CN101160299B - 将芦荟色苷a转化成芦荟苦素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过以下反应将芦荟色苷A水解转化成芦荟苦素的方法:由此提高了可从芦荟植物的汁液提取的芦荟苦素的量并使得芦荟苦素的提取和纯化也更容易且成本更低。由于芦荟苦素比芦荟色苷A更具商业价值,该方法还提高了来自芦荟植物的汁液或芦荟苦味物质的商业价值。该方法任选还包括将芦荟苦素与对香豆酸分离的步骤。该方法中所用的典型水解步骤是酸水解、碱水解和酶水解。在酸水解的情况中,酸是任何合适的有机或无机酸,如盐酸、硫酸、硝酸或磷酸。在酶水解的情况中,水解酶典型地是酯酶、脂酶或蛋白酶。
Description
发明背景
本发明涉及将芦荟色苷(aloeresin)A转化成芦荟苦素的方法。
芦荟是已知存在超过300种的肉质植物,大部分是非洲本土的。将来自芦荟的产物用于传统医药中已经有几个世纪了,特别是已经用于皮肤病学的应用中,用于治疗烧伤、疮和其他创伤。现代治疗观察包括抗炎活性、抗肿瘤活性、抗酸活性、抗糖尿病活性、酪氨酸酶抑制活性和抗氧化活性。芦荟产物还广泛用于化妆品和保健食品工业中,尤其是随着近来天然产品流行性的增加。
从其获得药物、治疗、皮肤病学或化妆品应用的主要非洲芦荟种是开普芦荟(Aloe ferox),一种局限于南部非洲的种。其他种的芦荟也可用于相似的目的。在USA,库拉索芦荟(Aloe vera)广泛用于皮肤护理产品、香波和保健饮料中。然而,已经发现开普芦荟具有几个优于库拉索芦荟的特性。例如,开普芦荟的钙和总氨基酸含量高于库拉索芦荟。栽培的开普芦荟植物的切割叶还产生比生长于其旁边的库拉索芦荟植物多大约20倍的苦汁(重量对重量而言)。因为开普芦荟叶厚宽得多,每个叶片的苦汁总产量甚至更大。从开普芦荟回收的凝胶量以体积计也一向大于从库拉索芦荟获得的。
存在许多分离芦荟特定成分的方法(参见,例如,US专利4,735,935和4,656,029)。芦荟的商业产品之一是从芦荟叶产生的汁液获得的,并且由于其苦味称为芦荟苦味物质(aloe bitters)。汁液通过本领域技术人员已知的传统方法收集并干燥以产生暗棕色的固体物质,称为芦荟苦味物质或Cape Aloes。
商业芦荟苦味物质含有四种主要成分,即芦荟素A、芦荟素B、芦荟苦素和芦荟色苷A。
开普芦荟叶渗出物中主要化合物的总体组成是非常固定的,尤其是考虑到该种的形态变异和广泛的天然分布区域时。在开普芦荟中,芦荟色苷A、芦荟苦素和芦荟素(差向异构体A和B两者)构成总干重的70%至97%,各自以大约4∶3∶2的比例。
通常通过选择性提取从芦荟苦味物质分离芦荟素A和B(或芦荟苷),其主要用作泻药。芦荟苦素也是从芦荟苦味物质分离的并用作皮肤美白和防晒剂(US专利4,656,029)。通常将芦荟色苷A丢弃。因此,尽管芦荟色苷A以最大量存在于芦荟汁液中,但其具有甚少的或没有商业价值。因此将芦荟色苷A转化成具有更高商业价值的化合物是有利的。
在以下的描述中,任何提及芦荟汁液也旨在提及芦荟苦味物质或芦荟苦味物质的提取物。
发明概述
根据本发明的第一个实施方案,提供了将芦荟色苷A转化成芦荟苦素的方法,该方法包括将至少部分芦荟色苷A水解成芦荟苦素和对香豆酸的步骤。
该方法可以进一步包括将芦荟苦素与对香豆酸分离的步骤。
可以使用酸水解来进行芦荟色苷A水解成芦荟苦素的步骤。
或者,可以使用水解酶来进行芦荟色苷A水解成芦荟苦素的步骤。
在酸水解的情况中,酸可以是任何有机或无机酸。特别地,酸可以是选自盐酸、硫酸、硝酸和磷酸中的一种或多种酸。
在酶水解的情况中,水解酶可以是酯酶、脂酶或蛋白酶。
特别地,水解酶可以选自米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白酶、来自Diversa的ESL001-02TM,来自Nordisk的NOVO388TM和来自AltusChiroscreen KitTM的米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶。更特别地,酶可以是Amano Protease MTM或来自Quest International的Bioprotease P concTM,这两者都是来自米曲霉的蛋白酶。
