CN115708841A - 一种降解赭曲霉毒素的复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种降解赭曲霉毒素的复方制剂及其制备方法和应用，涉及生物制剂技术领域。本发明提供了一种降解赭曲霉毒素的复方制剂，所述复方制剂包括微生态制剂和中药制剂；所述微生态制剂包括贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌。本发明所述复方制剂以可溶性淀粉或葡萄糖为载体进行包被处理，对制剂的有效成分具有保护作用，可以将有效物质顺利输送至胃肠道作用位置达到相应的功效。经试验证实可知，本发明所述制剂对赭曲霉毒素的降解效果可达到90％‑99％，并且对动物机体具有促生长、提高免疫力、保护脏器、提高毒素排泄能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种降解赭曲霉毒素的复方制剂及其制备方法和应用。
背景技术
赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后另一个引起广泛学者关注的霉菌毒素，其由曲霉和青霉产生的一组污染食品的次级代谢产物真菌毒素，其毒性大、分布广、产毒量高，对农产品污染严重、与人类健康关系密切。
赭曲霉毒素对肾脏和肝脏产生损伤作用，具有致畸性、致癌性和免疫毒性等多种弊端，对动物及人类健康有很大的潜在危害。随着人们对食品安全的日益重视，研究降解霉菌毒素的学者日益增多，其降解方法也逐渐丰富起来且不断升级。
赭曲霉毒素处理方法目前主要涵盖物理法、化学法、生物法三种。物理法(主要为辐射法和吸附法)和化学法(氢氧化钠、铵盐、次氯酸钠、臭氧等)在霉菌毒素去除方面占有重要意义，但存在操作上的困难、降低饲料的营养品质和适口性等缺点，同时有些方法还不适合直接饲喂。随着研究者的不断深入及开发，生物脱霉脱毒方法逐渐呈现在人们面前，主要降解方法有微生物菌体、微生物代谢产物、微生物提取物等，具有较大的优势和应用前景。因此，筛选出一株高产且活性较高降解霉菌毒素产物的菌株并应用于实际成为重中之重，可进一步改善物理和化学方法工作量大、可行性差、难以大规模使用、去除毒素的同时破坏营养物质、成本高、清除不彻底造成二次污染、化学试剂潜在危害及操作难等弊端。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种降解赭曲霉毒素的复方制剂，能够降解赭曲霉毒素，降解产物无毒、安全。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种降解赭曲霉毒素的复方制剂，所述复方制剂包括微生态制剂和中药制剂；所述微生态制剂包括贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌；所述微生态制剂和中药制剂的质量比为3-5.5：3-6。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏号为CICC 25046；所述粪肠球菌的保藏号为CICC 20022；所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CICC20522。
优选的，所述微生态制剂中贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的质量比为3-4.5：2-3.5：3.5-5。
优选的，所述中药制剂包括如下重量份的原料：黄芩30-35份、黄芪10-130份、防风55-60份、丹参70-90份、决明子40-50份、党参55-60份、茯苓60-80份、蒲公英80-100份。
更优选的，所述中药制剂由如下步骤制备得到：
将黄芩、黄芪、防风、丹参、决明子、党参、茯苓、蒲公英分别进行水提，所得的水提液混合浓缩后进行微囊化即得所述中药制剂。
更优选的，所述浓缩为10倍浓缩；所述微囊化的载体为可溶性淀粉或葡萄糖。
本发明还提供了一种上述复方制剂的制备方法，包括如下步骤：
将贝莱斯芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉混合后得到微生态制剂，将所述微生态制剂与中药制剂混合后即得所述复方制剂。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉是分别将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌进行发酵后离心所得的菌泥经干燥后所得。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉的菌落总数为(20-30)×1010CFU/g；粪肠球菌菌粉的菌落总数为(20-50)×1010CFU/g；枯草芽孢杆菌菌粉的菌落总数为(20-30)×1010CFU/g。
