CN117106640A - 一种高效降解霉菌毒素的生物制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种高效降解霉菌毒素的生物制剂及其制备方法，是将自主分离的保藏号为CCTCC NO：M2021287的贝莱斯芽孢杆菌J‑1和酵母细胞壁提取物的偶联产物与屎肠球菌、丁酸梭菌及葡萄糖氧化酶混合而成，无毒、安全，在屎肠球菌、丁酸梭菌及葡萄糖氧化酶发挥各自作用的同时，有效提高了贝莱斯芽孢杆菌J‑1对于霉菌毒素的降解作用。可作为动物养殖用添加剂，而且可吸附游离在机体内的霉菌毒素并高效降解，减少霉菌毒素对动物的伤害及对蛋、肉、奶等产品的不利影响；另可作为霉菌毒素降解剂，在动物体外对饲料及排出的粪便集中处理，防止粪便中的霉菌毒素对土壤、水源及养殖器具等产生二次污染。

Description

一种高效降解霉菌毒素的生物制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于霉菌及毒素污染与控制的农业生物技术领域，尤其涉及一种高效降解霉菌毒素的生物制剂及其制备方法。
背景技术
霉菌能使饲料或食品脂肪迅速变质，蛋白质消化率降低，并严重降低赖氨酸和精氨酸水平，且使代谢能减少。霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的对人类和动物具有较大毒性的次级代谢产物，可通过饮食进入机体内，引起急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、免疫系统、呼吸系统、消化系统及生殖系统等。特别是曲霉菌、镰刀霉、青霉菌、串珠镰孢菌等真菌产生的霉菌毒素由几百种化学成分不同的有毒化合物组成，毒性更强，如黄曲霉毒素B1（AFB1）、单端孢霉烯A（T-2）、呕吐毒素（DON）、玉米烯酮(ZEN)、伏马菌素（FB）等。黄曲霉毒素 B1能抑制DNA的合成、抑制RNA酶的活性、信使RNA以及蛋白质的合成(Giuseppina等，2003)，化学性质稳定，对热不敏感，只有在280℃以上高温下才能被破坏；玉米烯酮能引起姐妹染色单体的交换、染色体的断裂，使动物繁殖功能紊乱，出现持续发情，假妊娠，甚至不育等现象。呕吐毒素能引起猪条件性味觉厌恶，表现拒食、呕吐、腹泻消化道炎症和坏死。赭曲霉毒素含量200ug/kg就可导致猪肾生长缓慢、肝脏损伤、皮肤发黄。玉米中赤霉烯酮含量1mg/kg以上母猪就并会出现假发情。同时，霉菌毒素还有蓄积性，随着猪采食霉变饲料量的增加，通过蓄积也可达到致病量。然而，现有饲料厂产品库内堆积、运输到养殖场的装载环节、养殖场的场内存放、畜舍饲喂系统的再污染等因素均造成了霉菌毒素的二次污染问题，饲料生产企业及养殖企业均十分重视。
现有养殖企业主要防控手段有传统的物理吸附剂，虽有一定脱除霉菌毒素的能力，但是效果不稳定，效率低，特别是在消化道中会被吸附，导致动物二次中毒；进一步优化后筛选具有适应不同动物消化道定植功能的益生菌与酵母细胞壁提取物进行生物偶联，通过益生菌短暂定植于肠道，使其偶联酵母细胞壁提取物可更充分吸附毒素，随着时间延长生物偶联物自动脱落，吸附毒素的酵母细胞壁提取物随着肠道蠕动排出体外，具有较好和安全的脱毒效果。然而，现有的生物偶联剂只具有脱除霉菌毒素的作用，并不具有降解霉菌毒素的功能，因此如梅雨季节等原因导致饲料中的霉菌毒素超出酵母细胞壁提取物的吸附能力时，就会有霉菌毒素残留在动物机体内，不仅会对动物机体产生上述危害，直接影响动物生长及蛋、肉、奶等产品质量。另外，所吸附的大量霉菌毒素排出体外后会对土壤、水源及养殖器具等产生二次污染。
目前，已有将益生菌及酶制剂应用于饲料添加剂的记载，如对多种病原细菌和真菌具有广泛的抑制能力的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），主要产生有机酸以提高饲料的消化率且为肠道菌群提供生长繁殖营养屎肠球菌（Enterococcus faecium），可产生丁酸且在肠道后端定殖发酵产生益生物质抑制致病菌的繁殖能力进而提高机体的生产性能丁酸梭菌（Clostridium butyricum），可提高饲料消化率并补充机体内源酶不足的葡萄糖氧化酶等。但是，迄今为止并没有关于将贝莱斯芽孢杆菌、酵母细胞壁提取物的偶联产物与屎肠球菌、丁酸梭菌及葡萄糖氧化酶组合，以提高降解霉菌毒素效能的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种高效降解霉菌毒素的生物制剂及其制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种高效降解霉菌毒素的生物制剂，是将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）J-1和酵母细胞壁提取物的偶联产物与屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）及葡萄糖氧化酶混合而成，所述贝莱斯芽孢杆菌J-1已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2021287。
