之百分含置約為2.及硫酸化基之 百分含量約為98,係如前述藉13C-NMR(第9圖）測定。光 譜顯示與例1A之化合物相间的待擞佶號。 B) 與肼硫酸酯/肼之反應時間：2.5小時。産率：80mg産 (請先閲讀背而之注意事項再蜞寫本頁) 裝- 線. 本紙尺度遑用中as家楳华（CNS)T4規格（2】0x297公址） 81. 4. 10,000張（II) 2〇92S5 Λ 6 η 6 經濟部屮央標準巧Μ:」.消"'''汴杜,:!,^ 五、發明説明（) 物，具有N-乙醒基化基之百分含量約為23,及N-硫酸化基 之百分含量約為77,偽如前述藉13C-NMR(第10圈）測定。 光譜顯示舆例1B之化合物相同的特擻倍號。 C)與阱硫酸酯/阱之反應時間：80分鐽。産率：75mg産物 ，具有N-乙醛基化基之百分含量約為48,及N-流酸化基之 百分含量約為48,及N-硫基化基之百分含量約為52,傜如 前述藉13C-NMR(第U圖）測定。光譜顯示與例1C之化合物 相同的特擻倍號。 實施例1, 2及3製得之各多餹之NMR光譜，明白指 示起始IC5醣類之構造未出現其他修改。 富施例4 「r-盖向蛊縑化><-硫酴仆.劣醢額夕靱備（步am A)l〇Bg實施例1A之産物，與8mg如前述藉H. Prihar所述 (參見上文）由牛肝所得之製劑其中含有酶D-葡萄糖醛醯 基-L-伊杜糖醛醛基-C5-差向異構酶，於lml之含有50ιηΜ 氮化鉀，15mM EDTA 及 l%Triton X-100 之 0.05M Hepes, PH 7.4中培育。混合物於室溫雒持2曰，藉離子交換 - 層析術於DEAE纖維素上進行者.分離出期差向異構化 産物。獲得7iBg産物。 l-NMR光譜之低領域區（第12圖）明白顯示：於4,7 及4.95ppm具有L-伊杜糖醛酸殘基典型的佶號（Perlin A . S .於碳水化合物化畢方法.第VB卷.學術出版社.紐 約（1976), 94頁），該區域相當於糖醛酸總面積之18%。 藉由如J. Jacobsson等人所述（參見上文）進行之紙張層 本 尸、度边用屮《«5家桴 iMCNS)T4HJtM2Ktx29h>^l -27- 81.6. )1),000¾ ίϋ) ····";消部屮央榀準
”''-f1iJ-f;,,K Λ fi Ιί 6 五、發明説明（) 析術，測定L-伊杜糖醛酸之百分含量為18,由紙張層析圈 (第13圏）可得類似的結果。 B) 遵照如上A)之程序，將實施例2所得之10mg産物差向異 構化。樓得7mg産物。*H-NMR光譜（第14圖）顯示位在 4.7及4.95ppb的L-伊杜糖醛酸殘基之典型倍號.其面積相 當於糖醛酸缠面積之22%。 第13圖偽指如前述進行的紙張層析圖，由此國測定L- 伊杜耱醛酸之百分含量為20。 C) 實施例3C所得之10mg産物遵照如上A)之程序差向異構化 。播得7ng具有第13圈之紙張層析圖，由此圖測知L-伊杜 糖醛酸之百分含量為19。 實施例4A及4B製得之多醣類之NMR光譜明白顯示：除 C5-差向異構化作用之外，並未出現任何其他結構修改。 鑑於起始酶基及差向異構化反應程序，實施例4C之産物也 未出現任何其他结構修改。 奮掄例5 Π-硫酤化-H-硫敌化-Γ5-羔向里樓仆.劣醣額斛備（击既d) A)100mg實施例4A製得之産物溶解於20ml水中，及於室溫 通過安伯來特（Amberlite)(註冊商標）IR-120H*柱。随後 使用20ml水洗柱。收集溶離分及使用10%三丁胺於乙酵之 溶掖調整為pH 5,5。