TWI600429B - 麥角固醇之用途 - Google Patents

Description

麥角固醇之用途

本發明係關於麥角固醇(ergosterol)於減緩、抑制及/或治療腎臟病變(Nephropathy)，包括例如腎小管間質纖維化(Tubulointerstitia fibrosis)、腎小管萎縮(Tubular atrophy)、腎絲球硬化(Glomerulosclerosis)、腎絲球滲透性病變(Glomerular exudate lesion)、及腎臟纖維化(Renal ficrosis)的應用。本發明特別是關於使用麥角固醇以減緩、抑制及/或治療由糖尿病(Diabetes mellitus)所引起的腎臟病變。

腎臟病變(Nephropathy)為病患因某種腎臟疾病(Renal disease)所引起的腎臟功能喪失，包括腎小管間質纖維化(Tubulointerstitia fibrosis)、腎小管萎縮(Tubular atrophy)、腎絲球硬化(Glomerulosclerosis)、腎絲球滲透性病變(Glomerular exudate lesion)、及腎臟纖維化(Renal ficrosis)等症狀。

除遺傳、老化、不當用藥習慣等因子以外，其他例如糖尿病、高血壓、血脂異常、泌尿疾病、心血管疾病亦有可能造成腎臟功能喪失，其中，又以糖尿病所造成的腎臟功能喪失最為常見。舉例言之，已知台灣目前的腎臟病病患，有43%患者之腎 臟病變的發生是由糖尿病所引起，且該比例有逐年增加的趨勢。糖尿病引起腎臟病變的原因，包括例如患者血糖濃度過高、腎臟血流量增加、腎絲球篩孔負電荷逐漸消失、腎絲球過濾壓力增加等因素。

一般而言，腎臟功能喪失會導致體內毒素(例如血清尿素氮、肌酸酐)無法經由腎臟排除而堆積，而演變成末期腎臟疾病(End-stage renal disease，ESRD)，俗稱尿毒症(uremia)，此為一種不可逆之腎臟功能衰竭，且經常伴隨著蛋白尿、水腫、高血壓等症狀。其後，因腎臟功能持續惡化，病患必須接受血液透析或腹膜透析治療(俗稱洗腎)、或移植治療，以延緩腎臟功能衰竭、延續病患生命。

然而，血液透析或腹膜透析的價格昂貴，且洗腎患者在治療後經常會出現低血壓、肌肉抽筋、噁心、嘔吐、發燒、發冷、心絞痛、皮膚搔癢等後遺症，造成洗腎患者生活品質的喪失。為於臨床上更有效地改善腎臟病變且改善患者生活品質，持續開發減緩、抑制、或治療腎臟病變的藥物係有相當的必需性及迫切性。

本案發明人研究後發現，麥角固醇(ergosterol)對於發生腎臟病變的個體，可有效改善葡萄糖耐受性、降低血液中的胰島素、尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、及肌酸酐(Creatinine)的含量、降低尿液中的白蛋白/肌酸酐的比值(Albumin/Creatinine Ratio，ACR)、抑制腎臟纖維化因子的表現，故可用於減緩、抑制及/或治療腎臟病變，尤其是糖尿病所引起的腎臟病變。

本發明之一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造一製劑的用途，其中該活性成分係選自麥角固醇(Ergosterol)、其醫藥上可接受之酯、及前述之組合，且該製劑係用以減緩、抑制及/或治療腎臟病變(Nephropathy)。較佳地，該製劑係一藥劑、一食品、或一食品添加劑。

本發明之另一目的，在於提供一種減緩、抑制及/或治療腎臟病變的方法，其係包含於有需要之個體中投予有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

