CN112384225A - 食用偶氮染料亮黑bn在抑制引起手足口病的人肠道病毒的感染性中的应用 - Google Patents
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Abstract
提供了使用食用染料、特别是偶氮染料和磺化的偶氮染料抑制或治疗肠道病毒感染、特别是EV71和柯萨奇病毒感染以及与肠道病毒感染相关的疾病的方法和组合物，所述疾病包括手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。优选地，所述食用染料是E102柠檬黄、E110日落黄FCF、E122酸性红、E123苋菜红、E124胭脂红4R、E126胭脂红6R、E129诱惑红或E151亮黑BN(Black PN)。
Description
技术领域
本发明涉及食用染料降低人肠道病毒的感染性的用途，更具体地食用偶氮染料降低引起手足口病的肠道病毒(如EV71和柯萨奇病毒)的感染性的用途。本发明还涉及包含食用偶氮染料的抗病毒药物组合物。
背景技术
作为儿童中常见且具高度传染性的疾病的手足口病(HFMD)是由包括肠道病毒71(EV71)、柯萨奇病毒A16(CVA16)和柯萨奇病毒A6(CVA6)在内的人肠道病毒引起的[Chumakov M等人,(1979)Arch Virol 60:329-340；Solomon T等人,(2010)Lancet InfectDis 10:778-790]。HFMD通常是轻度且自限性的；然而，EV71的感染偶尔会导致致命的肺水肿和神经障碍，如脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹[Solomon T等人,(2010)LancetInfect Dis 10:778-790；Chang LY等人,(1999)Lancet 354:1682-1686]。自20世纪90年代以来，在亚太地区的EV71流行期间已经报告了数百万例感染病例和数千例死亡[Shimizu H等人,(1999)Jpn J Infect Dis 52:12-15；McMinn P等人,(2001)Clin Infect Dis 32:236-242；Wu JM等人,(2002)Pediatrics 109:E26-；Wu Y等人,(2010)Int J Infect Dis14:e1076-1081；Yang F等人,(2009)J Clin Microbiol47:2351-2352]。尽管自2015年以来已经有灭活的EV71疫苗可用[Zhu F等人,(2014)N Engl J Med 370:818-828；Zhou Y等人,(2016)Expert Rev Vaccines 15:803-813]，但是治疗HFMD及其相关发病和死亡的商业抗病毒药物仍然不可用。
属于小RNA病毒科中的肠道病毒属的人肠道病毒具有包裹在无包膜的二十面体颗粒中的正义单链RNA基因组，其中如下4种病毒结构蛋白中的每一种均具有60个拷贝：VP1至VP4。VP1参与肠道病毒的细胞附着和进入。例如，EV71病毒体上的每个VP1五聚体在5重对称轴处形成突出的星形平台，被称为峡谷的深凹陷围绕[Plevka P等人,(2012)Science 336:1274；Wang X等人,(2012)Nat Struct Mol Biol 19:424-429]。已经鉴定出作为所有测试的EV71病毒的功能性受体的清道夫受体B类成员2(SCARB2)与峡谷结合[Yamayoshi S等人,(2009)Nat Med 15:798-801；Dang M等人,(2014)Protein Cell 5:692-703]。相比之下，细胞表面上的硫酸化P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)和糖胺聚糖(GAG)与病毒衣壳的5重轴的顶点相互作用，从而促进EV71附着和感染[Nishimura Y等人,(2009)Nat Med 15:794-797；Nishimura Y等人,(2010)PLoS Pathog 6:e1001174；Nishimura Y等人,(2013)PLoSPathog 9:e1003511；Pourianfar HR等人,(2012)Virus Res 169:22-29；Tan CW等人,(2013)J Virol 87:611-620；Tan CW等人,(2017)Virology 501:79-87]。已经发现硫酸化的/磺化的肝素苏拉明和苏拉明衍生物与5重轴的顶点相互作用和结合，从而阻断EV71附着于宿主细胞[Wang Y等人,(2014)Antiviral Res 103:1-6；Ren P等人,(2014)EmergMicrobes Infect 3:e62；Nishimura Y等人,(2015)PLoS Pathog 11:e1005184]。通过与5重轴顶点处的VP1的H-I环相互作用并对其构象进行修饰，已经将细胞蛋白亲环蛋白A确定为EV71脱壳调节因子[Qing J等人,(2014)PLoS Pathog 10:e1004422]。与5重轴的顶点结合的抗体也预防EV71感染[Lee H等人,(2013)J Virol 87:11363-11370]。此外，在EV71表面上的峡谷和5重轴顶点周围的带正电荷的氨基酸精氨酸和赖氨酸对于活病毒的产生而言很重要[Yuan S等人,(2015)J Virol 90:741-752]。因此，靶向EV71的峡谷和5重轴顶点周围的带正电荷的氨基酸的化学与生物药剂可能成为对抗EV71感染的治疗剂的有希望的候选物。
偶氮染料通常是从石油合成的，并且占全世界所有有机染料的高达70％[Zollinger H(2003)Color chemistry:syntheses,properties,and applications oforganic dyes and pigments第3版,Wiley-VCH,Cambridge]。它们的特征在于在其结构中存在与两个不同或相同的单环或多环芳族基团共轭的偶氮键(-N＝N-)。它们可以仅含有一个偶氮部分，但是有些具有两个(重氮)或更多。偶氮染料的合成和生产很容易，并且据估计已经合成了超过10,000种偶氮染料，其中约3,000种在各个领域中在全球范围内使用[Zollinger H(2003)Color chemistry:syntheses,properties,and applications oforganic dyes and pigments第3版,Wiley-VCH,Cambridge；Robinson T等人,(2001)Bioresour Technol 77:247-255]。大多数偶氮染料是水溶性的，并且具有一个或多个与芳环连接的磺酸基并且以钠盐形式存在。偶氮染料的磺化增加了它们的溶解度，同时通过降低它们跨过细胞膜的渗透性而降低了它们在人和动物中的吸收，从而增强了它们的尿排泄和新陈代谢。一些偶氮染料被称为食用偶氮染料，因为它们被允许在食品、饮料和制药行业中用作添加剂。所有具有E编号的食用偶氮染料都可以在欧洲食品安全局(EFSA)的食品添加剂列表中找到。已知一些偶氮染料与蛋白质相互作用并且具有抗微生物活性[Baba M等人,(1993)Antiviral Chem Chemother 4:229-234；Ojala WH等人,(1995)Antiviral ChemChemother 6:25-33；Ojala WH等人,(1996)J Am Chem Soc 118:2131-2142；Ono M.等人,(1997)Nat Biotechnol 15:343-348；Weglarz TE,Gorecki L(2012)CHEMIK 66:1303-1307]。然而，食用偶氮染料的生物学作用和医学潜力(尤其是对肠道病毒)在很大程度上尚不清楚。
需要新的疗法来治疗包括引起HFMD的那些在内的肠道病毒感染。
发明内容
本发明涉及食用染料降低人肠道病毒的感染性的用途。更具体地，本发明涉及食用偶氮染料磺化的食用偶氮染料降低可以引起手足口病的肠道病毒(如EV71和柯萨奇病毒)的感染性的用途。
根据第一方面，本发明提供了一种包含至少一种食用染料的药物组合物，其用于医学。
在一些实施方案中，所述食用染料是偶氮染料。
在一些实施方案中，所述食用偶氮染料是磺化的食用偶氮染料。
在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗病毒感染。
在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗病毒相关疾病。在优选的实施方案中，所述病毒是肠道病毒，更优选地EV71和/或柯萨奇病毒。
在一些实施方案中，所述病毒相关疾病选自手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。
在优选的实施方案中，所述病毒相关疾病是手足口病(HFMD)。
在一些实施方案中，所述至少一种食用染料选自E102柠檬黄、E110日落黄FCF、E122酸性红、E123苋菜红、E124胭脂红4R、E126胭脂红6R、E129诱惑红和E151亮黑BN。
在一些实施方案中，所述至少一种食用染料选自E122酸性红、E123苋菜红、E129诱惑红和E151亮黑BN。
在优选的实施方案中，所述至少一种食用染料是E151亮黑BN。
在一些实施方案中，所述至少一种食用染料是选自E122酸性红、E123苋菜红、E129诱惑红和E151亮黑BN、优选E151亮黑BN的磺化的食用偶氮染料。
在一些实施方案中，本发明任何方面的组合物包含所述至少一种食用染料的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学功能衍生物。
