JP2005225802A - 新規な高脂血症治療剤および食品 - Google Patents

Abstract

【課題】 マツタケ（Tricholoma matsutake）を利用して、高脂血症の治療剤および食品を提供する。
【解決手段】 マツタケ（Tricholoma matsutake）、特にはマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株、の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）のいずれかをそのまま、あるいはその乾燥物、あるいはそれらの抽出物（例えば熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）を含有する、高脂血症治療剤および食品。
【選択図】 図 ３−２

Description

本発明は、動物やヒトにおける高脂血症の治療のための高脂血症治療剤および食品に関する。本発明の高脂血症治療剤および食品は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。

近年、高齢者人口の増加とともに、高コレステロール血症はますます増加している。本症においては、コレステロールが動脈血管壁に沈着・蓄積するため、動脈硬化が進行し、虚血性疾患（例えば、狭心症や心筋梗塞など）や脳血管障害（例えば、脳梗塞や脳出血など）のような重篤な疾患や障害に至る。

本症の予防と治療のために、食事療法や運動、禁煙など、日常生活のセルフケアが推奨されているが、セルフケアで改善されない場合や重病の場合などには、薬物療法が行われる。代表的な薬剤として、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元控訴阻害剤やプロブコール、コレスチラミン、フィブラート系薬剤、ニコチン酸製剤、ＥＰＡ製剤、デキストラン硫酸等が挙げられる。最近の大規模介入試験により、低コレステロール療法の意義・有用性が明らかにされてきたが、現行薬剤には副作用や禁忌が指摘されており、新規の治療・予防用薬剤や機能性食品の開発が要望されている。

ところで、きのこ類は多用な生物活性を有することから、古くから日本人の健康に寄与してきた。例えばマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕については、特公昭５７−１２３０号公報（特許文献１）に、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水または希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、およびエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示され、特許第２７６７５２１号明細書（特許文献２）には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。

さらに、本発明者らにより、マツタケ熱水抽出液、マツタケアルカリ溶液抽出液、あるいはこれら抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が免疫増強活性を有することが見出されている（国際公開第０１／４９３０８号パンフレット（特許文献３））。本発明者らはまた、マツタケの特定の菌糸体由来の部分精製画分にストレス負荷回復促進作用があることも見出した（特願２００２−１０６６３２号明細書）。

特公昭５７−１２３０号公報 特許第２７６７５２１号明細書 国際公開第０１／４９３０８号パンフレット

上述のようにマツタケには抗腫瘍活性、免疫増強活性、ストレス負荷回復促進作用などの種々の生理活性が含まれることが見出されている。しかしながら、本発明者の知る限りにおいて、マツタケ、あるいは該マツタケが属するキシメジ属に属する担子菌類が、高脂血症に対して優れた治療効果を有するということについては、これまで報告がされていない。

本発明者は、高脂血症モデルラットを用いて研究を重ねた結果、マツタケ、あるいは該マツタケが属するキシメジ属に属する担子菌類が、この高脂血症モデルラットに対しコレステロールを低下させる作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の課題は、マツタケ等のキシメジ属に属する担子菌類を利用した高脂血症治療剤および食品を提供することにある。

本発明は、マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、高脂血症治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、上記高脂血症治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株である、上記高脂血症治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、上記高脂血症治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液である、上記高脂血症治療剤および食品に関する。

本発明により、安全で、安定的に大量供給が可能な、高脂血症治療、高脂血症により併発されるおそれの高い動脈硬化、虚血性疾患（例えば、狭心症や心筋梗塞など）、脳血管障害（例えば、脳梗塞や脳出血など）等の防止のための薬剤および食品が提供される。

本発明の高脂血症治療剤および食品に用いられるマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕は、菌糸体、培養物（Broth）、子実体のいずれの形態のものも用いることができ、生でも乾燥したものでもよい。本発明では子実体は胞子も含むものとする。これら菌糸体、培養物（Broth）、子実体の各抽出物も用いることができる。

本発明では特にマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株が好ましく用いられる。

マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、本出願人によって新規菌株として従前に出願され（国際公開第０２／３０４４０号パンフレット）、独立行政法人産業技術総合研究所（（旧）工業技術院生命工学研究所）に平成１２年９月１４日に寄託されている。このマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより菌糸体継代株を得たものであり、呉羽化学工業（株）生物医学研究所で維持している。

マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の子実体の形態は、「原色日本新菌類図鑑（１）」（今関六也・本郷次雄編、保育社、昭和３２年発行）プレート（plate）９頁および２６頁に記載のマツタケ子実体に合致するものであった。

マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の継代は、エビオス寒天斜面培地で実施することができる。マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体をエビオス寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、大きなコロニーを形成する。走査型電子顕微鏡で観察すると、太さ１〜２μｍの枝状の菌糸体が無数に存在し、菌糸体側部に数μｍ程度の突起物が時々みられる。該菌株の菌糸体を大量培養する場合は、液体培地に接種し、静置培養、振盪培養、タンク培養等により行うことができる。

なお、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、もっぱら菌糸体の形状で継代維持または培養することが可能であるが、子実体の形状となることもある。

マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌学的性質は以下のとおりである。
（１）麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。接種３０日目のコロニー径は約４ｃｍである。

（２）ツアペック寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、およびフェノールオキシダーゼ反応検定用培地における培養的・形態的性質
上記いずれの培地においても、接種後１ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんどみられない。

（３）ＹｐＳｓ寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約５ｍｍである。

（４）グルコース・ドライイースト寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約２ｍｍである。

（５）最適生育温度および生育範囲
滅菌処理した液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ７．０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、５〜３５℃の種々の温度でそれぞれ培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体質量は５〜１５℃の範囲で直線的に増加し、１５〜２５℃の範囲で緩やかに増加した。２７．５℃以上ではほとんど増殖しなかった。最適生育温度は１５〜２５℃である。

（６）最適生育ｐＨおよび生育範囲
液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス）のｐＨを１モル／Ｌ塩酸または１モル／Ｌ水酸化カリウムで調整し、ｐＨ３．０〜８．０の種々の培地を調製して菌体の生育ｐＨを調べた。すなわち各培地をフィルター滅菌し、培地１０ｍＬを滅菌済１００ｍＬ容三角フラスコに分注した。マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種後、２２℃で培養し、フラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体の生育限界はｐＨ３．０〜７．０、最適生育ｐＨは４．０〜６．０であった。

（７）対峙培養による帯線形成の有無
エビオス寒天平板培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株のブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）と、公知の１３種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ ６９１５株；（財）発酵研究所）の各ブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）とを、約２ｃｍ間隔に対峙して植菌し、２２℃で３週間培養した後、両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判定した。

その結果、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（１３種類）のいずれの株に対しても明確な帯線を形成しなかった。なお、マツタケでは異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、公知のマツタケ株（１３種類）間についても、明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。

（８）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（「太田培地」。Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990)１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、２２℃で培養し、４２日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定したところ、菌体４４１ｍｇが得られた。

上記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、２８種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。その結果、菌体質量が多かった糖質関連物質から菌体質量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下のとおりである。

小麦デンプン＞トウモロコシデンプン＞デキストリン＞メチルβグルコシド＞セロビオース＞マンノース＞フラクトース＞アラビノース＞ソルビトール＞グルコース＞ラクトース＞グリコーゲン＞マンニトール＞リボース＞マルトース＞トレハロース＞ガラクトース＞ラフィノース＞メリビオース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。

なお、セルロース、ダルチトール、シュークロース、キシロース、メチルαグルコシド、イヌリン、イノシトール、およびソルボースでは、菌の発育はほとんどみられなかった。

次に、上記菌根菌用合成培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、１５種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。

その結果、菌体質量が多かった窒素関連物質から菌体質量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下のとおりである。

コーンスティープリカー＞大豆ペプトン＞ミルクペプトン＞硝酸アンモニウム＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞アスパラギン＞リン酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸ナトリウム＞肉エキス＞酵母エキス＞カザミノ酸＞クロレラ＞トリプトーン＞硝酸カリウム。

さらに、上記合成培地中のミネラルおよびビタミン類のうち、特定の１成分を除去した培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。

その結果、塩化カルシウム・二水和物、硫酸マンガン（II）・五水和物、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸コバルト・七水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸ニッケル・六水和物、塩酸アミン、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、塩酸ピリドキシン、塩化カーチニン、アデニン硫酸・二水和物、または塩酸コリンのいずれか１つを培地から除いても、菌体質量にほとんど影響がなかった。

