KR20110086474A

KR20110086474A - 감태 추출물을 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110086474A
Application number: KR1020100006228A
Authority: KR
Inventors: 이우송; 노문철; 류영배; 박수진; 장종선; 권형준; 김하현; 정형재
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-07-28
Also published as: KR101705760B1

Abstract

본 발명은 감태 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 감태 추출물 또는 이의 분획물이 항로타바이러스의 효과를 가지고, 다양한 로타바이러스에 대해 살바이러스 및 세포변성 억제효과를 동시에 나타내므로 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감태 추출물을 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for composition for prevention or treatment of rotavirus infection comprising ecklonia cava}

본 발명은 감태 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

로타바이러스 (rotavirus)는 전 세계적으로 어린 동물 (소, 돼지, 및 염소)과 영유아에서 심한 설사를 유발하는 가장 중요한 원인체 중 하나이며, 심한 설사 외에도 뇌염, 중이염, 괴사성 대장염, 간농양, 장중첩 등의 질병을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (Ester, M. K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology. pp. 1747-1785, 2001). 로타바이러스는 레오바이러스과 (reoviridae)에 속하며, 직경 70 mm의 11개로 분절화된 이중쇄 RNA 게놈을 3층의 캡시드 층으로 둘러싸고 있다. 이러한 3층의 캡시드 층 중에서 가장 외부에 있는 층은 VP4 및 VP7 단백질로 구성되어 있다. VP4 단백질은 숙주의 단백분해효소 (protease)에 의해 VP5와 VP8로 분할되기 때문에 그 혈청형을 P type이라고 하며, VP7 단백질은 당화 (glycosylation)되어 있기 때문에 그 혈청형을 G type이라 한다 (Ciarlet, M. and Ester, M. K. Rotaviruses: basic biology, epidemiology and methodologies in encyclopedia of envirionmental microbiology. pp. 2753-2773, 2002). VP4 및 VP7 단백질은 중화 항체를 유발함으로써 숙주의 방어에 중요하게 관여한다.

혈청형은 중간층 캡시드 단백질인 VP6에 대한 혈청형에 의해 A-G까지 총 7개의 종으로 나누어진다. 이들 중 혈청형 A 로타바이러스는 사람과 동물에서 가장 많이 발생하는데, 매년 전 세계적으로 1억 3천만명에게 장염을 유발하며, 이 중 87만 3천명은 사망에 이르는 매우 중요한 전염성 원인체로 알려져 있다.

혈청형 A 로타바이러스는 각각의 숙주에 특이적인 G 및 P type이 보고되어 있다. 사람에서는 G1-G3, G9과 P[4] 및 P[8]의 조합이 가장 우세하게 발생하고 있다 (Kapikian et al., 2001). 돼지의 경우 G3-G5, G11과 P[6] 및 P[7]의 조합이 가장 우세한 것으로 알려져 있다 (Gouvea and Timenetsky, 1994). 소는 G6, G8, G10과 P[1], P[5], 및 P[11]의 조합이 유리하게 나타난다 (Alfieri et al., 2004). 하지만 인플루엔자 바이러스와 유사하게, 동물과 물리적 접촉이 빈번한 나라의 사람에게서는 사람과 동물의 각기 다른 혈청형 A 로타바이러스가 혼합적으로 감염됨에 따라, 재조합 바이러스가 발생하여 사람에게 감염되는 사례들이 보고되고 있다 (jain et al., 2001). 또한, 브라질이나 미국에서는 사람에게서만 주로 발생하는 G9 로타바이러스가 돼지에게서도 발생 하였다 (Paul et al., 1988). 이와 같이 동물로부터 유래된 로타바이러스가 사람에게서 검출되는 것은 이것이 “인수공통전염병 원인체”라는 것을 의미하며, 다른 가축들 사이에도 서로 전파될 수 있는 축종 간의 전파 또한 발생하고 있다.

일반적으로, 이러한 바이러스 질병을 치료할 목적으로, 상피세포로의 흡착 저해, 세포로의 침입 저해, 유전자의 전사 및 복제 저해, 단백질의 합성 저해, 세포로부터의 방출 억제와 같은 방법들을 생각할 수 있으며, 각각 항바이러스의 표적으로 보고 있으나, 실질적으로 현재까지 로타바이러스에 대한 명확한 표적은 밝혀져 있지 않다.