在一些实施方案中，将所述组合物配制用于向受试者口服和/或局部施用。在一些实施方案中，将所述组合物配制为凝胶剂、乳膏剂、泡沫剂、洗剂或软膏剂。
在一些实施方案中，将所述组合物配制用于向受试者连续施用2至5天的时间、优选3至4天的时间。
在一些实施方案中，将所述组合物配制用于以高达4mg/kg体重/天(“体重/天”在下文缩写为“bw/天”)(E122)；15mg/kg bw/天(E123)；7mg/kg bw/天(E129)或5mg/kg bw/天(E151)的最大剂量施用。
根据另一方面，本发明提供了根据本发明任何方面的组合物用于制备治疗或预防肠道病毒感染或肠道病毒相关疾病用的药物的用途。
在一些实施方案中，所述病毒感染或病毒相关疾病是由肠道病毒引起的。
在优选的实施方案中，所述病毒是EV71和/或柯萨奇病毒、更优选EV71。
在一些实施方案中，所述病毒相关疾病选自手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。
在一些实施方案中，所述肠道病毒感染在受试者中表现为手足口病(HFMD)。
根据进一步的方面，本发明提供了一种治疗或预防病毒感染或病毒相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据本发明的组合物。
在一些实施方案中，所述病毒感染或病毒相关疾病是由肠道病毒引起的。
在优选的实施方案中，所述病毒是EV71和/或柯萨奇病毒、更优选EV71。
在一些实施方案中，所述肠道病毒相关疾病选自手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。在优选的实施方案中，所述肠道病毒相关疾病是手足口病(HFMD)。
在一些实施方案中，将所述组合物施用2至5天的时间、优选3至4天的时间。
在一些实施方案中，将所述组合物以高达4mg/kg bw/天(E122)；15mg/kg bw/天(E123)；7mg/kg bw/天(E129)或5mg/kg bw/天(E151)的最大剂量施用。
根据进一步的方面，本发明提供了一种用于治疗或预防肠道病毒感染或肠道病毒相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明任何方面的组合物。
为了方便起见，在本说明书中提到的书目参考文献以参考文献列表的形式列出并且添加在实施例的末尾。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。
附图说明
图1示出了食用染料对EV71-GFP感染RD细胞的影响。将EV71-GFP病毒与在细胞培养基中稀释的不同染料在37℃下一起孵育1h，然后以1的感染复数(MOI)接种到96孔板中的RD细胞中。在感染后24h观察并记录GFP信号。在此组下选择的所有磺化的食用偶氮染料E102、E110、E122、E123、E124、E126、E129和E151在300μM的浓度下都对EV71-GFP的感染展示出一定程度的抑制，如通过与模拟对照相比GFP信号的减少所示，而没有展现出细胞毒性。对三种另外的磺化的食用染料E131、E132和E133进行了类似的测试，但是只有E132在300μM的浓度下对EV71-GFP展现出抑制。总体而言，E122、E123、E129和E151是EV71-GFP感染的4种最强抑制剂。
图2A至2D示出了染料E122、E123、E129和E151的抗病毒和细胞毒性研究。(A)这4种抗EV71食用偶氮染料的化学结构。它们全部都含有磺化的芳环。(B)在体外E151对EV71-GFP感染的浓度依赖性抑制。将RD细胞在存在不同浓度的E151的情况下以1的MOI用EV71-GFP感染12h。在细胞固定之后，通过Hoechst 33258染色使所有细胞的细胞核(深灰色)可视化，并且在荧光显微镜下通过GFP信号(浅灰色)指示感染细胞。随着E151浓度的增加，GFP阳性细胞的数量逐渐减少。(C)在从0μM至200μM的指示浓度的4种偶氮染料之一处理之后感染细胞(GFP阳性)的百分比。给出了每种浓度的3个随机斑点的平均值±标准误差。(D)E122、E123、E129和E151在RD细胞中的细胞毒性研究。将细胞在DMEM-10中在不同浓度的每种染料中培养。在3天之后，通过MTT测定来测量在存在每种相应染料的情况下的细胞活力，并且以在不存在染料的情况下的细胞活力的百分比给出。示出了一式三份实验的平均值±标准误差。
图3A至3C示出了偶氮染料对人肠道病毒滴度的抑制作用。(A)来自不同亚基因群的八种RD细胞适应性EV71毒株和(B)EV71的其他4种临床分离株和6种柯萨奇A病毒在存在E122、E123、E129或E151的情况下的滴度降低测定。(C)E151对5种代表性肠道病毒的病毒后代产量的抑制作用。将RD细胞在存在各种浓度的E151的情况下以0.1的MOI用病毒感染48h。在RD细胞中滴定后代病毒，并且将其滴度以未经E151处理的后代病毒的百分比给出。示出了一式三份实验的平均值±标准误差。括号指示p值<0.05。
图4A和4B显示EV71的VP1-98和VP1-145处的氨基酸调节EV71对染料的敏感性。(A)EV71 VP1的多重蛋白质比对。对所有4种染料E122、E123、E129和E151都高度敏感的EV71-B2、EV71-B4、EV71-B5、EV71-C4和EV71-202具有VP1-98E,145G/Q，而对这4种染料稍敏感或有抗性的EV71-C1、EV71-C4、EV71-252和EV71-2242具有VP1-98K,145E(由方框突出显示)。(B)这4种染料对在VP1-98和VP1-145处具有不同氨基酸组合的EV71变体的感染性的影响。在RD细胞中在不存在或存在每种相应染料的情况下进行EV71变体的滴度降低测定。示出了一式三份实验的平均值±标准误差。括号指示p值<0.05。
图5A至5D示出了对E151抗性EV71突变体(命名为EV71-B5res)的选择和表征。(A)使EV71-B5在RD细胞中在存在E151的情况下传代。当与亲本野生型EV71-B5相比时，在VP1中具有如下3个氨基酸变化的第22代EV71-B5res(即EV71-E151-P22)展现出完全的E151抗性：E98K、G145E和P246A。核苷酸突变在双括号中加有下划线。(B)VP1-P246A为EV71 KE(VP1-98K,145E)毒株赋予完全的E151抗性。通过反向遗传(RG)将P246A引入EV71-B5、EV71-C4和EV71-2242毒株中。在RD细胞中在不存在或存在100μM E151的情况下滴定第二次传代的病毒。示出了一式三份实验的均值±SEM。括号指示p值<0.05。(C)EV71病毒体的卡通图像(从ViralZone网站改编)，所述病毒体是无包膜的二十面体，其中如下结构蛋白具有60个拷贝：VP1至VP4。黑色正五边形指示由VP1五聚体形成的5重轴的顶点。(D)EV71 5重轴顶点的三维表面。VP1-246(深色)和VP1-145(深色)处的氨基酸对于E151结合以预防EV71感染至关重要。VP1-246P是保守的，而VP1-145E占主导地位。具有VP1-145G/Q的EV71毒株对E151高度敏感，而具有VP1-145E的毒株对E151的敏感性较低。带正电荷的VP1-98K、VP1-242K和VP1-244K(暗灰色)也可能通过静电吸引与E151相互作用。
图6A至6D示出了E151对EV71附着于细胞或附着因子的抑制。(A)E151影响EV71-eGFP感染的早期阶段(细胞进入)。将RD或Vero细胞以1的MOI用EV71-eGFP感染。在感染后-1、0、1、2、3或4h以100μM的终浓度施用E151。在感染后12h，将细胞固定并用Hoechst 33258染色。在荧光显微镜下拍摄图像，并且通过使用
软件将其合并。当从感染后2h起添加E151时，未能阻止EV71-eGFP的感染(浅灰色)。每种处理的3个随机视野中的感染细胞(浅灰色)的百分比在代表性图像的左上角以均值±SEM给出。(B)E151以浓度依赖性方式阻止EV71-B4(对E151高度敏感)和EV71-C1(对E151的敏感性较低)在RD细胞上的附着。将预冷的病毒和细胞在4℃下孵育以进行附着，然后通过免疫印迹分析附着的病毒和细胞。尽管EV71-B5res对E151有抗性，E151在300μM的浓度下还是部分阻断其附着于RD细胞。(C)E151在下拉测定中破坏EV71-B4与人PSGL-1的结合，但是不破坏与人SCARB2重组蛋白的结合。使3μg SCARB2-Fc、1μg PSGL-1-Fc和3μg CTLA-4-Fc(对照)与蛋白A/G加琼脂糖结合，然后与经纯化的EV71-B4一起孵育。通过免疫印迹分析沉淀的蛋白质。(D)E151以剂量依赖性方式阻止EV71-B4与肝素琼脂糖的结合。
图7A和7B示出了E151对被VP1-P246A消除的EV71 KE毒株的附着的抑制作用。(A)E151在免疫印迹测定中以剂量依赖性方式阻止RG/EV71-B5-EGP(VP1-98E,145G,246P，对E151高度敏感)和RG/EV71-B5-KEP(VP1-98K,145E,246P，对E151稍敏感)在RD细胞和肝素上的附着，但是不阻止RG/EV71-B5-KEA(VP1-98K,145E,246A，对E151有抗性)在RD细胞和肝素上的附着。(B)E151在免疫荧光共聚焦显微术测定中阻止RG/EV71-B5-KEP在Vero细胞上的附着，但是不阻止RG/EV71-B5-KEA病毒体在Vero细胞上的附着。允许病毒体在存在或不存在100μM E151的情况下在4℃下附着于预冷的Vero细胞持续1h。在细胞固定之后，分别用抗EV71血清、抗EEA1抗体和Hoechst 33258对附着的病毒体(浅灰色小点；在放大视图中以箭头标识)、细胞早期内体(灰色小点)和细胞DNA或细胞核(浅灰色区域)染色。在代表性的绿色EV71通道图像(放大600倍)中的每个细胞的EV71点(puncta)数(平均值±标准误差)在右上角。在对应的EV71/EEA1/DNA多通道图像中的小方块的放大视图在左上角。
