CN115521886A - 艾渣发酵的饲用发酵制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种艾渣发酵的饲用发酵制剂及其制备方法和应用；所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法包括：将艾渣发酵的饲用发酵制剂的原料混合后进行双向性固体发酵，得到原料发酵产物；将所述原料发酵产物烘干，得到所述饲用发酵制剂。本发明旨在解决传统固体发酵，发酵周期长，有效成分利用率低，容易造成环境的污染，动物适口性差，液体发酵对仪器设备要求高，生产成本较高，动物消化吸收效率差的问题。艾渣发酵制剂在增强动物免疫力、抗病力、动物肠道菌群平衡方面均有较好效果，所制得的艾渣发酵制剂可作为饲料添加剂，也可作为替抗产品，有效解决抗生素的过度使用导致细菌耐药性和药物残留的问题。

Description

艾渣发酵的饲用发酵制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及饲料领域，具体涉及一种艾渣发酵的饲用发酵制剂及其制备方法和应用。
背景技术
中药发酵是一种传统的加工方法，可作为绿色生态的饲料添加剂，主要利用益生菌在特定的温度、湿度环境下，生物代谢产生酶类和代谢产物，对中药起到生物转化的作用。中药发酵可以分为液体发酵和固体发酵，液体发酵是在特定的生化反应器中，将发酵菌种加入比例混合好的培养液中，进行发酵。工艺要求严格，中药液体发酵前大部分需对药物进行提取，且需要特定的仪器设备，工艺复杂，使用大量化学试剂，成本较高；在生产过程中容易造成污染，会产生大量废料。传统固体发酵，以富含营养的农副产品作为发酵营养基质，用一种或多种真菌作为发酵菌种；许多固体发酵的菌种未经筛选和纯化，发酵基质不灭菌，发酵产品中的杂菌含量高，存活下来的细菌很容易在环境适宜条件下重新增殖，且抗药性增强，埋下隐患；其发酵自然开放，有效成分转化率低，获得的发酵产物的副作用较多，发酵工艺未对发酵过程中的温度、pH值、发酵时含水量等进行量化研究，导致发酵工艺欠佳。
产气荚膜梭菌属于厌氧性细菌，可以产生强烈的外毒素和侵袭性酶类，可构成强大的侵袭力，多种动物均可感染。牛感染会引起犊牛的肠毒血症和坏死性肠炎；不同毒素型的产气荚膜梭菌可引起羔羊痢疾、羊肠毒血症、羊猝狙等；猪感染时，持续性下痢，排红色水样稀粪内含组织碎片。鸡感染产气荚膜梭菌可引起鸡的腹泻、肠炎、肠毒血症，有时可见肠粘膜的组织脱落，严重则可引起死亡，给养殖业带来严重的经济损失。当前，由产气荚膜梭菌引起的疾病的防治以抗生素为主，但在养殖中抗生素的过度使用会导致细菌耐药性的产生，使动物的治疗效果适得其反，动物自身免疫力的降低，对动物产生不利影响，抗生素会产生药物残留，作为食品也会对人类安全造成不良影响。在减抗、替抗、禁止使用抗生素作为饲料添加剂的大趋势下，用益生菌或中草药以替代抗生素的现象越来越普遍，因此，探索“新型、高效、安全和绿色”的抗生素替代品逐渐成为饲料行业的研究热点。
现有技术对饲料添加剂的改进主要从以下几个方面进行：第一，通过对发酵工艺进行优化，提高药渣中有效成分的利用率。第二，简化发酵过程，让发酵物使用更加方便，降低发酵成本。第三，减少发酵过程中化学试剂的使用，减轻化学试剂对动物的不良影响。第四，对发酵所用菌种进行纯化，保证发酵过程中有益菌的含量，避免杂菌的产生。第五，加快新型、安全、高效的饲料添加剂的探索，减少抗生素的使用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种艾渣发酵的饲用发酵制剂及其制备方法和应用，旨在制备出一种艾渣发酵的饲用发酵制剂，该艾渣发酵的饲用发酵制剂对环境友好、减少了饲料抗生素的使用，同时适口性好、且发酵的饲用制剂毒性小，有较强的药理作用，有益于动物肠道菌群平衡，可以对动物的生长发育和抗病力产生有利影响。
为实现上述目的，本发明提出的一种艾渣发酵的饲用发酵制剂，所述艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备包括以下原料：枯草芽孢杆菌和黑曲霉、艾渣。
可选地，所述枯草芽孢杆菌质量为1～3份；所述黑曲霉质量为1～3份；所述艾渣质量为22～28份。
本发明还提出了艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法包括：
将所述艾渣、所述枯草芽孢杆菌和所述黑曲霉混合后进行原料发酵，得到原料发酵产物；
将所述原料发酵产物烘干，得到所述饲用发酵制剂。
可选地，将所述艾渣、所述枯草芽孢杆菌和所述黑曲霉混合后进行原料发酵，得到原料发酵产物的步骤包括：
将枯草芽孢杆菌制备成枯草芽孢杆菌的菌悬液、黑曲霉制备成黑曲霉的菌悬液，混合后接种，得混合菌悬液；
向所述混合菌悬液中添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵。
可选地，所述混合菌悬液中枯草芽孢杆菌和黑曲霉体积比为(1～3)：(1～3)。
可选地，向所述混合菌悬液添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵的步骤中，在所述发酵混合物中，所述枯草芽孢杆菌和黑曲霉的总的接种量为1％～9％。
可选地，向所述混合菌悬液添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵的步骤中，所述发酵的时间为3～7天。
