JPH0769915A

JPH0769915A - ウィルス感染・増殖抑制剤

Info

Publication number: JPH0769915A
Application number: JP5240284A
Authority: JP
Inventors: Isahiro Kawasaki; 功博川崎; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫; Kazuto Hasegawa; 一人長谷川; Wataru Mochiji; 亘持地; Shigeaki Tanaka; 重明田中; Naoki Yamamoto; 直樹山本
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1993-09-02
Filing date: 1993-09-02
Publication date: 1995-03-14
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: JP3770624B2

Abstract

(57)【要約】【目的】副作用の少ないペプチド性のウィルス感染・
増殖抑制剤の提供。【構成】次の式（１）または式（２）で示されるペプ
チドを有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤。式
（１）は、ヒトラクトフェリン（ＬＦ）の25〜40残基で
あり、そのＬＦ(25-52) 、ＬＦ(1-52)も用いることがで
きる。また式（２）は、ウシＬＦの24〜39残基であり、
そのＬＦ(25-51) 、ＬＦ(1-51)も用いることができる。【効果】抗ウィルス剤としてＨＩＶ、インフルエンザ
ウィルス等の感染の防止あるいは治療に有用である。 A-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Val-Ser-
Cys-Ile-Lys-Arg-B(式１） A-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-
Cys-Val-Arg-Arg-B(式２）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、副作用の少ないペプチ
ド性のウィルス感染・増殖抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウィルス感染による疾患の克服のため
に、これまで多くの努力がなされてきた。しかし近年、
世界的にも猛威をふるっているヒト免疫不全ウィルス
（ＨＩＶ）や毎年流行するインフルエンザウィルスのよ
うにいまだ有効な予防法や治療法の無いものもある。ウ
ィルス感染による疾患に対する治療法として抗ウィルス
剤による化学療法がある。しかし現在のところ、全身的
に投与され明白な効果を示す抗ウィルス剤はほとんど無
い。その理由として、ウィルスは細胞内で増殖し、増殖
のための機能をほとんど細胞に依存している。つまりウ
ィルスは感染後、その増殖を治療すべき人体の構成細胞
自体の増殖機能を利用して行っている。従ってウィルス
の増殖を抑える化学物質の多くは細胞にも作用して毒性
を示すからである。抗ウィルス剤の問題点としては上述
のように薬剤の選択毒性が低いこと以外にもウィルス感
染症の特徴から由来するいくつかの問題点がある。特に
急性・全身性のウィルス感染症では、症状が現れる時期
がウィルスの体内増殖のピークが過ぎてしまった後なの
で、むしろウィルスの感染を阻止し増殖を抑制する物質
が求められている。この様なウィルスの感染を防御する
方法としてワクチンの予防接種による方法があるが、こ
の方法はしばしばアレルギー反応や種々の副作用を示す
ことが知られており、しかもウィルスの変異に対しては
対処できないのが現実である。

【０００３】この様な状況において、本発明者らは、ラ
クトフェリン（ＬＦ）、トランスフェリン、オボトラン
スフェリンなど鉄結合能を有するタンパク質が、インフ
ルエンザウィルスやサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の
感染・増殖を抑制することを見出し特許出願を行った
（特開平２−２３３６１９）。ＬＦは、乳中に分泌され
る鉄結合性のタンパク質で抗菌活性があることが知られ
ている。ＬＦは、ヒトおよびウシ由来のものについて詳
細な研究が行われており、ヒトＬＦ、ウシＬＦともその
全アミノ酸配列がすでに決定されている(M.W. Rey,et a
l.,Neucleic AcidRes.,Vol.18,5288,1990およびP.E. Me
ad et al.,Neucleic Acid Res.,Vol.18,7167,1990)。特
開平１−２３３２２６にはＬＦ等の乳タンパク質を有効
成分とする抗ウィルス剤が開示されており、この中にＬ
Ｆが、外被性ウィルスおよび非外被性ウィルスに対して
有効であることが記載されている。また最近、本発明者
らは、ＨＩＶに対するこれら鉄結合性タンパク質の感染
・増殖抑制効果についても確認し、ＬＦを有効成分とす
るＨＩＶ感染・増殖抑制剤について特許出願を行った
（特願平４−２２０６３５）。

