WO2002030440A1 - Compositions medicinales favorisant le retablissement d'une surcharge et nouvelle souche de champignon matsutake - Google Patents

Compositions medicinales favorisant le retablissement d'une surcharge et nouvelle souche de champignon matsutake Download PDF

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stress
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hot water
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Kenichi Matsunaga
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Kureha Chemical Industry Co., Ltd.
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for promoting recovery from stress and a novel strain of Matsutake.
  • the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress according to the present invention can be administered not only as a pharmaceutical, but also in various forms, such as functional foods and health foods (including beverages), or foods and drinks as feeds. It is also possible to give in.
  • the composition for oral hygiene for example, which is temporarily contained in the mouth but is mostly exhaled from the mouth, for example, can be given in the form of a dentifrice, mouthwash, chewing gum, or gargle, or It can also be given in the form of an inhalant to be inhaled through the nose.
  • Matsutake contains various physiologically active substances.
  • Japanese Patent Publication No. 57-12330 discloses that emitanine mono-5-A, which is separated and purified from an extract obtained by extracting a liquid culture of Matsutake mycelium with hot water or a dilute solution of Arikiri, It is disclosed that Emitanin- 15-B, Emitanine- 15-C, and Emitanine- 15- have an inhibitory effect on the proliferation of sarcoma 180 cells.
  • a protein having a molecular weight of 20 to 210,000 separated from an aqueous extract of matsutake fruit body (molecular weight of subunit: 10 to 10) is disclosed. (11,000) have antitumor activity.
  • the present inventors have found that the matsutake hot water extract, the matsutake alkali solution extract, or the anion-exchange resin-adsorbed fraction of the matsutake hot water extract or mattake alkali solution extract have an immunopotentiating activity. Has already been found (Japanese Patent Application No. 2000-0-374).
  • the inventors of the present invention deliberately searched for another physiological activity other than the above-described antitumor activity or immunopotentiating activity of Matsutake, and found that Matsutake was an active ingredient exhibiting the stress load recovery promoting action. Was newly found to be included. Further, the present inventors have conducted extensive searches for the physiological activity of the novel matsutake strains, and as a result, newly found a novel matsutake strain containing an active ingredient which strongly exhibits the stress load recovery promoting action. The present invention is based on such findings. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to Matsutake [Tricholoma ma tsutake (S.I to & Ima ⁇ ) Sing.], A hot water extract of Matsutake, or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of Matsutake or an extract thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for promoting recovery from stress load, comprising a dried product and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also includes Matsutake, a hot water extract of Matsutake or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of Matsutake or a dried product thereof, alone or, if desired, with one or more food ingredients.
  • the present invention relates to a functional food for promoting recovery from stress.
  • the present invention contains a matsutake mushroom, a hot water extract of matsutake or a dried product thereof, or an extract of matsutake mushroom or a dried product thereof, and a carrier of an oral hygiene composition for promoting recovery from stress load.
  • the present invention relates to an oral hygiene composition.
  • the present invention provides a method of applying Matsutake, a hot water extract of Matsutake or a dried product thereof, or an extract of Matsutake mushroom or a dried product thereof to a stress load.
  • the present invention relates to a method for promoting recovery from stress, including administering an effective amount to a subject in need of recovery.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting recovery from stress, a function for promoting recovery from stress, of Matsutake, a hot water extract of Matsutake or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of Matsutake or a dried product thereof.
  • the present invention relates to a use for producing an oral food or an oral hygiene composition for promoting recovery from stress load.
  • the present invention also relates to Matsutake FERM BP-7304 strain, or a mycelium, culture, or fruiting body thereof.
  • the present invention relates to a hot water extract of Matsutake FERM BP-7304 strain or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of Matsutake FERM BP-7304 strain or a dried product thereof.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of electrophoresis of a PCR product obtained by the RAPD method for known Matsutake strains represented by bacterial numbers 1 to 6 shown in Table 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of a PCR product obtained by the RAPD method for known Matsutake strains represented by bacterial numbers 7 to 11 shown in Table 1.
  • Figure 3 shows the results of electrophoresis of the PCR products obtained by the RAPD method for the known Matsutake strains represented by bacterial numbers 12 to 13 shown in Table 1 and the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention. It is a photograph showing.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of electrophoresis of the PCR product obtained by the RAPD method for the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention.
  • FIG. 5 shows the activity of promoting a stress load recovery in a mixture of dry powder of hot water extract and dry powder of alkaline solution extract of Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention in a 3.2: 5.1 ratio. It is a graph shown.
  • FIG. 6 is a graph showing the stress load recovery promoting activity of each dried product powder of the Matsutake FERM BP-7304 strain and various Matsutake strains of the present invention.
  • Figure 7 shows the activity of promoting the recovery of stress load in each dry matter powder of different Matsutake strains. It is a graph which shows sex.
  • FIG. 8 is a graph showing the stress load recovery promoting activity of each dried product powder of still another Matsutake strain.
  • FIG. 9 is a graph showing the stress load recovery promoting activity of each dried product powder of still another Matsutake strain.
  • Matsutake eg, Matsutake mycelium, culture (Broth), or fruiting body
  • Matsutake hot water extract eg, Matsutake mycelium, culture (Broth), or fruiting body hot water extract
  • a dried form thereof or
  • Matsutake alkaline solution extract eg, Matsutake mycelium, culture (Broth), or fruiting body alkaline solution extract] or its dried product
  • Matsutake which is an active ingredient of the present invention, Matsutake, a hot water extract of Matsutake or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of Matsutake or a dried product thereof is used as the Matsutake mushroom.
  • the fruit body or mycelium, or the mycelium of Matsutake obtained by culturing (that is, the cultured mycelium), the culture (Broth), or the fruit body can be mentioned.
  • a new mattake strain of the present invention, Matsutake FERM BP-7304 [Trichol oma ma tsutake (S.I to & Imai) S ing. CM6271 ] Is preferably used.
  • the mycelium of Matsutake that can be used as an active ingredient in the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention is a mycelium obtained by culturing
  • a mycelium obtained by culturing is used. That is, a state where the medium is simply removed from the mixture of the cultured mycelium and the medium by an appropriate removing means (for example, filtration). It can be used in the form of a dried mycelium in which water has been removed from the mycelium after removing the medium by an appropriate means (for example, freeze-drying). The dried mycelium can also be used in the form of a crushed mycelium powder.
  • the natural mycelium can be used as it is, or water can be removed from the natural mycelium by an appropriate means (for example, freeze-drying).
  • the dried mycelium can be used in the form of a dried mycelium, and further, the dried mycelium can be used in the form of a crushed mycelium powder.
  • Examples of the culture of Matsutake (Broth) that can be used as an active ingredient in the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress according to the present invention include, for example, a mycelium obtained by culturing (that is, a cultured mycelium), a culture medium, The mixture may be used as it is, or may be used as a dried culture (Broth) obtained by removing water from the mixture by an appropriate means (for example, lyophilization). Furthermore, the culture (Broth) dried product can be used in the form of a crushed culture (Broth) dried product powder.
  • the fruit body of Matsutake that can be used as an active ingredient in the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention is, for example, a natural fruit body or a fruit body obtained by culture as it is, or It can be used in a crushed state, or it can be used in a state of a dried fruit body obtained by removing water from the fruit body by an appropriate means (for example, freeze-drying).
  • the dried fruit body can also be used in the form of a crushed dried fruit body powder.
  • the hot water extract of Matsutake is, for example, a natural fruit body or mycelium of Matsutake, or a mycelium of Matsutake obtained by culturing (ie, a cultured mycelium), a culture,
  • the temperature of the hot water used for hot water extraction is particularly limited, as long as the component contained in Matsutake mushrooms that exhibits the effect of promoting the recovery of stress load can be sufficiently extracted into the hot water extract. Although it is not a thing, the temperature is preferably 60 to 100 ° C, more preferably 80 to 98 ° C. When the mycelium or the fruiting body is used for hot water extraction, it is preferable to process the mycelium or the fruiting body into a crushed product or a powder so as to improve the extraction efficiency.
  • the extraction is preferably performed with stirring or shaking so as to improve the extraction efficiency.
  • the extraction time is determined, for example, by the state of Matsutake (ie, whether it is in a fruiting body, mycelium, or a culture, or in the case of processing into a crushed or powdered state), heat, It can be appropriately determined according to the temperature of the water, the presence or absence of stirring or shaking, or the conditions, but is usually 1 to 6 hours, preferably 2 to 3 hours.
  • the obtained hot water extract can be used as it is as an active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting the recovery of stress load of the present invention in a state in which insolubles are mixed, or after removing insolubles.
  • the extract can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress according to the present invention.
  • centrifugation of a hot water extract containing insolubles removes the insolubles, and only the resulting supernatant is used as the active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress according to the present invention.
  • the supernatant obtained by centrifuging the hot water extract containing insolubles is dialyzed to remove a low-molecular fraction (preferably a fraction having a molecular weight of 350 or less). It can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention.
  • a hot water extract for example, a hot water extract containing impurities, a supernatant obtained by centrifuging the hot water extract, or a dialysate of the supernatant, etc.
  • It can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress according to the present invention in a dried form from which water has been removed by any suitable means (for example, freeze-drying).
  • the method of producing an alkali solution extract of mattake or a dried product thereof, which is an active ingredient in the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention is, for example, the method of producing a hot water extract of matsutake described above. It can be carried out by a method according to. That is, except that an alkaline solution is used instead of hot water, it can be prepared by the same method as the above-mentioned method for producing a hot water extract of Matsutake. For example, a natural matsutake fruit body or mycelium, or a matsutake mycelium obtained by culturing (that is, a cultured mycelium), a culture (Broth), or a fruit body is treated with an alkaline solution. And can be obtained by extraction.
  • the aqueous solution used for the aqueous solution extraction is not particularly limited.
  • an alkali metal (for example, sodium or potassium) hydroxide, particularly an aqueous solution of sodium hydroxide is used.
  • the pH of the alkaline solution is preferably from 8 to 13, more preferably from 9 to 12.
  • the alkali solution extraction is preferably performed at 0 to 30 ° C, more preferably at 0 to 25 ° C.
  • the obtained alkaline solution extract can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress after the neutralization treatment, or without the neutralization treatment. Alternatively, it can be used as it is as an active ingredient of the pharmaceutical composition for promoting recovery of stress load of the present invention.
  • the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention includes matsutake [eg, matsutake mycelium, culture (Broth), or fruiting body], matsutake hot water extract [for example, matsutake mycelium, culture] (B roth) or hot water extract of fruiting body] or its dried product, or alkaline solution extract of matsutake [eg, matsutake mycelium, culture (B roth), or alkaline solution of fruiting body] Extract] or a dried form thereof can be administered to an animal, preferably a mammal (particularly a human), together with a usual pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier or diluent.
  • matsutake eg, matsutake mycelium, culture (Broth), or fruiting body
  • matsutake hot water extract for example, matsutake mycelium, culture] (B roth) or hot water extract of fruiting body] or its dried product
  • alkaline solution extract of matsutake eg,
  • the active ingredient in the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress according to the present invention a hot water extract of Matsutake or Matsutake or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of Matsutake or dried product thereof, promotes recovery from stress load. Have activity.
  • the active ingredient of the present invention can be administered in an effective amount together with a usual veterinarily acceptable carrier or diluent to a subject in need of promoting recovery from stress.
  • matsutake a hot water extract of matsutake or a dried product thereof, or an alkaline solution extract of matsutake or a dried product thereof is a pharmaceutical composition for promoting recovery from stress load, stress load.
  • Oral hygiene composition to promote recovery from stress foods or recovery from stress load Can be used to manufacture.
  • “recovery promoting activity against stress load (stress load recovery promoting activity)” refers to an activity that promotes recovery of immunity in the immune recovery period more than spontaneous recovery after release from stress load.
  • the timing of administration of the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention is not particularly limited as long as the recovery of the immunity temporarily reduced by the stress can be promoted by the administration. It can be administered before, during, or during the immune recovery phase after the stress is released.
  • stress load recovery promoting activity in the present invention is different from the mere “immune enhancing activity” previously found by the present inventors. That is, “immune enhancing activity” refers to the state before administration when an active ingredient having such activity is administered.
  • the activity seen generally means, therefore, an activity that enhances the immunity itself.
  • the “stress load recovery promoting activity J” in the present invention is, as described above, an activity that promotes the recovery of immunity during the immunity recovery period, and is therefore an activity that improves the recovery speed of immunity.
  • the immunity when the active ingredient having such activity is administered, the immunity is directly improved, whereas the drug for promoting the recovery of stress load of the present invention is improved.
  • the active ingredient in the composition, matsutake, matsutake hot water extract or its dried product, or matsutake alkali solution extract or its dried product is administered to the subject animal in advance before stress is applied.
  • immunity can be maintained without administering matsutake, a hot water extract of matsutake or its dried product, or an alkaline solution extract of matsutake or its dried product.
  • recovery of immunity is promoted.
