DE69825977T2

DE69825977T2 - Antivirale mittel

Info

Publication number: DE69825977T2
Application number: DE69825977T
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Otsu-shi SAGAWA; Nobuto Otsu-shi KOYAMA; Hideto Otsu-shi CHONO; Kazutoh Otsu-shi TAKESAKO; Ikunoshin Otsu-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2018-02-27
Also published as: EP0974347A1; JP3664735B2; CA2285988A1; CN1248164A; AU734118B2; KR20000076145A; EP0974347A4; ES2226096T3; KR100485418B1; US6518317B1; EP0974347B1; EA199900834A1; EA001607B1; AU6117698A; US20030149114A1; TW500612B; DE69825977D1; ATE274903T1; WO1998041196A1; CN1138538C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Pharmazeutika, Nahrungsmittel und Getränke, die aufgrund ihrer antiviralen Wirkung gegen pathogene Organismen nützlich sind.
Stand der Technik
Bei der antiviralen Wirkung gibt es eine Wirkung zum Induzieren der Widerstandsfähigkeit gegen Viren wie Inhibierung der Infektion des Virus bei Zellen, Inhibierung der Vermehrung des Virus in den infizierten Zellen usw., eine Wirkung zum selektiven Abtöten der Zellen, die vom Virus infiziert sind, und eine Wirkung zum Inaktivieren (d. h. Eliminieren der Infektionsfähigkeit) des Virus selbst.
Es gibt einen neutralisierenden Antikörper als Substanz, die eine Wirkung zum Inaktiveren des Virus selbst aufweist, während es einen Impfstoff als Mittel zum Induzieren eines solchen Antikörpers gibt. Obwohl die Induktion des Antikörpers durch Verabreichung von Impfstoff wirksam ist, um die Virusinfektion zu verhindern, sind derzeit jedoch wirksame therapeutische Verfahren unter Verwendung von Antikörper selten verfügbar. Außerdem gibt es kein wirksames therapeutisches Verfahren, bei dem der Virus direkt durch Pharmazeutika inaktiviert wird.
Bezüglich einer Wirkung zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Virus, erfolgt Inhibition der Replikation des Virusgenoms, Inhibition der Transkription von Virusgenom, Inhibition der Synthese von Virusprotein, Inhibition der Faltung des Virusproteins usw. Beim Induzieren solcher Wirkungen, erfolgt Unterdrückung der Aktivität oder Expres sion des Transkriptionsfaktors in der Zelle, Unterdrückung der Aktivität oder Expression des Transkriptionsfaktors vom Virus, Induktion von Hitzeschockproteinen usw. Ein Beispiel von Substanzen, die in der Lage sind, solch eine Wirkung zu induzieren, ist Prostaglandin.
Beispiele von Stoffen, die selektiv die Zellen abtöten, die von Virus infiziert sind, sind Acyclovir, Ganciclovir, Sorivudin usw., die als Arzneistoffe gegen Herpesviren verwendet werden.
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
Gegen Viren ist es viel wirksamer, mittels einer synergistischen Wirkung vorzugehen, als mittels einer Einzelwirkung. Wenn zum Beispiel eine Substanz verabreicht wird, die selektiv die virusinfizierten Zellen abtötet, ist es sehr schwierig, den Virus vollständig zu eliminieren, weil bis die infizierten Zellen abgetötet sind, neue Viren erzeugt sind und andere Zellen davon infiziert werden. Wenn hingegen eine Substanz verabreicht wird, die eine Wirkung zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren aufweist, ist es nicht möglich, die infizierten Zellen zu eliminieren.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen zu entwickeln, die eine Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen und eine Funktion zum selektiven Abtöten von virusinfizierten Zellen besitzen, und Pharmazeutika wie Antivirusmittel, Mittel zum Verbessern der hepatischen Funktion, Mittel zum Induzieren von Hitzeschockproteinen, Mittel zum Verhindern von Karzinogenese durch Onkogene, Mittel zum Verhindern von chemischer Karzinogenese usw. und antivirale Nahrungsmittel oder Getränke anzubieten, worin die oben genannte Verbindung enthalten ist.
Mittel zum Lösen der Probleme
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine intensive Untersuchung durchgeführt, um ein solches Ziel zu erreichen und sie haben gefunden, dass wenn Zellen mit einer Verbindung behandelt werden, die eine Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren und zum selektiven Abtöten der durch Virus infizierten Zellen besitzt, diese virusinfizierten Zellen selektiv geschädigt werden und deshalb die Menge an Virus, die bis zum Tod dieser Zellen erzeugt wird, abnimmt und dass, da die Zellen, die noch nicht von Virus infiziert sind, aufgrund der Verabreichung der Verbindung eine Widerstandsfähigkeit gegen Virus erwerben, Wachstum des Virus unterdrückt wird, selbst wenn eine neue Infektion auftritt. Mit anderen Worten, es wurde gefunden, dass die Verbindung, die eine Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen und zum selektiven Abtöten der durch Virus infizierten Zellen besitzt, zur Eliminierung von Viren wie AIDS-Virus des Menschen oder Hepatitis-C-Virus äußerst wirksam ist.
Die Funktion der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen kann durch Behandeln der Zellen mit der Verbindung vor einer Virusinfektion gefolgt von Verwendung der Inhibition der Virusinfektion bei Zellen, Inhibition der Replikation des Virusgenoms, Inhibition der Transkription von Virusgen, Inhibition von Virusproteinsynthese, Inhibition der Virusproteinfaltung usw. als Indices oder Maßstäbe gemessen werden.
Ferner kann die Funktion zum selektiven Abtöten der Zellen, die von Virus infiziert sind, durch Vergleichen der Überlebensrate von virusinfizierten Zellen mit denen nicht infizierter Zellen gemessen werden.
Es gibt keinerlei Einschränkung für die Verbindung mit einer Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen und auch zum selektiven Abtöten der Zellen, die von Virus infiziert sind, so lange die Verbindung diese beiden Funktionen aufweist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben das durch Formel [1] dargestellte 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on (nachfolgend einfach als „das Cyclopentenon" bezeichnet) oder eine optisch aktive Verbindung oder ein Salz davon als die Verbindung mit einer Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen und auch zum selektiven Abtöten der Zellen, die von Virus infiziert sind, gefunden, worauf die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, dass das erste Merkmal der vorliegenden Erfindung die Verwendung von mindestens einer Verbindung ausgewählt aus cis-, trans- oder einer Mischung aus Isomeren von 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on dargestellt durch die folgende Formel [I] und korrespondierende optisch aktive Formen davon oder ein Salz davon
in der Herstellung eines Wirkstoffes für die Behandlung oder Prävention von viralen Erkrankungen betrifft.
Das zweite Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus cis-, trans- oder einer Mischung aus Isomeren von 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on dargestellt durch die folgende Formel [1] und korrespondierende dargestellt durch die folgende Formel [1] und korrespondierende optisch aktive Formen davon oder ein Salz davon in der Herstellung eines Nahrungsmittels oder Getränks für die Behandlung oder Prävention von viralen Erkrankungen.
Das dritte Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus cis-, trans- oder einer Mischung aus Isomeren von 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on dargestellt durch die folgende Formel [1] und korrespondierende optisch aktive Formen davon oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon in der Herstellung eines Wirkstoffes zur Induzierung von Hitzeschockprotein (heat shock protein).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Beispiele des Virus AIDS-Virus des Menschen und Hepatitis-C-Virus. Beispiele des Antivirusmittels sind Antivirusmittel für den Menschen, Antivirusmittel für Tiere außer dem Menschen (wie Antivirusmittel für Haustiere, Hausgeflügel, Fische oder Shrimps) und Antivirusmittel für Pflanzen.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 ist ein Schaubild, das den Zusammenhang zwischen der Konzentration an Cyclopentenon und der Überlebensrate zeigt, wenn CEM-SS-Zellen verwendet werden;
2 ist ein Schaubild, das den Zusammenhang zwischen der Konzentration an Cyclopentenon und der Überlebensrate zeigt, wenn H9-Zellen verwendet werden;
3 ist ein Schaubild, das den Zusammenhang zwischen der Konzentration an Cyclopentenon und der Überlebensrate zeigt, wenn CEM-3B-Zellen verwendet werden;
4 ist ein Schaubild, das den Zusammenhang zwischen der Konzentration an Cyclopentenon und der Überlebensrate zeigt, wenn H9-3B-Zellen verwendet werden;
5 ist ein Schaubild, das eine Inhibierungswirkung des Cyclopentenons gegen Karzinogenität zeigt.
6 zeigt ein CD eines p-Dimethylaminobenzoylderivats von (–)-Cyclopentenon und eine Stereostruktur von (–)-Cyclopentenon.
7 zeigt ein CD eines p-Dimethylaminobenzoylderivats von (+)-Cyclopentenon und eine Stereostruktur von (+)-Cyclopentenon.
Ausführungsformen der Erfindung
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete in Formel [1] dargestellte Cyclopentenon deckt beide Isomeren ab, wo die Konfigurationen der Hydroxylgruppen an den 4- und 5-Positionen cis und trans sind. In der vorliegenden Erfindung kann jegliches von cis-Cyclopentenon, trans-Cyclopentenon und eine Mischung von cis- und trans-Cyclopentenon verwendet werden. Es ist auch möglich, optische aktive Substanzen davon zu verwenden.
Cis-Cyclopentenon kann durch eine chemische Synthese hergestellt werden [Helvetica Chimica Acta, Band 55, Seiten 2838-2844 (1972)]. Trans-Cyclopentenon kann entweder durch eine chemische Synthese hergestellt werden [Carbohydrate Res., Band 247, Seiten 217-222 (1993)] oder durch Erwärmen von Uronsäure wie Glucuronsäure, Uronsäurederivaten wie Glucuronlacton oder einer Substanz, die diese enthält (siehe WO-A-9 813 328) oder durch Umsetzen von 4-Acetoxy-5-alkoxypentadienal in Essigsäureanhydrid in Gegenwart von abn-Säurekatalysator (siehe JP-A-01 233255). In der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, ein erwärmtes Produkt oder teilweise gereinigtes Produkt oder gereinigtes Produkt davon zu verwenden.
Wenn zum Beispiel D-Glucuronsäure als Uronsäure verwendet wird und seine 1 % Lösung bei 121 °C vier Stunden lang erwärmt wird, wird das Cyclopentenon in der wärmebehandelten Substanz erzeugt. Das Cyclopentenon in dieser wärmebehandelten Substanz wird mit einem Lösemittel extrahiert und der Extrakt aufkonzentriert. Dann wird dieser konzentrierte Extrakt mittels einer Silicagelsäulenchromatographie getrennt, die eluierte Cyclopentenonfraktion wird aufkonzentriert, das Cyclopentenon mit Chloroform aus dem Konzentrat extrahiert und der Extrakt des Konzentrats einer Normalphasensäulenchromatographie unterzogen, worauf das Cyclopentenon in der wärmebehandelten Substanz isoliert wird.
