TW500612B - Antiviral agent - Google Patents

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500612 A7 B7 經滴部中央標率局員工消費合作社印掣 五、發明説明（〖） 發明所鼷之技術領域 本發明為鼸於經由抗病毒作用，而對於病麖生物為有 用之翳藥及飲食品。 先前之技術 於考慮抗病毒作用時，可思及抑制病毒對於細胞之感 染、於臧染細胞誘導出抑制病毒增殖等之病毒抵抗能力 之作用、選擇性地令威染病毒之細胞死滅之作用、及令 病毒本身失活（喪失感染力）之作用。 具有令病毒本身失活作用之物質，為病毒之中和抗體 。又，誘導此類抗體之方法為疫苗。但是，經由投予疫 苗誘導出抗體雖在病毒感染之預防上為有效果的，但是 目前所使用之抗體不為效果性的治療法。再者，亦無經 由直接令病毒失活之藥劑之效果性的治療法。 誘導病毒抵抗能力之作用有抑制病毒基因組之複製、 抑制病毒基因之轉錄、抑制病毒蛋白質之合成、抑制病 毒蛋白質之折*等。於誘導此類作用中，有抑制細胞内 轉錄因子之活性或表現、抑制來自病毒之轉錄因子之活 性或表現、熱衝擊蛋白質之誘導寺。作為誘導此類作用 之物質可列舉前列腺素。 又，作為令病毒感染細胞選擇性地死滅之物質有抗疱 疹病毒藥所使用之無環鳥甘、癌環鳥苜、solibudin等。 發明所欲解決之課題 對於病毒，以複合性作用予以處理者較經由單獮作用予 以處理者更具效果。例如，即使對病毒感染細胞投予選捧 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) π填寫太 、1Τ J· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 2 ) 1 1 性 地 死 滅 物 質 > 亦 因 細 胞 於 感 染 到 達 死 亡 為 止 之 間 病 1 I 毒 感 染 至 其 所 產 生 之 另 外 細 胞 9 而 使 得 將 病 毒 完 全 除 去 1 乃 變 為 非 常 困 難 〇 另 一 方 面 j 即 使 投 予 具 有 誘 導 病 毒 抵 /v 請 1 1 抗 能 力 作 用 之 物 質 ， 亦 4nc 熟 法 除 去 感 染 細 胞 〇 閲 讀 1 本 發 明 之 § 的 為 開 發 出 具 有 對 细 胞 誘 導 出 病 毒 抗 抗 性 背 面 1 之 •1 雜 m 能 ·、 及 令 病 毒 感 染 m 胞 選 擇 性 地 死 滅 雜 m 能 之 化 合 物 Λ 注 素 1 I 事 w 1 該 物 質 作 為 有 效 成 分 之 抗 病 毒 劑 Λ 肝 機 能 改 善 劑 Λ 熱 項 再 填 寫 本 1 •裝 衝 擊 蛋 白 質 誘 導 劑 、 癌 基 因 致 癌 預 防 劑 Λ 化 學 致 癌 抑 制 麵 等 之 翳 藥 品 及 抗 病 毒 用 食 品 或 飲 料 〇 頁 1 I 解 決 題 之 手 段 1 1 本 發 明 者 為 了 達 成 此 類 0 的 致 力 撿 討 9 結 果 發 現 若 令 1 1 具 有 對 細 胞 誘 導 病 毒 柢 抗 JUL· 性 機 能 .、 且 具 有 將 病 毒 感 染 细 1 訂 胞 選 擇 性 地 死 滅 雜 m 能 之 化 合 物 作 用 則 可 選 擇 性 地 使 病 1 毒 感 染 细 胞 受 到 傷 害 且 可 令 到 達 死 亡 為 止 所 產 生 之 病 1 | 毒 量 減 少 9 且 因 此 9 亦 令 感 染 綑 胞 到 達 死 亡 為 止 所 產 生 1 | 之 病 毒 所 新 感 染 之 细 胞 減 少 > 再 者 J 由 於 未 感 染 病 毒 之 1 ά I m 胞 亦 經 由 投 予 此 化 合 物 而 事 先 獲 得 病 毒 抵 抗 能 力 > 故 即 使 新 感 染 亦 可 抑 制 病 毒 增 殖 9 即 9 具 有 對 细 胞 誘 導 病 I 1 I 毒 抵 抗 性 機 能 、 且 具 有 將 病 毒 感 染 细 胞 選 擇 性 地 死 滅 雜 m 1 1 能 之 化 合 物 > 對 於 病 毒 之 除 去 9 例 如 人 類 後 天 性 兔 疫 不 I 全 病 毒 Λ 或 C 型 肝 炎 病 毒 之 除 去 乃 極 為 有 效 果 的 〇 1 W · I 本 發 明 所 使 用 化 合 物 之 於 细 胞 誘 導 病 毒 抵 抗 性 之 jm m 能 1 1 5 可 令 感 染 病 毒 刖 之 细 胞 K 化 合 物 作 用 後 S 抑 制 病 毒 1 1 對 细 胞 之 感 染 Λ 抑 制 病 毒 基 因 組 之 複 製 Λ 抑 制 病 毒 基 因 1 1 -4 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（ 之 質 白 蛋 毒 病 制 抑 成 合 之 0 白定 蛋測 毒行 病進 制標 抑指 為 作 錄等 轉疊 之折 比 由 藉 可 o ,定 能測 機而 之率 滅存 死生 地之 性胞 擇細 選染 胞感 細非 染與 感胞 毒細 病染 令感 ,毒 又病 較 毒種 病兩 將該 有有 具具 且為 、 若 fch 機物 性合 抗化 抵之 毒能 病機 導滅 誘死 胞地 细性 對擇 有選 具胞 為細 作染 感 定式 限琨 何發 任等 無者 nl,J 貝 Φ 者發 能本 物 合 ib 之 示 所 基 羥 以^， 機物 顯性合 烯抗化 戊抵之 環毒能 為病機 稱導滅 單誘死 ，胞地 下细性 Μ 對擇 i(有S -ΙΓ具胞 ~1為细 烯鹽染 戊其感 環或毒 體 性 活 學 光 其 或 病發 將本 有成 具完 且 且 、 並 逑 下 有 含 於 關 為 明 發 1 第 之 明 發 本 則 明 發 本 逑 槪 〇 若 明 烯 戊 環 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 性為 活分 學成 光效 其有 或為 酮作 卜物 -合 化 上 K 2 ] - 個 基一 羥少 二至 。 5-之 _ 4,出毒 之選病 示所抗 所鹽之 II其黴 ΓΙ或特 式體其 ο 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第 之 明 發 本 烯 戊 環 ί 2 1 基 羥少 二至 5-之 n4,出 ( 之選 示所 所鹽 I]其 _—* 或 式體 有性 含活 於學 關光 為其 明或 Η 2：發醜ο ο : - 品 免 食 性 用 天 毒 後 病 類 抗 入 之 有 徵 示 特 例 其 可 為 毒 分 病 成 ， 效 中 有 樣 為 態 作。佳 物料較 合飮之 化用明 上毒發 Μ 病本 個抗於 一 或 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（4 ) 疫不全病毒、或C型阡炎病毒。又，抗病毒劑可例示人 類用抗病毒劑、非人類動物用抗病毒麵（例如家畜、家 禽、魚類或蝦類用抗病毒劑）、或植物用抗病毒劑。 _面之簡簞說明 第1圖為示出使用CE^SS綑胞時之環戊烯酬濃度與細 胞生存率之關係圓。 第2圖為示出使用Η 9綑胞時之環戊烯酮濃度與细胞生 存率之關係圖。 第3画為示出使用C EM-3 Β細胞時之環戊烯酮濃度與细 胞生存率之關係圓。 第4圖為示出使用Η9-3Β细胞時之環戊烯嗣濃度與细 胞生存率之關係圖。 第5圖為示出環戊烯醒之抑制發癌作用圆。 第6蘭為示出（-）體環戊烯酮之對-二甲胺基苯甲薩 衍生物之CD及卜）體環戊烯嗣之立體構造圖。 第7圖為示出（+ )體環戊烯画之對-二甲胺基苯甲醯 衍生物之CD及（+ )體環戊烯酮之立體構造画。 發明之實施形態 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明所使用之式[I]所示之環戊烯削為包含4位與 5位羥基之立體構型為順式異構物和反式異構物兩者。 於本發明中，可使用順式環戊烯麵，且亦可使用反式環 戊烯嗣，並且亦可使用順式環戊烯酮與反式環戊烯嗣之 混合物。又，亦可使用其光學活性體。 順式環戊烯酮為依化學合成法所取得[H e h e t i c a 一 g 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 _ _-_Ξ____-_ k發明説明（5 ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Chi®ica Acta)、第 55卷、第 2838-2844頁（1972)]。反 式環戊烯嗣亦可依化學合成法取得[C a r b 〇 h y d r a t e R e s ♦ 第247卷、第217-222頁（1993 Π、或經由加熱糖醛酸， 例如葡萄糖醛酸、糖醛酸衍生物例如葡萄糖醛酸內酯或 其含有物等亦可取得（參照PCT/JP97 / 030252號說明書） °於本發明亦可使用含有環戊烯嗣之加熱處理物、其部 分精製物及精製物。 例如，使用D-葡萄糖醛酸作為糖醛酸，並將其溶液 於1 2 1 °C下加熱處理4小時，則可在加熱處理物中生成 環戊烯_。从溶劑萃取此加熱處理物中之環戊烯嗣，並 濃縮萃取物。 其次，將此濃縮物K矽膠柱層析予以分雛，並將溶出 之環戊烯嗣餾分濃縮，Μ氯仿由濃縮物萃取出環戊烯酬 ，並進行萃取濃縮物之順相柱層析，將加熱處理物中之 環戊烯_單離。 下逑示出環戊烯酮之物性。尚，環戊烯嗣之質量分析 為使用DX3 02質量分析計（日本電子公司製）進行。又， 使用重氯仿溶劑之NMR光譜测定為使用JNM-A500 (日本 電子公司製）。比旋光度為使用DIP-370型旋光計（日本 分光公司製）、UV吸收光譜為使用UV_2500分光光度計 (島津製作所公司製）、紅外線吸收光譜（IR)為使用 FTIR-8000紅外線分光光度計（島津製作所公司製）予 Μ分別測定。 一7 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 500612 Μ Β7 五、發明説明（） MS ιπ/s 115[M + H] + 1 H-NMR(CDCl3 ) δ4·20(1Η，d, J = 2.4Hz, 5 - Η)、4·83(1Η，ia，4-H)、 6*30(lH，dd, J = l*2，6·1Ηζ, 2-H)、7.48UH，dd, J = 2,1, 6.1Hz, 3-H) 但，i H-NMR之化學位移值為視CHC1 3之化學位移值 為7* 26 ppm而表示。 旋光度：[α ]笞0 ° (£ 1 ♦ 3、水） UV: Araax 215πιβ(水） IRUBr 法）：於 3400、1715、1 6 30、1115、1 060、 1025cm-1具有吸收0 所單雛之環戊烯酬經由光學分割，可取得（-卜4,5-二 羥基-2 -環戊烯-1-銅及（ + )- 4,5 -二羥基-2 -環戊嫌-1-酮 。當然，依合成方法所得之環戊烯酮亦可予Μ光學分割。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，將環戊烯麵溶於乙醇。於此乙醇溶液中再加入 己烷/乙醇（94/6),調製環戊烯酮溶液。將此試料溶液 ，使用例如Chiral pak AS(Dicel化學工業）柱並Μ柱溫 :40它、移動栢：己烷/乙醇（94/6)進行HPLC,則可將 環戊烯嗣予Μ光學分割。 所分割之（-)-4,5 -二羥基-2 -環戊烯-1-嗣[Μ下，稱 為（-）體環戊烯酮]之旋光度為[α]咨-105° (ι〇·30、 乙醇），（ + )-反式-4,5-二羥基-2-環戊烯-1-酮[以下， 稱為（+ )體環戊烯画]之旋光度為U]咨+104° (ι〇·53 、乙醇）。尚，旋光度為使用前逑之DIP-3 70型旋光計 一 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（7 ) (日本分光公司製）予K測定。 其次，依上逑記載之方法，進行卜）體環戊烯嗣及（+ ) 體環戊烯嗣之各質量分析、K核磁共振法（NMR)解析構造 、U V吸收光譜之測定、紅外線吸收光譜之測定。其结果 ,兩光學活性體顯示出與光學分割前之環戊烯嗣同樣之 结果。 將光學分割之（-)體環戊烯酬及（+ )體環戊烯麵分別ί卞為, 對-二甲胺基苯甲醸衍生物，使用J-720型圓偏光二色性 分散計（日本分光公司製），測定圓偏光二色性光譜（CD) ，其結果適用於二苯甲酸酯對掌性規則U 〇 u r n a 1 〇 f American Chemical Soeiety(J. Απι· Chem· Soc·)，第 91卷、第3989-3991頁（ 1969)],並且決定其立體構型。 (-）體環戊烯酮之對-二甲胺基笨甲醢衍生物之CD及 (-）體環戊烯嗣之立體構造示於第6圖。圖中縱軸為表 示莫耳圓偏光二色性、橫軸為表示波長（ηΗι)。上逑立體 構造為Μ式U]示於下： 0