可选地，向所述混合菌悬液添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵的步骤中，所述发酵用的固体培养基中的含水量为40％～80％。
可选地，将枯草芽孢杆菌制备成枯草芽孢杆菌的菌悬液、黑曲霉制备成黑曲霉的菌悬液，按比例混合后接种，得混合菌悬液的步骤包括：
将枯草芽孢杆菌菌液划线于LB固体培养基培养后，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基培养后，离心弃上清，菌体沉淀再用生理盐水重悬，制成枯草芽孢杆菌的菌悬液；
将黑曲霉菌液划线于PDA固体培养基培养后，挑取黑曲霉单个菌落，接种在PDA液体培养基培养后，离心弃上清，菌体沉淀再用生理盐水重悬，制成黑曲霉的菌悬液。
此外，本发明还提供一种饲料添加剂，包括如上所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂。
本发明提出的技术方案中，通过采用艾渣作为发酵初始原料，采用双向性固体发酵的发酵方式，以枯草芽孢杆菌和黑曲霉为发酵菌种，以具有活性成分的艾渣为发酵基质，使益生菌和艾渣有机结合。发酵基质提供营养物质满足菌体生长，同时菌体中的酶有利于基质中功能物质转化，成分发生相互作用、相互影响，产生新的味道和功能，大大提高了发酵物的适口性和药理作用。同时运用了混合菌种发酵，发酵力度更大，可使艾渣充分发酵，发酵的气固表面积大，发酵过程中气体的传递速率快，微生物在接近自然的条件下生长，培养时水分含量较少，培养过程中不易受杂菌污染，更适合微生物产酶或其他代谢产物的合成。菌丝代谢可产生一些液体发酵中不产生的酶或其他代谢产物；可以更好的将大分子物质分解被动物机体吸收。艾渣发酵物在抑制产气荚膜梭菌、调节肠道菌群平衡、增强动物机体生长性能和抗病力均有较好效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明提供的葡萄糖标准曲线的绘制：根据DNS法制得葡萄糖标准曲线示意图；
图2为L-酪氨酸标准曲线绘制：根据福林酚法制得L-酪氨酸标准曲线示意图；
图3为实施例2黄酮对产气荚膜梭菌抑菌试验图；
图4为芦丁标准曲线绘制：根据芦丁标准曲线绘制方法制得的标准曲线示意图；
图5为实施例2所制备的饲用发酵制剂与对比例的肠道损伤评分图；
图6为实施例2与对比例空肠内容物中产气荚膜梭菌菌落计数图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现有技术对饲料添加剂的改进主要从以下几个方面进行：第一，通过对发酵工艺进行优化，提高药渣中有效成分的利用率。第二，简化发酵过程，让发酵物使用更加方便，降低发酵成本。第三，减少发酵过程中化学试剂的使用，减轻化学试剂对动物的不良影响。第四，对发酵所用菌种进行纯化，保证发酵过程中有益菌的含量，避免杂菌的产生。第五，加快新型、安全、高效的饲料添加剂的探索，减少抗生素的使用。
鉴于此，本发明提供一种艾渣发酵的饲用发酵制剂，所述艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备包括以下原料：艾渣、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水，所述的发酵用水此处采用的是无菌水。
需要注意的是：艾蒿是菊科多年生草本植物，富含粗蛋白质、氨基酸、维生素、植物甾醇及多种未知生长因子、粗纤维等物质，将其补充到配合料中，能平衡和提高饲料的营养水平，再加上艾蒿的多种未知生长因子可有效促进动物生长性能，提高饲料的利用率和经济效益。同时成熟的艾蒿的枝叶含有的挥发油、多糖、黄酮、水芹烯的等物质，会散发出独特清香味，诱食和适口性强，多糖可以增强动物抗氧化能力，艾蒿中的黄酮具有很强的抑菌作用。
本发明提出的实施例中的艾渣是采用原材料艾蒿经过反复捶打、粉碎，提取艾绒后剩余的渣子而获得的，通过采用艾渣作为发酵初始原料，节约了资源，且仅用少量试剂，为微生物生长的提供了必要发酵条件，再添加经过筛选、活化后枯草芽孢杆菌和黑曲霉，将该菌种比例调整到最优，便可在适宜条件下发酵获得所需的艾渣发酵的饲用发酵制剂。该艾渣发酵的饲用发酵制剂对环境友好、减少了饲料抗生素的使用，适口性好且有益于动物肠道菌群平衡并对动物的生长性能和抗病能力产生有利影响。
在一些实施例中，具体操作如下：先将所述艾渣粉碎后过60目筛，在121℃下15min高压灭菌，将高压灭菌后的艾渣加入即可，其中，枯草芽孢杆菌：黑曲霉：艾渣的比例为(1～3)：(1～3)：(22～28)，所述艾渣比例相差偏大，会导致发酵不够充分，发酵效果不理想。具体地，本实施例中所述枯草芽孢杆菌：黑曲霉：艾渣的质量比比例为1：2：25为最优比，能够为枯草芽孢杆菌和黑曲霉提供所需要的营养物质，两种益生菌并在此基础上进行繁殖和代谢的。
枯草芽孢杆菌：黑曲霉：艾渣比例为(1～3)：(1～3)：(22～28)需要说明的是，上述配比目的在于枯草芽孢杆菌、黑曲霉、艾渣三者更好的协同作用，达到相辅相成的效果。枯草芽孢杆菌、黑曲霉、艾渣比例为1：2：25可以使艾渣充分发酵，另外，三者在此比例条件下纤维素酶活力和酸性蛋白酶活力可以得到大大提高。此外，通过两种益生菌的发酵可使艾渣细胞壁破裂，使艾渣内的黄酮、类固醇、生物碱、多糖、挥发油和酚类等天然活性成分进行结构修饰，或使底物分子发生氧化、歧化、异构化、消旋化，从而转化为价值更高的新化合物，大分子物质也更好的释放出来被动物机体吸收，发酵过程中分解的葡萄糖可以为微生物的生长提供营养物质。其他菌种比例酶活力提升不明显，艾渣内的营养物质转化不彻底导致利用率降低。在艾渣中添加枯草芽孢杆菌和黑曲霉，在发酵过程中可以分泌黄曲霉毒素降解酶，降解艾渣产生的黄曲霉结构中的呋喃环二氢双键、香兰素内脂环及戊烯酮环结构，明显降低了艾渣内的毒素含量。另外，两种菌可以改变艾渣中的活性成分的物质结构，提高有效成分的溶出率，发酵前后对比，菌种发酵可使黄酮浓度提升了近1倍，降低毒素含量，提升了抗菌效果。