一方、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化鉄（II）、またはリン酸二水素カリウムのいずれか１つを培地から除くと、菌体質量は顕著に減少した。すなわち、マグネシウム、鉄、リン、およびカリウムは、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の増殖に必須と考えられる。

（９）ＤＮＡ塩基組成（ＧＣ含量）
ＧＣ含量は４９．９％である。

（１０）ＲＡＰＤ法により生成するＤＮＡパターン
６種類の異なるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)用プライマー（１０ｍｅｒ）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法により生成するＤＮＡパターンについて、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株と、公知の４４種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ ６９１５株；（財）発酵研究所）とを比較したところ、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（４４種類）のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。

本発明の高脂血症治療剤および食品は、有効成分として、（i）マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体）の生のものをそのまま、あるいはこれを乾燥粉末としたもの、（ii）マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、熱水抽出液）、（iii）マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株のアルカリ溶液抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、アルカリ溶液抽出液）などを含む態様が好ましく例示されるが、これら例示に限定されるものではない。

本発明では上記（i）の態様が好ましい。

本発明の高脂血症治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

本発明の高脂血症治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の培養物（Broth）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物の状態で使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した培養物（Broth）乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記培養物（Broth）乾燥物を粉砕した培養物（Broth）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

上記培養工程は、特に限定されるものでなく、一般にマツタケ菌を培養する方法を任意に用いることができるが、例えば、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株（「マツタケ菌I」）を固形培地または液体培地で培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程、前記マツタケ菌IIを静置液体培養してマツタケ菌IIIを得る工程、前記マツタケ菌IIIを振盪培養してマツタケ菌IVを得る工程、前記マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて、培養液中に通気を行わない攪拌培養してマツタケ菌Vを得る工程、前記マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIを得る工程、前記マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIIを得る工程、および前記マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養してマツタケ菌VIIIを得る工程、からなる培養方法（特願２００２−３１１８４０号明細書）が、マツタケ菌の生理活性を損うことなく大量生産できるという点から好適に用いられる。

〈マツタケ菌Iを培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程〉
用いる培地としては、一般にマツタケ菌を培養する栄養源基質を有する培地であれば特に制限なく使用することができる。例えば、太田培地（Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990）、ＭＭＮ培地（Marx, D. H., "Phytopathology", 59:153-163, 1969）、浜田培地（浜田、"マツタケ", 97-100, 1964）等が挙げられるが、これら例示に限定されるものでない。

固形培地用の固形化剤としては、カラギーナン、マンナン、ペクチン、寒天、カードラン、デンプン、アルギン酸等が好適例として挙げられる。これらのうち寒天が好ましい。

使用可能な培地の栄養源基質には、炭素源、窒素源、無機元素源などが挙げられる。

上記炭素源としては、米デンプン、小麦粉デンプン、バレイショデンプン、サツマイモデンプン等のデンプン類；デキストリン、アミロペクシン等の多糖類；マルトース、シュクロース等の少糖類；フラクトース、グルコース等の単糖類などが挙げられる。さらに麦芽エキスを挙げることができる。マツタケ菌の生長速度から、グルコースなどの単糖類が好ましい時期と、デンプン類が好ましい時期とがあるので、時期に応じた炭素源を選択し、必要に応じて組合せて使用する。

上記窒素源としては、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティーブリカー、大豆粉、大豆ペプトンなどの天然由来物質や、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素などが挙げられる。これらは単独で、あるいは組合せて用いることができる。一般に生長速度を考慮すると、天然由来物質、特に酵母エキスが好ましい。

上記無機元素源は、リン酸および微量元素を供給するために使用される。例を挙げると、リン酸塩のほか、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅、鉄などの金属イオンの無機塩（例えば、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、等）があり、必要量を培地中に溶解する。

また、培地にビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類を添加することもできる。

さらに、使用するマツタケ菌の性質に応じて、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質などを添加することができる。植物抽出物としては、果菜類、根菜類、葉菜類などの抽出物が例示される。有機酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸などが例示される。核酸関連物質としては、市販の核酸、核酸抽出物、酵母、酵母エキスなどが例示される。

固形培地を調製する場合、炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌである。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌである。さらに他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。また、調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．０、特に好ましくは５．０〜５．５とする。