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (·〇體環戊烯嗣之對-二甲胺基苯甲釀衍生物之CD及 (+ )體環戊烯嗣之立體構造示於第7画。圖中縱軸為表 示莫耳圓偏光二色性、橫軸為表示波長（nffl)。尚，上逑 立體搆造為K式[I]示於下： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 500612 A 7 B7 五、發明説明（8 ) 0

第6及7圖及式U]、式[1]所示之（-)體環戊烯酮 為（-)-(41{,5$)-反式-4,5-二羥基-2-環戊烯-卜_,( + ) 體環戊烯嗣為（+ )-(4$，5!〇-反式-4,5-二羥基-2-環戊烯 - 1 -嗣。 Μ上，本發明所使用之環戊烯酮及其光學活性體亦可 依任何方法予Κ製造，且亦可依說明書所揭示之方法予 Κ製造，且亦可依化學合成方法予Κ合成，而環戊烯麵 之反式體、順式體及其混合物亦可使用於本發明。當然 ,Μ化學合成法所得之環戊烯酮的光學活性體亦被包含 於本發明所揭示之光學活性體。 環戊烯嗣或其光學活性體之鹽為醫藥容許鹽，且可依 公知之方法進行轉變。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明所使用之具有對細胞誘導病毒抵抗性機能、且 將病毒感染细胞選擇性地死滅機能之化合物，例如環戊 烯_或其光學活性體或其鹽為具有抗病毒作用，且Μ此 些化合物所選出之至少一個化合物作為有效成分則可製 成抗病毒劑。 即，若Κ具有對细胞誘導病毒抵抗性機能、且具有將 病毒感染细胞選擇性地死滅機能之化合物作為有效成分 ，並將其與公知的醫藥用載體組合予Κ製劑化，則可製 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ29<7公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（9 ) 造抗病毒劑。抗病毒麵之製造一般為將具有對细胞誘導 病毒抵抗性機能、且具有將病毒感染细胞選擇性地死滅 機能之化合物，例如環戊烯_或其光學活性體或其鹽所 選出之至少一個K上化合物，與藥學容許之液狀或固體 狀之載體摻混，且視需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、 緩衝劑、安定劑、賦形劑、黏合劑、崩散劑、潤滑劑等 ,則可作成錠劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等之 固形劑、通常液劑、懸浮劑、乳劑等之液劑。又，可作 成其於使用前經適當載體之添加而呈液狀之乾燥品。 翳藥用載體可依上逑投予形態及劑型而選擇，於經口 劑之情形中，可利用例如澱粉、乳糖、白糖、甘露糖醇 、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。又，於經口劑 之調製中，亦可再配合黏合劑、崩散劑、界面活性劑、 潤滑劑、流動性促進謂、矯味劑、著色麵、香料等。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另一方面，於非經口劑之情形為依據常法，將本發明 有效成分之具有對细胞誘導病毒抵抗性機能、且具有將 病毒感染細胞選擇性地死滅機能之化合物，例如環戊烯 酮或其光學活性體或其鹽所選出之化合物，溶解或懸浮 於作為稀釋劑之注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水 溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米 油、丙二醇、聚乙二醇等中，且視需要，加入殺菌麵、 安定劑、等張劑、無痛化劑等將其調製。 本發明之抗病毒劑，可依對應於製劑形態之適當的投 予路徑進行投予。投予方法亦無特別限定，且可為內用 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（10 ) 、外用及注射。注射劑例如可於靜脈內，肌肉內、皮下 、皮内等進行投予，且於外用劑中亦包含栓劑。 抗病毒劑之投予量為依據其製劑形態、投予方法、使 用目的及其所適用之患者年龄、體重、症狀而適當設定 ，雖無一定，但一般為製劑中所含有之具有對细胞誘導 病毒抵抗性機能、且具有將病毒感染细胞選擇性地死滅 機能之化合物，例如環戊烯酮或其光學活性體或其鹽所 選出之化合物份畺為成人每日0. 1 iu g〜200®g/kg。因為 投予量為依各種條件而變動，故當然亦有比上逑投予量 更少份量而為充分之情況，或者亦有必要超過範圍之情 況。本發明之藥劑除了可就其原樣經口投予Μ外，亦可 添加至任意的的飲食品中供日常性攝取。又，具有對綑 胞誘導病毒抵抗性機能、且具有將病毒感染細胞選擇性 地死滅機能之化合物，例如環戊烯麵或其光學活性體或 其鹽亦可使用作為抗病毒劑、抗病毒用食品或歆料之原 料。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明所使用之具有對細胞誘導病毒抵抗性機能、且 具有將病毒感染细胞選擇性地死滅機能之化合物，例如 環戊烯_或其光學活性體或其鹽為對於DNA病毒、RNA 病毒、逆轉錄酶病毒、及類病毒顯示出抗病毒活性。 因此，可使用作為人類用抗病毒劑、非人類動物用抗 病毒劑，例如對於家畜、家禽、養殖動物例如魚類、蝦 類等之病毒疫病有效的抗病毒劑、植物用抗病毒劑等、 有用生物用之抗病毒顏（。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（"） 載染至動物之DHA病毒可邛舉例如痘病毒、癯疹病骞 、腺病毒、B型肝炎病毒、乳頭狀瘤病骞、多瘤病毒、 愛氏頓病毒、桿狀病毒，威染至植物之DNA病毒可列舉 例如花椰菜鑲嵌病毒。感染至動物之RN A病毒可列舉例 如轉狀病毒、風疹病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒、 新城疫病毒、麻疹病毒、流性性耳下腺炎病毒、犬瘇熱 病毒、流行性感冒病毒、水疱性口内炎病骞、人類多瘤 病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒，威染至檀物之 RNA病毒可列舉例如煙草鑲嵌病毒、麥類矮小病毒、稻 縞藥祜病毒、煙草輪黏病毒。逆轉錄酶病毒可列舉例如 成人T細胞白血病病毒、人類後天性免疫不全病毒，類 病毒可列舉例如馬鈐薯紡鍾管狀類病毒。 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 環戊烯_或其光學活性體或其鹽為有效於治療及預防 非人類哺乳動物、鳥例如雞及火雞、冷血動物例如魚之 病毒疾病，此些化合物為對於下逑之非人類病毒顯示出 抗病毒活性。Cyruid Herpersrirus第1型、山羊疱痠 病毒第1型、皺褶型疱疹病毒第1型、慢性鼻疽疱疹病 毒第1型、慢性赛疽疱疹病毒第2型、火雞疱疹病毒第 1型、溯河魚疱疹病毒第1型、貓-魚類疱疹病毒第1 型、馬疱疹病毒第3型、牛疱疹病毒第1型、牛疱疹病 毒第3型、牛疱疹病毒第4型、豬疱疹病毒第1型、豬 疱疹病毒第2型、鼠疱疹病毒第1型、烏賊疱疹病毒第1 型、烏賊疱疹病毒第2型、松鼠疱疹病毒第1型、犬疱疹 病毒第1型、兔疱疹病毒第1型、馬疱疹病骞第1型、 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（U ) 馬疱疹病毒第2型。 經由對鳥類注私本發明之抗病毒劑或添加至飲料或飲 水等之獸醫術、飼養術所周知之方法，則可根據本發明 所使用之化合物預防和/或治療馬列克氐病等之鳥類病 毒性疾病。又，在水池、水槽、保存槽或飼養領域之水 、海水等中直接添加本發明所使用之化合物、或將本發 明所使用之化合物混合至飼料中，則可同樣地預防和/ 或治療瘤瘆類病毒例如Putinamas virus、 Sollomons Herpesvirns、Naeavirns等病毒感染所引起之於水池、 水槽、保存槽或飼養領域中之狹窄區域棲息之魚的病毒 疾病；例如鮭科魚類之傳染性造血器官壞死病、疱疹病 毒感染症或傳染性胰臟壞死病、虹鱒之病毒性出血性敗 血症、鯉魚之春情病毒疾病、各種魚類之淋巴性白血病 、海產魚-溯河魚之病毒性紅血球壞死病、比目魚等之 L a v d 〇病毒疾病、幼鲫魚等之病毒性胰肝壌死病、河豚 等之口白病等。尚，於投予本發明所使用之化合物、本 發明之抗病毒劑時之正確的規定為依據所必須治療之各 涸受撿體所需之必要性、治療之種類及飼養者之判斷。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 投予本發明抗病毒麵之非人類動物為經由保持健康， 而顯著改善生存率、成長率、產卵率等。 本發明所使用之具有對细胞誘導病毒抵抗性機能、且 具有將病毒感染細胞選擇性地死滅機能之化合物，例如 環戊烯國或其光學活性體或其鹽為經由抑制病毒蛋白質 之合成、且亦抑刖病毒基因組之合成，而顯示出強力的 一 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（·13) 抗病毒作用。並令此些病毒感染細胞選擇性地死滅。 例如即使於人類後天性免疫不全病毒（Μ下簡稱Η I V) 之感染患者，亦非為全部的C D 4陽性细胞感染Η I V ，而 為僅感染部分细胞。本發明之抗病毒劑為經由抑制此感 染细胞增殖HIV ,而選擇性地令感染细胞死滅並且對未 感染细胞誘導出病毒抵抗能力，使得可由ffl胞除去HIV。 環戊烯醒或其光學活性體或其鹽除了上述之抗病毒作 用K外，亦具有肝機能改善作用、熱衝擊蛋白質誘導作 用，且K環戊烯酬或其光學活性體或其鹽所選出之一涸 Μ上化合物作為有效成分之肝機能改善劑和熱衝擊蛋白 質誘導劑，可依上逑之抗病毒劑予Κ製劑化，且可依抗 病毒麵之方法進行投予。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肝機能改善劑和熱衝擊蛋白質衍生物之投予量為依據 其製劑形態、投予方法、使用目的及其所適用之患者年 齡、體重、症狀而適當設定，雖無一定，但一般為製劑 中所含有之環戊烯麵或其光學活性體或其鹽所選出之化 合物份量為成人每日O.ljti g〜200mg/kg。因為投予量為 依各種條件而變動，故當然亦有比上逑投予量更少份量 而為充分之情況，或者亦有必要超過範圍之情況。本發 明之藥劑除了可就其原樣經口投予K外，亦可添加至任 意的飲食品中供日常性攝取。又，環戊烯嗣或其光學活 性體或其鹽所選出之一個Μ上化合物亦可使用作為肝機 能改善用飲食品、熱衝擊蛋白質誘導用飲食品之原料。 藉由攝取環戊烯嗣或其光學活性體或其鹽，亦可改善 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 29*7公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 500612 A7 B7 五、發明説明（l4 ) 肝機能損害，並令GOT、GPT值正常化。 又，環戊烯_或其光學活性體或其鹽為具有誘導70K #耳呑（HSP70)等熱衝擊蛋白質之活性，且對於肝炎病 毒、愛滋病病毒、流行性感冒病毒、水泡性口內炎病毒 、疱瘆病毒等之RNA病毒、DHA病毒具有抗病毒作用。 又，熱衝擊蛋白質為參與癌兔疫，且亦具有生體防禦作 用。藉由攝取環戊烯酮或其光學活性體或其鹽，則可預 防、治療流行性感冒病毒所引起之感冒疾病等之病毒性 疾病。 尚，熱衝擊蛋白質為細胞和個體急逮接受比平常溫度 高5〜1 0 υ左右溫度變化時，所誘導合成之蛋白質的總 構，為在原核生物至高等真核生物間廣泛分布。真核生 物之熱衝擊蛋白質已知有HSP90、HSP70、泛素、HSP26 等。其中，HSP70為一種分子伴隠物（chaperon),其折 疊並未終了，又K不完全結合折疊蛋白質而有肋於立體 構造之形成。熱衝擊蛋白質之胺基酸序列為在進化過程 中被良好保存，HSP70為與大腸桿菌之Dnak蛋白質相同 。於人類存在約10個HSP70基因，其某些物質為呈構成 性地表規、某些則為經由各種剌激而被誘導。熱衝擊蛋 白質之合成除了熱衝擊Μ外，亦可經由各種化學物質、 氧化壓力等之細胞損害所誘導。 C. Amici等[Journal of Virology、第 68卷、第 6890 〜6899頁（1994 )]為報告若於具有α -不飽和羰基之 前列腺素A i存在下，培養經前代病毒所感染之動物細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T d 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 500612 A7 B7 五、發明説明（K ) 胞，則可誘導HSP70和HSP90之合成，且在誘導HSP70合 成期間可抑制病毒蛋白質之合成。又，A· Rossi等[The J 〇 u r n a 1 〇 f B i ο 1 〇 g i c a 1 C h e i s t r y、第 2 7 1 卷、第 3 2 1 9 2 〜3219 6頁（1996)】為報告2-璨戊烯-1-麵為與前列腺素 Αι同樣地誘導HSP70之合成，並且抑制水泡性口内炎病 毒蛋白質之合成。 經由本發明所使用之環戊烯_所引起之HSP7D誘導能 力，為在1〇μΜ下察見，且於20〜下為呈最大，其 若輿2-環戊烯-卜_霈要數百# Μ濃度方可誘導出HSP70 相比較，則可稱為僳為極高之誘導能力。其為可匹敵前 列腺素AiiHSPTfl誘導能力，但因環戊烯酮之分子量 為前列腺素At之1/3以下，故若以重量濃度相比較，則可 稍為具有比前列腺素更高之誘導能力。 本發明所使用之環戊烯酬或其光學活性膿或其鹽因為 具有如此高的熱衝擊蛋白質誘導作用，故對於DNA病毒 、RNA病毒、逆轉錄酶病毒、及類病毒顯示出抗病毒活 性。對於此些病毒、類病毒，可例示上述之各病毒、類 病毒。 環戊烯園或其光學活性體或其鹽即使對於經由癌基因 所轉形之癌細胞，亦具有增殖抑制活性，並且具有防止 癌基因所引起之致癌作用。 例如，乳頭狀瘤病毒為乳頭狀瘤多瘤空泡化病毒科 (papovaviridae>、乳頭狀瘤病毒屬（papillonavirus) 之DHA病毒，人類乳頭狀瘤病毒已知有造成子宮頸癌等 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

