WO1998041196A1 - Agents antiviraux - Google Patents

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WO1998041196A1
WO1998041196A1 PCT/JP1998/000816 JP9800816W WO9841196A1 WO 1998041196 A1 WO1998041196 A1 WO 1998041196A1 JP 9800816 W JP9800816 W JP 9800816W WO 9841196 A1 WO9841196 A1 WO 9841196A1
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cyclopentenone
virus
cells
pentenone
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PCT/JP1998/000816
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Hiroaki Sagawa
Nobuto Koyama
Hideto Chono
Kazutoh Takesako
Ikunoshin Kato
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Takara Shuzo Co., Ltd.
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    • C07C323/59—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups with amino groups bound to the carbon skeleton with acylated amino groups bound to the carbon skeleton

Definitions

  • the present invention relates to medicines and foods and drinks that are useful against pathogenic organisms due to their antiviral action.
  • the action of inducing virus resistance such as inhibiting virus infection of cells, inhibiting the growth of virus in infected cells, the action of selectively killing virus-infected cells, and the virus itself It can be considered to have the effect of inactivating (eliminating infectivity)
  • Neutralizing antibodies against the virus are known to have the effect of inactivating the virus itself.
  • a vaccine as a method for inducing such antibodies.
  • antibody induction by vaccine administration is effective in preventing viral infection, but at present there are few effective treatments using antibodies.
  • drugs that directly inactivate the virus are known to have the effect of inactivating the virus itself.
  • the effects of inducing virus resistance include inhibition of viral genome replication, inhibition of viral gene transcription, inhibition of viral protein synthesis, and inhibition of viral protein holding. Induction of such effects includes suppression of the activity or expression of intracellular transcription factors, suppression of the activity or expression of virus-derived transcription factors, induction of heat shock proteins, and the like. Prostaglandins include those that induce such effects.
  • those that selectively kill virus-infected cells include acyclovir, ganciclovir, and sorivudine, which are used as anti-herpesvirus drugs.
  • An object of the present invention is to develop a compound having a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells, and comprising such a substance as an active ingredient, an antiviral agent and a liver function improving agent. In some cases, it provides pharmaceutical products such as heat shock protein inducers, cancer gene carcinogenesis inhibitors, chemical carcinogenesis inhibitors, and foods or beverages for antiviral use.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to achieve such an object.
  • a compound having a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells is acted on, the virus That the infected cells are selectively damaged and the amount of virus produced before death is reduced, and therefore, the number of newly infected cells with the virus produced before death is reduced.
  • cells that have not been infected with the virus have already acquired virus resistance through the administration of this compound, so that virus growth is suppressed even when newly infected, that is, they induce virus resistance in cells.
  • Compounds that have a function and a function of selectively killing virus-infected cells can be used for virus removal, for example, human acquired immunity. All viruses, or heading to be very effective in removing c hepatitis virus.
  • the function of the compound used in the present invention to induce virus resistance in cells is as follows: after the compound is allowed to act on cells before virus infection, inhibition of virus infection to cells, inhibition of virus genome replication, virus gene transcription Inhibition, inhibition of viral protein synthesis, inhibition of viral protein folding, etc. can be measured as indices.
  • the function of selectively killing virus-infected cells can be measured by comparing the viability of virus-infected cells with that of non-infected cells.
  • Compounds having a function of inducing virus resistance in cells and having a function of selectively killing virus-infected cells are not limited as long as they have both functions. Absent.
  • the present inventors have proposed, as a compound having a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells, a compound represented by the formula [I],
  • the present inventors have found 5-dihydroxy-1-cyclopenten-1-one (hereinafter simply referred to as cyclopentenone), an optically active form thereof, or a salt thereof, and have completed the invention.
  • the first invention of the present invention is based on 4,5-dihydroxy-2-cyclopentene-11-one represented by the following formula [I] or an optically active form thereof or a salt thereof.
  • the present invention relates to an antiviral agent comprising at least one or more selected compounds as an active ingredient.
  • the second invention of the present invention relates to at least one or more selected from 4,5-dihydroxy-12-cyclopentene-11one represented by the formula [I], an optically active substance thereof, and a salt thereof.
  • the present invention relates to an antiviral food or antiviral beverage characterized by containing the compound of formula (I).
  • the virus is exemplified by human acquired immunodeficiency virus or hepatitis C virus.
  • the antiviral agent include an antiviral agent for humans, an antiviral agent for non-human animals (for example, an antiviral agent for livestock, poultry, fish or shrimp), or an antiviral agent for plants.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between pentenone concentration and cell viability when CEM-SS cells are used.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between cyclopentenone concentration and cell viability when H9 cells are used.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the pentenone concentration and the cell viability when CEM-3B cells are used.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between pentenone concentration and cell viability in the case of using H9-3B cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the inhibitory action of cyclopentenone on carcinogenesis.
  • FIG. 6 is a diagram showing the CD of the (1-) cyclopentenone p-dimethylaminobenzoyl derivative and the stereostructure of the (1-) cyclopentenone.
  • FIG. 7 is a diagram showing the CD of the p-dimethylaminobenzoyl derivative of the (+) cyclopentenone and the stereostructure of the (+) cyclopentenone.
  • the cyclopentenone represented by the formula [I] used in the present invention includes both a cis isomer and a trans isomer in the configuration of the 4- and 5-hydroxyl groups.
  • cis-cyclopentenone may be used
  • trans-cyclopentenone may be used
  • a mixture of cis-cyclopentenone and trans-cyclopentenone may be used.
  • These optically active compounds may be used.
  • the cis-cyclopentenone can be obtained by a chemical synthesis method (Helvetica Chimica Acta, Vol. 55, Vol. 2838-2844). P. (1972)].
  • Trans-cyclopentenone can be obtained by a chemical synthesis method (Carbohydrate Res., Vol. 247, Vol.
  • the physical properties of Sikuguchi Pentenone are shown below.
  • the mass spectrometry of pentenone was measured using a DX302 mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.).
  • the NMR spectrum was measured using a double-mouthed form solvent as described in JNM-A500 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • IR IR-8000 infrared spectrophotometer
  • I R (KBr method): Absorb at 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm- '.
  • cyclopentenone is dissolved in ethanol.
  • Hexane / ethanol (94/6) is further added to this ethanol solution to prepare a cyclopentenone solution.
  • this Cyclopentenone is optically resolved by performing HPLC on the sample solution using, for example, a Kiralpak AS (Daicel Chemical Industries) column with a column temperature of 40 ° C and a mobile phase of hexane / ethanol (94/6). can do.
  • the optically resolved (1-) cyclopentenone and (+)-cyclopentenone are ⁇ -dimethylaminobenzoyl derivatives, respectively, and a J-720 type circular dichroic dispersometer (JASCO Corporation)
  • the dichroic dichroic spectrum (CD) was measured using J. Am. Chem. Soc., And the results were applied to the dibenzoate chirality rule [J. Am. Chem. Soc. Vol. 91, pp. 3899-1939 (1969)], the configuration was determined.
  • the stereostructure of the (-) cyclopentenone is shown in FIG.
  • the vertical axis shows molar circular dichroism
  • the horizontal axis shows wavelength (nm).
  • the above three-dimensional structure is shown below as formula [II].
  • FIG. 7 shows the CDs of the p-dimethylaminobenzoyl derivative of (+)-form pentenone and (3-) cyclopentenone.
  • the vertical axis shows molar circular dichroism
  • the horizontal axis shows wavelength (nm).
  • the (-)-form cyclopentenone is represented by (1) -1 (4R, 5S) -1trans-1,4,5-dihydroxy-12-cyclopentene.
  • the 1-one, (+)-cyclopentenone is (+)-(4S, 5R) -trans-4,5-dihydroxy-2-cyclopentene-1-one.
  • the cyclopentenone or its optically active substance used in the present invention may be produced by any method, may be produced by the method disclosed in the specification, may be synthesized by a chemical synthesis method, and may be cyclopentene.
  • the trans and cis forms of tenone and their mixtures are also used in the present invention.
  • the optically active form of cyclopentenone obtained by the chemical synthesis method is also included in the optically active form disclosed in the present invention.
  • salt of cyclopentenone or an optically active form thereof there is a pharmaceutically acceptable salt, which can be converted by a known method.
  • the compound used in the present invention which has a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells, such as pentenone or optically active form thereof, or a salt thereof, It has a virus action and can produce an antiviral agent using at least one compound selected from these compounds as an active ingredient.
  • a compound having a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells is used as an active ingredient, and when formulated in combination with a known pharmaceutical carrier, an antiviral agent can be obtained. Can be manufactured.
  • Antiviral agent In general, a compound having a function of inducing viral resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells, such as pentenone, or an optically active form thereof, At least one compound selected from salts is blended with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, dispersant, emulsifier, buffer, stabilizer, or vehicle is formed.
  • solid preparations such as tablets, granules, powders, powders, capsules, and the like, as well as liquid preparations such as ordinary liquid preparations, suspensions, and emulsions, in addition to agents, binders, disintegrants, and lubricants.
  • liquid preparations such as ordinary liquid preparations, suspensions, and emulsions, in addition to agents, binders, disintegrants, and lubricants.
  • it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.
  • Pharmaceutical carriers can be selected according to the above administration forms and dosage forms.
  • oral preparations for example, starch, lactose, sucrose, mannite, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts, etc. are used.
  • a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a flavoring agent, a coloring agent, a fragrance, and the like can be further added.
  • a compound having a function of inducing virus resistance in cells as an active ingredient of the present invention and having a function of selectively killing virus-infected cells according to a conventional method, for example, Pentenone or one or more compounds selected from optically active forms or salts thereof as a diluent, distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, laccase oil, soybean oil, corn oil It is prepared by dissolving or suspending in propylene glycol, polyethylene glycol or the like, and adding a bactericide, a stabilizer, an isotonic agent, a soothing agent and the like as necessary.
  • Pentenone or one or more compounds selected from optically active forms or salts thereof as a diluent, distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, laccase oil, soybean oil, corn oil It is prepared by dissolving or suspending in propylene glycol, polyethylene
  • the antiviral agent of the present invention is administered by an appropriate administration route according to the formulation.
  • the administration method is not particularly limited, and can be used internally, externally, or by injection.
  • injectables can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations include suppositories and the like.
  • the dosage of the antiviral agent is appropriately determined depending on the formulation, administration method, purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient to which it is applied, and is not constant, but is generally included in the formulation Has the function of inducing virus resistance in cells, and A compound having a function of selectively killing virus-infected cells, for example, the amount of one or more substances selected from pentenone or optically active form thereof or a salt thereof is 0.1 lg to 20 mg per adult per day. / kg. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, a smaller amount than the above-mentioned dosage may be sufficient, or may be necessary beyond the range.
  • the drug of the present invention can be administered orally as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
  • a compound having a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells such as pentenone or optically active form thereof, or a salt thereof for antiviral agents and antiviruses It may be used as a raw material of food or beverage.
  • a compound used in the present invention which has a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells, such as pentenone or optically active form thereof or a salt thereof, Shows antiviral activity against DNA viruses, RNA viruses, retroviruses, and viroids.
  • antiviral agents for humans antiviral agents for non-human animals, such as livestock, poultry, aquaculture animals, for example, antiviral agents effective against viral diseases such as fish and shrimp, and plant antiviral agents, for example, It can be used as an antiviral agent for useful organisms, such as an antiviral agent effective against viral diseases of agricultural and horticultural crops such as flowers and vegetables.
  • DNA viruses that infect animals include poxvirus, herpesvirus, adenovirus, hepatitis B inores, nopirooma virus, polio-oma vinoles, Epstein-bano-renoinoles, and baculoinoures.
  • the DNA virus that infects plants includes, for example, the force reflower mosaic virus.
  • RNA viruses that infect animals include, for example, rotavirus, rubella virus, Japanese encephalitis ⁇ inores, dengue fever innores, New Katsunore disease ⁇ inores, measles virus, mumps virus, distemper virus, influenza virus, vesicular stomatitis virus, and human poliovirus.
  • Viruses, hepatitis A virus and hepatitis C virus; and RNA viruses that infect plants include, for example, tobacco mosaic virus, barley dwarf virus, rice stripe virus, and tobacco ring spot virus.
  • Retroviruses include, for example, adult T-cell leukemia virus, human Acquired immunodeficiency virus can be mentioned, and viroids include, for example, potato spindle tuber viroids.
  • Pentenone or an optically active form thereof or a salt thereof is effective for the treatment and prevention of viral diseases in non-human mammals, birds, for example, chickens and turkeys, cold-blooded animals, for example, fish. Shows antiviral activity against the following non-human viruses.
  • Silyl Herpesvirus 1 Capri Herpes 1, Laga Morph Henoles Virus 1, Facianido Henoles Innores Type 1, Fashianid Herpes Innores Type 2, Turkey Henoles Innores 1 Type, Anatide Henoles Innoles Type 1, Catfish Henoles Innores Type 1, Equid Herpes Virus Type 3, Bobido Heres Virus Type 1, Bobid Hermes Winoreles Type 3, Bobido Herenoles Type 3 Virus type 4, Big hennovirus virus type 1, Big hennovirus virus type 2, Miherid herpes virus type 1, Sepid hennovirus virus type 1, Sepido health phoenores type 2, Suino Inores Type 1, Power Ninoh Innores Innores Type 1, Hirain Health Innores 1 , Norepe Suuinoresu type 1 to Ekui de, Norepe Suuinoresu type 2 to Ekui de.
  • Avian viral diseases such as Marek's disease are used in the present invention by methods well known in veterinary techniques and breeding techniques, such as injecting the antiviral agent of the present invention into birds or adding it to feed or drinking water.
  • the compound used in the present invention may be added directly to water, seawater, or the like in a pool, aquarium, holding tank, or breeding area, or the compound used in the present invention may be mixed with feed to produce a virus of the group Viral diseases of fish that live in pools, aquariums, holding tanks or small areas in breeding areas due to viral infections, such as P. caterpillar innores, Henoles-winolas-Solomons, and Nazuri virus.
  • a non-human animal to which the antiviral agent of the present invention has been administered has remarkable improvements in survival rate, growth rate, egg production rate, etc. due to its health maintenance.
  • Compounds having a function of inducing virus resistance in cells and having a function of selectively killing virus-infected cells are It inhibits the synthesis of viral proteins and also suppresses the synthesis of the viral genome, thereby exhibiting a strong antiviral effect. It also selectively kills these virus-infected cells.
  • the antiviral agent of the present invention selectively kills infected cells while suppressing the HIV proliferation of the infected cells, induces virus resistance in uninfected cells, and enables removal of HIV from the cells.
  • Cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof has, in addition to the above-mentioned antiviral effect, a liver function improving action and a heat shock protein inducing action, and is selected from cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof.
  • a liver function improving agent or a heat shock protein inducer containing one or more compounds as an active ingredient can be formulated according to the above antiviral agent, and can be administered by a method according to the antiviral agent. .