로타바이러스의 감염을 억제하기 위해 많은 백신들이 개발되고 있으며, 특히 사람에 대해서는 사람과 동물의 로타바이러스를 재조합하여 만든 동물-사람 재조합바이러스 백신을 생산하여 판매하고 있다. 대표적으로, 소의 로타바이러스주인 WC3를 바탕으로 인간 로타바이러스주 혈청형의 특이성을 가진 VP4에 해당하는 유전자를 끼워 넣은 백신으로서, 로타텍 (RotaTeq, Merk 社)의 경우에는 2006년 미국의 FDA 승인을 거쳐 판매되고 있다. 하지만 이러한 재조합 바이러스 백신은 장중첩 (intrussusception)과 같은 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 이것으로는 다양한 로타바이러스 혈청형에 대한 예방을 할 수 없다는 큰 단점을 안고 있다.

이러한 백신의 단점을 극복하기 위해 로타바이러스를 억제할 수 있는 천연소재들에 관한 연구가 이루어지고 있다. 대표적으로, Takahashi 등은 스테비아의 열수 추출물이 항로타바이러스 효과가 있음을 보고한 바 있다 (Takahashi, K et al., Antiviral Res. 49, 15, 2001).

이에 본 연구팀은 감태 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물들이 로타바이러스 감염을 억제하는 활성을 가지며, 로타바이러스에 대한 살바이러스 억제 효과 및 세포변성 억제 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양상으로서, 감태 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 상기 조성물을 로타바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하는 로타바이러스의 활성을 억제하는 방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 감태 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 로타바이러스에 대해 살바이러스와 세포변성 억제효과를 동시에 나타내기 때문에 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 로타바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 로타바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 로타바이러스는 인간 (Human), 돼지 (Pocine), 소 (Bovine), 또는 염소 (Goat) 로타바이러스일 수 있다. 또한, 상기 로타바이러스는 장염, 설사, 감기, 인후염, 기관지염, 및 폐렴의 질환을 야기할 수 있다.

일반적으로 감태 (Ecklonia cava)는 미역과 (Alariaceae)의 여러해살이 해조로서, 점심대 (漸深帶)의 깊은 곳에서 자란다. 길이는 보통 1 ~ 2 m이며, 줄기는 원기둥 모양이고 밑동은 뿌리 모양이다.

본 발명에서 감태는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 제주도에서 직접 채취한 것을 사용할 수 있다.

상기 감태의 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 세척 및 건조로 이물질이 제거된 감태를 분쇄하여 얻은 감태 건조물을 물, C₁~C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C₁~C₄의 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 이때, 추출용매는 감태의 건조중량의 2~20 배로 하는 것이 바람직하다. 일례로 감태 건조물을 세절한 후 추출용기에 넣고 C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 넣고 일정기간 상온에서 방치한 다음, 여과하여 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 추출은 상온에서 1주 동안 방치하는 것이 바람직하며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

또한, 상기 감태 건조물을 80 ~ 90 ℃의 열수를 환류 장치에 연결하여 6시간 동안 방치한 다음, 이를 여과하여 열수 추출물을 얻을 수 있다. 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

한편, 본 발명에서 감태 분획물은 상기에서 얻은 감태 추출물로부터 분획하여 얻을 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 감태 분획물은 감태 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산 및 에틸아세테이트로 각각 분획함으로써 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물을 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 로타바이러스 감염의 발명 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 로타바이러스 감염 질환의 치료방법을 제공한다. 상기 로타바이러스는 인간 (Human), 돼지 (Pocine), 소 (Bovine), 또는 염소 (Goat) 로타바이러스일 수 있다. 또한, 상기 로타바이러스 감염 질환은 장염, 설사, 감기, 인후염, 기관지염, 및 폐렴일 수 있다.