  • the “immune enhancing activity” and the “stress load recovery promoting activity j” in the present invention are different activities.
  • the administration form of the pharmaceutical composition for promoting stress load recovery of the present invention is particularly limited.
  • oral preparations such as powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, or pills, or injections, external solutions, ointments And parenteral preparations such as suppositories, creams for topical administration, or eye drops.
  • oral preparations include, for example, gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose, soy lecithin, sucrose, fatty acid esters, talc, stearin Excipients such as magnesium acrylate, polyethylene glycol, magnesium gayate, maleic anhydride, or synthetic aluminum gayate, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, flow promoters, diluents, preservatives, It can be produced by a conventional method using a coloring agent, a flavor, a flavoring agent, a stabilizer, a humectant, a preservative, an antioxidant, or the like.
  • parenteral administration methods include injection (subcutaneous, intravenous, etc.) and rectal administration. Of these, injections are most preferably used.
  • a water-soluble solvent such as physiological saline or Ringer's solution
  • a water-insoluble solvent such as vegetable oil or a fatty acid ester, glucose or sodium chloride, etc.
  • a tonicity agent, a solubilizing agent, a stabilizer, a preservative, a suspending agent, an emulsifier, or the like can be optionally used.
  • the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention may be administered by using a sustained-release preparation technique using a sustained-release polymer or the like.
  • a sustained-release preparation technique using a sustained-release polymer or the like.
  • the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention is not limited thereto, but may be any of Matsutake, a hot water extract of Matsutake or a dried product thereof, or an extract of Matsutake mushroom or a dried product thereof. Can be contained in an amount of from 0.1 to 99% by weight, preferably from 0.1 to 80% by weight.
  • the dose when the pharmaceutical composition for promoting recovery from stress of the present invention is used can be appropriately determined according to the type of disease, the patient's age, gender, body weight, degree of symptoms, or the administration method, and the like. It can be administered orally or parenterally.
  • the administration form is not limited to pharmaceuticals, and it can be given in various forms, for example, functional foods and health foods (including beverages), or as feeds in the form of food and drink.
  • oral hygiene compositions for example, which are temporarily contained in the mouth, but which are mostly exhaled from the mouth, such as dentifrices, mouthwashes, chewing gums, or gargles, may be given.
  • it can be given in the form of an inhalant to be inhaled through the nose.
  • matsutake, hot water extract of matsutake or dried product thereof, or alkaline solution extract of matsutake or dried product thereof are used as additives (for example, food additives) as desired foods (including beverages) and feeds.
  • Dentifrice, mouthwash, chewing gum, or gargle are used as additives (for example, food additives) as desired foods (including beverages) and feeds.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention was obtained from the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (formerly, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (address: ⁇ 305—8566 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) It has been deposited at 1-chome No. 1, 1 Chuo No. 6)] since September 14, 2002.
  • This Matsutake FERM BP-7304 strain was obtained by subculturing the fruiting body tissue from Matsutake CM 6271 strain collected in Kameoka, Kyoto Prefecture, and culturing it in a test tube to obtain a mycelium subculture strain. Maintained by the Biomedical Research Institute, Inc.
  • the morphology of the fruiting body of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention is described in “Primary Color Japanese New Fungi Guidebook (I) J, Hoikusha (Osaka), published in 1987, edited by Ikuseki Rokuya and Hongo Tsujio. P late) It was in agreement with the matsutake fruiting body described on pages 15 and 77.
  • the passage of the matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention can be carried out on a slant culture medium of Ebisos agar. When the body is cultured in large amounts, it can be taken in a liquid medium and, for example, static culture, shaking culture, or tank culture can be performed.
  • the mycelium of the Matsutake F ERM BP-7304 strain of the present invention was inoculated on a shrimp agar plate medium, white hyphae grew radially and densely, and were observed with a c- scanning electron microscope, which formed large colonies.
  • the mycelium is innumerable with a thickness of 1 to 2 m, and projections of about several m are sometimes seen on the side of the mycelium.
  • Matsutake FERM BP The -7304 strain can be subcultured or maintained exclusively in the form of mycelium, but may be in the form of fruiting bodies.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention can be used in any of a potato 'glucose agar medium, a Wapec agar medium, a Sabouraud agar medium, an oatmeal agar medium, a synthetic mucole agar medium, or a phenoloxidase reaction assay medium. Even after 1 month of inoculation, almost no hyphal growth was observed.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention has a white luster and grows in a mat-like form on a YpSS agar medium. Inoculation 30 The growth distance of the eye is about 5 mm.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention has a glossy white color and grows in a mat form on a glucose-dry yeast agar medium. Inoculation 30 says the growth distance is about 2 mm.
  • a sterilized liquid medium (3 ⁇ / ⁇ glucose, 0.3; yeast extract; pH 7.0) was placed in a 10 OmL Erlenmeyer flask containing 1 OmL, and the inoculum of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention was added. 2 mg was inoculated, cultivated at various temperatures of 5 to 35 ° C., and the cells were taken out from the flask on the 28th day, washed well with distilled water, dried and weighed. As a result, the cell weight increases linearly in the range of 5 to 15 ° C. And increased slowly over the range 15-25 ° C. 27. Almost no growth occurred above 5 ° C. The optimal growth temperature is 15-25 ° C.
  • the pH of the liquid medium (3% glucose, 0.3% yeast extract) with 1 mo I ZL hydrochloric acid or 1 mo I ZL potassium hydroxide, and adjust the pH to 3.0 to 8.0.
  • the medium was prepared and the growth pH value was examined. Each medium was filter sterilized, and 1 OmL of the medium was dispensed into a sterilized 10 OmL Erlenmeyer flask. After inoculation of about 2 mg of the seed of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention, the cells were cultured at 22 ° C., and the cells were taken out of the flask, washed thoroughly with distilled water, dried, and weighed. It was measured. As a result, the growth limit of the cells was in the range of pH 3.0 to 7.0, and the optimal growth pH was 4.0 to 6.0.
  • a block (approximately 3 mm x 3 mm x 3 mm) of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention and each block (approximately 3 mm x 3 mm x 3 mm) of the 13 types of Matsutake strains shown in Table 1 described below were placed on an Ebboth agar plate medium. After inoculation at an interval of about 2 cm and culturing at 22 ° C for 3 weeks, it was determined whether or not a band was formed at the boundary between both colonies.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention did not form a clear line with any of the 13 types of Matsutake strains shown in Table 1.
  • Matsutake mushrooms it is said that no banding occurs in the confrontation culture between different strains, and none of the combinations of the 13 types of Matsutake shown in Table 1 formed a clear banding.
  • a sterilized synthetic medium for mycorrhizal fungi (Ohta et al., Trans. My co., Soc. Jpn., 31, 323, 1990) 1 O 0 m
  • a flask was inoculated with about 2 mg of a seed culture of Matsutake FERM BP-F strain 304 of the present invention, cultured at 22 ° C, the cells were removed from the flask on day 42, washed thoroughly with distilled water, and dried. When the weight was measured, 441 mg of bacterial cells were obtained.
  • the matsutake FERM of the present invention was added to each medium to which one of 28 kinds of carbohydrate-related substances was added instead of glucose, which is a carbon (C) source, in the synthetic medium for mycorrhizal fungi.
  • the BP-7304 strain was inoculated and cultured. After completion of the culture, the weight of the cells was measured. As a result, the carbohydrate-related substances having a low cell weight in order from the carbohydrate-related substances having a high cell weight are shown as follows:
  • sucrose sucrose, xylose, methyl glucoside, inulin, inositol, or sorbose.
  • the medium according to the present invention was added to each medium to which one of 15 nitrogen-related substances was added.
  • the strain FE RM BP-7304 was inoculated and cultured. After completion of the culture, the weight of the cells was measured.
  • the nitrogen-related substances having a low cell weight and the nitrogen-related substances having a low cell weight are shown in order as follows:
  • a matsutake FE RM BP-7304 strain of the present invention was inoculated and cultured in a medium from which a specific component was removed from the minerals and vitamins in the synthetic medium. was measured.
  • magnesium sulfate-seven Removal of one of the hydrates, iron chloride (II), or potassium dihydrogen phosphate from the medium significantly reduced the bacterial weight. That is, magnesium, iron, phosphorus, and potassium are considered to be essential for the growth of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention has a GC content of 49.9% (see Analysis Example 2 described later).
  • Example 1 Preparation of dry powder of Matsutake FERM BP-7304 strain
  • Matsutake FERM BP-7304 strain mycelium was inoculated into 10 50 OmL triangular flasks containing 10 OmL of sterilized medium (3% glucose, 0.3% yeast extract, pH 6.0). The culture was performed at 22 ° C for 4 weeks in a shaking incubator at 250 rpm. The obtained culture was filtered through a filter cloth to separate mycelia, and then sufficiently washed with distilled water. After freezing at a temperature of 60 ° C., freeze-drying was performed using a freeze dryer (MINI FAST MOD. D O. 5; Edwards) to obtain 10.1 g of a dried mycelium. C by grinding using; (Osaka Chemical Co. Wo nder B lender), to obtain a dried powder 9. 8 g The resulting mycelium Homopurenda Example 2: Preparation of dry powders of hot water extract and alkaline solution extract of Matsutake FERM BP-7304 strain
  • This operation was performed three times in total, and all the supernatants were put together, put into a dialysis membrane (Spectra ZPor 3 Membrane, molecular weight fraction: 3500 fraction), and dialyzed for 2 days in running tap water.
  • the solution in the dialysis membrane was concentrated by a rotary evaporator and then freeze-dried to obtain 1. O g of a dry powder of a hot water extract.
  • Example 5 Preparation of dried powder of hot water extract of matsutake fruit body from Nagano Prefecture
  • Example 4 Except for using the fruit body of Nagatake Prefecture instead of the fruit body of Iwate Prefecture, the procedure of Example 4 was repeated as it was to obtain a dried powder of hot water extract of the body of Matsutake fruit body. .5 g were obtained.
  • Comparative Example 1 Preparation of dry powder of hot water extract of Agaricus blazei fruiting body
  • Example 4 The procedure of Example 4 was repeated as it was, except that a commercially available Agaricusb I azei fruit body was used instead of the matsutake fruit body from Iwate Prefecture, to obtain the Agaricus blazei fruit body. 3.6 g of a dried powder of the hot water extract was obtained.
  • Example 4 was repeated except that a commercially available Ganoderma lucidum fruit body [G anode rma I ucidum (Fr.) Ka rst] was used in place of the Iwate Prefecture matsutake fruit body. By repeating the procedure as it was, 2.4 g of a dry powder of the hot water extract of the Reishi fruit body was obtained.
  • a commercially available Ganoderma lucidum fruit body [G anode rma I ucidum (Fr.) Ka rst] was used in place of the Iwate Prefecture matsutake fruit body.
  • Example 4 The procedure of Example 4 was repeated as it was, except that a commercially available shiitake mushroom body [Lentinusedodes (Berk.) Sing. A dried product of a hot water extract of the substance, 1.4 g of powder was obtained.
  • the matsutake FE RM BP-7304 of the present invention each of which is generated by the RAPD randomamplified polymorphic DNA (RAPD) method using each of six different primers (1 Omer) for PCR (pol ym erase chain reaction) alone.
  • the DNA pattern of the strain was compared to each DNA pattern of several known Matsutake strains.
  • Table 1 also shows the average value of 10 strains) and the origin of each Matsutake strain (establishment facility).
  • Primer RAP D 1 (base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in sequence listing: TGGTCA CCG A);
  • a primer RAPD2 (base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing: AGCGCC ATTG);
  • Primer RAPD3 (base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in Sequence Listing: TTCGAG CCAG);
  • Primer RAPD4 (base sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing: TGCGTG CTTG);
  • Primer RAP D 5 (base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing: G ACT AG CCTC);
  • Primer RAPD6 (base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in sequence listing: CTCACC GT CO
  • the DNA to be used is a commercially available DNA preparation kit (Dneasy P
  • the tube was inverted 2-3 times to mix. After the reaction was completed, buffer AP 2 (130 / L) was added to the reaction product, and the mixture was left under ice cooling for 5 minutes. The contents of the tube were then loaded into a column (QIAshredderrsincoIumn) and the column was placed in a 2 mL test tube and centrifuged at 15000 rpm for 2 minutes. After centrifugation, the solution that had passed through the column and accumulated at the bottom of the test tube was transferred to another test tube, and the liquid volume was measured. At this time, the cell debris at the bottom of the test tube was never touched.
  • the mixture was placed in a 2 mL test tube and centrifuged at 8000 rpm for 1 minute.
  • the column after centrifugation was charged with buffer AW (500 ⁇ L), the column was placed in a 2 mL test tube, centrifuged at 8000 rpm for 1 minute, and the solution at the bottom of the test tube was discarded. .
  • the above column was charged with buffer AW (500 L), and the column was placed in a 2 mL test tube, centrifuged at 15000 rpm for 2 minutes, and the solution at the bottom of the test tube was discarded. .
