JP7068704B2 - 老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤 - Google Patents
老化抑制剤、軟部組織の石灰化抑制剤、及び肺組織破壊抑制剤 Download PDFInfo
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Description
本発明において、ω-メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネートは化学的に合成された物質であってもよく、また、アブラナ科植物から得られた抽出物としての天然物であってもよい。これら物質として、具体的には5-メチルスルフィニルペンチルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、7-メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネート及び8-メチルスルフィニルオクチルイソチオシアネートが挙げられるが、本発明の目的を達成するためには、特に6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートが好ましい。
本発明の老化抑制剤は、ω-メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含有し、老化を抑制できる。
本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、ω-メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含有し、軟部組織の石灰化を抑制できる。
本発明の肺組織破壊抑制剤は、ω-メチルスルフィニルアルキルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含有し、肺組織の破壊を抑制できる。
本発明の老化抑制剤は、飲食品(機能性表示食品、特定保健食品)、医薬品、化粧料に配合することができる。また、本発明の一態様は、老化抑制剤を有効成分及び/又は添加剤として含む、飲食品(機能性表示食品、特定保健食品)、医薬品、化粧料である。本発明の好ましい態様は、本発明の老化抑制剤を含む、内服用の医薬品(内服用の医薬部外品を含む)及び飲食品が挙げられる。
本発明の軟部組織の石灰化抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様にして、飲食品(機能性表示食品、特定保健食品)、医薬品、化粧料に配合することができる。また、本発明の一態様は、軟部組織の石灰化抑制剤を有効成分及び/又は添加剤として含む、飲食品(機能性表示食品、特定保健食品)、医薬品、化粧料である。本発明の好ましい態様は、本発明の軟部組織の石灰化抑制剤を含む、内服用の医薬品(内服用の医薬部外品を含む)及び飲食品が挙げられる。
本発明の肺組織破壊抑制剤は、本発明の老化抑制剤と同様にして、飲食品(機能性表示食品、特定保健食品)、医薬品、化粧料に配合することができる。また、本発明の一態様は、肺組織破壊抑制剤を有効成分及び/又は添加剤として含む、飲食品(機能性表示食品、特定保健食品)、医薬品、化粧料である。本発明の好ましい態様は、本発明の組織破壊抑制剤を含む、内服用の医薬品(内服用の医薬部外品を含む)及び飲食品が挙げられる。
本発明の老化抑制剤等は、例えば、老化に関連する疾患又は症状の予防及び/又は治療に使用することができる。老化に関連する疾患又は症状とは、例えば、前述の通りである。本発明の老化抑制剤は、特に、肺気腫又は動脈硬化の予防及び/又は治療に使用することに適している。
本発明において、本発明の老化抑制剤に係る商品、商品の包装、商品に係る情報、又は商品に係る広告(例えば、取引書類、取扱い説明書、添付文書、通信販売のカタログやインターネットサイト等)には、「アンチエイジング」、「加齢に伴う病気の予防」、又は「若さを保つ」等と表示をすることもでき、更にそれらに類似する表示をすることもできる。
α-klothoヘテロ欠損マウス同士の交配により出生してきたα-klotho KOマウスを使用した。α-klotho KOは、3週齢直前のマウスから尾の一部を採取し、genotypingを行い、PCRにより決定した。飼育は8:00-20:00の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。41.7 ppmの6-MSITCを混水投与した。control群としては水を飲水させた。6-MSITC投与4-5週間後のマウスに麻酔後、心臓から4%PFAで還流固定を行った。還流固定後、採取した臓器を4%PFAで浸漬固定(4℃、overnight)後にPBSで洗浄し、パラフィン切片の作製、H&E染色、コッサ染色を行った。なお、パラフィン切片の作製から染色までは京都大学解剖センターに依頼した。