或者,酶可以是由DNA或氨基酸序列编码的酶,该序列至少实质上对应于上述任一种酶的DNA或氨基酸序列或其部分序列。
酶的DNA或氨基酸序列可以与上述酶的DNA或氨基酸序列具有至少70%的同源性。
酶可以是固体或液体形式。
优选,芦荟色苷A转化成芦荟苦素和对香豆酸而不形成副产物,特别地,不形成聚合物。
芦荟色苷A可以从任何种的芦荟植物获得,特别是来自开普芦荟或库拉索芦荟种,更特别是来自开普芦荟种。
可以从芦荟植物叶产生的汁液获得芦荟色苷A。汁液可以是液体或固体形式。
芦荟色苷A可以是部分纯化的形式。
使用酸时的水解步骤可以在约0.5N至约10N的酸浓度范围内进行,最佳在约2N至约5N酸的浓度下进行。
水解步骤可以在约20至约121℃进行,并且使用酸时,通常在约90℃进行。使用水解酶时,水解步骤通常在约37℃进行,除了使用ESL001-02TM时-在这种情况下,水解步骤可以在约50至约90℃下进行,更优选约70℃。
可以在反应介质中使用缓冲剂。缓冲剂可以是钠磷酸盐、碳酸盐或硼酸盐缓冲剂或水,或任何其他具有在约4至约8pH范围内的pKa的缓冲剂。缓冲剂浓度可为0.01M至1M的范围,优选0.1M。
可以加入有机溶剂,如乙醇或丙酮,浓度为约10至50%,优选约30%。
根据本发明的第二个实施方案,提供了从芦荟植物的汁液提取芦荟苦素的方法,该方法包括步骤:
将芦荟植物中的至少部分芦荟色苷A水解成芦荟苦素和对香豆酸;和
从汁液提取天然存在的芦荟苦素和从芦荟色苷A转化而来的芦荟苦素。
芦荟植物可以是开普芦荟种的植物。汁液可以是液体或固体形式。
可以根据基本上如上描述的方法来水解芦荟色苷A。
根据本发明的第三个实施方案,提供了通过基本上如上所述将芦荟色苷A水解成芦荟苦素和对香豆酸而形成的芦荟苦素。
芦荟色苷A可以来自芦荟植物的汁液,更特别地可以来自开普芦荟种的汁液。
芦荟苦素可以是天然存在的芦荟苦素和根据上述方法从芦荟色苷A转化而来的芦荟苦素的组合。
发明详述
在此描述了将芦荟色苷A水解转化成芦荟苦素的方法。
芦荟色苷A是对香豆酸的芦荟苦素基(aloesinyl)酯,并且申请人发现可以有效而经济地将芦荟色苷A水解成芦荟苦素(一种C-糖苷-5-甲基色酮),因此提高从芦荟植物汁液可提取的芦荟苦素量。因为芦荟苦素比芦荟色苷A更有商业价值,该方法还提高了来自芦荟植物的汁液或芦荟苦味物质的商业价值。以下描绘了芦荟色苷A转化成芦荟苦素的反应:
芦荟色苷A转化成芦荟苦素还有助于从芦荟苦味物质选择性地取出芦荟苦素,以及副产物芦荟素A和B。芦荟色苷A不存在情况下芦荟苦素的提取和纯化的困难和成本比芦荟色苷A存在时要低得多,出于两个主要的原因:
(a)转化后,存在更多可以提取的芦荟苦素;和
(b)转化后,只需要从芦荟苦味物质中分离两种主要的成分(芦荟苦素和芦荟素),并且因为这些成分具有非常不同的物理性质,芦荟苦素的选择性提取变得容易得多。
该方法还包括将芦荟苦素与对香豆酸分离的步骤。合适的分离步骤是本领域技术人员清楚的,在此不详细讨论了,尽管常用的分离方法包括溶剂提取、色谱和结晶。
可以用于该方法中的水解步骤实例是酸水解、碱水解和酶水解。
在酸水解的情况中,酸可以是任何有机或无机酸,如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
在酶水解的情况中,水解酶可以是酯酶、脂酶或蛋白酶,如米曲霉蛋白酶、来自Diversa的ESL001-02TM,来自Nordisk的NOVO388TM(特别是制剂中的蛋白酶污染物)或来自Altus Chiroscreen KitTM的米赫毛霉脂酶。更特别地,酶是来自Amano的Protease MTM或来自Quest International的Bioprotease P concTM,两者都是来自米曲霉的蛋白酶。或者,酶可以是通过DNA或氨基酸序列编码的酶,该序列至少实质上对应于上述任一种酶的DNA或氨基酸序列或其部分序列。酶的DNA或氨基酸序列可以与上述酶的DNA或氨基酸序列具有至少70%的同源性。酶可以是固体或液体形式。
