DE19844022C1 - Verwendung von eisenbindenden Glycoproteinen und/oder 10-Hydroxy-2-decensäure in Verbindung mit Thymochinon zur Behandlung von AIDS - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von eisenbindenden Glycoproteinen und/oder 10-Hydroxy-2-decensäure in Verbindung mit Thymochinon oder thymochinonhaltigen Schwarzkümmelprodukten zur Behandlung von AIDS und sonstigen Immunschwächekrankheiten. Bei Gabe dieser Wirkstoffe in der genannten Kombination zeigt sich im Plaque-Test eine sehr gute Wirkung gegen HIV, ohne daß mit schwerwiegenden Nebenwirkungen zu rechnen wäre.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von eisenbindenden Glyco­ proteinen und/oder 10-Hydroxy-2-decensäure in Verbindung mit Thymochinon oder thymochinonhaltigen Schwarzkümmelprodukten zur Behandlung von AIDS und sonstigen Immunschwächekrankheiten.

AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) ist eine der schwer­ sten derzeit verbreiteten Krankheiten, die hauptsächlich durch Bluttransfusionen und Sexualverkehr übertragen wird. Die Krank­ heit führt zum Verlust der Immunabwehr gegen carzinogene Sub­ stanzen, Viren und Bakterien, so daß der Körper krankmachenden Einflüssen von außen hilflos ausgeliefert ist. AIDS kann zeit­ weilig latent verlaufen, der Ausbruch der Krankheit beruht auf unkontrollierter Vermehrung des HIV-Virus' (Human Immunodefi­ ciency Virus).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, wirksame Mit­ tel für die AIDS-Therapie bzw. die HIV-Bekämpfung zu finden.

Aus EP 05 84 558 A2, EP 0 559 425 A1, JP 07069915A und Chem. Abstr. 125: 104382s (1996) ist bereits bekannt, daß das eisen­ bindende Glycoprotein Lactoferrin (oder ggf. sogar Bruchstück­ chen davon) gegen HIV gut wirksam ist. Weiterhin ist aus US 56 53 981 A, US 54 82 711 A und Chem. Abstr. 123: 152663q (1995) bekannt, daß auch Thymochinon oder thymochinonhaltige Schwarz­ kümmelprodukte gegen Immunschwächekrankheiten wie AIDS wirksam eingesetzt werden können, wobei dies insbesondere auch zur Un­ terstützung einer Krebstherapie vorgeschlagen wird.

Da es sich bei HIV um ein Virus handelt, das sich in bestimmten Krankheitsphasen explosionsartig vermehren kann, wodurch das Immunsystem bis zum Zusammenbruch belastet wird, ist es gerade bei der AIDS-Therapie wichtig, jede Möglichkeit zu nutzen, die Virenzahl drastisch zu verringern; ein Virenrestbestand nach einer nur virustatischen Behandlung wäre praktisch nicht zu to­ lerieren.

Überraschenderweise haben Versuche des Erfinders nun ergeben, daß die Verwendung von eisenbindenden Glycoproteinen und/oder 10-Hydroxy-2-decensäure in Verbindung mit Thymochinon oder thy­ mochinonhaltigen Schwarzkümmelprodukten bei der Behandlung von AIDS das Virus in einem Ausmaß eindämmen kann, wie dies bei Verwendung nur eines Bestandteils der Kombination nicht möglich wäre. Im Einzelnen ist dies anhand der Beispiele gezeigt. Durch die Kombination scheint das Virus daher auf verschiedenen Wegen angegriffen zu werden oder das Immunsystem wird auf verschiede­ ne Weise gestützt. Als Glycoproteine kann Lactoferrin oder z. B. Transferrin gegeben werden, - Als thymochinonhaltiges Schwarzkümmelprodukt kann z. B. ein Schwarzkümmelextrakt aus ägyptischem Schwarzkümmelsamen von Nigella sativa Wildkultivat, gegeben werden.

Das zu verwendende Lactoferrin wird vorzugsweise aus reifer (humaner oder boviner) Muttermilch gewonnen, und zwar in an sich bekannter Weise. Das Lactoferrin sollte weiter aufgerei­ nigt sein, was vorzugsweise gelelektrophoretisch geschieht. Es kann handelsübliches Lactoferrin verwendet werden.

Falls nichts anderes zur Verfügung steht, kann handelsübliches Thymochinon (2-Isopropyl-5-methyl-1,4-benzochinon) verwendet werden. Vorzugsweise jedoch wird das Thymochinon durch Extrak­ tion mit organischen Extraktionsmitteln (wie Alkohol, Ether, Aceton oder Chloroform) und anschließende Aufreinigung aus den Samen des ägyptischen Schwarzkümmels (semen Nigellae sativae tot.) erhalten. Es können für die Behandlung auch direkt Schwarzkümmelextrakte oder -auszüge verwendet werden - dies richtet sich nach der gewählten Applikationsform. Die verwende­ ten Schwarzkümmelprodukte sollten thymochinonreich oder zumin­ dest noch thymochinonhaltig sein.

