JP7068704B2

JP7068704B2 - 老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤

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Publication number: JP7068704B2
Application number: JP2018543997A
Authority: JP
Inventors: 陽一鍋島; 千秋安部; 義浩宇都; 隆司平松
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Filing date: 2017-10-06
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Description

本発明は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤、それらを含む飲食品、医薬品及び化粧料、並びにそれらの使用方法に関する。

人の平均寿命が長くなり、いわゆる高齢化社会を迎えた現代においては、老化に伴う身体の機能低下を抑制し、より快適な生活を送ることができるようにサポートする飲食品、医薬品及び化粧料へのニーズが顕在化している。

老化とＣａｌｐａｉｎ－１の活性化とが関与していることが報告されている。例えば、老化モデルマウスであるα－ｋｌｏｔｈｏマウスでは、２週齢まではＣａｌｐａｉｎ－１活性化が正常に制御されているが、３週齢以降でＣａｌｐａｉｎ－１の異常な活性化が起こり、細胞骨格タンパク質であるα－II ｓｐｅｃｔｒｉｎの分解を導くこと、２９月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスでは、α－ｋｌｏｔｈｏの発現低下、Ｃａｌｐａｉｎ－１の異常な活性化、及びα－II ｓｐｅｃｔｒｉｎの分解が見られることが報告されている（非特許文献１）。

また、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化は、軟部組織の石灰化に関連することが知られている。例えば、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスにカルパイン阻害剤であるＢＤＡ－４１０を投与すると、メンケベルグ型動脈硬化が抑制されることが報告されている（非特許文献２）。

ところで、６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート（以下、６－ＭＳＩＴＣとも記載する）は、わさびに含有されている香料の１つであり、これまでに抗酸化・抗炎症作用の様々な薬理作用を有することが知られている（非特許文献３、４）。

特許文献１には、６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）を活性化することにより、ＮＡＤ（Ｐ）^＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を調整し、エネルギー過剰から生じうる様々な疾患に使用されることが示唆されている（特許文献１：特表２００９－５２６８３９）。

特許文献２には、６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートが、ＴＮＦ－αの産生を抑制することが記載されており、変形性関節炎、関節リウマチといった炎症性疾患に使用されることが示唆されている（特許文献２：特開２００９－１３２６３５）。

特許文献３には、６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートが、精神的及び／又は肉体的ストレス負荷後の副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の血中濃度上昇の抑制、サイトカイン、ケモカインの増加を抑制することが記載されており、ストレスを起因とする疾患に使用されることが示唆されている（特許文献３：特開２００９－１２６８２６）。

しかしながら、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートが、老化抑制作用、軟部組織の石灰化抑制作用、及び肺組織破壊抑制作用を有することはこれまでに全く知られていない。

特表２００９－５２６８３９号公報特開２００９－１３２６３５号公報特開２００９－１２６８２６号公報

Ｍａｎｙａ，Ｈ．ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７（３８），３５５０３－３５５０８（２００２）Ｎａｂｅｓｈｉｍａ，Ｙ．ｅｔａｌ．ＳｃｉＲｅｐ．４，５８４７，（２０１４）Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ１１５（３），３２０－３２８（２０１１）Ｕｔｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．ＡｄｖＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．２０１２，６１４０４６（２０１２）

本発明で解決しようとする課題は、新規の老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤、それを含む飲食品、医薬品及び化粧料、並びにそれらの使用方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートが老化抑制作用、軟部組織の石灰化抑制作用、及び肺組織破壊抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートが、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化抑制作用を有し、これが老化抑制作用、軟部組織の石灰化抑制作用、及び肺組織破壊抑制作用をもたらしていることを見出した。

本発明の老化抑制剤は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する。

本発明の石灰化抑制剤は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する。

本発明の肺組織破壊抑制剤は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する。

本発明は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤を提供することができる。これを飲食品若しくは医薬品として摂取すること、又は化粧料として使用することにより、例えば、老化に関連する状態を改善すること、軟部組織の石灰化を抑制すること、又は肺組織の破壊を抑制することができる。

６－ＭＳＩＴＣの老化モデルマウス（α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス）に対する老化抑制効果を示す。ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣのＷｉｌｄｔｙｐｅマウス及びα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスにおける肺気腫抑制効果を示す。ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣのＷｉｌｄｔｙｐｅマウス及びα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスにおける異所性石灰化抑制効果を示す。６－ＭＳＩＴＣの老化モデルマウス（α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス）におけるＣａｌｐａｉｎ－１の活性化抑制効果を示す。６－ＭＳＩＴＣのＷｉｌｄｔｙｐｅマウス及びα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスにおけるＣａｌｐａｉｎ－１の活性化抑制効果を示す。６－ＭＳＩＴＣの老化モデルマウス（ＳＡＭＰ１マウス）に対する老化抑制効果を示す（ビームバランステスト）。６－ＭＳＩＴＣの老化モデルマウス（ＳＡＭＰ１マウス）に対する老化抑制効果を示す（皮膚の外見所見）。６－ＭＳＩＴＣの老化モデルマウス（ＳＡＭＰ１マウス）に対する老化抑制効果を示す（組織学的解析）。６－ＭＳＩＴＣのＣａｌｐａｉｎ－１の活性化抑制効果を示す。６－ＭＳＩＴＣのＣａｌｐａｓｔａｔｉｎの分解抑制効果を示す。