  • prepare a new test tube set the washed column, and keep it at 65 ° C.
  • the heated buffer AE (1 OO L) was charged, left at room temperature for 5 minutes, and then centrifuged at 8000 rpm for 1 minute to collect the DNA solution at the bottom of the test tube. The same operation was repeated once more, and a total of about 200 // DNA solution was recovered. 20 / L of the obtained DNA was subjected to 1 ⁇ agarose gel electrophoresis to confirm the amount and purity of the recovered DNA.
  • a cycle consisting of 45 cycles (provided that prior to the first cycle, a preliminary denaturation step at 94 ° C (2 minutes) was performed, followed by the final 45th cycle). After this cycle, a final extension step (2 minutes) is performed].
  • the reaction solution shown in Table 2 E x Ta q TM buffer, Ta Ka Ra Ex
  • T a q TM, and T a q S tart antibodies were mixed with 2-3 seconds after, distilled water, 1 0 XEX Ta q TM buffer, d NTP, and primers were added, and finally adding a DNA solution Prepared by Reaction solution (per tube)
  • FIGS. 1 to 4 DNA patterns obtained by separating the obtained PCR products by agarose gel electrophoresis are shown in FIGS. 1 to 4.
  • FIG. 1 shows the DNA patterns of the comparative strains represented by bacterial numbers 1 to 6 in Table 1
  • FIG. 2 shows the DNA patterns of the comparative strains represented by bacterial numbers 7 to 11 in Table 1.
  • FIG. 3 shows bacterial numbers 1 2 in Table 1.
  • 13 shows the DNA pattern of the comparative strain represented by No. 13 and the DNA pattern of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention.
  • FIG. 4 shows the DNA pattern of the Matsutake FER MBP-7304 strain of the present invention. Is shown.
  • the lane indicated by a circled number “1” in FIG. 1 shows the results of the strain of bacterial number 1 in Table 1, ie, the IFO 6915 strain.
  • the lane indicated by the circled number “14” in FIG. 3 shows the result of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention.
  • RAPD 1J to RAPD6J mean primers RAPD 1 to RAPD6.
  • Lanes 1 to 6 in FIG. 4 show the results of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention when the respective primers RAPD 1 to RAP D6 were used.
  • the symbol “M” in FIGS. 1 to 4 means a DN 4 molecular weight marker.
  • the same DNA molecular weight marker (1 kb DNAIadre, Catarowa number 1541 5-018, LifeTecnhologies, GIBCO-BRL, USA) was used.
  • FIG. 1 kb DNAIadre Catarowa number 1541 5-018, LifeTecnhologies, GIBCO-BRL, USA
  • the band indicated by arrow A is a DNA fragment of 4072 bp
  • the band indicated by arrow B is a DNA fragment of 3054 bp
  • the band indicated by arrow C is a DNA fragment of 2036 bp and a DNA fragment of 1636 bp.
  • the band indicated by arrow D is a 1018 bp DNA fragment
  • the band indicated by arrow E is 517 bp, 506 bp, 396 bp, 344 bp, and 298.
  • Each DNA fragment of bp overlaps.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention exhibited a DNA pattern different from any of the 13 types of comparative Matsutake strains shown in Table 1.
  • the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention is composed of 31 types of Matsutake strains other than the 13 types of comparative Matsutake strains shown in Table 1, namely, MA FF 460031, MAF F 460033, M AFF 460034 % MA FF 460035, MA FF 460036, M AFF 460037, MAF F 460038.
  • MA FF 460040, MAFF 460041, MA FF 460042, MA FF 460046, MAFF 460050, and MA FF 460096 (above, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Institute of Agricultural and Biological Resources), CM 627-3, CM 627 — 5, CM 62 Fu 6, and CM 627— 7 [or more, Kureha Chemical Industry Co., Ltd.], and IFO 6929, IFO 6931, IFO 6932, IFO 6934, IFO 6916, IFO 691 7, IFO 6918, IFO 6919, IFO 6921, IFO 6922, IFO 6923, IFO 6924, IFO 6926, and IFO 6928 [or more, Fermentation Research Institute] DNA pattern It was different.
  • the crude DNA was recovered from the obtained supernatant by the ethyl alcohol precipitation method, and then washed with 70 to 90% ethyl alcohol.
  • the obtained precipitate was redissolved in 5 mL of a citrate buffer and treated with RNase. Next, a small amount of phenol was added to the RNase-treated solution. After stirring, the phenol layer was removed by centrifugation.
  • the crude DNA was recovered from the supernatant again by the ethyl alcohol precipitation method, washed with 70 to 90% ethyl alcohol, and then subjected to a second RNase treatment.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the obtained purified DNA solution (100 L) was heat-treated at 100 ° C for 10 minutes, cooled on ice, treated with nuclease P1 at 50 ° C for 1 hour, and decomposed into nucleotides.
  • the GC content was quantified by a high performance liquid chromatogram (LC-16A; Shimadzu Corporation).
  • IZL ammonium phosphate solution (pH about 4.5) was used.
  • the injection volume was 10 jUL, detection was performed at a wavelength of 270 nm, and peak identification was performed by the absolute retention time method.
  • the modified percentage method was used as the quantification method.
  • the GC content of Matsutake FERM BP-7304 strain was 49.9%.
  • Evaluation Example 1 Evaluation of recovery promoting activity against stress load
  • the dried powder of the hot water extract and the dried powder of the Arikari solution extract of Matsutake FERM BP-7304 strain prepared in Example 2 were each used in a ratio of 3.2: 5.1.
  • the mixed mixture was used as an evaluation sample, and this evaluation sample was orally administered to a mouse for 4 weeks. Then, a restraint stress was applied for 18 hours, and the natural killer (NK) cell activity after the release of the stress was measured. The effect of the sample was examined.
  • mice were removed from the breeding cage, and the mice were confined one by one in a polypropylene cap centrifugal tube (catalog number: 2341-050; Technoglass Co., Ltd.) with a 50 mL cap with an air vent hole.
  • the mouse trapped in this tube was unable to move.
  • the tubes were then returned to their breeding cages and left for 18 hours, Restrained stress was given. After a stress load of 18 hours, the mouse was removed from the tube, returned to the breeding cage, and bred under a normal environment.
  • mice After the release of the restraint stress, the mice were sacrificed after a predetermined number of days [0 (immediately after release), 1 day, 3 days, 5 days, 7 days, and 14 days], and the test was performed according to the following procedure.
  • Natural killer (NK) cell activity was assessed by measuring the cytotoxic activity of lymph node cells against the NK-sensitive tumor cell line YAC-1 in vitro.
  • the spleen and mesenteric lymph node were aseptically removed from the mouse, and transferred to a sterile petri dish containing Hanks Balanced Salt Solution. After loosening the lymph nodes with scissors and tweezers, a single cell solution of lymphocytes was prepared through a mesh. 10% fetal bovine serum (Heat treatment at 56 ° C for 30 minutes) Addition Wash the cells three times with RPMI 1640 medium, then add 10% fetal bovine serum (heat treatment at 56 ° C for 30 minutes) 5 ⁇ 10 6 cells in RPMI 1640 medium supplemented with 4- (2-hydroxyethyl) 1-1-piperazineethanesulfonic acid and 20 jmol g gentamicin, respectively.
  • the cell suspension obtained by adjusting the volume to mL was used as effector cells.
  • YAC-1 cells used as target cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (heat treated at 56 ° C for 30 minutes). It has been maintained for several years. Radioactive sodium oxalate (Amersham Japan) was added to the YAC-1 cells and reacted at 37 ° C. for 20 minutes to remove unbound c- sodium radiochromate from 10% fetal bovine serum (56 ° C). in the heat treatment for 30 minutes embodiment) is removed by washing three times with the addition RPM I 1 640 medium and adjusted radioactive chromium-labeled tumor cells in 5 X 1 0 4 or Bruno mL.
  • the specific injury rate (S. c. Specific Lysis) is calculated by the formula:
  • B f is the spontaneous free group (ie, , The radioactivity (unit-Bq) of the supernatant in the culture group of radiochromium-labeled tumor cells alone
  • B max is the supernatant in the maximum free group (ie, the group of radiochromium-labeled tumor cells treated with Triton) Is the radioactivity (unit-Bq) of
  • Fig. 5 shows the results.
  • a control (healthy group) test the above procedure was repeated except that distilled water was orally administered for 4 weeks instead of the evaluation sample aqueous solution, and that no 18-hour restraint stress was given. Repeated as it was.
  • a comparative test the above procedure was repeated except that distilled water was orally administered for 4 weeks instead of the evaluation sample aqueous solution.
  • the line a indicates the results of the test (non-stress) in the subject (healthy group), and the line b (black circle) indicates the evaluation sample (Matsutake FE RM BP-7304 strain) according to the present invention.
  • 3.2 5.1 mixture of dried water extract powder and dried powder of Arikari solution extract) The result when an aqueous solution was administered is shown. The results of a comparative test (administration of distilled water and stress load) are shown. Further, in FIG.
  • NK cell activity Is significantly reduced.
  • the NK cell activity gradually recovers even when left as it is after the release of the restraint stress, but as shown by the line b, the powder of the dried hot water extract of Matsutake F ERM BP-7304 strain The recovery of NK cell activity was significantly accelerated by adding a mixture in a ratio of 3.2: 5.1 to the dried powder of the extract of the Arikari solution.
  • Matsutake FE RM BP Instead of a mixture of dry powder of hot water extract of 7304 strain and powder of dry extract of Arikiri solution in a ratio of 3.2: 5.1, Matsutake prepared in Example 1 above
  • F ERM BP Dried powder of strain 7304 (50 mg / kg / day), commercially available dried powder of matsutake fruit body from Iwate Prefecture prepared in Example 3
  • Table 3 shows the results.
  • the symbol “*” indicates that p ⁇ 0.01 (for distilled water administration).
  • Matsutake FERM BP instead of a mixture of dried powder of hot water extract of 7304 strain and dry powder of alkaline solution extract in the ratio of 3.2: 5.1, Matsutake F ERM BP prepared in Example 1 above — Except for using the dried powder of the 7304 strain (50 mg Zkg gay) and the dry powder of the five Matsutake strains shown in Table 1 (5 OmgZk gZday) used in Analysis Example 1 above, Evaluation example 1
  • the line c shows the result of the Matsutake FERM BP-7304 strain of the present invention
  • the line d shows the result of the Matsutake strain IFO6915
  • the line e shows the results for Matsutake strain IFO 6925.
  • the line f indicates the result of Matsutake IFO 6930
  • the line g indicates the result of Matsutake IFO 6935
  • the line h indicates the Matsutake strain.
  • the results of CM 627-2 are shown
  • the line i shows the results of Matsutake CM 627-4.
  • line j indicates the result of Matsutake strain IFO 30604
  • line k indicates the result of Matsutake strain IFO30605
  • line I indicates the result of Matsutake strain IFO30605.
  • the result of FO 30606 is shown, and the line m (open circle) shows the result of Matsutake strain MAFF 460039.
  • the operation of Evaluation Example 1 (1) was repeated as it was, except that each dried product of the hot water extract was used as a sample for evaluation.
  • the dose was 25 OmgZk gZd ay in each case.
  • Table 5 shows the results. In Table 5, No. B “*” indicates p ⁇ 0.01 (for distilled water administration).