본 발명에서 용어, "개체"란 로타바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 본 발명의 추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 로타바이러스 아형 또는 변이형의 인간 로타바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 로타바이러스 아형 또는 변이형의 로타바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 다양한 로타바이러스 아형 또는 변이형의 로타바이러스로 감염된 돼지, 소, 또는 염소를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 로타바이러스 감염 질환의 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

아울러, 본 발명은 감태 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공한다.

즉, 본 발명의 감태 추출물 또는 이의 분획물은 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 식품 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 감태 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 감태 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.

즉, 본 발명의 조성물은 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료를 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 감태 추출물 또는 이의 분획물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청경제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 로타바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하는 로타바이러스의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 접촉은 통상적인 방법으로 이루어지고, 로타바이러스는 살아있는 유기체, 조직 또는 세포 배양체, 생물학적 물질 시료 (혈액, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 눈물, 가래, 타액, 조직 시료 등) 등이 포함되며, 대개 바이러스와 같은 병인성 유기체를 함유할 수 있다. 이러한 시료들은 물 및 유기 용매/물 혼합물을 포함하는 어떠한 배지 내에 담길 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 투여한 후에 항로타바이러스 활성을 진단하는 직접 또는 간접 방법을 포함한 어떠한 방법에 의해서도 관찰될 수 있다. 로타바이러스 감염 억제 활성을 진단하는 정량적인, 정성적인 또는 세미-정량적인 방법들 모두가 사용 가능하며, 살아있는 유기체의 생리학적인 특성을 관찰하는 등 다른 어떠한 방법도 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 감태 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물들은 로타바이러스의 활성을 억제하는 효과를 나타내고, 다양한 로타바이러스에 대해 살바이러스 및 세포변성 억제 효과를 동시에 나타내므로 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 감태 추출물의 투여 용량에 따른 살바이러스의 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 감태 추출물의 제조

본 발명의 사용한 감태는 일반적으로 자연에서 쉽게 채집할 수 있는 것으로 본 발명의 추출물을 효율적으로 얻기 위하여 파우더 형태로 분쇄하여 사용하였다.

감태 2 kg에 95 %의 에탄올 (EtOH) 20 ℓ를 가하여 실온에서 7일 동안 방치하고, 이를 여과지로 여과한 후 농축하여 감태의 에탄올 추출물 (182 g)을 수득하였다.

실시예 2 : 감태 추출물로부터 분획물 및 화합물의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 수득한 감태의 에탄올 추출물 182 g에 물 2ℓ를 넣어 현탁시켰다. 이를 분별 깔대기에 넣고, 헥산 가용추출물 (48 g), 에틸아세이트 가용추출물 (90 g) 및 물 가용추출물 (20 g)을 수득하였다.

상기에서 수득한 에틸아세테이트 가용추출물 90 g을 클로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매 (30:1 ~ 1:1)를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 [실리카겔 700 g, 70 ~ 230 메쉬 (mesh)]를 실시하여 12개의 분획물 (Fr.1 ~ 12)로 분리하였다. 이들 중 두 번째 분획물 (Fr.2, 1.2 g)은 헥산 : 에틸아세테이트의 혼합용매를 이동상으로 하여, TLC 전개용매 헥산 : 에틸아세테이트 (1:2) 조건하에 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (100 g, 230 ~ 400 메쉬)를 실시하여 3개의 분획물 (Fr. 2-1 ~ 2-3)로 분리하였다. 이 중 첫 번째 분획물 (Fr. 2-1, 230 mg)에 대하여 메탄올에 충진된 Sephadex (LH-20) 컬럼크로마토그래피를 실시하여 순수한 화합물 1 (21 mg)을 수득하였다. 두 번째 분획물 (Fr. 2-2, 330 mg)에 대하여 메탄올 : 물의 혼합용매 (30/70, v/v)를 사용하여 역상크로마토그래피 (RP-18)를 이용하여 순수한 화합물 2 (21 mg)를 수득하였다. 또한 세 번째 분획물 (Fr. 2-3, 560 mg)은 헥산 : 에틸아세테이트의 혼합용매를 이동상으로 TLC 전개용매 헥산 : 에틸아세테이트 (1:2) 조건하에 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (50 g, 230 ~ 400 메쉬)를 수행하고 메탄올 : 물의 혼합용매 (30/70, v/v)를 사용하여 역상크로마토그래피 (RP-18)를 이용하여 순수한 화합물 3 (30 mg)을 수득하였다.