优选的所述偶联产物中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为2.0~10.0×108CFU/g，所述屎肠球菌的菌数为1.0~5.0×108CFU/g，所述丁酸梭菌的菌数2.0~7.0×108CFU/g，偶联产物、屎肠球菌、丁酸梭菌的质量比为3-5：1.5-2.5：3-4；所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的2-4%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g。。
优选的所述屎肠球菌的保藏号为CICC20424，所述丁酸梭菌的保藏号为CICC10390。
一种上述的高效降解霉菌毒素的生物制剂的制备方法，依次按照如下步骤进行：
步骤1. 将酵母细胞壁提取物与贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液按照质量比为4~6：1混合，得混合物；
步骤2. 加入与混合物等质量的碳二亚胺（EDC）偶联剂，避光反应后离心浓缩得偶联产物；
步骤3. 将偶联产物、屎肠球菌及丁酸梭菌分别微囊化包被制成粉剂，包被后菌粉剂中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为2.0~10.0×108CFU/g，屎肠球菌粉剂中的菌数为1.0~5.0×108CFU/g，丁酸梭菌粉剂中的菌数为2.0~7.0×108CFU/g；
步骤4. 将偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂及葡萄糖氧化酶混合，制得高效降解霉菌毒素生物制剂，所述偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂的质量比为3-5：1.5-2.5：3-4，所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的2-4%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g。。
优选的所述步骤2避光反应15~24 h。
本发明是将自主分离的保藏号为CCTCC NO：M2021287的贝莱斯芽孢杆菌J-1和酵母细胞壁提取物的偶联产物与屎肠球菌、丁酸梭菌及葡萄糖氧化酶混合而成，无毒、安全，在屎肠球菌、丁酸梭菌及葡萄糖氧化酶发挥各自作用的同时，有效提高了贝莱斯芽孢杆菌J-1对于霉菌毒素的降解作用。一方面本发明可作为动物养殖用添加剂，通过拌料或饮水等途径进入动物体内，不仅可增加饲料的适口性及其营养价值，提高对饲料的消化吸收利用率，而且可吸附游离在机体内的霉菌毒素并高效降解，减少霉菌毒素对动物的伤害及对蛋、肉、奶等产品的不利影响；另一方面，本发明可直接作为霉菌毒素降解剂，在动物体外对饲养动物的饲料及排出的粪便集中处理，可有效避免霉菌毒素随饲料进入机体内对动物的伤害，亦可防止粪便中的霉菌毒素对土壤、水源及养殖器具等产生二次污染，更好的保护动物机体健康与生态环境。
贝莱斯芽孢杆菌J-1菌种保藏日期：2021年3月29日。
保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
保藏号：CCTCC NO：M2021287。
具体实施方式
实施例1
本发明的高效降解霉菌毒素的生物制剂，依次按照如下步骤进行制备：
步骤1. 将保藏号为CCTCC NO：M2021287的贝莱斯芽孢杆菌J-1菌，按照常规方法发酵培养，得到贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液；将酵母细胞壁提取物与贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液按照质量比为6：1混合，得混合物；
步骤2. 加入与混合物等质量的碳二亚胺（EDC）偶联剂，避光反应15h后离心浓缩得偶联产物；
步骤3. 将保藏号为CICC20424的屎肠球菌和保藏号为CICC10390的丁酸梭菌分别按照常规方法发酵得菌液并通过离心后固液分离获菌体，将偶联产物、屎肠球菌菌体和丁酸梭菌菌体分别利用可溶性淀粉作为载体，经微囊化包被制成偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂和丁酸梭菌粉剂，包被后菌粉剂中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为2.5×108CFU/g，屎肠球菌粉剂中的菌数为1.5 ×108CFU/g，丁酸梭菌粉剂中的菌数为3.0×108CFU/g；