本发明还提供了上述的复方制剂或上述的制备方法在促进动物生长和/或提高动物免疫力中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种降解赭曲霉毒素的复方制剂，将贝莱斯芽孢杆菌与粪肠球菌、枯草芽孢杆菌结合后，加入经过水提的中药制剂，其中贝莱斯芽孢杆菌具有高产酶，可以将霉菌毒素的结构环打开，变成不具有毒性的结构，达到降解霉菌毒素毒性的作用；粪肠球菌可以分泌有机酸促进饲料的消化吸收，同时通过占位原理黏附于肠道中，降低致病菌的感染及侵害肠道的几率。中药制剂中以黄芩、黄芪、蒲公英为君药，决明子、丹参、党参为臣药，防风为佐药，茯苓为使药，各药味配伍合理，共同发挥抑菌、降解毒素、提高免疫力和保肝护肝的功效。
本发明所述复方制剂进行包被处理，可以对制剂的有效成分具有保护作用，可以将有效物质顺利输送至胃肠道作用位置达到相应的功效。经试验证实可知，本发明所述制剂对赭曲霉毒素的降解效果可达到90％-99％，并且对动物机体具有促生长、提高免疫力、保护脏器、提高毒素排泄能力。
生物保藏说明：
本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 25046，保藏日期2020年12月24日，保藏地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼3层。
本发明所述的枯草芽孢杆菌，分类命名：枯草芽孢杆菌，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 20522，保藏地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼3层。
本发明所述的粪肠球菌，分类命名：粪肠球菌，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 20022，保藏地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼3层。
具体实施方式
本发明提供了一种降解赭曲霉毒素的复方制剂，所述复方制剂包括微生态制剂和中药制剂；所述微生态制剂包括贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌；所述微生态制剂和中药制剂的质量比为3-5.5：3-6。
本发明中，所述微生态制剂中贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的质量比为3-4.5：2-3.5：3.5-5。本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌为自主分离并已保藏的菌株，保藏号为CICC 25046；所述粪肠球菌为粪肠球菌FQ15，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 20022；所述枯草芽孢杆菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 20522。本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌可提高畜禽的饲料利用率，降低料肉比，提高生产性能，经过发酵产生的物质和酶类对畜禽致病菌具有良好的抑制效果，并可通过特定渠道降解霉菌毒素。本发明所述微生态制剂采用贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌进行复配，可显著提高畜禽的消化吸收功能、抑菌及增强免疫力、提高生产性能、降低腹泻率。
本发明中，所述中药制剂包括如下重量份的原料：黄芩30-35份、黄芪10-130份、防风55-60份、丹参70-90份、决明子40-50份、党参55-60份、茯苓60-80份、蒲公英80-100份。本发明中，所述中药制剂由如下步骤制备得到：将黄芩、黄芪、防风、丹参、决明子、党参、茯苓、蒲公英分别进行水提，所得的水提液混合浓缩后进行微囊化即得所述中药制剂。本发明中，所述浓缩优选为10倍浓缩；所述微囊化的载体优选为可溶性淀粉或葡萄糖；所述中药制剂优选为粉剂。本发明对中药原料进行水提时，所述黄芩与水的料液比优选为1：10，水提次数优选为3次，每次提取时间优选为1.5h；所述黄芪与水的料液比优选为1：10，水提次数优选为3次，每次提取时间优选为1.5h；所述防风与水的料液比优选为1：25，水提次数优选为3次，每次提取时间优选为3h；所述丹参与水的料液比优选为1：15，水提次数优选为2次，每次提取时间优选为2h；所述决明子与水的料液比优选为1：10，水提次数优选为3次，每次提取时间优选为1.5h；所述党参与水的料液比优选为1：10，水提次数优选为3次，每次提取时间优选为3h；所述茯苓与水的料液比优选为1：15，水提次数优选为2次，每次提取时间优选为2h；所述蒲公英与水的料液比优选为1：10，水提次数优选为3次，每次提取时间优选为3h。本发明的中药制剂具有无污染、无残留、无危害的优势，应用于畜禽能够达到抑菌、提高免疫力的作用，对肝脏的解毒功能具有促进支撑保护作用，具有利尿、提高肾功能、促进肾排泄代谢废物、改善和保护肾脏的功能。
本发明还提供了一种上述复方制剂的制备方法，包括如下步骤：