使用各40m丨二乙醚將過量三丁胺抽取 三次.將含有例4A産物之三丁胺鹽之水溶液冷凍乾燥。所 得産物lOOmg溶解於32ial無水二甲基甲醛胺内，將765ms 毗啶♦三氣化硫加合物溶解於15rol無水二甲基甲醛胺加入 (請先間讀背而之注意卞項外蜴"木π) 本紙 5t 尺度边《丨中 S 國家桴峄公从） -28- H1. 6. ΙΠ,ΟΟί^ 〇ί) Λ (ϊ η 6 奴滴部十火榀準： ,-.ι'π'ίί-'τ¾ 五、發明説明（) 溶掖内，及所得混合物於Ot：維持1小時。加入等體積水 ，使用4%氫《化鈉水液將溶液諝整為pH 9,全體對蠹度 漸減的«化納於水之水溶掖進行滲析，如例1A所述。 將滲析後溶液冷凍乾燥，所得産物轉成對應之三丁胺 鹽時，於本例之相囘條件下反應。獲得180mg産物，如例 1A所述，産物最终與三甲胺•三氣化硫加合物反應。 獲得180mg標題化合物，具有如第15圖所示之13C-NMR 光譜，顯示特擻倍號位在60ρρπι (強）：N-硫酸化基；62ppb (強）：D-葡萄糖胺殘基之未取代6-羥基；69ppm(中）：6-0-硫酸化基；98ppbi(強）：葡萄糖胺殘基；99ΡΡΙ»(中）： 未硫酸化L-伊杜糖醛酸殘基；104ppra(強）：D-葡萄糖醛酸 殘基。 由位在69ppm之相同信號的面積測知，産物具有6-0-硫酸化基之最低百分含量為52。 B) 遵照如上例5/\之程序，及始於100mg例4B産物，獲得160 mg産物，具有第16圖之13C-NMR光譜，及顯示如间例5/\製 得之化合物的特擞信號。 由位在69ppm之倍號面積測知，産物具有6-0-硫酸化 基之最低百分含量為44。 C) 遵照如上例5A之程序，及始於5mg例4C産物，獲得9mg 産物。 鑑於起始酶基及硫酸化程序.例5C之産物未出現其他 結構修改。 (請先間讀背而之注意肀頊洱项艿木玎) -29- Λ 6 η 6 切濟部屮央惊半：5 nf!':,'" 五、發明説叫（) 辛笙向里嫌化Ν-» Π-碴BMh劣糖剪備 lOOng實施例1A製備之産物溶解於20nl水中，及於室 溫通遇安伯來特（註冊商標）IR-120V柱。«後以20·1水 洗滌柱。收集溶雄分及使用3b1三丁胺溶液（10%於乙酵 )調整為pH 5.5。使用40β1乙醚抽取過量三丁胺（三次Γ ，及將含例1Α産物之三丁胺鹽之溶液冷凍乾燥。 180ml所得鹽溶解於32ml無水二甲基甲醛胺内。於此 溶液内加入765mg無水吡啶♦三氣化硫加合物溶解於15ml 無水二甲基甲醯胺，及混合物維持於Ot： 1小時。反應混 合物與等體稹水合併，以4% NaOH水液將PH調整為7.0。 然後，如例1A所述，混合物對濃度漸減的NaCl溶液滲析。 滲析後之溶液經冷凍乾燥，所得産物於轉成對應之三 丁胺鹽時，於本例之相同條件下反應。獾得90mg産物，此 産物於例1A之相同條件下使用加合物三甲胺•三氣化硫處 理。播得一種産物具有6-0-硫酸化基之最低百分含量為35 (由位在"C-NMR光譜（第17圖）之69ppm的信號面積測定 ),及具有如例1A産物之相同特擞倍號。 窗旃例7 夫差向里樓化N-苻Π-‘硫酴仆.劣餹镅：> Μ備 如《施例6所述製備例U化合物之三丁胺鹽，及將此 鹽180mg溶解於32ml無水二甲基甲醯胺。溶液冷卻至0*0 及加入765ml於01C製備之無水吡啶•三氣化硫於15ml無水 二甲基甲醯胺之溶液。所得混合物於0¾維持1小時.及随 後與等體積蒸餾水混合。