步骤4. 将偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂及葡萄糖氧化酶用三维混合机混合均匀，制得高效降解霉菌毒素生物制剂，所述偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂的质量比为3.5 ：1.5：3，所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的3%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g，葡萄糖氧化酶为济南美味达生物科技有限公司的商品。
本发明实施例1作为添加剂使用时，可将1kg发明实施例1添加至1吨饲料中或饮水500L~1000L。
实施例2
本发明的高效降解霉菌毒素的生物制剂，依次按照如下步骤进行制备：
步骤1. 将保藏号为CCTCC NO：M2021287的贝莱斯芽孢杆菌J-1菌，按照常规方法发酵培养，得到贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液；将酵母细胞壁提取物与贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液按照质量比为5：1混合，得混合物；
步骤2. 加入与混合物等质量的碳二亚胺（EDC）偶联剂，避光反应20h后离心浓缩得偶联产物；
步骤3. 将保藏号为CICC20424的屎肠球菌和保藏号为CICC10390的丁酸梭菌分别按照常规方法发酵得菌液并通过离心后固液分离获菌体，将偶联产物、屎肠球菌菌体和丁酸梭菌菌体分别利用可溶性淀粉作为载体，经微囊化包被制成偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂和丁酸梭菌粉剂，包被后菌粉剂中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为4.0×108CFU/g，屎肠球菌粉剂中的菌数为2.5 ×108CFU/g，丁酸梭菌粉剂中的菌数为4.0×108CFU/g；
步骤4. 将偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂及葡萄糖氧化酶用三维混合机混合均匀，制得高效降解霉菌毒素生物制剂，所述偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂的质量比为3.5 ：2：3.5，所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的3%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g，葡萄糖氧化酶为济南美味达生物科技有限公司的商品。
本发明实施例2作为添加剂使用时，可将1kg发明实施例2添加至1吨饲料中或饮水500L~1000L
实施例3
本发明的高效降解霉菌毒素的生物制剂，依次按照如下步骤进行制备：
步骤1. 将保藏号为CCTCC NO：M2021287的贝莱斯芽孢杆菌J-1菌，按照常规方法发酵培养，得到贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液；将酵母细胞壁提取物与贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液按照质量比为4：1混合，得混合物；
步骤2. 加入与混合物等质量的碳二亚胺（EDC）偶联剂，避光反应24h后离心浓缩得偶联产物；
步骤3. 将保藏号为CICC20424的屎肠球菌和保藏号为CICC10390的丁酸梭菌分别按照常规方法发酵得菌液并通过离心后固液分离获菌体，将偶联产物、屎肠球菌菌体和丁酸梭菌菌体分别利用可溶性淀粉作为载体，经微囊化包被制成偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂和丁酸梭菌粉剂，包被后菌粉剂中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为10.0×108CFU/g，屎肠球菌粉剂中的菌数为5.0 ×108CFU/g，丁酸梭菌粉剂中的菌数为7.0×108CFU/g；
步骤4. 将偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂及葡萄糖氧化酶用三维混合机混合均匀，制得高效降解霉菌毒素生物制剂，所述偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂的质量比为4.5 ：2.5：3，所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的3%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g，葡萄糖氧化酶为济南美味达生物科技有限公司的商品。
本发明实施例3作为添加剂使用时，可将1kg发明实施例3添加至1吨饲料中或饮水500L~1000L。
对比例1：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是以保藏号为CICC6060的枯草芽胞杆菌替代贝莱斯芽孢杆菌J-1。