Es wurde weiter gefunden, daß auch 10-Hydroxy-2-decensäure in Kombination mit Thymochinon eine ausgezeichnete HIV- inhibierende Wirkung besitzt. Vorzugsweise wird die 10-Hydroxy- 2-decensäure aus frisch gewonnenem Gelee Royal isoliert. Gelée Royal (Weiselfuttersaft) ist ein von Ammenbienen zur Aufzucht von Königinnenlarven bereiteter Nahrungsbrei, der reich an Spu­ renelementen und der ungesättigten Fettsäure 10-Hydroxy-2- decensäure ist.

Die 10-Hydroxy-2-decensäure schützt die unbefallenen Zellen ge­ gen den zytopathischen Effekt von MIV. Es moduliert die Produk­ tion von T- und B-Lymphozyten, wodurch sich der Antikörper- Titer erhöht, der den AIDS-infizierten Patienten vor allem ge­ gen durch die Immunschwäche zusätzlich aufkommende bakterielle Infektionen im Bereich Haut, obere Atemwege und HNO schützt.

Auch die 10-Hydroxy-2-decensäure zeigt im Plaque-Test, in Kom­ bination mit Thymochinon und in Kombination mit Thymochinon und Lactoferrin sehr gute Wirkung gegen HIV, ohne daß mit schwer­ wiegenderen Nebenwirkungen zu rechnen wäre. Die beste Wirkung wurde bei Gabe aller drei Wirkstoffe erhalten.

Wie anhand der nachfolgenden Beispiele noch deutlich werden wird, wird der erfindungsgemäße Erfolg bei der Bekämpfung der HIV-Viren durch eine kombinierte Gabe von wenigstens 2 Wirk­ stoffen in Kombination erreicht. Bei Gabe von Lactoferrin ge­ meinsam mit Thymochinon wurde z. B. eine Reduktion der HIV- Plaques von 91% (statistisch) gemessen, bei Gabe aller drei Wirkstoffe eine Inhibierung von 98%.

Die Applikation des eisenbindenden Glycoproteins kann auf jede geeignete, Wirkung zeigende Weise erfolgen. Bevorzugt ist eine intravenöse Gabe von Lactoferrin und/oder 10-Hydroxy-2-decen­ säure und/oder Thymochinon. Bei oraler Gabe sollte das Präparat galenisch so eingestellt werden, daß ein guter Blutserumspiegel erreicht wird, d. h., die Konzentrationen sollten höher sein als beispielsweise bei intravenöser oder intraperitonealer Gabe.

Alle Wirkstoffe - Lactoferrin, 10-Hydroxy-2-decensäure und Thy­ mochinon bzw. das thymochinonhaltigen Schwarzkümmelpräparat - können auch in jeweils unterschiedlichen Applikationsformen an­ gewendet werden. Beispielsweise kann das Eisenprotein bzw. das Lactoferrin intravenös injiziert werden, während im wesentli­ chen gleichzeitig ein Schwarzkümmelpräparat oder Thymochinon in geeigneter galenischer Aufbereitung oral gegeben wird, wobei die 10-Hydroxy-2-decensäure zusätzlich entweder mit dem Lac­ toferrin oder dem Thymochinon verabreicht werden kann.

Derzeitig bevorzugt ist die kombinierte intravenöse Gabe der Wirkstoffe Lactoferrin (oder ersatzweise eines anderen eisen­ bindenden Proteins), und/oder 10-Hydroxy-2-decensäure und Thy­ mochinon in neutraler Lösung. Die Kombination aller drei Wirk­ stoffe ergab die bislang beste Wirkung.

Die Wirkstoffe könnten auch auf einem Träger aufgebracht sein, um z. B. während einer Blutwäsche auf das Blut einzuwirken oder um die Wirkstoffe aus einem Implantat gleichmäßig langsam abzu­ geben.