〈静置液体培養〉
次に、マツタケ菌II（マツタケ菌Iを固形培地または液体培地で培養または保存したマツタケ菌）を静置液体培養してマツタケ菌IIIを製造する方法について記載する。

通常、１００ｍＬ〜２Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。

この静置液体培養は、液体培地にマツタケ菌IIを接種することにより開始する。
接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍となる量の液体培地を使用する。

接種したマツタケ菌IIを含有する培養液中のマツタケ菌IIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIを含有する培養液を接種する。

該静置液体培養での培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は３０〜４００日間が好ましく、より好ましくは１２０〜２４０日間である。培養期間が３０日未満、あるいは４００日超では、大量培養に適した生育能を有するマツタケ菌IIIを得ることが困難となる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）を初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が、２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点から好ましい。

静置液体培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

静置液体培養に用いる栄養源基質として、マツタケ菌Iを培養する固形培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類等を使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩を使用する場合は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。

調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。

マツタケ菌IIIを含有する静置液体培養による培養液の一部若しくは全部を、マツタケ菌IIを含有する培養液（若しくは培養物）と同様に静置液体培養の接種源として、再度、静置液体培養工程で使用することもできる。

〈振盪培養〉
次いで、マツタケ菌III（マツタケ菌IIを静置液体培養して得られたマツタケ菌）を振盪培養して、マツタケ菌IVを製造する方法について記載する。

通常、３００ｍＬ〜５Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。

この振盪培養は、液体培地にマツタケ菌IIIを接種することにより開始する。
接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。

なお、接種時拡大倍率に見合う培養液の量を確保するために、静置液体培養を複数の培養装置を用いて製造することもできる。

接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液中のマツタケ菌IIIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIIを含有する培養液を接種する。

振盪培養では、培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は７〜５０日間が好ましく、より好ましくは１４〜２８日間である。

振盪培養に要する動力として、通常、三角フラスコ内の培養液単位体積あたりの攪拌所要動力０．０５〜０．４ｋＷ／ｍ^３を用いる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。

振盪培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

振盪培養に用いられる栄養源基質として、マツタケ菌IIを培養する液体培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類を使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。

調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。

〈攪拌培養〉
次に、攪拌培養により、マツタケ菌V、マツタケ菌VI、マツタケ菌VII、マツタケ菌VIIIを製造する方法について記載する。

この攪拌培養は、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を接種することにより開始する。以下の説明において、マツタケ菌IVは、マツタケ菌IIIを振盪培養して得られるマツタケ菌をいい；マツタケ菌Vは、マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて培養液中に通気を行わない撹拌培養を行って得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIは、マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIは、マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIIは、マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいう。

攪拌培養で用いる液体培地は、次のようにして調製することができる。
栄養源基質は、振盪培養で使用する、炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類と同じものを使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。デンプン類を好ましく使用できる。

攪拌を行う培養液中の浸透圧に影響するグルコースなどの単糖類を併用する場合、その使用量は、好ましくは０．１〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜４０ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．７〜２０ｇ／Ｌである。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが唖好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜、添加することができる。

調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。

攪拌培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

攪拌培養の培養温度は、１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃とする。

接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。

接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液中のマツタケ菌（IV〜VII）の乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液を接種する。

攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VII）を、さらに攪拌培養の母菌として用いる場合の培養日数は、３〜２０日間が好ましく、特には５〜１４日間である。

これらの培養日数後に、マツタケ菌（V〜VII）の乾燥菌糸体含有量が、好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜８ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｇ／Ｌになっている培養液は、攪拌培養に適した生育能を有するマツタケ菌（V〜VII）を含有している。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。

他方、攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VIII）を、マツタケ菌糸体として分離する場合の培養日数は５〜３０日間であり、好ましくは７〜２０日間、特に好ましくは１０〜１５日間である。

これらの培養日数から、炭素源の資化速度が著しく低下した時を培養終了とするのが好ましいが、適宜、製造サイクル、製造コスト等の製造形態に合せて決定することができる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が３５〜１００倍となるように培養することが、工業的な生産の点で好ましい。

マツタケ菌IVを含有する振盪培養で製造した培養液を、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置による攪拌培養工程で使用することもできる。

攪拌培養に使用する培養装置は、通気攪拌ができ、無菌性が確保できれば特に制限なく使用することが可能で、必要に応じて通気することができ、または通気装置を装着できるものを使用する。したがって、通常の、小型、中型および大型の培養槽、またはジャーファーメンターを使用することができる。