对比例2：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是以保藏号为CICC10160的解淀粉芽胞杆菌替代贝莱斯芽孢杆菌J-1。
对比例3：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是以保藏号为CICC10101的地衣芽孢杆菌替代贝莱斯芽胞杆菌J-1。
对比例4：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是以保藏号为CICC10365的迟缓芽胞杆菌替代贝莱斯芽孢杆菌J-1。
对比例5：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是以保藏号为CICC22096的短小芽胞杆菌替代贝莱斯芽孢杆菌J-1。
对比例6：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是步骤1只将酵母细胞壁提取物与空白培养基按照质量比为4：1混合，得混合物，即不添加贝莱斯芽孢杆菌J-1。
对比例7：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是步骤2中不添加碳二亚胺（EDC）偶联剂，避光反应24h后离心浓缩得产物，同时步骤3、4中的偶联产物均为步骤2所得的产物，即不添加偶联剂。
对比例8：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是不添加丁酸梭菌，步骤4只将偶联产物粉剂与屎肠球菌粉剂按质量比为4.5 ：2.5混合。
对比例9：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是不添加屎肠球菌，步骤4只将偶联产物粉剂与丁酸梭菌粉剂按质量比为4.5 ：3混合。
对比例10：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是不添加葡萄糖氧化酶，步骤4只将偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂与丁酸梭菌粉剂按质量比为4.5 ：2.5：3混合。
对比例11：
基本按照实施例3的方法制备生物制剂，与实施例3所不同的是步骤1制备贝莱斯芽孢杆菌J-1后，直接通过离心后固液分离获菌体，即不添加酵母提取物及偶联剂，步骤3则是将贝莱斯芽孢杆菌J-1的菌体经微囊化包被制成贝莱斯芽孢杆菌J-1粉剂替代偶联产物粉剂。
对比例12：
将保藏号为CCTCC NO：M2021287的贝莱斯芽孢杆菌J-1菌按照常规方法发酵培养后得菌液，活菌数为10.0×108CFU/g，利用可溶性淀粉作载体经微囊化包被制成粉剂。
实验：
一.体外降解霉菌毒素实验
（一）体外降解黄曲霉毒素B1（AFB1）
分别取本发明实施例1-3及对比例1-12各5g，与500μL黄曲霉毒素B1标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml；另以500μL黄曲霉毒素B1标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml，作为空白对照。于37℃恒温摇床中150r/min反应0h、24h、48h、72h，分别取样利用ELISA试剂盒检测黄曲霉毒素含量并计算降解率，实验结果见表1。
表1
从终降解率可见，本发明实施例1-3对黄曲霉毒素B1的降解率高于其他组别，说明本发明各组分相互配合，对黄曲霉毒素B1的降解有协同增效作用。
（二）体外降解玉米赤霉烯酮（ZEN）
分别取本发明实施例1-3及对比例1-12各5g，与500μL玉米赤霉烯酮标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml；另以500μL玉米赤霉烯酮标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml，作为空白对照。于37℃恒温摇床中150r/min反应0h、24h、48h、72h，分别取样利用ELISA试剂盒检测黄曲霉毒素含量并计算降解率，实验结果见表2。
表2
从终降解率可见，本发明实施例1-3对玉米赤霉烯酮的降解率高于其他组别，说明本发明各组分相互配合，对玉米赤霉烯酮的降解有协同增效作用。
（三）体外降解伏马毒素（FB）
分别取本发明实施例1-3及对比例1-12各5g，与500μL伏马毒素标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml；另以500μL伏马毒素标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml，作为空白对照。于37℃恒温摇床中150r/min反应0h、24h、48h、72h，分别取样利用ELISA试剂盒检测黄曲霉毒素含量并计算降解率，实验结果见表3。
表3
从终降解率可见，本发明实施例1-3对伏马毒素的降解率高于其他组别，说明本发明各组分相互配合，对伏马毒素的降解有协同增效作用。
