KR101954736B1 - 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물 - Google Patents
동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 동백유는 천연물로부터 유래한 물질로서 독성이 없으므로 천식의 예방, 개선 및 치료를 위한 식품이나 약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물에 관한 것이다.
동백나무는 우리나라를 비롯하여 중국과 일본에 자생하는 차나무과(Theaceae)에 속하는 약용식물로서 약 200여종이 알려져 있다. 이 중 약 70여종이 동백아속(亞屬), 즉 동백(Camellia japonica)과 애기동백(C. sasanqua)의 근연종이다. 한국에 자생하는 동백나무는 1종(Camellia japonica L.)으로 동백나무과(Theaceae), 동백속(Camelliae)의 교목이다. 동백나무의 잎은 건선, 인후통증, 화상에 효능이 있고, 가지와 열매는 머리비듬, 보혈, 비출혈(鼻出血), 어혈, 연골증, 월경이상, 이뇨, 인후통증, 장출혈, 종독(腫毒), 타박상, 토혈과 각혈, 행혈, 화상에 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, 이전 연구에서는 동백나무 잎과 꽃에는 항균, 항산화, 및 항염증 활성을 갖는 트리테르펜(triterpene), 플라보노이드, 탄닌 및 지방산이 함유되어 있는 것으로 보고하였다. 이러한 동백나무는 오래 전부터 민간에서 출혈과 염증 등의 질환을 치료하는데 사용해왔다. 뿐만 아니라, 우리나라에서는 2004년 이후에 동백나무를 식품소재로 개발하여, 2007년에는“동백차”로 불리는 다류 식품으로 상품화하기도 하였다.
특히 동백유는 동백나무(Camellia japonica)의 종자를 건조, 분쇄한 후 착유나 용매를 사용하여 추출하는 방식을 통해 얻어지는데, 예로부터 머릿기름, 정밀기계유 및 식용유로 사용되었다.
또한, 동백오일에 관한 선행 연구를 살펴보면, 염증활성억제효과 (Chem. Pharm. Bull. 45(12): 2016-2023(1997)), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus) 활성 저해 효과(Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 52(1):153-6(2004)) 및 에탄올 흡수 저해 효과(Chem. Pharm. Bull. 42(3): 742-744(1994)) 등이 보고되어 있다.
한편, 천식은 이물질에 대한 과민반응에 의해 야기되는 호흡기계 질환이며 호흡기계의 염증에 관계된 IL-4/IL-13/STAT (CK Oh et al. 2010; Seo JW et al. 2013), L-셀렉틴(selectin)과 세포내 부착분자(adhesion molecule)-1 등에 의해 야기된다고 알려져 있다(Tang MLK & Fiscus LC 2001). 호흡기계와 관련된 난치성 면역질환으로 알려져 있는 천식은 그 치료를 위한 다양한 방법과 치료제 개발이 진행되고 있으나 각 치료제의 장단점에 따라 사용이 제한되어 있는 실정이다. 따라서 오랜 기간 호흡계 질환의 치료에 사용되었던 다양한 천연물질에 대한 효능의 검색을 통해 천식치료 후보물질을 개발하는 동시에 천식에 대한 발병기전과 억제기전에 대한 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 천식 개선효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 물질을 찾고자 예의 연구한 결과, 동백유가 항천식 기능을 가진다는 사실을 발견하였으며, 그에 따라 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식을 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식을 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식을 예방, 개선 및 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 동백유는 동백오일로 불리기도 하는데 동백나무(Camellia japonica) 종자를 건조 및 분쇄한 후 착유나 용매를 사용하여 추출한 추출물을 말한다. 상기 동백유는 통상의 방법에 의하여 동백나무의 종자로부터 착유나 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.
특히 바람직하게, 본 발명의 동백유는 유기용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 그러나, 추출 방법은 제한되지 않으며, 예를 들어, 냉침추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
본 발명의 동백유는 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 또는 건조물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “유효성분”이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 동백유는 BALB/c 마우스에서 천식의 조직병리학적 특징인 점액, 호산구 침윤(eosinophil infiltration), 상피 증식(hyperplasia)의 감소를 나타내었다.