１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽を用いて、マツタケ菌IVの培養を行いマツタケ菌Vを製造する場合、液体培地中に通気せずに、攪拌培養を行うのが好ましい。１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽で通気を行って培養すると、菌糸が凝集し、成長点が欠失して母菌としての生育能が損われる場合があるからである。

また、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置により工業スケールで深部攪拌培養を行う場合、必要に応じて通気を行う。この場合の通気量は０．０５〜１．０ｖｖｍ、特には０．２〜０．５ｖｖｍとするのが好ましい。

攪拌培養における攪拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの所要攪拌動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ^３、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ^３の範囲で攪拌を行うことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育を始め、酸素供給量が不足し、さらに、生育した菌糸体の分散が不十分になるので、適宜、攪拌の強度を大きくすることが必要になる。当該深部攪拌では、培養初期には低通気、低撹拌速度で培養し、培養後期には高通気、高攪拌速度で培養するのが好ましい。

深部攪拌培養から得られたマツタケ菌糸体の分離・回収は、常法によって行うことができる。例えば、フィルタープレスなどによる濾過、遠心分離などである。

得られた菌糸体は、例えば蒸留水により充分に洗浄してから、次の熱水抽出工程を実施するのが好ましい。また抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工するのが好ましい。

本発明の高脂血症治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の子実体としては、例えば、子実体をそのままで、または子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、子実体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

本発明の高脂血症治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液は、例えば培養により得られるマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体（すなわち培養菌糸体）、培養物（Broth）、または子実体を熱水で抽出することにより得ることができる。

熱水抽出に用いる熱水の温度は、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株に含有される高脂血症治療作用を示す成分が、熱水抽出液中に充分に抽出される温度である限り特に限定されるものではないが、６０〜１００℃程度が好ましく、８０〜９８℃程度がより好ましい。

菌糸体または子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工することが好ましい。

また抽出の際には、抽出効率が向上するように、攪拌または振盪しながら実施するのが好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常１〜６時間程度であり、２〜３時間程度が好ましい。

得られた熱水抽出液は、不要物が混在する状態で、そのまま、本発明の高脂血症治療剤の有効成分として用いることもできるし、あるいは不溶物を除去してから、さらにはそこから抽出液中の低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明の高脂血症治療剤の有効成分として用いることもできる。

本発明の高脂血症治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株のアルカリ抽出液は、例えば、上述したマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液の製造方法において、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、上記熱水抽出液の製造方法に準じた方法により得ることができる。

アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは８〜１３が好ましく、９〜１２がより好ましい。アルカリ溶液抽出は０〜３０℃程度で実施するのが好ましく、０〜２５℃程度がより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常３０分間〜５時間程度であり、１〜３時間程度が好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、そのまま、あるいは所望により中和処理を実施してから、本発明の高脂血症治療剤および食品に用いる。

本発明の高脂血症治療剤および食品は、有効成分であるマツタケ、特にはマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株、あるいはその抽出物を、単独で、あるいは所望により薬剤学的に許容し得る担体とともに、ヒトや動物に投与することができる。

本発明において「高脂血症治療」とは、動物やヒトなどにおいて、高脂血症発症（病的状態）の治療を意味するが、高脂血症の発症を遅延・抑制せしめる効果も含む。また高脂血症により誘発され得る疾患の発症防止効果も含む。したがって、本発明の高脂血症治療剤および食品の投与・摂取時期は、特に限定されるものではないが、日常的に継続投与・摂取するのが好ましい。

本発明の高脂血症治療剤および食品の投与・摂取剤型としては特に限定されるものでなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、座剤、局所投与のクリーム、点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。

経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法により製造することができる。

非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内など）等が例示される。なかでも注射剤が最も好適に用いられる。

例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。

また、本発明の高脂血症治療剤および食品は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の高脂血症治療剤および食品をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。

本発明の高脂血症治療剤および食品は、これに限定されるものではないが、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。

本発明の高脂血症治療剤および食品を用いる場合の投与・摂取量は、被投与者の年齢、性別、体重、または投与・摂取方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまた非経口的に投与・摂取することが可能である。

また、投与・摂取形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を、添加剤（食品添加剤など）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、またはうがい剤等に添加することができる。