将贝莱斯芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉混合后得到微生态制剂，将所述微生态制剂与中药制剂混合后即得所述复方制剂。
本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉优选的是分别将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌进行发酵后离心所得的菌泥经干燥后所得。所述干燥优选为喷雾干燥，本发明对所述喷雾干燥的设备并没有特殊限定，在本发明的具体实施方式中，所述喷雾干燥设备优选为喷雾干燥塔。本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉的菌落总数优选为(20-30)×1010CFU/g；所述粪肠球菌菌粉的菌落总数优选为(20-50)×1010CFU/g；所述枯草芽孢杆菌菌粉的菌落总数优选为(20-30)×1010CFU/g。
本发明还提供了上述的复方制剂或上述的制备方法在促进动物生长和/或提高动物免疫力中的应用。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1)将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌按照各自常规的发酵工艺分别进行发酵，所得的菌泥经干燥后分别得到各菌种的菌粉；其中，各菌粉的菌落总数为：贝莱斯芽孢杆菌25×1010CFU/g，粪肠球菌FQ1540×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌20×1010CFU/g；将三种菌的菌粉按3：3.5：3.5的质量比混合得到微生态制剂；
2)中药组分各药材按着如下方法进行水提取：
黄芩与水按料液比1：10提取3次，提取1.5h/次；黄芪与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；防风与水按料液比1：25提取3次，3h/次；丹参与水按料液比1：15提取2次，2h/次；决明子与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；党参与水按料液比1：10提取3次，3h/次；茯苓与水按料液比1：15提取2次，2h/次；蒲公英与水按料液比1：10提取3次，3h/次。之后将各味中药材的水提物先混合后再10倍浓缩，按黄芩10：黄芪5：防风5：丹参10：决明子5：党参5：茯苓10：蒲公英10的体积比进行混合，最终溶液按1：10比例利用可溶性淀粉为载体进行微囊化包被，得中药制剂粉剂；3)将微生态制剂和中药制剂按4：5的质量比混合得到本发明所述的降解赭曲霉毒素的复方制剂。
实施例2
1)将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌按照各自常规的发酵工艺分别进行发酵，所得的菌泥经干燥后分别得到各菌种的菌粉；其中，各菌粉的菌落总数为：贝莱斯芽孢杆菌20×1010CFU/g，粪肠球菌FQ1530×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌30×1010CFU/g；将三种菌的菌粉按4：3：4的质量比混合得到微生态制剂；
2)中药组分各药材按着如下方法进行水提取：黄芩与水按料液比1：10提取3次，提取1.5h/次；黄芪与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；防风与水按料液比1：25提取3次，3h/次；丹参与水按料液比1：15提取2次，2h/次；决明子与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；党参与水按料液比1：10提取3次，3h/次；茯苓与水按料液比1：15提取2次，2h/次；蒲公英与水按料液比1：10提取3次，3h/次。之后将各味中药材的水提物先混合后再10倍浓缩，按黄芩10：黄芪5：防风5：丹参10：决明子5：党参5：茯苓10：蒲公英10的体积比进行混合，最终溶液按1：10比例利用可溶性淀粉为载体进行微囊化包被，得中药制剂粉剂；
3)将微生态制剂和中药制剂按4：5的质量比混合得到本发明所述的降解赭曲霉毒素的复方制剂。
实施例3
1)将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌按照各自常规的发酵工艺分别进行发酵，所得的菌泥经干燥后分别得到各菌种的菌粉；其中，各菌粉的菌落总数为：贝莱斯芽孢杆菌30×1010CFU/g，粪肠球菌FQ1545×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌25×1010CFU/g；将三种菌的菌粉按4.5：3.5：4.5的质量比混合得到微生态制剂；