图8A至8C显示E151抑制附着后的EV71-eGFP感染。(A)首先将在96孔板中接种的RD或Vero细胞在4℃下预冷15min，并且将冰冷培养基中的EV71-eGFP以10的MOI添加到细胞中以进行附着。在4℃下孵育1h之后，使用冰冷的PBS将未附着的病毒从细胞中洗掉。添加有或没有100μM E151的新鲜DMEM 10，并且将细胞转移到37℃培养箱中。在11h之后，将细胞固定并用Hoechst 33258染色。在荧光显微镜下拍摄图像，并且使用
软件将其合并。在每种条件下的3个随机斑点处的感染细胞(浅灰色)的百分比在代表性图像的左上角以平均值±标准误差给出。(B)E151在免疫荧光共聚焦显微术测定中阻止RG/EV71-B5-KEP内化到Vero细胞中，但是不阻止RG/EV71-B5-KEA内化到Vero细胞中。允许附着的病毒体在存在或不存在100μM E151的情况下在37℃下内化到细胞中持续30min。在细胞固定之后，分别用抗EV71血清、抗EEA1抗体和Hoechst 33258对病毒体(浅灰色小点；在放大视图中以箭头标识)、细胞早期内体(灰色小点)和细胞DNA或细胞核(浅灰色区域)染色。在代表性的绿色EV71通道图像(放大600倍)中的每个细胞的EV71点数(平均值±标准误差)在右上角。在对应的EV71/EEA1/DNA多通道图像中的小方块的放大视图在左上角。(C)E151以浓度依赖性方式将附着的EV71病毒体从RD细胞中洗脱出。将E151敏感性EV71-B5或抗性EV71-B5res与RD细胞在4℃下一起孵育1h以进行附着，并且用冰冷的PBS洗掉未附着的病毒。将附着的病毒-细胞分为3部分，并且重悬于具有0、30或100μM E151的冰冷PBS中。在4℃下伴随轻轻搅拌孵育15min之后，分离细胞沉淀和上清液以使用免疫印迹检测EV71抗原。E151从RD细胞中洗脱出附着的EV71-B5，但是并未洗脱出抗性EV71-B5res，这意味着病毒-细胞早期相互作用是可逆的，并且E151与细胞竞争结合野生型EV71。
图9示出了E151对EV71与脱壳因子亲环蛋白A(CypA)结合的阻止。在GST下拉测定中，将谷胱甘肽琼脂糖结合的GST或GST-CypA与经纯化的EV71-B5或EV71-E5res在不存在或存在E151的情况下一起孵育。用1D9抗体和抗GST血清通过免疫印迹分析沉淀的蛋白质。EV71-B5与GST-CypA相互作用，但是不与GST相互作用，并且在存在100μM E151的情况下未能与GST-CypA结合。如之前报道的，在EV71-B5res中的P246A几乎消除了病毒与GST-CypA之间的相互作用。
图10A至10C示出了E151对EV71激发的AG129小鼠的保护。(A)图指示了所述程序的时间线。将10LD50的EV71-B4(对E151高度敏感)或EV71-C1(对E151稍敏感)与1剂E151(200mg/kg bw/天)或PBS一起腹膜内地接种到14日龄的AG129小鼠中，然后在接下来的3天(即在小鼠出生之后的第15天至第17天)每天施用1剂E151。每天记录小鼠的发病和死亡，直到在病毒接种之后的21天。(B)记录经或未经E151处理的用EV71-B4或EV71-C1激发的小鼠的每日存活百分比(每组8只小鼠)，直到在激发之后的21天。未经E151处理的所有激发的小鼠都死亡，而经处理的小鼠则存活。(C)后代病毒在来自经PBS或E151处理的EV71-C1感染小鼠的脑(圆形)和后肢肌肉(三角形)中的滴度。在激发后4、8或12天对小鼠(每组每个时间点5只)实施安乐死，并且在RD细胞中滴定匀浆组织中的感染性病毒。将均值显示为实线(脑)或虚线(后肢肌肉)，并且还给出了经PBS与E151处理的小鼠之间的脑(圆形)或后肢肌肉(三角形)的p值。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。
为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。
如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为指定所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由……组成”。单词“包含(comprising)”的变体(如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)以及“包括(including)”的变体(如“包括(include)”和“包括(includes)”)具有对应变化的含义。
如本文所用，术语“食用染料”应解释为包括当添加到用于消耗的食品、饮料或药物中时赋予颜色的任何人工或天然着色剂、颜料或物质。
如本文所用，术语“磺化的偶氮食用染料”或“磺化的偶氮染料”应解释为包括通式R-N＝N-R'的合成有机化合物，其包含至少一个偶氮基-N＝N-和经取代的脂族、芳族或杂环系统(R，R')作为结构的一部分，其中经取代的芳族系统包括至少一个磺酸基。
在本文中(在本发明的任何方面或实施方案中)对所述“食用染料”、“磺化的偶氮食用染料”或“磺化的偶氮染料”的提及包括对此类化合物本身的提及，对此类化合物的互变异构体的提及，以及对此类化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学功能衍生物的提及。
可以提到的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。此类盐可以通过常规方式形成，例如通过使式I化合物的游离酸或游离碱形式与一或多个当量的适当的酸或碱反应，任选地在溶剂中或在盐不溶的介质中，随后使用标准技术(例如真空、通过冷冻干燥或通过过滤)除去所述溶剂或所述介质。也可以例如使用合适的离子交换树脂通过将盐形式的血清素能化合物的反荷离子与另一反荷离子交换来制备盐。
药学上可接受的盐的例子包括源自无机酸和有机酸的酸加成盐、以及源自金属(如钠、镁或优选钾和钙)的盐。
酸加成盐的例子包括与如下酸形成的酸加成盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸和对甲苯磺酸)、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、粘酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙基磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-L-苹果酸)、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、偏磷酸、甲磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一碳烯酸和戊酸。
盐的具体例子是源自以下的盐：无机酸，如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；有机酸，如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸；以及金属，如钠、镁或优选钾和钙。
如上文所提到的，所述“食用染料”、“磺化的偶氮食用染料”或“磺化的偶氮染料”化合物还涵盖所述化合物的任何溶剂化物及其盐。优选的溶剂化物是通过将无毒的药学上可接受的溶剂(下文称为溶剂化溶剂)的分子掺入本发明的化合物的固态结构(例如晶体结构)中而形成的溶剂化物。此类溶剂的例子包括水、醇(如乙醇、异丙醇和丁醇)和二甲亚砜。可以通过用溶剂或含有溶剂化溶剂的溶剂混合物重结晶本发明的化合物来制备溶剂化物。在任何给定情况下是否已经形成溶剂化物可以通过使用众所周知的标准技术(如热重分析(TGE)、差示扫描量热法(DSC)和X射线晶体学)对化合物的晶体进行分析来确定。
溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，并且水合物的例子包括半水合物、一水合物和二水合物。
本发明的化合物将通常作为与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的药物配制品来施用，可以适当考虑预期的施用途径和标准药学实践来选择所述佐剂、稀释剂或载体。此类药学上可接受的载体对活性化合物而言可以是化学惰性的，并且在使用条件下可以没有有害的副作用或毒性。合适的药物配制品可以在例如Remington The Science andPractice of Pharmacy,第19版,Mack Printing Company,Easton,Pennsylvania(1995)中找到。对于肠胃外施用，可以采用肠胃外可接受的水性溶液，其不含热原并且具有必需的pH、等渗性和稳定性。合适的溶液将是技术人员众所周知的，并且在文献中描述了许多方法。药物递送方法的简要综述也可以在例如Langer,Science(1990)249,1527中找到。
否则，技术人员可以使用常规技术和/或根据标准和/或公认的药学实践来常规地制备合适的配制品。
在一些实施方案(如包括包含本发明公开的主题的磺化的偶氮食用染料的药物组合物的那些)中，可以口服和/或局部施用药物组合物，从而治疗病毒感染。在一些实施方案中，将组合物配制为凝胶剂、乳膏剂、泡沫剂、洗剂或软膏剂。