  • the dosage as a hepatic function improver or heat shock protein inducer is appropriately determined depending on the dosage form, administration method, purpose of use and the age, weight, and symptoms of the patient to which it is applied.
  • the amount of one or more compounds selected from cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof contained therein is 0.1 ⁇ g to 2 O mg Z kg per adult per day.
  • the drug of the present invention can be administered orally as it is, or can be added to any food or drink to be taken on a daily basis.
  • cyclopentenone one or more compounds selected from optically active substances or salts thereof may be used as raw materials for foods and drinks for improving liver function and foods and drinks for inducing heat shock protein.
  • liver dysfunction is also improved and GOT and GPT levels are normalized.
  • Cyclic pentenone or its optically active form or a salt thereof has a heat shock protein-inducing activity such as 70 kDalton (HSP70), and is used for hepatitis virus, AIDS innores, innoleenzyzainoles, and blisters. It has antiviral activity against RNA virus and DNA virus such as raw stomatitis (Inores, Henoles vinoles). In addition, heat shock proteins are involved in cancer immunity and also have a biological defense effect. By ingesting cyclopentenone or its optically active substance or a salt thereof, viral diseases such as a cold disease caused by influenza virus can be prevented and treated.
  • HSP70 heat shock protein-inducing activity
  • RNA virus and DNA virus such as raw stomatitis (Inores, Henoles vinoles).
  • heat shock proteins are involved in cancer immunity and also have a biological defense effect.
  • Heat shock protein is a generic term for proteins whose synthesis is induced when cells or individuals undergo a rapid temperature change of about 5 to 10 ° C higher than the normal temperature, from prokaryotes to higher eukaryotes. It is widely distributed.
  • HSP90, HSP70, ubiquitin, HSP26 and the like are known.
  • HSP70 is a kind of molecular peptide and binds to unfolded or incompletely folded protein to help form a three-dimensional structure.
  • the amino acid sequence of the heat shock protein is well conserved during evolution, and HSP70 is homologous to the E. coli DnaK protein.
  • HSP70 is homologous to the E. coli DnaK protein.
  • HS-70 genes some of which are constitutively expressed and some are induced by various stimuli.
  • synthesis of heat shock proteins is induced by various chemicals and cell damage such as oxidative stress.
  • the HSP70 inducibility by the pen-mouth pentenone used in the present invention is seen at 10 ⁇ ⁇ and is maximum between 20 and 30. This is due to the fact that 2-cyclopenten-11-one has ⁇ S ⁇ 70. It can be said that the induction ability is extremely high as compared with the case where a concentration of several hundreds / M is required for induction. This is comparable to the ability of prostaglandin A, to induce HSP70, and the molecular weight of cyclopentenone is less than one-third of that of prostaglandin A, so that when compared by weight concentration, prostaglandin A, It can be said that it has higher inducibility.
  • cyclopentenone or its optically active substance or a salt thereof used in the present invention has such a high heat shock protein inducing action, it has antiviral activity against DNA viruses, RNA viruses, retroviruses, and viroids. Is shown. These viruses and viroids are exemplified by the above viruses and viroids.
  • Cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof has a growth inhibitory activity also on cancer cells transformed with an oncogene, and has an effect of preventing carcinogenesis by an oncogene.
  • papillomavirus is a DNA type of the papovavirus family (papovav iridae) and the genus papilo mawinores (papi l lomavirus), and as a human virus (HPV), HPV16, which causes cervical cancer and the like, is exemplified.
  • HPV human virus
  • Known cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof has a growth inhibitory effect on cells carcinomatized by HPV16 type cancer gene E7, and cyclopentenone or an optically active form thereof Or at least one compound selected from their salts
  • a virus carcinogenesis cell growth inhibitor can be provided, and carcinogenesis by oncogenes can be prevented.
  • cyclopentenone or its optically active substance or a salt thereof has a two-step carcinogenesis inhibitory action by an initiator and a promoter, and suppresses chemical carcinogenesis by using at least one compound selected from these compounds as an active ingredient.
  • Agent can be provided.
  • An oncogene carcinogenesis inhibitor or a chemical carcinogenesis inhibitor containing at least one compound selected from cyclopentenone or its optically active substance or a salt thereof as an active ingredient should be formulated according to the antiviral agent. It can be administered by a method according to the antiviral agent.
  • a compound having a function of inducing virus resistance in cells and having a function of selectively killing virus-infected cells for example, cyclopentenone or The optically active substance or a salt thereof can be used.
  • a heat-treated product of peronic acid containing cyclopentenone, a partially purified pentenone and a purified pentenone from the heat-treated product can be used.
  • a raw material selected from these cyclopentenone or its optically active substance or a salt thereof, a heat-treated product containing cyclopentenone, a partially purified cyclopentenone and a purified cyclopentenone from the heat-treated product is diluted and diluted.
  • the food or beverage to be produced by adding or / and adding thereto is included in the antiviral food or beverage of the present invention.
  • the method for producing the antiviral food or antiviral beverage of the present invention is not particularly limited, but includes cooking, processing, and production using commonly used food or beverage production methods.
  • Food or beverage which has the function of inducing viral resistance in cells and the function of selectively killing virus-infected cells, such as pentenone or optically active form thereof or salts thereof. It suffices if an effective amount of one or more compounds is contained.
  • Examples of the antiviral food or antiviral beverage of the present invention include compounds having a function of inducing viral resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells, for example, cyclopentenone or a compound thereof.
  • the shape is not particularly limited as long as it contains, is added and / or is diluted with at least one compound selected from optically active substances or salts thereof, and is in the form of tablets, granules, capsules, gels, and sols. Orally ingestible forms, such as forms, are also included.
  • liver function improving, heat shock protein inducing, carcinogenesis prevention food or liver function improving, heat shock protein inducing, carcinogenesis preventing beverage it has liver function improving effect, heat shock protein inducing effect, carcinogenesis preventing effect.
  • the form is not particularly limited as long as it contains, is added and / or is diluted with at least one compound selected from cyclopentenone or an optically active substance thereof or a salt thereof, and may be in the form of tablets, granules.
  • the food or beverage of the present invention also includes an orally ingestible form such as a capsule, gel, and sol.
  • the food or beverage of the present invention contains cyclopentenone having biological activity, an optically active form thereof, or a salt thereof, These compounds have various physiological activities, antiviral effects, liver function improving effects, heat shock protein inducing effects, carcinogenesis preventing effects, etc. It is a health food or beverage having the effects of preventing, treating, improving liver function, preventing carcinogenesis, etc. by taking them, and is useful for
  • the compound used in the present invention does not show toxicity even when administered in an effective amount of its biological activity. No single fatal case was observed with a single dose of any of these salts at 10 OmgZkg.
  • the agent of the present invention can be used as a therapeutic or prophylactic agent for viral diseases, liver diseases, cancers, etc., and is particularly useful for the treatment of HIV-induced acquired immunodeficiency syndrome and improvement of symptoms. .
  • Both the obtained (1) -cyclopentenone and (+)-cyclopentenone contained about 1% of enantiomer, so that they were optically resolved again under the above conditions.
  • the (1) -cyclopentenone not containing the enantiomer of 30.Omg to 19.7 mg of the (1) -cyclopentenone in the former peak, and the (+)-cyclopentenone in the later peak, 37.4111 From 8 to 27.7 mg of (+)-cyclopentenone containing no enantiomer were obtained, respectively.
  • the elution times of the (1) -form cyclopentenone and the (+)-form cyclopentenone by optical resolution HPLC were 33 minutes and 40 minutes, respectively.
  • Monoclonal antibody HSP 72/73 (Ab-1) that specifically reacts with the heat shock protein of 7 OkDa thermally induced on the blocked membrane [Oncogene Research Products Cat. # HSP01] After the reaction, the plate was washed with Tris-buffered saline (TBS) containing 0.05% Tween20, and further washed with TBS. Then, a peroxidase-conjugated secondary antibody, HRP-RabbitAntiMousse IgG (H + L) [Cat. # 61-6520, manufactured by ZYMED Laboratolies, Inc.] was reacted and washed in the same manner as the previous operation. .
  • TBS Tris-buffered saline
  • HRP-RabbitAntiMousse IgG H + L
  • the X-Ray film is applied to the membrane. Exposure confirmed the induction of a 70 kDa heat shock protein.
  • HeLa cells ATCC CCL-2
  • Dulbecco's modified medium containing 10% fetal calf serum DMEM; Nissui Co., Ltd.
  • DMEM fetal calf serum
  • cyclopentenone a final concentration of 0, 5, 10, 20, or 40 M.
  • Culture was continued for hours. The medium was discarded, 1 ml of 10% trifluoroacetic acid was added to each well, and the cells were collected with a scraper.
  • the cells thus obtained were blotted with SDS-PAGE by the method of Example 1 to detect the expression of a 70 kd heat shock protein.
  • the cells thus obtained were subjected to SDS-PAGE and blotting according to the method of Example 1 to detect the expression of the adenovirus hexon protein.
  • the primary antibody used was an anti-adenovirus hexon antibody [AB1056, manufactured by Chemicon International Inc.].
  • the hexone protein amount was clearly reduced in the group to which pentenone was added at 10 ⁇ or more compared to the control without pentenone.
  • the cell proliferation was the same as in the cyclopentenone-free category. Breeding was seen.
  • Example 2 Viral experimental protocol from HeLa cells infected with adenovirus and cultured after treatment with cyclopentenone in the same manner as in (2) Virus DNA was extracted according to the method described on page 25. That is, the virus-infected cells were washed with phosphate buffered saline, suspended in 1 ml of 0.6% sodium lauryl sulfate (SDS) aqueous solution of ZlOmM EDTA, and then washed with 3.O ml of 5M NaC. One aqueous solution was added. After leaving at 0 ° C for 1 hour, 3 ml of ethanol was added to the supernatant obtained by centrifugation and mixed.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • the precipitate obtained by centrifugation was dissolved in 0.2 ml of TE buffer [10 mM Tris-HC 1 pH 8.0, 1 mM EDTA], and 2 ⁇ l of 10 mM % SDS and 4 ⁇ l of 10 mg / m 1 proteinase K (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. Extract twice with an equal volume mixture of phenol and black form, add 20 ⁇ l of sodium acetate triacetate and 400 ⁇ l of ethanol to the aqueous layer, and centrifuge. The DNA was dissolved in ⁇ 1 of the buffer to obtain a DN ⁇ solution. 10 units of E c ⁇ ⁇ 22 I in 10 ⁇ l of DNA solution
  • Example 2 After culturing the HeLa cells in the same manner as in (2), 5% bovine fetus containing adenovirus type 5 (Adenoid 75 ATCC VR-5) was added without adding cyclopentenone. Serum-containing DMEM was added to cells for infection. However, the multiplicity of infection (m.o.i.) was set to 50. Thereafter, cyclopentenone was added so that the final concentration was 0, 5, 10, 20, or 40 ⁇ M, and the cells were cultured for 20 hours. After the culture, the hexon protein of adenovirus was detected in the same manner as in Example 2- (2).
  • 5% bovine fetus containing adenovirus type 5 (Adenoid 75 ATCC VR-5) was added without adding cyclopentenone. Serum-containing DMEM was added to cells for infection. However, the multiplicity of infection (m.o.i.) was set to 50. Thereafter, cyclopentenone was added so that the final concentration was 0, 5, 10, 20, or 40
  • Example 2 Hela cells were cultured in the same manner as in (2) and treated with cyclopentenone. Thereafter, as in Example 2- (4), the cells were infected with an adenovirus type 5 (Adenoid 75 ATCC VR-5) and cultured in a medium supplemented with cyclopentenone.
  • adenovirus type 5 Adenoid 75 ATCC VR-5
  • Example 2- (2) After the culture, the adenovirus hexon protein was detected in the same manner as in Example 2- (2). As a result, the hexone protein level was clearly decreased in the group to which 10 or more cyclopentenone was added, compared to the control without cyclopentenone. In addition, the cell growth in the pentenone-added section at 20 ⁇ or less was similar to that in the section without pentenone added.
  • Example 2 Similar to Example 5 (5), HeLa cells cultured with infection with type 5 adenovirus (Adenoid 75 ATCC VR-5) after treatment with cyclopentenone were used. The amount of viral DNA was measured in the same manner as in (1). As a result, the amount of virus DN ⁇ was clearly reduced in the group to which pentenone was added in an amount of 5 ⁇ or more compared to the control without pentenone.
  • Recombinant retinoviral vector BAG which has a / 3-galactosidase gene and a neomycin resistance gene as reporter genes, was digested with the restriction enzyme BamHI and self-ligated to remove the / 3-galactosidase gene.
  • the D0L vector was constructed.
  • Example 3 Transform the D0L vector plasmid described in (1) into E. coli HB101, culture in shi-broth medium, and extract plasmid from the collected cells.
  • the D0L plasmid was purified by cesium chloride density gradient ultracentrifugation.
  • the transfected cells were selected for 2 weeks in a Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% pup serum and containing 0.4 mg / ml of G418 (Gibco) at 37 ° C and 5% CO 2, and the resulting colonies were obtained.
  • 20 cells were cloned, the plate was expanded with a 100 mm diameter plate, the medium was changed in the state of semi-confluent, and after 24 hours, the supernatant was collected and filtered through a 0.45 ⁇ filter (Milex HV; Millipore) to remove the virus. The supernatant was used. Cells were detached with trypsin and stored in liquid nitrogen.
  • the titer of the virus supernatant obtained from each colony was determined by the method shown in Example 3 below one (3), the most titers high virus solution obtained click opening one down the recombinant Leto port Virus Established as producer cell CRIPZDOL.
  • the titer of the virus supernatant obtained from the producer cells at the time of the establishment was 1 ⁇ 10 6 colony forming units ( C fu) Zml.
  • the established producer cells were maintained in a Dulbecco's modified idal medium containing 10% pup serum and containing G418 containing 0.2 mg gZm1.
  • Virus titers were measured using NIH3T3 cells (ATCC CRL-1658).
  • NIH3T3 cells cultured in 10% lactose serum-containing Dulbecco's modified single medium were transferred to a 6-well plate (Iwaki Glass Co., Ltd.) at 50,000 cells / well and the next day, 8 / g / ml polybrene ( NIH3T3 cells were infected for 3 hours with 1 ml of virus dilution containing Sigma).
  • Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% calf serum was used for virus dilution.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% pup serum was further added to dilute polypropylene.
  • the obtained colonies were stained with Giemsa staining solution (Gibco) according to a conventional method and counted. The value obtained by multiplying the obtained colony number by the dilution ratio was defined as the virus titer as cfu.
  • Example 3_ The recombinant retrovirus producer cell IP / D0L described in (2) was subcultured into a 6-well plate, and it became semi-confluent. At this time, the medium was replaced with 1.5 ml of Dulbecco's modified Idal medium containing 10% of 10% litter serum containing 0 to 20 ⁇ l of cyclopentenone, and the supernatant was recovered 24 hours later. The Wilska value of the collected supernatant was measured by the method described in Example 2- (3), and the effect of addition of cyclopentenone on the virus-producing ability of the recombinant retinal virus producer cells was examined.