Physikalische Eigenschaften des Cyclopentenons werden nachfolgend angegeben. Es wurde eine massenspektrometrische Analyse des Cyclopentenons unter Verwendung eines Massenspektrometers DX302 (hergestellt von Nippon Denshi) durchgeführt. Ferner wurde Messung eines NMR unter Verwendung von schwerem Chloroform als Lösemittel mit JNM-A 500 (hergestellt von Nippon Denshi) durchgeführt. Spezifische Drehung wurde mit einem DIP-370 Polarimeter (hergestellt von Nippon Bunko) gemessen; Ultraviolettabsorptionsspektrum wurde mit einem UV-2500 Spektrophotometer (hergestellt von Shimadzu) gemessen; und Infrarotabsorptionsspektrum (IR) wurde mit einem FTIR-8000 Infrarotspektrophotometer (hergestellt von Shimadzu) gemessen.
MS m/z 115 [M + H]⁺
¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,20 (1H, d, J = 2,4 Hz, 5-H), 4,83 (1H, m, 4-H), 6,30 (1H, dd, J = 1,2, 6,1 Hz, 2-H), 7,48 (1H, dd, J = 2,1, 6,1 Hz, 3-H).
Der chemische Verschiebungswert von ¹H-NMR wurde auf der Basis angegeben, dass der chemische Verschiebungswert von CHCl₃ 7,26 ppm beträgt.
Optische Drehung: [α]_D ²⁰ 0° (c 1,3, Wasser)
UV:λ_max 215 nm (Wasser)
IR (KBr-Methode): es wurden Absorptionen bei 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm^–1 festgestellt.
Wenn das isolierte Cyclopentenon einer optischen Aufspaltung unterzogen wird, werden (–)-4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on und (+)-4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on erhalten. Es versteht sich von selbst, dass nach einem synthetischen Verfahren erhaltenes Cyclopentenon ebenso einer optischen Aufspaltung unterzogen werden kann.
Zum Beispiel wird das Cyclopentenon in Ethanol aufgelöst. Zu dieser ethanolischen Lösung wird ferner Hexan/Ethanol (94/6) hinzugegeben, um eine Cyclopentenonlösung herzustellen. Das Cyclopentenon kann optisch aufgespalten werden, wenn diese Probelösung einer HPLC unterzogen wird, zum Beispiel unter Verwendung einer Chiral Pack AS (hergestellt von Daicel Chemical Industries) unter solchen Bedingungen, dass die Säulentemperatur 40 °C beträgt und die mobile Phase Hexan/Ethanol (94/6) ist.
Die optische Drehung des optisch aufgespaltenen (–)-trans-4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on [nachfolgend als (–)-Cyclopentenon bezeichnet] beträgt [α]_D ²⁰ –105° (c 0,30, Ethanol), während die des optisch aufgespaltenen (+)-trans-4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on [nachfolgend als (+)-Cyclopentenon bezeichnet] [α]_D ²⁰ +104° (c 0,53, Ethanol) beträgt. Übrigens wurde die optische Drehung mit dem oben genannten Polarimeter des Typs DIP-370 (hergestellt von Nippon Bunko) gemessen.
Danach wurde jedes von (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon einer Strukturanalyse mittels Massenanalyse und Nuklearmagnetresonanz (NMR), Messung des UV-Absorptionsspektrums und Messung des Infrarotabsorptionsspektrums nach den schon genannten Verfahren unterzogen. Als Ergebnis davon, zeigten beide optisch aktiven Substanzen das selbe Ergebnis wie das Cyclopentenon vor der optischen Aufspaltung.
Sowohl optisch aufgespaltenes (–)-Cyclopentenon wie (+)-Cyclopentenon wurde in ein p-Dimethylaminobenzoylderivat überführt, das Zirkulardichroismusspektrum (CD) unter Verwendung eines Zirkulardichroismusdispersimeters vom Typ J-720 (hergestellt von Nippon Bunko) gemessen und auf das Ergebnis die Dibenzoatchiralitätsregel angewendet [J. Am. Chem. Soc., Band 91, Seiten 3989-3991 (1969)], um die Konfiguration zu bestimmen.
Das CD des p-Dimethylaminobenzoylderivats von (–)-Cyclopentenon und die Stereostruktur von (–)-Cyclopentenon sind in 6 gezeigt. In der Zeichnung gibt die Ordinate den molaren Zirkulardichroismus an, während die Abszisse die Wellenlänge (nm) angibt. Übrigens ist die obige Stereostruktur nachfolgend als Formel [II] angegeben
Das CD des p-Dimethylaminobenzoylderivats von (+)-Cyclopentenon und die Stereostruktur von (+)-Cyclopentenon sind in 7 gezeigt. In der Zeichnung gibt die Ordinate den molaren Zirkulardichroismus an, während die Abszisse die Wellenlänge (nm) angibt. Üb rigens ist die obige Stereostruktur nachfolgend als Formel [III] angegeben
Wie in 6, 7, Formel [II] und Formel [III] gezeigt, ist das (–)-Cyclopentenon (–)-(4R, 5S)-trans-4,5-Dihydroxy-2-Cyclopenten-1-on, während das (+)-Cyclopentenon (+)-(4S, 5R)-trans-4,5-Dihydroxy-2-Cyclopenten-1-on ist.
Die oben erwähnten Cyclopentenone oder eine optisch aktive Substanz davon können durch jede Methode hergestellt werden, d.h. sie können hergestellt werden durch eine Methode, die in dieser Beschreibung offenbart ist oder mittels chemischer Synthese; und trans- und cis-Cyclopentenon oder eine Mischung davon kann ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Selbstverständlich ist eine optisch aktive Substanz der Cyclopentenone, die durch ein chemisches Syntheseverfahren erhalten werden, ebenfalls in einer optisch aktiven Substanz umfasst, die in der vorliegenden Erfindung offenbart ist.
Beispiele für das Salz des Cyclopentenons oder optisch aktive Substanz davon, sind pharmazeutisch akzeptable Salze und sie können durch bekannte Umwandlungsverfahren hergestellt werden.
Die Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, die eine Funktion zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen hat und die ebenfalls eine Funktion hat zur selektiven Abtötung der Zellen, die von dem Virus infiziert wurden, wie beispielsweise das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, hat eine antivirale Wirkung, und es ist nun möglich, einen antiviralen Wirkstoff zu erzeugen, durch Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus den obigen als eine wirksame Verbindung.
Das heißt, dass die Verbindung, die eine Funktion zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen aufweist und ebenfalls eine Funktion zur selektiven Abtötung der von dem Virus infizierten Zellen aufweist, als eine wirksame Verbindung verwendet wird, und sie wird in ein pharmazeutisches Präparat hergestellt durch Verbinden mit bekannten pharmazeutischen Trägern eingebracht, und es ist nun möglich, einen antiviralen Wirkstoff zu erzeugen. Üblicherweise wird mindestens eine der Verbindungen ausgewählt aus der Verbindung, die eine Funktion aufweist zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen und ebenfalls eine Funktion zur selektiven Tötung der Zellen, die von dem Virus infiziert wurden, aufweist, wie beispielsweise das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, wird verbunden mit einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Träger und, wenn nötig, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Emulgierungsmittel, Puffer, Stabilisator, Füllstoff, Binder, Sprengmittel, Gleitmittel, etc., werden hierzu hinzugegeben, um einen antiviralen Wirkstoff zu erhalten, welcher in fester Form, wie beispielsweise Tabletten, Granulate, verdünnte Pulver, Pulver, Kapseln etc. oder in flüssiger Form, wie beispielsweise Lösungen, Suspensionen, Emulsionen etc. vorliegen kann. Weiterhin kann dies in einem trockenen Präparat sein, welches durch Zugabe eines geeigneten Trägers vor der Verwendung flüssig gemacht werden kann.
Der pharmazeutische Träger kann abhängig von der oben beschriebenen Art und Weise der Verabreichung und Form des Präparates ausgewählt werden. Im Falle von oralen Präparaten kann Stärke, Laktose, Zucker, Mannitol, Carboxymethylcellulose, Maisstärke, anorganische Salze etc. verwendet werden. In der Herstellung von Oralpräparaten können Bindemittel, Sprengmittel, oberflächenaktive Mittel, Gleitmittel, Fluiditätspromotoren, Geschmacksgegenmittel, Färbemittel, Aromastoffe etc. ferner damit verbunden werden.
Auf der anderen Seite können im Fall von parenteralen Präparaten diese durch übliche Methoden hergestellt werden, wobei mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Verbindung, die eine Funktion zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen aufweist und ebenfalls eine Funktion zur selektiven Tötung der Zellen, die vom Virus infiziert wurden, wie beispielsweise das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, welches eine wirksame Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, in einem Verdünnungsmittel gelöst oder suspendiert werden, wie beispielsweise destilliertes Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung, wässrige Lösung von Glukose, pflanzliches Öl zur Injektion, Sesamöl, Erdnussöl, Sojaöl, Maiskeimöl, Propylenglycol, Polyethylenglycol, etc., gefolgt, wenn notwendig, durch Hinzugabe von Bakteriziden, Stabilisatoren, isotonischen Mitteln, Analgetika etc.
Der antivirale Wirkstoff der vorliegenden Erfindung wird abhängig von der Form des Präparates auf einem geeigneten Weg verabreicht. Es gibt ebenfalls keine besondere Einschränkung für die Methode der Abreichung, und es kann verabreicht werden mittels oraler Anwendung, äußerlicher Anwendung und Injektion. Injektionspräparate werden beispielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan, intrakutan etc. verabreicht, während Präparate zur äußerlichen Verwendung Zäpfchen etc. beinhalten.
Die Dosis des antiviralen Wirkstoffs ist nicht besonders spezifiziert, sondern kann in Abhängigkeit von der Dosierungsform, der Verabreichungsmethode, Zweck der Verwendung und Alter, Körpergewicht, Kondition etc. des Patienten bestimmt werden. Üblicherweise wird jedoch die Menge von mindestens einer Verbindung ausgewählt aus der Verbindung, die eine Funktion zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen aufweist, und ebenfalls eine Funktion zur selektiven Abtötung der Zellen, die von dem Virus infiziert wurden, aufweist, wie beispielsweise das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, die in dem Präparat enthalten ist, für einen Erwachsenen 0,1 μg bis 20mg/kg pro Tag sein. Selbstverständlich kann die Dosis, abhängig von verschiedenen Faktoren variieren und darum kann in einigen Fällen eine geringere Dosis als die oben erwähnte ausreichend sein, während in anderen Fällen eine höhere Dosis als die obige notwendig sein kann. Der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung kann oral verabreicht werden wie er ist, und weiterhin kann der Wirkstoff ebenfalls täglich eingenommen werden nach Hinzugabe zu einem üblichen Nahrungsmittel und/oder Getränk. Weiterhin kann die Verbindung, die eine Funktion zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen aufweist und ebenfalls eine Funktion zur selektiven Tötung von Zellen, die von dem Virus infiziert wurden, aufweist, wie beispielsweise das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, verwendet werden als Material für den antiviralen Wirkstoff, antivirales Nahrungsmittel oder Getränk.