【０００４】この様に、ＬＦなど鉄結合性タンパク質は
ウィルスの感染・増殖抑制効果を持つことが次第に明ら
かとなり、抗ウィルス剤として、その実用化が期待され
てきた。これらタンパク質が実際に感染・増殖抑制剤と
して用いられるためには、体内に投与した場合抗原性
の点で問題が無いこと、大量に供給できることが必要
である。これらの鉄結合性タンパク質のうち、ウシＬＦ
やウシトランスフェリン、又は鶏卵から得られるオボト
ランスフェリンは大量に供給できるが人体内に投与した
場合抗原性を示すという問題がある。一方、ヒトＬＦは
抗原性に関しては問題無いが大量に供給することが困難
である。この様な問題を解決するために、本発明者らは
ＬＦ由来のペプチドフラグメントのうち〔化７〕および
〔化８〕が抗ウィルス活性を持つことを見出し特許出願
をおこなった（特願平５─６９２１０）。

【０００５】

【化７】Cys-Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Va
l-Arg-Gly-Pro-Pro-Val-Ser-Cys

【０００６】

【化８】Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Le
u-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys （ただし、これらの式中Cys は還元型でもよく、またペ
プチド内の２個のCysが−Ｓ−Ｓ−結合して酸化型とな
ってもよい。)

【０００７】これらのペプチドはそれぞれヒトＬＦの２
０〜３７残基およびウシＬＦの１９〜３６残基に相当す
るもので分子内のＳ−Ｓ結合は抗ウィルス活性に必須で
はなかった。これらのペプチドは天然のＬＦに比べて極
めて鎖長が短いため、化学合成や遺伝子操作による合成
により容易に供給することができる。またマウスを用い
た感染防御試験においては、ＣＭＶの感染を完全に抑制
するのに必要な〔化７〕および〔化８〕のペプチド量
は、 0.1g/体重kgであった。

【０００８】

【本発明が解決しようとする課題】本発明者らは、さら
に強力な抗ウイルス活性を有するＬＦフラグメントを得
る目的で、いくつかのＬＦフラグメントを化学的に合成
し、その抗ウィルス活性を検討することで、ヒトＬＦの
抗ウィルス活性に関する必須部分を検索した。その結
果、ヒトＬＦでは次の〔化９〕で示される２５〜４０残
基部分が、またウシＬＦでは次の〔化１０〕で示される
２４〜３９残基部分が抗ウィルス活性に必須であること
を見出した。なお以後のＬＦペプチドの残基の番号は天
然のヒトまたはウシラクトフェリンのアミノ酸配列に付
与された番号を用いる。

【０００９】

【化９】Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Va
l-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg

【００１０】

【化１０】Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-
Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg

【００１１】本発明者らは、この活性部分を含み、さら
に高活性な抗ウィルスペプチドを開発する目的で、〔化
９〕および〔化１０〕に示したペプチドを中心にＮ端側
およびＣ端側にペプチド鎖を延長したところ、ヒトＬＦ
では１〜５２残基〔化１１〕に相当する部分および２５
〜５２残基〔化１２〕に相当する部分が、これまで知ら
れていたＬＦ由来ペプチドに比べてより高活性であるこ
とを見出した。また、ウシＬＦでは１〜５１残基〔化１
３〕に相当する部分および２４〜５１残基〔化１４〕に
相当する部分がこれまで知られていたＬＦ由来ペプチド
に比べてより高活性であることを見出した。

【００１２】

【化１１】Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-
Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys-Phe-Gln-Tr
p-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Val-
Ser-Cys-Ile-Lys-Arg-Asp-Ser-Pro-Ile-Gln-Cys-Ile-Gl
n-Ala-Ile-Ala-Glu

【００１３】

【化１２】Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-
Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg-Asp-Ser-Pro-Ile-Gln-Cys-Il
e-Gln-Ala-Ile-Ala-Glu

【００１４】

【化１３】Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr-
Ile-Ser-Gln-Pro-Asp-Ser-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gl
n-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-
Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Al
a-Ile-Ala-Glu-Lys

【００１５】

【化１４】Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-
Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Il
e-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu

【００１６】また、これらのペプチドフラグメントのう
ち〔化１１〕および〔化１３〕は、分子内に２つのＳ−
Ｓ結合をもつことができるが、このＳ−Ｓ結合はウイル
ス活性の発現には必須ではなかった。Ｓ−Ｓ結合は存在
していても、存在していなくとも良い。従って、〔化１
１〕及び〔化１３〕のCys は還元型であってもあるいは
相互にＳ−Ｓ結合して酸化型になってもよい。