HI I— —1J I 500612 A7 B7 五、發明説明（ 原因之Η P V 1 6型 型 Μ 6 供 vlii HP可 由且 經 ， 於果 對效 為制 鹽抑 其殖 或增 體有 性具 活 ， 學胞 光細 其之 或化 麵癌 烯E7 戊因 環基 癌 合止. 化防 個 可 一 並 少 ， 至劑 之制 出抑 選殖 所增 鹽胞 其细 或癌 體致 性毒 活^病 學之 光分 其成 或效 嗣有 烯為 戊作 環物 始 起 制 抑 有 具 為 鹽 其 或 體 性 活 學 。 光 癌其 致或 之酬 起烯 引戊 所環 因 ， 基又 癌 些致 此學 Μ 化 供之 提分 可成 且效 ，有 用為 作作 癌物 致合 段化 階個 二一 之少 起至 引 之 所出 劑選 進所 促物 和合 劑化 選飮 所用 鹽防 其預 或癌 體致 性或 活品 學 食 光用 其防 或預 酮癌 烯致 戊之 環物 有 合 含 化 供個 。 提 一 劑可少 制此至 抑因之 癌 出 其 或 體 性 活 學 光 其 或 酮 烯 戊 環 有 含 少 至 之 出 選 所 癌方 致之 學劑 化毒 或病 劑抗 止據 防依 癌可 致並 因 ， 基化 癌麵 之製 分Μ 成予 效劑 有毒 為病 作抗 物依 合 可 化制 個抑 --------.— -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 中病 造將 製有 之具 料且 飲、 用能 毒機 病性 抗抗 或柢 品毒 食病 用導 毒誘 病胞 抗細 。之對 予明有 投發具 行本用 進於使 法 可 麵糖 烯之 戊麵 環婦 如戊 例環 ，有 物含 合 用 化使 之可 fcfc 4爵 ， 機又 滅 。 死鹽 地其 性或 擇體 選性 胞活 0 學 染光 感其 毒或 之 物 mil 理 、 處 用 熱 作 加 善 該。改 自麵能 ν5!ξ烯機 物戊肝 理環有 處的具 熱製於 加精 ， 酸及又 醛嗣 衝 熱 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 部 烯 戊 環 的 製 精 分 用 作 導 誘 質 白 蛋 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 500612 A7 B7 五、發明説明（17 ) 、致癌預防作用等之作用表現用食品或作用表琨用飲料 之製造中，亦可使用環戊烯酮或其光學活性體或其鹽、 含有環戊烯酮之加熱處理物、來自該加熱處理物之部分 精製環戊烯酮及精製的環戊烯S。 即，將此些環戊烯酬或其光學活性體或其鹽、含有環 戊烯酮之加熱處理物、來自該加熱處理物之部分精製的 環戊烯酮及精製的環戊烯酮所選出之原料予K稀釋和/ 或添加、所製造之食品或飲料為被包含於本發明之抗病 毒用食品或飲料。 本發明之抗病毒用食品或抗病毒用飮料之製法並無特 別限定，可列舉經由調理、加工及一般所使用之食品或 飮料之製法進行製造，且於所製造之食品或飲料中，若 含有具有對细胞誘導病毒抵抗機能、且具有將病毒感 染綑胞選擇性地死滅機能之化合物，例如環戊烯_或其 光學活性體或其鹽所選出之一個K上化合物之有效量即 可。 本發明之抗病毒用食品或抗病毒用飲料，若為含有、 添加和/或稀釋具有對細胞誘導病毒抵抗性機能、且具 有將病毒感染细胞選擇性地死滅機能之化合物，例如環 戊婦麵或其光學活性體或其鹽所選出之一涸Μ上之化合 物，則對其形狀並無特別限定，且亦包含藥片狀、顆粒 狀、膠囊狀、膠狀、溶膠狀等形狀之可經口性攝取之形 狀物。 又，肝機能改善用、熱衝擊蛋白質誘導用、致癌預防 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 500612 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 18 ) 1 i 用 食 品 或 肝 機 能 改 善 用 熱 衝 擊 蛋 白 質 誘 導 用 Λ 致 癌 預 I w 1 1 防 用 飲 料 > 若 為 含 有 Λ 添加和/或稀釋具有肝機能改善 Γ 作 用 Λ 熱 衝 擊 蛋 白 質 誘 導 作 用 致 癌 預 防 作 用 之 環 戊 烯 /^s 請 1 I 先 1 嗣 或 其 光 學 活 性 體 或 其 鹽 所 選 出 之 個 Μ 上 之 化 合 物 閱 讀 1 1 則 對 其 形 狀 並 無 特 別 限 定 $ 且 亦 包 含 藥 片 狀 、 顆 粒 狀 、 背 1¾ 1 i 之 Ί 1 膠 囊 狀 、 膠 狀 Λ 溶 膠 狀 等 形 狀 之 可 經 Ρ 性 攝 取 之 形 狀 物。 注 意 J 事 本 發 明 之 食 品 或 飲 料 為 含 有 具 有 生 理 活 性 之 Ttnf 環 戊 烯 酮 項 ! 或 其 光 學 活 性 ΜΜ m 或 其 鹽 且 經 由 此 些 化 合 物 所 具 有 之 各 存 填 寫 本 噘 種 的 生 理 活 性 Λ 抗 病 毒 作 用 肝 機 能 改 善 作 用 % 熱 衝 擊 頁 1 I 蛋 白 質 誘 導 作 用 Λ 致 癌 預 防 作 用 等 9 成 為 經 由 攝 取 而 具 I 1 1 有病毒性疾病預防、治療 Λ 肝 纖 m 能 改 善 效 果 Λ 致 癌 預 防 效 1 1 果 等 之 健 康 食 品 或 飲 料 9 為 可 用 於 維 持 生 體 恆 常 性 之 食 1 訂 品 或 飲 料 〇 1 I 本 發 明 所 使 用 之 化 合 物 即 使 Μ 其 生 理 活 性 之 有 致 量 進 1 1 行 投 予 5 亦 未 察 見 毒 性 9 例 如 於 經 Ρ 投 予 之 情 形 中 » 1 I 戊 烯 酮 或 其 光 學 活 性 體 或 其 鹽 之 任 一 者 即使Μ 1 0 0 毫 1 克 / 公 斤 對 進 行 單 回 投 予 亦 未 察 見 死 亡 例 〇 1 Μ 上 9 本 發 明 之 藥 劑 可 使 用 作 為 病 毒 性 疾 病 Λ 肝 疾 病 1 I Λ 癌 等 之 治 療 劑 或 預 防 劑 9 且特別有用於Η I V 所 引 起 之 1 1 後 天 性 免 疫 不 全 症 候 群 之 治 療 及 改 善 症 狀 〇 I 實 施 例 j Κ 下 列 舉 實 施 例 > 更 具 體 說 明 本 發 明 但 本 發 明 並 1 1 非 限 定 於 此 些 實 施 例 0 實 施 例 中 之 1 為 意 指 重 量 1 〇 1 I 1參 考 例 1 1 1 -20- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐）