실시예 3: 화합물 1 내지 3의 구조 분석

상기 실시예 2에서 얻은 화합물들의 분자량 및 분자식을 핵자기공명 (NMR) 분석 (Bruker AM 300, 500)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 2D NMR 분광학 자료, 융점 (melting point) 및 적외선 분광학 (IR) 자료를 이용하여 분자구조를 결정하였다.

실험예 1: 감태 추출물, 분획물 및 폴리페놀성 화합물의 로타바이러스에 대한 저해 효과 측정

먼저, 감태 추출물의 돼지 로타바이러스 KJ205 (G5P[7])에 대한 살바이러스 효과 (Virucidal effect) 및 세포변성효과 (CPE reduction effect)를 측정하기 위하여, 원숭이의 신장세포주인 TF-104 (Fetal rhesus monkey kidney)를 이용하여 하기와 같은 in vitro 실험을 수행하였다.

먼저, 96 well microplate에 TF-104 세포를 각 well 당 4 X 10⁴/ well이 되도록 넣고, 배지 alpha-MEM (penicillin 100 units, streptomycin 100 mg, 5% FBS)으로 배양하였다. TF-104 세포가 monolayer가 되자, 항생제만 포함된 alpha-MEM 배지로 2회 세척하였다. KJ205를 각각 0.01 MOI가 되도록 희석하여 EP 튜브에 담아 두었다. 여기에 DMSO (dimethylsulfoxide)로 희석한 감태 추출물을 농도별로 각 튜브에 넣은 후 4 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 미리 세척해둔 TF-104 세포에 하나의 농도당 3 well에 각각 접종하였다 (이하, 샘플 처리군이라 함). 한편, 비감염＋비투여 대조군 (Control, KJ205를 감염시키지 않고, 화합물을 처리하지 않은 세포군) 및 감염＋비투여 대조군 (Virus control, KJ205를 감염시킨 후, 화합물을 처리하지 않은 세포군)을 동일한 조건에서 1시간 반응 후 TF-104 세포에 접종하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 1시간 후 plate의 배지를 모두 제거하고 PBS로 1회 세척 다음, 항생제와 1 μg/mL 트립신이 첨가된 alpha-MEM 배지를 각 well에 100 mL씩 분한 후, 37 ℃에서 5 ~ 6일 동안 배양하였다. 감염＋비투여 대조군에서 완전히 세포변성효과 (Cytopathic effect, CPE)가 나올 때까지 5 ~ 6일 배양하였다. 도립현미경으로 매일 세포의 상태를 관찰하였다. 배양 5 ~ 6일 후 세포 생존률을 알아보기 위하여 neutral red solution (Sigma, UK)을 각 well당 1 mL씩 넣은 다음, 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 배지액을 제거하고 destaining soultion (1 % glacial acetic acid, 49 % DDW, 50 % EtOH)을 각 well에 100 mL씩 넣은 다음, 15분 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 비감염＋비투여 대조군 및 감염＋비투여 대조군과 본 발명의 감태 추출물이 나타내는 살바이러스 효과 (저해도 (%))를 하기 수학식 1에 의해 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 식에서, O.D 값은 540 nm에서 측정한 흡광도 값을 의미한다.

한편, 감태 추출물의 돼지 로타바이러스 KJ205 (G5P[7])에 대한 세포변성억제효과를 알아보기 위해, 항생제만 포함된 alpha-MEM 배지로 2회 세척한 TF-104 세포에 바이러스를 접종하여 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 1시간 후 접종한 바이러스액을 모두 제거하고, 감태 추출물을 농도별로 바이러스가 접종된 TF-104 세포에 처리하였다. 그 후, 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 감태 추출물이 나타내는 세포변성억제효과 (저해도 (%))를 상기 수학식 1에 의해 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	돼지 로타바이러스 KJ205 (G5P[7])
	살바이러스 효과 (Virucidal effect)			세포변성억제효과 (CPE inhibition effect)
	CC₅₀ ¹ ⁾ (μM)	EC₅₀ ² ⁾ (μM)	S.I.³⁾	CC₅₀ (μM)	EC₅₀ (μM)	S.I.
에탄올 추출물	>100	>100	-	>100	53.5	>1.9
[주] 1) 세포독성 농도로부터의 50 % 농도 값, 2) 억제효과 농도로부터 50 % 농도 값, 3) 선택지수, CC₅₀/EC₅₀