需要提前说明的是，本发明采用的是双向性固体发酵技术，双向性固体发酵是在现代科技条件严格控制下，用有益的药用益生菌发酵具有活性成分的中药材(称为药性基质)，它除能提供益生菌所需营养外，同时因益生菌酶的作用，分解转化药性基质的组织成分，使原有的成分(含活性成分)转化，形成新成分，从而具有新的性味功能，因此具有“双向性”，这项新型固体发酵技术与传统固体发酵相比具有增效、扩用、解毒等优点，而药性菌质比发酵菌的子实体或药性基质自身有更好的药理与临床效果。与一般固体发酵的药用菌质相比，药性菌质因成分变化或具有较多新成分而拓展了新用途。
本发明还提出一种艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法：所述艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S10、将所述艾渣、所述枯草芽孢杆菌和所述黑曲霉混合后进行原料发酵，得到原料发酵产物。
在将艾渣发酵的饲用发酵制剂的原料混合之前，需要先挑选原料，特别是枯草芽孢杆菌和黑曲霉的筛选；具体地，在进行步骤S10之前，可以按照以下步骤进行：
步骤S101、将枯草芽孢杆菌制备成枯草芽孢杆菌的菌悬液、黑曲霉制备成黑曲霉的菌悬液，混合后接种，得混合菌悬液；
步骤S102、向所述混合菌悬液中添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵。
在一些实施例中，具体操作如下：枯草芽孢杆菌悬液制备，将枯草芽孢杆菌菌液，划线于LB固体培养基，37℃培养12h，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基上，37℃、220rpm培养12h，离心弃上清，菌体沉淀用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL菌悬液。
黑曲霉悬液制备，将菌液划线于PDA固体培养基，37℃培养48h，挑取黑曲霉单个菌落接种在PDA液体培养基，28℃、220rpm培养48h，离心弃上清，真菌沉淀用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL黑曲霉悬液。
进一步地，所述培养种子液时用的培养基有以下四种，该四类培养基有利于枯草芽孢杆菌和黑曲霉的活化。
LB液体培养基：胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，氯化钠2g，蒸馏水200mL；
LB固体培养基：胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，氯化钠2g，琼脂粉3g，蒸馏水200mL；
PDA液体培养基：马铃薯葡萄糖水5.2g，蒸馏水200mL；
PDA固体培养基：马铃薯葡萄糖水5.2g，琼脂粉3g，蒸馏水200mL。
需要说明的是，在一些实施例中，步骤S10具体操作如下：将原料混合发酵，其中按照混合菌种比例优化结果，枯草芽孢杆菌和黑曲霉选取(1～3)：(1～3)的比例进行接种，同时艾渣和麸皮的比例4：1混合作为碳源，添加1％尿素作为氮源，另外加入10％ KH2PO4、5％MgSO4为枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的生长创造一个合适环境，有利于益生菌的生长，保证繁殖性能的稳定，加入无菌水制成含水量质量比为40％～80％的混合物，即水的质量占总的混合物的40％～80％，在所述发酵混合物中，要保证所述枯草芽孢杆菌和黑曲霉的总的接种量占所述总混合物的1％～9％，在28℃～32℃密封发酵3～7d，保证发酵物不会被外界环境所污染，避免杂菌的产生，并且在发酵过程中需要每6h摇动拍打发酵瓶，避免结块使其能够均匀发酵，最后得到发酵产物。最后试验结果将待测物测定结果带入标准曲线，再带入相应公式计算酶活力。此处采用的标准曲线，如附图1、2所示：根据DNS法制得葡萄糖标准曲线和根据福林酚法制得的L-酪氨酸标准曲线。
需要注意的是；枯草芽孢杆菌和黑曲霉可合成分泌淀粉酶、纤维素酶和酸性蛋白酶等内源性酶类，可为动物提供大量内源酶。因此，本发明通过纤维素酶、酸性蛋白酶活力来作为衡量标准进行优化。
在动物饲料中添加纤维素酶，能够提升饲料的消化利用率，且纤维素酶能够补充动物内源酶的不足，适量添加纤维素酶，能够有效地促进动物对营养物质的吸收，同时纤维素酶能够降低肠胃黏稠度，促进胃肠蠕动，改善动物的消化道环境，激活胃蛋白酶，促进动物的消化和吸收。
酸性蛋白酶作为饲料添加剂，可以补充动物消化道内酸性蛋白酶的缺乏和不足，提高动物对饲料的消化率，同时酸性蛋白酶还可以明显促进幼龄动物的生长发育。
此处，采用的枯草芽孢杆菌和黑曲霉可充分利用艾渣中的有效成分，发酵后可增强蛋白酶、纤维素酶含量和发酵物的药理活性，艾渣中的黄酮被动物吸收后具有很强的抑菌作用，有助于改善肉鸡肠道环境，提高肉鸡生长性能以及抗病力。
将艾渣、枯草芽孢杆菌和黑曲霉相结合，可以将植物中的大分子物质转化成小分子物质更加利于动物机体的吸收，提高肉鸡生长性能和抗病能力。