  • the titer of the virus solution obtained from the control group without addition was 9.5 ⁇ 10 4 cfu / ml, whereas the titer of 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20 ⁇ of cyclopentene was Viral fluid titers in the presence of Tenon were 8.3 x 10 ",
  • Control plasmid pcD2-Y expressing the G418 resistance gene [ol. Cell. Biol. Vol. 7, pp. 745-2752 (1 987)], and HPV16 type E7 and G418 resistance genes
  • Plasmid pcD2-16E7 [Jpn. J. Cancer Res. Vol. 82, pp. 1340-134 (1991)), which can express both, was transformed into E. coli HB101 by L-broth. The cells were cultured in a medium, the plasmid was extracted from the collected cells, and purified by cesium chloride density gradient ultracentrifugation to obtain a vector for gene transfer.
  • NIH3T3 cells 37 ° C, 5% C_ ⁇ 2 conditions, and cultured in 1 0% fetal ⁇ shea serum free Dulbecco's modified I one dull medium.
  • NIH3T3 cells transfected with the control vector and NIH3T3 cells transformed into cancer with HPV16 type E7 were each established in 9 strains.
  • NIH3T3 cells the cell line into which the control vector was introduced, and the cell line into which E7 had been introduced were placed on a 10 Omm tissue culture plate in a Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% litter serum and 50 to 70%. After washing with PBS, the cells were detached with a 0.25% trypsin-EDTA solution and suspended in 5 ml of Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% pup serum.
  • a part of the suspension was taken and the cell density was calculated using a Neubauer type hemocytometer. Based on the obtained numbers, dilute the cells with Dulbecco's Modified Idal Medium containing 10% pup serum and inoculate them at a density of 200 cells / plate on a tissue culture plate with a diameter of 60 mm. Culture was started in 3 ml of medium. Twenty-four hours after the start of the culture, cyclopentenone was added to a concentration of 5. After another 24 hours, the medium was replaced with a fresh medium, and cyclopentenone was added to 5 ⁇ ⁇ .
  • a plate without cyclopentenone was prepared, and the medium was replaced in the same manner.
  • the culture was performed in triplicate. After culturing for 9 days, colonies were fixed with methanol and stained with Giemsa's solution (GIBC0).
  • Table 3 shows the results of counting the stained colonies. Cells transfected with ⁇ 7 were more sensitive to pentenone in the mouth compared to control cells, and pentenone selectively acted on cancer gene-transformed cells. Table 3
  • Example 4 Similar results were obtained when other cell lines of Example 3 (5) were used. Similar results were obtained with (1) -cyclopentenone and (+)-cyclopentenone.
  • Example 4 Similar results were obtained with (1) -cyclopentenone and (+)-cyclopentenone.
  • the cells were washed with PBS, and the cells were infected with the influenza virus AZP RZ834 strain (preserved by Osaka Prefectural Institute of Public Health) and incubated for 30 minutes at 37 ° C. However, the multiplicity of infection (m.o.i.) was set to 0.01. After the incubation, the cells were washed with PBS and cultured in Eagle-MEM containing lOigZmI trypsin.
  • the infected cell supernatant was collected after 0, 1, 2 and 3 days, and the virus titer was determined by the focus counting method using the PAP method [J. Clin. Microbiol. Vol. 28, pp. 1308 to 1313 (19) 90)].
  • Example 41 Influenza virus was added to cells and infected with MDCK cells cultured in monolayer in the same procedure as in (1) in the absence of cyclopentenone as in Example 4 (1).
  • the cells were cultured in Eagle-MEM containing 1 O gZml trypsin supplemented with cyclopentenone so that the final concentration was 0, 5, 10, 20, or 40 // M.
  • a virus titer was determined in the same manner as in Example 4— (1). As a result, it was found that the virus titer was clearly lower in the group to which pentenone of 10 ⁇ m or more was added compared to the control without pentenone.
  • Table 5 shows the results. In each cyclopentenone-added section, the cells adhered without peeling. Table 5
  • Example 4 In the same procedure as in Example 1 (1), the cells were cultured in a monolayer, and the final concentration was 0, 20, or 40 // M / CK / CK cells treated with M for 6 hours with cyclopentenone.
  • Example 4 Influenza virus was infected in the same manner as (1), and culturing was continued in an Eagle-MEM medium containing 10 ⁇ g / m 1 trypsin containing the same concentration of cyclopentenone as before infection. Thereafter, the virus titer was determined in the same manner as in Example 4 (1). As a result, the virus titer was clearly lower in the group to which 20 ⁇ M or more of cyclopentenone was added compared to the control without the addition of pentenone. Table 6 shows the results. In each cyclopentenone-added section, cells adhered without peeling. Table 6 Days after infection Cyclopentenone concentration ( ⁇ )
  • Example 4 The same experiment as in (1) was performed with the multiplicity of infection (mo i.) Set to 0.001. As a result, the virus titer was clearly lower in the group to which cyclopentenone was added in an amount of 10 ⁇ M or more than in the control without pentenone. Table 7 shows the results. In each cyclopentenone-added section, the cells adhered without peeling.
  • Example 4 The same experiment as in (2) was performed with the multiplicity of infection (m.o.) set to 0.001. As a result, the virus titer was clearly lower in the group to which cyclopentenone was added in an amount of 10 ⁇ M or more than in the control without pentenone. Table 8 shows the results. In each cyclopentenone-added section, cells adhered without peeling.
  • Example 4 The same experiment as (3) was performed with the multiplicity of infection (m.o.i.) set to 0.001. As a result, the titer of the virus was clearly lower in the group to which cyclopentenone was added in an amount of 10 ⁇ M or more than in the control without pentenone. Table 9 shows the results. In each cyclopentenone-added section, cells adhered without peeling.
  • Figs. Fig. 1 and Fig. 2 show the relationship between the added pentenone concentration and the cell viability.
  • the horizontal axis is the added cyclopentenone concentration ( ⁇ ), and the vertical axis is the cell viability after 3 days of culture. (%).
  • Figure 1 shows the results using CEM-SS cells
  • Figure 2 shows the results using H9 cells. This is the result when a cell was used.
  • H9 cells (abbreviated as H9-3B) infected with HIV-1,,, ::! Cultured for 3 days with the addition of ⁇ 5 ⁇ M cyclopentenone More than 90% of both cells were infected with HIV-1 Cell viability was calculated by counting the number of live and dead cells As a result, in both cells, the cell viability was significantly reduced by the addition of pentenone at 3 ⁇ , and the cell viability was further reduced by the addition of pentenone at 5 / iM. In comparison, cyclopentenone exhibited an anti-HIV effect, and the results are shown in Fig. 3 and Fig. 4. That is, Fig. 3 and Fig.
  • FIG. 4 show the relationship between the concentration of added cyclopentenone and the cell viability.
  • the horizontal axis is the concentration of added cyclopentenone ( ⁇ ), and the vertical axis is the cell viability after 3 days of culture (%). Shown.
  • Figure 3 is the results obtained by using the C ⁇ - 3 ⁇ , 4 is the results obtained by using the Eta 9-3 beta.
  • Example 5 The concentration of ⁇ 24 antigen contained in the culture supernatant after culturing for 3 days in (2) was measured. As a result, the ⁇ 24 concentration was reduced according to the concentration of added cyclopentenone, and an anti-HIV effect was observed. Table 10 shows the results. However, in Table 10, the numbers in parentheses are the ratios of the respective cell culture supernatants to the ⁇ 24 concentration without cyclopentenone added, expressed in%.
  • V ero cells (AT CCCCL-81) were suspended in Eagle-MEM containing 10% fetal calf serum at a cell concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ ⁇ , and a 96-well microtiter plate was used. One hundred microliters of the cell suspension per well was added to the plate, and cultured overnight at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide to prepare monolayer Vero cells.
  • the medium was removed, washed twice with PBS, and Japanese encephalitis virus - the (JEV JaO Ar 363- 70 strain) 4. inoculated to a 9 X 1 0 2 pfu / ml , 5% carbonate
  • the cells were fixed in ethanol, and the focus counting method by the PAP method [Arch. Virol. 86, 129-135 (1) 9 8 5)] to perform focus counting.
  • JEV JaOAr-363-70 strain Japanese encephalitis virus
  • the cells were washed with PBS and cultured in MEM supplemented with pentenone to a final concentration of 0, 5, 10, 20, or 40 M.
  • the infected cell supernatant was collected after 0, 1, 2 and 3 days, and the virus titer was determined by the focus counting method by the PAP method using Vero cells [J. Clin. Microbiol. Vol. 28, Vol. Page 13 (1990)].
  • Example 7— (1) and (2) revealed that cyclopentenone has antiviral activity against Japanese encephalitis virus. Furthermore, Japanese encephalitis virus is a species that is syngeneic to hepatitis C virus, and Japanese encephalitis virus is currently used as a model of hepatitis C virus, for which no in vitro culture of hepatitis C virus has been established. ing. For these reasons, cyclopentenone is also effective as a therapeutic drug for hepatitis C.
  • the acetone solution was added to a 50 / zg Z mouse with DMB A (dimethylbenzanthracene) as an initiator.
  • DMB A dimethylbenzanthracene
  • FIG. 5 is a graph showing the carcinogenesis inhibitory effect of cyclopentenone, in which the vertical axis represents the carcinogenesis rate and the horizontal axis represents time (weeks).
  • open triangles indicate cyclopentenone 2.5 mg / mouse treated group (12 mice)
  • closed triangles indicate cyclopentenone 0.8 mgZ mouse treated group (11 mice)
  • open circles indicate control group (12 mice). Show.
  • pentenone did not show anti-inflammatory activity when applied to the pinna of a 2.5 mg mouse.
  • pentenone has an anti-promoter effect in two-stage chemical carcinogenesis.
  • the heat-treated glucuronic acid containing cyclopentenone, (1) -cyclopentenone, and (+)-cyclopentenone also showed similar results.
  • Cyclopentenone was added to physiological saline (listed in the Japanese Pharmacopoeia) at a concentration of 1% to prepare an injection.
  • physiological saline listed in the Japanese Pharmacopoeia
  • cyclopentenone and glycyrrhizic acid were added to prepare an injection.
  • pentenone was sufficiently kneaded with a small amount of water-absorbing ointment, and then the remaining water-absorbing ointment was gradually added and kneaded until uniform to prepare an ointment.
  • This ointment is applied to the affected area 4 to 5 times a day.
  • the pH was measured with a pH meter, and the acidity was expressed as 0.1 IN a ⁇ Hi (m 1) required to neutralize the sample at 1 ° m 1 to pH 7.0. Further, the sugar content was measured with a Brix refractometer.
  • the cyclopentenone-containing substance As the cyclopentenone-containing substance, the cyclopentenone-containing vectin heat-treated solution described in Example 13- (1) was used, and its solid content was added.
  • the beverage 10 Oml contains 4 mg of pentenone in the mouth.
  • a compound having a function of inducing virus resistance in cells and a function of selectively killing virus-infected cells such as cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof is selected.
  • An antiviral agent comprising a compound as an active ingredient is provided.
  • the antiviral agent of the present invention selectively kills virus-infected cells and imparts virus resistance to virus-uninfected normal cells, and its synergistic effect makes it difficult to treat viral diseases such as AIDS and C-type. It is a very useful antiviral agent for the treatment of hepatitis and the improvement of symptoms.
  • pharmaceuticals containing pentenone or its optically active substance or salts thereof having physiological activities such as liver function improving action, heat shock protein inducing action, virus carcinogenesis preventing action, anti-promoter action, etc.
  • the drug is a useful drug for maintaining homeostasis of a living body, particularly for maintaining gastrointestinal health.
  • the present invention also has a function of inducing virus resistance in cells, and there is provided an antiviral food or antiviral beverage comprising a compound having a function of selectively killing infected cells, for example, a compound selected from cyclopentenone or an optically active form thereof or a salt thereof as an active ingredient.
  • these foods and drinks are useful as foods and drinks for improving symptoms of various diseases caused by viruses or as foods and drinks for prevention.
  • the composition contains cyclopentenone having a physiological activity such as a liver function improving action, a heat shock protein inducing action, a virus carcinogenesis preventing action, an anti-promoter action, or an optically active form thereof, or a salt thereof.
  • Foods and drinks are provided, and the foods and drinks are useful for maintaining the homeostasis of living organisms, particularly for maintaining gastrointestinal health.