본 발명의 천식 예방 및 치료용 조성물은 유효성분으로서 동백유를 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 70 중량% 범위 내에서 결정될 수 있다. 여기서 “유효량”이란 천식의 예방, 개선, 치료, 또는 그 증상의 발현 지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 동백유의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우 천식 개선 효과가 미약하고, 70 중량%를 초과하는 경우 함량 증가에 따른 효과 증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제가 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 천식을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 천식에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 천식의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “치료” 또는 “개선”은 개체에서 (a) 천식의 발전의 억제 (b) 천식의 경감 및 (c) 천식의 제거를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “개체”는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 천식과 관련한 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 동백유가 천식의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물의 유효성분으로 사용되는 경우, 유효성분으로서 동백유 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 식품보조 첨가제, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 동백유를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 가공육류, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 동백유 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
점액, 호산구 침윤 및 세포과다증식은 천식의 대표적인 조직병리학적 특징으로, 기관지허파꽈리 세척액(BALF)에서 WBC, 호산구 및 IgE의 변화로 항천식 활성을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 동백유를 동물실험에서 사용한 결과, 점액, 호산구 침윤 및 세포과다증식이 동백유의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 동백유는 항천식 활성을 갖는 천연물로서 약학 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 동백유가 천식 장애 예방 및 개선용 약제학적 조성물의 유효성분으로 사용되는 경우, 유효성분으로서 동백유 이외에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적으로 허용되는 담체는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 천식을 예방 및 치료할 수 있는데, 치료방법은 상기 약학 조성물을 약제학적 유효량으로 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물 내에 다양한 경로로 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여방법은 모든 방식으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 또는 피하 투여 등으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명의 상술한 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 및 치료용 조성물을 개체에 투여하여 천식을 치료, 예방, 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 천식의 치료에 있어서, 상기 개체는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
면역글로불린 E (Immuno Globulin E, IgE)는 단백질의 일종으로서 알레르기 반응에서 중요한 역할을 하는 항체이다. IgE가 특정 물질에 노출되면 면역체계는 몸을 보호하기 위하여 IgE를 생산하기 시작한다. 결과적으로 알레르기, 천식이 유발되면 체내의 IgE가 다량 생산된다. 동물실험에서 얻은 BALF 샘플을 통해서 IgE의 발현을 측정하여 특정 단백의 발현 부위를 육안분석할 수 있다. 본 발명에 따르면, 동백유의 농도가 높을수록 혈청 중에서 IgE 발현이 감소하였으며, 이는 본 발명에 따른 동백유의 항천식 활성을 시사하는 것이다.
본 발명에 따른 동백유는 항천식 효과가 우수하여 천식을 예방, 개선 및 치료하기 위한 약학적 조성물 및 기능성 식품 조성물 등의 제조를 위한 활성성분으로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 동백유는 세포에 대한 독성이 없어 항천식용 약학 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 은 OVA(Ovalbumin) 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 WBC 세포수 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 호산구 세포수 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 IgE 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다. a: CON, b: OVA, c: DEX, d: 동백유 10 mg/kg, e: 동백유 100 mg/kg, f: 동백유 500 mg/kg
도 5는 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 PAS 염색 결과를 나타낸 것이다. a: CON, b: OVA, c: DEX, d: 동백유 10 mg/kg, e: 동백유 100 mg/kg, f: 동백유 500 mg/kg
도 2는 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 호산구 세포수 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 IgE 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다. a: CON, b: OVA, c: DEX, d: 동백유 10 mg/kg, e: 동백유 100 mg/kg, f: 동백유 500 mg/kg
도 5는 OVA 유도군에서 본 발명의 일 실시예에 따른 동백유 투여에 의한 PAS 염색 결과를 나타낸 것이다. a: CON, b: OVA, c: DEX, d: 동백유 10 mg/kg, e: 동백유 100 mg/kg, f: 동백유 500 mg/kg
이하, 제조예 및 실험예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하였다. 이들 제조예 및 실험예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실험예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
모든 데이터는 평균±표준 편차로 표현하였고, 반올림하여 나타내었다. 두 평균 사이의 차이는 t-테스트를 수행하였고, 세 개 이상의 평균 사이의 차이는 사후 검증 (Tukey's multiple range test) 변화량 분석을 수행하였으며, p-값<0.05 수준에서 유의차를 검정하였다.
