JP7261367B2 - 抗ウイルス剤及び抗ウイルス組成物 - Google Patents
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Description
ウイルスには、ゲノムとしてDNAを有するDNAウイルスと、RNAを有するRNAウイルスとに大別される。このうち、DNAウイルスには単純ヘルペスウイルス(HSV)などが、RNAウイルスにはインフルエンザウイルス(IFV)などがある。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、抗ウイルス作用を示す組成物、抗ウイルス用食品組成物、特にHSVの潜伏感染・回帰発症に対抗する薬剤などを提供することである。
こうして、本発明に係る組成物は、硫酸化多糖類を含有し、抗ウイルス効果を示すことを特徴とする。
上記発明において、硫酸化多糖類は、ラムナン硫酸であることが好ましい。また、ウイルスとしては、インフルエンザウイルス(IFV)またはヒトヘルペスウイルス(HSV)であることが好ましい。またHSVの場合には、HSV-1であることがより好ましい。また、抗ウイルス効果としては、殺ウイルス活性であることが好ましい。
本発明の組成物は、医薬品(医薬組成物)として提供できる。
また、本発明の組成物は、ウイルス感染症の予防又は治療に用いられる抗ウイルス用食品組成物として提供できる。
医薬組成物は、ウイルスの増殖阻害作用・殺ウイルス活性を示すために有効な量のラムナン硫酸に加えて、薬学的に許容される担体・添加剤を配合することにより提供される。この医薬組成物は、医薬品または医薬部外品として提供される。医薬組成物は、内用的または外用的に用いられる。この医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び/又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用できる。特に、ラムナン硫酸は、経口投与または経皮投与によっても効果があるので、内服剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤として好ましく用いられる。
食品分野では、ウイルスの増殖阻害・殺ウイルス作用を生体内で発揮できる有効量のラムナン硫酸を食品素材として、各種食品に配合することにより、食品組成物を提供できる。このとき、食品分野において、抗ウイルス効果・ウイルス増殖阻害用などと表示された食品組成物を提供できる。食品組成物としては、一般の食品に加え、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等が例示される。加えて、食品添加物として用いられる。
食品組成物としては、例えば畜肉加工品、農産加工品、飲料(清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク、濃縮飲料など)、粉末飲料(粉末ジュース、粉末スープなど)、菓子(キャンディ(のど飴)、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等)、パン、シリアル、調味料などが例示される。
本発明は、ラムナン硫酸を有効成分として含み、ウイルス感染症患者、ウイルス感染症を罹患したヒト以外の動物を対象とした抗ウイルス剤用特定保健用食品、抗ウイルス剤栄養機能食品、抗ウイルス剤機能性表示食品として用いられる。
本発明は、ラムナン硫酸を有効成分として含み、生体、例えばウイルス感染症を罹患する前のヒト、ウイルス感染症予備軍のヒト、ヒト以外の動物を対象とした抗ウイルス剤用特定保健用食品、抗ウイルス剤用栄養機能食品、抗ウイルス剤用機能性表示食品として用いられる。
<ラムナン硫酸の調製>
ラムナン硫酸としては、天然由来のどのような物でも用いることができる。本実施形態では、ヒトエグサから熱水抽出して得たものを用いた。簡単に説明すると次の通りである。乾燥した海藻を水で洗浄し、熱水(95℃~100℃)で6時間抽出した。得られた熱水抽出液を純水に対して透析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥物を水に溶解した後、陰イオン交換クロマトグラフィーにアプライし、連続的に溶出させ、ラムナン硫酸を精製した。これを発明の試料として用いた。
なお、本発明に使用可能な硫酸化多糖類(例えば、ラムナン硫酸)は、上記方法以外にも各種方法によって調製できる。また、原料としては、ヒトエグサに限られず、アナアオサ、リボンアオサなどを用いることができる。
HSVの潜伏感染・回帰発症系は、小型実験動物(マウス)で再現することができる。BALB/cマウスの角膜にHSV-1を接種し、潜伏感染が成立する1ヵ月後に、薬物刺激を与えて回帰発症を誘導した。この回帰発症に対し、ラムナン硫酸の経口投与が有効であるか否かを評価した。HSV-1として、回帰発症率が最も高いとされているMcKrae株を用いた。