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Description

明 細 書
抗ウィルス剤
発明の属する技術分野
本発明は、 抗ウィルス作用により、 病原生物に対し有用な医薬及び飲食品に関 する。
従来の技術
抗ウィルス作用を考える場合、 細胞へのウィルス感染の阻害、 感染細胞でのゥ ィルスの増殖の阻害等のウィルス抵抗能を誘導する作用、 ゥィルス感染した細胞 を選択的に死滅させる作用、 及びウィルス自身を不活化する （感染力をなくす） 作用が考えられる。
ウィルス自身を不活化する作用を持つものとしてウィルスに対する中和抗体が ある。 またこのような抗体を誘導する方法としてワクチンがある。 しかし、 ワク チン投与による抗体誘導は、 ウィルス感染の予防には効果的であるが、 現時点で は抗体を用いる効果的な治療法はあまりない。 更に、 ウィルスを直接不活化する 薬剤による効果的な治療法もない。
ウィルス抵抗能を誘導する作用としては、 ウィルスゲノムの複製阻害、 ウィル ス遺伝子の転写阻害、 ウィルスタンパクの合成阻害、 ウィルスタンパクのホール デイング阻害等が考えられる。 このような作用を誘導するには、 細胞内の転写因 子の活性あるいは発現の抑制、 ウィルス由来の転写因子の活性あるいは発現の抑 制、 熱ショックタンパクの誘導等がある。 このような作用を誘導するものとして 、 プロスタグランジンが挙げられる。
またウィルス感染細胞を選択的に死滅させるものとしては、 抗ヘルぺスウィル ス薬として用いられているァシクロビル、 ガンシクロビル、 ソリブジン等がある
発明が解決しょうとする課題
ウィルスに対しては、 単独の作用で対処するより、 複合的作用で対処した方が 効果的である。 例えば、 ウィルス感染細胞を選択的に死滅させる物質を投与して も、 感染細胞が死に至るまでの間に、 ウィルスが産生され他の細胞に感染するた め、 ウィルスを完全に除去するのは非常に困難である。 一方、 ウィルス抵抗能を 誘導する作用を持った物質を投与しても、 感染細胞を除去することはできない。 本発明の目的は、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能、 及びウィルス感染細 胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物を開発し、 該物質を有効成分とする 抗ウィルス剤、 肝機能改善剤、 熱ショ ックタンパク誘導剤、 がん遺伝子発がん防 止剤、 化学発がん抑制剤等の医薬品、 及ぴ抗ウィルス用食品又は飲料を提供する こと〖こある。
課題を解決するための手段
本発明者らはかかる目的を達成するために鋭意検討した結果、 細胞にウィルス 抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能 を有する化合物を作用させると、 ウィルス感染細胞が選択的に傷害を受け、 なお かつ死に至るまでに産生されるウィルス量が減少すること、 またそのため、 感染 細胞が死に至るまでに産生されたウィルスに新しく感染する細胞も減少すること 、 更に、 ウィルス未感染の細胞もこの化合物の投与により前もってウィルス抵抗 能を獲得しているため、 新しく感染してもウィルスの増殖が抑制されること、 す なわち、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染細胞を 選択的に死滅させる機能を有する化合物は、 ウィルスの除去、 例えばヒ ト後天性 免疫不全ウィルス、 又は c型肝炎ウィルスの除去に極めて効果的であることを見 出した。
本発明において使用する化合物の細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能は、 ゥ ィルス感染前の細胞に化合物を作用させた後、 ウィルスの細胞への感染阻害、 ゥ ィルスゲノムの複製阻害、 ウィルス遺伝子の転写阻害、 ウィルスタンパクの合成 阻害、 ウィルスタンパクのホ一ルディング阻害等を指標として測定することがで きる。
またウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能はゥィルス感染細胞と非感染 細胞の生存率を比較することにより測定することができる。
細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染細胞を選択的 に死滅させる機能を有する化合物としては、 該両機能を有すれば良く何ら限定は ない。
そして、 本発明者らは、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つゥ ィルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物として、 式 〔 I〕 で表 される化合物、 4， 5—ジヒ ドロキシ一 2—シクロペンテン一 1—オン （以下、 単にシクロペンテノンと称す） 若しくはその光学活性体又はその塩を見出し、 発 明を完成させた。
本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は下記式 〔 I〕 で表される 4， 5— ジヒ ドロキシー 2—シク口ペンテン一 1一オン若しくはその光学活性体又はそれ らの塩から選択される少なくとも一つ以上の化合物を有効成分として含有するこ とを特徴とする抗ウィルス剤に関する。
Figure imgf000005_0001
本発明の第 2の発明は式 〔 I〕 で表される 4 , 5—ジヒ ドロキシ一 2—シクロ ペンテン一 1一オン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少な くとも一つ以上の化合物を含有することを特徴とする抗ウィルス用食品又は抗ゥ ィルス用飲料に関する。
本発明の好ましい態様において、 ウィルスとしてはヒ ト後天性免疫不全ウィル ス、 又は C型肝炎ウィルスが例示される。 また抗ウィルス剤としてはヒ ト用抗ゥ ィルス剤、 非ヒ ト動物用抗ウィルス剤 （例えば家畜、 家禽、 魚類又はェビ類用抗 ウィルス剤） 、 又は植物用抗ウィルス剤が例示される。
図面の簡単な説明
図 1は C E M— S S細胞を用いた場合のシク口ペンテノン濃度と細胞生存率の 関係を示す図である。
図 2は H 9細胞を用いた場合のシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示 す図である。 図 3は CEM— 3 B細胞を用いた場合のシク口ペンテノン濃度と細胞生存率の 関係を示す図である。
図 4は H 9— 3 B細胞を用いた場合のシク口ペンテノン濃度と細胞生存率の関 係を示す図である。
図 5はシクロペンテノンの発がん抑制作用を示す図である。
図 6は （一） 体シクロペンテノンの p—ジメチルァミノベンゾィル誘導体の C D及び （一） 体シクロペンテノンの立体構造を示す図である。
図 7は （+ ) 体シクロペンテノンの p—ジメチルァミノベンゾィル誘導体の C D及び （+ ) 体シクロペンテノンの立体構造を示す図である。
発明の実施の形態
本発明において使用する式 〔 I〕 で表されるシクロペンテノンは、 4位と 5位 のヒ ドロキシル基の立体配置がシスの異性体と トランスの異性体の双方を包含す る。 本発明においてはシス体シクロペンテノンを用いても良いし、 トランス体シ クロペンテノンを用いても良いし、 シス体シクロペンテノンと トランス体シクロ ペンテノンの混合物を用いても良い。 また、 これらの光学活性体を用いても良い シス体シクロペンテノンは化学合成法によって得られる 〔ヘルべチカ キミ力 ァクタ （H e l v e t i c a C h i m i c a Ac t a) 、 第 5 5卷、 第 2 838〜 2844頁 （1 9 7 2) 〕 。 トランス体シクロぺ テノンは化学合成法 によっても得られるし 〔カーボハイ ドレート リサーチ （C a r b o h y d r a t e R e s . ) 、 第 24 7卷、 第 2 1 7〜 222頁 （1 99 3) 〕 、 またゥロ ン酸、 例えばグルクロン酸、 ゥロン酸誘導体、 例えばダルクロノラク トン、 又は これらの含有物等を加熱処理することによつても得られる （P CTZJ P 9 7/ 03052号明細書参照） 。 本発明ではシクロペンテノンを含有するこれらの加 熱処理物、 その部分精製物及び精製物が使用できる。
例えば、 ゥロン酸として D—グルクロン酸を使用し、 その 1 %溶液を 1 2 1°C で 4時間加熱処理することにより、 加熱処理物中にシク口ペンテノンが生成され る。 'この加熱処理物中のシク口ペンテノンを溶媒で抽出し、 抽出物を濃縮する。 次にこの濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一で分離し、 溶出するシク 口ペンテノン画分を濃縮し、 濃縮物からシク口ペンテノンをクロロホルムで抽出 し、 抽出濃縮物の順相カラムクロマトグラフィーを行うことにより、 加熱処理物 中のシクロペンテノンが単離される。
シク口ペンテノンの物性を下記に示す。 なおシク口ペンテノンの質量分析は D X 302質量分析計 （日本電子社製） を用いて行った。 また、 重クロ口ホルム溶 媒を.用いた NMRスぺク トルの測定は J NM— A 500 (日本電子社製
) を用いた。 比旋光度は D I P— 3 70型旋光計 （日本分光社製） 、 UV吸収ス ぺク トルは UV— 2500分光光度計 （島津製作所社製） 、 赤外吸収スぺク トル
( I R) は FT I R— 8000赤外分光光度計 （島津製作所社製） をそれぞれ用 い測定した。
MS m/ z 1 1 5 〔M + H〕 +
Figure imgf000007_0001
δ 4. 20 (1 H, d， J = 2. 4 H z , 5— H) 、 4. 83 ( 1 H, m, 4 -H) 、 6, 30 ( 1 H, d d , J = 1. 2 , 6. 1 H z , 2 -H) 、 7. 48
(1 H, d d， J = 2. 1， 6. 1 H z, 3— H)
但し、 'H— NMRの化学シフ ト値は CHC 13 の化学シフ ト値を 7. 26 p p mとして表した。
旋光度： 〔α〕 》 2° 0° ( 1. 3、 水）
UV : え ma x 2 1 5 nm (水）
I R (KB r法） ： 3400、 1 7 1 5、 1 630、 1 1 1 5、 1 060、 1 025 c m—'に吸収を有する。
単離されたシクロペンテノンを光学分割することにより、 （一） 一 4， 5—ジ ヒ ドロキシ— 2—シク口ペンテン一 1一オン及び （+ ) — 4， 5—ジヒ ドロキシ — 2—シクロペンテン一 1一オンを得ることができる。 当然、 合成方法により得 られたシクロペンテノンも光学分割することができる。
例えば、 シクロペンテノンをエタノールに溶かす。 このエタノール溶液にへキ サン/エタノール （94/6) を更に加え、 シクロペンテノン溶液を調製する。 この 試料溶液を、 例えばキラールパック AS (ダイセル化学工業） カラムを用いカラ ム温度： 40°C、 移動相 ：へキサン/エタノール （94/6) で H P L Cを行うこと により、 シクロペンテノンを光学分割することができる。
分割された （一） 一 トランスー4， 5—ジヒ ドロキシ一 2—シクロペンテン一 1一オン 〔以下、 （一） 体シクロペンテノンと称する] の旋光度は 〔ひ〕 D 20- 1 05° ( 0.30 、 エタノール） であり、 （+ ) — トランス一 4， 5—ジヒ ド 口キシ一 2—シクロペンテン一 1—オン 〔以下、 （+ ) 体シクロペンテノンと称 する〕 の旋光度は 〔a〕 D 2° + 1 04° ( 0.53 、 エタノール） である。 な お旋光度は前記の D I Ρ- 370型旋光計 （日本分光社製） を用いて測定した。 次に （一） 体シクロペンテノン及び （+ ) 体シクロペンテノンのそれぞれの質 量分析、 核磁気共鳴法 （NMR) による構造解析、 UV吸収スぺク トルの測定、 赤外吸収スぺク トルの測定を上記記載の方法に準じ行う。 その結果、 両光学活性 体は光学分割前のシク口ペンテノンと同一の結果を示す。
光学分割された （一） 体シクロペンテノン及び （+ ) 体シクロペンテノンをそ れぞれ ρ—ジメチルァミノベンゾィル誘導体とし、 J一 7 20型円二色性分散計 (日本分光社製） を用い、 円二色性スぺク トル （CD) を測定し、 その結果をジ ベンゾエートキラリティルールに適用し [ジャーナル ォブ アメリカン ケミ カル ソサイエティ （J. Am. Chem. Soc. ) 、 第 9 1卷、 第 3 989〜 39 9 1 頁 （ 1 96 9) ] 、 その立体配置を決定した。
(―) 体シク口ペンテノンの p―ジメチルァミノベンゾィル誘導体の CD及び
(-) 体シクロペンテノンの立体構造を図 6に示す。 図中縦軸はモル円二色性、 横軸は波長 （nm) を示す。 なお、 上記立体構造を、 式 〔II〕 として下記に示す
〔II〕
Figure imgf000008_0001
( + ) 体シク口ペンテノンの p—ジメチルァミノベンゾィル誘導体の C D及び ( + ) 体シクロペンテノンの立体構造を図 7に示す。 図中縦軸はモル円二色性、 横軸は波長 （n m) を示す。 なお、 上記立体構造を、 式 〔I I I〕 として下記に示 す：
〔I II〕
Figure imgf000009_0001
図 6、 7及び式 〔I I〕 、 式 〔I I I〕 に示すように （―） 体シクロペンテノンは (一） 一 ( 4 R , 5 S ) 一 トランス一 4 , 5—ジヒ ドロキシ一 2—シクロペンテ ン一 1—オン、 （+ ) 体シクロペンテノンは （+ ) ― ( 4 S , 5 R ) — トランス —4， 5—ジヒ ドロキシー 2—シク口ペンテン一 1 —オンである。
以上、 本発明に使用するシク口ペンテノン又はその光学活性体はいかなる方法 で製造しても良く、 明細書で開示の方法で製造しても良く、 化学合成方法で合成 しても良く、 シクロペンテノンのトランス体、 シス体及びそれらの混合物も本発 明に使用される。 当然、 化学合成法で得られたシクロペンテノンの光学活性体も 本発明で開示の光学活性体に包含される。
シクロペンテノン又はその光学活性体の塩としては、 医薬として許容される塩 があり、 公知の方法にて変換することができる。
本発明で使用する、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィル ス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシク口ペンテノン 若しくはその光学活性体又はそれらの塩は抗ウィルス作用を有し、 これらの化合 物から選択される少なく とも 1つの化合物を有効成分として抗ウィルス剤を作製 することができる。
すなわち細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウイルス感染細胞 を選択的に死滅させる機能を有する化合物を有効成分とし、 これを公知の医薬用 担体と組合せ製剤化すれば抗ウィルス剤を製造することができる。 抗ウィルス剤 の製造は一般的には、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィル ス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシク口ペンテノン 、 若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なく とも 1以上の化 合物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、 かつ必要に応じて溶 剤、 分散剤、 乳化剤、 緩衝剤、 安定剤、 賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤等を加 えて、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 粉末剤、 カプセル剤等の固形剤、 通常液剤、 懸濁剤 、 乳剤等の液剤であることができる。 またこれを使用前に適当な担体の添加によ つて液状となし得る乾燥品とすることができる。
医薬用担体は、 上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、 経口剤の 場合は、 例えばデンプン、 乳糖、 白糖、 マンニッ ト、 カルボキシメチルセルロー ス、 コーンスターチ、 無機塩等が利用される。 また経口剤の調製に当っては、 更 に結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 潤沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤、 着色剤、 香料 等を配合することもできる。