なお、上記において、特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品ごとに厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要あり）をいい、いわゆる健康食品とは上記保健機能食品以外の食品一般を広く意味するもので、健康補助食品等を含むものである。

次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものでない。

I．被検物質
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥物粉末（以下「ＣＭ６２７１」とも記す）の調製
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株菌糸体を、滅菌処理した培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ６．０）３．５ｔの入った７ｔ容培養タンクに接種し、２５℃で攪拌しながら４週間培養を行った。得られた培養物を濾布濾過し、菌糸体を分離した後、蒸留水で充分に洗浄した。

得られた菌糸体の一部（約１ｋｇ）を−６０℃に凍結した後、凍結乾燥機（MINIFAST MOD. DO. 5；Edwards社）を用いて凍結乾燥することにより、乾燥菌糸体１１０ｇを得た。

この乾燥菌糸体を、ホモブレンダー（Wonder Blender社）を用いて粉砕することにより、乾燥物粉末（ＣＭ６２７１）１００ｇを得た。これをシリカゲル入りの容器に密封し、１８℃で保存した。

II．動物および飼育環境
日本クレア（株）から体重５５〜６０gの４週齢雄性Wistarラットを購入し、呉羽化学工業（株）生物医学研究所で個別飼育した。

ラットは、温度２２±１℃、相対湿度５５±１０％、換気回数１０〜２０回／時、照明時間６〜１８時間に設定したバリアシステムの飼育室にて、金属製ケージ（Ｗ１５×Ｄ３０×Ｈ１７ｃｍ）中で個別飼育した。飼育期間中の湿温度は２１．５〜２２．５℃、相対湿度は４８〜７１％で推移した。

予備飼育期間中は飼料としてＣＥ−２（オリエンタル酵母（株））を与えたが、本試験では、基本食または実験食を自由に与えた。飲料水はオートクレーブ処理した水道水を自由摂取させた。

III．飼料の調製
下記表１に示す組成の基本食（高コレステロール食）、実験食（高コレステロール食のセルロース成分の代わりにＣＭ６２７１添加）を調製した。

下記表１に示す成分（ＣＭ６２７１、セルロースを除く）中、ラードはシグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）から購入し、その他の飼料成分は和光純薬工業（株）から購入した。これら成分と、被験物質（ＣＭ６２７１）またはセルロース（対照）を所定濃度で混合することにより実験食、基本食を調製し、使用時まで４℃で保存した。

表１中、「無機物質」^（＊１）は、炭酸カルシウム３９．２９質量％、リン酸水素カルシウム二水和物０．４３質量％、リン酸二水素カリウム３４．３１質量％、塩化ナトリウム２５．０６質量％、硫酸マグネシウム七水和物９．９８質量％、クエン酸鉄ｎ水和物０．６２３質量％、硫酸銅五水和物０．１５６質量％、硫酸マンガン一水和物０．１２１質量％、塩化亜鉛０．０２質量％、沃化カリウム０．０００５質量％、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２５質量％からなる組成（水分を除く）である。「ビタミン類」^（＊２）含有量（１００飼料あたり）は、塩酸チアミン０．５ｍｇ、リボフラビン０．５ｍｇ、ニコチン酸２．５ｍｇ、パントテン酸カルシウム２．０ｍｇ、塩酸ピリドキシン０．２５ｍｇ、ビタミンＫ０．０５ｍｇ、ビオチン０．０１ｍｇ、葉酸０．０２ｍｇ、ビタミンＢ１２０．００２ｍｇ、イノシトール１０．０ｍｇ、アスコルビン酸５．０ｍｇ、α−トコフェロール１０．０ｍｇ、ビタミンＡ４００１．Ｕ．、ビタミンＤ２００１．Ｕ．である。これら無機物質およびビタミン類の選択と添加量は、「Harpar AE,Amino acide balannce and imbalance I. Dietary level of protein and acid imbalance.J.Nutrition 68:405-418,1959」記載内容に準拠した。

IV．個体およびケージ識別方法
各ラットの背側尾根部に油性マーカーで個体番号を記入することにより個体を識別した。ケージには投与区分および動物番号を記したカラーラベルを付けて識別した。

V．群分け
ラットの群分けは、体重に偏りが生じないように、ラットを２群に（１群６匹）に振り分け、各群において動物番号を付けた。余剰動物は群分け終了後試験系より除外した。