經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 發明説明（D) 將10克之D -葡萄糖醛酸（Sigma公司製G5269)溶解於1 公升之水中，於1 2 1 °C下加熱4小時後，於減壓下濃縮 癸的1 0毫升。於其中加入醋酸丁酯：醋酸：水=3 : 2 : 2混合 液之上層40毫升並混合後，將離心所得之上清液於減壓 下樓繡至約1 0毫升為止。 將上逑萃取液加至柱層析用矽膠gy-300SP(2x 28公分 、富士 S U i s i a化學公司製），並以醋酸丁酯：醋酸：水= 3:2:2之上層作為溶雛液，K壓縮器加壓至〇.2kg/cm2， 並Μ每分鐘5毫升之流速下進行分離。以每1餾分1〇毫 升地進行分餾，且取出各餾分之一部分Μ薄層曆析進行 分祈時，於第61至80為止之餾分中含有高純度的環戊烯 _。收集此些餾分並於減壓下濃縮後，以40毫升之氯仿 _取，且在減壓下濃縮萃取液，取得1〇〇毫克之環戊烯 晒。 此餾分Μ使用Parxjpak S型柱之順相HPLC予Μ分雛， Μ 2 1 5 n hi之紫外線吸收進行檢测時，其純度為9 8駕。 將上逑環戊烯釀113, 9毫克溶於乙醇2. 8 5毫升中。於 此乙醇溶液中再加入己烷/乙醇（94/6)3.85毫升，調製 成17毫克/毫升之環戊烯酮溶液。此液之濾紙 過濾，作成光學分割HPLC試料溶液。 此試料溶液依Κ下條件進行光學分割並分別吸 集前波峰之（-)體環戊烯購及後波峰之（+ )體環戊烯酮 之餾分，減壓乾燥，且分別取得（〜）體環戊烯酮43.2毫 克、（+ )體環戊烯酮43·0毫克。 - 2 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Γ#:先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 500612 A7 B7 五、發明説明（2Q ) 光學分割Η P L C條件 柱：Chiral pak AS (DiceMb 學工業）2.0 公分 Χ25·0 公分 柱潙：4〇υ 移動相：己烷/乙醇（94/6) 流速：1 4 . 0毫升/分鐘 撿測：ϋ V 2 1 0 n m 試料注入量：1 5 0微升（2 · 5 5毫克） 由於所得之（-)體環戊烯酮及（+ )體環戊烯嗣兩者均 約含有1¾之對映體，故再度於上逑之條件下進行光學分 割。其結果，由前波峰之（-)體環戊烯醑30.0毫克取得 19.7毫克不含對映體之（-)體環戊烯酮、後波峰之（+ ) 體環戊烯麵37.4毫克取得27.7毫克不含對映體之（+ )體 環戊烯酬。（-)體環戊烯麵及（+ )體環戊烯酮之光學分 割Η P L C的溶出時間分別為3 3分鐘、4 0分鐘。 實施例1 ⑴將含有2x 10s细胞/毫升人類前骨髓性白血病細 胞 HL-60(ATCC CCL-240)之含 10¾胎牛血清之RPMI1640培 養基5毫升，置入6孔穴平板之各孔穴中，於37 °C 51 C0 2存在下培養24小時後，將參考例1記載之環戊烯酮 K最終濃度為0、10、20、30、40、50、100 μ Μ地進行 添加，並再繼續培養8小時。 培養終了後，計測細胞數後，Μ離心回收細胞，並Κ 磷酸緩衝食鹽水（PBS)洗淨，調製成環戊烯_處理细胞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 500612 A 7 B7 五、發明説明（21 ) 。又，於4 5 °C進行1 0分鐘熱處理後，亦同樣地調製培養 细胞。 使用此些處理細胞，依據Μ ο 1 e c u 1 a r C 1 ο n i n g [冷泉港 實驗室付印Π 989 >]記載之方法，進行SDS聚丙烯醯胺 謬電泳（S D S - P A G Ε )。令處理细胞Μ 2 · 5 X 1 0 8细胞/毫 升懸浮於SDS-P AGE Sample buffer中，並將此細胞懸浮 疲於1 0 0 °C下處理1 0分鐘後將各5黴升加至2枚之S D S -PAGE膠中（5¾折疊式膠、10¾分雛式膠），進行電泳。將 其一之膠予Μ克麥西染色，且另外之膠則點渍至聚偏氟 乙烯轉移膜（Imiiiobilon TM: MILLIP0RE 公司製 Cat·# IPVH000- 1 0 )。將此膜Μ B 1 ock Ace (大日本製藥股份有 限公司cat . # UK-B25)於4¾下封阻一晚。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 令與此封胆之膜中所熱誘導之70 k Da熱衝擊蛋白質專 一性地反應之單株抗體HSP 72/73(Ab-l)[0nC〇gene Research Products公司製 Cat # HSP01]反應後，K 含 有0.05ITween 20之Tris緩衝食鹽水（TBS)予Μ洗淨，並 再M TBS洗淨。其次，令過氧化酶複合二次抗體HR Ρ-Rabbit Anti Mouse IgG(H+L)[ZYMED Laboratolies, Inc製Cat. # 6 1 -65 20 ]反應，並與先前之操作同樣地洗 淨。令如此K 一次抗體、二次抗體反應之膜，K化學魯 米諾試藥 R E N A I S S A N C E ™ [ D u ρ ο n t N E N 公司製 C a t .林 NEL-100)反應後，以X-Ray膜予以感光並確認誘導出70 k D a之熱衝擊蛋白質。 其結果，確認於20至30 α Μ之環戊烯酮添加下，誘導 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 500612 A7 B7五、發明説明（22 ) 出與45 t〕10分鐘熱處理同程度之7〇kDa熱衝擊蛋白質。 其誘導之強弱示於表1 。尚，表1中+為表示誘導之強 度，+愈多則意指誘導愈強。又，-為未察見誘導、土 為為意指稍微誘導。 表1 處理细胞 熱衝擊蛋白質誘導 4 5 °C 1 0分間熱處理 + + + 0 μ Μ環戊烯酮 - 10 μ Μ環戊烯酮 + 20w Μ環戊烯醒 + + + 30 μ Μ環戊烯酮 + + + 40 Ki Μ環戊烯嗣 + + 5 0 // Μ環戊烯嗣 + 1 0 0 iu Μ環戊烯酬 土 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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、1T 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製 又.關於〇)體環戊烯酮、（+ )體環戊烯酮亦取得同 樣之结果c 實施例2 (1)將H e L a細胞（A TC C C C L - 2 )於1 0公分平板中、K含有 101胎牛血清之杜貝克氏（Dalubeceo)修飾衣格爾氏 (E a g 1 e ’ s )培養基（D Μ E Μ ;日水公司製），於5 %二氧化碳 氣體存在下、37 1C培養至801匯集為止後，添加終濃度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 500612 A7 B7五、發明説明（23 ) 為0、5、10、20、或40 μ Μ之環戊烯酮，並於上逑條件 下再繼續培養6小時◊丟棄培養基，並於各孔穴中加入 1毫升之10¾三氯醋酸後，Μ刮板回收细胞。 如此所得之细胞的SDS-PASGE與點漬作用為依實旛例 1之方法進行，並且撿測到7〇kd熱衝擊蛋白質之表現。 其結果，於5 /i Μ〜40 μ Μ環戊烯嗣添加部分中察見到 誘導出70k d熱衝擊蛋白質。其結果示於表2 。尚，表2 中，+為表示經由點漬所觀察到的70kd熱衝擊蛋白質之 訊號強度，+愈多則意指訊號愈強。又，土為意指訊號 為非常弱。 表2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·*-----三1-*=_- €衣· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 處理細胞 70kd熱衝擊蛋白質量 0 μ Μ環戊烯酮 土 5 μ Μ環戊烯麵 + 10 iu Μ環戊烯麵 + + 2 0 y Μ環戊烯_ + + + 4 0 μ Μ環戊烯酮 + + + (2)將H e L a细胞於1 0公分平板中、Μ含有1 0纟胎牛血清 之D Μ Ε Μ於5 $二氧化碳氣體存在下、3 7 °C培養至8 0 I匯集 為止後，添加終濃度為0、5、1 0、2 0、或40 & Μ之環戊 烯嗣，並於上逑條件下再繼續培養6小時。其後，Μ含 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）