第1圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(，即「控制組」)、經STZ處理之小鼠(，即「STZ組」)、及經STZ及麥角固醇處理之小鼠(，即「STZ+麥角固醇組」)在不同時間之存活率，其中，縱軸代表存活率百分比(%)，橫軸代表各組小鼠各自經上述不同條件處理後所經過的時間(週數)；第2圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(，即「控制組」)、經STZ處理之小鼠(，即「STZ組」)、經STZ及麥角固醇處理之小鼠(，即「STZ+麥角固醇組」)、及經STZ及羅格列酮處理之小鼠(，即「STZ+羅格列酮組」)在不同時間之葡萄糖耐受度，其中，縱軸代表血糖值(毫克/分 升)，橫軸代表各組小鼠各自經上述不同條件處理後所經過的時間(分鐘)；第3圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「控制組」)、經STZ處理之小鼠(即，「STZ組」)、及經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「STZ+麥角固醇組」)血液中胰島素含量(毫克/分升)的長條圖；第4圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「控制組」)、經STZ處理之小鼠(即，「STZ組」)、及經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「STZ+麥角固醇組」)血液中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)含量(毫克/分升)的長條圖；第5圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「控制組」)、經STZ處理之小鼠(即，「STZ組」)、及經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「STZ+麥角固醇組」)血液中肌酸酐(Creatinine)含量(毫克/分升)的長條圖；第6圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「控制組」)、經STZ處理之小鼠(即，「STZ組」)、及經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「STZ+麥角固醇組」)尿液中的白蛋白/肌酸酐的比值(Albumin/Creatinine Ratio，ACR)的長條圖；第7圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「控制組」)、經STZ處理之小鼠(即，「STZ組」)、及經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「STZ+麥角固醇組」)之腎絲球胞外基質及基底膜增厚情形的蘇木精-伊紅染色照片圖；以及第8圖係顯示未經STZ及麥角固醇處理之小鼠(即，「控制組」)、經STZ處理之小鼠(即，「STZ組」)、經STZ及麥角固 醇處理之小鼠(即，「STZ+麥角固醇組」)、及經STZ及羅格列酮處理之小鼠(即，「STZ+羅格列酮組」)之腎絲球胞外基質中腎臟纖維化因子表現情形的免疫組織化學染色照片圖。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。

本案發明人發現，麥角固醇(Ergosterol)對於發生腎臟病變的個體，可提供改善葡萄糖耐受性、降低血液中的胰島素、尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、及肌酸酐(Creatinine)的含量、降低尿液中的白蛋白/肌酸酐的比值(Albumin/Creatinine Ratio，ACR)、及抑制腎臟纖維化因子(例如：α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA))的表現的效果，且可提高腎臟病變個體之存活率。

因此，本發明係關於使用麥角固醇於製造一製劑之用途。其中，該製劑係用以減緩、抑制及/或治療腎臟病變，包括例如腎小管間質纖維化(Tubulointerstitia fibrosis)、腎小管萎縮(Tubular atrophy)、腎絲球硬化(Glomerulosclerosis)、腎絲球滲 透性病變(Glomerular exudate lesion)、及腎臟纖維化(Renal ficrosis)。於本發明一具體實施態樣中，該製劑係用於減緩、抑制及/或治療糖尿病所引起的腎臟病變。

其中，麥角固醇可由中草藥純化分離而來，亦可透過化學合成方法獲得。於本發明之一具體實施態樣中，係使用由牛樟芝(Antrodia camphorata)純化分離而得之麥角固醇。例如，可採用市售之牛樟芝粉末，以甲醇進行萃取，再以乙酸乙酯/正己烷(乙酸乙酯：正己烷=1：9)進行矽膠管柱層析分離，沖提出麥角固醇，其結構如下：

根據本發明所提供之製劑可以呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，但不以此為限，該製劑可以藥劑之形式提供，亦可以呈固體或流體之食品或食品添加劑的形式提供，其中，該食品例如膳食補充品、保健食品，該保健食品例如日常營養補充食品、術後營養補充品、營養品等。較佳地，係以藥劑或保健食品之形式提供該製劑。舉例言之，可於糖尿病患者的日常飲食中添加或使用本發明保健食品，以達到減緩、抑制及/或治療由糖尿病所引起之腎臟病變的效果。