α-klothoヘテロ欠損マウス同士の交配により出生してきたα-klotho KOマウス及びWild typeマウスを使用した。それぞれ、3週齢直前のマウスから尾の一部を採取し、genotypingを行うことで、遺伝子型を決定した。6-MSITC投与を3-4週間とした以外は、実施例1と同様にして、α-klotho KOマウス及びWild typeマウスを処置し、パラフィン切片の作製、H&E染色、コッサ染色を行った。パラフィン切片の作製、H&E染色、コッサ染色は、以下の通り行った。まず、包埋したパラフィン切片をミクロトーム(RM2235、Leica BIOSYSTEMS)で4μmに薄切後、スライドガラスに貼り付け、40℃で1~2時間インキュベーションした。パラフィン切片を、キシレン漕に10分間浸水を3回、100%エタノール漕に10分間浸水を3回、90%エタノール漕に10分間浸水を1回、80%エタノール漕に10分間浸水を1回、70%エタノール漕に10分間浸水を1回ずつ行うことで、脱パラフィンを行った。HE染色では、脱パラフィン後の切片を蒸留水で切片に水がなじむまで水洗後に、マイヤーヘマトキシリン液で10分間浸水後に、37℃の水で軽く水洗し、37℃の水で5分間浸水した。70%エタノールになじませ、1%エオシン漕に1分30秒間浸水した。100%エタノール漕で10回出没を4回行った後に、キシレン漕で10回出没を4回行った。キシレンで透徹した切片をマリノール(武藤化学、品番20092)で封入し、顕微鏡で観察した。コッサ染色では、脱パラフィン後の切片を蒸留水で切片に水がなじむまで水洗後に、5%硝酸銀溶液に一晩浸水した。蒸留水で水洗後に5%チオ硫酸ナトリウム溶液に2~3分浸水させた。蒸留水で5分間水洗後、ケルンエヒトロート溶液(ヌクレアファストレッド 0.1%, 硫酸アルミニウム 5%))に5分浸水した。蒸留水で5分間水洗後、100%エタノール漕で10回出没を4回行った後に、キシレン漕で10回出没を4回行った。キシレンで透徹した切片をマリノール(武藤化学、品番20092)で封入し、顕微鏡で観察した。
ヒト老化様症状の病態モデルマウスとして、α-klotho KOマウスを使用した。飼育は8:00-20:00の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。α-klothoヘテロ欠損マウスは自家繁殖を行い、2週齢直前に尾を採取しPCR法を用いたGenotypingにより、α-klotho KOマウスを選別した。2週齢の雄性α-klotho KOマウスに6-MSITC 5 mg/kgの腹腔内投与を6日間連続で行った。control群としては生理食塩水(大塚製薬、大塚生食注)を投与した。肺組織単離後に、肺重量の50倍量のProtease inhibitor cocktail含有RIPA buffer(ナカライテスク、型番:08714-04)を加え、バイオマッシャーSP(NIPPI、型番:893163)にてホモジナイズした。ホモジナイズ後、氷上で30分間インキュベートし、16,000rpm、4℃、10分間で遠心を行い、上清を回収した。タンパク定量はPierce BCA protein assay kit(THERMO FISHER SCIENTIFIC、型番:23227)で行った。タンパク定量後、sample bufferを加え95℃で5分間インキュベーションした肺組織抽出液をwestern blotサンプルとした。7.5%又は4-20%gradientゲルでSDS-PAGEを行い、タンパク分離した。膜を転写後、wash(5分間x3)、5%スキムミルクで1時間ブロッキング、洗浄(10分間x2、5分間x1)、1次抗体としてAnti-Calpain-1 large subunit antiobody(希釈倍率1:1000、CELL SIGNALING TECHNOLOGY、型番:#2556)、Anti-Calpastatin antibody(希釈倍率1:1000、CELL SIGNALING TECHNOLOGY、型番:#4146)、Anti-Alpha fodrin antibody (希釈倍率1:1000、ABCAM、型番:AB11755)、Anti-b-actin antibody(希釈倍率1:1000、 CELL SIGNALING TECHNOLOGY、型番:#4967)を用い、4℃、overnightで反応させた。1次抗体反応後、洗浄(10分間x2、5分間x1)、2次抗体としてECL-anti-rabbit IgG HRP抗体(希釈倍率1:10000、GE HEALTHCARE、型番:LNA934V/AG)を用い室温で1時間反応させた。wash(10分間x3)後にECL Prime Detection Reagent(GE HEALTHCARE、型番:RPN2236)と反応後、富士メディカルフィルムプロセサーFPM100にてバンドを検出した。
α-klothoヘテロ欠損マウス同士の交配により出生してきたα-klotho KOマウス及びWild typeマウスを使用した。2週齢直前に尾を採取しPCR法を用いたGenotypingにより、α-klotho KOマウス及びWild typeマウスを選別した。実施例3と同様にして、α-klotho KOマウス及びWild typeマウスを処置し、それぞれの肺組織抽出液について、western blotによる解析を行った。
老化マウスモデルとして、SAM(Senescence-Accelerated Mouse)P1を使用した。飼育は8:00-20:00の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。17週齢のSAMP1マウスを日本SLCより購入し、20週齢のSAMP1マウスに41.7 PPMの6-MSITCを混水投与した(6-MSITC群)。Control群としては水を投与した。64週齢時に運動テストとして協調運動、筋力、平衡感覚を評価するビームバランステスト(Beam balance test)を行った。ビームバランステスト装置として、地面より高さ50cmの位置に地面と平行に直径24cm、長さ95cmの棒を設置し、棒の片端にゴール地点として退避場所を設置し反対側にスタート地点を設定した。そして、スタート地点からマウスが80cmを移動するのに要した時間を測定することにより運動能力を評価した。1匹のマウスにつき3回テストを行い、平均値をそのマウスの走行時間値とした。なお、マウスは事前にスタート地点から退避場所に移動するように数日間訓練したマウスを用いた。