不论施用途径如何，本发明的化合物通常以有效达到所需反应的量施用。如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指治疗组合物(例如，包含磺化的偶氮食用染料和药学媒介物、载体或赋形剂的组合物)的足以产生可测量的生物学反应(例如，肠道病毒感染量的减少)的量。可以改变本发明的治疗组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便施用对于具体受试者和/或应用而言有效地实现所需治疗反应的量的一种或多种磺化的活性偶氮食用染料。当然，在任何具体情况下的有效量将取决于多种因素，包括治疗组合物的活性、配方、施用途径、与其他药物或疗法的组合、所治疗病症的严重程度以及所治疗受试者的身体状况和既往病史。优选地，施用最小剂量，并且在每种相应的磺化的偶氮食用染料的规定最大日剂量内将剂量逐步增加至最小有效量。治疗有效剂量的确定和调整以及对何时和如何进行此类调整的评价是本领域普通技术人员已知的。
有关配方和剂量的另外的指导，参见美国专利号5,326,902和5,234,933；PCT国际公开号WO 93/25521；Berkow等人,(1997)The Merck Manual of Medical Information,Home编辑Merck Research Laboratories,Whitehouse Station,N.J.；Goodman等人,(2006)Goodman&Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版McGraw-Hill Health Professions Division,New York；Ebadi.(1998)CRC DeskReference of Clinical Pharmacology.CRC Press,Boca Raton,Fla.；Katzung,(2007)Basic&Clinical Pharmacology,第10版Lange Medical Books/McGraw-Hill MedicalPub.Division,New York；Remington等人,(1990)Remington's PharmaceuticalSciences,第18版Mack Pub.Co.,Easton,Pa.；Speight等人,(1997)Avery's DrugTreatment:A Guide to the Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Valueof Drugs in Disease Management,第4版Adis International,Auckland/Philadelphia；以及Duch等人,(1998)Toxicol.Lett.100-101:255-263，将其中的每一个通过引用并入本文。
术语“受试者”在本文中定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究的目的，受试者可以特别是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。特别地，为了治疗肠道病毒感染和/或肠道病毒相关疾病，受试者可以是被EV71和/或柯萨奇病毒感染的人。肠道病毒相关疾病的例子包括但不限于HFMD、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。
如在本发明的上下文中使用的术语“治疗”是指预防性、改善性、治疗性或治愈性治疗。
具体实施方式
现在已经大体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，所述实施例是通过说明的方式而提供的，并不旨在限制本发明。
实施例
如在Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSprings Harbor Laboratory,New York(2012)中所描述的，通常遵循本领域已知且未具体描述的标准分子生物学技术。
方法
细胞、病毒和食用偶氮染料
将人横纹肌肉瘤(RD；ATCC编号CCL-136)和猴Vero(ATCC编号CCL-81)细胞系在5％CO2培养箱中在37℃下维持在补充有10％胎牛血清(FBS)(Biowest)和1X抗生素-抗真菌药(Life Technologies)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Life technologies)中。
使人肠道病毒的18种临床分离株(表1)和由反向遗传系统产生的1种合成EV71-C4[Meng T等人,(2012)Virol J 9:238]在RD细胞中扩增，然后在-80℃下储存用于将来的实验。
表1.在此实验研究中使用的病毒列表。
*由于在体外病毒繁殖期间发生突变，我们实验室中病毒的基因组序列可能与GenBank中公布的不同。
**[Wu Y等人,(2010)Int J Infect Dis 14:e1076-1081]。
使用Reed和Muench公式，在RD细胞中将病毒滴度确定为50％组织培养感染剂量(TCID50)。使用引物seqEV71-P1-F和seqEV71-P1-R通过OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen)扩增EV71和CVA16的P1基因，然后将其插入pJET1.2载体(Thermo Scientific)中以进行测序(表2)。
表2.在此实验研究中使用的引物列表。
R＝A或G；Y＝C或T；K＝G或T
所有食用染料柠檬黄(03322-25MG)、日落黄(68775-25MG)、酸性红(52245-25MG)、苋菜红(87612-25MG)、胭脂红4R(18137-25MG)、胭脂红6R(96365-25MG)、诱惑红AC(38213-25MG、458848-100G)、Black PN(11220-25MG、211842-10G)、专利蓝V(74748-25MG)和亮蓝FCF(80717-100MG)都购自Sigma-Aldrich。将10mM的所有染料溶解在无菌水中，然后用DMEM稀释至所需浓度。
在本发明中示例的E151的化学结构如下所示。
E151是具有分子式C28H17N5Na4O14S4的磺化的双偶氮染料，分子量为867.68g/mol。其IUPAC化学名称为4-乙酰胺基-5-羟基-6-[7-磺酸根-4-(4-磺酸根苯偶氮基)-1-萘偶氮基]萘-1,7-二磺酸四钠。“E151”在本文中也可以用它的几个通用名称之一来提及，如“B09”、亮黑、亮黑BN或亮黑PN。
其IUPAC化学名称为(4E)-5-氧代-1-(4-磺酸根苯基)-4-[(4-磺酸根苯基)亚肼基]-3-吡唑甲酸三钠；化学式为C16H9N4Na3O9S2并且摩尔质量为534.3g/mol。
其IUPAC化学名称为6-羟基-5-[(4-磺基苯基)偶氮基]-2-萘磺酸二钠；化学式为C16H10N2Na2O7S2并且摩尔质量为452.36g/mol。
其IUPAC化学名称为4-羟基-2-[(E)-(4-磺酸根-1-萘基)二氮烯基]萘-1-磺酸二钠；化学式为C20H12N2Na2O7S2并且摩尔质量为502.44g/mol。
其IUPAC化学名称为(4E)-3-氧代-4-[(4-磺酸根-1-萘基)亚肼基]萘-2,7-二磺酸三钠；化学式为C20H11N2Na3O10S3并且摩尔质量为604.47g/mol。
其IUPAC化学名称为1-(4-磺基-1-萘偶氮基)-2-萘酚-6,8-二磺酸三钠盐；化学式为C20H11N2Na3O10S3并且摩尔质量为604.46g/mol。
其IUPAC化学名称为7-羟基-8-(萘-1-二氮烯基)萘-1,3-二磺酸二钠；化学式为C20H12N2Na2O7S2并且摩尔质量为502.43g/mol。
其IUPAC化学名称为6-羟基-5-[(2-甲氧基-5-甲基-4-磺基苯基)偶氮基]-2-萘磺酸二钠；化学式为C18H14N2Na2O8S2并且摩尔质量为496.42g/mol。
其IUPAC化学名称为3,3′-二氧代-2,2′-双亚吲哚基(bisindolyden)-5,5′-二磺酸二钠盐；化学式为C16H8N2Na2O8S2并且摩尔质量为466.36g/mol。
抗体和重组蛋白
小鼠抗EV71血清是由被亚致死剂量的经纯化的EV71-B4免疫的AG129幼鼠产生的。使用小鼠抗EV71单克隆抗体1D9[Tang ML等人,(2012)J Med Virol 84:1620-1627]来在免疫印迹中检测和定量VP1。内部制备小鼠抗GST血清。小鼠HRP缀合的抗β-肌动蛋白抗体和山羊抗小鼠IgG-HRP抗体分别购自Dako和Life Technologies。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(sc-47778)购自Santa Cruz Biotechnology，并且HRP缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(P0260，Dako)和兔抗人IgG抗体(P021402-2，Dako)来自Agilent。Alexa Fluor(AF)594缀合的兔抗早期内体抗原1(EEA1)单克隆抗体(ab206913)和AF488缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(A32723)分别来自Abcam和Life technologies。
与人IgG1的Fc区融合的EV71附着因子人SCARB2和PSGL-1(SCARB2-Fc和PSGL-1-Fc)以及CTLA-4-Fc(阴性对照Fc蛋白)购自R&D Systems。根据标准方案表达并纯化与GST融合的EV71脱壳因子人亲环蛋白A。
GST标记的亲环蛋白A(GST-CypA)的表达和纯化