當以藥劑之形式提供本發明製劑時，該藥劑可視所欲之投藥形式而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限， 該藥物可以口服或非經口服(例如皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、或鼻腔)等投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該藥劑。

以適於口服投藥之劑型為例，本發明所提供之藥劑可含有任何不會不利影響麥角固醇之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：溶劑(水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、及前述之組合)、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑、固體載劑(例如澱粉、皂土(bentonite))等。可利用任何合宜之方法，以適於口服投藥的劑型提供該藥劑，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等。

至於適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之注射劑型或點滴劑型，則可於本發明所提供之藥劑中含有一或多種，例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至該有需要之個體前將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中、或將其乳化，提供所欲之注射劑。此外，適於經鼻腔或經皮膚投予之外用劑型，則例如乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液 (例如洗液、懸浮液)。

視需要地，可於本發明所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、安定劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分或與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對麥角固醇之所欲效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用本發明所提供之藥劑，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。舉例言之，當以口服方式施用至一個體以減緩、抑制及/或治療腎臟病變時，以麥角固醇計，其用量為每天約1毫克/公斤體重至約100毫克/公斤體重，較佳為每天約5毫克/公斤體重至約70毫克/公斤體重，更佳為每天約10毫克/公斤體重至約40毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重個體所須之投藥量。惟，對於急性患者而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。

當根據本發明所提供之製劑係以保健食品之形式提供時，其可為包括例如乳製品類、肉類、麵包類、麵食品、餅乾、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等形態，但不以此為限。其中，有關麥角固醇之添加步驟可視保健食品之類型而異，只要該添加步驟之環境不會影響該麥角固醇的處理效益即可。舉例言之，可於製造過程中的原料階段即添加麥角固醇(即，作為保健 食品的一部分)，或者可於完成製造後的成品階段再添加麥角固醇(即，作為保健食品的添加物)。至於該添加步驟中之麥角固醇的形式，則可為麥角固醇本身，或者可先將麥角固醇與其他各種成分(例如蛋白質、糖類、膳食纖維、脂肪、微量元素、或維生素等，但不以此為限)混合，製成錠狀、膠囊狀、顆粒狀、粉末狀、懸浮液狀、或乳化液狀之調配物之後，再行添加與混合。

視需要地，可於本發明所提供之保健食品另含有合宜用量之賦形劑(例如乳糖、白糖、澱粉、或甘露醇)、崩散劑(例如碳酸鈣或羧甲基纖維素鈣)、結合劑(例如α化澱粉、阿拉伯膠、羧甲基纖維素、聚乙烯基呲咯啶酮、或羥丙基纖維素)、增黏劑(天然橡膠)、潤滑劑(例如滑石粉、硬脂酸鎂、或聚乙二醇6000)、及/或其他添加劑(例如可提高該保健食品於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該保健食品的穩定性及儲存性之緩衝劑、安定劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、或抗真菌劑等)。此外，該保健食品可視需要另含一或多種其他活性成分或與含該一或多種其他活性成分之保健食品併用，以進一步加強該保健食品之效益或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對麥角固醇之所欲效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用本發明所提供之保健食品，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。亦可針對特定族群調整本發明所提供之保健食品中麥角固醇的含量，較佳為調整至每日應服用的量。舉例言之，若一個體之每日建議使用量為約10毫克，又該保健食品每份含5毫 克之麥角固醇，則該個體每日可食用大約二份該保健食品。可於本發明保健食品之外包裝標示建議使用量、特定族群(例如孕婦、糖尿病患者)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。

此外，本發明另提供一種減緩、抑制及/或治療腎臟病變的方法，其係包含於有需要之個體中投予有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。其中，有關麥角固醇之施用型態與適用劑量等，均如上述之說明。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