Die Verbindung mit einer Funktion zur Induzierung einer Virusresistenz in Zellen und ebenfalls einer Funktion zur selektiven Tötung von Zellen, die von dem Virus infiziert wurden, wie beispielsweise das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat eine antivirale Aktivität gegen DNA-Viren, RNA-Viren, Retroviren und Viroide.
Dementsprechend kann er zur Herstellung eines antiviralen Wirkstoffes für Menschen, antiviralen Wirkstoffs für Tiere außer dem Menschen verwendet werden, wie beispielsweise die, die wirksam sind gegen virale Erkrankungen (beispielsweise für domestizierte Tiere, domestiziertes Geflügel und kultivierte Tiere wie Fisch und Schalentiere), antiviraler Wirkstoff für Pflanzen, wie beispielsweise die, für virale Erkrankungen von Landwirtschafts- und Gartenbauprodukten (beispielsweise Blumen und Gemüse) und antiviralen Wirkstoff für gebräuchliche belebte Dinge.
Beispiele eines DNA-Virus, der Tiere infiziert, sind Pockenvirus, Herpesvirus, Adenovirus, Hepatitis B-Virus, Papillomavirus, Polyomavirus, Epstein-Barr-Virus und Baculovirus, während ein Beispiel eines DNA-Virus, der Pflanzen infiziert, Blumenkohlmosaikvirus ist. Beispiele eines RNA-Virus, der Tiere infiziert, ist Rotavirus, Rubellavirus, japanischer Encephalitisvirus, Denguevirus, Newcastlediseasevirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Staupevirus, Influenzavirus, Vesicularstomatitisvirus, humaner Poliomyelitisvirus, Hepatitis A-Virus und Hepatitis C-Virus, während Beispiele eines RNA-Virus, der Pflanzen infiziert, Tabakmosaikvirus, Weizenverzwergungsvirus (wheat dwarf virus), Reisstreifenvirus (rice stripe virus) und Tabakringfleckvirus (ringspot virus) sind. Beispiele eines Retrovirus ist adulter T-Zellenleukämievirus und humane erworbene Immunabwehrschwäche-Virus und ein Beispiel eines Viroids ist Kartoffelspindelknollenviroid (potatos spindle tuber viroid).
Das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon, sind zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Therapie und Vorbeugung von Viruserkrankungen bei Säugern außer dem Menschen und Vögeln wie Hühnern und Truthähnen und kaltblütigen Tieren wie Fischen effektiv und eine solche Verbindung weist eine antivirale Aktivität auf die folgenden nicht humanen Viren aus. Diese sind sciruider Herpesvirus Typ 1, cavlider Herpesvirus Typ 1, la gomorpher Herpesvirus Typ 1, phasianider Herpesvirus Typ 1, phasianider Herpesvirus Typ 2, turkey Herpesvirus Typ 1, anatider Herpesvirus Typ 1, catfish Herpesvirus Typ 1, equider Herpesvirus Typ 3, bovider Herpesvirus Typ 1, bovider Herpesvirus Typ 3, bovider Herpesvirus Typ 4, porciner Herpesvirus Typ 1, porciner Herpesvirus Typ2, murider Herpesvirus Typ 1, cebider Herpesvirus Typ 1, cebider Herpesvirus Typ 2, tupalider Herpesvirus Typ 1, caniner Herpesvirus Typ 1, feliner Herpesvirus Typ 1, equider Herpesvirus Typ 1 und equider Herpesvirus Typ 2.
Viruserkrankungen von Vögeln wie die Marek-Krankheit können durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung nach in der Tierheilkunde und Zucht bekannten Verfahren verhindert und/oder geheilt werden, wie dadurch, dass das antivirale Mittel der vorliegenden Erfindung den Vögeln injiziert oder der Nahrung und dem Trinkwasser zugesetzt wird. Wenn ferner die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung direkt dem Teich, Wassertank, Lagertank oder Wasser, Seewasser usw. in einem Zuchtbereich hinzugefügt wird oder mit dem Futter vermischt wird, können die folgenden Krankheiten gleichermaßen verhindert und/oder geheilt werden. Diese sind Viruserkrankungen von Fischen, die in einem engen Bereich wie einem Teich, Wassertank, Behälter oder Zuchtbereich leben, der mit Herpesvirus wie petite catfish Virus, Herpesvirus solomons und Nerka-Virus infiziert ist, und ihre Beispiele sind infektiöse nektrotisierende Erkrankung der blutbildenden Organe, infektiöse Erkrankungen durch Herpesvirus oder infektiöse nektrotisierende Erkrankung des Pankreas bei Fischen der Familie der Lachse, virale hämorrhagische Septikämie der Regenbogenforelle, Springvirämie der Karpfen, Lymphocystis verschiedener Fische, virale nekrotisierende Erkrankung der Erythrozyten von Seefischen und anadromen Fischen, rhabdovirale Erkrankungen von Plattfischen und dergleichen, virale nekrotisierende Erkrankung des Pankreas und der Leber bei Fischbrut von Gelbschwanzfischen und dergleichen, Schnauzengeschwüre bei Torafugu (einer Art Kugelfisch) usw. Übrigens hängt die präzise Regulierung beim Verabreichen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung und des antiviralen Mittels der vorliegenden Erfindung natürlich von der Notwendigkeit für jedes zu behandelnde Tier, der Art der Behandlung und der Beurteilung des Züchters ab.
Die Tiere außer dem Menschen, denen das antivirale Mittel der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, sind in der Lage, ihre Gesundheit zu erhalten, wobei die Verbesserung der Überlebensrate, Wachstumsrate, Fortpflanzungsrate usw. signifikant ist.
Die Verbindung mit einer Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen und auch mit einer Funktion zum selektiven Abtöten der von Virus infizierten Zellen wie zum Beispiel das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, inhibiert die Synthese dieser Virusproteine und inhibiert die Synthese von Virusgenom ebenso und dementsprechend zeigt sie eine starke antivirale Wirkung. Außerdem tötet sie selektiv die mit diesen Viren infizierten Zellen ab.
Zum Beispiel sind sogar bei Patienten, die an humanem Immunschwächevirus (nachfolgend als HIV abgekürzt) leiden, nicht alle CD4-positiven Zellen von HIV infiziert, sondern nur ein Teil davon ist infiziert. Das antivirale Mittel der vorliegenden Erfindung inhibiert die Produktion von HIV in diesen infizierten Zellen und tötet gleichzeitig selektiv die infizierten Zellen ab, und induziert die Widerstandsfähigkeit gegen Virus der nicht infizierten Zellen, wobei es möglich ist, die HIV aus den Zellen zu entfernen.
Das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon weisen neben der oben genannten antiviralen Wirkung eine Fähigkeit zum Verbessern der hepatischen Funktion und eine Induktionswirkung für das Hitzeschockprotein auf. Ein Mittel zum Verbessern der Leberfunktion und ein Mittel zum Induzieren des Hitzeschockproteins, das mindestens eine Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz oder einem Salz davon enthält, kann auf die selbe Weise wie im Falle des oben genannten antiviralen Stoffes in ein pharmazeutisches Präparat eingebracht werden und kann auf die selbe Weise wie beim antiviralen Stoff verabreicht werden.
Die Dosis als Mittel zum Verbessern der hepatischen Funktion und zum Induzieren des Hitzeschockproteins ist nicht besonders spezifiziert, sondern kann in Abhängigkeit von Dosierungsform, Verabreichungsverfahren, Zweck der Verwendung und Alter, Körpergewicht, Kondition usw. des Patienten auf geeignete Weise bestimmt werden. Üblicherweise liegt die Menge mindestens einer Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz oder einem Salz davon, die in dem Präparat enthalten sind, für einen Erwachsenen bei 0,1 μg – 20 mg/kg pro Tag. Selbstverständlich kann die Dosis in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren schwanken und deshalb kann eine Dosis von weniger als der oben genannten in einigen Fällen ausreichend sein, während in anderen Fällen, eine Dosis von mehr als der oben genannten notwendig sein kann. Das Mittel der vorliegenden Erfindung kann oral verabreicht werden wie sie ist und ferner kann das Mittel ebenso täglich nach Zusatz zu üblicher Nahrung und/oder Getränk eingenommen werden. Ferner kann mindestens eine Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz oder einem Salz davon als Material für das Nahrungsmittel oder Getränk zum Verbessern der hepatischen Funktion oder zum Induzieren des Hitzeschockproteins verwendet werden.
Wenn das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon genommen wird, wird eine Störung der hepatischen Funktion gebessert und GOT- und GPT-Werte werden normal.
Außerdem weist das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon eine Induktionswirkung des Hitzeschockproteins aus wie dem Hitzeschockprotein 70 kDa (HSP70) usw., und weist eine antivirale Wirkung gegen RNA-Virus und DNA-Virus auf, wie Hepatitisvirus, AIDS-Virus, Influenzavirus, Vesikularstomatitisvirus und Herpesvirus. Das Hitzeschockprotein trägt zur Krebsimmunität bei und weist eine Bioabwehrwirkung auf. Wenn das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon genommen wird, können Viruserkrankungen wie Erkältung durch Influenza verhindert oder geheilt werden.
Übrigens ist Hitzeschockprotein ein allgemeiner Name für das Protein, dessen Synthese induziert wird, wenn eine Zelle oder ein Lebewesen einer plötzlichen Temperaturveränderung ausgesetzt wird, die um etwa 5-10 °C höher ist als die normale Temperatur, und es ist in Prokaryonten und höheren Eukaryonten verbreitet vorhanden. Beispiele bekannter Hitzeschockproteine sind HSP90, HSP70, Ubiquitin und HSP26. Darunter ist HSP70 eine Art molekularer Begleiter und ist an Proteine gebunden, wo die Faltung unvollständig ist oder nicht vollständig erfolgt ist, um die Bildung einer Stereostruktur zu unterstützen. Die Aminosäuresequenz des Hitzeschockproteins wurde im Laufe der Evolution gut erhalten und HSP70 ist mit dem DnaK-Protein von Escherichia coli identisch. Beim Menschen gibt es ungefähr zehn HSP70-Gene und einige davon werden konstitutionell exprimiert, während andere durch verschiedene Stimulationen induziert werden. Neben dem Hitzeschock, wird das Hitzeschockprotein durch verschiedene chemische Substanzen und durch Zellschäden wie Oxidation induziert.
C. Amici et al. haben berichtet [Journal of Virology, Band 68, Seiten 6890-6899 (1994)], dass wenn mit Sendai-Virus infizierte Tierzellen in Gegenwart von Prostaglandin A₁ inkubier werden, das eine α,β- ungesättigte Carbonylgruppe aufweist, die Synthese von HSP70 und HSP90 induziert wird und dass, bei der induzierten Synthese von HSP70, die Synthese von Virusprotein inhibiert ist. Ferner haben A. Rossi et al. berichtet [The Journal of Biological Chemistry, Band 271, Seiten 32192-32196 (1996)], dass wie im Falle von Prostaglandin A₁, 2-Cyclopenten-1-on die Synthese von HSP70 induziert und die Synthese von Vesikularstomatitisvirusprotein inhibiert.