、1T 500612 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (24 ) 1 1 有 51 胎 牛 血清 之 D Μ E Μ 洗 淨 綑 胞 > 並將 含有腺病毒Ad5 1 d 1 X [Sa it 〇等， J on r n a 1 0 f V i Γ 0 logy 、第54卷、第711 1 7 1 9 頁（1 9 8 5 )] 之 含51 胎 牛 血 清 D Μ E Μ加至细胞令其感染 V 請 1 I » 且 培 養 2 0小 時 0 但， 將 多 重 慼 染度 (hi · 〇 · i ·)設定於 5 0 先 閱 讀 1 1 I Ο 丟 棄 培 養基 於 各孔 穴 中 加 入 1毫 升之10¾三氯醋酸 背 ιέ 1 1 之 1 後 9 Μ 刮 板回 收 細 胞。 注 意 I 如 此 所 得之 細 胞 的 SDS - PAGE 與 點瀆 作用為依實施例1 事 項 1 之 方 法 進 行， 並 且 檢測 到 腺 病 毒 之異 己麵蛋白質之表規 再 填 寫 本 % 〇 但 * —* 次抗 am 體 為 使用 抗 腺 病 毒 異己 嗣 ί几體[Chemicon 頁 1 I In t e r η at i ο n a 1 In C·製 λ AB1056] 〇 1 1 於 添 加 10 u MM上環戊烯嗣部分中， 比未添加環戊烯 1 1 酮 之 對 照 ，其 異 己 _蛋 白 質 顯 著 減少 。又，於添加2 0 u Μ 1 訂 K 下 環 戊 烯嗣 部 分 則察 見 與 IBS m 戊 烯酮 未添加部分同樣的 1 細 胞 增 殖 〇 1 | (3) 由 實 施例 2-⑵ 同樣 地 於 rm 環 戊 烯酮 處理後令Μ腺病毒 1 1 感 染 並 將 培養 之 He L a细 胞 9 依 厂 病毒 實驗手冊」（Medical 1 J Vi e w 發 行 )24^ -25頁記載之方法萃取病毒DNA 。 I 即 > 將 病毒 m 染 細胞 Μ 磷 酸 緩 衝食 鹽水予K洗淨，懸 1 1 浮 於 1 毫 升之 o. 6¾月桂 基 硫 酸 鈉 (SDS) /IOhiM EDTA水溶 1 1 液 後 f 添 加3 · 0毫升之5M Na C I 水 溶液 。於ο υ下放置1 1 小 時 於 離心 所 得 之上 清 液 中 加 入3 毫升乙醇並混合。 _ _ I 將 離 心 所 得之 沈 澱 溶解 於 0 . 2毫升之TE緩衝液 1 1 Tr ‘ i S 丨-HC 1 p Η 8 . 0 IirM EDTA], 加入2 黴升之10¾ SDS和 1 I 4 微 升 之 10毫 克 / 毫升 蛋 白 酶 K (寶酒造公司製）並於 1 1 1 -26 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（25 ) 3 7它下保溫1小時。Μ苯酚和氯仿之等量混合液萃取2 次，於水曆中加入20微升之3Μ醋酸鈉和400黴升之乙醇 並且離心，將沈澱溶解於50徼升之ΤΕ緩衝液中，取得 DN Α溶液。於10黴升之DNA溶液中加入10單位之EcoT22 I (寶酒造公司製）和1微升之1 〇毫克/毫升核糖核酸酶A 將其切開，並進行瓊脂糖膠電泳，測定病毒DNA量。其 结果，於添加5 μ MM上環戊烯_之部分中，比未添加環 戊烯酮之對照，其病毒DNA量顯著減少。 ⑷與實施例2 -⑵同樣地培養H e La細胞後，未添加環戊 烯麵地，於細瞧中加入含有第5型腺病毒（Adenoid 75 ATCC VR-5)之含51胎牛血清之DMEM令其感染。但，將多 重感染度（ . 〇 . i .)設定於5 0。其後，將環戊烯麵Μ終濃 度為0、5、10、20、或40μΜ地進行添加，並且培養20 小時。培養後，與實施例2-©同樣地進行腺病毒六碳蛋 白質之撿測。其結果，添加ΙΟμΜΚ上環戊烯酮之部分 ,比未添加環戊烯酮之對照，其異己嗣蛋白質量顯著減 少。又，於添加20 α ΜΚ下環戊烯酮之部分，察見與環 戊烯嗣未添加部分同樣的细胞增殖。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ml nn nn HI HI —LI ^^^1 n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) __. (5)與實施例2 -⑵同樣地培養H e L a綑胞，並Κ環戊烯_ 處理。其後，與實施例2-④同樣地感染第5型腺病毒 (Adenoid 75 ATCC VR-5),並於添加環戊烯麵之培養基 中培養。培養後，與實施例2 -②同樣地進行腺病毒異己 嗣蛋白質之撿測。其结果，添加IOmMK上環戊烯嗣部 分，比未添加環戊烯酮之對照，其異己嗣蛋白質顯著減 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（26 ) 少。又，於添加20 α MM下環戊烯麵之部分，察見與環 戊烯麵未添加部分同樣的細胞增殖。 (6)與實_例2-(5)同樣地於環戊烯酮處理後，感染第5 型腺病毒（Adenoid 75 ATCC VR-5)所培養之HeU綑胞， 依實施例2 - (3)同樣之方法，测定病毒D Η A量。其結果， 添加5μΜΜ上環戊烯酮之部分，比未添加環戊烯酮之對 照，其病毒DNA量顯著減少。 K上，由實施例2-(2)〜（6)之結果，可得知經由環戊烯 酬感染前、感染後，或感染前後之投予，對於腺病毒具 有抗病毒活性。又，關於（-)體環戊烯麵、（+ )體環戊 烯酮亦取得同樣之結果。 實施例3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (1)將 Proceeding of the National Academic of Science of the USAiProc. Natl. Aead· S c i * USA.) 、第84卷、第156〜160頁（ 1987)記載之具有半乳糖 苜酶基因和新黴素耐性基因作為報告者（reporter)基因 之重組逆轉錄酶病毒載體BAG , K限制酶BamHI予K切 開，並令其自我連接，構築成取出0 -半乳糖f酶基因 之D0L載體。 ⑵將實施例3 - Ο)記載之D 0 L載體質體轉形至大腸桿菌 (E. coli)HB101,並KL-broth培養基培養，由收集之 菌體萃取出質體，並以氯化鉋密度梯度超離心，精製 D0L質體。 將精製之D0L質體10微克，使用Cationic Liposome 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7——^_B1________-__五、發明説明（27) [1>ans 2T LT-li寶酒造公司）]導入重組逆轉錄酶病毒 裝墳（packaging)细胞 TCRIPCProc· Natl. Acad· Sci. 第 85卷、第 6460〜6464頁（1988)]0 將導入之细胞於3 7 °C、5等〇2條件下，从含有〇·4毫 克/毫升G418(Gibco公司）之含10¾胎牛血清杜貝克氏修 _衣格爾氐培養基選殖2週，並由所得之菌落選殖出20 個，於直徑1〇〇®ιη平板上増殖，且於半匯集狀態下更換 培養基，於24小時後回收上清液並Μ 0· 45 /i m濾紙（Mi lex HV:MHlipora公司）過濾，作成病毒上清液。又，將细 胞Μ胰蛋白酶予K剝取，並於液態氮中保存。 由各菌落所得之病毒上清液力價為依下逑實施例3-③ 所示之方法予Μ測定，並將最高力價之病毒液所得之選 殖株確立作為重組逆轉錄酶病毒生產«胞ICRIP/DOL。 確立時之生產細胞所得之病毒上清液力價為1X106菌 落形成單位（cfu) /毫升。所確立之生產细胞為Μ含有 〇 · 2毫克/毫升G 4 1 8之含1 0 %胎牛血清杜貝克氏修飾衣 格爾氐培養基予Μ維持。 ③於病毒力價之測定中使用ΝΙΗ3Τ3細胞（ATCC CRL-1 6 5 8 )。將含1 01胎牛血清杜貝克氏修飾衣格爾氏培養 基所培養之Ν ΙΗ3Τ3细胞，於6孔穴平板（岩城璃璃公司） 中植人50000個/孔穴，隔日，Μ含有8黴克/毫升 ?〇丨；^1)「616($丨8!113公司）之1毫升病毒稀釋液感染$ ΝΙΗ3Τ3细胞3小時。於病毒之稀釋中使用含10¾胎牛血 清杜貝克氏修飾衣格爾氏培養基。感染終了後，為了稀 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----^--*--裝·

、1T d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 500612 A7 B7 五、發明説明（28 ) 釋Poly brene,再添加2毫升之含10¾胎牛血清杜貝克 S修飾衣格爾氐培養基。隔日，更換成含有〇 . 4毫克/ 毫升G 4 1 8之含1 0 %胎牛血清杜貝克氐修飾衣格爾氏培養 基，每隔3〜4日更換培養基，進行2週選殖，形成菌 落。所得之菌落K奇薩姆染色液（G i b c 〇公司）依常法染 色並計數。所得之菌落數乘Μ稀釋倍率之值為C f II之病 毒力價。 ⑷將實施例3 -⑵記載之重組逆轉錄酶病毒生產細胞T C P I P / D 0 L植入6孔穴平板中，於呈現半匯集狀態時， Μ含有0〜20 μ Μ環戊烯酮之含101胎牛血清杜貝克氏修 飾衣格爾氏培養基1 . 5毫升更換，於2 4小時後回收上清 液。所回收上清液之病毒力價依實施例2 - (3)記載之方法 予Κ測定，並撿討添加環戊烯麵對於重組逆轉錄酶病毒 生產細胞之病毒產生能力之影響。 由未添加環戊烯酮之對照實驗區所得之病毒液力價為 9 , 5 X 10 4 c f u / 毫升，相對地於 0. 1、0 · 5、1 . 0、2 · 0、 5 . 0、1 0、2 0 y Μ環戊烯酮存在下之病毒力價分別為 8 . 3 X 1 0 4 - 6 . 4 X 10 4 、6.lxi04 - 3.8 x 1Q 4 、 5.6X104 、5.1X104 、4.lxl04cfu/nil,確認經由 添加環戊烯嗣可令生產細胞所得之病毒液之力價降低。 即，可察見環戊烯國對於重組逆轉錄酶病毒生產细胞之 病毒產生能力之抑制作用。 (5)將表琨G 4 1 8耐性基因之對照質體p c D 2 - Y [ Μ ο 1 . C e 1 1 · Biol.第7卷、第2745〜2752頁（1987)]、及可表現 一30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