實施例1：自牛樟芝粉末純化、分離出麥角固醇

以甲醇對牛樟芝粉末(購自葡萄王生技公司)進行萃取，共進行三次，然後合併三次萃取所得之甲醇萃取液。於該甲醇萃取液中添加乙酸乙酯及水(其中，甲醇萃取液與乙酸乙酯之體積比為1：1)，以進行液液分配，然後移除水相而留下乙酸乙酯相。接著，對所留下的乙酸乙酯相進行管柱層析(column chromatography)分離(固定相：SiO₂；沖提液：乙酸乙酯：正己烷=1：9)，並收集沖提液，得到白色結晶。接著以丙酮進行再結晶，得到純度大於99%之麥角固醇，透過¹H-NMR分析，確認其結構如下：

實施例2：腎臟病變小鼠模型的建立

將雄性ICR小鼠(年齡為6至8週，且每隻約25克)穩定飼養一週後，以腹腔注射的方式，將鏈佐黴素(Streptozotocin，STZ，購自Sigma)以75毫克/公斤體重之用量注射至ICR小鼠(共11隻)，每天注射一次，連續7天(即，總共注射7次)，以獲得腎臟病變之小鼠模型，稱為「STZ組」小鼠。另外，以相同模式，但未注射鏈佐黴素，僅對小鼠注射等量之普通食鹽水(normal saline，NS)，所得為「控制組」小鼠(共4隻)。

實施例3：於腎臟病變小鼠投予麥角固醇或羅格列酮(Rosiglitazone)

於上述實施例2之「STZ組」小鼠完成7次注射後次日，以尾部靜脈注射的方式，將實施例1之麥角固醇以10毫克/公斤體重之用量注射至「STZ組」小鼠(共4隻)，每天注射一次，連續7天，所得為經麥角固醇處理之腎臟病變小鼠，稱為「STZ+麥角固醇組」小鼠。另外，以相同模式，但以口服的方式，將羅格列酮(購自Sigma；係一胰島素增敏劑)以3毫克/公斤體重之用量投予至「STZ組」小鼠(共4隻)，所得為經羅格列酮處理之腎臟病變小鼠，稱為「STZ+羅格列酮組」小鼠。

實施例4：存活率測試

穩定飼養實施例2之「控制組」小鼠(共4隻)及「STZ組」小鼠(共3隻)以及實施例3之「STZ+麥角固醇組」小鼠(共4隻)，歷時4週，且於飼養期間觀察小鼠之存活情形並計算存活率。結果示於第1圖。

由第1圖可知，相較於「控制組」，「STZ組」小鼠之存活率明顯下降。然而，相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠之存活率則明顯提升。前述結果顯示，麥角固醇可有效延長腎臟病變患者之存活率。

實施例5：葡萄糖耐受性試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)

穩定飼養實施例2之「控制組」(共4隻)及「STZ組」小鼠(共3隻)以及實施例3之「STZ+麥角固醇組」(共4隻)及「STZ+羅格列酮組」(共4隻)小鼠，歷時2週。

其後，將小鼠禁食12小時後，以尾部取血的方式，使用血糖儀(MAJOR II，購自信晶)測定小鼠之空腹血糖值。接著，以口服方式，將葡萄糖以3克/公斤體重之用量投予至小鼠，並測量投予葡萄糖後第15、45、95、135分鐘之血糖值，觀察血糖值變化(其中，空腹血糖值即為第0分鐘之血糖值)，以測試葡萄糖的利用程度。結果示於第2圖。

由第2圖可知，相較於「控制組」，「STZ組」小鼠之葡萄糖利用程度較低。而相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠之葡萄糖利用程度則明顯提升，且與「STZ+羅格列酮組」相當。前述結果顯示，麥角固醇可有效改善腎臟病變患者的葡萄糖耐受性。

實施例6：血液生化值分析

(6-1)胰島素、尿素氮、及肌酸酐的含量

穩定飼養實施例2之「控制組」(共4隻)及「STZ組」(共3隻)小鼠以及實施例3之「STZ+麥角固醇組」(共4隻)及「STZ+羅格列酮組」(共4隻)小鼠，歷時2週，其後，以眼窩採血方式，採取0.5毫升之全血(whole blood)並進行離心(5000rpm、10分鐘)後。接著，取0.2毫升之血清，使用自動生化分析儀(Hitachi Model 7600 automatic analyzer)，利用比色法原理，分析血清中胰島素、尿素氮、及肌酸酐的含量，結果示於第3至5圖。