具体地，枯草芽孢杆菌和黑曲霉可利用艾渣发酵培养基进行繁殖和代谢，艾渣与微生物之间可发生协同作用，艾渣中的营养物质有助于微生物的分裂、生长和生物转化的发生。同时微生物代谢产生的淀粉酶、纤维素酶使艾渣中的多糖、黄酮、粗纤维、粗蛋白等有效成分进行结构修饰，使底物分子发生氧化、异构化，转化为价值更高的新化合物，增强药效，减少艾渣中有毒成分的含量，同时微生物发酵可以使植物细胞壁破裂，使艾渣中的大分子物质发生降解，则进一步分解为葡萄糖、氨基酸等容易进入动物体内的小分子物质，也可以促进中药有效活性成分的析出，提高艾渣的利用率，分解产生的葡萄糖可以为微生物的生长提供营养物质，发酵也可在一定程度上改善艾渣的适口性。
具体地，黄酮类化合物具有很多的生物活性功能，包括抗炎、抗病毒、酶抑制、抗菌等作用，黄酮的抑菌范围很广，对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌及真菌均具有一定的抑菌效果。黄酮类化合物的抗菌活性，依赖于其结构，主要是芳环上的取代基，5,7-二羟基、4-羟基、3-羟基取代基都可以提高其抗菌效果。1、黄酮可破坏细胞壁膜的完整性及通透性，从而破坏微生物的细胞形态，增加细胞膜的通透性，进一步使细菌的ATP从细胞质中流出，达到降低胞内ATP含量的目的。2、抑制D-丙氨酸连接酶活性从而抑制细胞壁的合成。3、抑制关键代谢酶的合成而抑制细胞膜的合成，胞壁膜的破坏使得菌株胞内碱性磷酸酶等物质泄漏，导致细胞形态形成不可逆转的损伤。4、艾蒿黄酮类物质可抑制核酸的合成，切割DNA并可能导致细胞渗漏，从而达到抗菌作用。黄酮可抑制产气荚膜梭菌生物被膜形成和破坏菌毛结构，产气荚膜梭菌菌体边缘呈绒毛状，可见到纤维状的菌毛，黄酮作用于菌体边缘，破坏IV型菌毛的纤维状结构，使梭菌的边缘变得光滑，黏附能力下降，达到抑菌效果。
进一步地，发酵后的艾渣采取的是饮水饲喂的方式，将30g发酵物溶解在1L水中，搅拌使其充分溶解后过滤饲喂效果最好，在试验过程中适口性较好，也会降低其料肉比，而其他产品大多采用拌料饲喂的方式适口性较差。
步骤S20、将所述原料发酵产物烘干，得到所述饲用发酵制剂。
此处采用的是烘干，将发酵后样品于无菌条件下平铺于托盘中，50℃～60℃烘干，烘干过程中要晃动托盘，使其均匀烘干，烘干后取出样品密封保存。
此外，本发明还提供一种饲料添加剂，包括饲用发酵制剂，所述饲用发酵制剂由上述的所述艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法制得。
所述饲用发酵制剂具备了上述艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法的全部有益效果，在此不再一一赘述。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
发酵所用混合菌种的制备
实施例1
(1)制备艾渣培养基：称取艾渣22g粉碎后过60目筛后高压灭菌121℃灭菌15min后备用，接着向备用的艾渣添加5.5g麸皮，0.22g尿素与2.75g KH2PO4和1.38g MgSO4充分混合后，获得艾渣培养基。
(2)枯草芽孢杆菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌菌液，划线于LB固体培养基，37℃培养12h，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基上，37℃、220rpm培养12h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL枯草芽孢杆菌悬液。
黑曲霉悬液制备：将菌液划线于PDA固体培养基上，37℃培养48h，挑取黑曲霉单个菌落接种在PDA液体培养基，28℃、220rpm培养48h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL黑曲霉菌悬液。
(3)将(2)中制备的枯草芽孢杆菌悬液和黑曲霉菌悬液分别按体积比1：1混合接种于艾渣培养基，且混合后的菌悬液按3％接种量进行接种，再向艾渣培养基添加无菌水，使得该发酵培养基的含水量质量比为40％，随后将该发酵培养基置于30℃恒温发酵4d，在发酵过程中需要每8h摇动拍打发酵瓶，将发酵产物烘干后获得的饲用发酵制剂。取发酵后样品用乙酸缓冲液浸提后，根据DNS法，在波长540nm下测OD值，测定发酵后产物的纤维素酶活性；取发酵后样品用乳酸缓冲液浸提后，根据福林酚法，在波长680nm下测OD值，测定发酵后产物的酸性蛋白酶活性。
实施例2
(1)制备艾渣培养基：称取艾渣25g粉碎后过60目筛后高压灭菌121℃灭菌15min后备用，接着向备用的艾渣添加6.25g麸皮，0.25g尿素与3.125g KH2PO4和1.56g MgSO4充分混合后，获得艾渣培养基。
(2)枯草芽孢杆菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌菌液，划线于LB固体培养基，37℃培养12h，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基上，37℃、220rpm培养12h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL枯草芽孢杆菌悬液。
黑曲霉悬液制备：将菌液划线于PDA固体培养基上，37℃培养48h，挑取黑曲霉单个菌落接种在PDA液体培养基，28℃、220rpm培养48h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL黑曲霉菌悬液。