2)中药组分各药材按着如下方法进行水提取：黄芩与水按料液比1：10提取3次，提取1.5h/次；黄芪与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；防风与水按料液比1：25提取3次，3h/次；丹参与水按料液比1：15提取2次，2h/次；决明子与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；党参与水按料液比1：10提取3次，3h/次；茯苓与水按料液比1：15提取2次，2h/次；蒲公英与水按料液比1：10提取3次，3h/次。之后将各味中药材的水提物先混合后再10倍浓缩，按黄芩10：黄芪5：防风5：丹参10：决明子5：党参5：茯苓10：蒲公英10的体积比进行混合，最终溶液按1：10比例利用可溶性淀粉为载体进行微囊化包被，得中药制剂粉剂；
3)将微生态制剂和中药制剂按4：5的质量比混合得到本发明所述的降解赭曲霉毒素的复方制剂。
实施例4
1)将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌按照各自常规的发酵工艺分别进行发酵，所得的菌泥经干燥后分别得到各菌种的菌粉；其中，各菌粉的菌落总数为：贝莱斯芽孢杆菌40×1010CFU/g，粪肠球菌FQ1540×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌25×1010CFU/g；将三种菌的菌粉按3.5：4：4的质量比混合得到微生态制剂；
2)中药组分各药材按着如下方法进行水提取：黄芩与水按料液比1：10提取3次，提取1.5h/次；黄芪与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；防风与水按料液比1：25提取3次，3h/次；丹参与水按料液比1：15提取2次，2h/次；决明子与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；党参与水按料液比1：10提取3次，3h/次；茯苓与水按料液比1：15提取2次，2h/次；蒲公英与水按料液比1：10提取3次，3h/次。之后将各味中药材的水提物先混合后再10倍浓缩，按黄芩10：黄芪5：防风5：丹参10：决明子5：党参5：茯苓10：蒲公英10的体积比进行混合，最终溶液按1：10比例利用可溶性淀粉为载体进行微囊化包被，得中药制剂粉剂；
3)将微生态制剂和中药制剂按4：5的质量比混合得到本发明所述的降解赭曲霉毒素的复方制剂。
实施例5
1)将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌按照各自常规的发酵工艺分别进行发酵，所得的菌泥经干燥后分别得到各菌种的菌粉；其中，各菌粉的菌落总数为：贝莱斯芽孢杆菌30×1010CFU/g，粪肠球菌FQ1530×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌20×1010CFU/g；将三种菌的菌粉按4.5：3.5：4.5的质量比混合得到微生态制剂；
2)中药组分各药材按着如下方法进行水提取：黄芩与水按料液比1：10提取3次，提取1.5h/次；黄芪与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；防风与水按料液比1：25提取3次，3h/次；丹参与水按料液比1：15提取2次，2h/次；决明子与水按料液比1：10提取3次，1.5h/次；党参与水按料液比1：10提取3次，3h/次；茯苓与水按料液比1：15提取2次，2h/次；蒲公英与水按料液比1：10提取3次，3h/次。之后将各味中药材的水提物先混合后再10倍浓缩，按黄芩10：黄芪5：防风5：丹参10：决明子5：党参5：茯苓10：蒲公英10的体积比进行混合，最终溶液按1：10比例利用可溶性淀粉为载体进行微囊化包被，得中药制剂粉剂；
3)将微生态制剂和中药制剂按4：5的质量比混合得到本发明所述的降解赭曲霉毒素的复方制剂。
对比例1
制备复方制剂的方法步骤与实施例1相同，不同之处在于：本对比例复方制剂中仅含有微生态制剂。
对比例2
制备复方制剂的方法步骤与实施例1相同，不同之处在于：本对比例中不添加微生态制剂。
对比例3
制备复方制剂的方法步骤与实施例1相同，不同之处在于：本对比例中微生态制剂中只含有贝莱斯芽孢杆菌。
实施例6
分别取实施例1-5以及对比例1-3制备得到的复方制剂(分别按复方制剂1：生理盐水5的质量比溶解后)取3mL加入到霉菌毒素(购买于天津阿尔塔生物科技有限公司)0.1mL(浓度为100μg/mL)中，于37℃条件下降解70h，利用酶联免疫吸附(ELISA)测定降解之前和之后的赭曲霉毒素含量，结果如下表1。其中，酶联免疫吸附测定(ELISA)按赭曲霉毒素试剂盒操作说明书进行测定，样品需离心后取上清。
降解率＝(实验后的数据\实验初数据)×100％。
表1各实施例和对比例降解结果(平均值±标准差)
| 组别 | 各组别降解率％ |
| 对照组1(生理盐水) | 0.00±0.00<sup>Ff</sup> |
| 实施例1 | 96.84±0.26<sup>BbDd</sup> |
| 实施例2 | 94.77±0.68<sup>CcEe</sup> |