以下に、本発明について詳細に説明する。

＜ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート＞
本発明において、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートは化学的に合成された物質であってもよく、また、アブラナ科植物から得られた抽出物としての天然物であってもよい。これら物質として、具体的には５－メチルスルフィニルペンチルイソチオシアネート、６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、７－メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネート及び８－メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートが挙げられるが、本発明の目的を達成するためには、特に６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートが好ましい。

本発明において、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートは、天然物である場合、本わさび、西洋わさび、キャベツ、クレソン、芽キャベツ、カリフラワー、大根、からみ大根、ナタネ、ブロッコリー、タカナ、カラシナ、カブ、ハクサイなどのアブラナ科植物群から選択される一種又は複数種から得られるものが好ましい。その中で、６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの含有率が高い本わさび（ＷａｓａｂｉａＪａｐｏｎｉｃａ）がより好ましく、本わさび葉又は本わさび根茎いずれを用いてもよいが、より含有率の高い本わさび根茎が特に好ましい。

ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートの調製方法を説明すると、例えば、以下のとおりである。

例えば、Ｋｉａｅｒらの方法に従って（Ｋｉａｅｒｅｔａｌ．Ａｃｔａｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ、１１、１２９８、１９５７年）、出発物質としてω－クロロアルケノールを用い、ＣＨ３－ＳＮａと還流してω－メチルチオアルケノールを得、これにＳＯＣｌ_２を作用させてω－クロロアルケノールメチルサルファイドを得る。

例えば、次に、Ｇａｂｒｉｅｌ法を用いてアミノ基を導入し、Ｎ－（ω－メチルチオアルキル）－フタルイミドを生成し、これにヒドラジン水化物を加えて還流し、ω－メチルチオアルキルアミンを得る。さらに、Ｌｉらの方法（Ｌｉｅｔａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６２、４５３９、１９９７年）に従い、チウラムジスルフィドを経て得られたω－メチルチオアルキルイソチオシアネートをｍＣＰＢＡでメチルチオ基を酸化し、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートを得る。

例えば、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートを含有するアブラナ科植物からの抽出に当たっては、植物体を粉砕若しくはすりおろしの物理的手段で抽出の前処理に供し、水やメタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、ジクロロエタンなどの有機溶媒で抽出するか、水蒸気蒸溜や分子蒸溜などの蒸溜法で抽出することが好ましいが、特にこれらの方法に限定されるものではない。

例えば、本わさびの有機溶剤での具体的抽出方法を示すと、本わさびの根茎をすりおろした後、酢酸エチル溶媒で抽出し、この抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水の後、エバポレータで濃縮し、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートを得る。この方法は特に６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの抽出に最適である。６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートは、市販のものを用いてもよく、例えば、金印株式会社製のわさびスルフィニル（登録商標）（６－ＭＳＩＴＣ（登録商標））が挙げられる。

例えば、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートのクレソンからの抽出の場合も、本わさびと同様に抽出される。例えば、クレソンをすりつぶした後、酢酸エチル溶媒で抽出し、この抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水の後、エバポレータで濃縮し、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートを得る。この方法は特に、７－メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネートや８－メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートの抽出に最適である。

なお、上述の抽出液は抽出、濃縮の後、液液分配法、クロマトグラフィー、分子蒸溜、精留など、任意の方法によって精製される。精製手段の前後に、熱風乾燥、凍結乾燥などの乾燥手段を組み合わせてもよい。

本発明において、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートは、具体的には、アリルイソチオシアネート、第２級ブチルイソチオシアネート、３－ブテニルイソチオシアネート、４－ペンテニルイソチオシアネート、５－ヘキセニルイソチオシアネート、５－メチルチオペンチルイソチオシアネート、６－メチルチオヘキシルイソチオシアネート、７－メチルチオヘプチルイソチオシアネート、８－メチルチオオクチルイソチオシアネートなどが挙げられる。

本発明において、さらにω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート以外の成分を含んでもよく、これらの成分は、上述の方法により植物体から抽出する以外に、各種化学合成法により合成されてもよい。当業者は、当該分野で周知の方法によりこれらの成分を合成することができる。

本発明において、「生理学的に許容し得る塩」は、生理学的効果を保持し、また生理学的か、若しくはそうでない理由で望ましくないものではない遊離塩基又は遊離酸の特性を保持する塩を意味する。本発明において、生理学的に許容し得る塩として、例えば、薬学的に許容される塩が挙げられる。

＜老化抑制剤＞
本発明の老化抑制剤は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含有し、老化を抑制できる。

本発明において、「老化の抑制」とは、例えば、老化に伴う身体の生理学的変化を抑制することを意味し、例えば、老化を遅延すること、老化に関連する疾患又は症状と関係する体の状態を改善することが含まれる。老化に伴う身体の生理学的変化としては、例えば運動能力の低下を含む身体能力の低下が挙げられる。本発明の老化抑制剤は、老化を遅延することから、例えば、老化遅延剤ともいえる。