Eine Fähigkeit des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Cyclopentenons zum Induzieren von HSP70 wird bei 10 μM festgestellt und wird bei 20-30 μM maximal und dies kann als eine sehr hohe Induktionsfähigkeit bezeichnet werden im Vergleich zur Tatsache, dass eine Konzentration von einigen hundert μM an 2-Cyclopenten-1-on erforderlich ist, um das HSP70 zu induzieren. Diese Fähigkeit ist äquivalent zur Fähigkeit zum Induzieren des HSP70 durch Prostaglandin A₁ und da das Molekulargewicht von Cyclopentenon nicht mehr als ein Drittel dessen von Prostaglandin A₁ beträgt, besitzt des Cyclopentenon beim Vergleich bezüglich der Gewichtskonzentration eine höhere Induktionsfähigkeit als Prostaglandin A₁.
Da das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, eine solch hohe Fähigkeit zum Induzieren des Hitzeschockproteins aufweist, besitzt es eine antivirale Wirkung gegen DNA-Virus, RNA-Virus, Retrovirus und Viroid. Beispiele solcher Viren und Viroide sind die oben genannten.
Außerdem besitzt das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von Krebszellen, die durch Krebsgen transformiert sind, und weist eine Wirkung zum Verhindern der Karzinogenese aufgrund von Krebsgen auf.
Zum Beispiel ist der Papillomavirus ein DNA-Virus, der zur Familie der Papovaviridae und dem Genus Paillomarvirus gehört, und zum Beispiel humaner Papillomavirus (HPV), HPV Typ 16, der als Ursache für Gebärmutterhalskrebs bekannt ist.
Das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon weist eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von Krebszellen auf, die durch Krebsgen E7 eines HPV16 Typs erzeugt sind. Auf diese Weise kann ein Inhibierungsmittel gegen das Wachstum von Krebszellen, die durch Virus ausgelöst sind, durch die Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz davon oder einem Salz davon als Wirkkomponente angeboten werden, wodurch Krebsentstehung durch Krebsgen vorgebeugt werden kann.
Übrigens weist das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon eine inhibierende Wirkung auf die Karzinogenese in zwei Schritten auf, als Initiator und Promotor, und es ist nun möglich, ein Inhibierungsmittel gegen chemische Krebsentstehung anzubieten, das mindestens eine Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz davon oder einem Salz davon als Wirkkomponente enthält.
Dementsprechend ist es möglich, Nahrungsmittel oder Getränk zur Vorbeugung von Karzinogenese anzubieten, das mindestens eine Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz davon oder einem Salz davon enthält.
Ein Mittel zur Verhinderung der Karzinogenese durch Onkogen oder ein Mittel zum Unterdrücken der chemischen Karzinogenese enthaltend mindestens eine Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz davon oder einem Salz davon kann zur Herstellung eines Medikaments verwendet und nach einem Verfahren verabreicht werden, das ähnlich ist wie beim antiviralen Mittel.
Bei der Herstellung des antiviralen Nahrungsmittels oder Getränks der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Verbindung zu verwenden, die eine Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Virus in Zellen und auch eine Funktion zum selektiven Abtöten von virusinfizierten Zellen aufweist, wie Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon. Es ist auch möglich, ein wärmebehandeltes Produkt von Uronsäure zu verwenden, das das Cyclopentenon oder ein teilweise gereinigtes oder gereinigtes Cyclopentenon erhalten aus der wärmebehandelten Substanz enthält.
Ferner ist es bei der Herstellung eines Wirkung exprimierenden Nahrungsmittels oder Getränks mit einer Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Induzieren von Hitzeschockproteinen, Vorbeugen der Karzinogenese usw. auch möglich, das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon oder ein wärmebehandeltes Produkt von Uronsäure zu verwenden, das das Cyclopentenon oder ein teilweise gereinigtes oder ein gereinigtes Cyclopentenon erhalten aus der wärmebehandelten Substanz enthält.
Auf diese Weise ist ein Nahrungsmittel oder Getränk, das durch Verdünnen und/oder Zusetzen des Cyclopentenons, einer optisch aktiven Substanz davon oder eines Salzes davon oder eines Materials ausgewählt aus dem Cyclopentenon enthaltenden wärmebehandelten Produkt, teilweise gereinigtem Cyclopentenon und gereinigtem Cyclopentenon aus dem wärmebehandelten Produkt hergestellt ist, vom antiviralen Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung umfasst.
Es gibt keine besondere Einschränkung für das Verfahren zur Herstellung des antiviralen Nahrungsmittels oder Getränks der vorliegenden Erfindung, aber Garen, Verarbeiten und üblicherweise verwendete Herstellungsverfahren für Nahrungsmittel oder Getränke können angewendet werden, vorausgesetzt, dass eine wirksame Menge mindestens einer Verbindung ausgewählt aus der Verbindung mit einer Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Virus in Zellen und auch mit einer Funktion zum selektiven Abtöten der von Virus infizierten Zellen, wie zum Beispiel das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon, ist im erhaltenen Nahrungsmittel oder Getränk enthalten.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Form des antiviralen Nahrungsmittels oder Getränks der vorliegenden Erfindung, so lange eine Verbindung ausgewählt aus der Verbindung mit einer Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Virus in Zellen und auch mit einer Funktion zum selektiven Abtöten der von Virus infizierten Zellen, wie zum Beispiel Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz davon oder ein Salz davon, darin enthalten, zugesetzt und/oder darin verdünnt ist. Auf diese Weise umfasst die Form solche, die oral aufgenommen werden können, wie Tabletten, Granulat, Kapseln, Gel und Sol.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Form des Nahrungsmittels oder Getränks mit einer Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Induzieren von Hitzeschockproteinen, Vorbeugen der Karzinogenese, so lange eine Verbindung ausgewählt aus Cyclopentenon, einer optisch aktiven Substanz oder einem Salz davon mit einer Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Induzieren von Hitzeschockproteinen, Vorbeugen der Karzinogenese darin enthalten, zugesetzt und/oder darin verdünnt ist. Auf diese Weise umfasst die Form solche, die oral aufgenommen werden können, wie Tabletten, Granulat, Kapseln, Gel und Sol.
Das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung enthält Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon mit physiologischen Wirkungen und aufgrund der physiologischen Wirkungen der Verbindung wie antivirale Wirkung, Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Induzieren von Hitzeschockproteinen, Vorbeugen der Karzinogenese usw. ist es ein gesundes Nahrungsmittel oder Getränk mit Wirkungen zum Vorbeugen und Behandeln von Viruserkrankungen, Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Wirkung zum Vorbeugen von Karzinogenese usw. und ferner ist es ein Nahrungsmittel oder Getränk, das zur Erhaltung der Homöostasis im lebenden Körper geeignet ist.
Es wurde bei der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung keine Toxizität beobachtet, selbst wenn die Dosis, die wirksam ist, um diese physiologischen Wirkungen zu erreichen, verabreicht wird. Im Falle der oralen Verabreichung ist zum Beispiel bei Ratten bei einmaliger oraler Verabreichung von 100 mg/kg irgendeines von Cyclopentenon, einer optischen aktiven Substanz oder eines Salzes davon kein Todesfall aufgetreten.
Zusammenfassend kann das pharmazeutische Mittel der vorliegenden Erfindung als therapeutisches oder vorbeugendes Mittel für Viruserkrankungen, Lebererkrankungen, Krebs usw. verwendet werden und ist besonders geeignet für die Therapie von AIDS, das durch HIV induziert ist und zur Verbesserung dieses Syndroms.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird ferner erläutert durch die folgenden Beispiele, obwohl die vorliegende Erfindung niemals auf diese Bei spiele beschränkt ist. Übrigens bedeuten in den Beispielen verwendete „%" „Gewichts-%".
Vergleichsbeispiel 1
D-Glucuronsäure (G 5269, hergestellt von Sigma) (10 g) wurde in 1 Liter Wasser aufgelöst, auf 121 °C vier Stunden lang erwärmt und in vacuo auf ungefähr 10 ml aufkonzentriert. Dieses wurde vermischt mit 40 ml der oberen Schicht einer Mischung von Butylacetat, Essigsäure und Wasser mit 3:2:2 und zentrifugiert und die erhaltene Überstandsflüssigkeit wurde in vacuo auf ungefähr 10 ml aufkonzentriert.
Der obige Extrakt wurde auf Silicagel (BW-300SP; 2 × 28 cm, hergestellt von Fuji Silycia) für eine Säulenchromatographie aufgegeben und unter Verwendung einer oberen Schicht einer Mischung von Butylacetat, Essigsäure und Wasser mit 3:2:2 als Elutionsmittel bei einer Strömungsrate von ungefähr 5 ml/Minute bei einem Druck von 0,2 kg/cm² unter Verwendung eines Kompressors getrennt. Es wurde eine Fraktionierung vorgenommen, um ein Volumen einer Fraktion von 10 ml zu erhalten und ein Teil jeder Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie analysiert, worauf Cyclopentenon in hoher Reinheit in der 61. bis 80. Fraktion enthalten war. Diese Fraktionen wurden gesammelt, in vacuo aufkonzentriert, mit 40 ml Chloroform extrahiert und der Extrakt in vacuo aufkonzentriert, so dass 100 mg Cyclopentenon erhalten wurden.
Die Fraktion wurde mittels einer Normalphasen-HPLC unter Verwendung einer Säule Palpack Typ S (hergestellt von Takara Shuzo) getrennt, und bei einer Erfassung durch Ultraviolettabsorption bei 215 nm wurde eine Reinheit von 98 % gefunden.
Das obige Cyclopentenon (113, 9 mg) wurde in 2,85 ml Ethanol aufgelöst. Zu dieser ethanolischen Lösung wurden 3,85 ml He xan/Ethanol (94/6) hinzugefügt, um eine Cyclopentenonlösung (17 mg/ml) herzustellen. Diese Lösung wurde durch einen Filter von 0,5 μm filtriert, um eine Probenlösung für eine HPLC mit optischer Aufspaltung herzustellen.
Diese Probenlösung wurde auf eine HPLC mit optischer Aufspaltung aufgegeben, wobei jede der Fraktionen von (–)-Cyclopentenon im früheren Peak und von (+)-Cyclopentenon im späteren Peak gesammelt und in vacuo zur Trockene eingedampft wurde, so dass 43,2 mg des (–)-Cyclopentenons und 43,0 mg des (+)-Cyclopentenon erhalten wurden.
Bedingungen der HPLC mit optischer Aufspaltung
Säulen: Chiral Pack AS (hergestellt von Daicel) 2,0 cm × 25,0 cm
Säulentemperatur: 40 °C
Mobile Phase: Hexan/Ethanol (94/6)
Strömungsrate: 14,0 ml/Minute
Detektion: UV 210 nm
Menge der aufgegebenen Probe: 150 μl (2,55 mg)
Jedes des hier erhaltenen (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon enthält ungefähr 1 % Enantiomer und deshalb wurden sie einer erneuten optischen Aufspaltung unter den oben genannten Bedingungen unterzogen. Als Folge davon wurden 19,7 mg des (–)-Cyclopentenon ohne Enantiomergehalt aus 30,0 mg des (–)-Cyclopentenon des früheren Peaks erhalten, während aus 37,4 mg des (+)-Cyclopentenon aus dem späteren Peak, 27,7 mg des (+)-Cyclopentenon ohne Enantiomerengehalt erhalten wurden. Übrigens betrugen die Elutionszeiten bei der HPLC mit optischer Auflösung für (–)-Cyclopentenon 33 Minuten und für (+)-Cyclopentenon 40 Minuten.