(3)将(2)中制备的枯草芽孢杆菌悬液和黑曲霉菌悬液分别按体积比1：2混合接种于艾渣培养基，且混合后的菌悬液按7％接种量进行接种，再向艾渣培养基添加无菌水，使得该发酵培养基的含水量质量比为60％，随后将该发酵培养基置于30℃恒温发酵5d，在发酵过程中需要每6h摇动拍打发酵瓶，将发酵产物烘干后获得的饲用发酵制剂，取发酵后样品用乙酸缓冲液浸提后，根据DNS法，在波长540nm下测OD值，测定发酵后产物的纤维素酶活性，取发酵后样品用乳酸缓冲液浸提后，根据福林酚法，在波长680nm下测OD值，测定发酵后产物的酸性蛋白酶活性。
实施例3
(1)制备艾渣培养基：称取艾渣28g粉碎后过60目筛后高压灭菌121℃灭菌15min后备用，接着向备用的艾渣添加7g麸皮，0.28g尿素与3.5g KH2PO4和1.75g MgSO4充分混合后，获得艾渣的培养基。
(2)枯草芽孢杆菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌菌液，划线于LB固体培养基，37℃培养12h，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基上，37℃、220rpm培养12h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL枯草芽孢杆菌悬液。
黑曲霉悬液制备：将菌液划线于PDA固体培养基上，37℃培养48h，挑取黑曲霉单个菌落接种在PDA液体培养基，28℃、220rpm培养48h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL黑曲霉菌悬液。
(3)将(2)中制备的枯草芽孢杆菌悬液和黑曲霉菌悬液分别按体积比1：3混合接种于艾渣培养基，且混合后的菌悬液按1％接种量进行接种，再向艾渣培养基添加无菌水，使得该发酵培养基的含水量质量比为70％，随后将该发酵培养基置于30℃恒温发酵3d，在发酵过程中需要每8h摇动拍打发酵瓶，将发酵产物烘干后获得的饲用发酵制剂。取发酵后样品用乙酸缓冲液浸提后，根据DNS法，在波长540nm下测OD值，测定发酵后产物的纤维素酶活性，取发酵后样品用乳酸缓冲液浸提后，根据福林酚法，在波长680nm下测OD值，测定发酵后产物的酸性蛋白酶活性。
实施例4
(1)制备艾渣培养基：称取艾渣22g粉碎后过60目筛后高压灭菌121℃灭菌15min后备用，接着向备用的艾渣添加5.5g麸皮，0.22g尿素与2.75g KH2PO4和1.38g MgSO4充分混合后，获得艾渣培养基。
(2)枯草芽孢杆菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌菌液，划线于LB固体培养基，37℃培养12h，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基上，37℃、220rpm培养12h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL枯草芽孢杆菌悬液。
黑曲霉悬液制备：将菌液划线于PDA固体培养基上，37℃培养48h，挑取黑曲霉单个菌落接种在PDA液体培养基，28℃、220rpm培养48h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL黑曲霉菌悬液。
(3)将(2)中制备的枯草芽孢杆菌悬液和黑曲霉菌悬液分别按体积比2：1混合接种于艾渣培养基，且混合后的菌悬液按5％接种量进行接种，再向艾渣培养基添加无菌水，使得该发酵培养基的含水量质量比为50％，随后将该发酵培养基置于30℃恒温发酵6d，在发酵过程中需要每8h摇动拍打发酵瓶，将发酵产物烘干后获得的饲用发酵制剂。取发酵后样品用乙酸缓冲液浸提后，根据DNS法，在波长540nm下测OD值，测定发酵后产物的纤维素酶活性，取发酵后样品用乳酸缓冲液浸提后，根据福林酚法，在波长680nm下测OD值，测定发酵后产物的酸性蛋白酶活性。
实施例5
(1)制备艾渣培养基：称取艾渣28g粉碎后过60目筛后高压灭菌121℃灭菌15min后备用，接着向备用的艾渣添加7g麸皮，0.28g尿素与3.5g KH2PO4和1.75g MgSO4充分混合后，获得艾渣的培养基。
(2)枯草芽孢杆菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌菌液，划线于LB固体培养基，37℃培养12h，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基上，37℃、220rpm培养12h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL枯草芽孢杆菌悬液。
黑曲霉悬液制备：将菌液划线于PDA固体培养基上，37℃培养48h，挑取黑曲霉单个菌落接种在PDA液体培养基，28℃、220rpm培养48h，离心，用生理盐水重悬，制成1×108CFU/mL黑曲霉菌悬液。
(3)将(2)中制备的枯草芽孢杆菌悬液和黑曲霉菌悬液分别按体积比3：1混合接种于艾渣培养基，且混合后的菌悬液按9％接种量进行接种，再向艾渣培养基添加无菌水，使得该发酵培养基的含水量质量比为80％，随后将该发酵培养基置于30℃恒温发酵7d，在发酵过程中需要每7h摇动拍打发酵瓶，将发酵产物烘干后获得的饲用发酵制剂。取发酵后样品用乙酸缓冲液浸提后，根据DNS法，在波长540nm下测OD值，测定发酵后产物的纤维素酶活性，取发酵后样品用乳酸缓冲液浸提后，根据福林酚法，在波长680nm下测OD值，测定发酵后产物的酸性蛋白酶活性。