芦荟色苷A通常转化成芦荟苦素和对香豆酸而不形成副产物,如聚合物。
任何种的芦荟植物都适宜作为芦荟色苷A的来源,其可从芦荟植物的叶产生的汁液获得。汁液可以是液体或固体形式,且芦荟色苷A可以是纯化形式、部分纯化形式或可以是汁液或芦荟植物另一部分内的未纯化形式。
使用酸时的水解步骤通常在约0.5N至约10N的酸浓度范围内进行,最佳地在约2N至约5N酸的浓度下进行。浓度为约10至50%,优选约30%的有机溶剂,如乙醇或丙酮,可以任选地加入反应过程中。
水解步骤通常在约20至约121℃进行,并且使用酸时,通常在约90℃进行。使用水解酶时,水解步骤通常在约37℃进行,除了使用酶ESL001-02时,在这种情况下,水解步骤在约50至约90℃下进行,更特别是约70℃。
可以在反应介质中使用缓冲剂。缓冲剂可以是钠磷酸盐、碳酸盐或硼酸盐缓冲剂或水,或任何其他具有在约4至约8pH范围内的pKa的缓冲剂。缓冲剂浓度可为约0.01M至1M的范围,优选0.1M。
通过上述水解方法获得的芦荟苦素可以用于局部皮肤组合物中。芦荟素可以用于各种用于人和兽医市场的组合物中。
实施例:
在实施例中,使用盐酸和硫酸来展示酸水解芦荟色苷A成芦荟苦素的能力,使用米曲霉蛋白酶来展示芦荟色苷A至芦荟苦素的酶水解。
开发定量HPLC方法作为分析工具来监测在此所述的水解方法的优化过程中芦荟色苷A、芦荟苦素和对香豆酸的量。测试的详细内容和结果列于以下的实施例中。
实施例1:使用HCl和丙酮的酸水解
在丙酮存在或不存在下用1.3或5N的HCl在90℃随着时间水解含有芦荟色苷A(15%)的芦荟汁液。使用丙酮来提高芦荟汁液中底物的溶解性。以定时的间隔取出等份的反应试样(20μl),并加入100mMpH7.2的含有30%丙酮的磷酸盐缓冲剂中。使用确立的方法,通过HPLC进行样品的分析。
结果显示出水解的速率取决于酸强度,使用5N HCl时获得40%至80%的转化。10%丙酮的存在略微提高了水解。在较高的酸强度,芦荟色苷A消失的速率较大。结果还显示出在3至5N HCl,在2h内消失了90-95%芦荟色苷A。
实施例2:使用HCl或H2SO4和乙醇的酸水解
将乙醇用作丙酮的替代物。在所示时间内在50%(v/v)乙醇存在下使用1N HCl或H2SO4在90℃水解含有芦荟色苷A的芦荟提取物。芦荟提取物的量为10至50%(v/v)。在所示的时间间隔取出每个反应的等份试样(1ml),并加入0.5ml冷的丙酮中。使用确立的方法,通过HPLC进行样品的分析。
使用H2SO4作为水解酸和30%的芦荟汁液浓度,4h反应后芦荟色苷A和芦荟苦素之间的摩尔差额闭合(mole balance closures)在80%的区域内(并且在该阶段内可能更高)。H2SO4用作酸时,与HCl相比较,摩尔差额闭合高约10%,但观察到摩尔差额丧失地较快。
实施例3:使用米曲霉蛋白酶的酶水解
测试了各种条件,以便初步优化芦荟提取物或纯芦荟色苷A中的芦荟色苷A向芦荟苦素的酶水解。选择米曲霉蛋白酶作为水解酶的实例,并测试了两种米曲霉蛋白酶,一种是来自Amano的Protease MTM,另一种是来自Quest International的Bioprotease P concTM。
Protease MTM说明:
来源:米曲霉(Non-GMO)
稀释剂:土豆糊精(Non-GMO)
稀释剂含量:大约15%
Bioprotease P concTM说明:
最少400,000HUT蛋白酶u/gm
-总活菌计数<50,000/gm
-酵母&霉菌<200/gm
-大肠杆菌:25gm中不存在
-沙门氏菌:25gm中不存在
-符合所有其他国际规范
(重金属、铅、砷等),如FCC&JECFA所列出的。
以小规模研究了以下参数:
酶浓度:1至50mgl酶
芦荟提取物:每3ml15μl至200μl
缓冲剂类型:钠磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐
缓冲剂浓度:0.001M至1M
pH:4至7
Tween浓度:0、1和10%v/v
丙酮浓度:0至50%
使用芦荟汁液作为底物时,通常获得芦荟苦素浓度至少50%提高。