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Description

明 細 書 ストレス負荷回復促進用医薬組成物及び新規マツタケ株 技術分野
本発明は、 ストレス負荷回復促進用医薬組成物及び新規マツタケ株に関する。 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、 医薬品として投与することがで きるだけでなく、 種々の形態、 例えば、 機能性食品や健康食品 （飲料を含む） 、 又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。 更には、 オーラル衛生用 組成物、 例えば、 口中に一時的に含むものの、 そのほとんどを口中より吐き出す 形態、 例えば、 歯磨剤、 洗口剤、 チューインガム、 又はうがい剤の形で与えるこ とも、 あるいは、 鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。 背景技術
マツタケには種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、 例えば、 特公昭 5 7 - 1 2 3 0号公報及び特許第 2 7 6 7 5 2 1号明細書には、 マツタケ に含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。 前記特公昭 5 7— 1 2 3 0 号公報には、 マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アル力リ溶液で抽出して 得られる抽出液から分離精製されたエミタニン一 5— A、 エミタニン一 5— B、 エミタニン一 5— C、 及びエミタニン一 5—りに、 サルコ一マ 1 8 0細胞の増殖 阻止作用があることが開示されている。 また、 前記特許第 2 7 6 7 5 2 1号明細 書には、 マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量 2 0〜 2 1万のタ ンパク質 （サブユニットの分子量- 1 0〜 1 1万） が抗腫瘍活性を有することが 開示されている。
更に、 本発明者は、 マツタケ熱水抽出液、 マツタケのアルカリ溶液抽出液、 あ るいは、 マツタケ熱水抽出液又はマッタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹 脂吸着画分が、 免疫増強活性を有することを既に見出している （特願 2 0 0 0— 3 7 4号） 。
ところで、 ストレスは、 心身症などの社会生活適応障害を引き起こすだけでな く、 生活習慣病などの発症及び進行の引き金にもなりうることが知られている。 ストレスに晒されたときの心身変化に対しては、 対症療法的に抗不安薬 （精神安 定剤） や漢方薬が処方されているものの、 ストレスに伴う免疫機能変化に対する 有効な対処方法は現在模索中といえる。 本発明者が知る限りにおいて、 ストレス 負荷から開放された後、 自発的な免疫力の回復を促進する作用 （すなわち、 スト レス負荷回復促進作用） を示す食品も知られていないし、 食品中に前記ストレス 負荷回復促進作用を示す物質が存在することも知られていない。
本発明者は、 マツタケについて、 既に知られている前記の抗腫瘍活性又は免疫 増強活性以外の更に別の生理活性を銳意探索したところ、 マツタケには、 前記ス トレス負荷回復促進作用を示す活性成分が含まれていることを新たに見出した。 また、 本発明者が発見した新規マツタケ株の生理活性を鋭意探索したところ、 前 記ス卜レス負荷回復促進作用を強く示す活性成分を含む新規マツタケ株を新たに 見出した。 本発明はこのような知見に基づくものである。 発明の開示
従って、 本発明は、 マツタケ [T r i c h o l oma ma t s u t a k e (S. I t o & I ma ί ) S i n g. ] 、 マツタケの熱水抽出液若しくはそ の乾燥体、 又はマツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体と、 薬剤学的 に許容することのできる担体とを含有する、 ストレス負荷に対する回復促進用の 医薬組成物に関する。
また、 本発明は、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又は マツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 1又はそれ以上の食品成分と共に含有する、 ストレス負荷に対する回 復促進用の機能性食品に関する。
また、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 叉はマツタケの アル力リ溶液抽出液若しくはその乾燥体と、 オーラル衛生用組成物の担体とを含 有する、 ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物に関する。 また、 本発明は、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又は マツタケのアル力リ溶液抽出液若しくはその乾燥体を、 ス卜レス負荷に対する回 復促進が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 ストレス負荷に対する回 復促進方法に関する。
また、 本発明は、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又は マツタケのアルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体の、 ストレス負荷に対する回 復促進用医薬組成物、 ストレス負荷に対する回復促進用機能性食品、 あるいは、 ス卜レス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するための使用 に関する。
また、 本発明は、 マツタケ FERM BP— 7304株、 あるいは、 その菌糸 体、 培養物、 又は子実体に関する。
更に、 本発明は、 マツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液又はその 乾燥体、 あるいは、 マツタケ FERM BP— 7304株のアルカリ溶液抽出液 又はその乾燥体に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 表 1に記載の菌番号 1〜 6で表される公知のマツタケ株に関して、 R A P D法によリ得られた P C R産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図 2は、 表 1に記載の菌番号 7〜1 1で表される公知のマツタケ株に関して、 RAP D法によリ得られた P C R産物の電気泳動の結果を示す写真である。 図 3は、 表 1に記載の菌番号 1 2〜1 3で表される公知のマツタケ株及び本発 明のマツタケ FERM BP— 7304株に関して、 RAPD法により得られた P C R産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図 4は、 本発明のマツタケ FERM B P— 7304株に関して、 RAPD法 によリ得られた P C R産物の電気泳動の結果を示す写真である。
図 5は、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液乾燥物粉 末とアルカリ溶液抽出液乾燥物粉末との 3. 2 ： 5. 1の比率の混合物における ストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
図 6は、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株及び各種マツタケ株の 各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促進活性を示すグラフである。
図 7は、 別の各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促進活 性を示すグラフである。
図 8は、 更に別の各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促 進活性を示すグラフである。
図 9は、 更に別の各種マツタケ株の各乾燥物粉末におけるストレス負荷回復促 進活性を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明のス卜レス負荷回復促進用医薬組成物は、
(1 ) マツタケ [例えば、 マツタケの菌糸体、 培養物 （B r o t h) 、 又は子実 体] 、
(2) マツタケの熱水抽出液 [例えば、 マツタケの菌糸体、 培養物 （B r o t h) 、 又は子実体の熱水抽出液] 又はその乾燥体、 あるいは、
(3) マツタケのアルカリ溶液抽出液 [例えば、 マツタケの菌糸体、 培養物 （B r o t h) 、 又は子実体のアルカリ溶液抽出液] 又はその乾燥体
の少なくとも 1つを、 有効成分として含有し、 更に、 薬剤学的又は獣医学的に許 容することのできる通常の担体又は希釈剤を含有する。
本発明の有効成分である、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を調製するのに用いる 前記マツタケとしては、 例えば、 天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、 又は 培養により得られるマツタケの菌糸体 （すなわち、 培養菌糸体） 、 培養物 （B r o t h) 、 若しくは子実体を挙げることができる。 ストレス負荷回復促進作用を 強く示す活性成分を含む点で、 本発明の新規マッタケ株であるマツタケ FERM BP— 7304株 [T r i c h o l oma ma t s u t a k e (S. I t o & I ma i ) S i n g. CM6271] を用いることが好ましい。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分として用いるこ とのできるマツタケの菌糸体としては、 培養により得られる菌糸体を使用する場 合には、 例えば、 培養により得られる菌糸体 （すなわち、 培養菌糸体） と培地と の混合物から適当な除去手段 （例えば、 濾過） により培地を除去しただけの状態 で使用することもできるし、 あるいは、 培地を除去した後の菌糸体から適当な手 段 （例えば、 凍結乾燥） で水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することも できるし、 更には、 前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用 することもできる。 また、 天然の菌糸体を使用する場合には、 例えば、 天然の菌 糸体をそのまま使用することもできるし、 あるいは、 天然の菌糸体から適当な手 段 （例えば、 凍結乾燥） で水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することも できるし、 更には、 前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用 することもできる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分として用いるこ とのできるマツタケの培養物 （B r o t h) としては、 例えば、 培養により得ら れる菌糸体 （すなわち、 培養菌糸体） と培地との混合物の状態でそのまま使用す ることもできるし、 あるいは、 前記混合物から適当な手段 （例えば、 凍結乾燥） で水分を除去した培養物 （B r o t h) 乾燥物の状態で使用することもできるし、 更には、 前記培養物 （B r o t h) 乾燥物を粉砕した培養物 （B r o t h) 乾燥 物粉末の状態で使用することもできる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分として用いるこ とのできるマツタケの子実体としては、 例えば、 天然の子実体又は培養により得 られる子実体をそのままで、 あるいは、 前記子実体を破砕した状態で使用するこ ともできるし、 あるいは、 前記子実体から適当な手段 （例えば、 凍結乾燥） で水 分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもできるし、 更には、 前記子実 体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
マツタケの熱水抽出液は、 例えば、 天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、 又は培養により得られるマツタケの菌糸体 （すなわち、 培養菌糸体） 、 培養物
(B r o t h) 、 若しくは子実体を、 熱水で抽出することにより得ることができ る。
熱水抽出に用いる熱水の温度は、 マツタケに含有されるストレス負荷回復促進 作用を示す成分が、 熱水抽出液中に充分に抽出されることのできる温度である限 リ、 特に限定されるものではないが、 60~100°Cであることが好ましく、 8 0〜98°Cであることがより好ましい。 菌糸体又は子実体を熱水抽出に用いる場合には、 抽出効率が向上するように、 破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
また、 抽出の際には、 抽出効率が向上するように、 撹拌又は振盪しながら実施 することが好ましい。 抽出時間は、 例えば、 マツタケの状態 （すなわち、 子実体、 菌糸体、 又は培養物のいずれの状態であるか、 あるいは、 破砕物又は粉体の状態 に加工した場合にはその加工状態） 、 熱水の温度、 又は撹拌若しくは振盪の有無 若しくは条件に応じて、 適宜決定することができるが、 通常、 1〜6時間であり、 2〜 3時間であることが好ましい。
得られた熱水抽出液は、 不溶物が混在する状態で、 そのまま、 本発明のストレ ス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることもできるし、 あるいは、 不溶物を除去してから、 あるいは、 不溶物を除去し、 更に、 抽出液中の低分子画 分を除去してから、 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分とし て用いることもできる。 例えば、 不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離するこ とによリ不溶物を除去し、 得られる上清のみを、 本発明のストレス負荷回復促進 用医薬組成物の有効成分として用いることができる。 あるいは、 不溶物が混在す る熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、 低分子画分 （好ましく は分子量 3 5 0 0以下の画分） を除去してから、 本発明のストレス負荷回復促進 用医薬組成物の有効成分として用いることができる。 更には、 熱水抽出液 （例え ば、 不純物が混在する熱水抽出液、 前記熱水抽出液を遠心分離して得られる上清、 あるいは、 前記上清の透析物などを含む） から、 適当な手段 （例えば、 凍結乾 燥） で水分を除去した乾燥体の状態で、 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組 成物の有効成分として用いることができる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分である、 マッタ ケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体の製法は、 例えば、 先に説明した、 マツ タケの熱水抽出液の製造方法に準じた方法により実施することができる。 すなわ ち、 熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、 マツタケの熱水抽出液の 前記製造方法と同様の方法により、 調製することができる。 例えば、 天然のマツ タケの子実体若しくは菌糸体、 又は培養により得られるマツタケの菌糸体 （すな わち、 培養菌糸体） 、 培養物 （B r o t h ) 、 若しくは子実体を、 アルカリ溶液 で抽出することにより得ることができる。