제조예 1: 동백유(ECJL) 제조
대한민국 전라남도 완도 수목원으로부터 제공된 동백나무(Camellia japonica, CJ) 종자로부터 종피를 제거한 후 압착하여 동백유를 제조하였다.
실험예 1: 동백유의 항천식 활성 측정
1) 재료 및 방법
본 시험은 오브알부민으로 천식을 유도한 실험동물에서 동백유의 항천식 효능을 측정하기 위하여 수행하였다.
(1) 실험동물
특정병원체 부재(SPF)의 6주령 암컷 BALB/c 마우스를 실험동물로 선택하였다. 동물 수는 시험결과를 해석할 수 있는 최소한의 충분한 수로 산정하며 투여물질에 따라 총 6개의 실험군으로 나누었으며 각 군당 8마리씩 산정하였다. 산정 기준은 부검 시 4마리는 BALF(기관지허파꽈리 세척액) 채취, 4마리는 폐조직을 얻기 위함이다.
실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10~20 회/시간, 조명시간 12시간 및 조도 150~300 Lux로 유지되는 환경에서 사육하였다. 동물은 적량의 깔개를 담은 폴리카보네이트 사육상자에서 순화 및 투여기간에 사육상자 당 4마리 이하로 사육하였다.
(2) 실험방법
동물실험일정은 동물 입수 후 시험을 실시하는 동물실 내에서 6일간 순화기간을 가지고 매일 1회 이상 관찰하였다. 시험군은 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 측정하여 순위화하고 각 군의 평균체중이 균일하게 분포하도록 시험군을 무작위 분배하여 군분리하였다. 각 그룹은 대조군, OVA 야기대조군, 양성대조군, 동백유 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kg 으로 총 6그룹으로 설정하였다. 실험은 순화기간 후 2주간 1주 1회 복강주사로 OVA를 감작한다. 3주째부터 5일 동안 오전에 양성대조물질과 동백유를 경구투여하고 오후에 5 % OVA 용액 흡입을 실시하였다. 투여액량은 실험동물 체중(g) 당 28 μL를 경구투여하였고 감작은 체중과 상관없이 마리당 일정량을 투여하였다. 5일동안 투여 후 그 다음날 부검을 실시하였다.
(3) 투여방법
- 복강투여: OVA(난백알부민, Sigma Aldrich, Louis, MO, USA, 카탈로그 번호:A5503) 20 μg + alum hydrate(Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA, 카탈로그 번호:77161) 1 mg + 생리식염수(normal saline, JW Pharmaceutical, 서울, 대한민국) 500 μL/head로 투여하였다. 투여해야할 동물 마리수를 총 50 마리로 계산하여 OVA 1000 μg + alum hydrate 50 mg + 생리식염수 25 mL로 환산하여 조제하였다. 주 1회로 2주간 복강주사로 감작시키고 1 mL 시린지를 이용하여 주사하였다.
- 경구투여: 대조군과 야기대조군은 생리식염수를 투여하고 투여용 동백유는 0.5% 메틸 셀룰로스(Sigma Aldrich, Louis, MO, USA, 카탈로그 번호:M0387)로 조제하여 사용하였다. 고농도는 100 mg의 동백유를 칭량하여 5.6 mL의 0.5% 메틸 셀룰로스에 용해시켜 사용하였다. 중농도는 20 mg의 동백유를 칭량하여 5.6 mL의 0.5% 메틸 셀룰로스에 용해시키고, 저농도는 2 mg의 동백유를 칭량하여 5.6 mL의 0.5% 메틸 셀룰로스에 용해시켜 사용하였다. 양성대조물질로서 덱사메타손(DEX, SAMNAM Pharm, 충남, 대한민국)은 생리식염수에 넣고 보텍싱으로 용해시켜 최종 투여액량에 맞게 조제하였다. 모든 조제는 투여 당일 조제한다.
흡입(Inhalation): OVA 1 g + 생리식염수 20 mL (5% OVA 용액)로 만들어 보텍싱하여 투여하였다. neublizer (OMRON, NE-U17)를 사용하여 5일 동안 강제 흡입을 실시하고 흡입챔버(inhalation exposure chamber)를 이용하여 전신노출시켰다.