Beispiel 1
(1) Ein RPMI 1640 Medium (5 ml), das 10 % fetales Rinderserum enthält, das 2 × 10⁵ Zellen/ml humane promyelozytische Leukämiezellen HL-60 (ATCC CCL-240) enthält, wurde in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen platziert, bei 37 °C 24 Stunden lang in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert, dann das im Vergleichsbeispiel 1 beschriebene Cyclopentenon hinzugefügt, so dass eine Endkonzentration von 0, 10, 20, 30, 40, 50 oder 100 μM erhalten wurde, und die Inkubation wurde für weitere acht Stunden fortgesetzt.
Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellzahlen ausgezählt und die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, um mit Cyclopentenon behandelte Zellen herzustellen. In der Zwischenzeit wurden ebenso Zellen hergestellt, die zehn Minuten lang auf 45 °C erwärmt und danach der selben Inkubation unterzogen wurden.
Die derart behandelten Zellen wurden nach einem in „Molecular Cloning" [Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] beschriebenen Verfahren einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen. Die behandelten Zellen wurden in einem SDS-PAGE Probenpuffer suspendiert, so dass eine Konzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen/ml erreicht wurde, die erhaltene Zellsuspension wurde bei 100 °C zehn Minuten lang behandelt und jeweils 5 μl davon wurden auf zwei Tafeln von SDS-PAGE Gelen aufgetragen (5 % Stapelgel; 10 % Trennungsgel), um eine Elektrophorese vorzunehmen. Eines der Gele wurde mit Coomassie gefärbt, während das andere Gel einem Blotting mit einer Polyvinylidendifluoridtransfermembran (Immobilon^TM, hergestellt von Millipore, Katalog Nr. IPVH000-10) unterzogen wurde. Die Membran wurde einer Blockierung bei 4 °C über Nacht mit Block Ace (hergestellt von Dainippon Pharmaceutical; Katalog Nr. UK-B25) unterzogen.
Die blockierte Membran wurde mit monoklonalem Antikörper HSP 72/73 (AB-1) (hergestellt von Oncogene Research Products, Katalog-Nr. HSP01) umgesetzt, der spezifisch mit wärmeinduziertem Hitzeschockprotein von 70 kDa reagiert und mit TBS gewaschen, das 0,05 % Tween 20 enthält, gefolgt von einem weiteren Waschen mit TBS. Danach wurde mit Peroxidase versetztem sekundärem Antikörper HRP-Hase-Anti-Maus IgG (H+L) (hergestellt von Zymed Laboratories, Katalog-Nr. 61-6520) umgesetzt und auf die selbe Weise wie beim obigen Schritt gewaschen. Die Membranen, die mit primären und sekundären Antikörpern als solche behandelt wurden, wurden mit Renaissance^TM (einem Chemilumorreagens hergestellt von Dupont NEN, Katalog-Nr. NEL-100) umgesetzt und mit einem Röntgenfilm photosensibilisiert, um die Induktion des Hitzeschockproteins von 70 kDa zu bestätigen.
Das Ergebnis war, dass durch Zugabe von Cyclopentenon (20 bis 30 μM) die Induktion des Hitzeschockproteins von 70 kDa, das fast das selbe war wie das bei 45 °C für 10 Minuten wärmebehandelte, bestätigt wurde. Die Intensität der Induktion ist in Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 gibt „+" den Intensitätsgrad der Induktion an und je mehr „+", desto intensiver ist die Induktion. Übrigens bedeutet „ – ", dass keine Induktion festgestellt wurde, und „±" bedeutet, dass die Induktion gering war.
Tabelle 1
Die selben Ergebnisse wurden auch im Falle von (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon erhalten.
Beispiel 2
(1) HeLa-Zellen (ATCC CCL-2) wurden in mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; hergestellt von Nissuisha), das 10 fetales Rinderserum enthält, in einer 10 cm Platte bei 37 °C in Gegenwart von 5 % Kohlendioxidgas inkubiert, bis eine Konfluenz von 80 erfolgte, dann wurde Cyclopentenon hinzugegeben, so dass die Endkonzentration 0, 5, 10, 20 oder 40 μM beträgt, und die Inkubation wurde unter den oben genannten Bedingungen weitere sechs Stunden fortgesetzt. Das Medium wurde verworfen, 1 ml 10 % Trichloressigsäure in jede der Vertiefungen hinzugegeben und die Zellen mit einem Schaber gewonnen.
Die so hergestellten Zellen wurden nach einem Verfahren von Beispiel 1 einer SDS-PAGE und einem Blotting unterzogen, um die Expression des 70 kDa Hitzeschockproteins zu erfassen.
Das Ergebnis war, dass Induktion des 70 kDa Hitzeschockproteins in Abschnitten gefunden wurde, denen Cyclopentenon von 5 μM bis 40 μM zugesetzt war. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 angegeben. In Tabelle 2 gibt das Zeichen „+" die Signalstärke des im Blotting beobachteten 70 kDa Hitzeschockproteins an und je mehr „+", desto intensiver ist das Signal. Das Zeichen „±" bedeutet, dass das Signal sehr schwach war.
Tabelle 2
(2) HeLa-Zellen wurden in einem DMEM, das 10 % fetales Rinderserum enthält, in einer 10 cm Platte bei 37 °C in Gegenwart von 5 Kohlendioxidgas inkubiert, bis eine Konfluenz von 80 % erfolgte, dann wurde Cyclopentenon hinzugegeben, so dass seine Endkonzentration 0, 5, 10, 20 oder 40 μM beträgt, und die Inkubation wurde unter den oben genannten Bedingungen weitere sechs Stunden fortgesetzt. Danach wurden die Zellen mit dem DMEM, das 5 % fetales Rinderserum enthält, gewaschen, dann wurde das DMEM, das 5 % fetales Rinderserum enthält, das Ad5 dIX [ein Adenovirus; Saito et al.: Journal of Virology, Band 54, Seiten 711–719 (1985)] enthält, den Zellen hinzugegeben, so dass die Zellen damit infiziert wurden, und die Inkubation wurde für 20 Stun den durchgeführt. Übrigens wurde die Multiplizität der Infektionen (m.o.i.) auf 50 eingestellt. Das Medium wurde verworfen, 1 ml 10 Trichloressigsäure in jede der Vertiefungen hinzugegeben und die Zellen mit einem Schaber gewonnen.
Dann wurden SDS-PAGE und Blotting der oben erhaltenen behandelten Zellen nach dem Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt, um die Expression von Hexonproteinen des Adenovirus zu erfassen. Übrigens wurde Anti-Adenovirushexonantikörper (AB 1056; hergestellt von Chemicon International Inc.) als primärer Antikörper verwendet.
In dem Teil, dem 10 μM Cyclopentenon oder mehr hinzugefügt wurden, nahm die Menge an Hexonprotein erkennbar ab, im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war. In den Teilen, denen 20 μM Cyclopentenon oder weniger hinzugefügt wurden, war das beobachtete Wachstum der Zellen ähnlich dem im Teil, dem kein Cyclopentenon zugesetzt war.
(3) Virale DNA wurde nach dem in „Protocols for Experiments of Virus" (Seiten 24-25; veröffentlicht von Medical View) aus HeLa-Zellen extrahiert, die mit Cyclopentenon behandelt und mit Adenovirus infiziert wurden, gefolgt von Inkubation auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(2).
Auf diese Weise wurden von Virus infizierte Zellen mit einer mit Phosphorsäure gepufferten Salzlösung gewaschen, in 1 ml wässriger Lösung von 0,6 % Natriumlaurylsulfat (SDS) suspendiert und 10 mM EDTA und 3,0 ml von 5 M wässriger Natriumchloridlösung hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 0 °C eine Stunde stehen gelassen und zentrifugiert und 3 ml Ethanol wurden der erhaltenen Überstandsflüssigkeit hinzugefügt, danach vermischt. Der durch Zentrifugieren abgetrennte Niederschlag wurde in 0,2 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl mit pH 8,0 und 1 mM EDTA) aufgelöst, dann wurden 2 μl 10 % SDS und 4 μl 10 mg/ml Proteinase K (hergestellt von Takara Shuzo) hinzugegeben und die Mischung wurde bei 37 °C ein Stunde lang stehen gelassen. Dies wurde mit einer Mischung von gleichen Mengen an Phenol und Chloroform zweimal extrahiert, 20 μl 3 M Natriumacetat und 400 μl Ethanol zur wässrigen Schicht hinzugegeben, die Mischung zentrifugiert und der Niederschalg in 50 μl des TE-Puffers aufgelöst, so dass eine DNA-Lösung erhalten wurde. Die DNA-Lösung (10 μl) wurde mit 10 Einheiten EcoT221 (hergestellt von Takara Shuzo) und 1 μl von 10 mg/ml Ribonuclease A verdaut und dann einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die Menge an viraler DNA zu bestimmen. Das Ergebnis war, dass eine erkennbare Abnahme der Menge an viraler DNA in den Teilen auftrat, denen 5 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle, wo kein Cyclopentenon zugesetzt war.
(4) Nachdem HeLa-Zellen auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(2) inkubiert wurden, wurde DMEM, das 5 % fetales Rinderserum enthält, das Adenovirus Typ 5 (Adenoid 75; ATCC VR-5) enthält, den Zellen hinzugefügt, ohne Zusatz von Cyclopentenon, wodurch die Zellen damit infiziert wurden. Übrigens wurde die Multiplizität der Infektionen (m.o.i.) auf 50 eingestellt. Danach wurde das Cyclopentenon hinzugefügt, so dass eine Endkonzentration von 0, 5, 10, 20 oder 40 μM erhalten wurde, und die Inkubation wurde 20 Stunden lang durchgeführt. Nach der Inkubation wurde die Erfassung von Hexonproteinen des Adenovirus auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(2) durchgeführt. Das Ergebnis war, dass eine erkennbare Abnahme der Menge an Hexonproteinen in den Teilen auftrat, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle, wo kein Cyclopentenon zugesetzt war. Übrigens war Wachstum der Zellen in den Teilen auftrat, denen 20 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, ähnlich dem in den Teilen, denen kein Cyclopentenon zugesetzt war.
(5) HeLa-Zellen wurden auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(2) inkubiert und mit Cyclopentenon behandelt. Danach wurden die Zellen mit dem Adenovirus Typ 5 (Adenoid 75; ATCC VR-5) auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(4) infiziert und in einem Medium inkubiert, dem Cyclopentenon zugesetzt war. Nach der Inkubation wurde Erfassung von Hexonproteinen des Adenovirus auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(2) durchgeführt. Das Ergebnis war, dass eine erkennbare Abnahme der Menge an Hexonprotein in den Abschnitten auftrat, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle, wo kein Cyclopentenon zugesetzt war. Übrigens war Wachstum der Zellen in den Teilen, denen 20 μM oder weniger Cyclopentenon zugesetzt waren, ähnlich dem im Teil, dem kein Cyclopentenon zugesetzt war.