利用4%氫氣化納將pH調整至9 (請先閱請背而之注意事項洱碭巧木玎) -30- . 6. !(丨，丨)⑻張（ii) Λ fi Η 6 五、發明説明（) ,及加入4倍體積之飽和以乙酸銷之乙酵。混合物於 維持隔夜，獲得沈澱，沈澱溶解於50ml蒸皤水。所生成之 溶液對蒸皤水滲析3日（每日3X21,截留14000D),最終 冷凍乾燥。 重複前述程序可得下列各化合物： A)産率：85ng。化合物顯示N-硫酸化基之百分含量約為95 及6-0-硫酸化基之百分含量約為1〇〇 (分別位在第18圖13C-NMR光譜之60及69ρρπι之倍號），S03-/C00_比約為2.1 ，及[α ]為 +55,4°。 Β)産率：94mg。化合物顯示Η-硫酸化及6-0-硫酸化基之百 分含量類似化合物7A (倍號分別位在第19圖13C-NMR光譜 之60及69〇?111).及503-/(：00-比約為2.2。 C) 産率：82rog。化合物顯示H-硫酸化及6-Q-硫酸化基之百 分含量類似化合物7A (倍號分別位在第20圖"C-NMR光譜 之60及69?9〇1),及5〇3-/(：0〇-比約為2.2。 D) 産率：95rag。化合物顯示N-硫酸化基之百分含量約為95 ，及6-0-硫酸化基之百分含量約為86 (分別位在第21圖 "C-NMR 光譜之 60 及 69ppm) , SOr/COO-比約為 1.8。 宮旃俐ft 去羔向里楢仆,N-及Π-硫酴仆.劣缠額：> 轴備 使用實施例1A之化合物之三丁胺鹽作起始物料.及將 兩種溶掖之混合液維持於Ot：經歴不等時間而重複實施例 7之程序。重複該程序可製得下列各化合物： A)産率80rog。反應時間：20分鐘。化·合物顯示N-硫酸化基 本 iMfc 尸、度遢用中 SH家桴孕（CNS)，丨 丨 X297公-31- HI. 6. 1(),0()0¾ (II) 五、發明説明 經 滴 部 屮 央 準 /、 •» {} 杜 之百分含量約為95.及6-0-硫酸化基之百分含置約為70 ( 分別位在第22圈13C-NMR光譜之60及69ppm之信號）， S〇3 /C00·比約為 1.6。 B) 産率92mg。反應時間：40分鐘。化合物顯示N-硫酸化基 之百分含量約為95,及6-0-硫酸化基之百分含量約為75 ( 分別位在第23圈13C-HHR光譜之60及69ppm之佶號）， SOr/C00·比約為 1.7。 C) 産率90mg。反應時間：4小時。化合物顯示硫酸化及 6-0-硫酸化基之百分含量類似化合物7A (倍號分別位在第 24 圖 13C-NMR 光譜之 60 及 69PPI0 之信號），S〇3-/CO〇-比 約為 2.3,及[ct ]為+62.4°。 D) 産率95mg。反應時間：5.5小時。如於例1A所述進行N-再度硫酸化反應。化合物顯示N-硫酸化及6-0-硫酸化基之 百分含置類似化合物7A (信號分別位在第25圖13 C-HMR光 譜之60及69?口111之倍號），303-/(：00-比約為2,52。 宮掄例9 去羔向里鳒化N-苻Π-硫酸仆.劣_類靱備 重複實施例7之程序，再度使用例U之化合物之三丁 胺鹽作起始物料，及使用並未製成無水化合物的吡啶•三 氣化硫加合物。重複前述程序製得下列各化合物： /\)産率83mg。化合物顯示N-硫酸化及6-0-硫酸化基之百分 含置類似化合物7A (倍號分別位在第26圖13C-NMR光譜之 60及 69ppra) . S0：T / C00-比約為 1 . 