2) 분석 방법
(1) 일반증상관찰: 모든 시험군의 동물에 대하여 입수일부터 부검일까지 매일 1회 이상 일반증상 관찰을 수행하였다.
(2) 체중변화량 및 사료섭취량: 시험기간 중 3일 1회 측정하였다.
(3) 부검: 최종 부검일(D20)에 모든 마우스를 부검하였다. 각 실험군에서 앞 번호 4마리는 BALF, 비장을 채취하고, 나머지는 폐, 비장을 채취하였다. 혈청은 모든 마우스에서 채취하었다.
(4) 조직 및 장기의 보관
- 비장 및 폐: 부검 시 1/2은 액체질소에 넣어 급속동결한 후 초저온냉동고 혹은 액체질소통(약 -75˚c)에 보관하여 PCR/웨스턴 블로팅용으로 활용하고, 1/2은 10% 포르말린 용액에 보관하여 조직병리 및 면역조직화학(IHC)용으로 활용하였다.
- BALF 채취: 마취가 된 실험동물을 핀셋으로 조직을 벌려 기관을 확보 후 수술실을 밑으로 넣어주어 느슨히 묶어주고 가위로 기관을 살짝자른 후 니들을 제거한 주사기에 PBS 0.2 mL을 넣고 존데에 꽃은 후 주입하였다. 주입 후 다시 PBS를 빨아들이면서 BALF를 채취하였다. 같은 방법으로 0.2 mL 씩 3번 BALF를 채취하였다.
3) 시료분석
(1) BALF의 혈구분석
첫 번째 채취한 BALF는 1번 튜브, 두 번째, 세 번째 채취한 BALF는 2번 튜브에 같이 넣었다. 1번 튜브는 5분간 3000 rpm에서 원심분리 후 상층액을 3번으로 옮긴 후 남은 펠릿과 PBS 20 μL를 넣어 혼합하였다. 2번 튜브는 5분간 3000 rpm에서 원심분리 후 상층액을 버리고 펠릿과 PBS 60 μL를 넣어 혼합한 후 1번의 20 μL와 혼합하여 총 80 μL로 혈구분석기(Hemavet 950FS, Drew Scientific Inc, Korea)를 활용하여 혈구분석을 실시하였다.
(2) 채혈은 심장 채혈하였다.
(3) BALF의 IgE 분석
BD 마우스 IgE ELISA 세트(BD OptEIA, 카탈로그 번호: 555248)를 사용하며, 시약은 키트 Datasheet에 맞게 준비하였다. Coat 마이크로웰에 코팅 완충액으로 희석한 Capture Ab를 100 μL씩 넣고 커버를 덮고 4 ℃에서 하룻밤 방치하였다. 세척 완충액으로 300 μL씩 3번 세척하였다. 각 웰에 어세이 희석액 200 μL씩을 넣고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 300 μL씩 3번 세척하였다. 각 웰에 어세이 희석액으로 희석한 표준물과 샘플 100 μL씩을 넣고 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 세척 완충액 300 μL로 5번 세척하였다. 각 웰에 Working Detector (Detection Antibody + SAv-HRP reagent)를 100μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 300 μL씩 7번 세척한 후 각 웰에 TMB 기질 용액을 100 μL씩 넣고 실온의 암조건에서 30분 인큐베이션하였다. 각 웰에 중지액을 50 μL씩 첨가하여 450 nm에서 측정하였다.
(4) H&E 염색
H&E 염색은 Hematoxylin & Eosin 염색법으로 조직 염색에서 가장 널리 사용되는 염색법이다. 헤마톡실린은 염기성으로 조직에서 인산기가 많이 들어있는 핵을 염색하기 위하여 사용된다. 에오신(Eosin)은 산성으로 염기성을 띠는 원자단과 결합하여 색을 내게 되는데 세포질, 세포벽 등의 세포의 바깥구조를 염색한다.