（三）体外降解呕吐毒素（DON）
分别取本发明实施例1-3及对比例1-12各5g，与500μL呕吐毒素标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml；另以500μL呕吐毒素标准品（购买于天津阿尔塔生物科技有限公司，100μg/mL）于无菌纯化水中定容至10ml，作为空白对照。于37℃恒温摇床中150r/min反应0h、24h、48h、72h，分别取样利用ELISA试剂盒检测黄曲霉毒素含量并计算降解率，实验结果见表4。
表4
从终降解率可见，本发明实施例1-3对呕吐毒素的降解率高于其他组别，说明本发明各组分相互配合，对伏马毒素的降解有协同增效作用。
二.体内降解霉菌毒素实验
实验选择21000只体重相近、健康的肉仔鸡，随机分为7组，每组包含3个重复，每个重复1000只肉仔鸡。7个实验组为对照组、实施例1、实施例1、实施例3、对比例1、对比例2和对比例12，整个饲养周期均正常饲养并饲喂常规饲料。空白对照组的饮水中添加可溶性淀粉，其它各组分别添加对应制得的生物制剂，添加量为50升饮水添加100g。
试验结束后前后记录初始及出栏重体重，记录死逃鸡只，并将出栏时粪便取样，检测粪便样品中黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB）、呕吐毒素（DON）及玉米赤霉烯酮（ZEN）的含量（单位ng/g），实验结果见表5。
表5
从表5可见，本发明实施例1-3的料肉比及死淘率要低于其他组别，平均日增重高于其他组别，实施例1-3组肉鸡粪便的黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB）、呕吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）的含量低于其他组别。说明本发明制剂在实际应用中可达到良好的排除及降解霉菌毒素的效果，同时能够提高生产性能，降低养殖成本。

Claims (6)

1.一种高效降解霉菌毒素的生物制剂，其特征在于：将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）J-1和酵母细胞壁提取物的偶联产物与屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）及葡萄糖氧化酶混合而成，所述贝莱斯芽孢杆菌J-1已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2021287。
2.根据权利要求1所述的高效降解霉菌毒素的生物制剂，其特征在于：所述偶联产物中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为2.0~10.0×108CFU/g，所述屎肠球菌的菌数为1.0~5.0×108CFU/g，所述丁酸梭菌的菌数为2.0~7.0×108CFU/g，偶联产物、屎肠球菌、丁酸梭菌的质量比为3-5：1.5-2.5：3-4；所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的2-4%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g。
3.根据权利要求1或2所述的高效降解霉菌毒素生物制剂的制备方法，其特征在于：所述屎肠球菌的保藏号为CICC20424，所述丁酸梭菌的保藏号为CICC10390。
4.一种如权利要求1所述的高效降解霉菌毒素的生物制剂的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
步骤1. 将酵母细胞壁提取物与贝莱斯芽孢杆菌J-1菌液按照质量比为4~6：1混合，得混合物；
步骤2. 加入与混合物等质量的碳二亚胺（EDC）偶联剂，避光反应后离心浓缩得偶联产物；
步骤3. 将偶联产物、屎肠球菌及丁酸梭菌分别微囊化包被制成粉剂，偶联产物粉剂中贝莱斯芽孢杆菌的菌数为2.0~10.0×108CFU/g，屎肠球菌粉剂中的菌数为1.0~5.0×108CFU/g，丁酸梭菌粉剂中的菌数为2.0~7.0×108CFU/g；
步骤4. 将偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂及葡萄糖氧化酶混合，制得高效降解霉菌毒素生物制剂，所述偶联产物粉剂、屎肠球菌粉剂、丁酸梭菌粉剂的质量比为3-5：1.5-2.5：3-4，所述葡萄糖氧化酶添加量为生物制剂质量的2-4%，所述葡萄糖氧化酶酶活为10000U/g。
5. 根据权利要求4所述高效降解霉菌毒素生物制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2避光反应15~24 h。
6.根据权利要求4或5所述高效降解霉菌毒素生物制剂的制备方法，其特征在于：所述屎肠球菌的保藏号为CICC20424，所述丁酸梭菌的保藏号为CICC10390。
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