Die verwendeten Wirkstoffe sind natürlichen Ursprungs und gut verträglich. Schwarzkümmel ist ein im Orient seit alters be­ kanntes medizinisches Heilkraut. Die Extrakte sind gut unter­ sucht und weitestgehend nebenwirkungsfrei. Die gute Wirksamkeit und Verträglichkeit der kombinierten Gabe von Lactoferrin und/oder 10 Hydroxy-2-decensäure und Thymochinon wurde anhand folgender Beobachtungen bewertet:

1. in vitro:

• - klare Virus-Inhibierung, bzw. gutes antivirales Potential gegen HIV

2. in vivo:

• - steigende Phagocyten-Zelltiter;
• - Verbesserung der Leber-, Nieren- und Gallenfluß-Funktion;
• - keine meßbare Veränderung des Herzschlags (Puls, Herz­ rhythmus);
• - keine Veränderung der Blutzusammensetzung (keine Beeinträch­ tigung des Haemoglobinlevels, keine Veränderung in der Anzahl der roten Blutkörperchen, keine Veränderungen bei den weißen Blutkörperchen und Thrombozyten bezüglich Anzahl und Morpho­ logie);
• - keine Veränderung der Enzymseketion im Magen;
• - Verbesserung der Immunoglobulin-Titer, insbesondere IgA und IgG.

Diese Ergebnisse wurden durch tägliche intravenöse Injektion (über bis zu 90 Tage) an 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Mäusen (C57 BL/6) und Kaninchen gewonnen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher er­ läutert:

1. Materialien: Lactoferrin (LF):

aus reifer menschlicher Muttermilch extrahiert und gelelektro­ phoretisch gereinigt (alternativ mit HPLC gereinigt), zur wei­ teren Verwendung in PBS aufgenommen;

Thymochinon (Thq):

aus den Samen von ägyptischem Schwarzkümmel mit organischen Lö­ sungsmitteln extrahiert (EtOH, Et₂O, CHCl₃, Aceton) und ge­ trocknet;
zur weiteren Verwendung in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) oder physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.

10-Hydroxy-2-decensäure (10 HDA):

aus frisch gewonnenem Gelde Royal extrahiert und mit Hilfe prä­ parativer Dünnschichtchromatographie gewonnen (durch chromato­ graphische Fraktionierung mit DSC = Dünnschichtchromatogra­ phie), nach der Identifikation mit HPLC in kristalliner Form getrocknet.

2. Methoden: in vitro:

1 - HIV wurde mit einer Plaque-Reduktionstechnik titriert nach den bei Larder et al. (Larder, B. A., Chesebro, B. and Richman; Antimicrob. Agents Chemother.; 1990, 34: 436-441) und Pauwels et al. (1988) beschriebenen Methoden. Bei diesem Verfahren wird eine Monolayer-Schicht aus HT4-6C-Zellen (mit CD4-Gen) mit 100 bis 300 PFU/well infiziert und in den Vertiefungen einer Rund­ boden-96-well-Microverdünnungsplatte auf einem Medium gezüch­ tet, das 10% fetales Rinder- oder Kalbs-Serum enthielt. Es wurden von jedem getesteten Material verschiedene Konzentratio­ nen einzeln oder in Kombination mit den anderen getesteten Ma­ terialien verwendet. Die Platten wurden drei Tage bei 37°C in­ kubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Monolayer- Zellen mit 10%iger Formaldehydlösung in phosphatgepufferter Salzlösung fixiert und mit 0,25% Kristallviolett angefärbt. Die Plaques wurden quantifiziert.

2 - Die antiviralen Eigenschaften jedes getesteten Materials wurden außerdem durch einen Syncytia-Test (Syncytia formation assay, SFA) nach der bei Johnson et al. (Johnson, V. A. and Byington, R. E. in Aldovini, A. and Walker, B. D. (Eds.); Techniques in HIV Research, Stockton Press, New York, 1990, p. 71) and Prieto et al. (Prieto, L., Hervas-Stubbs, S., Garcia- Granero, N., Berosain, C., Riazu-Boj, J., Lasrte, J., Prieto, J. und Borros-Cuerta, F.; Eur. J. Immunol.; 1995, 25: 877-883) beschriebenen Methode überprüft. Für diese Technik wurden C8166-Zellen von der Europäischen Sammlung für Tierzellkulturen (ECACC Nr. 88051601) bei einer Konzentration von 3 × 10⁵ - 9 × 10⁵ Zellen/ml bei 37°C und 5% CO₂ in Vollmedium kultiviert: RPMI 1640 ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum und 1% Penizil­ lin/Streptomycin. 50 µl verschiedener Lösungen von je­ dem zu testenden Material (alleine und in Kombination mit den anderen getesteten Materialien) wurden, gefolgt von 50 µl Vi­ ruskonzentrat, das 100-150 Syncytia formation units (SFU) enthielt, in die Microtiter-wells gegeben. Nach der Inkubation in 5% CO₂ bei 37°C über 1 h wurden 5 × 10⁴ C8166-Zellen (in 50 µl) zugegeben und es wurde nochmals 24 h bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden suspendiert, und 50 µl der Suspension wurden aufgenommen und auf eine saubere Platte gegeben. Bei der Aus­ zählung der Syncytia wurden nur Syncytia mit einem Durchmesser größer als fünfmal der Größe normaler C8166-Zellen gezählt.