アル力リ溶液抽出に用いるアル力リ溶液としては、 特に限定されるものではな いが、 例えば、 アルカリ金属 （例えば、 ナトリウム又はカリウム） の水酸化物、 特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。 前記アル力リ溶液の p Hは、 8〜 1 3であることが好ましく、 9〜 1 2であることがより好ましい。 ァ ルカリ溶液抽出は、 0〜3 0 °Cで実施することが好ましく、 0〜2 5 °Cで実施す ることがより好ましい。 得られたアルカリ溶液抽出液は、 中和処理を実施してか ら、 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることも できるし、 あるいは、 中和処理を実施することなく、 そのまま、 本発明のス卜レ ス負荷回復促進用医薬組成物の有効成分として用いることもできる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、 マツタケ [例えば、 マツタケ の菌糸体、 培養物 （B r o t h ) 、 又は子実体] 、 マツタケの熱水抽出液 [例え ば、 マツタケの菌糸体、 培養物 （B r o t h ) 、 又は子実体の熱水抽出液] 又は その乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液 [例えば、 マツタケの菌 糸体、 培養物 （B r o t h ) 、 又は子実体のアルカリ溶液抽出液] 又はその乾燥 体を、 薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共 に、 動物、 好ましくは哺乳動物 （特にはヒト） に投与することができる。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物における有効成分である、 マッタ ケ、 マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液 抽出液又はその乾燥体は、 ストレス負荷に対する回復促進活性を有する。
従って、 本発明における有効成分である、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液又 はその乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体は、 そ れ単独で、 あるいは、 好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる 通常の担体又は希釈剤と共に、 ストレス負荷に対する回復促進が必要な対象に、 有効量で投与することができる。
また、 本発明における有効成分である、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液又は その乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体は、 スト レス負荷に対する回復促進用医薬組成物、 ストレス負荷に対する回復促進用機能 性食品、 あるいは、 ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を 製造するために使用することができる。
一般に、 動物に対して、 単発的に、 あるいは、 或る期間に亘つてストレスを与 えると、 通常、 その動物における免疫能は低下するが、 前記ストレス負荷から解 放されると、 自発的な免疫力の回復が起こる。 本明細書における 「ストレス負荷 に対する回復促進活性 （ストレス負荷回復促進活性） 」 とは、 ストレス負荷から 開放した後、 免疫力回復期における免疫力の回復を、 自発的な回復よりも促進す る活性を意味する。
本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の投与時期は、 ストレス負荷によ リ一時的に低下した免疫力を、 その投与により回復促進可能である限り、 特に限 定されるものではなく、 例えば、 ストレス負荷の前、 ストレス負荷中、 及び 又 はストレス負荷から開放した後の免疫力回復期に投与することができる。
なお、 本発明における前記 「ストレス負荷回復促進活性」 は、 本発明者が先に 見出した前記の単なる 「免疫増強活性」 とは異なる。 すなわち、 「免疫増強活 性」 とは、 そのような活性を有する有効成分を投与した場合に、 投与前の状態
(ストレスの負荷がなく、 免疫力が通常の状態であることもできるし、 あるいは、 ストレス負荷により、 免疫力が低下している状態であることもできる） と比較し て、 免疫力の向上がみられる活性を一般に意味し、 従って、 免疫力それ自体を向 上させる活性である。 一方、 本発明における 「ストレス負荷回復促進活性 J とは、 前述のように、 免疫力回復期における免疫力の回復を促進する活性であって、 従 つて、 免疫力の回復速度を向上させる活性である。 本発明のストレス負荷回復促 進用医薬組成物を投与すると、 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物を投 与しない場合と比較して、 免疫力の回復速度が上昇する。
更には、 「免疫増強活性」 においては、 そのような活性を有する有効成分を投 与すると、 直接的に、 免疫力の向上がみられるのに対して、 本発明のストレス負 荷回復促進用医薬組成物における有効成分である、 マツタケ、 マツタケの熱水抽 出液又はその乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体 を、 予め、 ストレスを負荷する前に対象動物に投与しておくと、 ストレス負荷中 及び免疫力回復期中に、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、 ある いは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を投与しなくても、 免疫力 回復期において免疫力の回復が促進される。 この点においても、 「免疫増強活 性」 と本発明における 「ストレス負荷回復促進活性 j とは、 異なる活性である。 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物の投与剤型としては、 特に限定が なく、 例えば、 散剤、 細粒剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 懸濁液、 ェマルジョ ン剤、 シロップ剤、 エキス剤、 若しくは丸剤等の経口剤、 又は注射剤、 外用液剤、 軟膏剤、 坐剤、 局所投与のクリーム、 若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げるこ とができる。
これらの経口剤は、 例えば、 ゼラチン、 アルギン酸ナトリウム、 澱粉、 コーン スターチ、 白糖、 乳糖、 ぶどう糖、 マンニット、 カルボキシメチルセルロース、 デキストリン、 ポリビニルピロリドン、 結晶セルロース、 大豆レシチン、 ショ糖、 脂肪酸エステル、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 ポリエチレングリコール、 ゲイ酸マグネシウム、 無水ゲイ酸、 又は合成ゲイ酸アルミニウムなどの賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 希釈剤、 保存剤、 着色剤、 香料、 矯味剤、 安定化剤、 保湿剤、 防腐剤、 又は酸化防止剤等を用いて、 常法に 従って製造することができる。
非経口投与方法としては、 注射 （皮下、 静脈内等） 、 又は直腸投与等が例示さ れる。 これらのなかで、 注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、 注射剤の調製においては、 有効成分の他に、 例えば、 生理食塩水若し くはリンゲル液等の水溶性溶剤、 植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶 剤、 ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防 腐剤、 懸濁化剤、 又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、 徐放性ポリマーなどを 用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。 例えば、 本発明のストレス負 荷回復促進用医薬組成物をェチレンビニル酢酸ポリマーのぺレットに取リ込ませ て、 このペレツ卜を治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる c 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物は、 これに限定されるものではな いが、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液又はその乾燥体、 あるいは、 マツタケの アル力リ溶液抽出液又はその乾燥体を、 0 . 0 1〜 9 9重量％、 好ましくは 0 . 1〜 8 0重量％の量で含有することができる。 本発明のストレス負荷回復促進用医薬組成物を用いる場合の投与量は、 病気の 種類、 患者の年齢、 性別、 体重、 症状の程度、 又は投与方法などに応じて適宜決 定することができ、 経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、 投与形態も医薬品に限定されるものではなく、 種々の形態、 例えば、 機 能性食品や健康食品 （飲料を含む） 、 又は飼料として飲食物の形で与えることも 可能である。 更には、 オーラル衛生用組成物、 例えば、 口中に一時的に含むもの の、 そのほとんどを口中より吐き出す形態、 例えば、 歯磨剤、 洗口剤、 チューィ ンガム、 又はうがい剤の形で与えることも、 あるいは、 鼻から吸引させる吸入剤 の形で与えることも可能である。 例えば、 マツタケ、 マツタケの熱水抽出液又は その乾燥体、 あるいは、 マツタケのアルカリ溶液抽出液又はその乾燥体を、 添加 剤 （例えば、 食品添加剤） として、 所望の食品 （飲料を含む） 、 飼料、 歯磨剤、 洗口剤、 チューインガム、 又はうがい剤等に添加することができる。
本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センター [ (旧） 工業技術院生命工学工業技術研究所 （あて 名： 〒 305— 8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) ] に平成 1 2年 9月 1 4日より寄託しているものである。 このマツタケ FERM BP— 7304株は、 京都府亀岡市で採取したマツタケ CM 6271株から子実 体組織を切り出し、 試験管内で培養することにより、 菌糸体継代株を得たもので あり、 呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で維持している。
本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の子実体の形態は、 今関六也■ 本郷次雄編の 「原色日本新菌類図鑑 （ I ) J 、 保育社 （大阪） 、 昭和 62年発行、 プレー卜 （P l a t e) 1 5及び 77頁記載のマツタケ子実体に合致するもので あった。 本発明のマツタケ FERM B P— 7304株の継代は、 ェビォス寒天 斜面培地で実施することができる。 前記菌株の菌糸体を大量培養する場合には、 液体培地に摂取し、 例えば、 静置培養、 振とう培養、 又はタンク培養により実施 することができる。
本発明のマツタケ F ERM BP— 7304株の菌糸体をェビ才ス寒天平板培 地に接種すると、 白色の菌糸が放射状に密に生育し、 大きなコロニーを形成する c 走査型電子顕微鏡で観察すると、 太さ 1〜2 mの枝状の菌糸体が無数に存在し, 菌糸体側部に数〃 m程の突起物が時々みられる。 なお、 マツタケ FERM BP -7304株は、 もっぱら菌糸体の形状で継代維持又は培養することが可能であ るが、 子実体の形状となることもある。
以下、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の菌学的性質について説 明する。
(1 ) 麦芽エキス寒天培地における培養的■形態的性質
本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 麦芽エキス寒天培地におい ては、 白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。 接種 30日目の コロニー径は約 4 c mである。
(2) ポテト■グルコース寒天培地、 ッァペック寒天培地、 サブロー寒天培地、 ォートミール寒天培地、 合成ムコール寒天培地、 及びフェノールォキシダーゼ反 応検定用培地における培養的■形態的性質
本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 ポテト 'グルコース寒天培 地、 ッァペック寒天培地、 サブロー寒天培地、 オートミール寒天培地、 合成ムコ ール寒天培地、 又はフエノールォキシダーゼ反応検定用培地のいずれの培地にお いても、 接種 1ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんど見られない。
(3) Y pS s寒天培地における培養的■形態的性質
本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 Y pS s寒天培地において は、 白色の光沢を有し、 マット状に生育する。 接種 30曰目の生育距離は約 5 m mであ
(4) グルコース■ ドライ ースト寒天培地における培養的■形態的性質 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 グルコース ' ドライィース 卜寒天培地においては、 白色の光沢を有し、 マット状に生育する。 接種 30曰目 の生育距離は約 2 m mである。
(5) 最適生育温度及び生育の範囲
滅菌処理した液体培地 （ 3 ο/οグルコース， 0. 3。酵母エキス； p H 7. 0 ) 1 OmLの入った 1 0 OmL容三角フラスコに、 本発明のマツタケ FERM B P— 7304株の種菌約 2m gを接種し、 5〜 35°Cの種々の温度でそれぞれ培 養し、 28曰目にフラスコから菌体を取り出し、 蒸留水でよく洗浄した後に乾燥 させ、 重量を測定した。 その結果、 菌体重量は 5〜1 5°Cの範囲で直線的に増加 し、 1 5〜25°Cの範囲で緩やかに増加した。 27. 5°C以上ではほとんど増殖 しなかった。 最適生育温度は 1 5〜25°Cである。
(6) 最適生育 p H及び生育の範囲
液体培地 （3%グルコース， 0. 3%酵母エキス） の pHを 1 mo I ZL塩酸 又は 1 mo I ZL水酸化カリウムで調製して、 p Hが 3. 0〜8. 0の範囲の 種々の培地を調製して生育 pH値を調べた。 各培地をフィルター滅菌し、 培地 1 OmLを滅菌済 1 0 OmL容三角フラスコに分注した。 本発明のマツタケ FER M BP— 7304株の種菌約 2m gを接種後、 22°Cで培養し、 28曰目にフ ラスコから菌体を取り出し、 蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、 重量を測定し た。 その結果、 菌体の生育限界は pH 3. 0〜7. 0の範囲にあり、 最適生育 p Hは 4. 0〜6. 0であった。
(7) 対峙培養による帯線形成の有無
ェビォス寒天平板培地に、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株のブ ロック （約 3mmx 3mmx 3mm) と、 後述の表 1に示す 1 3種類のマツタケ 株の各ブロック （約 3mmX 3mmx 3mm) とを、 約 2 c m間隔に対峙して植 菌し、 22 °Cで 3週間培養した後、 両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判 定した。
その結果、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 表 1に示す 1 3 種類のマツタケ株のいずれの株に対しても、 明確な帯線を形成しなかった。 なお、 マツタケでは、 異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、 表 1に示す 1 3 種類のマツタケ株間についても、 明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。
(8) 栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地 （Oh t aら， T r a n s. My c o に So c. J p n. , 31， 323, 1 990) 1 0 m Lの入った 1 O 0 mし容三角フ ラスコに、 本発明のマツタケ FERM BP—フ 304株の種菌約 2mgを接種 し、 22°Cで培養し、 42日目にフラスコから菌体を取り出し、 蒸留水でよく洗 浄した後に乾燥させ、 重量を測定したところ、 菌体 441 mgが得られた。