其中，纤维素酶活性测定：发酵后样品用乙酸缓冲液浸提后，取粗酶液1mL，加0.5％的羧甲基纤维素钠溶液3mL，于50℃水浴30min，冷却加2mL DNS，再沸水浴5min，冷却至室温，加蒸馏水定容后，在波长540nm下测OD值，带入标准曲线，再带入公式计算酶活力。
酸性蛋白酶活力测定：发酵后样品用乳酸缓冲液浸提后，准确吸取1mL稀释好的待测酶液加入各试管，40℃水浴预热5min，每管加入1mL 1％酪蛋白溶液，40℃水浴10min，迅速加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸溶液，摇匀。40℃水浴10min取出，各加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL稀福林试剂，摇匀，40℃水浴20min，离心取上清，冷却至室温。在波长680nm下测OD值，带入标准曲线后，再带入公式计算酶活力。
纤维素酶活力计算公式：X＝m/t×1000×n
X:每克发酵艾渣具有的纤维素酶活力，单位U/g。
酸性蛋白酶活力计算公式：
Figure BDA0003887496830000131
X:每克发酵艾渣具有的酸性蛋白酶活力，单位U/g。
对比例1
对比例1为空白试验。
将实施例1至实施例5和对比例1所制得的饲用发酵制剂测试结果，绘制表格，其中利用做出的标准曲线和公式进行计算相应的浓度，所用标准曲线如附图1和附图2。
表一：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000141
由表一可知：实施例2酶活力值明显高于其他实施例酶活力值，即当枯草芽孢杆菌和黑曲霉比例为1：2时，纤维素酶活力为2542.13±13.610U/g。
表二：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000142
由表二可知：实施例2和实施例5酶活力值高于其他实施例酶活力值，即当枯草芽孢杆菌和黑曲霉比例为1：2和3：1时，酸性蛋白酶活力为195.71±2.647U/g和202.18±3.257U/g。
因此，综合两种酶的含量，最终选择枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌种比例为1：2。
表三：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000143
由表三可知：实施例2和实施例4的酶活力值高于其他实施例酶活力值，即当枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合接种量为7％和5％时，纤维素酶活力为1390.73±14.187U/g和1371.54±12.054U/g。
表四：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000144
由表四可知：实施例2的酶活力最高，当枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合接种量为7％时，酸性蛋白酶活力最高为232.66±5.633U/g。
因此，综合两种酶的含量，最终选择混合接种量为7％。
表五：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000151
由表五可知：实施例2和实施例3酶活力值明显高于其他实施例酶活力值，即当发酵培养基含水量为60％和70％时，纤维素酶活力为1548.09±12.828U/g和1667.06±14.185U/g。
表六：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000152
由表六可知：实施例2酶活力最高，即当发酵培养基含水量为60％时，酸性蛋白酶活力最高为253.89±7.097U/g。
因此，综合两种酶的含量，最佳发酵培养基含水量为60％。
表七：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000153
由表七可知：实施例2和实施例4酶活力明显高于其他实施例酶活力值，即当发酵时间为5天和6天时，测得纤维素酶活力为1920.37±14.869U/g和1916.53±12.081U/g。
表八：实施例一至实施例五所得的饲用发酵制剂测试结果单位：U/g
Figure BDA0003887496830000154
Figure BDA0003887496830000161
由表八可知：实施例2酶活力最高，即当发酵时间为5天时，测得酸性蛋白酶活力为184.18±5.417U/g。
因此，综合两种酶的含量，最佳发酵天数为5天。
发酵前后艾渣中毒素检测
称取10g±0.1g发酵前后艾渣，加入50mL样本提取液，用摇床或者振荡器充分震荡5min之后静置5min，用滤纸过滤，或者用离心机6000rpm离心30s，取600μL样本稀释液，加入过滤后滤液或者离心后的100μL上清液，用涡旋仪涡旋30s混匀备用。用移液枪吸取100μL经过前期处理的待测样品加入检测卡的加样孔中，静置15min，15min后测试卡插入上转发光免疫分析仪进行检测。
表九：发酵前后艾渣毒素检测