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、1T d 500612 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（29 ) HPV16型E7和G418耐性基因兩者之質體pcD2-16E7[Jpn. J* Cancer Res.第 82卷、第 1340〜1343頁（1991)]轉形 大腸桿菌E. coli HB101,並ML-broth培養基培養，由 所收集之菌體萃取質體，並Μ氯化鉋密度梯度超離心予 Μ精製，作成基因導入用載體質體。 ΝΙΗ3Τ3細胞為在37°C、5IC02條件下，於含10¾眙牛 血清杜貝克氏修飾衣格爾氏培養基中培養.。 將精製之質體10黴克，使用Cationic L丨P〇s〇Hie(T>anS ITLT-1,寶酒造公司製）導人NIH3T3细胞，並將細胞於 37°C、5IC〇2條件下，Μ含有0.4毫克/毫升G418(GIBC0) 之含1 0 胎牛血清杜貝克氏修飾衣格爾氏培養基選殖2 週，並將所得之菌落選殖，且於ΦΙΟΟιπβι之組織培養平 板中增殖，且順次Μ液態氮保存。 藉此，分別確立9株經導入對照載體之ΝΙΗ 3 Τ3细胞、 及Η Ρ V 1 6型Ε 7所癌化之Ν I Η 3 Τ 3细胞。 將導入對照載體之细胞株視為ΝΙΗ3Τ3/Υ-1、ΝΙΗ3Τ3々_ 2、 ΝΙΗ3Τ3/Υ-ΝΙΗ3Τ3/Υ-ΗΙΗ3Τ3/Υ-5、 ΝΙΗ3Τ3 / Υ-6、ΗΙΗ3Τ3/Υ-7、H I Η 3 Τ 3 / Υ - δ 及 Ν I Η 3 Τ 3 / Υ - 9 〇 將導人Ε7之細胞株視為ΗΙΗ3Τ3/Ε7-1、ΗΙΗ3Τ3/Ε7 - 2 、ΝΙΗ3Τ3/Ε7-3、 ΝΙΗ3Τ3/Ε7-4、 ΝΙΗ3Τ3/Ε7-5、 ΝΙΗ3Τ3 /Ε7-6、ΝΙΗ3Τ3/Ε7-7、ΗΙΗ3Τ3/Ε7-8 及 ΝΙΗ3Τ3/Ε7-9。

(6)將ΝΙΗ3Τ3、導人對照載體之细胞株、及導入Ε7之细 胞株於lOOaiio之組織培養平板中，Κ含101胎牛血清杜 貝克氏修飾衣格爾氐培養基增殖至5 0〜7 0 %匯集，Μ P B S -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 衣— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -——4·- =------? ..........................rf

、1T 500612 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 洗淨後，以0. 2 5¾胰蛋白酶-EDT A溶液將細胞剝落，並且 懸浮於含1 〇 |胎牛血清杜貝克氐修飾衣格爾氐培養基5 毫升中。 取出部分的懸浮液，K N a ί v a孔穴型血球計算板，計 算细胞密度。Μ所得之數字為基礎K含1 0 %胎牛血清杜 貝克氏修飾衣格爾氏培養基稀釋，並於直徑60ΒΙΒΙ之組織 培養平板中Μ 200细胞/平板播撒，且於3毫升之培養 基中開始培養。於培養開始24小時後，添加5 μ Μ之環戊 烯嗣。再24小時後，Μ新的培養基更換且添加5 μ Μ環戊 烯酮。 Μ後每隔2〜3日更換培養基並且添加5 Μ環戊烯麵 。準備不添加環戊烯嗣之平板作為對照實驗區，並同樣 地更換培養基。各準備3份進行培養。培養9日後，Κ 甲醇固定並Μ奇薩姆液（G I B C 0 )將菌落染色。 尚，使用 111113了3、《1113丁3/¥-1及《11{3了3/^7-2並評 價。 計數經染色菌落之結果示於表3 。導入Ε 7之细胞為比 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對照细胞對於環戊烯酬之感受性高，且環戊烯麵為選擇 性地對癌基因轉形細胞作用。 -32 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表3 細胞 菌落數（平均土 S D ) 對照 環戊烯醒處理 Ν ΙΗ3Τ3 ΝΙΗ3Τ3/Υ-1 ΝΙΗ3Τ3 / Ε7-2 91.7±11.9 85.3±4.0 83.3土 8,4 71.3土 2,3 67,3土 3,2 2 2.3 + 3.5 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .................*一 一_\| -----三…-J- · 使用實施例3_(5) K外之细胞株亦取得同樣之結果。又 ,(-)體環戊烯酮、（+ )體環戊烯酮亦取得同樣之結果。 實施例4 (1)對24孔穴微平板中使用含101胎牛血清Eagle-MEM 於51二氧化碳氣體存在下、37 °C培養至單曆之MDCK细胞 (大阪府立公眾衛生研究所保存株），添加終濃度為〇、5 、10、20、或40 y Μ之環戊烯麵，並於上述條件再繼續 培養6小時。 其後，K PBS將细胞洗淨，並將流行性感冒病毒Α/ PR/ 8 / 34株（大阪府立公眾衛生研究所保存株）加至细 胞令其感染，於3 7 t!下培養3 0分鐘。但，將多重感染度 (1, 〇 . i .)設定於0 . 0 1。培養後，K P B S洗淨細胞，並於 含有10微克/毫升胰蛋白_之Eagle-MEM中培養。 於0、1、2、3日後採集感染細胞上清液，並MPAP法 之中心計數法U . C 1 i η · Μ丨e r 〇 b i ο 1 ·第2 8卷、第1 3 0 8〜 一 3 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 500612

B 五、發明説明（>) 1313頁（ 1 9 9 0 )]算出病毒之力價。 其結果，添加10#Μ以上琛戊烯黼之部分，比未添加 環戊烯_之對照，其病毒力價為顯箸降低。其結果示於 表4。又，各環戊烯酮添加部分均無細胞剝落地接黏。 表4 誠染後 環戊烯酮濃度Μ> 之曰數 0 5 10 20 40 Pfu/毫升 Pfu/毫升 pfu/毫升 pfil/毫升 pfu/毫升 0 <ι.〇χ 10 2 <1.0X 102 <1·0Χ lfl2 <1.0Χ 10 2 <1.0Χ 102 1 3.6X 10 s 4.ΟΧ 105 2.ΟΧ 105 2.2Χ 10 3 4.ΟΧ ΙΟ2 2 1·0Χ 10 6 8.ΟΧ 105 7.2Χ ΙΟ5 2.6Χ 10s 1.9Χ ΙΟ5 3 1.5Χ 10 5 9.6Χ 10 4 2.4Χ ΙΟ5 3.8Χ 105 5.6Χ ΙΟ5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ⑵依實施例4-⑴同樣之手鑛對瓌戊烯_非存在下且於 單層培養之HDCK細胞，與實施例4-(1)同樣地將流行性 感冒病毒加至細胞令其感染，並以添加終濃度為0、5、 10、20、或40#Μ環戊烯酬之含10微克/毫升胰蛋白酶 之Eagle-MEM予以培養。其後，與實施例4-(1>同樣地， 算出病毒力價。其結果，添加以上環戊烯_之部 分，為此未添加環戊烯酬之對照，其病毒力價為顯著降 低〇其結果示於表5。又，於各環戊烯_添加部分為無 細胞剝落地接黏。 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（W ) 表5 威染後 琛戊烯酮濃度U Μ) 之日數 0 5 10 20 40

Pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 0 1 2 3 <1·0Χ 10 2 4·2Χ 10 6 1.6Χ 106 4·8Χ 10 5 <1·❹X 10 2 2.4Χ 105 1.5Χ 106 1.9Χ 105

ο ο ο ο IX IX 1X IX X X X X 0 9 4 7 lx 1X no IX <1·0Χ 10 2 1.2Χ 10 S 1.0Χ 10 6 7.2Χ 10 5 <1.0X 102 <1·0Χ 10 2 <1.0Χ 10 2 <1.0Χ ΙΟ2 ⑶依實施例4-⑴同樣之手饋，對犟層培養並以終濃度 為0、20、或40 Μ環戊烯_處理6小時之MDCK細胞，輿 實施例4-⑴同樣地以流行性感冒病毒將其感染，並以含 有感染前同濃度環戊烯酬之含10微克/毫升胰蛋白酶之 Eagla-MEM培養基繼鑛培養。其後，與實施例4-⑴同樣 地，算出病毒力價。其結果，添加2()>uM以上環戊烯酬 之部分，為比未添加環戊烯_之對照，其病骞力價為顯 著降低〇其結果示於表6。又，於各琛戊烯謂添加部分 均無細胞剝落地接黏。 表6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 感染後 之曰數 璨戊烯酬濃度（#Μ) 0 2 0 4 0 Pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 0 <1 .ΟΧ ΙΟ 2 < l .0 X ΙΟ 2 < I .0 X ΙΟ 2 I 4 . 6 X I 0 5 9.8 X I 0 4 < I . 0 X I 〇 2 2 6 . 6 X I 0 5 I . 6 X I 0 5 < I . 0 X I 〇 2 3 I . 0 X ΙΟ 5 I . 3 X ΙΟ 5 < I . 0 X ΙΟ 2 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612