파리핀 제거 및 수화과정으로 자일렌 15분, 80% 알코올 1분, 90% 알코올 1분, 100% 알코올 1분의 과정을 실시하였다. 탈수과정 후 1차 증류수에 5분 동안 수세를 실시한 후 헤마톡실린에 1분 30초 동안 담가 염색하였다. 염색 후 조직이 파랗게 보일 때까지 1차 증류수에 15분간 세척을 수행하였다. 청명과정 및 탈수과정으로 95% 알코올 1분, 에오신 6분, 95% 알코올 1분, 95% 알코올 1분, 100% 알코올 1분, 자일렌 6분 동안 한 후에 고정하는 과정으로 조직봉입을 실시하였다. 조직봉입 후 현미경으로 관찰하였다.
(5) PAS 염색
조직 내에는 폴리사카라이드, 뮤코폴리사카라이드, 뮤코단백질, 당단백질 등이 존재한다. PAS 염색은 이들 단백질과 결합된 탄수화물기가 과요오드산(periodic acid)에 의해 산화되어 알데히드기를 생성하고 이것이 Schiff 시약과 작용하여 붉은 자주색을 나타낸다.
이 실험은 파라핀 제거 및 수화과정으로 자일렌 15분, 80% 알코올 1분, 90% 알코올 1분, 100% 알코올 1분의 과정을 실시하였다. 실시 후 10분 동안 0.5 % 과요오드산 용액에 담가 조직을 산화시켰다. 산화 후 5분 동안 흐르는 수돗물에 수세하고 3분 정도 동안 1차 증류수로 가볍게 세척하였다. 세척 후 10분 동안 Schiff 시약에 담가 반응시킨 후 5분 동안 흐르는 수돗물에 수세하였다. 세척 후 1분 30초 동안 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 염색하고 다시 10분 동안 흐르는 물에 세척하였다. 세척 후 고정 과정으로 조직봉입을 실시한 후 현미경으로 관찰하였다.
4) 시험 결과
(1) 일반증상관찰: 실험기간 중 특별한 증상은 관찰되지 않았다.
(2) 체중 및 사료량 측정결과: 실험군 사이에서 유의할 만한 체중 차이는 관찰되지 않았다.
(3) BALF 중 분화 세포수(Differential cell count)
도 1은 OVA 유도군에서 동백유 투여에 의한 WBC 세포수 변화를 나타낸 것이다. 도 1에서 보는 바와 같이, WBC는 OVA 유도군에서 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였고 동백유의 농도별 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였다.
도 2는 OVA 유도군에서 동백유 투여에 의한 호산구 세포수 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보는 바와 같이, 호산구는 OVA 유도군에서 대조군과 비교하여 증가하였고 동백유 농도별 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였다.
도 3은 OVA 유도군에서 동백유 투여에 의한 IgE 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보는 바와 같이, IgE는 OVA 유도군에서 대조군과 비교하여 유의성 있게 증가하였고 동동백유 농도별 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였다.
(4) H&E 염색
도 4는 OVA 유도군에서 동백유 투여에 의한 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다(a: CON, b: OVA, c: DEX, d: 동백유 10 mg/kg, e: 동백유 100 mg/kg, f: 동백유 500 mg/kg). 도 4에서 보는 바와 같이, OVA 유도군에서 대조군과 비교하여 호산구, 점액, 상피증식(epithelial hyperplasia)이 증가하였고 양성대조군은 대조군과 비슷하게 감소하였으며 동백유 농도별 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였다.
(5) PAS 염색
도 5는 OVA 유도군에서 동백유 투여에 의한 PAS 염색 결과를 나타낸 것이다(a: CON, b: OVA, c: DEX, d: 동백유 10 mg/kg, e: 동백유 100 mg/kg, f: 동백유 500 mg/kg). 도 5에서 보는 바와 같이, OVA 유도군에서 대조군과 비교하여 점액이 증가하였고 양성대조군은 대조군과 비슷하게 감소하였으며 동백유 농도별 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하였다.
Claims (2)
- 동백나무(Camellia japonica) 종자로부터 종피를 제거한 후 압착하여 제조된 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 동백나무(Camellia japonica) 종자로부터 종피를 제거한 후 압착하여 제조된 동백유를 유효성분으로 포함하는 천식 예방 및 개선용 식품 조성물.
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