使用引物GST-CypA-F和GST-CypA-R通过Qiagen一步式RT-PCR试剂盒(Qiagen)从RD细胞的总RNA中扩增人亲环蛋白A ORF(NM_203431)。通过In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)，将其克隆到具有在N末端融合的GST标签的经BamH I消化的pGEX-4T-1表达载体中。将重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞中，并且在质粒纯化之后通过测序证实插入物的正确性。为了表达GST或GST-CypA，将经转化的细胞在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下进行培养。在OD600达到0.8之后，在22℃下通过终浓度为0.2mM的IPTG诱导蛋白质表达。在诱导5小时之后，收获细胞，并且根据标准方案纯化可溶性GST和GST-CypA。最后将经纯化的蛋白质溶解在PBS中，并且依据A280测量它们相应的浓度。
EV71-GFP报告病毒的产生
如先前所描述的[Yamayoshi S等人,(2009)Nat Med 15:798-801]，经修改构建了具有绿色荧光蛋白(GFP)基因的EV71-B4基因组。使用引物GFP/EV71-B4-F和GFP/EV71-B4-R(表2)通过PCR将感染性质粒pJET-hPolI-B4[Meng T等人,(2012)Virol J 9:238]线性化，使得5'UTR和VP4分离。用引物GFP-F和GFP-R(表2)扩增来自pLVX-IRES-ZsGreen1载体(Clontech)的在3'端具有EV71蛋白酶2A识别序列AITTL的GFP基因。所有PCR都使用Q5高保真2X Master Mix(New England Biolabs)进行，并且在DNA凝胶电泳之后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取PCR产物。通过In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)将经纯化的GFP-AITTL基因和经线性化的pJET-hPolI-B4质粒连接在一起，从而形成重组质粒pJET-hPolI-B4/GFP。通过使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)将质粒pJET-hPolI-B4/GFP直接转染到RD细胞中产生感染性EV71-GFP报告病毒，然后使其在RD细胞中进一步繁殖以再进行2次传代。
食用偶氮染料的细胞毒性测定
使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑鎓(MTT)测定试剂盒(TOX-1，Sigma)确定偶氮染料在细胞培养中的细胞毒性。将在具有10％FBS的100μl DMEM(DMEM-10)中的104个RD细胞接种到96孔板中并在培养箱中孵育6h。然后用含有不同浓度偶氮染料的新鲜DMEM-10更换培养基。在孵育3天之后，除去培养基，并且用PBS洗掉多余的偶氮染料。向每个孔中添加在DMEM-10中的浓度为0.5mg/ml的100μl的MTT，并且继续在培养箱中再孵育3h。然后添加100μl的MTT增溶溶液，并且将板在室温下轻轻涡旋15min。用Tecan的Sunrise酶标仪测量每个孔在570nm波长处的吸光度。通过比较经偶氮染料处理的细胞的吸光度与模拟细胞的吸光度来估计偶氮染料的细胞毒性。
食用偶氮染料对EV71的体外抗病毒活性
为了筛选抗EV71药物，将在EV71-B4基因组中含有GFP报告基因的EV71-GFP在含有浓度为300μM的偶氮染料的DMEM-10中稀释至104TCID50/100μl，并且在37℃下孵育1h。将经处理的病毒以104个细胞/孔的密度接种到96孔板中的RD细胞中，并且将板转移到培养箱中。在感染后24h，在紫外光显微镜(Olympus)下观察并记录每个孔中的GFP信号。
在偶氮染料对EV71感染的浓度依赖性抑制测定中，将104TCID50的EV71-GFP溶解在具有从200μM至3.1μM的2倍稀释染料的100μl DMEM-10中，并且在37℃下孵育1h。将经处理的病毒以1TCID50/细胞的感染复数(MOI)接种到96孔板中的RD细胞中。
在EV71感染的时间依赖性抑制测定中，以1的MOI用EV71-GFP感染96孔板中的密度为104个细胞/孔的RD细胞。在感染后-1、0、1、2、3和4h，将E151以100μM的终浓度添加到细胞培养基中。
在附着后阶段的EV71感染的抑制中，将96孔板中的密度为104个细胞/孔的RD细胞在4℃冷却器中冷却30min，并且与105TCID50的EV71-GFP在4℃下一起孵育以进行病毒附着。将未附着的病毒除去，并且1h后用冰冷的PBS洗涤两次。为细胞补足新鲜的DMEM-10，并且将其在培养箱中进行孵育。
在孵育12h之后，将细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定并用Hoechst 33258染色。在合并由紫外光显微镜记录的图像之后，使用
软件计算GFP阳性细胞的百分比。计算每个样品的3张随机图像中的GFP阳性细胞的百分比。
病毒滴度降低测定
在细胞培养测定中确定肠道病毒对食用偶氮染料的敏感性，所述测定测量染料对RD细胞单层免于经历病毒感染引起的细胞病变效应(CPE)的保护程度。将RD细胞以每孔104个在100μl DMEM-10中的细胞接种到96孔板中，并且在培养箱中孵育6小时。将100μl的在含或不含偶氮染料的DMEM中的十倍系列稀释液在室温下孵育1小时并转移到板中。在4天之后，将阳性感染孔计数为细胞单层上的透明CPE。通过Reed和Muensch方法确定TCID50值。
E151对病毒感染的IC50的确定
将EV71和CVA16病毒稀释至104TCID50/0.5ml的浓度，并且在培养箱内在DMEM-10中用不同浓度的E151处理1h。将RD细胞以105个细胞/孔的密度接种到24孔板中并在培养箱中孵育6h，然后将培养基更换为0.5ml的EV71稀释液，使得以0.1TCID50/细胞的感染复数(MOI)感染细胞。在培养箱中感染48h之后，将感染细胞冻融3次，并且滴定上清液中的病毒。一式三份地进行在每种浓度处理下每种病毒的孵育。进行了两个独立实验。
E151抗性EV71的选择
使E151高敏感性EV71-B4、EV71-B5和EV71-C5毒株在RD细胞中在存在10μM E151的情况下重复传代10次，然后在存在100μM E151的情况下再传代12次；而使E151低敏感性EV71-2242、EV71-C1和EV71-C4在RD细胞中在存在100μM E151的情况下直接传代12次。选择E151抗性EV71-B5-P22(也称为EV71-B5res)来鉴定负责E151抗性的突变。简而言之，用RNeasy试剂盒(Qiagen)从感染细胞的上清液中提取其RNA，然后使用对应的引物通过OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen)扩增其P1基因以进行测序。
通过反向遗传产生EV71突变体
首先通过RT-PCR扩增EV71-B5的基因组并将其置于人RNA聚合酶I启动子反向遗传(RG)系统下，如在先前的论文[Meng T等人,(2012)Virol J 9:238]中所描述的，并且将感染性质粒命名为pJET-B5。根据In-Fusion方案(Clontech)通过用对应的引物进行定点诱变将VP1-98、VP1-145和VP1-246处的突变引入pJET-B5中。通过将其对应的感染性质粒直接转染到RD细胞中来产生感染性突变体。简而言之，将1μg质粒与2.5μl的Lipofectamine 2000(Life Technologies)在Opti-MEM(Life technologies)中混合，然后转染到6孔板的细胞单层中。使所有产生的病毒都在RD细胞中进一步繁殖以进行2次传代，并且通过测序证实第2代的其VP1基因的正确性。如果没有特别提及，则所有随后的细胞感染实验都使用第2代RG病毒。
EV71和细胞的结合抑制测定
将RD细胞用具有5mM EDTA的PBS分离，并且用DMEM洗涤两次。然后将细胞重悬于具有1％FBS的DMEM(DMEM-1)中，并且在冰上冷却15min。将108TCID50的经纯化的EV71-B4(对E151高敏感)、EV71-C1(对E151低敏感)或EV71-B5res(对E151有抗性)分别与200万个RD细胞在500μl的含有终浓度为0、30、100或300μM的E151的DMEM-1中混合。在4℃下伴随轻轻搅拌孵育1h之后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，并且通过免疫印迹分析并检测结合的病毒。
为了测定E151从RD细胞中洗脱附着的EV71，将3x108 TCID50的E151敏感性EV71-B5或抗性EV71-B5res分别与600万个预冷的RD细胞在4℃下一起孵育1h以进行附着。然后用冰冷的PBS洗掉未附着的病毒。将附着的病毒-细胞分为3部分，并且重悬于具有0、30或100μME151的冰冷PBS中。在4℃下伴随轻轻搅拌再孵育15min之后，分离细胞沉淀和上清液以如上检测EV71抗原。
所有结合测定都在两个独立实验中一式两份地进行。
EV71和病毒附着/脱壳因子的结合抑制测定
首先将所有琼脂糖珠都在4℃下伴随轻轻搅拌用PBS中的3％BSA封闭至少3h，因为它们可以与EV71颗粒非特异性相互作用。
将40μl的经BSA预处理的蛋白A/G琼脂糖珠(Santa Cruz)与2μg的SCARB2-Fc、PSGL-1-Fc或CTLA-4-Fc在250μl的PBS+(pH 7.4，0.1％BSA和0.2％Igepal CA-630)中直接混合。同时，将108TCID50的经纯化的EV71-B4稀释在250μl的PBS+或含有600mM的E151的PBS+中。在4℃下孵育30min之后，添加病毒，并且将其与珠和重组蛋白在4℃下伴随轻轻搅拌再一起孵育2h。