前記菌根菌用合成培地中の炭素 （C) 源であるグルコースの代わりに、 28種 類の糖質関連物質のいずれか 1つを加えた各培地に、 本発明のマツタケ FERM B P— 7 3 0 4株を接種して培養し、 培養終了後、 菌体重量を測定した。 その結果、 菌体重量が多かった糖質関連物質から菌体重量が少なかった糖質関 連物質を順に示せば、 以下のとおりである：
小麦デ: プン >卜ゥモロコシデンプン>デキストリン>メチル j8グルコシド >セ 口ピオ一ス>マンノース >フラク卜一ス>ァラビノース >ソルビトール >グルコ —ス >ラクトース>グリコーゲン >マンニ I ^一ル>リポース >マルトース>トレ ハロース>ガラクト一ス>ラフイノース>メリビオー > N—ァセチルグルコサ ミン。
なお、 セルロース、 ダルチ！ ^一ル、 シュ一クロース、 キシロース、 メチル グ ルコシド、 ィヌリン、 イノシトール、 又はソルポースでは菌の発育はほとんどみ られなかった。
次に、 前記菌根菌用合成培地中の窒素 （N ) 源である酒石酸アンモニゥ厶の代 わりに、 1 5種類の窒素関連物質のいずれか 1つを加えた各培地に、 本発明のマ ッタケ F E RM B P— 7 3 0 4株を接種して培養し、 培養終了後、 菌体重量を 測定した。
その結果、 菌体重量が多かった窒素関連物質から菌体重量が少なかった窒素関 連物質を順に示せば、 以下のとおりである：
コーンスティ一プリカ一 >大豆ペプトン >ミルクペプトン >硝酸アンモニゥム> 硫酸アンモニゥ厶>酒石酸アンモニゥム>炭酸アンモニゥム>ァスパラギン >リ ン酸アンモニゥ厶>塩化アンモニゥ厶>硝酸ナトリウム >肉エキス >酵母エキス >カザミノ酸 >クロレラ>トリプトーン >硝酸力リゥム。
更に、 前記合成培地中のミネラル及びビタミン類の内、 特定一成分を除去した 培地に、 本発明のマツタケ F E RM B P— 7 3 0 4株を接種して培養し、 培養 終了後、 菌体重量を測定した。
その結果、 塩化カルシウム '二水和物、 硫酸マンガン （II) ·五水和物、 硫酸 亜鉛■七水和物、 硫酸コバルト■七水和物、 硫酸銅■五水和物、 硫酸ニッケル - 六水和物、 塩酸チアミン、 ニコチン酸、 葉酸、 ビォチン、 塩酸ピリドキシン、 塩 化カー二チン、 アデニン硫酸■二水和物、 又は塩酸コリンのいずれか 1つの欠損 によっては、 菌体重量にはほとんど影響なかった。 一方、 硫酸マグネシウム -七 水和物、 塩化鉄 （Π) 、 又はリン酸二水素カリウムのいずれか 1つを培地から除 くと、 菌体重量は顕著に減少した。 すなわち、 マグネシウム、 鉄、 リン、 及び力 リウムは、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の増殖に必須と考えら れる。
(9) DN Aの塩基組成 （GC含量）
本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の GC含量は、 49. 9%であ る （後述の分析例 2参照） 。
(1 0) RAP D法により生成する DN Aパターン
6 ¾ の異なる PCR (p o l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) 用プライマー （1 Ome r ；具体的な塩基配列については、 後述の分析例 1 を参照のこと） をそれぞれ単独で用いる RAP D ( r a n d om a m p I i f i e d p o l ymo r p h i c D N A) 法により生成する D N Aパターンに ついて、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株と、 44種類のマツタケ 株 （具体的な菌株名については、 後述の分析例 1を参照のこと） とを比較したと ころ、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 44種類のマツタケ株 のいずれとも異なる DN Aパターンを示した。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
実施例 1 ：マツタケ FERM BP— 7304株の乾燥物粉末の調製
マツタケ FERM BP— 7304株菌糸体を、 滅菌処理した培地 （3%グル コース， 0. 3%酵母エキス， pH6. 0) 1 0 OmLの入った 50 OmL容三 角フラスコ 1 0本に接種し、 22°Cで 250 r p mの振盪培養機で 4週間培養を 行なった。 得られた培養物を濾布濾過し、 菌糸体を分離した後、 蒸留水で充分に 洗浄した。 一 60°Cに凍結した後、 凍結乾燥機 （M I N I FAST MOD. D O. 5 ; Edwa r d s社） を用いて凍結乾燥することにより、 乾燥菌糸体 1 0. 1 gを得た。 得られた菌糸体を、 ホモプレンダー （Wo n d e r B l e n d e r ；大阪ケミカル社） を用いて粉砕することにより、 乾燥物粉末 9. 8 gを得た c 実施例 2 ：マツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液及びアルカリ溶液 抽出液の各乾燥物粉末の調製
前記実施例 1と同様の手順により調製したマツタケ FERM BP— 7304 株菌糸体の乾燥物粉末 1 5 gを、 1 L容のビーカーに移し、 純水 600m Lを加 えた後、 スターラー撹拌下、 93〜98°Cのウォーターバス中で 3時間抽出した。 抽出終了後、 室温まで冷却し、 遠心分離 （12000 r pm, 20分間） により、 上清を得た。
沈殿部には純水 30 OmLを加え、 前記と同様の処理を行なった。 この操作を 計 3回行ない、 全ての上清を合わせて、 透析膜 （S p e c t r a ZPo r 3 M emb r a n e, 分子量 3500分画） に入れ、 水道水の流水中で 2日間透析し た。 透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 熱水抽出液の乾燥物粉末 3. 2 gを得た。
熱水抽出を実施した後に残った沈澱部に、 0. 5mo I ZL水酸化ナトリウム 溶液 40 OmLを加えた後、 スターラー撹拌下、 25°Cで 1時間抽出した。 抽出 終了後、 遠心分離 （1 2000 r pm, 20分間） により、 上清を得た。
沈殿部には 1. Omo I ZL水酸化ナトリウム溶液 400mLを加え、 前記と 同様の処理を行なった。 2つの上清を合わせ、 1. Omo I ZL塩酸にて pHを 7. 0に調整した後、 透析膜 （S p e c t r a ZPo r 3 Memb r a n e, 分子量 3500分画） に入れ、 水道水の流水中で 2日間透析した。 透析膜内液を ロータリーエバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 アルカリ溶液抽出 液の乾燥物粉末 5. 1 gを得た。
実施例 3 ：岩手県産マツタケ子実体の乾燥物粉末の調製
市販の岩手県産マツタケ子実体 [黒潮市場 （東京都新宿区北新宿） にて購入] 250 gを、 凍結乾燥機 （M I N I F AS T MOD. DO. 5 ; Edwa r d s社） を用いて乾燥した後、 ホモプレンダー （Wo ri d e r B l e n d e r ; 大阪ケミカル社） を用いて粉砕することにより、 乾燥物粉末 35 gを得た。
実施例 4 ：岩手県産マツタケの熱水抽出液及びアルカリ溶液抽出液の各乾燥物粉 末の調製
前記実施例 3と同様の手順により調製した市販の岩手県産マツタケ子実体の乾 燥物粉末 20 gを、 1 L容のビーカーに移し、 純水 80 OmLを加えた後、 スタ 一ラー撹拌下、 93〜98°Cのウォーターバス中で 3時間抽出した。 抽出終了後、 室温まで冷却し、 遠心分離 （1 2000 r pm, 20分間） により、 上清を得た。 沈殿部には純水 50 OmLを加え、 前記と同様の処理を行なった。 この操作を 計 3回行ない、 全ての上清を合わせて、 透析膜 （S p e c t r a ZPo r 3 M emb r a n e, 分子量 3500分画） に入れ、 水道水の流水中で 2日間透析し た。 透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 熱水抽出液の乾燥物粉末 1. O gを得た。
熱水抽出を実施した後に残った沈澱部に、 0. 5mo I /L水酸化ナトリウム 溶液 500mLを加えた後、 スターラー撹拌下、 25°Cで 1時間抽出した。 抽出 終了後、 遠心分離 （1 2000 r pm, 20分間） により、 上清を得た。
沈殿部には 1. 0 m o I Z L水酸化ナ卜リゥ厶溶液 500 m Lを加え、 前記と 同様の処理を行なった。 2つの上清を合わせ、 1. Omo I ZL塩酸にて p Hを 7. 0に調整した後、 透析膜 （S p e c t r aZP o r 3 Memb r a n e, 分子量 3500分画） に入れ、 水道水の流水中で 2日間透析した。 透析膜内液を ロータリーエバポレーターで濃縮した後、 凍結乾燥を行ない、 アルカリ溶液抽出 液の乾燥物粉末 5. 1 gを得た。
実施例 5 ：長野県産マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マッタケ子実体の代わリに、 長野県産マッタケ子実体を用いたこと以 外は、 前記実施例 4の手順をそのまま繰り返すことにより、 マツタケ子実体の熱 水抽出液の乾燥物粉末 1. 5 gを得た。
比較例 1 ：ァガリクス■ブラゼイ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、 市販のァガリクス■ブラゼィ （Ag a r i c u s b I a z e i ) 子実体を用いたこと以外は、 前記実施例 4の手順をそ のまま繰り返すことにより、 ァガリクス■ブラゼイ子実体の熱水抽出液の乾燥物 粉末 3. 6 gを得た。
比較例 2 ：霊芝子実休の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、 市販の霊芝子実体 [G a n o d e rma I u c i d um (F r. ) Ka r s t] を用いたこと以外は、 前記実施例 4の 手順をそのまま繰リ返すことにより、 霊芝子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末 2. 4 gを得た。
比較例 3 ：シィタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末の調製
岩手県産マツタケ子実体の代わりに、 市販のシィタケ子実体 [L e n t i n u s e d o d e s (B e r k. ) S i n g. ] を用いたこと以外は、 前記実施例 4の手順をそのまま繰り返すことにより、 シィタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物 粉末 1. 4 gを得た。
分析例 1 ：マツタケ F E RM B P— 7 304株の RA P D法による同定
本分析例では、 6種類の異なる P CR (p o l ym e r a s e c h a i n r e a c t i o n) 用プライマー （1 Om e r ) をそれぞれ単独で用いる R A P D r a n d o m a m p l i f i e d p o l ymo r p h i c D NA) 法 によりそれぞれ生成する本発明のマツタケ F E RM B P— 7 304株の D N A パターンを、 複数の公知マツタケ株の各 D N Aパターンと比較した。
比較用の公知マツタケ株としては、 表 1に示す 1 3種類を使用した。 前記実施 例 1と同様にして、 乾燥菌糸体を得、 更にそれを粉砕することにより、 乾燥物粉 末を得た。 各マツタケ株の菌糸体収量 （培地 1 O Om L当たりの乾燥菌体重量，
1 0本の平均値） と、 各マツタケ株の由来 （樹立施設） についても、 併せて表 1 に示す。
菌番号 菌株名 収量 (ε) 由来 （樹立施設）
1 I FO 691 5 0. 6 / (財） 発酵研究所
2 I FO 6925 0. 50 (財） 発酵研究所
3 I FO 6930 0. / 2 (財） 発酵研究所
4 I FO 6935 0. 65 (財） 発酵研究所
5 CM 627-2 0. 79 呉羽化学工業 （株）
八
6 CM 627-4 0. 80 呉羽化学工業 （株）
7 I FO 30604 0. 49 (財） 発酵研究所
8 I FO 30605 0. 7 I (財） 発酵研究所
9 I FO 30606 0. 35 (財） 発酵研究所
1 0 MAF F 460039 0. 56 農林水産省
農業生物資源研究所
1 1 KT 001 0. 68 呉羽化学工業 （株）
1 2 I FO 6920 0. 72 (財） 発酵研究所
1 3 I FO 6933 0. 56 (財） 発酵研究所 前記 P C R用プライマーとしては、
プライマー RAP D 1 (配列表の配列番号 1で表される塩基配列： TGGTCA CCG A) ；
プライマー ;RAPD2 (配列表の配列番号 2で表される塩基配列： AGCGCC ATTG) ；
プライマ一 RAPD3 (配列表の配列番号 3で表される塩基配列： TTCGAG CCAG) ；
プライマ一 RAPD4 (配列表の配列番号 4で表される塩基配列： TGCGTG CTTG) ；
プライマー RAP D 5 (配列表の配列番号 5で表される塩基配列： G ACT AG CCTC) ；及び
プライマー RAPD6 (配列表の配列番号 6で表される塩基配列： CTCACC GT CO
を化学合成により調製し、 使用した。
RAP D法 (こ使用する DN Aは、 市販の DN A調製キット （Dn e a s y P
1 a n t M i n i K i t ; Q I AG EN社） を用いて、 その取り扱い説明書 [Dn e a s y P l a n t M i n i Ha n d b o o k f o r D N A i s o l a t i o n f r om p l a n t t i s s u e ( a r c h, 1 9 99, Q I AG EN, K. K. ， 東京） ] に準じて、 以下の手順により調製した。 すなわち、 余分な水分を除去した各マッタケ菌株の菌糸体 （約 1 OOmg) を チューブに入れた後、 液体窒素で凍結し、 使用時まで一 80°Cで保存した。 サン プルの入ったチューブを解凍した後、 緩衝液 A P 1 (400 L) と RNァーゼ Aス卜ック溶液 (RNa s e A s t o c k s o l u t i o n) 4〃 Lとを 加え、 ボルテックスミキサーを用いて内容物を充分に混和させた。 次いで、 前記 チューブを 65°Cのウォーターバスに入れ、 1 0分間インキュベートした。 なお、 前記インキュベーション中、 チューブを 2〜 3回反転させて混和させた。 反応終 了後、 前記反応物に緩衝液 A P 2 (1 30/ L) を加え、 氷冷下で 5分間放置し た。 次いで、 チューブ内容物をカラム （Q I A s h r e d d e r s i n c o I umn) に装入し、 前記カラムを 2 m L容の試験管に入れて、 1 5000 r pmで 2分間遠心分離した。 遠心分離後、 カラムを通過して試験管底にたまった 溶液を別の試験管に移し、 液量を測定した。 この際、 試験管底にある細胞片には 絶対触れないようにした。
続いて、 カラム通過液と同量の 100%エチルアルコールと、 半分量の緩衝液 AP 3とを試験管に加え、 よく混和させた。 前記溶液 650〃 Lを別のカラム (DN e a s y m i n i s p i n c o l umn) に装入し、 刖 §Sカフムを
2 m L容の試験管に入れて、 8000 r p mで 1分間遠心分離した。 遠心分離後 のカラムに緩衝液 AW (500〃 L) を装入し、 前記カラムを 2m L容の試験管 に入れて、 8000 r pmで 1分間遠心分離し、 試験管底の溶液を廃棄した。 前 記カラムに緩衝液 AW (500〃 L) を装入し、 前記カラムを 2 m L容の試験管 に入れて、 1 5000 r pmで 2分間遠心分離し、 試験管底の溶液を廃棄した。 次に、 新しい試験管を用意し、 前記洗浄処理したカラムをセットし、 65°Cに保 温した緩衝液 A E (1 OO L) を装入し、 室温で 5分間おいた後、 8000 r pmで 1分間遠心分離し、 試験管底の DN A溶液を回収した。 同じ操作をもう一 度繰り返し、 合計約 200//しの DNA溶液を回収した。 得られた DNAの内、 20 / Lを 1 <½ァガロースゲル電気泳動にかけ、 D N Aの回収量及び純度を確認 した。