(6) Die Menge an viraler DNA wurde auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(3) von HeLa-Zellen gemessen, die mit Cyclopentenon behandelt mit Adenovirus Typ 5 (Adenoid 75; ATCC VR-5) infiziert wurden, gefolgt vom Inkubieren auf die selbe Weise wie in Beispiel 2-(5). Das Ergebnis war, dass eine erkennbare Abnahme der Menge an viraler DNA in den Teilen auftrat, denen 5 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle, wo kein Cyclopentenon zugesetzt war.
Aus den Ergebnissen der oben genannten Beispiele 2-(2) bis (6) ist ersichtlich, dass Verabreichung des Cyclopentenons vor, nach oder vor und nach der Infektion antivirale Wirkung auf den Adenovirus zeigte. Die selben Ergebnisse wurden auch im Falle von (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon erhalten.
Beispiel 3
(1) Rekombinierter Retrovirusvektor BAG mit β-Galactosidasegen und neomycinresistentem Gen als Reportergene wie in Froceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Band 84, Seiten 156-160 (1987) erwähnt, wurde durch ein Restriktionsenzym BamHl verdaut, um eine Selbstligation durchzuführen, worauf DOL aufgebaut wurde, woraus β-Galactosidasegen eliminiert wurde.
(2) Das in Beispiel 3-(1) genannte DOL-Vektorplasmid wurde in E. coli HB 101 transformiert, in einem L-Brühemedium inkubiert, das Plasmid aus den gewonnenen Zellen extrahiert und das DOL-Plasmid mittels einer Ultrazentrifugierung mit Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gereinigt.
Das gereinigte DOL-Plasmid (10 μg) wurde in Retrovirusverpackungszelle Y CRIP [Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Band 85, Seiten 6460-6464 (1988)] unter Verwendung eines kationischen Liposoms (Trans 2T LT-1; hergestellt von Takara Shuzo) eingeführt.
Die Zellen nach der Einführung wurden über zwei Wochen bei 37 °C unter Bedingungen von 5 % CO₂ in einem 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das 0,4 mg/ml G418 (Gibco) enthält, selektiert, 20 dadurch selektierte Kolonien wurden geklont und in einer Platte mit einem Durchmesser von 100 mm ausgebreitet, das Medium unter semikonfluenten Bedingungen ausgetauscht und die Überstandsflüssigkeit wurde nach 24 Stunden aufgenommen und durch einen Filter von 0,45 μm gefiltert (Milex HV; hergestellt von Millipore), so dass eine Überstandsflüssigkeit des Virus erhalten wurde. In der Zwischenzeit wurden die Zellen mit Trypsin abgenommen und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Der Titer der Überstandsflüssigkeit des Virus erhalten aus jeder der Kolonien wurde nach dem im folgenden Beispiel 3-(3) genannten Verfahren bestimmt und der Klon, von dem die Viruslösung mit dem höchsten Titer erhalten wurde, wurde als eine rekombinante Retroviruserzeugerzelle Y CRIP/DOL festgestellt. Der Titer der Überstandsflüssigkeit des Virus erhalten aus den Erzeugerzellen betrug zum Zeitpunkt der Feststellung 1 × 10⁶ koloniebildende Einheiten (cfu)/ml. Die als solche festgestellten Erzeugerzellen wurden in einem 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifizierten Eagle-Medium gehalten, das 0,2 mg/ml G418 enthält.
(3) NIH3T3-Zellen (ATCC CRL-1658) wurden zur Messung des Titers des Virus verwendet. Die in einem 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifizierten Eagle-Medium inkubierten NIH3T3-Zellen wurden mit einer Rate von 50.000 Zellen/Vertiefung auf eine Platte mit sechs Vertiefungen (Iwaki Glass) überführt und am nächsten Tag wurden sie unter Verwendung von 1 ml verdünnter Viruslösung, die 8 μg/ml Polybrene (Sigma) enthält, drei Stunden lang infiziert. Zum Verdünnen des Virus wurde ein mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium, das 10 Kalbsserum enthält, verwendet. Nach Beendigung der Infektion wurden weitere 2 ml mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium, das 10 % Kalbsserum enthält, hinzugefügt, um das Polybrene zu verdünnen. Am nächsten Tag wurde ein Austausch mit einem 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifizierten Eagle-Medium, das 0,2 mg/ml G418 enthält, vorgenommen. Eine Selektion wurde über zwei Wochen durch Austausch des Mediums alle drei bis vier Tage wie oben beschrieben vorgenommen, worauf Kolonien gebildet wurden. Die erhaltenen Kolonien wurden auf herkömmliche Weise unter Verwendung von Giemsa-Färbeflüssigkeit (Gibco) zum Auszählen angefärbt. Der durch Multiplizieren der ausgezählten Kolonien mit dem Verdünnungsgrad erhaltene Wert wurde als cfu definiert und als Titer des Virus verwendet.
(4) Die in Beispiel 3-(2) genannten rekombinanten Retroviruserzeugerzellen Y CRIP/DOL wurden in eine Platte mit sechs Vertiefungen übertragen und, wenn der semikonfluente Zustand erreicht ist, mit 1,5 ml eines 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das 0 bis 20 μM des Cyclopentenons enthält, ausgetauscht. Nach 24 Stunden wurde die Überstandsflüssigkeit aufgenommen. Der Titer des Virus der aufgenommenen Überstandsflüssigkeit wurde nach dem in Beispiel 2-(3) genannten Verfahren gemessen und der Einfluss der rekombinanten Retroviruserzeugerzellen auf die Produktivität des Virus durch Zusatz des Cyclopentenons untersucht.
Der Titer der aus dem Kontrollexperimentteil erhaltenen Viruslösung, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, betrug 9,5 × 10⁴ cfu/ml, während die Viruslösungen in Gegenwart von 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10 und 20 μM Cyclopentenon 8,3 × 10⁴, 6,4 × 10⁴, 6,1 × 10⁴, 3,8 × 10⁴ , 5,6 × 10⁴, 5,1 × 10⁴ bzw. 4,1 × 10⁴ cfu/ml betrugen, worauf bestätigt war, dass der Titer der Viruslösungen, die aus den Erzeugerzellen erhalten wurden, durch Zusatz von Cyclopentenon abnimmt. Somit ist eine Wirkung des Cyclopentenons zum Unterdrücken der Virusproduktivität der rekombinanten Retroviruserzeugerzellen bestätigt.
(5) Kontrollplasmid pcD2-Y, das G418 resistente Gene exprimiert [Mol. Cell Biol., Band 7, Seiten 2745-2752 (1987)] und Plasmid pcD2-16E7, das sowohl HPV16-Typ E7 und G418 resistente Gene exprimiert [Jpn. J. Cancer Res., Band 82, Seiten 1340-1343 (1981)] wurden auf E. coli HB 101 übertragen, in einem L-Brühemedium inkubiert und das Plasmid aus den gewonnenen Zellen extrahiert und mittels einer Ultrazentrifugierung mit Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gereinigt, so dass Vektorplasmid zum Einführen von Genen erhalten wird.
NIH3T3-Zellen wurden in einem 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubiert.
Das gereinigte Plasmid (10 μg) wurde in die NIH3T3-Zellen unter Verwendung eines kationischen Liposoms (TranslT LT-1; hergestellt von Takara Shuzo) eingeführt, die Zellen wurden über zwei Wochen in einem 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das 0,4 mg/ml G418 (Gibco) enthält, unter 5 % CO₂ selektiert und die erhaltenen Kolonien wurden geklont, in einer Gewebekulturplatte mit 100 mm Durchmesser kultiviert und nacheinander in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Als Ergebnis davon wurden jeweils neun Linien von NIH3T3 Zellen, in die Kontrollvektoren eingeführt wurden und NIH3T3-Zellen, die tumorgen von HPV16 Typ E7 transformiert wurden, ausgebildet.
Die Zelllinien, in die Kontrollvektoren eingeführt wurden, wurden mit NIH3T3/Y-1, NIH3T3/Y-2, NIH3T3/Y-3, NIH3T3/Y-4, NIH3T3/Y-5, NIH3T3/Y-6, NIH3T3/Y-7, NIH3T3/Y-8 und NIH3T3/Y-9 bezeichnet.
Die Zelllinien, in die E7 eingeführt wurden, wurden mit NIH3T3/E7-1, NIH3T3/E7-2, NIH3T3/E7-3, NIH3T3/E7-4, NIH3T3/E7-5, NIH3T3/E7-6, NIH3T3/E7-7, NIH3T3/E7-8 und NIH3T3/E7-9 bezeichnet.
(6) NIH3T3 Zellen, die Zelllinien, in die die Kontrollvektoren eingeführt wurden und die Zelllinien, in die E7 eingeführt wurden, wurden auf 50-70 % Konfluenz in einer 100 mm Gewebekulturplatte unter Verwendung eines 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium kultiviert und mit PBS gewaschen und die Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung abgenommen und in 5 ml eines 10 % Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifizierten Eagle-Medium suspendiert.
Ein Teil der Suspension wurde entnommen und ihre Zelldichte unter Verwendung eines Blutzählers vom Typ Newbauer berechnet.
Ausgehend von den erhaltenen Daten wurde die Suspension mit 10 Kalbsserum enthaltenden mit Dulbecco modifizierten Eagle-Medium verdünnt und auf eine Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 60 mm ausgesät, so dass eine Konzentration von 200 Zellen/Platte erhalten wurde und eine Inkubation in 3 ml des Mediums begonnen. Nach 24 Stunden vom Beginn der Inkubation wurde Cyclopentenon in einer Menge von 5 μM hinzugefügt. Nach weiteren 24 Stunden wurde das Medium gegen ein frisches ausgetauscht und Cyclopentenon in einer Menge von 5 μM hinzugefügt.
Danach wurde alle zwei bis drei Tage das Medium ausgetauscht und Cyclopentenon in einer Menge von 5 μM hinzugefügt. Als Kontrollexperimentalteil wurde eine Platte präpariert, zu der kein Cyclopentenon zugesetzt wird und das Medium wurde auf die selbe Weise wie oben ausgetauscht. Jede Inkubation wurde in drei Durchgängen durchgeführt. Nach neun Tagen Inkubation wurde eine Fixierung mit Methanol vorgenommen und die Kolonien mit einer Giemsa-Lösung (Gibco) angefärbt.
Übrigens wurde die Bestimmung unter Verwendung von NIH3T3, NIH3T3/Y-1 und NIH3T3/E7-2 durchgeführt.
Ergebnisse des Auszählens der angefärbten Kolonien sind in Tabelle 3 angegeben. Die Zellen, in die E7 eingeführt wurde, zeigten im Vergleich zu den Kontrollzellen hohe Empfindlichkeit auf Cyclopentenon. Daher wirkte das Cyclopentenon selektiv auf die von Onkogenen transformierten Zellen.
Tabelle 3
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn andere Zelllinien des Beispiels 3-(5) verwendet wurden. Außerdem ergaben auch (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon ähnliche Ergebnisse.