VI．実験および評価
上記２つに群分けされた各群（ｎ＝６）のラットを用いて以下の実験および評価を行った。

なお各データ統計学的処理は、スチューデント・ティー・テスト（Student t-test）を用い、有意水準を５％未満（ｐ＜０．０５）とした。

［一般状態観察、体重測定、および飼料摂取量］
一般状態は、１日１回観察し、体重を投与開始日および最終投与日を含み週１回測定した。実験食摂取期間中、週５日、ラットの一般状態を観察するとともに、体重および飼料摂取量を測定した。

実験食摂取期間中のラットの体重、体重増加量、および飼料摂取量の結果を表２および図１-１、図１-２に示す。なお表２中の数字は平均±ＳＤ（標準偏差）を示す。「飼料摂餌量」^（＊）は、４週間の総摂取量である。

表２および図１-１、図１-２の結果から明らかなように、基本食群と実験食群との間で体重および飼料摂取量はほとんど変わりなく、有意な変動はなかった。

［臓器質量（相対質量）］
試験終了時（剖検時）に肝臓、腎臓、および脳を摘出して、その質量を測定し、体重１００ｇあたりの質量換算をした。結果を表３および図２に示す。なお表３中の数字は平均±ＳＤを示す。

表３および図２の結果から明らかなように、基本食群と実験食群との間で、臓器の相対質量に有意差はなかった。

［血液、肝、および糞中の脂質量等の測定］
１．採血および臓器・糞採取方法
４週間飼育後、１２時間絶食させ、あらかじめヘパリン溶液（１０００ｕｎｉｔ／ｍＬ）を通した注射筒で心臓採血し、これを遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）して血漿を得た。

肝臓は摘出後、凍結乾燥を行い、さらに粉末化した。また、飼育最後の４日間の糞を採取し、同様に凍結乾燥後、粉末化した。

２．測定方法
上記のようにして採取した血漿、肝臓（凍結乾燥後粉末化）、糞（凍結乾燥後粉末化）を用いて、これら各試料中の総脂質量、コレステロール類、トリグリセリド等のレベルを測定した。測定は以下の方法によった。

ヘマトクリットは、多項目自動血球計数装置SysmexKX-21（シスメックス（株）製）を用いて測定した。

全コレステロール、遊離コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、トリグリセライドは、市販キット（コレステロールＥ−テストワコー、遊離コレステロールＥ−テストワコー、ＨＤＬ−コレステロールＥ−テストワコー、β−リポ蛋白Ｃ−テストワコー、トリグリセライドＥ−テストワコー；いずれも和光純薬（株）製）を用いて測定した。

肝臓および糞の脂質は、Flochの方法「Floch J., Lees M., Sloane-Stanely: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem., 226: 497-509, 1957」に準じて、組織１ｇあたりクロロホルム・メタノール（３：１）混液２０ｍＬを加え、ポッターエルハイムホモゲナイザーを用いて５分間攪拌抽出し、抽出液を濾紙濾過し、濾液を回収した。得られた残渣を同抽出液で洗浄し、洗浄液を回収した。この洗浄液を濾液と併せて減圧乾燥後、質量を測定して、全脂質量とした。

血漿、肝臓、および糞の総コレステロールは、Zakの方法「Zak B: Simple rapid microtechnique for serum total cholesterol. Am. J. Clin. Pathol..27:.583-588,.1957」に準じて測定した。すなわち、試料をアルコール・アセトン混合液を用いて抽出・濾紙濾過後、濾液０．１ｍＬに塩化鉄沈殿試薬（塩化鉄６水和物８４０ｍｇを氷酢酸１００ｍＬに溶解した液を、使用時に氷酢酸で１０倍希釈したもの）４．０ｍＬを加えて混合し、３分後に濾紙濾過して濾液を回収した。当該濾液３．０ｍＬに濃硫酸２．０ｍＬを加えてよく混合した。当該液が室温になるまで放置した後、５６０ｎｍの吸光度を分光分析計により測定し、コレステロール標準液の倹量線に外挿して定量した。

３．血漿の測定結果
上記測定方法により、血中のヘマトクリット、ヘモグロビン、グルコース、コレステロール類、およびトリグリセリドレベルの測定を行った。結果を表４および図３-１、図３-２に示す。なお表４中の数字は平均±ＳＤを示す。