9 ,及[α ]為+56.4° (請先間讀背而之注意事項#碣"木打) 本叭怅尺;1边用中S困ΐ桴峄（CNS) 丨公发） -32- 6.丨"，(·張（;丨） ii 2〇9 Λ 6 Π 6 經 濟 部 屮 央 準 .Vifi. /vif f-i- M1 五、發明説明（) B) 産率75»ge化合物顯示N-硫酸化及6-0-硫酸化基之百分 含置類似化合物7A (倍號分別位在第27圖"C-HMR光譜之 60 及 69ppb) , S〇3/CO〇-比約為 1.9,及[α ]為+56.2。 〇 C) 産率70mg。化合物顯示Ν-硫酸化及6-0-硫酸化基之百分 含量類似化合物7A (信號分別位在第28_13C-NMR光箝之 60及69?卩111).503-/(：00'比約為2.05.及[〇(]為+56.7° 〇 奮掄例1 0 去差向里後化N-苻Π-硫酴仆.劣齙萌靱備 1 如實施例6所述，製備實施例1 A之化合物之三丁胺鹽 ，及將180fflg此S溶解於室溫之32ml無水二甲基甲醛胺内 。溶掖維持於室溫，加入於室溫製備之1.53g無水加合物 吡啶♦三氧化硫於30ml無水二甲基甲醯胺之溶液。所得混 合物於室溫維持5.5小時，随後以等體積蒸餾水混合。藉 4%氫氣化鈉將pH調整至9,及如例7所述回收化合物。 如例1A所述將所得物料進行N-再度硫酸化反應。反應混合 物以4倍體積之飽和以乙酸鈉之醇稀釋，及如例7所述回 收终産物。 檢知N-硫酸化及6-0-硫酸化基之百分 含量類似化合物7A (倍號分別位在第29圖13C-NMR光譜之 60 及 69pph〇 ,具有 S03_/C00·比約為2,5 ,及[α ]為 + 59.4°。産率：86mg。 請 ifi 背 而 之 注 -tV •\i*· 項 A 项 Ϋ, 木 Τι 本扒張尺度边用，I，S «家烊岱UinxW/公.tt ) 一 3 3 — 8!. 6. (1:) ^濟部屮火標苹6:.::」-'/!71'''''0,,-卬^ 五、發明説明（) +盖庙里饞仆.N-苻Π-碴敢化劣_箱夕剪備 重複實施例10之程序，但其中兩種溶液係於55¾製備 ,及混合及雒持於此溫度經歷24小時。所得化合物顯示N-硫酸化及6-0-硫酸化基之百分含置類似化合物7A (信號分 別位在第30圖13C-NMR光譜之60及69ppm),及S〇3-/CO〇-比約為2.7。産率：77ng。 官旃俐1 2 去弟向里嫌化Ν-苻Π-硫租Mh劣醣類夕餺備 如實施例6所述製備實施例3A, 3B及3C之化合物之三 丁胺鹽。此等鹽使用吡啶•三氣化硫無水加合物處理，及 如例7所述，由反應介質中固收。重複前述程序可製得下 列化合物： A) 産率：80ng。起始三丁胺鹽為例3A化合物之三丁胺鹽。 化合物顯示SOr/COO·比約為2。 B) 産率：72mg。起始三丁胺鹽為例3B化合物之三丁胺鹽。 化合物顯示H-硫酸化基之百分含量約為77,及6-0-硫酸化 基之百分含量約為100 (信號分別位在第31圖13C-NHR光譜 之 60 及 69ρρπι),及 S〇3-/C00—比約為 1.8。 C) 産率：90mg。起始三丁胺鹽為例3C化合物之三丁胺鹽。 化合物顯示N-硫酸化基之百分含量約為52.及6-0-硫酸化 基之百分含量約為100 (倍號分別位在第32圖1 3C-NMR光譜 之 60 及 69ppm),及 S〇3 — /CO〇-比約為 1.5。 奮旃例1 .Ί 醮催.VD-硫酸化反_ (請先間讀背而之注念"項洱项"木页) 本紙張尺度逍用十 乜 iMCNSMMWtSCMOxSO'/公从> -34- 81. 