Beispiel 4
(1) Zu den MDCK-Zellen (hinterlegt beim Prefectural Public Hygiene Laboratory, Osaka Prefecture), die in einer 24-Loch-Mikrotiterplatte unter Verwendung von 10 % fetales Rinderserum enthaltenden mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium in Gegenwart von 5 Kohlendioxidgas inkubiert wurden, bis Monoschichten erhalten wurden, wurde Cyclopentenon auf eine Endkonzentration von 0, 5, 10, 20 oder 40 μM hinzugefügt und die Inkubation für weitere sechs Stunden unter den oben genannten Bedingungen fortgesetzt.
Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit Influenzavirus A/PR/8/34 infiziert (hinterlegt beim Prefectural Public Hygiene Laboratory, Osaka Prefecture) und bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert. Die Multiplizität der Infektionen (m.o.i.) wurde auf 0,01 eingestellt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in einem 10 μg/ml Trypsin enthaltenden Eagle-Medium inkubiert.
Die Überstandsflüssigkeit der infizierten Zellen wurde nach 0, 1, 2 und 3 Tagen aufgenommen und der Titer des Virus nach einem PAP-Verfahren unter Verwendung eines Fokuszählverfahrens bestimmt [J. Clin. Microbiol., Band 28, Seiten 1308-1313 (1990)].
Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, der Titer des Virus im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar verringert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 angegeben. Außerdem waren die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 4
(2) Gemäß den selben Schritten wie in Beispiel 4-(1) wurde Influenzavirus zu den MDCK-Zellen hinzugefügt, die in Monoschichten ohne Cyclopentenon inkubiert wurden, und diese Zellen wurden auf die selbe Weise wie in Beispiel 4-(1) mit dem Virus infiziert und in einem Eagle-MEM, das 10 μg/ml Trypsin enthält, dem Cyclopentenon auf eine Endkonzentration von 0, 5, 10, 20 oder 40 μM hinzugefügt wurde, inkubiert. Danach wurde der Titer des Virus auf die selbe Weise wie in Beispiel 4-(1) bestimmt. Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, der Titer des Virus im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar verringert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 angegeben. Außerdem waren die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 5
(3) Gemäß den selben Schritten wie in Beispiel 4-(1) wurden die MDCK-Zellen, die in Monoschichten inkubiert und mit Cyclopentenon auf eine Endkonzentration von 0, 20 oder 40 μM sechs Stunden lang behandelt wurden, mit Influenzavirus auf die selbe Weise wie in Beispiel 4-(1) infiziert und die Inkubation wurde in 10 μg/ml Trypsin enthaltendem Eagle-MEM fortgesetzt, dem Cyclopentenon in der selben Konzentration wie vor der Infektion zugesetzt war. Danach wurde der Titer des Virus auf die selbe Weise wie in Beispiel 4-(1) bestimmt. Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 20 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, der Titer des Virus im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar verringert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 6 angegeben. Außerdem waren die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 6
(4) Das selbe Experiment wie in Beispiel 4-(1) wurde durchgeführt, wo die Multiplizität der Infektionen (m.o.i.) auf 0,001 eingestellt ist. Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, der Titer des Virus im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar verringert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 angegeben. Außerdem waren die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 7
(4) Das selbe Experiment wie in Beispiel 4-(2) wurde durchgeführt, wo die Multiplizität der Infektionen (m.o.i.) auf 0,001 eingestellt ist. Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, der Titer des Virus im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar verringert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 8 angegeben. Außerdem waren die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 8
(6) Das selbe Experiment wie in Beispiel 4-(3) wurde durchgeführt, wo die Multiplizität der Infektionen (m.o.i.) auf 0,001 eingestellt ist. Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, der Titer des Virus im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar verringert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 9 angegeben. Außerdem waren die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 9
Aus den Ergebnissen der oben genannten Beispiele 4-(1) bis (6) ist ersichtlich, dass das Cyclopentenon antivirale Wirkung gegen Influenzavirus zeigte. Außerdem ergaben (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon auch ähnliche Ergebnisse.
Beispiel 5
(1) Wirkung von Cyclopentenon auf T-Zellen des Menschen
Das Cyclopentenon (0,5-5 μM) wurde zu 2 × 10⁵ Zellen/ml CEM-SS Zellen (ATCC CCL-119) oder zu H9-Zellen (ATCC HTB-176) hinzugefügt und über drei Tage inkubiert und die Anzahl der lebenden Zellen und der toten Zellen wurde ausgezählt, worauf die Überlebensraten der Zellen berechnet wurden.
Das Ergebnis war, dass bei beiden Zellen keine signifikante Abnahme der Überlebensrate der Zellen durch Zusatz von Cyclopentenon auftrat. Das Ergebnis ist in 1 und 2 angegeben. Somit sind 1 und 2 Schaubilder, die den Zusammenhang zwischen der Konzentration des zugesetzten Cyclopentenons und der Überlebensrate der Zellen zeigen, worin die Abszisse die Konzentration (μM) des zugesetzten Cyclopentenons angibt, während die Ordinate die Überlebensrate (%) der Zellen nach drei Tagen Inkubieren angibt. 1 ist das Ergebnis, wenn CEM-SS-Zellen verwendet wurden, während 2 das Ergebnis ist, wenn H9-Zellen verwendet wurden.
(2) Wirkung von Cyclopentenon auf HIV-infizierte T-Zellen
Das Cyclopentenon (1-5 μM) wurde zu mit HIV-1_IIIB infizierten CEM-SS-Zellen (abgekürzt als CEM-3B) oder zu mit HIV-1_IIIB infizierten H9-Zellen (abgekürzt als H9-3B) hinzugefügt und drei Tage lang inkubiert. Bei beiden Zellen wurden 90 % oder mehr der Zellen mit HIV-1_IIIB infiziert. Die Anzahl der lebenden und toten Zellen wurde ausgezählt und daraus die Überlebensraten der Zellen berechnet.
Das Ergebnis war, dass bei beiden Zellen durch Zusatz von 3 μM Cyclopentenon die Überlebensrate der Zellen signifikant abnahm und im Falle des Zusatzes von 5 μM Cyclopentenon die Überlebensrate der Zellen weiter abnahm. Daher zeigte im Vergleich zu Beispiel 5-(1), das Cyclopentenon eine anti-HIV-Wirkung. Das Ergebnis ist in 3 und 4 angegeben. Daher sind 3 und 4 Schaubilder, die den Zusammenhang zwischen der Konzentration des zugesetzten Cyclopentenons und der Überlebensrate der Zellen zeigen, worin die Abszisse die Konzentration (μM) des zugesetzten Cyclopentenons angibt, während die Ordinate die Überlebensrate (%) der Zellen nach drei Tagen Inkubieren angibt. 3 ist das Ergebnis, wenn CEM-3B-Zellen verwendet wurden, während 4 das Ergebnis ist, wenn H9-3B-Zellen verwendet wurden.
Beispiel 6
Es wurde die Konzentration des in der Überstandsflüssigkeit der Kultur nach drei Tagen Inkubation im Falle des Beispiels 5-(2) enthaltenen Antigen p24 gemessen. Das Ergebnis war, dass die Konzentration des p24 entsprechend der Konzentration des zugesetzten Cyclopentenons abnahm, worauf die anti-HIV-Wirkung festgestellt wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 10 gezeigt. In Tabelle 10 sind die Zahlen in Klammern der Anteil der Überstandsflüssigkeit der Zellkulturen (wenn kein Cyclopentenon zugesetzt ist) zur Konzentration an p24 ausgedrückt in %.
Tabelle 10
Beispiel 7
Vero-Zellen (ATCC CCL-81) wurden in 10 % fetales Rinderserum enthaltendem Eagle-MEM suspendiert, bis eine Zellkonzentration von 5 × 10⁴ Zellen/100 μl erhalten wurde, die Suspension wurde in einer 96-Loch-Mikrotiterplate in der Weise eingebracht, dass 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung gegossen und über Nacht bei 37 °C in Gegenwart von 5 % Kohlendioxidgas inkubiert wurden und die Vero-Zellen in Form von Monoschichten ausgebildet wurden.
Ein Eagle-MEM Medium, dem Cyclopentenon auf eine Endkonzentration von 0, 5, 10, 20 oder 40 μM zugesetzt ist, wurde den Zellen hinzugefügt und die Inkubation wurde bei 37 °C über sieben Stunden in Gegenwart von 5 % Kohlendioxidgas durchgeführt.
Nach Beendigung der Inkubation wurde das Medium entfernt, zweimal mit PBS gewaschen, dann Japanischer Enzephalitisvirus (Stamm JEV JaOAr-363-70) in einer Konzentration von 4,9 × 10² pfu/ml eingeimpft, bei 37 °C über 30 Stunden in Gegenwart von 5 % Kohlendi oxidgas inkubiert, die Zellen wurden mit Ethanol fixiert und eine Fokuszählung wurden mittels einer Fokuszählung nach einem PAP-Verfahren bestimmt [Arch. Virol., Band 86, Seiten 129-135 (1985)].
Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 40 μM Cyclopentenon zugesetzt war, die Anzahl der Punkte im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar abnahm. Das Ergebnis ist in Tabelle 11 angegeben. Übrigens wurden die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 11
(2) Vero-Zellen, die in einer 24-Loch-Mikrotiterplatte unter Verwendung eines 10 % fetales Rinderserum enthaltendem Eagle-MEM in Gegenwart von 5 % Kohlendioxidgas bei 37 °C inkubiert wurden, bis Monoschichten gebildet wurden, wurden mit PBS gewaschen, mit 4,9 × 10² pfu/ml Japanischem Enzephalitisvirus (Stamm JEV JaOAr-363-70) infiziert und bei 37 °C 90 Minuten lang inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in einem MEM inkubiert, dem Cyclopentenon zugesetzt ist, so dass sich eine Endkonzentration von 0, 5, 10, 20 oder 40 μM ergibt.
ie Überstandsflüssigkeit der infizierten Zellen wurde nach 0, 1, 2 und 3 Tagen aufgenommen und der Titer des Virus mittels der Fokuszählung nach einem PAP-Verfahren bestimmt [J. Clin. Microbiol., Band 28, Seiten 1308-1313 (1990)].
Das Ergebnis war, dass in den Teilen, denen 10 μM oder mehr Cyclopentenon zugesetzt waren, die Anzahl der Punkte im Vergleich zur Kontrolle, der kein Cyclopentenon zugesetzt war, erkennbar abnahm. Das Ergebnis ist in Tabelle 12 angegeben. Übrigens wurden die Zellen nicht eliminiert, sondern hafteten in jedem der Teile, denen Cyclopentenon zugesetzt war.
Tabelle 12
Aus dem obigen Ergebnis für Beispiel 7-(1) udn (2) ist ersichtlich, dass das Cyclopentenon eine antivirale Wirkung gegen Japanischen Enzephalitisvirus zeigt. Übrigens gehört der Japanische Enzephalitisvirus zu einer Spezies des selben Typs wie der Hepatitis C-Virus und unter den vorliegenden Bedingungen, wo Inkubation von Hepatitis C in vitro noch nicht erreicht wurde, wird der Japanische Enzephalitisvirus als ein Modell des Hepatitis C-Virus verwendet. Folglich ist das Cyclopentenon als therapeutisches Mittel auch gegen Hepatitis C wirksam.