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 감태 추출물은 살바이러스 효과를 나타내는 선택지수 (seletive index, SI)가 1.9 이상으로, 우수한 살바이러스 효과를 나타내었다. 이러한 살바이러스 효과는 도 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 나타남을 확인할 수 있다. 특히, 감태 추출물의 CC₅₀은 100 μg/mL 이상으로 높은 농도에서도 독성을 나타내지 않았다. 이는 감태 추출물이 낮은 독성을 가지며, 바이러스 저해 효과는 매우 높은, 우수한 활성을 가진다는 것을 보여준다.

실험예 2 : 화합물 1 내지 3의 급성 독성 실험

상기 실시예 2에서 얻은 화합물들의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정 병원체 부재 (SPF, specific pathogens free) C57BL/6J 마우스를 암수 각각 12 마리씩 4군 (암수 각각 3마리/실험군)으로 나누어, 온도 22 ± 3 ℃, 습도 55 ± 10 %, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용하기 전 약 1주일간 순화시켰다. 실험동물용 사료 (마우스 및 랫트용, (주)제일제당, 서울, 대한민국) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.

상기 실시예 2에서 제조한 화합물 2를 0.5 % 트윈 80 (tween 80)에 50 mg/mL 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g 당 0 mL, 0.04 mL (100 mg/kg), 0.2 mL (500 mg/kg) 및 0.4 mL (1,000 mg/kg)씩 각 군에 경구 투여하였다. 시료는 단회 경구 투여하였으며, 투여 후 7일 동안 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여 당일에는 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 후에, 그리고 투여 익일부터 7일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반적인 증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다.

그 결과, 시료를 투여한 모든 마우스에서 특기할 만한 임상증상이 나타나지 않았으며, 폐사된 마우스도 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명의 화합물은 마우스에서 1,000 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)이 1,000 mg/kg 이상인 안전한 물질임을 확인할 수 있었다.

이하, 감태 추출물 및 이의 분획물을 함유한 약학적 제제 또는 건강식품의 예를 설명한다.

제조예 1: 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4. 주사액제의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 감태 추출물, 분획물, 이로부터 분리한 화합물, 또는 이의 염을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하여 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

제조예 2: 건강식품의 제조

2-1. 조리용 양념의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.2 ~ 10 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2-2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

2-3. 밀가루 식품의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.1 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-4. 스프 및 육즙 ( gravies )의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.1 ~ 1.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-5. 그라운드 비프 ( ground beef )의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

2-6. 유제품 ( dairy products )의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

2-7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지된 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지된 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 감태 추출물, 분획물, 이로부터 분리한 화합물, 또는 이의 염의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류 (현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류 (들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물의 건조분말 (1 중량%),

영지 (0.5 중량%),

지황 (0.5 중량%)

2-8. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05 ~ 0.3 %, 카라멜 0.005 ~ 0.02 %, 비타민 C 0.1 ~ 1 %의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79 ~ 94 %의 정제수를 섞어서 시럽을 만들었다. 상기에서 제조한 시럽을 85 ~ 98 ℃에서 20 ~ 180초 동안 살균하여 냉각수와 1 : 4의 비율로 혼합시킨 다음, 탄산가스를 0.5 ~ 0.82 % 주입하여 감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2-9. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

2-10. 야채쥬스의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

2-11. 과일쥬스의 제조

감태 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물 0.1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims

감태 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁~C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 추출한 것을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 로타바이러스는 인간 (Human), 돼지 (Pocine), 소 (Bovine), 또는 염소 (Goat) 로타바이러스인 것을 특징으로 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 로타바이러스는 장염, 설사, 감기, 인후염, 기관지염, 및 폐렴의 질환을 야기시키는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.