老化マウスモデルとして、SAM(Senescence-Accelerated Mouse)P1を使用した。飼育は8:00-20:00の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。17週齢のSAMP1マウスを日本SLCより購入し、20週齢のSAMP1マウスに41.7 PPMの6-MSITCを混水投与した(6-MSITC群)。Control群としては水を投与した。77週齢時のマウスの外見評価後、心臓から4%PFAで還流固定を行った。還流固定後、採取した臓器を4%PFAで浸漬固定(4℃、overnight)後にPBSで洗浄し、パラフィン切片の作製、H&E染色を行った。パラフィン切片の作製、H&E染色は、以下の通り行った。まず、包埋したパラフィン切片をミクロトーム(RM2235、Leica BIOSYSTEMS)で4μmに薄切後、スライドガラスに貼り付け、40℃で1~2時間インキュベーションした。パラフィン切片を、キシレン漕に10分間浸水を3回、100%エタノール漕に10分間浸水を3回、90%エタノール漕に10分間浸水を1回、80%エタノール漕に10分間浸水を1回、70%エタノール漕に10分間浸水を1回ずつ行うことで、脱パラフィンを行った。脱パラフィン後の切片を水洗後、マイヤーヘマトキシリン液で10分間浸水後に、37℃の水で軽く水洗し、37℃の水で5分間浸水した。70%エタノールになじませ、1%エオシン漕に1分30秒間浸水した。100%エタノール漕で10回出没を4回行った後に、キシレン漕で10回出没を4回行った。キシレンで透徹した切片をマリノール(武藤化学、品番20092)で封入し、顕微鏡で観察した。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの病態モデルマウスとして、C57/BL10-mdxマウスを使用した。Wildtypeマウスとして遺伝的backgroundであるC57BL/10マウスを使用した。飼育は8:00-20:00の明暗周期で行い、餌、水は自由に摂取させた。mdxマウスは自家繁殖を行い、C57BL/10マウスは日本SLCより購入した。4週齢の雄性mdxマウス、雄性C57BL/10マウスに125.1ppm 6-MSITCを4週間混水投与した。control群としては水を飲水させた。腓腹筋単離後に、筋重量の50倍量のProtease inhibitor cocktail含有RIPA buffer(ナカライテスク、型番:08714-04)を加え、バイオマッシャーSP(Nippi、型番:893163)にてホモジナイズした。ホモジナイズ後、氷上で30分間インキュベートし、16,000rpm、4℃、10分間で遠心を行い、上清を回収した。タンパク定量はPierce BCA Protein Assay Kit(THERMO FISHER SCIENTIFIC、型番:23227)で行った。タンパク定量後、sample bufferを加え95℃で5分間インキュベーションした筋抽出液をwestern blotサンプルとした。7.5%又は4-20%gradientゲルでSDS-PAGEを行い、タンパク分離した。膜を転写後、wash(5分間x3)、5%スキムミルクで1時間ブロッキング、洗浄(10分間x2、5分間x1)、1次抗体としてCalpain-1 Large subunit antiobody(希釈倍率1:1000、CELL SIGNALING TECHNOLOGY、型番:#2556)、calpastatin antibody(希釈倍率1:1000、CELL SIGNALING TECHNOLOGY、型番:#4146)、b-Actin antibody(希釈倍率1:1000、 CELL SIGNALING TECHNOLOGY、型番:#4967)を用い、4℃、overnightで反応させた。1次抗体反応後、洗浄(10分間x2、5分間x1)、2次抗体としてECL-anti-rabbit IgG HRP抗体(希釈倍率1:10000、GE HEALTHCARE、型番:LNA934V/AG)を用い室温で1時間反応させた。wash(10分間x2、5分間x1)後にECL Prime Detection Reagent(GE HEALTHCARE、型番:RPN2236)と反応後、富士メディカルフィルムプロセサーFPM100にてバンドを検出した。
Claims (8)
- 6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する軟部組織の石灰化抑制剤。
- 6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はその生理学的に許容される塩を含有する肺組織破壊抑制剤。
- 軟部組織の石灰化に起因する疾患若しくは症状の治療又は予防用である、請求項1に記載の軟部組織の石灰化抑制剤。
- 疾患又は症状が、肺気腫;動脈硬化;肝硬変からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項3に記載の軟部組織の石灰化抑制剤。
- 飲食品、医薬品又は化粧料の形態である、請求項1、3又は4に記載の軟部組織の石灰化抑制剤。
- 肺組織破壊に起因する疾患若しくは症状の治療又は予防用である、請求項2に記載の肺組織破壊抑制剤。
- 疾患又は症状が、肺気腫である、請求項6に記載の肺組織破壊抑制剤。
- 飲食品又は医薬品の形態である、請求項2、6又は7に記載の肺組織破壊抑制剤。
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