本発明において、「老化に関連する疾患又は症状」とは、例えば、老化に伴って発症する疾患又は症状を意味し、具体的には、肺気腫（加齢に起因するものを含む）；慢性閉塞肺疾患（ＣＯＰＤ）；骨粗しょう症；アルツハイマー；網膜変性症；メンケベルグ型動脈硬化等の動脈硬化；成長障害；早期死亡；骨密度低下；卵巣、子宮及び精巣の顕著な萎縮；小脳のプルキンエ細胞の脱落；胸腺の顕著な萎縮；胃壁、皮膚、気管、心臓弁、動脈の中膜等の軟部組織の石灰化；動脈の内膜の肥厚；皮膚の萎縮；毛根の減少；皮下脂肪の消失；運動能低下；異常歩行；成長ホルモン分泌顆粒の減少が挙げられる。

本発明の老化抑制剤は、例えば、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を抑制できる。したがって、本発明の老化抑制剤は、例えば、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因する疾患又は症状と関係する体の状態を改善できる。Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因する疾患又は症状は、その疾患又は症状がＣａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因すればよく、例えば、前述の疾患又は症状が挙げられる。

＜軟部組織の石灰化抑制剤＞
本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含有し、軟部組織の石灰化を抑制できる。

本発明において、「軟部組織の石灰化」とは、例えば、軟部組織にカルシウム塩が沈着する現象あるいは沈着した状態を意味する。ここで、「軟部組織」とは、例えば、生体における骨格以外の支持組織のことを意味し、例えば、結合組織、血管、横紋筋、平滑筋、末梢神経組織等が含まれる。また、本発明において、「軟部組織の石灰化」は、「異所性石灰化」ともいえ、血管壁、内臓（例えば、心臓、肺、腎臓、肝臓等が挙げられる）等における石灰化を含む。

本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、軟部組織の石灰化を抑制できることから、例えば、軟部組織の石灰化（異所性石灰化）に起因する疾患又は症状と関係する体の状態を改善できる。軟部組織の石灰化に起因する疾患又は症状は、その疾患又は症状が軟部組織の石灰化（異所性石灰化）に起因すればよく、例えば、肺気腫（喫煙に起因するものを含む）、動脈硬化（メンケベルグ型動脈硬化及び人工透析に伴う動脈硬化を含む）、肝硬変等が挙げられる。なお、本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様、例えば、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を抑制でき、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因する疾患又は症状と関係する体の状態を改善できる。

＜肺組織破壊抑制剤＞
本発明の肺組織破壊抑制剤は、ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含有し、肺組織の破壊を抑制できる。

本発明において、「肺組織破壊の抑制」とは、例えば、肺胞を含む肺に関連する組織の破壊の阻害、減少、遅延等を意味し、例えば、肺胞と肺胞とを仕切る肺胞壁の破壊の阻害、減少、遅延等を含む。肺組織の破壊は、例えば、Ｃａｌｐａｉｎ－１の作用によるものを含む。

本発明の肺組織破壊抑制剤は、肺組織破壊を抑制できることから、例えば、肺組織破壊に起因する疾患又は症状と関係する体の状態を改善できる。肺組織破壊に起因する疾患又は症状は、その疾患又は症状が肺組織破壊に起因すればよく、例えば、肺気腫（喫煙に起因するものを含む）が挙げられる。なお、本発明の肺組織破壊抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様、例えば、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を抑制でき、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因する疾患又は症状と関係する体の状態を改善できる。

＜老化抑制剤を有効成分及び／又は添加剤として含む、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料＞
本発明の老化抑制剤は、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料に配合することができる。また、本発明の一態様は、老化抑制剤を有効成分及び／又は添加剤として含む、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料である。本発明の好ましい態様は、本発明の老化抑制剤を含む、内服用の医薬品（内服用の医薬部外品を含む）及び飲食品が挙げられる。

本発明の老化抑制剤を飲食品に配合する場合、本発明の老化抑制剤の他に、甘味料、着色料、保存料、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、糊剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤（防ばい剤）、イーストフード、ガムベース、香料、酸味料、調味料、乳化剤、ｐＨ調整剤、かんすい、膨脹剤、栄養強化剤、その他飲食品素材等を混合して、所望の形態に調製すればよい。本発明の老化抑制剤を含む飲食品の形態は、特に制限されるものではない。例えば、ゲル状剤、顆粒、細粒、カプセル、錠剤、粉末、液剤、半固形剤等のサプリメントタイプの食品；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、アルコール飲料、果汁飲料、茶類、栄養飲料等の飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；ガム、タブレット、キャンディー、クッキー、グミ、せんべい、ビスケット、ゼリー等の菓子類；パン、麺類、シリアル、ジャム、調味料等が挙げられる。これらの食品は、例えば、一般の飲食品の他、栄養補助食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等のニュートラシューティカルとしても使用できる。

本発明の老化抑制剤を医薬品（医薬部外品を含む）に配合する場合、本発明の老化抑制剤の他に、必要に応じて、他の薬効成分、薬学的に許容される担体や添加剤等を任意に配合してもよい。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤化剤、緩衝剤、保存剤、香料等が挙げられる。本発明の老化抑制剤を含む医薬品の形態は、特に制限されるものではない。例えば、注射剤、外用剤、吸入剤、座剤、フィルム剤、トローチ剤、液剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、点眼剤、洗眼剤、点鼻剤等が挙げられる。また、経口投与に適した形態（即ち、内服用医薬品）が好ましく、例えば、トローチ剤、液剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等が挙げられる。これらの医薬品（医薬部外品を含む）は、老化抑制用の医薬品として使用される。