一方、 非経口剤の場合は、 常法に従い本発明の有効成分である細胞にウィルス 抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染細胞を選択的に死滅させる機能 を有する化合物、 例えばシク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの 塩から選択される 1以上の化合物を希釈剤としての注射用蒸留水、 生理食塩水、 ブドウ糖水溶液、 注射用植物油、 ゴマ油、 ラッカセィ油、 ダイズ油、 トウモロコ シ油、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ 、 必要に応じ、 殺菌剤、 安定剤、 等張化剤、 無痛化剤等を加えることにより調製 される。
本発明の抗ウィルス剤は、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投 与方法も特に限定はなく、 内用、 外用及び注射によることができる。 注射剤は、 例えば静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与し得、 外用剤には座剤等も包含され る。
抗ウィルス剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的及びこれ に適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではないがー 般には製剤中に含有される細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つゥ ィルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシク口ペンテ ノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される 1以上の物の量が成 人 1 日当り 0 . l g〜2 0 m g / k gである。 もちろん投与量は、 種々の条件 によって変動するので、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 あるい は範囲を超えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、 任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。 また細胞にウィルス 抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染細胞を選択的に死滅させる機能 を有する化合物、 例えばシク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの 塩を抗ウィルス剤、 抗ウィルス用食品又は飲料の原料として用いても良い。
本発明で使用する、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィル ス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシク口ペンテノン 若しくはその光学活性体又はそれらの塩は、 D N Aウィルス、 R N Aウィルス、 レトロウイルス、 及びウイロイ ドに対して抗ウィルス活性を示す。
従って、 ヒ ト用抗ウィルス剤、 非ヒ ト動物用抗ウィルス剤、 例えば家畜、 家禽 、 養殖動物、 例えば魚類、 ェビ類等のウィルス病に有効な抗ウィルス剤、 植物用 抗ウィルス剤、 例えば花卉類、 野菜類等の農園芸作物のウィルス病に有効な抗ゥ ィルス剤等、 有用生物用の抗ウィルス剤として使用することができる。
動物に感染する D N Aウィルスと しては例えばポックスウィルス、 ヘルぺスゥ ィルス、 アデノウイルス、 B型肝炎ゥイノレス、 ノ ピローマウィルス、 ポリオ一マ ウイノレス、 ェプスタイ ン一バーノレゥイノレス、 バキュロウイノレスが挙げられ、 植物 に感染する D N Aウィルスとしては例えば力リフラワーモザィクウィルスが挙げ られる。 動物に感染する R N Aウィルスとしては例えばロタウィルス、 風疹ウイ ノレス、 日本脳炎ゥイノレス、 デング熱ゥイノレス、 ニューカツスノレ病ゥイノレス、 麻疹 ウィルス、 おたふくかぜウィルス、 ジステンパーウィルス、 インフルエンザウイ ルス、 水疱性口内炎ウィルス、 ヒ トポリオウイルス、 A型肝炎ウィルス、 C型肝 炎ウィルスが挙げられ、 植物に感染する R N Aウィルスとしては例えばタバコモ ザイクウィルス、 麦類矮小ウィルス、 イネ縞葉枯ウィルス、 タバコ輪点ウィルス が挙げられる。 レトロウイルスと しては例えば成人 T細胞白血病ウィルス、 ヒ ト 後天性免疫不全ウィルスが挙げられ、 ウイロイ ドとしては例えばジャガイモスピ ンドルチユーバーウイロイ ドが挙げられる。
シク口.ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は非ヒ ト哺乳動物、 鳥、 例えばニヮ トリ及び七面鳥、 冷血動物、 例えば魚のウィルス病の治療及び予 防に有効であり、 これらの化合物は下記の非ヒ トウィルスに対して抗ウィルス活 性を示す。 サイルイ ド ヘルぺスウィルス 1型、 カプリ ド ヘルぺス 1型、 ラガ モルフ へノレぺスウィルス 1型、 ファシアニド へノレぺスゥイノレス 1型、 ファシ アニ ド ヘルぺスゥイノレス 2型、 ターキー へノレぺスゥイノレス 1型、 アナチド へノレぺスゥイノレス 1型、 キャッ ト フィッシュ へノレぺスゥイノレス 1型、 ェクイ ド ヘルぺスウィルス 3型、 ボビド ヘルぺスウィルス 1型、 ボビド ヘルぺス ウイノレス 3型、 ボビド へノレぺスウィルス 4型、 ビッグ へノレぺスウィルス 1型 、 ビッグ へノレぺスゥイノレス 2型、 ミユリ ッ ド ヘルぺスウィルス 1型、 セピド へノレぺスゥイノレス 1型、 セピド ヘルぺスゥイノレス 2型、 ッパイード へノレぺ スゥイノレス 1型、 力ニン へノレぺスゥイノレス 1型、 ヒライン ヘルぺスゥイノレス 1型、 ェクイ ド へノレぺスゥイノレス 1型、 ェクイ ド へノレぺスゥイノレス 2型。 本発明の抗ウィルス剤を鳥類に注射するか又は飼料若しくは飲料水に添加する 等の獣医術、 飼育術において周知の方法によって、 マーレック氏病等の鳥類のゥ ィルス性疾患が本発明に使用する化合物によって、 予防及び Z又は治療される。 またプール、 水槽、 保持タンク又は飼育領域の水、 海水等に直接、 本発明に使用 する化合物を添加するか、 又は飼料中に本発明に使用する化合物を混合して、 へ ノレぺス類ウィルス、 例えばプチナマズゥイノレス、 へノレぺス一ウイノレス ソロモン ス、 ナ一力 ウィルス等のウィルス感染によるプール、 水槽、 保持タンク又は飼 育領域中の狭い区域に棲息する魚のウィルス病、 例えばサケ科魚類の伝染性造血 器壊死病、 ヘルぺスウィルス感染症又は伝染性腌臓壊死病、 ニジマスのウィルス 性出血性敗血症、 コィの春ウィルス病、 種々の魚のリンホシスチス病、 海産魚 ' 遡河魚のウィルス性赤血球壊死病、 ヒラメ等のラブドウィルス病、 プリ稚魚等の ウィルス性膝肝壊死病、 トラフグ等の口白病等を同様に予防及び Z又は治療し得 る。 なお本発明に使用する化合物、 本発明の抗ウィルス剤を投与するに当っての 正確な規制は、 必然的に治療されている個々の被検体に関する必要性、 治療の種 類及び飼育者の判断次第である。
本発明の抗ウィルス剤が投与された非ヒ ト動物はその健康保持により、 生存率 、 成長率、 産卵率等の改善が顕著である。
本発明で使用する、 細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィル ス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシクロペンテノン 若しくはその光学活性体又はそれらの塩はこれらのウィルスタンパクの合成を抑 制し、 ウィルスゲノムの合成も抑制することにより、 強い抗ウィルス作用を示す 。 またこれらのウィルス感染細胞を選択的に死滅させる。
例えばヒ ト後天性免疫不全ウィルス （以下 HIV と略記する） の感染患者におい ても、 すべての CD4 陽性細胞に HIV が感染しているのではなく、 一部の細胞にの み感染している。 本発明の抗ウィルス剤は、 この感染細胞の HIV 増殖を抑制しな がら選択的に感染細胞を死滅させ、 未感染細胞にウィルス抵抗能を誘導し、 細胞 からの HIV の除去が可能となる。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は上記抗ウィルス作 用のほか、 肝機能改善作用、 熱ショックタンパク誘導作用を有し、 シクロペンテ ノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される 1以上の化合物を有 効成分とする肝機能改善剤や熱ショックタンパク誘導剤を、 上記抗ウィルス剤に 準じ、 製剤化することができ、 抗ウィルス剤に準じた方法で投与することができ る。
肝機能改善剤や熱ショックタンパク誘導剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的及びこれに適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜 設定され、 一定ではないが一般には製剤中に含有されるシクロペンテノン若しく はその光学活性体又はそれらの塩から選択される 1以上の化合物の量が成人 1 日 当り 0 . 1 μ g〜2 O m g Z k gである。 もちろん投与量は、 種々の条件によつ て変動するので、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲 を超えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、 任意の 飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。 またシクロペンテノン若し くはその光学活性体又はそれらの塩から選択される 1以上の化合物物を肝機能改 善用飲食品、 熱ショックタンパク誘導用飲食品の原料として用いても良い。
シク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を摂取することによ り、 肝機能障害も改善され、 GOT、 GPT値が正常化する。
またシク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は 70 kダルト ン （HS P 70) 等の熱ショックタンパク誘導活性を有し、 肝炎ウィルス、 エイ ズゥイノレス、 イ ンフノレエンザゥイノレス、 水疱十生口内炎ゥイノレス、 へノレぺスウイノレ ス等の RNAウィルス、 DNAウィルスに対する抗ウィルス作用を有する。 また 、 熱ショックタンパクはがん免疫に関与しており、 また生体防御作用をも有する 。 シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を摂取することによ り、 インフルエンザウイルスによる風邪疾患等のウィルス性疾患が予防、 治療で きる。
なお熱ショックタンパクは細胞や個体が平常の温度よりも 5〜 1 0°C程度高い 温度変化を急激に受けたときに合成が誘導されるタンパクの総称であり、 原核生 物から高等真核生物まで幅広く分布している。 真核生物の熱ショックタンパクと しては HS P 90、 HS P 70、 ュビキチン、 H S P 26等が知られている。 そ の中で H S P 70は分子シャぺ口ンの一種であり、 フォールディングが完了して いない、 または不完全にフォールデイングしたタンパクに結合して立体構造の形 成を助ける。 熱ショックタンパクのアミノ酸配列は進化の過程でよく保存されて おり、 H S P 70は大腸菌の D n a Kタンパクと相同である。 ヒ トには約 1 0個 の HS Ρ 70遺伝子が存在しているが、 これらのあるものは構成的に発現してお り、 あるものは様々な刺激によって誘導される。 熱ショックタンパクの合成は熱 ショックのほかに様々な化学物質、 酸化ス トレス等の細胞障害によっても誘導さ れる。
C. ァミチら （C. Amici) ら 〔ジャーナル ォブ ビロロジー （Journal of V irology)、 第 68卷、 第 6890〜6899頁 （1994) 〕 は、 α， ]3—不飽和カルボニル を持つプロスタグランジン A , の存在下でセンダイウィルスを感染させた動物細 胞を培養すると HS P 70と HS P 90の合成が誘導され、 H S P 70の合成が 誘導されている間はウィルスタンパクの合成が抑制されることを報告している。 また、 A . ロッシ （A. Rossi) ら 〔ザ ジャーナル ォブ バイオロジカル ケ ミストリー （ The Journal of Biological Chemistry) 、 第 2 7 1卷、 第 32192 〜32196 頁 （1996) 〕 は、 2—シクロペンテン一 1 一オンがプロスタグランジン A , と同様に H S P 7 0の合成を誘導し、 水疱性口内炎ウィルスタンパクの合成 を抑制することを報告している。
本発明で使用するシク口ペンテノンによる H S P 7 0誘導能は 1 0 μ Μでみら れ、 2 0〜 3 0 で最大となるが、 これは 2—シクロペンテン一 1 —オンが Η S Ρ 7 0を誘導するには数百/ Mの濃度を要することと比較すると極めて高い誘 導能であるといえる。 これはプロスタグランジン A , による H S P 7 0誘導能に 匹敵するものであり、 シクロペンテノンの分子量がプロスタグランジン A , の 3 分の 1以下であるので重量濃度で比較するとプロスタグランジン A , よりも高い 誘導能を持つといえる。
本発明で使用するシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は このように高い熱ショックタンパク誘導作用を持つことから、 D N Aウィルス、 R N Aウィルス、 レトロウイルス、 及びウイロイ ドに対して抗ウィルス活性を示 す。 これらのウィルス、 ウイロイ ドには上記の各ウィルス、 ウイロイ ドが例示さ れる。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はがん遺伝子で形質 転換されたがん細胞に対しても増殖抑制活性を有し、 がん遺伝子による発がんを 防止する作用を有する。
例えばパピローマウィルスはパポバウィルス科 （papovav iridae) 、 パピロー マウイノレス属 （papi l lomavirus) の DNAゥイノレスであり、 ヒ トノ ピロ一マウイノレ ス （HPV) としては、 例えば子宮頸がんなどの原因となる HPV16型が知られている シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は HPV16型のがん遺 伝子 E7によってがん化した細胞に対し、 増殖抑制効果を有し、 シクロペンテノン 若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なく とも一つの化合物 を有効成分として、 ウィルス発がん細胞増殖抑制剤を提供することができ、 がん 遺伝子による発がんを防止することができる。
またシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はイニシエータ 一とプロモーターによる 2段階発がんの抑制作用を有し、 これらの化合物から選 択される少なく とも一つの化合物を有効成分として、 化学発がん抑制剤を提供す ることができる。
したがってシク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択 される少なくとも一つの化合物を含有する発がん予防用食品又は発がん予防用飲 料を提供することができる。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少な くとも一つの化合物を有効成分として含有するがん遺伝子発がん防止剤又は化学 発がん抑制剤は抗ウィルス剤に準じ、 製剤化することができ、 抗ウィルス剤に準 じた方法で投与することができる。
本発明の抗ウィルス用食品又は抗ウィルス用飲料の製造においては細胞にウイ ルス抵抗を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染細胞を選択的に死滅させる機 能を有する化合物、 例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれら の塩を使用することができる。 またシクロペンテノンを含有するゥロン酸の加熱 処理物、 該加熱処理物からの部分精製シク口ペンテノン及び精製シク口ペンテノ ンを使用することができる。
また肝機能改善作用、 熱ショックタンパク誘導作用、 発がん予防作用等を有す る作用発現用食品又は作用発現用飲料の製造においても、 シクロペンテノン若し くはその光学活性体又はそれらの塩、 シク口ペンテノンを含有する加熱処理物、 該加熱処理物からの部分精製シク口ペンテノン及び精製シク口ペンテノンを使用 することができる。
すなわちこれらのシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩、 シクロペンテノンを含有する加熱処理物、 該加熱処理物からの部分精製シクロべ ンテノン及び精製シク口ペンテノンから選択される原料を希釈及び/又は添加し て、 製造される食品又は飲料は本発明の抗ウィルス用食品又は飲料に包含される 本発明の抗ウィルス用食品又は抗ウィルス用飲料の製造法は、 特に限定はない が、 調理、 加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙 げることができ、 製造された食品又は飲料に、 細胞にウィルス抵抗を誘導する機 能を有し、 且つウィルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例 えばシク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される 1 以上の化合物の有効量が含有されていれば良い。
本発明の抗ウィルス用食品又は抗ウィルス用飲料としては、 細胞にウィルス抵 抗を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有 する化合物、 例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩か ら選択される 1以上の化合物が含有、 添加及び/又は希釈されていれば特にその 形状に限定は無く、 タブレッ ト状、 顆粒状、 カプセル状、 ゲル状、 ゾル状等の形 状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
また肝機能改善用、 熱ショックタンパク誘導用、 発がん予防用食品又は肝機能 改善用、 熱ショ ックタンパク誘導用、 発がん予防用飲料としては肝機能改善作用 、 熱ショックタンパク誘導作用、 発がん予防作用を有するシクロペンテノン若し くはその光学活性体又はそれらの塩から選択される 1以上の化合物が含有、 添加 及び/又は希釈されていれば特にその形状に限定は無く、 タブレッ ト状、 顆粒状 、 カプセル状、 ゲル状、 ゾル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する 本発明の食品又は飲料は生理活性を有するシクロペンテノン若しくはその光学 活性体又はそれらの塩を含有し、 これらの化合物の有する種々の生理活性、 抗ゥ ィルス作用、 肝機能改善作用、 熱ショックタンパク誘導作用、 発がん予防作用等 によって、 これらを摂取することによりウィルス性疾患予防、 治療、 肝機能改善 効果、 発がん予防効果等を有する健康食品又は飲料であり、 生体の恒常性の維持 に有用な食品又は飲料である。
本発明で使用する化合物はその生理活性の有効量の投与を行っても毒性は認め られず、 例えば経口投与の場合シク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそ れらの塩のいずれかを 1 0 OmgZk gでラッ トに単回投与しても死亡例は認め られない。
以上、 本発明の薬剤はウィルス性疾患、 肝疾患、 がん等の治療剤又は予防剤と して用いることができ、 特に HIV が惹起する後天性免疫不全症候群の治療、 症状 改善に有用である。
実施例
以下、 実施例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はこれらの 実施例に何ら限定されるものではない。 なお、 実施例における％は重量％を意味 する。
参考例 1
1 0 gの D—グルゾロン酸 （シグマ社製 G 5 26 9) を 1 リ ッ トルの水に 溶解し、 1 2 1 °Cで 4時間加熱した後約 1 Om 1になるまで減圧下濃縮した。 こ れに酢酸ブチル：酢酸：水 = 3 ： 2 ： 2混合液の上層 4 Om 1 を加えて混合後、 遠心によって得た上清を減圧下約 1 Om 1まで濃縮した。
上記抽出液をカラムクロマトグラフィー用シリカゲル BW— 300 S P (2 X 28 cm, 富士シリシァ化学社製） にアプライし、 酢酸ブチル：酢酸：水 = 3 ： 2 ： 2の上層を溶離液としてコンプレッサーで 0. S k gZcm2 に加圧し、 毎 分 5m 1の流速で分離を行った。 1画分当り 1 Om 1になるようにフラクシヨネ —ションを行い、 各画分の一部をとつて薄層クロマトグラフィ一で分析したとこ ろ 6 1番から 80番までの画分に高純度のシク口ペンテノンが含まれていた。 こ れらの画分を集めて減圧下濃縮した後 4 Om 1のクロロホルムで抽出し 、 抽出液を減圧下濃縮することによって 1 0 Omgのシク口ペンテノンを得た。 この画分をパルパックタイプ Sカラムを用いた順相 HP LCで分離し、 2 1 5 nmの紫外線吸収で検出したところ、 純度は 9 8%であった。
上記シクロペンテノン 1 1 3. 9mgをエタノーノレ 2. 8 5m l に溶かした。 このエタノール溶液にへキサン Zエタノーノレ （94/6) 3. 85 m l を更に加え、 1 7 m gZm 1のシクロペンテノン溶液を調製した。 この液を 0. 5 /i mのフ ィルターでろ過し、 光学分割 HPLC 試料溶液とした。 この試料溶液を以下の条件で光学分割 HPLC を行い、 前ピークの （一） 体シク 口ペンテノン及び後ピークの （+ ) 体シクロペンテノンのフラクションをそれぞ れ集め、 減圧乾固し、 （一） 体シクロペンテノン 43.2 mg、 （ + ) 体シクロペン テノン 43. Omgをそれぞれ得た。
光学分割 HPLC 条件
カラム ： キラールパック AS (ダイセル化学工業） 2.0 cmX 25.0 cm カラム温度： 40°C
移動相 ：へキサン Zエタノール （94/6)
流速： 14.0 ml/min
検出 ： UV 210 nm
試料注入量： 150 1 (2.55 mg)
得られた （一） 体シクロペンテノン及び （+ ) 体シクロペンテノンは両者共に 約 1 %のェナンチォマーを含有していたため再度上記の条件で光学分割した。 そ の結果、 前ピークの （一） 体シクロペンテノン 30. Omgから 1 9. 7mgの ェナンチォマーを含有しない （一） 体シクロペンテノンを、 後ピークの （+ ) 体 シクロペンテノン 3 7. 41118から 2 7. 7 m gのェナンチォマーを含有しない (+ ) 体シクロペンテノンをそれぞれ得た。 なお （一） 体シクロペンテノン、 （ + ) 体シクロペンテノンの光学分割 H P L Cの溶出時間はそれぞれ 3 3分、 40 分であった。
実施例 1
(1 ) 2 X 1 05 eel ls/mlのヒ ト前骨髄性白血病細胞 11ぃ60 (ATCC CCL-240) を含む 1 0 %牛胎児血清含有 RPMI1640培地 5tnl を 6穴プレートの各ゥエルに入れ 、 3 7°C5%C02 存在下で 24時間培養した後、 最終濃度が、 0 、 1 0、 2 0、 30、 40、 50、 1 00 μΜになるように参考例 1記載のシクロペンテノ ンを添加し、 更に 8時間培養を続けた。
培養終了後、 細胞数を計測した後、 細胞を遠心分離で回収し、 リン酸緩衝食塩 水 （PB S) で洗浄して、 シクロペンテノン処理細胞を調製した。 また、 45°C10 分間熱処理を行った後、 同様に培養した細胞も調製した。 これらの処理細胞を用い、 モレキユラ一 クローニング （Molecular Cloning) 〔コールド スプリ ング ハーバー ラボラ トリー プレス （Cold Spring Harb or Laboratory Press) ( 1989 ) 〕 記載の方法に従って S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS- PAGE) を行った。 処理細胞は、 2. 5 X 1 06 cells/mlに なるように SDS-PAGE Sample buffer に懸濁し、 この細胞懸濁液を 1 0 0 。Cで 1 0分間処理した後、 5 μ 1ずつを 2枚の SDS-PAGEゲル （5 %スタツキングゲル 、 1 0%セパレーシヨンゲル） にアプライし、 電気泳動を行った。 一方のゲルは 、 クマシ一染色し、 他方のケノレは、 Polyvinylidene dif luoride transfer membr ane [ImmobilonTM ： ミリポア （MILLIPORE ) 社製 Cat. # IPVH000- 10 〕 にブロ ッティングした。 このメンブレンを Block Ace (大日本製薬株式会社 Cat. ίί UK - B25 ) で 4 °Cー晚ブロッキングした。
このブロッキングしたメンブレンに熱誘導される 7 OkDa の熱ショックタンパ クと特異的に反応するモノクローナル抗体 HSP 72/73(Ab - 1) 〔オンコジーン リ サーチ プロダクツ （Oncogene Research Products) 社製 Cat. # HSP01] を反応 させた後、 0. 0 5 % Tween2 0を含むトリス緩衝食塩水 （T B S) で洗浄し、 更に、 T B Sで洗浄した。 次いで、 Peroxidase複合二次抗体 HRP-RabbitAnti Mou se IgG (H+L) [ZYMED ラボラ トリース社 （ZYMED Laboratolies, Inc. ) 製 Cat. ίί 61 - 6520〕 を反応させ、 先の操作と同様に洗浄した。 このように一次抗体、 二次 抗体と反応させたメンブレンに、 ケミルミノール試薬 RENAISSANCETM 〔デュポ ン NEN (Dupont NEN ) 社製 Cat. ίί ΝΕし- 100〕 を反応させた後、 X-Ray フィルム を感光して 70kDa の熱ショックタンパクの誘導を確認した。
その結果、 2 0から 3 0 μ M のシクロペンテノンの添加で、 4 5 °C 1 0分間 熱処理と同程度の 7 OkDa の熱ショックタンパクの誘導が確認された。 その誘導 の強弱は表 1に示した。 なお表 1中、 +は誘導の強さを表し、 +が多いほど誘導 が強いことを意味する。 また一は誘導が認められなかったこと、 土は誘導がわず かであることを意味する。 処理細胞 熱ショックタンノ、ク誘導
45°C10分間熱処理 + + +
Ομ M シクロ ペンテノン ―
10 μ Μ シクロ'ペンテノン +
20 μ Μ シクロ'ペンテノン 1 r
30 μ Μ シクロ'ペンテノン + + +
40 μ Μ シクロ'ペンテノン + +
50// Μ シクロ'ペンテノン +
100 μ Μ シクロ' 土
また （一） 体シクロペンテノン、 （+) 体シクロペンテノンについても同様の 結果を得た。
実施例 2
(1) He L a細胞 （ATCC CCL— 2) を 1 0 cmプレート中、 1 0% 牛胎児血清含有ダルべッコ変法ィ一グル培地 （ D M E M； 日水社製） で 80 %コ ンフルェントになるまで 5%炭酸ガス存在下、 3 7°Cで培養した後、 終濃度が 0 、 5、 1 0、 20、 又は 40 Mになるようにシクロペンテノンを添加し、 上記 条件で更に 6時間培養を続けた。 培地を捨て、 各ゥエルに 1 m 1の 1 0%トリク ロロ酢酸を加えた後、 スクレーパーで細胞を回収した。
こうして得られた細胞の S D S— P AG Eとブロッティングを実施例 1の方法 で行い、 70 k d熱ショックタンパクの発現を検出した。
その結果、 5 zM〜40 シク口ペンテノン添加区分で 70 k d熱ショック タンパクの誘導が見られた。 その結果を表 2に示す。 なお、 表 2中、 +はブロッ ティングによって観察された 70 k d熱ショックタンパクのシグナルの強さを表 し、 +が多いほどシグナルが強いことを意味する。 また、 土はシグナルが非常に 弱いことを意味する <
表 2
Figure imgf000022_0001
(2) H e L a細胞を 1 0 c mプレート中、 1 0 %牛胎児血清含有 DM E Mで 80%コンフルェントになるまで 5%炭酸ガス存在下、 37°Cで培養した後、 終 濃度が 0、 5、 1 0、 20、 又は 40 μΜになるようにシクロペンテノンを添加 し、 上記条件で更に 6時間培養を続けた。 この後、 5%牛胎児血清含有 DMEM で細胞を洗浄し、 アデノウィルスである A d 5 d 1 X 〔サイ トウ （S a i t o ) ら、 ジャーナル ォブ ビロロジー、 第 54卷、 第 7 1 1〜 7 1 9頁 （ 1 9 8 5) 〕 を含む 5 %牛胎児血清含有 DMEMを細胞に加えて感染させ、 20時間培 養した。 但し、 感染多重度 （m. o. i . ) を 50に設定した。 培地を捨て、 各 ゥヱルに 1 m lの 1 0%トリクロ口酢酸を加えた後、 スクレ一パーで細胞を回収 した。
こうして得られた細胞の S D S— P A G Eとブロッテイングを実施例 1の方法 で行い、 アデノウイルスのへキソンタンパクの発現を検出した。 但し、 一次抗体 は抗アデノウイルスへキソン抗体 〔ケミコン インターナショナル社 (Chemicon International Inc. )製、 AB 1 056〕 を用いた。
1 0 μΜ以上のシク口ペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン非添加 の対照に比べて明らかにへキソンタンパク量が減少していた。 また、 20 /Μ以 下のシクロペンテノン添加区分ではシクロペンテノン非添加区分と同様の細胞増 殖が見られた。
( 3) 実施例 2— ( 2) と同様にシクロペンテノン処理の後でアデノウイルス を感染させて培養した H e L a細胞から 「ウィルス実験プロ トコール」 （メジ力 ルビユ一社発行） 2 4〜2 5頁記載の方法に従ってウィルス D N Aを抽出した。 すなわち、 ウィルス感染細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、 1 m l の 0. 6 % ラウリル硫酸ナトリウム （S D S ) Z l O mM ED T A水溶液に懸濁した後、 3. O m l の 5M N a C 1水溶液を添加した。 0 °Cで 1時間放置し、 遠心によ り得た上清に 3 m 1のエタノールを加えて混合した。 遠心によって得た沈殿を 0 . 2 m 1 の T E緩衝液 〔1 0 mM ト リス （T r i s ) -H C 1 p H 8. 0、 1 mM E DT A] に溶解し、 2 μ 1 の 1 0 % S D Sと 4 μ 1 の 1 0 m g /m 1プロティナ一ゼ K (宝酒造社製） を加えて 3 7°Cで 1時間保温した。 フエノ一 ルとクロ口ホルムの等量混合液で 2回抽出し、 水層に 2 0 μ 1 の 3 Μ酢酸ナトリ ゥムと 4 0 0 μ 1 のエタノールを加えて遠心し、 沈殿を 5 0 μ 1 の Τ Ε緩衝液に 溶解して DN Α溶液を得た。 1 0 μ 1の DNA溶液に 1 0単位の E c ο Τ 2 2 I
(宝酒造社製） と 1 μ 1の 1 0 m gZm 1 リボヌクレアーゼ Aを加えて消化し、 ァガロースゲル電気泳動を行ってウィルス DN A量を測定した。 その結果、 5 μ Μ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン非添加の対照に 比べて明らかにウィルス D Ν Α量が減少していた。
(4) 実施例 2— ( 2) と同様に H e L a細胞を培養した後、 シクロペンテノ ンを添加せずに、 5型アデノウイルス （Adenoid 75 ATCC VR- 5) を含む 5 %牛胎 児血清含有 DMEMを細胞に加えて感染させた。 但し、 感染多重度 （m. o . i . ) を 5 0に設定した。 その後、 終濃度が 0、 5、 1 0、 2 0、 又は 4 0 μ Μに なるようにシクロペンテノンを添加し、 2 0時間培養した。 培養後は、 実施例 2 ― ( 2) と同様にアデノウイルスのへキソンタンパクの検出を行った。 その結果 、 1 0 μ Μ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン非添加 の対照に比べて明らかにへキソンタンパク量が減少していた。 また、 2 0 /ζ Μ以 下のシクロペンテノン添加区分ではシク口ペンテノン非添加区分と同様の細胞増 殖が見られた。 (5) 実施例 2— (2) と同様に H e L a細胞を培養し、 シクロペンテノンで 処理した。 その後、 実施例 2— （4) と同様に、 5型アデノウイルス （Adenoid 75 ATCC VR-5) を感染させ、 シクロペンテノンを添加した培地で培養した。 培養 後は、 実施例 2— (2) と同様にアデノウイルスのへキソンタンパクの検出を行 つた。 その結果、 1 0 以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロべ ンテノン非添加の対照に比べて明らかにへキソンタンパク量が減少していた。 ま た、 20 μΜ以下のシク口ペンテノン添加区分ではシク口ペンテノン非添加区分 と同様の細胞増殖が見られた。