PCRは、 表 2に示す反応溶液 （全容量 =25/ L) 中において、 94°Cの変 性工程 （30秒間） 、 36°Cの結合工程 （1分間） 、 及び 72°Cの伸長工程 （2 分間） からなるサイクルを 45サイクル実施する条件 [但し、 第 1回目のサイク ルの前に、 94°Cの予備的な変性工程 （2分間） を実施し、 更に、 最後の第 45 回目のサイクルの後に、 最終的な伸長工程 （2分間） を実施する] で行なった。 なお、 表 2に示す反応溶液は、 E x Ta qTMバッファー、 Ta Ka Ra Ex
Ta qTM、 及びT a q S t a r t抗体を混合して 2〜 3秒後に、 蒸留水、 1 0 X E X Ta qTMバッファー、 d N T P、 及びプライマーを添加し、 最後に D N A溶液を添加することにより調製した。 反応溶液 （1チューブ当たり)
E X T a qTMバッファー （宝酒造） 0. 8 L
Ta Ka Ra E x T a q TM (宝酒造） 0. 2〃 L
T a q S t a r t抗体 （宝酒造） 0. 2〃 L
蒸留水 8. 3 jti L
1 0 x E x T a q TMバッファ一 （宝酒造） 2. 5 u L
d N T P 2. し
プライマー 1 · 0 jU L
DNA 1_0 U L 得られた P C R産物をァガロースゲル電気泳動法によリ分離して得られる D N Aパターンを、 図 1〜図 4に示す。 図 1は、 表 1における菌番号 1 ~6で表され る比較用菌株の DN Aパターンを示し、 図 2は、 表 1における菌番号 7〜1 1で 表される比較用菌株の DN Aパターンを示し、 図 3は、 表 1における菌番号 1 2 〜1 3で表される比較用菌株の DN Aパターンと、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の DN Aパターンとを示し、 図 4は、 本発明のマツタケ FER M B P— 7304株の DN Aパターンを示す。
図 1における丸付き数字 「1」 〜 「6」 、 図 2における丸付き数字 「7」 〜 「1 1」 、 及び図 3における丸付き数字 「1 2J 〜 「1 3」 〖ま、 表 1における菌 番号 1〜13に、 それぞれ対応する。 例えば、 図 1における丸付き数字 「1」 で 示すレーンは、 表 1における菌番号 1の菌株、 すなわち、 I FO 691 5株の 結果を示す。 また、 図 3における丸付き数字 「1 4」 で示すレーンは、 本発明の マツタケ FERM BP— 7304株の結果を示す。
図 1〜図 3における記号 「RAPD 1J 〜 「RAPD6J は、 プライマー RA PD 1〜RAPD6を意味する。
図 4における各レーン 1〜6は、 それぞれ、 各プライマー RAPD 1〜RAP D 6を用いた場合の本発明のマツタケ FERM BP— 7304株の結果を示す。 また、 図 1〜図 4における記号 「M」 は、 DN Α分子量マーカーを意味する。 前記の各電気泳動では、 同じ DN A分子量マーカー （1 k b DN A I a d d e r , カタロワ番号 1 541 5— 01 8, L i f e T e c h n o l o g i e s 社， G I BCO— BRL, 米国） を用いた。 図 4において、 矢印 Aで示すバンド は 4072 b pの DN A断片であり、 矢印 Bで示すバンドは 3054 b pの DN A断片であり、 矢印 Cで示すバンドは 2036 b pの DN A断片と 1636 b p の DN A断片とが重なっているものであり、 矢印 Dで示すバンドは 101 8 b p の DN A断片であり、 矢印 Eで示すバンドは、 51 7 b p、 506 b p、 396 b p、 344 b p、 及び 298 b pの各 DN A断片が重なっているものである。 図 1〜図 4に示すように、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 表 1に示す 1 3種類の比較用マツタケ株のいずれとも異なる DN Aパターンを示 した。
また、 具体的な DN Aパターンは図示しないが、 本発明のマツタケ FERM BP— 7304株は、 表 1に示す 1 3種類の比較用マツタケ株以外の 31種類の マツタケ株、 すなわち、 MA F F 460031、 MAF F 460033、 M AFF 460034% MA F F 460035, MA F F 460036, M A F F 460037、 MAF F 460038. MA F F 460040, M A F F 460041 , MA F F 460042, MA F F 460046, M A F F 460050、 及び MA F F 460096 (以上、 農林水産省農業生 物資源研究所） 、 CM 627— 3、 CM 627— 5、 CM 62フー 6、 及 び CM 627— 7 [以上、 呉羽化学工業 （株） ] 、 並びに I FO 6929、 I FO 6931、 I FO 6932、 I FO 6934, I FO 691 6、 I FO 691 7、 I FO 691 8、 I FO 691 9、 I FO 6921、 I FO 6922、 I FO 6923、 I FO 6924、 I FO 6926、 及び I FO 6928 [以上、 （財） 発酵研究所] の DN Aパターンとも異なつ ていた。
分析例 2 ：マツタケ F ERM BP— 7304株の GC含量
前記実施例 1と同様にして得られたマツタケ F ERM BP— 7304株の菌 糸体 （湿重量 = 1. 0 g) の入った 5 OmL容の三角フラスコに、 I mgZmL プロティナーゼ K (メルク社， ドイツ） のリン酸緩衝化生理食塩水 （PBS)
(p H 7. 4) 溶液 2 OmLを加え、 ときどき振盪しながら、 65 °Cで 2時間反 応させた。 1 00°Cで 1 0分間の熱処理により酵素を失活させた後、 37°Cまで 冷却し、 ザィモリアーゼ （生化学工業） を適当量 （約 1 mg) 加え、 更に、 3 7°Cで 4時間反応させた。 次いで、 T r i s—ドデシル硫酸ナトリウム （SD S) 緩衝液 4 OmLを加え、 60°Cで溶菌処理して DN A抽出液を調製した。 前記抽出液に等量のフエノールを添加して撹拌した後、 遠心分離してフヱノー ル層を除去した。 得られた上清から、 エチルアルコール沈澱法により粗 DNAを 回収した後、 70〜90%エチルアルコールで洗浄した。 得られた沈澱をクェン 酸緩衝液 5m Lに再溶解し、 RNァーゼ処理を実施した。 次に、 RNァーゼ処理 溶液にフ； i:ノールを少量添加し、 撹拌した後、 遠心分離にてフエノール層を除去 した。 上清から再度、 エチルアルコール沈澱法により粗 DN Aを回収し、 70〜 90%エチルアルコールで洗浄した後、 2回目の RNァーゼ処理を実施した。 R Nァ一ゼ処理後、 エチレンジァミン四酢酸 （EDTA) 含有酢酸緩衝液 0. 5 m Lを添加し、 イソプロパノールにて DN Aを沈澱させ、 遠心分離にて回収した。 これを再度、 70〜90%エチルアルコールで洗浄し、 最終的にクェン酸緩衝液 1 mLに溶解し、 精製 DN A溶液とした。
得られた精製 DNA溶液 1 OO Lを 1 00°Cで 1 0分間熱処理した後、 氷冷 し、 ヌクレアーゼ P 1により 50°Cで 1時間処理し、 ヌクレオチドに分解した。
GC含量は、 高速液体クロマトグラム （LC一 6 A；島津製作所） により定量し た。 標準品として、 GCキット （ャマサ醤油） を使用し、 カラムとして、 YMC -P a c k AQ— 31 2 (直径 =6. Omm, 長さ = 1 5 Omm) を使用し、 移動相として、 0. 2mo I ZLリン酸アンモニゥ厶溶液 （pH約 4. 5) を使 用した。 注入量は 1 0 jU Lとし、 検出は、 波長 270 nmで実施し、 ピーク同定 は、 絶対保持時間法により行なった。 定量法としては、 修正百分率法を使用した。 マツタケ FERM BP— 7304株の GC含量は、 49. 9%であった。 評価例 1 ：ストレス負荷に対する回復促進活性の評価
(1 ) マツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液及びアルカリ溶液抽出 液の評価
本評価例では、 前記実施例 2でそれぞれ調製したマツタケ FERM BP— 7 304株の熱水抽出液乾燥物粉末とアル力リ溶液抽出液乾燥物粉末とを 3. 2 ： 5. 1の比率で混合した混合物を評価用サンプルとし、 この評価用サンプルをマ ウスに 4週間経口投与した後、 拘束ストレスを 1 8時間負荷し、 ストレス解放後 のナチュラルキラー （NK) 細胞活性を測定することにより、 前記サンプルの影 響を検討した。
具体的には、 日本 S LCから購入した 8週齢雄性 C57 BLZ6マウス （各群 =5〜1 0匹） に、 評価用サンプルの水溶液 （前記実施例 2でそれぞれ調製した マツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液乾燥物粉末とアル力リ溶液抽 出液乾燥物粉末とを 3. 2 : 5. 1の比率で混合した後、 蒸留水に溶解した溶 液） を 4週間に亘つて、 通常の飼育用ケージ中で経口投与 （50mgZk gZd a y) した。 続いて、 マウスを前記飼育ケージから取り出し、 空気抜けの穴を開 けた 50 m L容のキャップ付きポリプロピレン製遠心用チユーブ （カタ口グ番号 2341— 050 ；テクノグラス社） にマウスを 1匹ずつ閉じ込めた。 このチュ ーブ中に閉じ込められたマウスは、 身動きができない状態となった。 次に、 それ らのチューブを飼育用ケージに戻し、 1 8時間その状態で放置することにより、 拘束ストレスを与えた。 1 8時間のストレス負荷の後、 チューブからマウスを取 リ出し、 飼育用ケージに戻し、 普通の環境下で飼育した。
前記拘束ストレスを開放してから、 所定日数 [0曰 （解放直後） 、 1日、 3曰、 5日、 7日、 及び 14日] 経過後に、 マウスを屠殺し、 以下の手順に従って、 試 験管内で N K感受性の腫瘍細胞株 Y A C— 1に対するリンパ節細胞の細胞傷害活 性を測定することにより、 ナチュラルキラ一 （NK) 細胞活性を評価した。
すなわち、 マウスから脾臓及び腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、 ハンクス 平 ½fe類溶液 (H a n k s Ba l a n c e d S a l t So l u t i o n) を入れた無菌シャーレに移した。 はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、 メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。 1 0%牛胎児血清 （56°Cで 30分間の熱処理を実施） 添加 RPM I 1 640培地で細胞を 3回洗浄した後、 1 0 %牛胎児血清 （ 56 °Cで 30分間の熱処理を実施） 、 20mmo l Zしの 4 - (2—ヒドロキシェチル） 一 1ーピペラジンエタンスルホン酸、 及び 30jl g Zmしゲンタマイシンをそれぞれ添加した RPM I 1 640培地で、 細胞濃度を 5 X 1 06個 mLに調整して得た細胞懸濁液をエフェクター細胞として用いた。 一方、 標的細胞として用いた Y AC— 1細胞は、 1 0%牛胎児血清 （56°Cで 30分間の熱処理を実施） 添加 RPM I 1 640培地中で、 呉羽化学工業株式会 社生物医学研究所で継代維持したものである。 前記 Y AC— 1細胞に放射性ク口 ム酸ナトリウム （アマ一シャムジャパン） を加え、 37 ¾で 20分間反応させた c 未結合の放射性クロム酸ナトリウムを、 1 0%牛胎児血清 （56°Cで 30分間の 熱処理を実施） 添加 RPM I 1 640培地で 3回洗浄することにより除去し、 放 射性クロム標識腫瘍細胞を 5 X 1 04個ノ mLに調整した。
先に調整した前記ェフエクタ一細胞懸濁液又はその 2倍希釈系列と、 前記放射 性クロム標識腫瘍細胞懸濁液とを、 それぞれ 0. 1 mLずつ試験管に加え、 3 7°Cの 5%炭酸ガス培養器中で 4時間反応させた。 なお、 この際、 後述する特異 的傷害率を算出するために、 放射性クロム標識腫瘍細胞と培地とを試験管に加え た懸濁液、 そして、 放射性クロム標識腫瘍細胞と界面活性剤 （トリトン；最終濃 度 =0. 05%) とを試験管に加えた懸濁液についても、 37°Cの 5%炭酸ガス 培養器中で 4時間反応させた。 反応終了後、 1 0%牛胎児血清 （56°Cで 30分 間の熱処理を実施） 添加 RPM I 1 640培地 1. 5mLを試験管に更に加え、 ミキサーで充分に混合した後、 遠心分離 （1 2000 r pm, 5分間， 4°C) す ることにより、 上清を得た。 得られた上清の放射能活性をガンマカウンターを用 いて測定した。
特異的傷害率 （S. し . S p e c i f i c L y s i s) を、 式：
[S. L. ] = { (B— Bf) / (Bmax-Bf) } x 1 00
[式中、 S. し は、 特異的傷害率 （単位 =%) であり、 Bは、 実験群における 上清の放射能活性 （単位 =Bq) であり、 Bfは、 自然遊離群 （すなわち、 放射 性クロム標識腫瘍細胞単独培養群） における上清の放射能活性 （単位- Bq) で あり、 Bmaxは、 最大遊離群 （すなわち、 トリトン処置した放射性クロム標識腫 瘍細胞群） における上清の放射能活性 （単位- Bq) である]
から算出し、 エフェクター細胞 1 07個当たり 30%の腫瘍細胞を傷害する細胞 数、 すなわち、 「30%傷害単位 （し y t ί c Un i t s 30% ; L U 3 0) J で NK細胞活性を表示した。
結果を図 5に示す。 なお、 対照 （健常群） 試験として、 評価用サンプル水溶液 の代わりに、 蒸留水を 4週間に亘つて経口投与したこと、 そして、 18時間の拘 束ストレスを与えなかったこと以外は、 前記操作をそのまま繰り返した。 また、 比較試験として、 評価用サンプル水溶液の代わりに、 蒸留水を 4週間に亘つて経 口投与したこと以外は、 前記操作をそのまま繰り返した。
図 5において、 折れ線 a (白四角） は、 対象 （健常群） 試験 （非ストレス） の 結果を示し、 折れ線 b (黒丸） は、 本発明による評価用サンプル （マツタケ FE RM BP-7304株の熱水抽出液乾燥物粉末とアル力リ溶液抽出液乾燥物粉 末との 3. 2 ： 5. 1の比率の混合物） 水溶液を投与した場合の結果を示し、 折 れ線 c (黒三角） は、 比較試験 （蒸留水投与及びストレス負荷） の結果を示す。 また、 図 5において、 折れ線 bにおける前記黒丸の肩に示す記号 「 +」 は、 ρ< 0. 01 (折れ線 cにおける黒三角で示される結果に対して） であることを示し、 折れ線 cにおける前記黒三角の肩に示す記号 Γ* j は、 ρ<0. 01 (折れ線 a における白四角で示される結果に対して） であることを示す。
図 5の折れ線 b, cに示すように、 拘束ストレスを負荷すると、 NK細胞活性 は顕著に低下する。 折れ線 Cに示すように、 拘束ストレス解放後、 そのまま放置 しても NK細胞活性は緩やかに回復するが、 折れ線 bに示すように、 マツタケ F ERM BP— 7304株の熱水抽出液乾燥物粉末とアル力リ溶液抽出液乾燥物 粉末との 3. 2 : 5. 1の比率の混合物を添加しておくことにより、 N K細胞活 性の回復が有意に早まった。
(2) マツタケ F ERM BP— 7304株の乾燥物粉末、 岩手県産マツタケ子 実体の乾燥物粉末、 及び岩手県産マツタケ子実体の熱水抽出液乾燥物粉末とアル 力リ溶液抽出液乾燥物粉末との混合物の評価
マツタケ F E RM BP— 7304株の熱水抽出液乾燥物粉末とアル力リ溶液 抽出液乾燥物粉末との 3. 2 ： 5. 1の比率の混合物の代わりに、 前記実施例 1 で調製したマツタケ F ERM BP— 7304株の乾燥物粉末 （50mgZk g /d a y) , 実施例 3で調製した市販の岩手県産マツタケ子実体の乾燥物粉末
(50mg/k g/d a y) 、 及び前記実施例 4で調製した市販の岩手県産マツ タケ子実体の熱水抽出液乾燥物粉末とアル力リ溶液抽出液乾燥物粉末との 1. 0 : 5. 1の比率の混合物 （25mgZk gZd a y) を使用したこと以外は、 前記評価例 1 ( 1 ) の手順を繰り返した。
結果を表 3に示す。 表 3において、 記号 「*」 は、 p<0. 0 1 (蒸留水投与 に対して） であることを示す。
表 3
N K»¾¾ しし U30) .