In vivo: Die zu untersuchenden Wirkstoffe - zu Vergleichszwec­ ken einzeln, im Sinn der Erfindung in Kombination - wurden über bis zu 90 Tage intravenös infizierten Kaninchen und Mäusen injiziert. Die Organfunktionen der Tiere, Blut und Immuntiter (Immunoglobulintiter) wurden ständig kontrolliert.

Im einzelnen wurde untersucht:

die Leberfunktion (SGPT und SGOT), die Gallenabsonderung, die Nierenfunktion (Serum-Harnsäure, Serum-Harnstoff zusätzlich zu Kreatin), Blut-Cholesterol, Anzahl und Morphologie roter und weißer Blutkörperchen und Blutplättchen (Thrombozyten), IgA- und IgG-Titer, Puls und Herzrhythmus.

Beispiele:

Lactoferrin wurde in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) im Konzentrationsbereich von 0,5 mg/ml bis 2,0 mg/ml gelöst. Thymochinon wurde entweder in PBS oder aqua bidest. in einem Konzentrationsbereich von 0,1 mg/ml bis 0,5 mg/ml gelöst. 10- Hydroxy-2-decensäure wurde in PBS im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,75 mg/ml gelöst. Alle Lösungen wurden durch Membran­ filtration sterilisiert und bei -20°C gelagert.

Mit diesen Lösungen, bzw. Mischungen daraus, wurden die Virus­ titrationen (s. o.) und die Behandlung der Mäuse und Kaninchen durchgeführt. Bei Verwendung von 10-Hydroxy-2-decensäure betrug die Konzentration zwischen 0,1 und 1,75 mg/ml bezogen auf die Gesamtlösung.

Die oben angegebene Lactoferrinlösung hatte bereits, wie be­ kannt, alleine bei intravenöser Gabe bzw. in dem o. a. Plaque- Test eine deutliche antivirale Wirkung gegen HIV. Bei einem Level von 1 mg/ml wurde eine Virusreduktion von 82% erhalten.

Ein noch besseres Ergebnis wurde jedoch erhalten, wenn erfin­ dungsgemäß Lösungen eingesetzt wurden, die sowohl Lactoferrin als auch Thymochinon enthielten. Für eine Lösung, die 1 mg/ml Lactoferrin und gleichzeitig 0,5 mg/ml Thymochinon enthielt, wurde im Plaque-Test eine Virusreduktion von 91% gefunden (dieses Ergebnis wurde statistisch ausgewertet). Die optimalen Konzentrationen an eisenbindenden Glycoprotein und Thymochinon bzw. Thymochinonextrakt müssen sich im Einzelfall nach den Aus­ gangsbelastungen an HIV richten.

Fig. 1 zeigt die Inhibierung des HIV-1 Wachstums (Plaque- Bildung) in Prozent durch Lactoferrin (LF mit 1 mg/ml), Thy­ mochinon (Thq mit 0,5 mg/ml) und 10-Hydroxy-2-decensäure (10 HDA mit 1,75 mg/ml) einzeln oder in verschiedener Kombination.

Es können auch höhere Konzentrationen verwendet werden, wenn dies erforderlich erscheint. So wurde z. B. die Kombination: LF 2,0 mg/ml, Thq 1,25 mg/ml und 10 HDA 3,0 mg/ml getestet und er­ gab eine Inhibierung von 100%. Die Konzentrationen sind daher nicht beschränkt und hängen nur von den medizinischen Erforder­ nissen ab.

Die Ergebnisse sind zusätzlich numerisch in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben:

Claims (9)

1. Verwendung von eisenbindenden Glycoproteinen und/oder 10- Hydroxy-2-decensäure in Verbindung mit Thymochinon oder thy­ mochinonhaltigen Schwarzkümmelprodukten zur Behandlung von AIDS und sonstigen Immunschwächekrankheiten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als eisenbindendes Glycoprotein Lactoferrin verwendet wird.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lactoferrin aus reifer Muttermilch gewonnen wurde.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Lactoferrin mit Gelelektrophorese gereinigt wurde.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Thymochinon aus Schwarzkümmelsamen extrahiert wurde.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Schwarzkümmelprodukt ein Schwarzkümmel­ extrakt eingesetzt wird.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die 10-Hydroxy-2-decensäure aus Gelee Royal ge­ wonnen wurde, vorzugsweise durch Extraktion.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Substanz(en) intravenös verabreicht wird/werden.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 innerhalb eines pharmazeutischen Präparates, bei welchem die Wirkstoffe auf ei­ nem Träger aufgebracht sind, von dem sie langsam in die Umge­ bung abgegeben werden können.