如第3圖所示，「STZ組」小鼠之血液中胰島素的含量係增加至「控制組」的3倍。而相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠之血液中胰島素的含量則明顯降低。前述結果顯示，麥角固醇可有效提升腎臟病變患者對葡萄糖的利用程度，故可降低腎臟病變患者血液中胰島素的含量。

另一方面，如第4圖及第5圖所示，「STZ組」小鼠之血液中尿素氮及肌酸酐的含量係分別增加至「控制組」的3倍及2.5倍。而相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠之血液中尿素氮、及肌酸酐的含量則明顯降低。前述結果顯示，麥角固醇可有效促進腎臟病變患者體內毒素(例如尿素氮、肌酸酐)的排除。

(6-2)白蛋白/肌酸酐之比值

穩定飼養實施例2之「控制組」(共4隻)及「STZ組」(共3隻)小鼠以及實施例3之「STZ+麥角固醇組」(共4隻)小鼠，歷時2週。接著，刺激小鼠排尿，並收集尿液，以檢測尿液 中白蛋白及肌酸酐的含量，並計算白蛋白/肌酸酐之比值(Albumin/Creatinine Ratio，ACR)，結果示於第6圖。

如第6圖所示，「STZ組」小鼠尿液中的白蛋白/肌酸酐之比值係增加至「控制組」的7倍。而相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠尿液中的白蛋白/肌酸酐之比值則明顯降低。前述結果顯示，麥角固醇可有效降低腎臟病變患者尿液中白蛋白的含量，此即，麥角固醇可改善蛋白尿的症狀。

實施例7：蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin Staining，H & E Staining)染色

穩定飼養實施例2之「控制組」(共4隻)及「STZ組」(共3隻)小鼠以及實施例3之「STZ+麥角固醇組」(共4隻)及「STZ+羅格列酮組」(共4隻)小鼠，歷時4週，其後，將小鼠犧牲，並進行以下之蘇木精-伊紅染色分析：取上述四組小鼠之腎臟組織樣本，於福馬林中浸泡2天，並進行組織脫水、滲臘。接著，對完成滲臘的組織樣本進行包埋，再以每片5毫米的厚度進行切片。將切片後的組織樣本展開以貼附在玻片上，於60℃的烘箱內進行脫臘，歷時1小時，再以二甲苯(購自Thermo)清洗，並以酒精進行回水(rehydration)。其後，將組織樣本置於蘇木紫溶液(hematoxylin，購自Thermo)中浸泡7分鐘，以水沖洗後，再置於氨水中浸泡至變色。以水沖洗後，再以70%酒精稍微潤濕組織樣本，並以伊紅(Eosin，購自Thermo)進行染色30秒。分別以95%及100%酒精對組織樣本進行脫水6分鐘，再以二甲苯清洗。最後，進行封片，於顯微鏡下觀察結果並照相存檔。結果示於第7圖。

由第7圖可知，相較於控制組，「STZ組」小鼠之腎絲球胞外基質(Glomerular extracellular matrix，GEM)及腎絲球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)皆有明顯增厚的現象。而相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠之腎絲球胞外基質及腎絲球基底膜的厚度則明顯減少。前述結果顯示，麥角固醇可有效抑制腎絲球胞外基質及基底膜增厚，故可避免腎絲球硬化(Glomerulosclerosis)及腎絲球滲透性病變(Glomerular exudate lesion)。

實施例8：免疫組織化學染色(Immunohistochemistry，IHC)