本発明の老化抑制剤を化粧料（機能性化粧料を含む）又は外用医薬部外品に配合する場合、本発明の老化抑制剤に加えて、薬学的又は香粧学的に許容される担体（水、油性成分等）を配合して、所望の形態に調製することができる。化粧料としては、皮膚に適用可能である限り、その形態は、特に制限されるものではない。例えば、液状、乳液状、粉末状、固形状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、ムース状、顆粒状、錠剤状、ゲル状、ゼリー状、ペースト状、ジェル状、エアゾール状、スプレー状、リニメント剤、パック剤等の形態が挙げられる。これらの化粧料は、老化抑制作用を有する化粧料として使用される。

更に、本発明の老化抑制剤は、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料への添加剤としても使用でき、本発明の老化抑制剤を含有する飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料によれば、本発明の老化抑制剤に起因する効果が得られる。本発明の老化抑制剤を飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料に配合することによって、老化抑制作用を付与することができる。本発明の老化抑制剤は、内服用の医薬品（内服用の医薬部外品を含む）及び飲食品への老化抑制剤機能の付与に使用することができる。

本発明の老化抑制剤が添加剤として使用される場合も、配合される飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料の形態等は限定されず、前述した飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料の形態等が挙げられる。

飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料における本発明の老化抑制剤の配合量は特に制限されず、適用の目的（対象疾患や症状の種類等）、適用対象部位、適用者の性別や年齢、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料の形態、これらの投与又は摂取方法や回数、嗜好等に応じて適宜設定される。従って、本発明の老化抑制剤の飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料への配合量は制限されないが、例えば、本発明の老化抑制剤は、成人１日当たりの適用量が、前記ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートが総量で０．１～１００ｍｇ、好ましくは０．１～７０ｍｇ、さらに好ましくは０．５～５０ｍｇ、特に好ましくは０．５～３０ｍｇとなるよう配合することが例示される。また、前述したように、前記ω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートは本わさび、西洋わさび、キャベツ、クレソン、芽キャベツ、カリフラワー、大根、からみ大根、ナタネ、ブロッコリー、タカナ、カラシナ、カブ、及びハクサイ等のアブラナ科植物から抽出・精製処理して得ることをはじめ、これらの成分は植物から抽出・精製処理して得ることができ、この過程で得られる抽出物そのものを本発明の老化抑制剤としてもよく、この抽出物そのものを本発明の老化抑制剤とする場合には、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料に対して、抽出物を成人１日当たりの適用量として、０．０１～１．０ｇ、好ましくは０．０１～０．７ｇ、さらに好ましくは０．０５～０．５ｇ、特に好ましくは０．０５～０．３ｇの範囲で配合することが望ましい。

＜軟部組織の石灰化抑制剤を有効成分及び／又は添加剤として含む、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料＞
本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様にして、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料に配合することができる。また、本発明の一態様は、軟部組織の石灰化抑制剤を有効成分及び／又は添加剤として含む、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料である。本発明の好ましい態様は、本発明の軟部組織の石灰化抑制剤を含む、内服用の医薬品（内服用の医薬部外品を含む）及び飲食品が挙げられる。

＜肺組織破壊抑制剤を有効成分及び／又は添加剤として含む、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料＞
本発明の肺組織破壊抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様にして、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料に配合することができる。また、本発明の一態様は、肺組織破壊抑制剤を有効成分及び／又は添加剤として含む、飲食品（機能性表示食品、特定保健食品）、医薬品、化粧料である。本発明の好ましい態様は、本発明の組織破壊抑制剤を含む、内服用の医薬品（内服用の医薬部外品を含む）及び飲食品が挙げられる。

＜医薬用途＞
本発明の老化抑制剤等は、例えば、老化に関連する疾患又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。老化に関連する疾患又は症状とは、例えば、前述の通りである。本発明の老化抑制剤は、特に、肺気腫又は動脈硬化の予防及び／又は治療に使用することに適している。

本発明の老化抑制剤等は、前述のように、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を抑制できることから、例えば、Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因する疾患又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化に起因する疾患又は症状とは、例えば、前述の通りである。

本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様、老化に関連する疾患又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。

本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、前述のように、軟部組織の石灰化（異所性石灰化）を抑制できることから、例えば、軟部組織の石灰化（異所性石灰化）に起因する疾患又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。軟部組織の石灰化（異所性石灰化）に起因する疾患又は症状とは、例えば、前述の通りである。

本発明の肺組織破壊抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様、老化に関連する疾患又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。

本発明の肺組織破壊抑制剤は、前述のように、肺組織破壊を抑制できることから、例えば、肺組織破壊に起因する疾患又は症状の予防及び／又は治療に使用することができる。肺組織破壊に起因する疾患又は症状とは、例えば、前述の通りである。

＜表示等＞
本発明において、本発明の老化抑制剤に係る商品、商品の包装、商品に係る情報、又は商品に係る広告（例えば、取引書類、取扱い説明書、添付文書、通信販売のカタログやインターネットサイト等）には、「アンチエイジング」、「加齢に伴う病気の予防」、又は「若さを保つ」等と表示をすることもでき、更にそれらに類似する表示をすることもできる。