(6) 実施例 2— (5) と同様にシクロペンテノン処理の後で 5型アデノウィ ルス （Adenoid 75 ATCC VR-5) を感染させて培養した H e L a細胞から実施例 2 一 (3) と同様の方法でウィルス DNA量を測定した。 その結果、 5 μΜ以上の シク口ペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン非添加の対照に比べて明 らかにウィルス DN Α量が減少していた。
以上、 実施例 2— (2) 〜 （6) の結果から、 シクロペンテノンは感染前、 感 染後、 あるいは感染前後の投与により、 アデノウイルスに対して抗ウィルス活性 をもつことが明らかになった。 また （一） 体シクロペンテノン、 （+ ) 体シクロ ペンテノンについても同様の結果を得た。
実施例 3
(1) プロシーディングズ ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイ エンシーズ ォブ ザ USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ) 、 第 84卷、 第 1 56〜 1 60 頁（1987)に記載の、 /3—ガラク トシダーゼ遺伝子とネオマイシン 耐性遺伝子をレポ一ター遺伝子として持つ組換レト口ウィルスべクター BAGを、 制限酵素 BamHI で消化し、 セルフライゲーシヨンさせることによって /3—ガラク トシダーゼ遺伝子を抜き取った D0L ベクタ一を構築した。
(2) 実施例 3— （1) 記載の D0L ベクタープラスミ ドを大腸菌 （E. coli) H B 1 0 1に形質転換し、 し-ブロス培地で培養し、 集めた菌体よりプラスミ ドを抽 出し、 塩化セシウム密度勾配超遠心にて D0Lプラスミ ドを精製した。
精製した DOし プラスミ ド 1 O /ig を組換えレトロウイルスパッケージング細胞 CRIP 〔プロシ一ディングズ ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイ エンシーズ ォブ ザ USA、 第 85卷、 第 6460〜 6464 頁（1988)〕 にカチォ ニックリボソーム 〔Trans 2 T LT- 1 (宝酒造社） 〕 を用いて導入した。
導入した細胞を 3 7°C、 5 % C O 2 条件下、 G418 (ギブコ社） を 0. 4mg/ m l含む 1 0% 仔ゥシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地で 2週間選択し、 得 られたコロニーを 20個クローニングし、 直径 1 00 mmプレートで増やし、 セ ミコンフルェントの状態で培地を交換し、 24時間後に上清を回収して 0. 45 μπιフィルター （Milex HV ；ミリポア社） でろ過し、 ウィルス上清とした。 また 細胞はトリプシンではがし、 液体窒素中で保存した。
各コロニーより得たウィルス上清の力価は下記の実施例 3一 (3) に示す方法 で測定し、 最も力価の高いウィルス液が得られたク口一ンを組換えレト口ウィル スプロデューサ一細胞 CRIPZDOL として樹立した。 樹立時のプロデューサー細 胞から得たウィルス上清の力価は 1 X106 コロニー形成ユニッ ト （Cfu ) Zmlで あった。 樹立したプロデューサー細胞は G418を 0. 2m gZm 1含む 1 0%仔ゥ シ血清含ダルべッコ改変ィーダル培地で維持した。
(3) ウィルス力価の測定には NIH3T3細胞 （ATCC CRL— 1 6 58) を 用いた。 10% 仔ゥシ血清含ダルべッコ改変ィ一グル培地で培養した NIH3T3細胞を 6ゥエルプレート （岩城硝子社） に 50000 個/ゥエルで植え継ぎ、 翌日、 8 / g/ mlのポリブレン （シグマ社） を含む lml のウィルス希釈液で NIH3T3細胞に 3時間 感染させた。 ウィルスの希釈には 1 0%仔ゥシ血清含ダルベッコ改変イーグル培 地を用いた。 感染終了後、 ポリプレンを希釈するために、 更に 2m lの 1 0%仔 ゥシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地を添加した。 翌日より G418を 0.4mg/ml含 む 1 0 %仔ゥシ血清含ダルべッコ改変ィ一グル培地に交換し、 3〜 4日ごとに培 地を交換しながら、 2週間選択を行い、 コロニーを形成させた。 得られたコロニ —をギムザ染色液 （ギブコ社） にて、 常法に従い染色し計数した。 得られたコロ ニー数に希釈倍率を乗じた値を、 cfu としてウィルス力価とした。
(4) 実施例 3_ (2) 記載の組換えレトロウイルスプロデューサ一細胞 IP/D0L を 6ゥエルプレートに植え継ぎ、 セミコンフルェントの状態になったと きにシクロペンテノンを 0〜 20 μ Μ含む 1 0 %仔ゥシ血清含ダルベッコ改変ィ 一ダル培地 1.5ml に交換し、 24時間後に上清を回収した。 回収した上清のウィル スカ価を実施例 2— (3) 記載の方法で測定し、 シクロペンテノンの添加による 組換えレト口ウィルスプロデューサー細胞のウィルス産生能への影響を検討した シク口ペンテノンを添加していない対照実験区より得たウィルス液の力価は 9. 5 X 104 cfu / mlであったのに対し、 0.1 、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、 10、 2 0 μΜ のシクロペンテノン存在下でのウィルス液の力価はそれぞれ 8.3 X 10" 、
6.4Χ 104、 6. IX 10\ 3.8Χ 10\ 5.6Χ 10\ 5.1 X 10\ 4.1 X 104 cfu I mlであり、 シクロペンテノンの添加によりプロデューサー細胞から得られ るウィルス液の力価の低下が確認された。 すなわちシク口ペンテノンよる組換え レトロウィルスプロデューサー細胞のウィルス産生能の抑制作用が認められた。
(5) G418耐性遺伝子を発現するコントロールプラスミ ド pcD2-Y [ ol. Cell. Biol. 第 7卷、 第 2 745〜 2 75 2頁 （1 987) ] 、 および HPV16型 E7と G41 8耐性遺伝子の両方を発現できるプラスミ ド pcD2- 16E7 [Jpn. J. Cancer Res. 第 8 2卷、 第 1 340〜 1 34 3頁 （1 9 9 1 ) を大腸菌 E. coli HB101 に形質 転換し、 L-ブロス培地で培養し、 集めた菌体よりプラスミ ドを抽出し、 塩化セシ ゥム密度勾配超遠心にて精製し、 遺伝子導入用べクタ一プラスミ ドとした。
NIH3T3細胞は 37°C、 5%C〇2 条件下、 1 0 %仔ゥシ血清含ダルベッコ改変 ィ一ダル培地中にて培養した。
精製したプラスミ ド 1 0 gを NIH3T3細胞にカチォニックリボソーム （Transl T LT - 1, 宝酒造社製） を用いて導入し、 細胞を 3 7°C、 5 % C O 条件下、 G418 (GIBC0) を◦. 4mg/m l含む 1 0%仔ゥシ血清含ダルべッコ改変ィ一ダル培 地で 2週間選択し、 得られたコロニーをクローユングし、 0 1 00mmの組織培 養プレートにまで増やし、 順次、 液体窒素で保存した。
これにより、 コントロールベクターを導入した NIH3T3細胞、 及び HPV16型 E7に よってがん化させた NIH3T3細胞をそれぞれ 9株づっ樹立した。
コントロールベクタ一を導入した細胞株を NIH3T3/Y-1、 NIH3T3/Y-2, NIH3T3/Y -3、 NIH3T3/Y- 4、 NIH3T3/Y- 5、 NIH3T3/Y- 6、 NIH3T3/Y- 7、 NIH3T3/Y- 8および NIH3 T3/Y- 9とした。
E7を導入した細胞株を NIH3T3/E7 - 1、 NIH3T3/E7- 2、 NIH3T3/E7- 3、 NIH3T3/E7 - 4 、 NIH3T3/E7- 5、 NIH3T3/E7- 6、 NIH3T3/E7- 7、 NIH3T3/E7- 8および NIH3T3/E7- 9と した。
( 6 ) NIH3T3細胞、 コントロールベクターを導入した細胞株、 および E7を導入 した細胞株を 1 0 O m mの組織培養プレートにて 1 0 %仔ゥシ血清含ダルベッコ 改変イーグル培地で 5 0〜 7 0 %コンブルエントにまで増やし、 PBSで洗浄後、 0 . 2 5 %トリプシン- EDTA溶液で細胞を剥がし、 1 0 %仔ゥシ血清含ダルべッコ 改変イーグル培地 5 m 1に懸濁した。
懸濁液の一部をとり、 ノィバウエル型血球計算板にて細胞密度を計算した。 得 られた数字を元に 1 0 %仔ゥシ血清含ダルべッコ改変ィ一ダル培地にて希釈し、 直径 6 0 m mの組織培養プレートに 2 0 0細胞/プレートになるように播き、 3 m 1 の培地中で培養を開始した。 培養開始から 2 4時間後、 シクロペンテノンを 5 になるように添加した。 さらに 2 4時間後、 新しい培地と交換しシクロべ ンテノンを 5 μ Μになるように添加した。
以後は 2〜3日毎に培地を交換しシクロペンテノンを 5 μ Μになるように添加し た。 対照実験区として、 シクロペンテノンを添加しないプレートを用意し、 同じ ように培地交換した。 培養はそれぞれ 3本立てで行った。 9日間培養後、 メタノ ールで固定してギムザ液 （GIBC0) でコロニーを染色した。
なお NIH3T3、 NIH3T3/Y-1および ΝΙΗ3Τ3/Ε7 - 2を用いて評価した。
染色したコロニーを計数した結果を表 3に示す。 Ε7を導入した細胞は、 コント ロール細胞に比べてシク口ペンテノンへの感受性が高く、 シク口ペンテノンはが ん遺伝子形質転換細胞を選択的に作用した。 表 3
Figure imgf000028_0001
実施例 3— (5) の他の細胞株を使用した場合も、 同様の結果を得た。 また （ 一） 体シクロペンテノン、 （+ ) 体シクロペンテノンでも同様の結果を得た。 実施例 4
(1 ) 24穴マイクロプレート中で 1 0 %牛胎児血清含有 Eagle- MEMを用い単 層になるまで 5 %炭酸ガス存在下、 37°Cで培養した MDCK細胞 （大阪府立公 衆衛生研究所保存株） に終濃度が 0、 5、 1 0、 20、 又は 40 / Mになるよう にシクロペンテノンを添加し、 上記条件で更に 6時間培養を続けた。
この後、 PB Sで細胞を洗浄し、 インフルエンザウイルス AZP RZ8 34 株 （大阪府立公衆衛生研究所保存株） を細胞に加えて感染させ、 30分間、 37 °Cでインキュベートした。 但し、 感染多重度 （m. o . i . ) を 0.01に設定した 。 インキュベート後、 細胞を P B Sで洗浄し、 l O igZm l トリプシンを含ん だ Eagle- MEMで培養した。
感染細胞上清を 0、 1、 2、 3日後に採取し、 ウィルスのタイターを P A P法 によるフォーカス計数法 [J. Clin. Microbiol.第 28卷、 第 1 308〜 1 3 1 3頁 （ 1 9 90) ] で求めた。
その結果、 1 0 μ Μ以上のシク口ペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテ ノン非添加の対照に比べて明らかにウィルスのタイターが低下していた。 その結 果を表 4に示す。 また各シクロペンテノン添加区分でも、 細胞ははがれること無 く接着していた。
表 4
感染後の日数 シクロ'ペンテノン濃度 （ Μ)
π 5 1 0 20 40 τ u/ rr pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
\ 1， υχ丄リ <1. OxlO2 く 1. OxlO2
1 3.6χ105 4. OxlO5 2. OxlO5 2.2xl03 4. OxlO2 o
o
2 Ι.ΟχΙΟ6 8. OxlO5 7.2xl05 2.6xl05 1.9x10s
V
X
3 1.5χ105 9.6xl04 2.4xl05 3.8xl05 5.6x1 o0s
(2) 実施例 4一 （ 1 ) と同様の手順でシクロペンテノン非存在下、 単層に培 養した MD CK細胞に実施例 4一 （1 ) と同様にインフルエンザウイルスを細胞 に加えて感染させ、 終濃度が 0、 5、 1 0、 20、 又は 40 //Mになるようにシ クロペンテノンを添加した 1 O gZm l トリプシンを含んだ Eagle - MEMで培養し た。 その後、 実施例 4— ( 1 ) と同様に、 ウィルスのタイターを求めた。 その結 果、 1 0 μΜ以上のシク口ペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン非添 加の対照に比べて明らかにウィルスのタイターが低下していた。 その結果を表 5 に示す。 また、 各シクロペンテノン添加区分で、 細胞ははがれること無く接着し ていた。 表 5
感染後の日数 シクロ ペンテノン濃度 （μ Μ)
U 八
5 1 0 2 0 4 0 pi u/m丄 pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 く 1. ΟχιΟ 〈1· OxlO o2 <1. OxlO2 <1.0xl02 <1. OxlO2
丄 4. Xiり 2.4xl05 1.9x10s <1. OxlU
2 1· 6χ106 3.4x10s 1. OxlO6 〈1. OxlO2 o
3 4.8χ105 1.9xl05 1.7xl05 7.2xl05 く 1. OxlO2
( 3 ) 実施例 4一 ( 1 ) と同様の手順で単層に培養し、 終濃度が 0、 2 0、 又 は 4 0 // Mのシクロペンテノンで 6時間処理した MD CK細胞に、 実施例 4— ( 1 ) と同様にインフルエンザウイルスを感染させ、 感染前と同濃度のシクロペン テノンを含む 1 0 μ g /m 1 トリプシン含有 Eagle- MEM培地で培養を続けた。 そ の後、 実施例 4一 ( 1 ) と同様に、 ウィルスのタイターを求めた。 その結果、 2 0 μ Μ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン非添加の対 照に比べて明らかにウィルスのタイターが低下していた。 その結果を表 6に示す 。 また各のシクロペンテノン添加区分でも、 細胞ははがれること無く接着してい た。 表 6 感染後の日数 シクロペンテノン濃度 （μΜ)
0 20 40 pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 <1. OxlO2 <1. OxlO2 〈1. OxlO2
1 4.6xl05 9.8xl04 く 1. OxlO2
2 6.6x10s 1.6xl05 〈1. OxlO2
3 1.0x10s 1.3x10s <1. OxlO2
(4) 実施例 4一 (1) と同様の実験を感染多重度 （m. o. i . ) を 0.001に 設定して行った。 その結果、 1 0 μΜ以上のシクロペンテノンを添加した区分で はシク口ペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウィルスのタイターが低下し ていた。 その結果を表 7に示す。 また、 各シクロペンテノン添加区分でも、 細胞 ははがれること無く接着していた。
表 7
感染後の日数 シクロ'ペンテノン濃度 （μ M)
0 5 1 0 Λ Π
η p 1 u / / m ΙΠ I pfu/ml pfu/ml pfu/ml piu/ mi
/ 1 Λν 1 Π 2 <1. OxlO2 〈1. OxlO2 <1. OxlO2 XI
1 / 1 Π UAΥ1 ΠJ2 <1. OxlO2 1. OxlO2 · L/Χ
2 3.6x10s 5.2x10s 6.2x10s 5.0x10s 4.4χ103 o
X
o o
3 3.8xl04 4. OxlO4 8.6xl04 8. OxlO3
( 5) 実施例 4— ( 2 ) と同様の実験を感染多重度 （m. o . に ） を 0.001に 設定して行った。 その結果、 1 0 μΜ以上のシクロペンテノンを添加した区分で はシク口ペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウィルスのタイターが低下し ていた。 その結果を表 8に示す。 また各シクロペンテノン添加区分でも、 細胞は はがれること無く接着していた。
表 8 感染後の日数 シクロペンテノン濃度 ( ju M)
0 5 1 0 2 0 4 0
！ o
o ：
pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml pfu/ml
0 <1. OxlO2 <1.0xl02 〈1. OxlO2
1 6. OxlO2 く 1. OxlO2 <1.0xl02 <1. OxlO2
2 3.6xl05 8.8xl04 2. OxlO5 1.8xl04 〈1. OxlO2 o o
o o
3 3.8xl04 2.6xl04 1.8xl04 1.2xl04 く 1. OxlO2
( 6 ) 実施例 4 — ( 3 ) と同様の実験を感染多重度 （m. o . i . ) を 0.001 に設定して行った。 その結果、 1 0 μ Μ以上のシクロペンテノンを添加した区分 ではシク口ペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウィルスのタイタ一が低下 していた。 その結果を表 9に示す。 また各シクロペンテノン添加区分でも、 細胞 ははがれること無く接着していた。