6. 10,0(10¾ (i!) 2〇9’颂 鲠消部屮央榀準Ad :1:11-¾ Λ 6 Π6 五、發明説明（) 使用下列各成分製備2nl反應混合物：2mg實施例5B 化合物，0.4·丨依製備例1之程序製妥之酶製劑（相當於 約 1.6ng 蛋白質）；ImM PAPS M0.05HHepes;10niMHnCla-5mM CaCl*' lOmM HgCl«-3.5wM HaF-(0.5-l%) Triton X-100, pH 7.4。反應混合物於37¾培育2小時，然後/ 藉著於100它加熱2分鏡終止反應。藉離心去除變性蛋白 質，及上清液通過以0.2M H4NN〇3平衡的西法雷斯G-15柱 (0.8X100)。溶離出之物料經冷凍乾燥。 如此製得之物料樣品（500 w g)溶解於500 « 1 50bM Tris-0.5M NaCl, pH 7.4,施於以相同缓衝液平衡的3id1 抗凝血酶HI-西法羅斯柱上。然後使用50mM Tris-2M NaCl, pH7.4溶離柱。溶離分含有總物料之10%。 害掄俐1 4 太發明 >(卜.会物夕沃件 若干本發明化合物之活性係使用如下試驗於試管試驗 中評估： a) 抗-Xa活性，如A. N. Teien等人，血栓研究，&_, 413 (1976)所述進行； b) 肝素輔因子Ε活性，如D. Dupoy 丄.，Thromb. Haem .,6uQ_(2) . 237 (1988)所述進行； C) APTT,大體如 W. H. Bel 1等人.自然.11主，880 (1954) 所述進行.但以鹽水將血漿樣品稀釋1: 1;及 d)TT,大體如 C. Eika 等人，Lance H, 376(1972)所述進 行，但使用鹽水將血漿樣品稀釋1: 1。 本从法尺度边用中 从） _ 81. 6. :0,0()0¾ (ii) (請先閲讀背而之注意肀項洱项打木页) 209^2.5 Λ β Π 6 五、發明説明（) 所得結果摘述於下表： 表 1 試管試驗活袢狳藿 實施例 抗-Xa HCII APTT TT 化合物 IC50* IC50* IC200*- IC200 5Α 11 0.4 20 4 5Β 56 0.46 39 13 5C 59.7 0.05 3.55 1.2 "抑制50%所需濃度（《 s/ml) -"凝血時間加倍所需濃度（w g/m 1) 結果指示本發明之多_類於臨床上可用作抗血栓劑及 抗凝血劑。 富旃例1 5 各實施例之未差向異構化N-, 0-硫酸化化合物之性質 列於下表2。 表 2 (請先閱-背而之注意卞項#项"木页) '?濟部中央^^,/, :.^.5-¾ 試管試.駱活件综蟄 實施例 抗-Xa HCII APTT TT 化合物 IC50* IC50* IC200" IC200*B 6 5.7 0.26 8 7A 5.06 0.25 - 2.5 7C 5.4 0.51 - - 6C 2.7 0.57 - _ 8D 2.2 0.05 一 36 —
Hi . 6. )"，_汍（Η) Λ 6 Π 6 -¾ 五、發明説明（) 9B 8.7 0.31 - - 9C 8.2 0.35 - - 10 1.7 0.99 - - 11 6.1 0.62 - - *抑制50%所需濃度（w g/ml)凝血時間加倍所需濃度g/ml) (請先閲讀背而之注意事項洱碭艿本页) 線- 本紙张尺度边W中阐S ί：榀iMCNS) T4gUM21〇x297公处） 一37- 6. 10,000^ {\\)