また、本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、「喫煙による悪影響をおさえる」、「人工透析における悪影響をおさえる」、又は「異常な石灰を抑制する」ために使用することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣの老化モデルマウスに対する老化抑制効果：α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス＞
α－ｋｌｏｔｈｏヘテロ欠損マウス同士の交配により出生してきたα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスを使用した。α－ｋｌｏｔｈｏＫＯは、３週齢直前のマウスから尾の一部を採取し、ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行い、ＰＣＲにより決定した。飼育は８：００－２０：００の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。４１．７ｐｐｍの６－ＭＳＩＴＣを混水投与した。ｃｏｎｔｒｏｌ群としては水を飲水させた。６－ＭＳＩＴＣ投与４－５週間後のマウスに麻酔後、心臓から４％ＰＦＡで還流固定を行った。還流固定後、採取した臓器を４％ＰＦＡで浸漬固定（４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）後にＰＢＳで洗浄し、パラフィン切片の作製、Ｈ＆Ｅ染色、コッサ染色を行った。なお、パラフィン切片の作製から染色までは京都大学解剖センターに依頼した。

水又は６－ＭＳＩＴＣを投与したα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスの組織学的解析の結果を図１に示す。７－８週齢時のα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスの表現型として、大動脈の石灰化、肺気腫等が観察されるが、カルシウム沈着を検出するコッサ染色の結果より、６－ＭＳＩＴＣを投与したマウスでは大動脈の石灰化が抑制されていた。また、Ｈ＆Ｅ染色の結果より、６－ＭＳＩＴＣを投与しなかったマウスでは、肺胞と肺胞とを仕切る肺胞壁の破壊による肺胞の拡大が見られ、肺気腫が生じていたのに対し、６－ＭＳＩＴＣを投与したマウスでは、肺胞の拡大が見られず、肺気腫が抑制されていた。これらの結果は、６－ＭＳＩＴＣが、老化モデルマウスにおける老化症状を抑制することを示している。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣの肺気腫及び異所性石灰化抑制効果：Ｗｉｌｄｔｙｐｅマウス及びα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス＞
α－ｋｌｏｔｈｏヘテロ欠損マウス同士の交配により出生してきたα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス及びＷｉｌｄｔｙｐｅマウスを使用した。それぞれ、３週齢直前のマウスから尾の一部を採取し、ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行うことで、遺伝子型を決定した。６－ＭＳＩＴＣ投与を３－４週間とした以外は、実施例１と同様にして、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス及びＷｉｌｄｔｙｐｅマウスを処置し、パラフィン切片の作製、Ｈ＆Ｅ染色、コッサ染色を行った。パラフィン切片の作製、Ｈ＆Ｅ染色、コッサ染色は、以下の通り行った。まず、包埋したパラフィン切片をミクロトーム（ＲＭ２２３５、ＬｅｉｃａＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）で４μｍに薄切後、スライドガラスに貼り付け、４０℃で１～２時間インキュベーションした。パラフィン切片を、キシレン漕に１０分間浸水を３回、１００％エタノール漕に１０分間浸水を３回、９０％エタノール漕に１０分間浸水を１回、８０％エタノール漕に１０分間浸水を１回、７０％エタノール漕に１０分間浸水を１回ずつ行うことで、脱パラフィンを行った。ＨＥ染色では、脱パラフィン後の切片を蒸留水で切片に水がなじむまで水洗後に、マイヤーヘマトキシリン液で１０分間浸水後に、３７℃の水で軽く水洗し、３７℃の水で５分間浸水した。７０％エタノールになじませ、１％エオシン漕に１分３０秒間浸水した。１００％エタノール漕で１０回出没を４回行った後に、キシレン漕で１０回出没を４回行った。キシレンで透徹した切片をマリノール（武藤化学、品番２００９２）で封入し、顕微鏡で観察した。コッサ染色では、脱パラフィン後の切片を蒸留水で切片に水がなじむまで水洗後に、５％硝酸銀溶液に一晩浸水した。蒸留水で水洗後に５％チオ硫酸ナトリウム溶液に２～３分浸水させた。蒸留水で５分間水洗後、ケルンエヒトロート溶液（ヌクレアファストレッド０．１％，硫酸アルミニウム５％））に５分浸水した。蒸留水で５分間水洗後、１００％エタノール漕で１０回出没を４回行った後に、キシレン漕で１０回出没を４回行った。キシレンで透徹した切片をマリノール（武藤化学、品番２００９２）で封入し、顕微鏡で観察した。