| 实施例3 | 96.77±0.25<sup>DdBb</sup> |
| 实施例4 | 98.27±0.25<sup>Aa</sup> |
| 实施例5 | 94.17±0.31<sup>EeCc</sup> |
| 对比例1(菌剂组) | 30.69±0.66<sup>BbCc</sup> |
| 对比例2(中药组) | 20.54±0.75<sup>Dd</sup> |
| 对比例3(贝莱斯芽孢杆菌组) | 29.93±0.30<sup>CcBb</sup> |
| 对照组2(可溶性淀粉) | 0.00±0.00<sup>Ee</sup> |
可见，各实施例组与对照组降解率差异极显著，实施例4降解率极显著高于其他实施例，此种结果的产生可能是因为贝莱斯芽孢杆菌的数量高于其他组，以及导致的菌间数量比例不一致；实施例1和3差异不显著，与其他组差异极显著；实施例2和5差异不显著，与其他组差异极显著。而且，实施例1组降解率极显著高于对照组及其他对比例组。
实施例7
临床实验效果
将实施例1的复方制剂在临床进行大批量田间试验，整个饲养周期均饲喂常规饲料。对照组正常饲养，每日饮水添加可溶性淀粉200g，试验组1每日饮水添加实施例1所述的复方制剂200g，试验组2每日饮水添加实施例1所述的复方制剂150g，每日添加饮水饲喂，常规免疫。将设置试验组、对照组通过肉鸡验证本制剂对其生产性能(平均日增重、试验末平均重量、死淘率、料肉比)及粪便中赭曲霉毒素检出量的影响，各生产性能根据如下公式计算得到；
平均日增重＝[末重g-初重g]/日龄；
试验末平均重量＝试验末出栏总重量(kg)/试验末出栏总只数(kg)；
死淘率＝死淘数(只)/试验总数(只)×100％；
料肉比＝耗料总量(kg)/增重总量(kg)；
具体结果如表2：
表2肉鸡试验结果(平均值±标准差)
可见，试验组的平均日增重及试验末平均重量显著高于对照组，死淘率和料肉比显著低于对照组，试验组粪便中赭曲霉毒素检出量极显著低于对照组。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种降解赭曲霉毒素的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂包括微生态制剂和中药制剂；所述微生态制剂包括贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌；所述微生态制剂和中药制剂的质量比为3-5.5：3-6。
2.根据权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏号为CICC25046；所述粪肠球菌的保藏号为CICC20022；所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CICC 20522。
3.根据权利要求1或2所述的复方制剂，其特征在于，所述微生态制剂中贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的质量比为3-4.5：2-3.5：3.5-5。
4.根据权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，所述中药制剂包括如下重量份的原料：黄芩30-35份、黄芪10-130份、防风55-60份、丹参70-90份、决明子40-50份、党参55-60份、茯苓60-80份、蒲公英80-100份。
5.根据权利要求4所述的复方制剂，其特征在于，所述中药制剂由如下步骤制备得到：
将黄芩、黄芪、防风、丹参、决明子、党参、茯苓、蒲公英分别进行水提，所得的水提液混合浓缩后进行微囊化即得所述中药制剂。
6.根据权利要求5所述的复方制剂，其特征在于，所述浓缩为10倍浓缩；所述微囊化的载体为可溶性淀粉或葡萄糖。
7.一种权利要求1所述复方制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将贝莱斯芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉混合后得到微生态制剂，将所述微生态制剂与中药制剂混合后即得所述复方制剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉是分别将贝莱斯芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌进行发酵后离心所得的菌泥经干燥后所得。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉的菌落总数为(20-30)×1010CFU/g；粪肠球菌菌粉的菌落总数为(20-50)×1010CFU/g；枯草芽孢杆菌菌粉的菌落总数为(20-30)×1010CFU/g。
10.权利要求1-6任意一项所述的复方制剂或权利要求7-9任意一项所述的制备方法在促进动物生长和/或提高动物免疫力中的应用。
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