表４および図３-１、図３-２の結果から明らかなように、血中のヘマトクリット値、ヘモグロビン値、およびグルコース値は、基本食群と実験食群との間でほとんど違いはなかった。

一方、総コレステロール値、遊離コレステロール値、コレステロール・エステル値、ＬＤＬ−コレステロール値、（総コレステロール − ＨＤＬ−コレステロール）／ＨＤＬ−コレステロール値、およびトリグリセリド値は、基本食群に比し実験食群で有意に低く、ＨＤＬ−コレステロールは有意に高かった。

４．肝臓の測定結果
上記測定方法により、上記凍結乾燥粉末化した肝臓中の、総脂質量、総コレステロール値、およびトリグルセリド値を測定した。結果を表５および図４に示す。なお表５中の数字は平均±ＳＤを示す。

表５および図４の結果から明らかなように、肝中の総脂質量、総コレステロール値、およびトリグルセリド値は、基本食群に比べ実験食群で有意に低かった。

５．糞の測定結果
上記測定方法により、上記凍結乾燥粉末化した糞中の、総脂質量および総コレステロール値を測定した。結果を表６および図５に示す。なお表６中の数字は平均±ＳＤを示す。

表６および図５の結果から明らかなように、糞中の総脂質量および総コレステロール値は、基本食群に比べ実験食群で有意に高かった。

以上の成績から、高コレステロール食で飼育したラットにおいて、ＣＭ６２７１経口摂取は、血漿および肝臓のコレステロール濃度上昇を抑制し、糞中への脂質排泄を促進することが示唆された。

茶葉由来粗カテキンやその構成成分は、高コレステロール食摂取ラットのコレステロール増加を抑制することが報告されており、そのメカニズムとして、食餌由来コレステロールや胆汁酸吸収並びに再吸収阻害を通じて効果が発現すると考えられている（福與・原・村松、「日本栄養・食糧学会誌」、39：495-500、1986；Muramatsu K. Fukuyo M., Hara Y. Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol-fed rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol, 32: 613-622, 1986）。ＣＭ６２７１のコレステロール低下メカニズムや活性成分は現在のところ不明であるが、シイタケ、特にはＣＭ６２７１が、コレステロールの糞中排泄を高め、結果的に血中コレステロール値低下を導いていると推察される。

VII．まとめ
上記実験結果から明らかなように、実験群では、対照群に比し、血漿総コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロール値は有意に低く、ＨＤＬ−コレステロール値は有意に高かった。さらに、肝の総脂質量、全コレステロール値、およびトリグリセリド値は有意に低かった。一方、体重増加量および飼料摂取量は両群間で差はほとんどなかった。これによりＣＭ６２７１添加飼料は高脂血症モデルラットにおいてコレステロールを低下させる作用を有することが示唆された。

実施例における実験食摂取期間の体重変化を示すグラフである。 実施例における実験食摂取期間の摂餌量を示すグラフである。 実施例における臓器（肝臓、腎臓、脳）の相対的質量（換算値）を示すグラフである。 実施例における血中のヘマトクリット（Ht）、ヘモグロビン（Hb）およびグルコース（Glu）の測定結果を示すグラフである。 実施例における血中の全コレステロール（T-Cho.）、遊離コレステロール（Free Cho.）、コレステロール・エステル（Cho-ester）、ＨＤＬ−コレステロール(HDL-Cho.)、ＬＤＬ−コレステロール(LDL-Cho.)、（総コレステロール − ＨＤＬ−コレステロール）／ＨＤＬ−コレステロール（T-Cho. − HDL-Cho.）/HDL-Cho.、およびトリグリセリド（TG）の測定結果を示すグラフである。 実施例における肝中の総脂質量、全コレステロール、およびトリグリセリドの測定結果を示すグラフである。 実施例における糞中の総脂質量、全コレステロール（T-Cho.）の測定結果を示すグラフである。

Claims (10)

1. マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、高脂血症治療剤。
2. マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項１記載の高脂血症治療剤。
3. マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株である、請求項１または２記載の高脂血症治療剤。
4. マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の高脂血症治療剤。
5. マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液、である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の高脂血症治療剤。
6. マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、高脂血症治療のための食品。
7. マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項６記載の食品。
8. マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株である、請求項６または７記載の食品。
9. マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の食品。
10. マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液、である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の食品。
    
    

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