将20-40μl的经BSA处理的肝素琼脂糖(Abcam)与108TCID50的经纯化的EV71在500μl的含有浓度为0、10、30、100、300或1000μM的E151的PBS+中在4℃下伴随轻轻搅拌一起孵育2h。将经BSA处理的含有30μg的GST或GST-亲环蛋白A的谷胱甘肽-琼脂糖珠(ThermoFisher)与108TCID50的经纯化的EV71-B5或EV71-B5res颗粒在500μl的PBS+或含有300μM的E151的PBS+中在4℃下伴随轻轻搅拌一起孵育。在孵育之后，将珠用含有0.01％Tween-20的冰冷PBS洗涤3次，然后通过免疫印迹分析结合的蛋白质和病毒。
所有结合测定都在两个独立实验中一式两份地进行。
免疫印迹
将样品溶解在SDS上样缓冲液中。在100℃下加热5至10min之后，将样品中的蛋白质用12％SDS-PAGE凝胶分离，并且转移到0.2μm硝酸纤维素膜(Bio-rad)上。首先用具有0.1％Tween-20的PBS(PBST)中的5％脱脂乳封闭膜。为了检测EV71 VP1蛋白，用小鼠抗VP1mAb 1D9(来自杂交瘤培养的上清液)、随后用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(1:2000)将膜印迹。为了检测GST标记的蛋白质，用小鼠抗GST血清(1:5000)、随后用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(1:2000)将膜印迹。为了检测人Fc重组蛋白，用HRP缀合的抗人Fc抗体(1:2000)将膜印迹。为了检测细胞β-肌动蛋白，用HRP缀合的抗人β-肌动蛋白单克隆抗体(1:8000)将膜印迹。所有印迹缓冲液都是具有3％脱脂乳的PBST，并且印迹时间通常是在室温下2h或在4℃下过夜。
在每次印迹之后，用PBST将膜洗涤3次，每次5至10min。在将膜与Clarity WesternECL底物(Bio-Rad)一起孵育之后，通过Gel-Imager ChemiDoc Touch(Bio-Rad)检测并记录化学发光信号，并且通过Image Lab软件进行分析。
免疫荧光共聚焦显微术测定
将300μl的DMEM-10中的Vero细胞(5x104)接种到μ-Slide 8孔玻璃底载玻片(ibidi)上，然后在24h后，将载玻片在4℃下预冷15min并且除去培养基。为了进行病毒附着，将经纯化的EV71病毒稀释在有或没有100μM的E151的冰冷DMEM-10中，然后以100的MOI添加到细胞中。在4℃下孵育1h之后，将细胞用冰冷的DMEM洗涤3次以除去未附着的病毒，然后用PBS中的4％PFA固定15min。为了进行病毒内化，为附着有病毒的细胞补足新鲜的300μl的有或没有100μM的E151的DMEM-10，并且将其在37℃培养箱中进一步孵育15min至1h，随后固定。将经固定的细胞用PBS中的0.5％triton X-100透化10min，并且在4℃下用含有5％BSA的PBS封闭过夜。在用PBST洗涤之后，将细胞与PBS+中的小鼠抗EV71血清(1:1000)在4℃下伴随轻轻搅拌一起孵育至少3h。在PBST洗涤之后，然后将细胞与AR594缀合的兔抗EEA1单克隆抗体(1:1000)和AR448缀合的抗小鼠IgG抗体(1:1000)一起孵育过夜。然后用PBS中的Hoechst 33258(0.1μg/ml)对细胞染色10min。在用PBST再洗涤3次之后，在共聚焦激光扫描显微镜FV3000(Olympus)下观察PBS中的细胞。
伦理学声明
将来自B&K Universal(英国)的AG129小鼠在ABSL2实验室内的各个通风笼中圈养，以进行动物护理和使用。所有动物实验都按照国立传染病研究所(NIID)的动物实验指南进行，并且实验方案由新加坡的Temasek Life Sciences Laboratory Ltd的机构动物护理和使用委员会(IACUC)审核并批准(IACUC项目批准号TLL-16-023：食用色素对人肠道病毒71型体内感染的影响(Influence of food colorings on the infection of humanenterovirus 71in vivo))。
AG129小鼠中的EV71感染
经由腹膜内(i.p.)途径用在0.2ml的PBS中的10LD50的EV71-B4(3x1010TCID50)或EV71-C1(1.5x108TCID50)激发14日龄的AG129新生鼠。
从激发后0至3天开始，每天通过腹膜内途径向E151保护组的小鼠以200mg/kg体重施用1剂在PBS中的E151，而在模拟组中仅使用PBS。每天记录临床得分和生存率，直到激发后21天。为了研究在受激发的小鼠中的病毒繁殖，在用CO2对小鼠实施安乐死之后，收集、称重后肢的肌肉和脑并将其储存在-80℃下。通过使用TissueLyser LT匀浆器(Qiagen)在具有10％FBS和5x抗生素-抗真菌药的DMEM中以500mg/ml匀浆样品。将匀浆冻融两次，然后在4℃下保持1h。在RD细胞中滴定澄清匀浆的上清液(在4℃下10,000gx10min)中的病毒后代。
统计学
一式两份或一式三份地进行病毒滴度和结合测定的所有定量。使用学生t检验(双尾的)比较平均值，并且p值<0.05被认为具有统计学显著性。
实施例1
食用染料对EV71-GFP繁殖的抑制作用
筛选十一种广泛使用的食用染料在37℃下在存在5％CO2的情况下孵育24h后抑制EV71-GFP(在病毒复制期间产生GFP作为报告物)在感染复数(MOI)为1时在横纹肌肉瘤(RD)细胞中感染和复制的潜力(图1)。通过比较在存在每种染料的情况下的GFP信号与模拟对照，由于GFP信号减少，所有磺化的偶氮染料柠檬黄(E102)、日落黄FCF(E110)、酸性红(E122)、苋菜红(E123)、胭脂红4R(E124)、胭脂红6R(E126)、诱惑红(E129)和亮黑BN(E151)在300μM的浓度下都抑制感染EV71-GFP，而没有引起细胞毒性。在其他3种磺化的食用染料专利蓝V(E131)、靛蓝(E132)和亮蓝FCF(E133)中，只有E132在300μM的浓度下对EV71-GFP展现出一定程度的抑制。总体而言，在体外E122、E123、E129和E151是EV71-GFP的4种最强抑制剂(图1)。
染料E122、E123、E129和E151对人肠道病毒感染的体外抗病毒活性
在抗病毒和细胞毒性研究中对这四种全部含有磺化的芳环的偶氮染料E122、E123、E129和E151(图2A)进行进一步测试。它们在感染的RD细胞中对EV71-GFP展现出剂量依赖性抑制，因为注意到GFP阳性细胞的数量随其浓度的增加而循序减少(图2B和2C)。染料E151在RD细胞中是对抗EV71-GFP的最佳药物。基于GFP阳性细胞的百分比，E151的50％抑制浓度(IC50)为10.1μM，而其他三种染料E122、E123和E129的IC50为约50μM(图2C)。相比之下，E151在RD中的50％细胞毒性浓度(CC50)为1870μM，并且这其他三种染料的CC50大于5000μM，其是通过MTT测定评价的(图2D)。
通过使用病毒滴度降低测定，在RD细胞中研究了这四种偶氮染料对野生型人肠道病毒的感染性的抑制作用。100μM的E151显著阻止病毒感染引起的细胞病变效应(CPE)，并且降低属于不同亚基因群的所有8种RD细胞适应性EV71毒株(图3A)和4种临床EV71分离株(图3B)的滴度。然而，E122、E123和E129在浓度300μM下未能降低EV71-C1和EV71-C4的滴度。此外，E151还抑制所有3种CVA16和1种CVA6病毒的感染性，而并未显示出对1种CVA4和1种CVA10病毒的感染性的抑制作用(图3B)。还通过滴定来自在存在各种浓度的E151的情况下以0.1的MOI感染2天的RD细胞的后代病毒评价了E151对5种代表性肠道病毒的生长的抑制作用。E151对EV71的IC50的范围是从2.39μM(高度敏感的EV71-B2)到28.12μM(稍敏感的EV71-C1)(图3C)。
有趣的是，染料E151对人肠道病毒的抑制作用不尽相同。在存在100μM E151的情况下，具有VP1-98E,145G/Q的PSGL-1结合性EV71毒株如EV71-B2、EV71-B4、EV71-B5、EV71-C2、EV71-C5和EV71-202(图4A)对E151高度敏感，其中滴度降低>105；而具有VP1-98K,145E的非PSGL-1结合性毒株如EV71-C1、EV71-C4、EV71252和EV71 2242(图4A)对E151稍敏感，其中滴度降低约102(图3A和3B)。为了确定VP1-98和/或VP1-145处的氨基酸是否影响EV71对E151和3种染料E122、E123和E129的敏感性，使用反向遗传(RG)系统[Meng T等人,(2012)Virol J 9:238]产生EV71-B5和EV71-C4的在VP1-98和VP1-145处具有不同氨基酸组合的变体。在滴度降低测定中，RG/EV71-B5和RG/EV71-C4的-EE变体(VP1-98E,145E)对E122、E123和E151稍敏感，但是对E129有抗性。-KE变体仅对E151稍敏感，并且对E122和E123有抗性。-EG和-EQ变体对所有4种染料都高度敏感，而-KG和-KQ变体仅对E122和E151高度敏感。出乎意料的是，E129增强了RD细胞中的由具有VP1-98K的EV71变体引起的CPE并增加了其滴度(图4B)。使用DNASTAR MegAlign Pro13软件对从1969年至2017年在NCBI GenBank中发布的6585个完整EV71 VP1序列进行的多重蛋白质比对表明，-EE变体占主导地位并且它们在发布的总EV71 VP1序列中的百分比为约82.4％。自2008年以来每两年间隔，-KE变体的百分比的范围是从6.5％至15.6％(表3)。