Inzwischen wurden das selbe Ergebnis auch für (–)-Cyclopentenon und (+)-Cyclopentenon erhalten.
Beispiel 8
Als eine Frau, bei der Hepatitis C fünf Jahre zuvor diagnostiziert wurde, und die keine Verbesserung der hepatischen Funktion zeigte, wo sowohl GOT als auch GPT trotz Behandlung mit Interferon und Minofagen Strong um 150 lagen, das Getränk, das gemäß Beispiel 13 hergestellt wurde, in einer Dosis von 50 ml (enthält 2 mg des Cyclopentenons) zwei Monate lang einnahm, verbesserten sich sowohl GOT als auch GPT auf 80. Als sie es einen weiteren Monat einnahm, erreichten sowohl GOT als auch GPT 30, worauf eine signifikante Verbesserung der hepatischen Funktion festgestellt wurde.
Beispiel 9
Bei Mäusen des ICR-Stamms (erworben von Nippon SLC; sieben Wochen alt; weiblich) wurden am Rücken die Haare abrasiert und DMBA (Dimethylbenzanthracen) als Initiator in Form einer Lösung in Aceton in einer Dosis von 50 μg/Maus aufgetragen. Nach einer Woche wurde TPA (12-o-Tetrasecanolyphorbol-13-acetat) als Promotor in Form einer Lösung in Aceton in einer Dosis von 1 μg/Maus zweimal pro Woche bis zum Ende des Tests an der Stelle aufgetragen, wo der Initiator aufgetragen ist, während 80 % ethanolische Lösung von Cyclopentenon oder 80 % Ethanol (Kontrolle) eine Stunde vor jeder Anwendung von TPA aufgetragen wurden, worauf die antikarzinogene Wirkung gegen Karzinogenese bewirkt durch eine zweistufige Karzinogenese auf Haut über 20 Wochen beobachtet wurde.
Die Kontrollgruppe (eine Gruppe, der nur ein Vehikel aufgetragen wurde) zeigte eine Karzinogeneserate von 100 % (12 Mäuse von 12) innerhalb von 15 Wochen, während das Cyclopentenon die Karzinogenese stark unterdrückte und die Karzinogeneserate der Mäuse, denen 2,5 mg verabreicht wurden, in 15 Wochen 8,3 % betrug (1 Maus von 12) und dass innerhalb von und nach 19 Wochen 25 % betrug (3 Mäuse von 12). Das Ergebnis ist in 5 angegeben. Daher ist 5 ein Schaubild, das antikarzinogene Wirkung des Cyclopentenons zeigt, in der die Ordinate die Karzinogeneserate ist, während die Abszisse die Zeit (Wochen) angibt. Im Schaubild stehen offene Dreiecke, schwarze Dreiecke und offene Kreise für eine mit 2,5 mg Cyclopentenon pro Maus (12 Mäuse insgesamt) behandelte Gruppe, eine mit 0,8 mg Cyclopentenon pro Maus (11 Mäuse insgesamt) behandelte Gruppe bzw. eine Kontrollgruppe (12 Mäuse insgesamt).
Übrigens zeigte beim Antientzündungstest von TPA in Ohrmuscheln von Mäusen das Cyclopentenon keine Antientzündungswirkung bei Anwendung von 2,5 mg (pro Maus) an der Ohrmuschel der Maus.
Zusammengefasst zeigte das Cyclopentenon eine Antipromotorwirkung in einer zweistufigen chemischen Karzinogenese. Erwärmtes Produkt von Glucuronsäure enthaltend das Cyclopentenon, das (–)-Cyclopentenon und das (+)-Cyclopentenon zeigten auch das selbe Ergebnis.
Beispiel 10 – Injektionspräparate

(1) Cyclopentenon wurde einer physiologischen Kochsalzlösung (wie in der Japanischen Pharmakopoe angegeben) in einer Konzentration von 1 hinzugefügt, um ein Injektionspräparat herzustellen.
(2) (–)-Cyclopentenon und Glycyrrhizinsäure wurden einer physiologischen Kochsalzlösung (wie oben) in einer Konzentration von 0,5 % bzw. 0,1 % hinzugefügt, um ein Injektionspräparat herzustellen.

Beispiel 11 – Tabletten

(1) Eine Tablette mit 10 mg Cyclopentenon und einer geeigneten Menge an mikrokristalliner Cellulose wurden hergestellt und mit Zucker überzogen, um ein Tablettenpräparat auszubilden.
(2) Eine Tablette mit 0,1 mg (+) Cyclopentenon, 10 mg Dikaliumglycyrrhizinat und einer geeigneten Menge an mikrokristalliner Cellulose wurden hergestellt und mit Zucker überzogen, um ein Tablettenpräparat auszubilden.

Beispiel 12 – Salbe
Zunächst wurde Cyclopentenon mit einer kleinen Menge an Absorptionssalbe verknetet und dann die restliche Absorptionssalbe allmählich hinzugefügt und damit verknetet, bis Homogenität erreicht ist, um ein Salbenpräparat herzustellen.
Diese Salbe wurde auf den betroffenen Teil vier- oder fünfmal am Tag aufgetragen.
Beispiel 13
(1) Pektin (Pomosin Pectin LM-13CG; hergestellt von Hercules) (5 kg) wurde zu 100 Litern Leitungswasser hinzugefügt und die Mischung von der Flüssigkeitstemperatur von 28 °C auf 120 °C erhitzt, indem 35 Minuten lang Dampf hineingeblasen wurde, unter Rühren fünf Stunden lang bei 120 °C gehalten und abgekühlt, so dass 135 Liter abgekühlte Mischung erhalten wurden. Dieser wurden 1,35 kg Celite #545 (hergestellt von Celite) und 1,35 kg Silica #600-S (hergestellt von Chuo Silica) als Filterhilfsmittel zugesetzt und eine Filtration mit einem Kompaktfilter (6-Zoll Filterpaper in 16 Stufen; ADVANTEC #327) vorbeschichtet mit 0,1 kg Celite #545 und 0,1 kg Silica #600-S durchgeführt. Das erhaltene Filtrat wurde einer kontinuierlichen Wärmebehandlung (bei 98 °C 60 Sekunden lang) unter Verwendung eines Plattenerhitzers (hergestellt von Nichihan Seisakusho) unterzogen, gefolgt vom Abkühlen, um 150 Liter wärmebehandelte Pektinlösung herzustellen, die Cyclopentenon enthält.
Die wärmebehandelte Pektinlösung, die das Cyclopentenon enthält, weist einen pH von ungefähr 3,5 auf, eine Acidität von 6,2 ml und einen Zuckergrad von 5,8 Brix-%. Übrigens wurde der pH mit einem pH-Meter gemessen, die Acidität wurde als Menge (ml) 0,1 N NaOH zur Neutralisierung auf pH 7,0 ausgedrückt und der Zuckergrad wurde mit einem Brix-Saccharometer gemessen.
(2) Es wurde ein Getränk gemäß der folgenden Formulierung hergestellt.
Die in Beispiel 13-(1) genannte Cyclopentenon enthaltende wärmebehandelte Pektinlösung wurde als cyclopentenonhaltiges Material verwendet und seine auf Feststoffbasis errechnete Menge wurde zugesetzt. Dieses Getränk (100 ml) enthält 4 mg Cyclopentenon.
Die vorliegende Erfindung bietet ein antivirales Mittel, das eine Verbindung, die eine Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Viren in Zellen und eine Funktion zum selektiven Abtöten von virusinfizierten Zellen aufweist, wie Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon als wirksame Komponente enthält. Das antivirale Mittel der vorliegenden Erfindung tötet virusinfizierte Zellen selektiv ab und verleiht normalen Zellen, die nicht von Virus infiziert sind, eine Widerstandsfähigkeit gegen Virus, und als Folge der synergistischen Wirkung ist es ein antivirales Mittel, das äußerst nutzvoll ist für die Therapie von hartnäckigen Viruserkrankungen wie AIDS und Hepatitis C und auch für die Verbesserung der Symptome. Außerdem bietet die vorliegende Erfindung ein pharmazeutisches Mittel, das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon enthält, das verschiedene physiologische Wirkungen zeigt, wie Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Wirkung zum Induzieren der Hitzeschockproteine, Wirkung zum Verhindern der viralen Karzinogenese und eine Antipromotorwirkung. Dieses pharmazeutische Mittel ergibt einen Arzneistoff, der zum Erhalt der Homöostasis des lebenden Körpers geeignet ist, insbesondere zum Erhalt der Gesundheit von Magen und Darm.
Die vorliegende Erfindung bietet ferner ein antivirales Nahrungsmittel oder antivirales Getränk, das eine Verbindung mit einer Funktion zum Induzieren einer Widerstandsfähigkeit gegen Virus in Zellen und eine Funktion zum selektiven Abtöten von virusinfizierten Zellen, wie Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon als wirksame Komponente enthält. Ein solches Nahrungsmittel oder Getränk ist geeignet als Nahrungsmittel oder Getränk zum Verbessern der Symptome verschiedener Krankheiten, die durch Virus verursacht sind. Außerdem bietet die vorliegende Erfindung ein Nahrungsmittel oder Getränk, das Cyclopentenon, eine optisch aktive Substanz oder ein Salz davon enthält, das physiologische Wirkung zeigt, wie Wirkung zum Verbessern der hepatischen Funktion, Wirkung zum Induzieren der Hitzeschockproteine, Wirkung zum Verhindern der viralen Karzinogenese und eine Antipromotorwirkung, und das Nahrungsmittel oder Getränk ist geeignet zum Erhalt der Homöostasis des lebenden Körpers, insbesondere zum Erhalt der Gesundheit von Magen und Darm.

Claims

Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus cis-, trans- oder einer Mischung aus Isomeren von 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on dargestellt durch die folgende Formel [1] und korrespondierende optisch aktive Formen davon oder ein Salz davon
in der Herstellung eines Wirkstoffes für die Behandlung oder Prävention von viralen Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff für die Behandlung von humanem AIDS oder C-Typ Hepatitis ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff für die Behandlung von Menschen, nicht menschlichen Tieren oder zur Anwendung an Pflanzen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Wirkstoff für die Behandlung von domestizierten Tieren, domestiziertem Geflügel, Fischen oder Garnelen ist.
Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus cis-, trans- oder einer Mischung aus Isomeren von 4,5-Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on dargestellt durch die folgende Formel [1] und korrespondierende optisch aktive Formen davon oder ein Salz davon
in der Herstellung eines Nahrungsmittels oder Getränks für die Behandlung oder Prävention von viralen Erkrankungen.
Verwendung mindestens einer Verbindung ausgewählt aus cis-, trans- oder einer Mischung aus Isomeren von 4,5- Dihydroxy-2-cyclopenten-1-on dargestellt durch die folgende Formel [1] und korrespondierende optisch aktive Formen davon oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon
in der Herstellung eines Wirkstoffes zur Induzierung von Hitzeschockprotein (heat shock protein).