实施例4:使用米曲霉蛋白酶的酶水解
以每1ml反应3mg纯(91%)芦荟色苷A进行反应,使用AmanoProtease MTM或Quest Bioprotease P concTM作为酶。研究的参数是:
酶浓度:2和20mg
缓冲剂浓度:0.01M钠磷酸盐
pH:5.5
在37℃进行反应,在振荡搅拌器上进行搅拌,历经20h。实现芦荟色苷A完全转化成芦荟苦素。
对于所有的反应,将整个3ml的反应接受分析。用水∶甲醇∶THF(20∶40∶40)将样品补足至25ml并在HPLC上分析。
确定了在37℃米曲霉蛋白酶发挥功能最佳。使用上述的参数优化芦荟色苷A向芦荟苦素和对香豆酸的酶转化,并发现了其中芦荟色苷A完全转化成芦荟苦素和对香豆酸的条件。4h后,芦荟苦素含量100%增加且芦荟色苷A100%降低。因此转化完全,使用纯芦荟色苷A作为底物时具有接近100%的摩尔差额。
实施例5:芦荟苦素的大规模生产
在夹套、搅拌罐、玻璃衬里的反应器中进行反应。使用等效质量(equivalent mass)的2M HCl溶液在搅拌下水解芦荟汁液。将反应器加热至90℃并将温度维持大约5.5小时。获得的芦荟色苷转化是大约94%,向芦荟苦素的平均选择性为大约30%。
在反应结束时,通过使冷却水通过夹套而将反应器内含物冷却至70℃。使用45%苛性碱溶液(相对于酸大约0.75当量)将系统中和至大约4.5的pH。
将反应器进一步冷却至28℃,并停止搅拌。使反应混合物分成2相。水相(称为水解产物)沉降至底部而含有固体的上层(称为上层)沉积在顶部。将水解产物排至存储罐中。
在加水之前用氮气伴随搅拌一起使上层充气。然后用等效质量的水洗涤反应器的内含物。将反应器在25℃搅拌30分钟,然后再静置30分钟。
在25℃进行混合物的分离,上层保持在顶部。将水相排至存储罐中。将水洗涤物与之前排出的水解产物合并。从反应后流回收的总芦荟苦素为大约84%。
通过溶解于10%苛性碱溶液从反应器中除去剩余的固体。然后排出洗涤溶液并作为废物处理。
本发明不旨在限于在此所述的精确细节。例如,申请人设想其他水解剂也可以用于水解反应中,如为所测试的酸或酶的化学或生物等同物的酸和酶。
Claims (17)
1.从芦荟植物的芦荟苦味物质中提取芦荟苦素的方法,该方法包括步骤:
将芦荟苦味物质中的芦荟色苷A水解成芦荟苦素和对香豆酸;和
从芦荟苦味物质中选择性提取天然存在的芦荟苦素和从芦荟色苷A转化而来的芦荟苦素。
2.根据权利要求1的方法,其中芦荟植物是开普芦荟(Aloe ferox)种的芦荟植物。
3.根据权利要求1或2任一项的方法,其中通过酸水解将芦荟色苷A水解成芦荟苦素。
4.根据权利要求1或2任一项的方法,其中通过酶水解将芦荟色苷A水解成芦荟苦素。
5.根据权利要求3的方法,其中将有机酸用于酸水解。
6.根据权利要求3的方法,其中将无机酸用于酸水解。
7.根据权利要求6的方法,其中酸选自盐酸、硫酸、硝酸和磷酸。
8.根据权利要求4的方法,其中用于进行酶水解的酶选自酯酶、脂酶和蛋白酶。
9.根据权利要求4或8任一项的方法,其中酶选自米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白酶、ESL 001-02TM、NOVO 388TM和米赫毛霉(Mucor miehei)脂酶。
10.根据权利要求9的方法,其中米曲霉蛋白酶是Protease MTM或Bioprotease P concTM。
11.根据之前任一项权利要求的方法,其中芦荟色苷A转化成芦荟苦素和对香豆酸而不形成副产物。
12.根据之前任一项权利要求的方法,其中芦荟色苷A转化成芦荟苦素和对香豆酸而不形成聚合物。
13.根据权利要求3的方法,其在约0.5N至约10N酸的酸浓度范围中进行。
14.根据权利要求3的方法,其在约2至约5N酸的酸浓度范围中进行。
15.根据之前任一项权利要求的方法,其中使用缓冲剂。
16.根据权利要求3的方法,其中将有机溶剂添加至水解步骤中。
17.根据权利要求16的方法,其中有机溶剂是乙醇或丙酮。
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