水又は６－ＭＳＩＴＣを投与したＷｉｌｄｔｙｐｅマウス及びα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスの、肺及び腎臓の組織学的解析の結果を、図２－１及び図２－２にそれぞれ示す。６－７週齢時のα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスの表現型として、肺気腫、腎臓の石灰化等が観察されるが、カルシウム沈着を検出するコッサ染色の結果（図２－２）より、６－ＭＳＩＴＣを投与したα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスでは腎臓の石灰化が抑制されていた。（腎臓の画像において、矢印で示す茶褐色部分は石灰化を示す。）また、Ｈ＆Ｅ染色の結果（図２－１）より、６－ＭＳＩＴＣを投与しなかったα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスでは、肺胞と肺胞とを仕切る肺胞壁の破壊による肺胞の拡大が見られ、肺気腫が生じていたのに対し、６－ＭＳＩＴＣを投与したα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスでは、肺胞の拡大が見られず、肺気腫が抑制されていた。なお、Ｗｉｌｄｔｙｐｅは、実験上のコントロールとして示している。これらの結果は、６－ＭＳＩＴＣが、老化モデルマウスにおける老化症状を抑制することを示している。また、これらの結果は、６－ＭＳＩＴＣが肺気腫及び異所性石灰化抑制効果を有することを示している。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣのＣａｌｐａｉｎ－１活性化抑制効果：α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス＞
ヒト老化様症状の病態モデルマウスとして、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスを使用した。飼育は８：００－２０：００の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。α－ｋｌｏｔｈｏヘテロ欠損マウスは自家繁殖を行い、２週齢直前に尾を採取しＰＣＲ法を用いたＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇにより、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスを選別した。２週齢の雄性α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウスに６－ＭＳＩＴＣ５ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与を６日間連続で行った。ｃｏｎｔｒｏｌ群としては生理食塩水（大塚製薬、大塚生食注）を投与した。肺組織単離後に、肺重量の５０倍量のＰｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ含有ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ（ナカライテスク、型番：０８７１４－０４）を加え、バイオマッシャーＳＰ（ＮＩＰＰＩ、型番：８９３１６３）にてホモジナイズした。ホモジナイズ後、氷上で３０分間インキュベートし、１６，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間で遠心を行い、上清を回収した。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、型番：２３２２７）で行った。タンパク定量後、ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒを加え９５℃で５分間インキュベーションした肺組織抽出液をｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔサンプルとした。７．５％又は４－２０％ｇｒａｄｉｅｎｔゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、タンパク分離した。膜を転写後、ｗａｓｈ（５分間ｘ３）、５％スキムミルクで１時間ブロッキング、洗浄（１０分間ｘ２、５分間ｘ１）、１次抗体としてＡｎｔｉ－Ｃａｌｐａｉｎ－１ｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔａｎｔｉｏｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、型番：＃２５５６）、Ａｎｔｉ－Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、型番：＃４１４６）、Ａｎｔｉ－Ａｌｐｈａｆｏｄｒｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＡＢＣＡＭ、型番：ＡＢ１１７５５）、Ａｎｔｉ－ｂ－ａｃｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、型番：＃４９６７）を用い、４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた。１次抗体反応後、洗浄（１０分間ｘ２、５分間ｘ１）、２次抗体としてＥＣＬ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧＨＲＰ抗体（希釈倍率１：１００００、ＧＥＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、型番：ＬＮＡ９３４Ｖ／ＡＧ）を用い室温で１時間反応させた。ｗａｓｈ（１０分間ｘ３）後にＥＣＬＰｒｉｍｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＧＥＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、型番：ＲＰＮ２２３６）と反応後、富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ１００にてバンドを検出した。

肺組織でのＣａｌｐａｉｎ－１活性化を、前記肺組織抽出液についてｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔでのバンドパターンを解析することにより評価した。図３に示すように、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／Ｃｏｎｔｒｏｌ群とα－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／６－ＭＳＩＴＣ群とを比較すると、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／６－ＭＳＩＴＣ群では、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し、（Ｉ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を示すＣａｌｐａｉｎ－１のｃｌｅａｖａｇｅバンド（Ａｃｔｉｖｅｆｏｒｍ）の発現の抑制、（ＩＩ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の基質である細胞骨格のタンパク質α－II ｓｐｅｃｔｒｉｎ（α－ｆｏｄｒｉｎの別名表記）分解産物を示すα－II ｓｐｅｃｔｒｉｎのｃｌｅａｖａｇｅバンドの減少、（ＩＩＩ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の内在性阻害剤であるＣａｌｐａｓｔａｔｉｎのより多くの残存が見られた。これらの結果は、６－ＭＳＩＴＣはＣａｌｐａｉｎ－１活性化を抑制することにより、肺組織損傷を抑制していることを示している。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣのＣａｌｐａｉｎ－１活性化抑制効果：Ｗｉｌｄｔｙｐｅマウス及びα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス＞
α－ｋｌｏｔｈｏヘテロ欠損マウス同士の交配により出生してきたα－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス及びＷｉｌｄｔｙｐｅマウスを使用した。２週齢直前に尾を採取しＰＣＲ法を用いたＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇにより、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス及びＷｉｌｄｔｙｐｅマウスを選別した。実施例３と同様にして、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯマウス及びＷｉｌｄｔｙｐｅマウスを処置し、それぞれの肺組織抽出液について、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔによる解析を行った。