表 9 感染後の日数 シク ロン ンテノン濃度 （/iM)
π w 5 1 0 厶 U 4 U piu/ n pfu/ml pfu/ml pi u/nU pi u/ml o
X
U く丄 · UX丄 U く 1. OxlO o2 〈1. OxlO2 ハ" ハ 2
く丄. UxIU \ 1. ハ
UxlU
丄 D . UX丄 \J 〈1. OxlO2 / \丄 1 ην π 2
. 丄 U
2 6.2xl05 4.4xl05 4.8x10s 3.2χ104 く 1· OxlO2
3 3.6xl04 5.6xl04 2.8xl04 2.8χ104 く 1. OxlO2 以上、 実施例 4— (1) 〜 （6) の結果から、 シクロペンテノンはインフルェ ンザウィルスに対して抗ウィルス活性をもつことが明らかになった。 また （―） 体シクロペンテノン、 （+ ) 体シクロペンテノンでも同様の結果を得た。
実施例 5
(1 ) ヒ ト T細胞に対するシクロペンテノンの作用
2 X 1 05 個 1の CEM— S S細胞 （ATCC CCL— 1 1 9) 又は1^1 9細胞 （ATCC HTB— 1 7 6) に 0. 5〜 5 μ Mシクロペンテノンを添加 して 3日間培養し、 生細胞数と死細胞数を計数して細胞生存率を算出した。
その結果、 どちらの細胞においてもシク口ペンテノン添加による細胞生存率の 顕著な減少は見られなかった。 その結果を図 1 と図 2に示す。 すなわち、 図 1 と 図 2は添加したシク口ペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図であり、 横軸 は添加したシクロペンテノン濃度 （μΜ) 、 縦軸は 3日間培養後の細胞生存率 （ %) を示す。 図 1は C EM— S S細胞を用いた場合の結果であり、 図 2は H 9細 胞を用いた場合の結果である。
(2) H I V感染 T細胞に対するシクロペンテノンの作用
H I V- 1 , , , „ に感染した CEM— S S細胞 （CEM— 3 Bと略称する） 又 は H I V— 1 ,,, に感染した H 9細胞 （H9— 3 Bと略称する） に：！〜 5 μ M シクロペンテノンを添加して 3日間培養した。 両細胞の 90%以上が H I V- 1 に感染している。 生細胞数と死細胞数を計数して細胞生存率を算出した。 その結果、 どちらの細胞においても 3 μΜシク口ペンテノン添加によって細胞 生存率が顕著に減少し、 5 /iMシク口ペンテノン添加では更に細胞生存率が低下 した。 すなわち実施例 5— （1) と比較し、 シクロペンテノンは抗 H I V作用を 示した。 その結果を図 3と図 4に示す。 すなわち、 図 3と図 4は添加したシクロ ペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図であり、 横軸は添加したシクロペン テノン濃度 （μΜ) 、 縦軸は 3日間培養後の細胞生存率 （％) を示す。 図 3は C ΕΜ- 3 Βを用いた場合の結果であり、 図 4は Η 9— 3 Βを用いた場合の結果で ある。
実施例 6
実施例 5— (2) の 3日間培養した後の培養上清中に含まれる ρ 24抗原の濃 度を測定した。 その結果、 添加したシクロペンテノン濃度に応じて ρ 24濃度が 減少し、 抗 H I V作用が認められた。 その結果を表 1 0に示す。 但し、 表 1 0に おいて括弧内の数字はシクロペンテノン非添加時のそれぞれの細胞培養上清の ρ 24濃度に対する比を％で表したものである。
表 1 0 シクロペンテノン濃度 培養上清中の ρ 2 4濃度 （ n g / m 1 )
(β Μ) C ΕΜ- 3 Β H 9 - 3 B
0 2 8 0 ( 1 0 0 %) 2 1 0 ( 1 0 0 %)
1 2 3 2 ( 8 3 %) 2 0 3 ( 9 7 %)
3 1 7 6 (6 3 %) 1 5 7 ( 7 5 %)
5 1 7 5 ( 6 3 %) 1 4 8 ( 7 0 %) 実施例 7
V e r o細胞 （AT C C C C L— 8 1 ) を 1 0 %牛胎児血清含有 Eagle- MEM に 5 X 1 04 cells/ 1 0 0 μ \の細胞濃度になるように懸濁し、 9 6穴マイク ロタイタ一プレートに 1穴当たり 1 0 0 μ 1の細胞懸濁液を入れ、 5 %炭酸ガス 存在下、 3 7 °Cで一晩培養し、 単層となった V e r o細胞を調製した。
この細胞に、 終濃度が 0、 5、 1 0、 2 0、 又は 4 0 μ Μになるようにシクロ ペンテノンを添加した Eagle- MEM培地を添加して 5 %炭酸ガス存在下、 3 7°Cで 7時間培養した。
培養終了後、 培地を除去し、 P B Sで 2回洗浄後、 日本脳炎ウィルス （JEV JaO Ar - 363- 70株） を 4. 9 X 1 02 pfu / mlになるように接種し、 5 %炭酸ガス存 在下、 3 7°Cで 3 0時間培養した後、 細胞をエタノール固定し、 P AP法による フォーカス計数法 [Arch. Virol.第 8 6卷、 第 1 2 9〜 1 3 5頁 （ 1 9 8 5 ) ] でフォーカス計数を行った。
その結果、 4 0 μ Μのシク口ペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテノン 非添加の対照に比べて明らかにフォーカスの数が低下していた。 その結果を表 1 1に示す。 また各シクロペンテノン添加区分で、 細胞ははがれることなく接着し ていた。 表 1 シクロペンテノン濃度 （μΜ) pru I ml
0 3. 0 X 1 0
1 0 1. 6 X 1 07
20 2. 1 X 1 07
40 4. 9 X 1 0
(2) 24穴マイクロプレート中で 1 0 %牛胎児血清含有 Eagle-MEMを用い単 層になるまで 5 %炭酸ガス存在下、 3 7°Cで培養した V e r o細胞を P B Sで洗 浄し、 4. 9 X 1 02 pfu / ml の日本脳炎ウィルス （JEV JaOAr- 363- 70株） を細胞に加えて感染させ、 90分間、 3 7°Cでインキュベートした。
インキュベート後、 細胞を P B Sで洗浄し、 終濃度が 0、 5、 1 0、 20、 又 は 40 Mになるようにシク口ペンテノンを添加した MEMで培養した。
感染細胞上清を 0、 1、 2、 3日後に採取し、 ウィルスのタイターを V e r o 細胞を用いた PAP法によるフォーカス計数法 [J. Clin. Microbiol.第 28 卷、 第 1 308〜 1 3 1 3頁 （ 1 9 90) ] で求めた。
その結果、 1 0 μ Μ以上のシク口ペンテノンを添加した区分ではシク口ペンテ ノン非添加の対照に比べて明らかにウィルスのタイタ一が低下していた。 その結 果を表 1 2に示す。 また各シクロペンテノン添加区分で、 細胞ははがれることな く接着していた。 1 2 シク口ペンテノ 'ン濃度 ウィル； 接種後の日数
(μΜ) 1 曰 2曰 3曰 pfu 1 ml pfu 1 ml pfu 1 ml
0 6. OX 103 5.6X 106 1.1 X 107
1 0 6. OX 103 2.4X 10fi 4.4X 106
2 0 6.4X 103 1.9X 10e 3. OX 106
40 0 0 0 上記実施例 7— （1 ) 、 (2) の結果から、 シクロペンテノンは日本脳炎ウイ ルスに対して抗ウィルス活性をもつことが明らかになった。 さらに、 日本脳炎ゥ ィルスは、 C型肝炎ウィルスと同系の種であり、 C型肝炎ウィルスの in vitro での培養が確立していない現在では C型肝炎ウィルスのモデルとして日本脳炎ゥ ィルスが利用されている。 これらのことより、 シクロペンテノンは C型肝炎の治 療薬としても有効である。
また （一） 体シクロペンテノン、 （+ ) 体シクロペンテノンについても同様の 結果を得た。 .
実施例 8
5年前に C型肝炎ウィルス感染症と診断され、 インタ一フュロン、 強力ミノフ ァーゲンによる治療を受けてきたが、 GOT、 G P Tともに 1 50前後と肝機能 の改善が見られなかった女性が、 後記実施例 1 3で得られた飲料を毎日 5 Om l (シクロペンテノン 2 m g含有） 、 2力月飲用した結果、 GOT、 GPTともに 80と改善した。 更に同様に 1力月飲用を続けた結果、 GOT、 G PTともに 3 0と顕著な肝機能の改善が見られた。
実施例 9
I CR系マウス （日本エスエルシ一より購入、 7週令、 雌性） の背部の毛を剃 つた後、 イニシエータ一として DMB A (dimethylbenzanthracene) を 5 0 /z g Zマウスとなるように、 そのアセトン溶液を塗布し、 その 1週間後より、 プロモ ータ一とし Γ ΡΑ ( 12-o-Tetrasecanoylphorbol 13- acetate) ¾r 1 μ g/マウ スとなるように、 そのアセ トン溶液をイニシエータ一塗布部に、 毎週 2回試験終 了まで塗布し、 シク口ペンテノンの 8 0 %ェタノール溶液又は対照の 8 0 %エタ ノール溶液を各 T P A塗布の 1時間前に塗布し、 2段階皮膚発がんにおける発が ん抑制作用を 2 0週間観察した。
対照群 （vehicle塗布群） は 1 5週以降は 1 0 0% ( 1 2匹中 1 2匹） の発が ん率を示したのに対し、 シクロペンテノンは強力に発がんを抑制し、 2. 5 m g Zマウスは 1 5週以降に 8. 3 % ( 1 2匹中 1匹） 、 1 9週以降に 2 5 % ( 1 2 匹中 3匹） の発がん率という発がん抑制を示した。 結果を図 5に示す。 すなわち 図 5はシクロペンテノンの発がん抑制作用を示す図であり、 縦軸は発がん率、 横 軸は時間 （週） を示す。 図中白三角はシクロペンテノン 2. 5 m g/マウス処理 群 （1 2匹） 、 黒三角はシクロペンテノン 0. 8mgZマウス処理群 （ 1 1匹） 、 白丸は対照群 （1 2匹） を示す。
なおマウス耳介における T P A炎症試験においてシク口ペンテノンは 2. 5 m g マウスのマウス耳介塗布において抗炎症活性を示さなかつた。
以上シク口ペンテノンは 2段階化学発がんにおいて抗プロモーター作用を示し た。 シクロペンテノンを含有するグルクロン酸の加熱処理物、 （一） 体シクロべ ンテノン、 （+ ) 体シクロペンテノンも同様の結果を示した。
実施例 1 0
注射剤
( 1 ) 生理食塩液 （日本薬局方収載品） にシクロペンテノンを 1 %濃度で加え 注射剤を作製した。 (2) 生理食塩水 （前記と同じ） に （一） 体シクロペンテノン及びグリシルリ チン酸をそれぞれ 0. 5%及び0. 1 %濃度で加え、 注射剤を作製した。
実施例 1 1
錠剤
( 1 ) シクロペンテノン 1 Omgと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠 剤を調製し、 糖衣を施し、 錠剤を作製した。
(2) ( + ) 体シクロペンテノン 0. l m g、 グリシノレリチン酸ジカリウム 1 Om g及び微結晶セルロースの適量を含有する錠剤を調製し、 糖衣を施し、 錠剤 を作製した。
実施例 1 2
軟膏
シク口ペンテノン 1 g
吸水軟膏 （日本薬局方収載） 9 9 g
シク口ペンテノンをまず少量の吸水軟膏と十分に練り合せ、 次いで残った吸水 軟膏を徐々に加えて均一になるまで練り合せて軟膏を作製した。
この軟膏は 1 日 4〜 5回患部に塗布される。
実施例 1 3
( 1 ) ぺクチン （ポモシンぺクチン LM— 1 3 CG ： ハーキュリーズ社製） 5 k gを水道水 1 0 0リ ッ トルに添加し、 液温 2 8 °Cから液温 1 2 0 °Cとなるまで 水蒸気吹き込みにより 3 5分間昇温させ、 次いでかくはん下で 1 2 0°C、 5時間 保温し、 次いで冷却し、 冷却物 1 3 5リツ トルを調製した。 次いで冷却物にろ過 助剤として、 セライ ト # 5 4 5 (セライ ト社製） 1. 3 5 k g、 及びシリカ # 6 00 - S (中央シリカ社製） 1. 3 5 k gを添加し、 次いでセライ ト # 5 4 5の 0. 1 k g、 及びシリカ # 6 0 0— Sの 0. 1 k gでプレコートしたコンパク ト フィルター （6インチ 1 6段ろ紙： ADVANTE C # 3 2 7) でろ過を行った 。 得られたろ液はプレートヒーター （日阪製作所製） による連続瞬間加熱処理 （ 9 8°C、 6 0秒） を行った後冷却し、 1 5 0 リ ッ トルのシクロペンテノン含有の ぺクチン加熱処理液を調製した。 シクロペンテノン含有のぺクチン加熱処理液の p Hは約 3. 5、 酸度は 6. 2 m l、 糖度は 5. 8 B r i x%であった。 なお p Hは p Hメーターで測定し、 酸 度は試料 1 ◦ m 1を p H 7. 0に中和するのに要する 0. I N N a〇Hi (m 1 ) で表示した。 更に糖度はブリ ックス糖度計で測定した。
(2) 下記組成で飲料を調製した。
果糖ブトゥ糖液糖 5 00 %
砂糖 4 00 %
酸味料 1 20%
香料 0 30 %
シク口ペンテノン含有物 0 5 %
精製水 ― ―
計 1 00. 00 %
シクロペンテノン含有物としては実施例 1 3— ( 1) 記載のシクロペンテノン 含有べクチン加熱処理液を使用し、 その固形物換算量を添加した。 この飲料 1 0 Om l 中には 4 m gのシク口ペンテノンが含有されている。
発明の効果
本発明により細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィルス感染 細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシクロペンテノン若しく はその光学活性体又はそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする抗ウイ ルス剤が提供される。 本発明の抗ウィルス剤はウィルス感染細胞を選択的に死滅 させ、 且つウィルス未感染の正常細胞にウィルス抵抗性を付与し、 その相乗作用 により、 難治療性のウィルス疾患、 例えば A I DS、 C型肝炎等の治療及び症状 改善に極めて有用な抗ウィルス剤である。 また本発明により、 肝機能改善作用、 熱ショ ックタンパク誘導作用、 ウィルス発がん予防作用、 抗プロモーター作用等 の生理活性を有するシク口ペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を 含有する医薬品が提供され、 該医薬品は生体の恒常性の維持、 特に胃腸健康保持 に有用な医薬品となる。
また本発明により細胞にウィルス抵抗性を誘導する機能を有し、 且つウィルス 感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、 例えばシクロペンテノン若 しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする抗 ウィルス用食品又は抗ウイルス用飲料が提供され、 これらの飲食品はウィルスが 起因となる種々の疾病の症状改善用飲食品又は予防用飲食品として有用である。 また本発明により、 肝機能改善作用、 熱ショックタンパク誘導作用、 ウィルス発 がん予防作用、 抗プロモーター作用等の生理活性を有するシクロペンテノン若し くはその光学活性体又はそれらの塩を含有する飲食品が提供され、 該飲食品は生 体の恒常性の維持、 特に胃腸健康保持に有用な飲食品となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記式 〔 I〕 で表される 4， 5—ジヒ ドロキシ一 2—シクロペンテン一 1 一オン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なく とも一つ以 上の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗ウィルス剤。
〔 I〕
Figure imgf000043_0001
2. ウィルスがヒ ト後天性免疫不全ウィルス、 又は C型肝炎ウィルスである請 求の範囲 1に記載の抗ウィルス剤。
3. ヒ ト用抗ウィルス剤、 非ヒ ト動物用抗ウィルス剤又は植物用抗ウィルス剤 である請求の範囲 1記載の fetウィルス剤。
4. 家畜、 家禽、 魚類又はェビ類用抗ウィルス剤である請求の範囲 3記載の抗 ウィルス剤。
5. 下記式 〔 I〕 で表される 4， 5—ジヒ ドロキシ一 2—シクロペンテン一 1 —オン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なく とも一つ以 上の化合物を含有することを特徴とする抗ウィルス用食品又は抗ウィルス用飲料
〔 I〕
Figure imgf000043_0002
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