穩定飼養實施例2之「控制組」(共4隻)及「STZ組」(共3隻)小鼠以及實施例3之「STZ+麥角固醇組」(共4隻)及「STZ+羅格列酮組」(共4隻)小鼠，歷時4週，其後，將小鼠犧牲，並進行以下之免疫組織化學染色分析：取上述四組小鼠之腎臟組織樣本，於福馬林中浸泡2天，並進行組織脫水、滲臘。接著，對完成滲臘的組織樣本進行包埋，再以每片5毫米的厚度進行切片。將切片後的組織樣本展開以貼附在玻片上，於60℃的烘箱內進行脫臘，歷時1小時，再於二甲苯中浸泡脫臘，歷時15分鐘。其後，將20微克/毫升的蛋白水解酵素K(proteinase K)加到組織樣本上，於37℃反應30分鐘，再於3%的過氧化氫中浸泡5分鐘。以0.02莫耳濃度的磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline，PBS)浸洗，再將平衡緩衝溶液(Equilibration buffer)加到組織樣本上，歷時1分鐘，其後，將TdT酵素加到到組織樣本上，歷時1小時。以0.02莫耳濃度的PBS浸洗， 再將α-平滑肌肌動蛋白抗體(anti-α-SMA body，購自Abcam)加到組織樣本上，於4℃反應30分鐘。以0.02莫耳濃度的PBS浸洗，再將辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素(strepavidin-HRP)加到組織樣本上，於4℃反應30分鐘。以0.02莫耳濃度的PBS浸洗，再將HRP之呈色受質(DAB substrate，購自Abcam)加到組織樣本上，於27℃反應20分鐘。將組織樣本置於蒸餾水中浸泡3分鐘，再加入Mayer氏蘇木紫(Mayer’s hematoxylin)染色2分鐘。最後，以70%、80%、及90%酒精分別浸泡組織樣本10分鐘，並進行封片，於顯微鏡下觀察結果並照相存檔。結果示於第8圖。

已知α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)係一腎臟纖維化因子，其表現量可作為腎臟纖維化的指標，表現量越高表示腎臟纖維化的情形越嚴重。由第8圖可知，將較於控制組，「STZ組」小鼠之腎絲球胞外基質中α-平滑肌肌動蛋白的表現量係明顯增加。而相較於「STZ組」，「STZ+麥角固醇組」小鼠之中α-平滑肌肌動蛋白的表現量則明顯減少，且與「STZ+羅格列酮組」相當。前述結果顯示，麥角固醇可有效抑制腎臟纖維化因子的表現，此即，麥角固醇可有效抑制腎臟纖維化。

由以上實驗結果可知，麥角固醇可有效延長腎臟病變患者之存活率、改善腎臟病變患者之葡萄糖耐受性、提升腎臟病變患者對葡萄糖的利用程度、促進腎臟病變患者體內毒素(例如尿素氮、肌酸酐)的排除、改善蛋白尿的症狀、抑制腎絲球胞外基質及基底膜增厚、抑制腎臟纖維化因子。前述結果說明，麥角固醇可用於減緩、抑制、及/或治療腎臟病變。

Claims (6)

1. 一種使用一活性成分於製造一製劑的用途，其中該活性成分係如下結構式之麥角固醇(Ergosterol)，且該製劑係用以減緩、抑制及/或治療腎臟病變(Nephropathy)：
2. 如請求項1之用途，其中該腎臟病變係由糖尿病(Diabetes mellitus)所引起。
3. 如請求項1之用途，其中該腎臟病變係選至以下之至少一者：腎小管間質纖維化(Tubulointerstitia fibrosis)、腎小管萎縮(Tubular atrophy)、腎絲球硬化(Glomerulosclerosis)、腎絲球滲透性病變(Glomerular exudate lesion)、及腎臟纖維化(Renal ficrosis)。
4. 如請求項1之用途，其中該製劑係一藥劑或保健食品。
5. 如請求項1之用途，其中該製劑之用量，以麥角固醇計，為每天約1毫克/公斤體重至100毫克/公斤體重。
6. 如請求項1之用途，其中該麥角固醇係萃取自牛樟芝(Antrodia camphorata)。