図４に、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔの結果を示す。図４Ａは、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔのバンドバターンを示す画像である。図４ＢおよびＣは、Ｃａｌｐａｉｎ－１及びα－II ｓｐｅｃｔｒｉｎについて、インタクトのバンド強度に対するｃｌｅａｖａｇｅバンド強度の割合を示すグラフである。バンド強度は、画像解析ソフトであるＩｍａｇｅＪにより定量化した。図４Ａ～Ｃに示す通り、Ｗｉｌｄｔｙｐｅ／Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝３）とα－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝３）を比較すると、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、Ｉ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を示すＣａｌｐａｉｎ－１のｃｌｅａｖａｇｅバンド（Ａｃｔｉｖｅｆｏｒｍ）の発現の亢進、（ＩＩ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の基質である細胞骨格のタンパク質α－II ｓｐｅｃｔｒｉｎ（α－ｆｏｄｒｉｎの別名表記）分解産物を示すα－II ｓｐｅｃｔｒｉｎのｃｌｅａｖａｇｅバンドの増加がみられ、Ｃａｌｐａｉｎ－１活性化による肺組織細胞骨格の分解がみられた。一方、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／６－ＭＳＩＴＣ群（ｎ＝３）では、α－ｋｌｏｔｈｏＫＯ／Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し、（Ｉ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の活性化を示すＣａｌｐａｉｎ－１のｃｌｅａｖａｇｅバンド（Ａｃｔｉｖｅｆｏｒｍ）の発現の抑制、（ＩＩ）Ｃａｌｐａｉｎ－１の基質である細胞骨格のタンパク質α－II ｓｐｅｃｔｒｉｎ（α－ｆｏｄｒｉｎの別名表記）分解産物を示すα－II ｓｐｅｃｔｒｉｎのｃｌｅａｖａｇｅバンドの減少がみられた。これらの結果は、６－ＭＳＩＴＣはＣａｌｐａｉｎ－１活性化を抑制することにより、肺組織損傷を抑制していることを示している。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣの老化抑制効果：ＳＡＭＰ１マウス＞
老化マウスモデルとして、ＳＡＭ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｄＭｏｕｓｅ）Ｐ１を使用した。飼育は８：００－２０：００の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。１７週齢のＳＡＭＰ１マウスを日本ＳＬＣより購入し、２０週齢のＳＡＭＰ１マウスに４１．７ＰＰＭの６－ＭＳＩＴＣを混水投与した（６－ＭＳＩＴＣ群）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群としては水を投与した。６４週齢時に運動テストとして協調運動、筋力、平衡感覚を評価するビームバランステスト（Ｂｅａｍｂａｌａｎｃｅｔｅｓｔ）を行った。ビームバランステスト装置として、地面より高さ５０ｃｍの位置に地面と平行に直径２４ｃｍ、長さ９５ｃｍの棒を設置し、棒の片端にゴール地点として退避場所を設置し反対側にスタート地点を設定した。そして、スタート地点からマウスが８０ｃｍを移動するのに要した時間を測定することにより運動能力を評価した。１匹のマウスにつき３回テストを行い、平均値をそのマウスの走行時間値とした。なお、マウスは事前にスタート地点から退避場所に移動するように数日間訓練したマウスを用いた。

前述の通り、協調運動、筋力、平衡感覚を評価するビームバランステストを行った結果を表１及び図５に示す。表１及び図５に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝３）と比べ６－ＭＳＴＩＣ投与群（ｎ＝３）では、足場が不安定なスタート地点から安全な退避場所に移動する際の移動時間が早かったことから、６－ＭＳＩＴＣ投与したマウスでは運動能力の低下が抑制・遅延されていることが示された。運動能力の低下は老化で顕著に起こる現象であるため、この結果は、６－ＭＳＩＴＣが老化の進展を抑制することを示している。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣの老化抑制効果：ＳＡＭＰ１マウス＞
老化マウスモデルとして、ＳＡＭ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｄＭｏｕｓｅ）Ｐ１を使用した。飼育は８：００－２０：００の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。１７週齢のＳＡＭＰ１マウスを日本ＳＬＣより購入し、２０週齢のＳＡＭＰ１マウスに４１．７ＰＰＭの６－ＭＳＩＴＣを混水投与した（６－ＭＳＩＴＣ群）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群としては水を投与した。７７週齢時のマウスの外見評価後、心臓から４％ＰＦＡで還流固定を行った。還流固定後、採取した臓器を４％ＰＦＡで浸漬固定（４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）後にＰＢＳで洗浄し、パラフィン切片の作製、Ｈ＆Ｅ染色を行った。パラフィン切片の作製、Ｈ＆Ｅ染色は、以下の通り行った。まず、包埋したパラフィン切片をミクロトーム（ＲＭ２２３５、ＬｅｉｃａＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）で４μｍに薄切後、スライドガラスに貼り付け、４０℃で１～２時間インキュベーションした。パラフィン切片を、キシレン漕に１０分間浸水を３回、１００％エタノール漕に１０分間浸水を３回、９０％エタノール漕に１０分間浸水を１回、８０％エタノール漕に１０分間浸水を１回、７０％エタノール漕に１０分間浸水を１回ずつ行うことで、脱パラフィンを行った。脱パラフィン後の切片を水洗後、マイヤーヘマトキシリン液で１０分間浸水後に、３７℃の水で軽く水洗し、３７℃の水で５分間浸水した。７０％エタノールになじませ、１％エオシン漕に１分３０秒間浸水した。１００％エタノール漕で１０回出没を４回行った後に、キシレン漕で１０回出没を４回行った。キシレンで透徹した切片をマリノール（武藤化学、品番２００９２）で封入し、顕微鏡で観察した。

６－ＭＳＩＴＣを投与したＳＡＭＰ１マウスの皮膚の外見所見と組織学的解析の結果を図６及び図７に示す。ＳＡＭＰ１マウスは週齢の進行に伴い目周囲に糜爛がみられる。図６に示す通り、ＳＡＭＰ１／Ｃｏｎｔｒｏｌ群マウスは３匹中３匹で糜爛を呈していたが、ＳＡＭＰ１／６－ＭＳＩＴＣ群マウスでは２匹中１匹が糜爛を呈しており、糜爛を呈していないマウスの外見は正常であった。また、皮膚の組織学的所見として、図７に示す通り、ＳＡＭＰ１／Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群マウスと比較して、ＳＡＭＰ１／６－ＭＳＩＴＣ群マウスでは脂肪組織の厚さならびに構造が保たれていた。これらの結果は、６－ＭＳＩＴＣが老化の進展を抑制することを示している。