7 B 五、發明説明（从） ⑷進行輿資施例4-⑴同樣之實驗並將多重威染度 (n.o.i·)設定為fl.Ofll。其結果，添加10>uM以上環戊烯 酮部分，比未添加環戊烯酬之對照，其病毒力價為顯箸 降低。其結果示於表7 ^又，於各環戊烯酮添加部分均 無細胞剝落地接黏。 感染後 之曰數 環戊烯削濃度（#M> 0 5 10 20 40 Pfu/毫升 pfu/毫升 Pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 0 <1.0X10^ <1.0X102 <1.0Xl〇2 <l.〇Xl〇2 <1.0X102 1 <1.0X102 <1.0X102 <l.〇Xl〇2 <l.〇Xl〇2 <l.〇xl〇2 2 3.8X105 5·2Χ105 6.2X10S 5.OX 10 5 4.4X 10 3 3 3.8X 10 4 4.OX 10 4 8.6X 10 4 1.1X 10 5 8.OX 10 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\\云 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ⑸進行與實施例4 -(2)同樣之實驗並將多重感染度 (n.o.i·)設定為0·001。其結果，添加Ifl/iM以上環戊烯 _之部分，比未添加環戊烯_之對照，其病毒力價為顯 箸降低。其結果示於表8。又，於各環戊烯麵添加部分 均無細胞剝落地接黏。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（35 ) 表8 感染後 環戊烯酮濃度（Μ M) 之曰數 0 5 10 20 40 pf u/毫升 pf u/毫升 pf u/毫升 pf u/毫升 pf u/毫升 0 <ι·〇χ 10 2 <1.〇x 10 2 <l.〇x 10 2 <l.〇x 10 2 <l.〇x 10 2 1 6.〇x 10 2 <1.〇x 10 2 <1.〇x 10 2 <1,〇x 10 2 <l.〇x 10 2 2 3.6Χ 10 5 8,8X 10 4 2.〇x 10 5 1.8X 10 4 <l.〇x 10 2 3 3.8Χ 10 4 2.6X 10 4 1.8X 10 4 1.2X 10 4 <l.〇x 10 2 •…=:=-«HI· nn **_=—I 1-·- H^B ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (6)進行與實施例4- (3)同樣之實驗並將多重感染度 (Ht.o.i.)設定為0.001。其結果，添加10以1<以上環戊烯 麵之部分，比未添加環戊烯麵之對照，其病毒力價為顯 著降低。其結果示於表9 。又，於各環戊烯酬添加部分 均無细胞剝落地接黏。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（# ) 表9 絨染後 之曰數 環戊烯酬濃度（AM) 0 5 10 20 40 pfu/毫升 Pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 pfu/毫升 0 <1.0X102 <1.0X102 <1.0X102 <l.〇Xl〇2 <l.〇Xl〇2 1 6.OX 10 3 <1.0X 10 2 <1.0X 10 2 <1.0X 10 2 <l.〇X 10 2 2 6.2X 10 5 4.4X 10 5 4.8x 10 s 3 · 2 X 10 4 <1 · 0 X 10 2 3 3.6X 10 4 5.6X 10 4 2.8X 10 4 2.8X 10 4 <l.〇X 10 2 --------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 以上，由實施例4-(0〜（6)之結果，可知環戊烯酮為對 於流行性感冒病毒具有抗病毒作用。又，(_)體環戊烯 _、（ + )體環戊烯酮亦取得同樣之結果。 (1)環戊烯_對於人類T細胞之作用 實施例5 於 2X105 値 / 毫升之 CEM-SS 細胞（ATCC CCL-119)或 H9細胞（ATCC HTB-176)中添加0.5〜5μΜ環戊烯鯛並培 養3天，計數活細胞數和死細胞數並且算出細胞生存率。 其結果，於任何細胞中均未察見因環戊烯圈之添加而 令細胞生存率顯著減少。其結果示於第1圖和第2圖。 即，第1圖和第2圖為示出添加瓌戊烯酬濃度和細胞生 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 500612 A 7 B7 五、發明説明（37 ) 存率之關係圖，橫軸為表示添加之環戊烯酬濃度（a Μ) 、縱軸為表示培養3日後之细胞生存率（¾)。第1圖為 使用CEM-SS细胞時之结果，第2圓為使用H9细胞時之結 果。 ⑵環戊烯醒對於Η I V感染了细胞之作用 於HIV - 1 1ΪΒ慼染之CEM -SS細胞（簡稱CEM-3Β)或 HIV-1 ΙΤΒ感染之Η9细胞（簡稱Η9 - 3Β)中添加1〜5/iM環 戊烯酮並培養3天。兩细胞之9 0 I K上為慼染Η I V -1。 計數活ffl胞數和死细胞數並且算出细胞生存率。 其結果，於任何细胞中均經由3 μ Μ環戊烯_之添加而 令细胞生存率顯著減少，且於添加5 μ Μ環戊烯嗣中再令 细胞生存率降低。即，與實施例5 -⑴比較，環戊烯嗣為 顯示出投Η IV作用。其結果示於第3画和第4圏。即， 第3圖和第4圔為示出添加環戊烯嗣濃度和细胞生存率 之關係圖，橫軸為表示添加之環戊烯麵濃度（M H )、縱 軸為表示培養3日後之細胞生存率（I)。第3圖為使用 CEM-3B時之結果，第4圖為使用H9-3B時之结果。 實旛例6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 測定實旛例5 -②之培養3日後之培養上清液中所含之 P24抗原濃度。其結果，對應於所添加之環戊烯嗣濃度 其P 24濃度乃減少，察見抗HIV作用。其结果示於表10 。但，表1 0括弧內之數字為未添加環戊烯醒時之各细胞 培養上清液之p24濃度比Μ %表示。 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 500612 A7 B7 五、發明説明（38 ) 表1 0 環戊烯酮濃度 (u Μ) 培養上清液中之ρ24 C Ε Μ - 3 Β 濃度（n g / Μ 1 ) H9 - 3B 0 280(100¾) 210 (100¾) 1 232(831) 210 (97%) 3 176 (631) 157 (75¾) 5 175 (631) 148 ( 7 01) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例7 今Vero细胞（ATCC CCL-81)於含10$胎牛血清之Eagle - MEM中，M5X104细胞/100微升之細胞濃度懸浮，且 於96孔穴微標準平板之每1孔穴加入100徼升之ffl胞懸 浮液，於5 %二氧化碳氣體存在下、3 7 下培養一晚，調 製單曆之V e r 〇细胞。 於此细胞中，加入已添加終濃度為0、5、1 0、2 0、或 40μΜ環戊烯酮之Eagle_MEM培養基，並於51二氧化碳氣 體存在下、3 7 °C下培養7小時。 培養终了後，除去培養基，K P B S洗淨2回後，接種 4.9X 102 pfu/毫升之日本腦炎病毒（JEV Ja0Ar-363-70 株），並於5 I二氧化碳氣體存在下、3 7 °C下培養3 0小時 後，Μ乙醇固定细胞，並Μ PAP法之中心計數法[Arch . V i r ο 1 .第8 6卷、第1 2 9〜1 3 5頁（1 9 8 5 )]進行中心計數。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 500612 Μ Β7五、發明説明（39 ) 其結果，添加40 μ Μ環戊烯_之部分，比未添加環戊 烯麵之對照，其中心數目降低。其结果示於表11。又， 於各環戊烯酮添加部分為ffl胞無剝落地接黏。 表1 1 環戊烯晒濃度（Μ Μ) p f u /毫升 0 3 , 0 x 1 0 7 10 1 . 6 x 10 7 20 2 . 1 x 10 7 40 4 . 9 x 1 0 6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •罐衣· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ②將2 4孔穴黴平板中使用含1 0 I胎牛血清之E a g 1 e -MEM於51二氧化碳氣體存在下、37 °C培養至單層為止之 Vero綑胞，MPBS洗淨，並加入4.9xi02pfu /毫升之 日本腦炎病毒（JEV JaOAr-363-70株）令其感染，且於 3 7 °C培養9 0分鐘。 培養後，K P B S洗淨细胞，並K添加終濃度0、5、1 0 、20、或40 α Μ環戊烯嗣之MEM予K培養。 於0、1、2、3日後採集感染细胞上清液，並K使用 Vero綑胞之PAP法依中心計數法[J. Clin. Microbiol. 第28卷、第1 308〜1313頁（1990)]算出病毒之力價。 其结果，添加1 0 μ Μ K上環戊烯酬之部分，比未添加 環戊烯嗣之對照，其病毒力價為顯著降低。其結果示於 -41 一 d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 500612 A 7 B7 五、發明説明（40 ) 表1 2。又，於各環戊烯酮添加部分為细胞未剝落地接黏。 表12

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •罐衣.