1.試験方法
(1)潜伏感染・回帰発症系
麻酔下のBALB/cマウスに対し、左右の角膜を23ゲージ針束で3回ずつ交差して擦過後、HSV-1 McKrae株(1×105 PFU/5μl/mouse)を接種した。その後、14日間に渡って、角膜の症状(Lesion scores)を記録した。感染3日後及び5日後に、PBS 0.1 mlずつで左右の角膜を洗浄し、回収した洗浄液をplaque assayに供した。生存したマウスについて、発症の程度及び左右角膜のウイルス量のデータに基づいて、均等に1群7匹ずつ、後述の通り3群に分けた。
感染35日後に1200mg/kgの酪酸ナトリウム(NaB)を腹腔内注射した。翌日(感染36日後)に、更に600mg/kgのNaBを腹腔内注射した後、4時間後に43℃の温浴に10分間浸漬した。
感染38日後(初回のNaB処置から3日後)に、全血、左右の眼球、左右の三叉神経節(TG)、脳を採取した。全血から血清を調製し、2回目の中和抗体価を測定した。1回目の中和抗体価の測定値と比較し、被検体投与による抗体価の変動を検討した。また、眼球、TG、脳については、超音波処理し、遠心後、上清からウイルスの検出を試みた。
(2)群分け
下記3群を用いた。
#1 陰性対照群:滅菌水(Control)を0.4 ml/dayとして経口投与した。
#2 陽性対照群:アシクロビル(ACV)を1mg/0.4ml/dayとして経口投与した。
#3 ラムナン硫酸群:ラムナン硫酸を5mg/0.4ml/dayとして経口投与した。
BALB/cマウス30匹に対し、HSV-1を接種したところ、6匹が感染6日後~14日後に死亡した。生存した24匹中、角膜に症状が認められず、かつ角膜からウイルスが検出されなかったマウスが3匹認められた。そのため、残りの21匹を#1~#3の各群に7匹ずつ振り分けた。
初感染から35日後及び36日後に、回帰発症を引き起こすために、2回のNaB注射及び1回の熱刺激処置を行った。この回帰発症処置によって、死亡例は認めなかった。
表1には各群の回帰発症率を、表2には各群の中和抗体価をそれぞれ示した。
表2に示した通り、陰性対照群#1及び陽性対照群#2では、血清の中和抗体価は、感染28日後と感染37日後の間で変動は認められなかった。これに対し、ラムナン硫酸群#3では、血清の中和抗体価は、感染37日後には、感染28日後に比べ、約1.4倍の上昇が認められた。
なお、全てのマウスについて、脳からウイルスは検出されなかった。
このように、ラムナン硫酸は、HSV-1の潜伏感染・回帰発症系において、有効に回帰発症を抑制することが明らかとなり、この効果にはラムナン硫酸の免疫機能刺激作用によるウイルス特異的抗体の上昇が寄与していると推察された。
一般に、ウイルスは宿主となる細胞内に侵入し、細胞内で増殖した後に、細胞外に放出される。抗ウイルス効果として、細胞内でのウイルス増殖を抑制するものと、細胞外のウイルス粒子の感染力を失わせるものがある。後者の作用は、殺ウイルス活性(virucidal effect)、不活化効果(inactivation)などと呼ばれている。ラムナン硫酸について、殺ウイルス活性の有無を調べた。
1.試験方法
(1)ウイルス株-宿主細胞系
ウイルス株-宿主細胞系として、次の2種類を用いた。HSV-2(単純ヘルペスウイルス2型)-Vero細胞(アフリカミドリザル由来細胞)及びIFV(インフルエンザウイルス)-MDCK細胞(イヌ腎由来細胞)を用いた。
各ウイルスについて、ストック溶液をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈し、それぞれ2×105 PFU/mLに調製したものをウイルス溶液とした。このウイルス溶液0.5mLと被験溶液0.5mLとを混合し、検体溶液とした。被験溶液として、10,100及び1000μg/mLに調製したラムナン硫酸溶液を用いた。陰性対照として、PBSを用いた。
検体溶液を調製後、室温に置き、0,1,10及び30分後に10μLずつ採取し、990μLのPBSと混合して、1000μLの100倍希釈溶液とした。100倍希釈溶液から100μLを採取し、予め単層状に培養した宿主細胞に振り掛け、室温で1時間感染させた。ここにプラークアッセイ用培地を重層し、37℃にて2~3日間培養した。プラークの出現を確認後、クリスタルバイオレット液で細胞を固定・染色し、顕微鏡下でプラーク数を測定した。0時間のプラーク数を100%として、各処理時間経過後の残存ウイルス量を求めた。
図1にはHSV-2に対する殺ウイルス活性試験の結果を、図2にはIFVに対する殺ウイルス活性試験の結果を、それぞれ示した。
図1に示すように、ラムナン硫酸は、10μg/mL~1000μg/mLの濃度域において、HSV-2に対して、時間依存的・濃度依存的に殺ウイルス活性を示した。