＜ワサビ含有物６－ＭＳＩＴＣのＣａｌｐａｉｎ－１活性化抑制効果＞
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの病態モデルマウスとして、Ｃ５７／ＢＬ１０－ｍｄｘマウスを使用した。Ｗｉｌｄｔｙｐｅマウスとして遺伝的ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄであるＣ５７ＢＬ／１０マウスを使用した。飼育は８：００－２０：００の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。ｍｄｘマウスは自家繁殖を行い、Ｃ５７ＢＬ／１０マウスは日本ＳＬＣより購入した。４週齢の雄性ｍｄｘマウス、雄性Ｃ５７ＢＬ／１０マウスに１２５．１ｐｐｍ６－ＭＳＩＴＣを４週間混水投与した。ｃｏｎｔｒｏｌ群としては水を飲水させた。腓腹筋単離後に、筋重量の５０倍量のＰｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ含有ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ（ナカライテスク、型番：０８７１４－０４）を加え、バイオマッシャーＳＰ（Ｎｉｐｐｉ、型番：８９３１６３）にてホモジナイズした。ホモジナイズ後、氷上で３０分間インキュベートし、１６，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間で遠心を行い、上清を回収した。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、型番：２３２２７）で行った。タンパク定量後、ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒを加え９５℃で５分間インキュベーションした筋抽出液をｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔサンプルとした。７．５％又は４－２０％ｇｒａｄｉｅｎｔゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、タンパク分離した。膜を転写後、ｗａｓｈ（５分間ｘ３）、５％スキムミルクで１時間ブロッキング、洗浄（１０分間ｘ２、５分間ｘ１）、１次抗体としてＣａｌｐａｉｎ－１Ｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔａｎｔｉｏｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、型番：＃２５５６）、ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、型番：＃４１４６）、ｂ－Ａｃｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（希釈倍率１：１０００、ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、型番：＃４９６７）を用い、４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた。１次抗体反応後、洗浄（１０分間ｘ２、５分間ｘ１）、２次抗体としてＥＣＬ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧＨＲＰ抗体（希釈倍率１：１００００、ＧＥＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、型番：ＬＮＡ９３４Ｖ／ＡＧ）を用い室温で１時間反応させた。ｗａｓｈ（１０分間ｘ２、５分間ｘ１）後にＥＣＬＰｒｉｍｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＧＥＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、型番：ＲＰＮ２２３６）と反応後、富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ１００にてバンドを検出した。

腓腹筋抽出液でのＣａｌｐａｉｎ－１活性化をｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔでのバンドパターンより評価したところ、図８に示すように、ｍｄｘ／ｃｏｎｔｒｏｌ群とｍｄｘ／６－ＭＳＩＴＣ群を比較すると、ｍｄｘ／６－ＭＳＩＴＣ群では完全長（ｉｎｔａｃｔ）のＣａｌｐａｉｎ－１が有意に残存し、かつｃｌｅａｖａｇｅバンドの減少がみられた。これは、６－ＭＳＩＴＣ投与によりＣａｌｐａｉｎ－１活性化が抑制（ｐ＝０．０２０）されていることを示している。また、Ｃａｌｐａｉｎ－１の内在性阻害物質であるＣａｌｐａｓｔａｔｉｎ発現量を評価したところ、図９に示すように、ｍｄｘ／ｃｏｎｔｒｏｌ群とｍｄｘ／６－ＭＳＩＴＣ群を比較すると、ｍｄｘ／６－ＭＳＩＴＣ群ではＣａｌｐａｓｔａｉｎが多く残存していた（ｐ＝０．００４９）。ＣａｌｐａｓｔａｔｉｎはＣａｌｐａｉｎ－１の基質として作用することが知られていることから、この結果は、Ｃａｌｐａｉｎ－１が基質を分解していないことを示している。なお、有差検定はｍｄｘ／ｃｏｎｔｒｏｌ群とｍｄｘ／６－ＭＳＩＴＣ群間でＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ－ｔｅｓｔを行った。有意差は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１とする。

本発明のω－メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤は、飲食品、医薬品又は化粧料に使用することができる。

Claims

６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する軟部組織の石灰化抑制剤。
６－メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する肺組織破壊抑制剤。
軟部組織の石灰化に起因する疾患若しくは症状の治療又は予防用である、請求項１に記載の軟部組織の石灰化抑制剤。
疾患又は症状が、肺気腫；動脈硬化；肝硬変からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項３に記載の軟部組織の石灰化抑制剤。
飲食品、医薬品又は化粧料の形態である、請求項１、３又は４に記載の軟部組織の石灰化抑制剤。
肺組織破壊に起因する疾患若しくは症状の治療又は予防用である、請求項２に記載の肺組織破壊抑制剤。
疾患又は症状が、肺気腫である、請求項６に記載の肺組織破壊抑制剤。
飲食品又は医薬品の形態である、請求項２、６又は７に記載の肺組織破壊抑制剤。