表3.在VP1-98和VP1-145处具有不同氨基酸组合的EV71变体的百分比。
因此，与其他测试的染料相比，E151事实上似乎是更适合抗EV71感染的抗病毒剂。
E151染料抗性EV71突变体的选择和表征
如在方法中所描述的，通过使EV71病毒在RD细胞中在存在E151的情况下传代来选择E151抗性EV71突变体。最终发现，传代22次的突变型EV71-B5(称为B5-E151-P22或EV71-B5res)在RD细胞中对浓度为100μM的E151完全有抗性(图5A)。对EV71-B5res基因组的测序揭示了当与其亲本野生型EV71-B5相比时在其VP1蛋白中有如下三个氨基酸突变：E98K、G145E和P246A(图5A)，这意味着从E151高度敏感的毒株(-EG)转换到稍敏感的毒株(-KE)对于EV71-B5产生E151抗性而言是必需的。测序结果还表明，一个突变P246A可能足以使EV71的-KE毒株抵抗E151。最重要的是，VP1-246P在EV71中高度保守(>99.9％)(图4A)，这突显了E151具有抑制所有已知的循环EV71毒株的潜力。
通过将这些突变引入反向遗传EV71-B5感染性克隆中来产生EV71突变体。在滴度降低测定中在存在100μM E151的情况下对来自第二次传代的突变体进行了测试。结果表明，E98K并未显著影响EV71-B5对E151的敏感性(图4B)，但是它弥补了P246A引起的生长缺陷，使得在RD细胞中传代3次之后并未诱导CPE(数据未显示)。与E98K组合，突变G145E或P246A将滴度降低从EV71-B5-wt中的>105显著降低到这些双重突变体中的约102，但是只有E98K、G145E和P246A的组合为EV71-B5赋予完全的E151抗性(图4B和5B)。此外，EV71-C4和EV71-2242毒株中的突变P246A使得它们具有E151抗性。然而，P246A将突变体的生长滴度降低了约10到100倍(图5B)。所述发现也与图2中所示的结果相吻合，即具有VP1-145G/Q的EV71毒株对E151高度敏感，而具有VP1-145E的EV71毒株对E151的敏感性较低。基于EV71病毒体的晶体结构，VP1-145和VP1-246位于5重轴的顶点处，并且靠近VP1-242K和VP1-244K(图5C和5D)。带负电荷的E151(图5B)可能与VP1-242K和VP1-244K相互作用以影响病毒感染，并且突变VP1-145E和VP1-246A可能破坏E151和EV71的相互作用。
E151抑制EV71进入
为了研究E151可能影响EV71复制生命周期中的哪些步骤，在EV71-GFP以1的MOI在RD或Vero细胞中感染后的不同时间点添加E151(图6A)。仅当在感染后2h内添加E151时，E151才对EV71-GFP的感染性产生抑制作用，如在感染后12h具有阳性GFP信号的感染细胞显著减少所表明的。因此，E151破坏EV71感染的早期阶段，如病毒附着、内化和/或脱壳，但是未破坏其在细胞内的复制。
为了进一步剖析E151的抑制机制，在不存在或存在E151的情况下进行EV71对细胞和附着因子的附着(图7)。在细胞-病毒结合测定中，E151以浓度依赖性方式阻止病毒对RD细胞的附着。EV71-B4(对E151高度敏感)和EV71-C1(对E151稍敏感)在RD细胞上的附着分别被浓度为30μM和100μM的E151显著阻断，在免疫印迹中通过特异性抗VP1单克隆抗体1D9检测。尽管EV71-B5res对E151有抗性，E151在300μM的非常高的浓度下还是部分阻断其附着于RD细胞(图6B)。然而，300μM的E151并未降低EV71-B5res在RD细胞培养中的感染性(数据未显示)。在下拉测定中，E151还阻断了EV71-B4与PSGL-1-Fc融合蛋白的结合，因为E151和PSGL-1两者都与病毒5重轴的顶点相互作用[Nishimura Y等人,(2013)PLoS Pathog 9:e1003511]，而它并未阻止EV71-B4与人SCARB2-Fc重组蛋白之间的相互作用，所述重组蛋白已经被鉴定与病毒峡谷区域结合[Dang M等人,(2014)Protein Cell 5:692-703](图6C)。此外，E151以浓度依赖性方式阻止EV71-B4与肝素琼脂糖的结合，所述肝素琼脂糖也靶向顶点(图6D)。
为了评价VP1-145和VP1-246处的氨基酸是否决定染料E151对EV71附着的影响，在相同的细胞-病毒附着测定中对RG/EV71-B5-EGP(VP1-98E,145G,246P，对E151高度敏感)、RG/EV71-B5-KEP(VP1-98K,145E,246P，对E151稍敏感)和RG/EV71-B5-KEA(VP1-98K,145E,246A，对E151有抗性)突变体进行了测试。结果与对应的野生型EV71变体的结果一致。与对RD细胞和肝素的附着分别被浓度为30μM和100μM的E151抑制的RG/EV71-B5-EGP相比，RG/EV71-B5-KEP对RD细胞和肝素两者的附着都仅在较高的E151浓度下受抑制。如所预期的，RG/EV71-B5-KEA中的P246A使得突变体的附着不受E151的影响(图7A)。在免疫荧光共聚焦显微术测定中，在4℃下孵育1h之后，通过抗EV71-B4血清检测在Vero细胞上附着的EV71病毒体。RG/EV71-B5-KEP的附着被100μM的E151强烈阻止，因为每个细胞的病毒点(绿色)从在不存在E151的情况下的49±5.9(平均数±标准误差)显著降低至在存在E151的情况下的1.8±0.8；而E151抗性RG/EV71-B5-KEA的附着没有受到E151的显著影响，因为在模拟细胞与经E151处理的细胞之间在每个细胞的病毒点方面没有统计学差异(图7B)。
染料E151抑制在附着后阶段的EV71感染
在附着后阶段，100μM E151显著阻止EV71-GFP感染，并且将RD细胞中的感染细胞百分比从32.9±0.59降低至0.65±0.22并将Vero细胞中的感染细胞百分比从12.5±0.51降低至0.43±0.16(图8A)。在免疫荧光共聚焦显微术测定中进一步检查了E151对经纯化的EV71的内化的影响。将RG/EV71-B5-KEP和RG/EV71-B5-KEA与Vero细胞在不存在E151的情况下在4℃下一起孵育以进行附着。在用冷PBS洗掉未附着的病毒之后，将在不存在或存在100μM E151的情况下附着的病毒和细胞转移到37℃培养箱中持续30min，以允许病毒内化。然后固定细胞，并且观察内化的EV71病毒体和早期内体抗原1(EEA1)。在不存在E151的情况下(模拟)，RG/EV71-B5-KEP和RG/EV71-B5-KEA两者的内化都是正常的，并且一些EV71点(绿色)与EEA1(红色)共定位，表明内化的病毒体与早期内体融合(图8B)。然而，在存在E151的情况下，与模拟中的情况(44.5±4.9)相比，检测到的每个细胞的RG/EV71-B5-KEP点更少(3±1.3)；而每个细胞的RG/EV71-B5-KEA点数在模拟细胞(38.6±4.5)与经E151处理的细胞(39±4.1)之间没有显著差异。因此，RG/EV71-B5-KEP的内化被E151抑制。病毒颗粒可能会被E151从细胞上分离，因为在存在E151的情况下在30min内内化的EV71不会被细胞降解。
为了证明E151可以洗脱附着的EV71，将由E151敏感性EV71-B5或抗性EV71-B5res附着的RD细胞重悬于具有0、30或100μM E151的冰冷PBS中。在4℃下伴随轻轻搅拌孵育15min之后，分离细胞沉淀和上清液以通过免疫印迹检测EV71抗原。结果表明，附着的EV71-B5而非EV71-B5res被E151以浓度依赖性方式从细胞中洗脱或释放到上清液中(图8C)。
在病毒内化之后，进一步发现E151可以阻止EV71-B5与EV71脱壳因子亲环蛋白A(CypA)的结合。在GST下拉测定中，EV71-B5与GST-CypA相互作用，但是不与GST相互作用，并且在存在100μM E151的情况下未能与GST-CypA结合(图9)。EV71-B5res中的突变P246A显著削弱了病毒与GST-CypA之间的相互作用，如之前所报道的[Qing J等人,(2014)PLoSPathog10:e1004422]，并且这种弱相互作用也被E151抑制(图9)。
E151对EV71激发的AG129小鼠的体内保护
在14日龄的用10LD50的野生型EV71-B4(3x1010TCID50)或EV71-C1(1.5x108TCID50)腹膜内激发的AG129幼鼠中评估E151的功效。然后从第十四天至第十七天(激发后0至3天)通过腹膜内接种用E151 200mg/kg体重(bw)/天或200μl PBS/天处理小鼠(每组8只幼鼠)。对照组中的经PBS处理的小鼠从早至激发后6天开始就开始展现出临床症状，如驼背和肢体麻痹，并且从激发后8天开始死亡。最终它们全部死亡，并且存活百分比下降到0。但是在E151处理的情况下，在整个实验过程中，所有小鼠都未显示出肢体麻痹，并且完全免于死亡(图10A)。
为了进一步评价E151的保护功效，在激发后4、8或12天对经PBS或E151处理的EV71-C1激发的小鼠实施安乐死(每组每个时间点5只小鼠)，然后滴定后代病毒在脑和后肢肌肉组织中的滴度(图10B)。对于经PBS处理的小鼠，从激发后4天开始在肌肉和脑中检测到感染性后代病毒。后代病毒在脑中的滴度随时间不断增加，而肌肉中的滴度在激发后4天达到最高并在接下来的时间下降，如先前所报道的[Khong WX等人,(2012)J Virol 86:2121-2131]。相比之下，在用E151处理的小鼠中，在脑和肌肉组织两者中都检测到显著更低的病毒滴度。尽管在从激发后4天开始停止E151处理之后，后代病毒在经E151处理的小鼠的肌肉中的滴度有所增加，但是脑中的滴度并未增加到可检测的水平(103.5TCID50/g)。