【００１７】これらのＬＦフラグメントに関するこれま
での知見としては、ヒトＬＦの１〜５０残基部分がＬＦ
分子の受容体結合領域であるとする報告（B.F. Anderso
n,etal,J.Mol.Biol.,209,711,1989）、ヒトＬＦの４〜
５２に相当するペプチドがＬＦとリンパ球の結合を阻害
したという報告（D.Legrand,et al,Biochemistry,31,92
43,1992)、ヒトＬＦの１〜４７残基に相当するペプチド
およびウシＬＦの１７〜４１残基に相当するペプチドが
抗菌活性をもつという報告(W.Bellamy,et al.,Biochim.
Biophys.Acta,1121,130,1992 ）などがあるが抗ウィル
ス活性についての記載は無い。またこの抗菌活性に関し
て、特開平５−７８３９２ではヒトＬＦの１９〜２９残
基あるいはウシＬＦ１８〜２８残基部分を含むペプチド
が、特開平５−１４８２９５ではヒトＬＦの２１〜２６
残基あるいはウシＬＦ２０〜２４残基部分を含むペプチ
ドが、特開平５−１４８２９６ではウシＬＦの２１〜２
５残基あるいはウシＬＦ２５〜２９残基部分を含むペプ
チドが、特開平５−１４８２９７ではウシＬＦの２０〜
２４残基部分を含むペプチドについてそれぞれ記載され
ているが、いずれも本発明の抗ウィルス効果に必須な部
位とは異なっている。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の〔化１
５〕または〔化１６〕で表されるアミノ酸配列を有する
ペプチドを有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤に
関する。また、このペプチドは薬理的に許容される塩の
形となっていてもよい。

【００１９】

【化１５】A-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pr
o-Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg-B 但し式中Ａは、アミノ末端、アセチル基、ペプチド残基
のいずれかであり、Ｂはカルボキシル末端、アミド、ペ
プチド残基のいずれかを示す。

【００２０】

【化１６】A-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Se
r-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-B 但しＡは、アミノ末端、アセチル基、ペプチド残基のい
ずれかであり、Ｂはカルボキシル末端、アミド、ペプチ
ド残基のいずれかを示す。

【００２１】また〔化１５〕、〔化１６〕に示す配列を
基にＮ末端側およびＣ末端側にペプチド鎖を延長したペ
プチドを有効成分とすることができる。このようなペプ
チドとしては、例えば、前記した、〔化１１〕、〔化１
２〕、〔化１３〕、〔化１４〕に示すペプチドが例示さ
れる。さらにこれらの薬理的に許容される塩、例えば塩
酸塩、酢酸塩なども用いることができる。〔化１５〕お
よび〔化１６〕に示すペプチドは、それぞれヒトＬＦの
２５〜４０残基およびウシＬＦの２４〜３９残基に相当
する配列であり、前述のように本発明における抗ウィル
ス活性に必須な領域である。以下本発明のウィルス感染
・増殖抑制剤中の有効成分のＬＦ由来のアミノ酸配列を
含むペプチドはヒトＬＦ（２５−４０）あるいはウシＬ
Ｆ（２４−５１）のようにＬＦ中のアミノ酸配列の番号
で記載する。本発明のペプチドを得るためには、通常の
化学合成による方法、ＬＦのプロテアーゼ分解物から単
離する方法、遺伝子組み換えによる方法などどれでもよ
い。さらに、市販のペプチドシンセサイザー等の合成装
置を用いて直鎖ペプチドを得た後、通常の方法でＳ−Ｓ
結合を形成させることもできるし、Ｓ−Ｓ結合を形成さ
せなくても良い。

【００２２】これらのペプチドまたはペプチド誘導体は
単独もしくは賦型剤、安定剤を添加して製剤化すること
ができる。本発明のウィルス感染・増殖抑制剤は、経
口、注射、座薬として投与することができる。通常は、
成人１日あたり０．１〜１．０ｇを投与することにより
効果を示す。またこれらのペプチドは、従来から食品素
材として用いられているタンパク質の一部なので安全性
の面でも問題無い。特にヒト由来のペプチドフラグメン
トは、その抗原性が非常に低いため実用上好ましい。

【００２３】以下に本発明によるウィルス感染・増殖抑
制剤について実施例により詳細に説明する。なお、合成
は、泉谷ら著「ペプチド合成の基礎と実験」（1985年丸
善刊）p194-233に記載の方法に従い固相合成法にて行っ
た。