、1T d 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由上述實施例7 _ Ο)、（2)之結果，可知環戊烯酮為對於 日本腦炎病毒具有抗病毒活性。再者，日本腦炎病毒與 C型肝炎病毒為同系種，C型肝炎病毒於生體外之培養 未被確立，故目前利用日本腦炎病毒作為C型肝炎病毒 之模型。由此，環戊烯麵亦有效於作為C型肝炎之治療 藥。 又，關於（-)體環戊烯酮、（+ )體環戊烯酮亦取得同 樣之結果。 實施例8 5年前被診斷為C型肝炎病毒感染症、接受干擾素、 強力Minophagen治療，但GOT 、GPT均為150左右之未 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 % Α7 Β7 五、發明説明（41) 見肝機能改善之女性K每日50毫升（含有環戊烯酬2毫 克）後逑實施例1 3所得之飲料飲用2個月後，结果G 0 T 、 GPT均改善至80。再同樣繼續飲用1個月，结果察見 GOT 、GPT均為30之顯著的改善肝機能。 實施例9 將IC R系鼠（由日本S L C購入、7週齡、雌性）背部毛 剃除後，令作為起始劑之D Μ B A (二甲基苯並Μ )的丙麵溶 疲Μ 50徼克/鼠塗敷，一週後，將作為促進削之ΤΡΑ (12-0 — Tetrasecanoylphorbol 13icetate)的丙嗣溶液 Μ 1黴克/鼠地，於起始劑塗敷部K每週2回至試驗終 了為止進行塗敷，並將環戊烯嗣之801乙醇溶液或對照 之8 0 I乙醇溶液於各Τ Ρ Α塗敷前小時進行塗敷，觀察 2 0週之於二階段皮膚致癌中的致癌抑制作用。 對照群（陚形劑塗敷群）於1 5週K後顯示出1 0 0 (1 2匹 中12匹）之致癌率，相對地，環戊烯麵為強力地抑制致 癌，且2 . 5毫克/鼠為在1 5週Μ後Μ 8，3 % (1 2匹中1匹）、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 9週Μ後Κ 2 5 % (1 2匹中3匹）之致癌率顯示出抑制致癌 。結果示於第5圖。即，第5圖為示出環戊烯酮之致癌 抑制作用之圖，縱軸為表示致癌率、橫軸為表示時間 (週）。圖中白三角為表示環戊烯酮2 . 5毫克/鼠處理群 、黑三角為表示環戊烯酮0 , 8毫克/鼠處理群（11匹）、 白圈為表示對照群Π 2匹）。 尚，於鼠耳殼之1?&發炎試驗中，環戊烯麵於2.5毫 克/鼠之鼠耳殻塗敷中未顯示出抗發炎活性。 -43一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 500612 A7 五、發明説明（42 ) K上，環戊烯麵為在二階段化學致癌中顯示出抗促進 劑作用。含有環戊烯嗣之葡萄糖醛酸加熱處理物、（-） 體環戊烯麵、（+ )體環戊烯麵亦顯示出同樣之效果。 實施例10 注射劑 (1) 於生理食鹽液（日本藥典收載品）中加入1纟濃度之環 戊烯酮，製作注射劑。 (2) 於生理食鹽水中（同前逑）分別加入0.5¾及（Κ II濃度 之（-)體環戊烯嗣及甘草酸，製作注射劑。 實施例1 1 錠劑 ⑴調製含有環戊烯嗣1 0毫克和微结晶性纖維素適量之 錠劑，施Μ糖衣，製作錠劑。 ⑵調製含有（+ )體環戊烯酮1 . 〇毫克、甘草酸二鉀1 〇 毫克及微結晶纖維素適量之錠劑、施Κ糖衣，製作錠劑。 實施例1 2 軟膏 環戊烯酮 1克 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 吸水軟膏（日本藥典收載） 99克 將環戊烯麵首先與少量之吸水軟膏充分捏和，其次慢 慢加入剩餘的吸水軟膏捏和均勻，製作成軟膏。 實施例1 3 (1)將果膠（Ρ 〇 m 〇 c i η P e c t i n L Μ - 1 3 C G : H e r e u 1 i s 公司 製）5公斤加至自來水1 0 0公升中，藉由吹入水蒸氣令 …4 4 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612 A 7 B7五、發明説明（43 ) 液溫由2 8 °C升潙至液溫1 2 0 °C為止地升溫3 5分鐘，其次 於攪拌下K 1 2 0 °C保潙5小時，其次冷卻，調製冷卻物 135公升。其次於冷郤物中添加作為肋丨慮劑之Cel ite #545 (Cel ite 公司製）1,35公斤、及 Silica #600-S(中央 5 i 1 i c a公司製）1 . 3 5公斤，次Μ預塗層C e 1 i t e # 5 4 5 0 · 1 公斤、及S i i ί e a tf 6 0 0 - S 0 · 1公斤之壓縮濾紙（6英寸1 6 段濾紙：A D V A N T E C # 3 2 7 )進行過滤。所得之濾液Μ板式 加熱器（日阪製作所製）進行連續瞬間加熱處理（98 °C、 6 0秒鐘）後冷卻，調製成1 5 0公斤之含有環戊烯酮之果 膠加熱處理液。 含有環戊烯嗣之果膠加熱處理液的p Η為約3 * 5 ，酸度 為6 . 2毫升、糖度為5 . 8 B r i X I。尚，ρ Η為Μ ρ Η計進行測 定，而酸度為Μ試料10毫升中和至ΡΗ7.0所需之0.1Ν N a 0 Η量（毫升）表示。再者，糖度為Μ B r i X糖度計測定。 ⑵K下逑組成調製飲料。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫士 :寫本頁} 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 果糖葡萄糖液糖 5*001 砂糖 4 * 0 0 % 酸味料 1*201 香料 0.301 環戊烯嗣含有物 0.5¾ 精製水 剩餘量 合計 100 , 00¾ 使用實_例1 3 - 0)記載之含環戊烯嗣果膠加熱處理疲 一45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 500612

/X 7C

、，·、' I ____ 年月「二 1 五、發明說明（44 ) 一 作爲環戊烯酮含有物，並添加其固形物換算量。此飮料 100毫升中含有4毫克之環戊烯酮。 實施例1 4 爲製作具梅粒之梅酒，在有蓋的5公升瓶器中混合7 5 重量％之果糖葡萄糖液糖1 440克、95體積％之原料用酒精 6 7 0毫升及水3 4 0毫升後，放入1公斤青梅。 本發明品在將上述物品置入瓶中時，以實施例1 3 - ( 1 ) 之含有環戊烯酮的果膠加熱處理液，每100毫升製品添 加含環戊烯酮0 . 8毫克。 蓋上各瓶蓋後，置於室溫下，時而輕微攪拌，浸漬青 梅兩個月。然後再加入28體積％之酒精水溶液1020毫升 予以混合，再繼續成熟兩個月即可獲得梅酒。 實施例15 本發明品係使用普通牛乳之均質牛乳（水分爲88 · 6重 量/體積％，蛋白質爲2 . 8重量/體積％，脂肪爲3 · 5重量/ 體積％，乳糖爲4 . 5重量/體積％，碳水化合物爲〇 . 8重量 /體積％ )，以實施例1 3 - ( 1 )之含有環戊烯酮的果膠加熱處 理液，每1 00毫升之製品添加含環戊烯酮〇 · 4毫克。 實施例16 遵循常法，由大豆作成豆乳，係以凝固劑使其凝固’ 調製爲一般的木棉豆腐。本發明品爲在豆乳中’以實施 例13-U)之含有環戊烯酮的果膠加熱處理液’每100毫 升之製品添加含環戊烯酮〇 . 8毫克。 -46- 500612 _____年月f 五、發明說明（45 ) ~—一一一 實施例17 菓子類食品之製法’以巧克力醬、糖果及橘子果膠試 做之。 以兩個蛋黃、1 2 5毫升牛乳、1 〇克小麥粉及3 〇克砂 糖，加溫攪拌調製成巧克力醬。 糖果則以攪拌器攪拌1 · 2公斤砂糖與〇 . 8克糖漿溶解 混合後’用電鍋煮至1 2 0 - 1 3 0 °C，使水分含量在2 %以 下，再加入16.3克乳酸（50重量％溶液）、10.ι克之蘋果 酸、5 . 0克碳酸鈣及適量香料而調製成。 橘子果膠係以9克角叉采膠（carrageen in)與180克細 粒糖混合，加入8 0 0毫升的水，並混合、加熱溶解。再 加入溫州橘子濃l(S果汁1 〇克、棒樣酸2克、棒檬酸蘇打 1.5克、橘子香味2克及香料1克，調製而成。本發明之 巧克力醬、糖果、橘子果膠各以實施例1 3 - ( 1 )之含有環 戊烯酮的果膠加熱處理液，每1 00毫升之製品添加含環 戊烯酮0 . 8毫克。 實施例1 8 糊狀製品之製法’以魚肉作成之魚糕及家畜肉作成之 香腸試做。 魚糕之製法係在1公斤鳕魚（S A級）中加入1 〇 〇克水及 20克食鹽，1 5分鐘後拿出’各分爲40克以乙烯包纏 繞，在下放置一晚，在常溫下蒸1 5分鐘可得蒸熟之 魚糕。 -47- 500612 五、發明說明（46 ) 香腸之製法係將2公斤豬肉、700克豬脂肪切爲5毫米 肉塊’混合以7克胡椒、3克鼠尾草香料及1克宣蔻香 料’切丁後，裝入直徑2公分豬腸中，蒸煮1 5分鐘可 得。 在魚糕未用乙烯包纏繞拿出前及香腸切丁未裝入豬腸 前’以實施例13-(1)之含有環戊烯酮的果膠加熱處理 液’每1 00毫升之製品添加含環戊烯酮3 . 2毫克。 發明之效果 ί衣ί廉本發明，提供具有對細胞誘導病毒抵抗性機能、 i具有將病毒感染細胞選擇性地死滅機能之化合物，例 如環戊烯酮或其光學活性體或其鹽所選出之化合物作爲 有效成分之抗病毒劑。本發明之抗病毒劑爲令病毒感染 細胞選擇性地死滅，且對未感染病毒之正常細胞賦予病 毒抵抗性，且經由其相乘作用而成爲於難治療性之病毒 疫病例如AIDS、C型肝炎等之治療及改善症狀上之極爲 有用的抗病毒劑。又，依據本發明，提供含有具有肝機 能改善作用、熱衝擊蛋白質誘導作用、病毒致癌預防作 用、抗促進劑作用等生理活性之環戊烯酮或其光學活性 體或其鹽之醫藥品，該醫藥品在生體恆定性之維持上， 特別是保持胃腸健康上，爲有用之醫藥品。 又，依據本發明，提供以具有對細胞誘導病毒抵抗性 機能、且具有將病毒感染細胞選擇性地死滅機能之化合 物，例如環戊烯酮或其光學活性體或其鹽所選出之化合 -48- 500612 9_·2β 五、發明說明（47 ) 物作爲有效成分之抗病毒用食品或抗病毒用飮料，此些 飮食品可用於作爲起因於病毒之各種疾病的症狀改善用 飮食品或預防用飮食品。又，依據本發明，提供含有具 有肝機能改善作用、熱衝擊蛋白質誘導作用 '病毒致癌 預防作用、抗促進劑作用等生理活性之環戊烯酮或其光 學活性體或其鹽之飲食品，該飲食品在生體恆定性之維 持上，特別是保持胃腸健康上，爲有用之飮食品。 -49-

Claims (1)

1. 500612 六、申請專利範圍 年月曰 補无 第8 7 1 0 3 0 4 4號「抗病毒劑」專利案 (91年6月20日修正) A申請專利範圍·· I一種抗病毒劑，其特徵爲含有一種選自下式Π]所示之 4,5-二羥基-2-環戊烯-1-酮或其光學活性體或其鹽之 化合物作爲有效成分

   2.如申請專利範圍第1項之抗病毒劑，其中病毒爲人類 後天性免疫不全病毒、或c型肝炎病毒。 3 .如申請專利範圍第1項之抗病毒劑，其爲人類用抗病 毒劑或非人類動物用抗病毒劑。 4 .如申請專利範圍第3項之抗病毒劑，其爲家畜、家禽 、魚類或蝦類用抗病毒劑。 5 ·如申請專利範圍第1項之抗病毒劑，其係用於食品。 6 ·如申請專利範圍第1項之抗病毒劑’其係用於飮料。 7·—種熱衝擊蛋白質誘導劑’其特徵爲含有一種選自下 式[I]所示之4,5-二經基-2-環戊烯-1-酮或其光學活 性體或其鹽之化合物作爲有效成分’ 人