Figure BDA0003887496830000162
由表九可知：运用上转发光法对发酵前后艾渣内5种常见毒素含量进行检测，并与国标中家禽饲料或添加剂允许添加量进行比较，发酵前后艾渣里5种毒素均符合标准(黄曲霉毒素B1≤10μg/kg、玉米赤霉烯酮毒素≤500μg/kg、伏马毒素≤20mg/kg、T2毒素≤1mg/kg、呕吐毒素≤5mg/kg)，但黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮毒素发酵后的含量明显降低。枯草芽孢杆菌和黑曲霉的发酵过程中可分泌黄曲霉毒素降解酶和降解酶簇降解艾渣中的毒素，产生有益效果。
发酵物艾渣黄酮抑菌试验
采用醇提法，提取未发酵的艾渣黄酮和发酵后艾渣黄酮，具体步骤：准确称取未发酵艾渣和发酵后艾渣各25g加入80％乙醇500mL，用磁力搅拌器充分混匀，70℃水浴锅水浴1h，4℃静置过夜，6000rpm离心8min取上清，抽滤收集滤液，旋转蒸发仪旋蒸至液体挂壁，底部膏状，用10～15mL 80％乙醇溶解，滤器过滤即可。用TSC培养基和牛津杯法进行产气荚膜梭菌药敏试验。
图3的左上：为实施例2发酵后艾渣黄酮；右上；未发酵艾渣黄酮；左下：80％乙醇；右下：氨苄西林药敏片；
由图3可知：发酵后艾渣黄酮对产气荚膜梭菌形成抑菌环直径为14.51mm，未发酵艾渣黄酮形抑菌环直径为11.35mm，80％乙醇对照无抑菌作用，氨苄西林药敏片对照抑菌环直径为21.25mm。结果表明，发酵后艾渣黄酮对产气荚膜梭菌有明显的抑制和杀灭作用，且发酵可以提高艾渣的抑菌效果，产生有益作用。
发酵前后艾渣黄酮浓度检测
黄酮浓度测定方法；准确吸取50倍稀释后发酵前后艾渣黄酮1mL于25mL容量瓶中(空白对照为80％乙醇)，加入5％NaNO2溶液1mL摇匀后静置6min，再加入Al(NO3)3溶液1mL，摇匀后静置6min，加入4％NaOH溶液10mL，摇匀后用80％乙醇溶液定容，静置15min于波长510nm下测定OD值，每个样品平行3次，取平均值，用回归方程计算黄酮浓度。此处采用的标准曲线，如附图4所示，根据芦丁标准曲线绘制方法制得的标准曲线示意图。
表十：发酵前后艾渣黄酮浓度单位：mg/mL
Figure BDA0003887496830000171
由表十可知：发酵后艾渣黄酮与未发酵艾渣黄酮浓度相比提高了近1倍，枯草芽孢杆菌和黑曲霉协同发酵过程中使艾渣细胞壁破裂，使艾渣内的黄酮等活性物质更好的释放出来，浓度得到了提高，也与体外对产气荚膜梭菌抑菌效果保持一致。
动物试验
本发明实施例试验动物：选取1日龄白羽肉鸡。
发酵液配制：准确称取30g实施例2制备出的艾渣发酵物，加入1L无菌水充分搅拌混匀，使艾渣发酵物充分溶解后过滤即得。
动物分组：本试验选取60只健康体重相近雏鸡共分3个组，A：艾渣发酵液饮水+基础日粮(攻菌)、B：正常饮水+基础日粮(攻菌)、C：正常饮水+基础日粮(不攻菌)，每组20只鸡。
饲养管理：试验鸡在隔离器内进行饲养，饲养环境及用具进行严格的清扫和消毒。确保适宜的温度、湿度、通风和光照，严格按照饲养管理的要求进行，保证试验过程中对应日粮的供应，日粮采用正大肉小鸡、肉中鸡配合饲料，试验期间鸡自由采食。艾渣发酵液组保证艾渣发酵液在试验周期内的充足供应。
鸡只攻菌：采用活菌计数法确定A型产气荚膜梭菌菌液的活菌浓度为1×108CFU/mL，14日龄肉鸡除不攻菌对照组外，其他组口腔灌服产气荚膜梭菌菌液2mL/只，不攻菌对照组灌服相同剂量的无菌生理盐水，连续攻菌7d。21日龄后鸡放血致死，解剖观察其病变，分析各组病变差异。
肠道损伤评分
第21日龄后鸡放血致死，解剖观察其肠道病变，对肠道损伤情况进行评分。
表十一：肠道损伤评分标准
Figure BDA0003887496830000181
由附图5可知：实施例2组肠道评分为1.25分，而攻菌对照组为1.75分，不攻菌对照组为0分，故实施例2组在攻产气荚膜梭菌后可明显的降低肠道的损伤评分，艾渣发酵液饮水后可增强免疫力，提高肉鸡对产气荚膜梭菌的抵抗力。
空肠内容物菌落计数
准确称取空肠内容物0.1g，加入900μL无菌生理盐水制备内容物悬浮液，使用生理盐水依次做10倍比稀释，每个稀释度取100μL倾注于TSC培养基中，于37℃厌氧培养12h，测定肠道内容物中产气荚膜梭菌数量，每个稀释度设三个平行，结果以log10表示。
由附图6可知：21日龄，实施例2组、攻菌对照组与不攻菌对照组相比由于攻菌导致空肠内产气荚膜梭菌数量明显上升，实施例2组的空肠产气荚膜梭菌菌数为4.3lgCFUg-1而攻菌对照组为4.85lgCFUg-1，不攻菌对照组为3.6lgCFUg-1，故实施例2组与攻菌对照组相比空肠内产气荚膜梭菌数明显降低，说明艾渣发酵液对产气荚膜梭菌有抑制作用，可减少肠道内产气荚膜梭菌数量，增强肉鸡对产气荚膜梭菌的抵抗力。
肉鸡生长性能检测
每天记录给料量及剩料量，攻菌前后早上空腹称重，计算体重、日采食量、平均日增重和料肉比。
表十二:生长性能检测结果(体重)单位：g
Figure BDA0003887496830000191
注：*表示与攻菌对照组比较存在显著差异(P＜0.05)。
由表十二的结果可知：14日龄(攻菌前)实施例2组在攻菌前体重略高于攻菌对照组和不攻菌对照组，21日龄(攻菌后)实施例2组体重明显高于攻菌对照组且差异显著(P＜0.05)。在攻菌期间，实施例2组体重差值明显高于其他两组，攻菌对照组体重差值低于不攻菌对照组，攻菌前，攻菌对照组体重略高于不攻菌对照组，但攻菌一周后攻菌对照组体重反而低于不攻菌对照组，说明攻菌使攻菌对照组体重增长变慢，但加入实施例2的艾渣发酵的饲用发酵制剂饮水后可增强肉鸡对产气荚膜梭菌的抵抗力，可促进体重的显著增长。