总结
由于人类感染性疾病的药物开发需要很长的评价时间和巨大的成本，因此面临着障碍。发现具有良好安全性记录和先前批准的用法的化学品的新颖用途可能是一种有吸引力的方法。EV71的细胞进入开始于其附着于细胞膜上的分子，并且结束于其基因组释放到细胞质中[Dimitrov DS,(2004)Nat Rev Microbiol 2:109-122]。已经报道了多种靶向EV71进入的抗EV71药物[Shang L等人,(2013)Antiviral Res 97:183-194；Tan CW等人,(2014)J Biomed Sci 21:14]。被批准为食品添加剂的食用偶氮染料在室温下非常稳定，并且易于以低成本生产[Zollinger H(2003)Color chemistry:syntheses,properties,andapplications of organic dyes and pigments第3版,Wiley-VCH,Cambridge]。它们已经被使用了很多年，而没有报告明显的不良副作用。在此项研究中，它们被证明能够抑制EV71、CVA16和CVA6(其是HFMD的3种主要病原体)的感染性。
我们发现测试的食用偶氮染料中有几种通过阻断病毒进入而对EV71、CVA16和/或CVA6的感染性具有一定程度的体外抑制作用。在这里，对亮黑BN(E151)进行了更全面的探索，因为我们的研究显示它能够以最高的效率抑制所有已知的EV71毒株。E151通过靶向病毒5重轴的顶点来阻止病毒附着于附着因子硫酸化的PSGL-1和肝素来抑制EV71的感染性(图6)。另一方面，E151和NF449两者都不影响EV71与人SCARB2的结合，SCARB2是与EV71的峡谷区域相互作用的功能性受体。这些结果表明人SCARB2可能不是EV71附着所必需的；并且符合RD或Vero细胞中的SCARB2敲减对EV71的附着没有影响[Ku Z等人,(2015)J Virol 89:12084-12095]。有趣的是，E151还通过从RD和Vero细胞中洗脱出附着的病毒体来预防在附着后阶段的EV71感染，这意味着EV71附着于细胞上是可逆的，并且E151与细胞附着因子竞争结合EV71(图8)。此外，E151破坏EV71与病毒脱壳因子人亲环蛋白A而非人SCARB2之间的相互作用。然而，E151对EV71的脱壳和RNA释放的总体影响尚需进一步研究。在细胞进入之后，EV71的后续复制似乎不受E151的抑制(图6A)。总体而言，E151在体外阻止EV71的进入。
与具有VP1-145E的分离株相比，染料E151对具有VP1-145G/Q的EV71分离株的感染展现出更大的抑制作用(图3和4)。有趣的是，在VP1-145处用E取代G/Q也使苏拉明在体外预防EV71感染方面的功效降低了30倍[Ren P等人,(2017)Sci Rep 7:42902]，这表明带负电荷的VP1-145E改变了顶点的静电性质(图5D)并削弱了EV71与E151/苏拉明之间的结合亲和力。此外，VP1-246P也参与E151和EV71的相互作用。突变VP1-P246A为具有VP1-98K,145E的EV71毒株赋予E151抗性，但是降低了突变体的生长滴度，这意味着E151抗性EV71在进化上可能处于不利地位。尽管VP1-98和VP1-145处的氨基酸分别时常从E转换为K以及从E转换为G/Q[Tee KK等人,(2010)J Virol 84:3339-3350]，但是VP1-246P在EV71中高度保守(图4A)。因此，E151可能潜在地抑制所有已知的循环EV71毒株。
尽管HFMD是轻度且自限性的，但是它具有高度传染性，伴有显著的发病，偶有严重的神经并发症和死亡，尤其是归因于EV71的那些。因此，在如下两种情况下迫切需要抗病毒药物(尤其是抗EV71)来抗击HFMD：(i)对HFMD患儿进行治疗性治疗以加快康复速度并降低发病率；以及(ii)降低脱落病毒的感染性，这将间接降低其传播性。
本文测试的E151和其他食用偶氮染料已经被用作食品添加剂很多年，因此它们被认为足够安全以用作治疗剂。考虑到食用偶氮染料E151在体外和在体内有效地预防EV71感染，它可能是治疗儿童的由EV71、CVA16和CVA6引起的HFMD的有前途的候选药物。
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Claims (22)
1.一种包含至少一种食用染料的药物组合物，其用于医学。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述食用染料是食用偶氮染料。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述食用偶氮染料是磺化的食用偶氮染料。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于预防或治疗病毒感染或病毒相关疾病。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述病毒感染或病毒相关疾病是由肠道病毒、优选EV71和/或柯萨奇病毒引起的。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述病毒相关疾病选自手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述至少一种食用染料选自：
E102柠檬黄((4E)-5-氧代-1-(4-磺酸根苯基)-4-[(4-磺酸根苯基)亚肼基]-3-吡唑甲酸三钠)，
E110日落黄FCF(6-羟基-5-[(4-磺基苯基)偶氮基]-2-萘磺酸二钠)，
E122酸性红(4-羟基-2-[(E)-(4-磺酸根-1-萘基)二氮烯基]萘-1-磺酸二钠)，
E123苋菜红((4E)-3-氧代-4-[(4-磺酸根-1-萘基)亚肼基]萘-2,7-二磺酸三钠)，
E124胭脂红4R(1-(4-磺基-1-萘偶氮基)-2-萘酚-6,8-二磺酸三钠盐)，
E126胭脂红6R(7-羟基-8-(萘-1-二氮烯基)萘-1,3-二磺酸二钠)，
E129诱惑红(6-羟基-5-[(2-甲氧基-5-甲基-4-磺基苯基)偶氮基]-2-萘磺酸二钠)以及
E151亮黑BN(4-乙酰胺基-5-羟基-6-[7-磺酸根-4-(4-磺酸根苯偶氮基)-1-萘偶氮基]萘-1,7-二磺酸四钠)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述至少一种食用染料选自E122酸性红、E123苋菜红、E129诱惑红和E151亮黑BN。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含所述至少一种食用染料的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学功能衍生物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中将所述组合物配制用于向受试者口服和/或或局部施用。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中将所述组合物配制为凝胶剂、乳膏剂、泡沫剂、洗剂或软膏剂。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中将所述组合物配制用于向受试者连续施用2至5天的时间、优选3至4天的时间。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中将所述组合物配制用于以高达4mg/kg体重/天(对于E122)；15mg/kg体重/天(对于E123)；7mg/kg体重/天(对于E129)或5mg/kg体重/天(对于E151)的最大剂量施用。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物用于制备治疗或预防肠道病毒感染或肠道病毒相关疾病用的药物的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述肠道病毒是EV71和/或柯萨奇病毒。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其中所述肠道病毒相关疾病是手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹或急性心肺功能不全。
17.一种治疗或预防肠道病毒感染或肠道病毒相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肠道病毒是EV71和/或柯萨奇病毒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肠道病毒相关疾病选自手足口病(HFMD)、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和急性心肺功能不全。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用2至5天的时间、优选3至4天的时间。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中将所述组合物以高达4mg/kg体重/天(对于E122)；15mg/kg体重/天(对于E123)；7mg/kg体重/天(对于E129)或5mg/kg体重/天(对于E151)的最大剂量施用。
22.一种用于治疗或预防肠道病毒感染或肠道病毒相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至13中任一项所述的组合物。
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