0曰 曰 3曰 5曰 7曰 4曰 対照 験 49 47 48 50 48 48
(ストレス負荷なし）
比較試験 7 9 1 1 22 30 42
(蒸留水投与及びストレス負荷）
実施例 1 1 0 2 1 * 35* 46氺 48* 50
実施例 3 1 0 20* 3 1* 37* 49* 5 1 *
実施例 4 1 1 22* 37* 41 * 46* 48 (3) 各種マツタケ株の乾燥物粉末の評価
マツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液乾燥物粉末とアルカリ溶液 抽出液乾燥物粉末との 3. 2 ： 5. 1の比率の混合物の代わりに、 前記実施例 1 で調製したマツタケ F ERM BP— 7304株の乾燥物粉末 （50mgZk g ά a y) と、 前記分析例 1で使用した表 1に示す 1 3種類のマツタケ株の乾燥 物粉末 （5 OmgZk gZd a y) とを使用したこと以外は、 前記評価例 1
(1) の手順を繰り返した。
結果を表 4及び図 6〜図 9に示す。
表 4において、 記号 「*」 は、 pく 0. 01 (蒸留水投与に対して） であるこ とを示す。
図 6〜図 9において、 折れ線 a (黒四角） は、 対照試験 （ストレス負荷なし） の結果を示し、 折れ線 b (白四角） は、 比較試験 （蒸留水投与及びストレス負 荷） の結果を示す。
図 6において、 折れ線 c (黒三角） は、 本発明のマツタケ FERM BP— 7 304株の結果を示し、 折れ線 d (黒菱形） は、 マツタケ株 I FO 691 5の 結果を示し、 折れ線 e (黒丸） は、 マツタケ株 I FO 6925の結果を示す。 図 7において、 折れ線 f (黒三角） は、 マツタケ株 I FO 6930の結果を 示し、 折れ線 g (黒菱形） は、 マツタケ株 I FO 6935の結果を示し、 折れ 線 h (黒丸） は、 マツタケ株 CM 627— 2の結果を示し、 折れ線 i (白丸） は、 マツタケ株 CM 627— 4の結果を示す。
図 8において、 折れ線 j (黒三角） は、 マツタケ株 I FO 30604の結果 を示し、 折れ線 k (黒菱形） は、 マツタケ株 I FO 30605の結果を示し、 折れ線 I (黒丸） は、 マツタケ株 I FO 30606の結果を示し、 折れ線 m (白丸） は、 マツタケ株 MA F F 460039の結果を示す。
図 9において、 折れ線 n (黒三角） は、 マツタケ株 KT 001の結果を示し, 折れ線 P (黒菱形） は、 マツタケ株 I FO 6920の結果を示し、 折れ線 q (黒丸） は、 マツタケ株 I FO 6933の結果を示す。 表 4
NK細胞活性 （LU 30)
-J c
園株 u □ o O / Ώ 1 mfy.
対照試験 4 8 4 7 4 6 4 6 4 7 4 Ό
(ス卜レス負荷なし）
L ~^E^>
比車父試験 6 8 1 4 2 1 2 8 4
(？ 留水投与及ひス卜レス: 何）
t実施例]
cr
r t RM B P / 04 1 \ 2 4 2 * 7 * Ό u * 4 O
I F O D 9 Ί 1 cr
1 0
O Ί o o Ί 0 4 rr
O
I Fリ 69 25 9 1 7 o
Ί y o 7 4 1 4
I F O 6930 8 1 0 1 8 o 9 0 b 4 0
I F O 6935 8 1 3 2 1 3 Z 0 9 4 2
CM 627—2 7 1 4 20 30 4 4 4 4
CM 627—4 8 1 3 1 9 3 0 1 4 6
I F O 30604 6 1 1 2 0 3 5 3 9 0
I FO 30605 6 1 4 1 8 3 6 3 8 4 5
I FO 30606 6 1 4 1 8 3 0 3 6 4 4
MA F F 460039 8 1 3 1 9 2 9 3 7 4 5
KT 001 7 1 5 2 1 3 4 4 2 4 1
I FO 6920 7 1 1 1 9 3 3 4 0 4 0
I FO 6933 7 1 0 1 7 3 0 3 7 4 2 表 4に示すように、 マツタケ F ERM BP— 7 304株の乾燥物粉末、 及び 表 1に示す 1 3種類のマツタケ株の乾燥物粉末のいずれも、 NK細胞活性の回復 を促進したが、 中でも、 マツタケ F ERM BP— 7304株の乾燥物粉末が、 最も優れた回復促進活性を示した。
また、 表 1に示す 1 3種類のマツタケ株以外の 3 1種類のマツタケ株、 すなわ ち、 MA F F 46003 1 , MA F F 460033, MA F F 46003 4、 MA F F 460035. A F F 460036, MA F F 46003 7 , MA F F 460038. MA F F 460040, MA F F 4600 1、 MA F F 460042. MA F F 460046. MA F F 46005 0、 及び MA F F 460096 (以上、 農林水産省農業生物資源研究所） 、 C M 627— 3、 CM 627— 5、 CM 627— 6、 及び CM 627 -7 [以上、 呉羽化学工業 （株） ] 、 並びに I FO 6929、 I FO 693 1、 I FO 6932、 I FO 6934、 I FO 69 1 6、 I FO 69 1 7、 I FO 69 1 8、 I FO 69 1 9、 I FO 692 1、 I FO 6922、 I FO 6923、 I FO 6924、 I FO 6926、 及び I F O 692 8 [以上、 （財） 発酵研究所] の乾燥物粉末 （50mgZk gZd a y) を使用 したこと以外は、 前記評価例 1 ( 1 ) の手順を繰り返したところ、 これらのマツ タケ株においても、 N K細胞活性の回復が確認されたが、 本発明のマツタケ F E R BP— 7304株の回復促進活性を越えるものはなかった。
(4) 長野県産マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末、 及び各種キノコの熱 水抽出液乾燥物粉末の評価
前記実施例 5で調製した長野県産マツタケ子実体の熱水抽出液の乾燥物粉末、 あるいは、 前記比較例 1〜3でそれぞれ調製したァガリクス■ブラゼイ子実体、 霊芝子実体、 又はシィタケ子実体の各熱水抽出液乾燥物を評価用サンプルとした こと以外は、 前記評価例 1 (1 ) の操作をそのまま繰り返した。 なお、 投与量は、 いずれも、 25 OmgZk gZd a yであった。
結果を表 5に示す。 表 5において、 B号 「*』 は、 pく 0. 01 (蒸留水投与 に対して） であることを示す。
表 5
NK細胞活性 （LU30)
0曰 1曰 C3 κ α -7 Π
Ο Η I *+
対 試験 47 48 yi -7
4 Ό 4 1
(ストレス負荷なし）
比較試験 6 8 1 3 26 29 44
(蒸留水投与及ぴストレス負荷）
実施例 5 1 0 1 4* 22* 34* 37* 47
比較例 1 5 7 1 5 27 30 37
比較例 2 3 8 1 1 24 28 36
比較例 3 4 9 1 0 27 29 40 産業上の利用可能性
本発明のス卜レス負荷回復促進用医薬組成物によれば、 ス卜レス負荷に対する 回復を促進することができる。 配列表フリーテキス卜
配列表の数字見出しく 223 >には、 「A r t i f i c i a l S e q u e n c e j の説明を記載する。 具体的には、 配列表の配列番号 1〜配列番号 6の配列 で表される塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、 プライマー RAPD 1〜 プライマー RAPD6である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又はマツタケのアル カリ溶液抽出液若しくはその乾燥体と、 薬剤学的に許容することのできる担体と を含有する、 ストレス負荷に対する回復促進用の医薬組成物。
2. 前記マツタケが、 マツタケ F E RM B P— 7 3 0 4株である、 請求項 1に 記載のストレス負荷に対する回復促進用医薬組成物。
3 . 前記マツタケが、 菌糸体、 培養物、 又は子実体である、 請求項 1又は 2に記 載のストレス負荷に対する回復促進用医薬組成物。
4. マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又はマツタケのアル カリ溶液抽出液若しくはその乾燥体を、 それ単独で、 あるいは、 所望により 1又 はそれ以上の食品成分と共に含有する、 ストレス負荷に対する回復促進用の機能 性食品。
5. 前記マツタケが、 マツタケ F E R M B P— 7 3 0 4株である、 請求項 4に 記載のストレス負荷に対する回復促進用機能性食品。
6. 前記マツタケが、 菌糸体、 培養物、 又は子実体である、 請求項 4又は 5に記 載のストレス負荷に対する回復促進用機能性食品。
7 . マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又はマツタケのアル カリ溶液抽出液若しくはその乾燥体と、 オーラル衛生用組成物の担体とを含有す る、 ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物。
8 . 前記マツタケが、 マツタケ F E RM B P— 7 3 0 4株である、 請求項 1に 記載のストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物。
9. 前記マツタケが、 菌糸体、 培養物、 又は子実体である、 請求項 7又は 8に記 載のストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物。
1 0. マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又はマツタケのァ ルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体を、 ストレス負荷に対する回復促進が必要 な対象に、 有効量で投与することを含む、 ストレス負荷に対する回復促進方法。
1 1 . 前記マツタケが、 マツタケ F E R M B P— 7 3 0 4株である、 請求項 1 0に記載のストレス負荷に対する回復促進方法。
1 2. 前記マツタケが、 菌糸体、 培養物、 又は子実体である、 請求項 10又は 1 1に記載のストレス負荷に対する回復促進方法。
1 3. マツタケ、 マツタケの熱水抽出液若しくはその乾燥体、 又はマツタケのァ ルカリ溶液抽出液若しくはその乾燥体の、 ストレス負荷に対する回復促進用医薬 組成物、 ストレス負荷に対する回復促進用機能性食品、 あるいは、 ストレス負荷 に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するための使用。
1 4. 前記マツタケが、 マツタケ FERM BP— 7304株である、 請求項 1 3に記載の使用。
1 5. 前記マツタケが、 菌糸体、 培養物、 又は子実体である、 請求項 1 3又は 1 4に記載の使用。
1 6. マツタケ FERM BP— 7304株。
1 7. マツタケ FERM BP— 7304株の菌糸体、 培養物、 又は子実体。
1 8. マツタケ FERM BP— 7304株の熱水抽出液又はその乾燥体、 ある いは、 マツタケ FERM BP— 7304株のアルカリ溶液抽出液又はその乾燥 体。
1 9. マツタケ FERM BP— 7304株が、 菌糸体、 培養物、 又は子実体で ある、 請求項 1 8に記載の熱水抽出液若しくはその乾燥体又はアルカリ溶液抽出 液若しくはその乾燥体。
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