表十三:生长性能检测结果(平均日增重)单位：g
Figure BDA0003887496830000201
注：*表示与攻菌对照组比较存在显著差异(P＜0.05)。
由表十三的结果可知：攻菌前三个组平均日增重无明显差别，但在攻菌一周后，实施例2组平均日增重明显高于其他两组且差异显著(P＜0.05)，攻菌对照组平均日增重低于不攻菌对照组，但差异不显著。说明采用本发明的艾渣发酵饲用发酵制剂饮水可有效抵抗产气荚膜梭菌的攻击，增强鸡的抗病力并促进体重的增长，对动物的生长产生有利作用。
表十四:生长性能检测结果(平均日采食量)单位：g
Figure BDA0003887496830000202
由表十四的结果可知：攻菌前后各组在平均日采食量上无明显差别。说明艾渣发酵液适口性较好。
表十五:生长性能检测结果(料肉比)
Figure BDA0003887496830000203
注：*表示与攻菌对照组比较存在显著差异(P＜0.05)。
由表十五的结果可知：攻菌前三个组在料肉比上无明显差别，在攻菌后，实施例2组料肉比低于其他两组且差异显著(P＜0.05)，结果说明艾渣发酵液饮水可降低肉鸡的料肉比并且促进肉鸡体重增长。
当肉鸡饮水饲喂艾渣发酵物并在产气荚膜梭菌的攻击下，体重依然显著高于攻菌对照组并且差异显著(P＜0.05)，艾渣发酵液饮水对产气荚膜梭菌有抑制作用，可提高肉鸡对产气荚膜梭菌的抗病力并促进肉鸡体重的增加，促进肉鸡生长性能的提高。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种艾渣发酵的饲用发酵制剂，其特征在于，所述艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备包括以下原料：艾渣、枯草芽孢杆菌和黑曲霉。
2.如权利要求1所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌质量为1～3份；所述黑曲霉质量为1～3份；所述艾渣质量为22～28份。
3.一种艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法包括：
将艾渣、枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合后进行原料发酵，得到原料发酵产物；
将所述原料发酵产物烘干，得到所述饲用发酵制剂。
4.如权利要求3所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，将艾渣、枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合后进行原料发酵，得到原料发酵产物的步骤包括：
将枯草芽孢杆菌制备成枯草芽孢杆菌的菌悬液、黑曲霉制备成黑曲霉的菌悬液，混合后接种，得混合菌悬液；
向所述混合菌悬液中添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵。
5.如权利要求3所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述混合菌悬液中枯草芽孢杆菌和黑曲霉体积比为(1～3)：(1～3)。
6.如权利要求3所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，向所述混合菌悬液添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵的步骤中，在所述发酵混合物中，所述枯草芽孢杆菌和黑曲霉的总的接种量为1％～9％。
7.如权利要求3所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，向所述混合菌悬液添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵的步骤中，所述发酵的时间为3～7天。
8.如权利要求3所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，向所述混合菌悬液添加麸皮、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、水进行发酵的步骤中，所述发酵用的固体培养基中的含水量质量比范围为40％～80％。
9.如权利要求3所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂的制备方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌制备成枯草芽孢杆菌的菌悬液、黑曲霉制备成黑曲霉的菌悬液，按比例混合后接种，得混合菌悬液的步骤包括：
将枯草芽孢杆菌菌液划线于LB固体培养基培养后，挑取枯草芽孢杆菌单个菌落，接种在LB液体培养基，离心弃上清，菌体沉淀再用生理盐水重悬，制成枯草芽孢杆菌的菌悬液；
将黑曲霉菌液划线于PDA固体培养基培养后，挑取黑曲霉单个菌落，接种在PDA液体培养基，离心弃上清，菌体沉淀再用生理盐水重悬，制成黑曲霉的菌悬液。
10.一种饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的艾渣发酵的饲用发酵制剂。
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