図2に示すように、ラムナン硫酸は、10μg/mLにおいて、1分間の処理時間でIFVの感染力をほぼ半減させた。但し、濃度依存的な活性は顕著には認められなかった。
このように、ラムナン硫酸は、濃度依存的にHSV-2の殺ウイルス活性を示すことが明らかとなった。しかも、ラムナン硫酸とウイルスの混合液を100倍希釈しても殺ウイルス活性がみられたことから、ラムナン硫酸とウイルスとの相互作用は不可逆的であるといえる。
1.試験方法
(1)ヘルペス症状発症系
ペントバルビタール(50 mg/kg)麻酔下のBALB/cマウス(6週齢、♀)の左側腹の毛をバリカンと除毛クリームによって除毛した。後述の通り、マウスを6群に分けた。各群のサンプルを、経口投与群(#1~#3)ではウイルス接種7日前から14日後までの間、塗布群(#4~#6)ではウイルス接種1日前から14日後までの間、1日2回(9時と18時)投与した。塗布群では、除毛部分について、後述の5%エマルジョンをマウス一匹あたりに約50mg~60mgを綿棒で塗布した。
#4~#6の塗布群に与える5%エマルジョン液は次の通りに調製した。50mlチューブに、egg L-α-phosphatidylcholine 400 mg、スクワレン1.5g、サンプル889.5 mgを加え、50℃で約20分間加熱した。グリセリン0.35 mlと蒸留水14.65 mlの混合液を加え、vortex乳化処理した(90秒間)。50mlチューブを氷冷し、ポリトロン乳化(20,000 rpm、5分間)した。これを5%エマルジョン液とした。サンプルとして、#4にはPBSを、#5にはアシクロビル(ACV)を、#6にはラムナン硫酸(Rhamnan sulfate)をそれぞれ用いた。
0:無症状
1:1~2カ所に点状の皮膚病変(点状の炎症)
2:皮膚病変部が線状に伸びて、約1/2の領域に拡大する
3:皮膚病変部が線状に伸びて、全体に拡大する
4:足の麻痺や脳炎症状
5:死亡
下記6群を用いた(各群についてn=5)。
#1 陰性対照群:滅菌水(Control)を0.4ml/dayとして経口投与した。ウイルス接種7日前から14日後まで投与した。
#2 陽性対照群(経口):アシクロビル(ACV)を1mg/0.4ml/dayとして経口投与した。ウイルス接種7日前から14日後まで投与した。
#3 ラムナン硫酸群(経口):ラムナン硫酸を5mg/0.4ml/dayとして経口投与した。ウイルス接種7日前から14日後まで投与した。
#4 陰性対照群:PBSで調製したエマルジョン液を塗布投与した。ウイルス接種1日前から14日後まで投与した。
#5 陽性対照群(塗布):アシクロビル(ACV)の5%エマルジョン液を塗布投与した。ウイルス接種1日前から14日後まで投与した。
#6 ラムナン硫酸群(塗布):ラムナン硫酸の5%エマルジョン液を塗布投与した。ウイルス接種1日前から14日後まで投与した。
表3,4及び図3,4には、ヘルペス症状の発症頻度の結果を、表5には、死亡例の結果を、それぞれ示した(全て平均値を示す)。表3はラムナン硫酸を経口投与した場合であり、表4はラムナン硫酸をウイルス接種部位に塗布した場合である。表3及び表4中において、「*」はp<0.05、「**」はp<0.01、「***」はp<0.001で陰性対照群に対する有意差が認められたことを示す。
また、表5に示すように、ラムナン硫酸は、経口投与時にマウスの生存率を高めた。ラムナン硫酸を塗布すると、更に生存率が80%と高くなり、死亡例(1例)でも延命効果が認められた。
このように、本実施形態によれば、抗ウイルス作用を示す組成物、抗ウイルス用食品組成物、特にIFVの感染、HSVの潜伏感染・回帰発症に対抗する薬剤などを提供できた。
Claims (1)
- 乾燥したヒトエグサを水で洗浄し、95℃~100℃の熱水で6時間抽出し、得られた熱水抽出液を純水に対して透析し、凍結乾燥した後、凍結乾燥物を水に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィーにアプライし、連続的に溶出させることで得られたラムナン硫酸を含有し、ヒトヘルペスウイルス1(HSV-1)の潜伏感染からの回帰発症に対する活性を示す、HSV-1の潜伏感染からの回帰発症を抑制するための抗ウイルス用食品組成物。
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日本薬学会年会要旨集,2007年,Vol.127th, No.2,p.109, Abstract No.28P1-pm219 |
日本薬学会年会要旨集,2008年,Vol.128th, No.3,Abstract No.27PE-am107 |
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