【実施例１】ヒトＬＦ（２５−４０）の合成ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、
パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基として
Ｃ末端側からペプチド鎖を順次延長することにより０．
２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。
得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド１２３３ｍｇをフ
ェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール
存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドの
ＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行っ
た。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテ
ルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し
凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド５００ｍｇ
は、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（２１．
５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶出：０．１％ＴＦＡを
含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出〕により
精製しヒトＬＦ（２５−４０）の直鎖精製ペプチド３４
０ｍｇを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬ
Ｃによる分析の結果９３％であった。

【００２４】

【実施例２】ヒトＬＦ（２５−５２）の合成実施例１と同様の方法で合成し、純度９６％のヒトＬＦ
（２５−５２）の鎖状ペプチド３８６ｍｇを得た。

【００２５】

【実施例３】Ｎ−アセチル−ヒトＬＦ（２５−４０）−アミド（Ａｃ
−ヒトＬＦ（２５−４０）−ＮＨ₂）の合成ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）によりベ
ンズヒドリルアミン樹脂を用い第３ブチルオキシカルボ
ニル（ｔ−Ｂｏｃ）基をアミノ末端の保護基としてＣ末
端側から遂次ペプチド鎖を延長することにより０．２５
ｍｍｏｌスケールで合成を行った。縮合反応をすべて終
えた後、アミノ末端のｔ−Ｂｏｃ基を除去し、無水酢酸
でこれをアセチル化した。ＨＦ処理によりペプチドの樹
脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧
濃縮によりＨＦを除去し目的の粗Ａｃ−ヒトＬＦ（２５
−４０）−ＮＨ₂を得た。この粗ペプチドを実施例１と
同様にしてＨＰＬＣで精製し、純度９１％の上記精製ペ
プチド４２ｍｇを得た。

【００２６】

【実施例４】ヒトＬＦ（１−５２）、〔²⁰Cys(Acm),³⁷Cys(Acm) 〕ヒ
トＬＦ（１−５２）および〔¹⁰CysSH,²⁰Cys(Acm),³⁷Cys
(Acm),⁴⁶CysSH 〕ヒトＬＦ（１−５２）の合成ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、
パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基とし、
²⁰Cys および³⁷Cys のＳＨ基をアセトアミドメチル（Ａ
ｃｍ）基で保護してＣ末端側から遂次ペプチド鎖を延長
することにより０．２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペ
プチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチ
ド２３３７ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオー
ル、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護
基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去
した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、こ
れを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖
粗ペプチド９７０ｍｇは、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデ
シル４ＰＷ（２１．５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶
出：０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルにてグラ
ジエント溶出〕により精製し直鎖精製ペプチド〔¹⁰CysS
H,²⁰Cys(Acm),³⁷Cys(Acm),⁴⁶CysSH 〕ヒトＬＦ（１−５
２）６０７ｍｇを得た。得られた精製ペプチドの純度
は、ＨＰＬＣによる分析の結果９６％であった。このペ
プチドをフェリシアン化カリウム存在下空気酸化により
¹⁰Cys,⁴⁶Cys にＳ−Ｓ結合を形成させさらにＨＰＬＣに
て精製することで、純度９０％の〔²⁰Cys(Acm),³⁷Cys(A
cm) 〕ヒトＬＦ（１−５２）４５０ｍｇを得た。さらに
このペプチドをヨウ素処理しＡｃｍ基の除去とＳ−Ｓ結
合の形成を同時に行い、ＨＰＬＣで精製することでヒト
ＬＦ（１−５２）１２０ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分
析の結果このペプチドの純度は８９％であった。

【００２７】

【実施例５】ウシＬＦ（２４−３９）の合成ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、
パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基として
Ｃ末端側から遂次ペプチド鎖を延長することにより０．
２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。
得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド１３４０ｍｇをフ
ェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール
存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドの
ＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行っ
た。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテ
ルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し
凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド５４３ｍｇ
は、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（２１．５
×１５０ｍｍ，東ソー社），溶出：０．１％ＴＦＡを含
む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出〕により精
製し直鎖精製ペプチド３６７ｍｇを得た。得られた精製
ペプチドの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果９０％で
あった。

【００２８】

【実施例６】ウシＬＦ（２４−５１）の合成実施例５と同様の方法で合成し、純度９３％の鎖状ペプ
チド４３２ｍｇを得た

【００２９】

【実施例７】Ｎ−アセチル−ウシＬＦ（２４−３９）−アミド（Ａｃ
−ウシＬＦ（２４−３９）−ＮＨ₂）の合成ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）によりベ
ンズヒドリルアミン樹脂を用い第３ブチルオキシカルボ
ニル（ｔ−Ｂｏｃ）基をアミノ末端の保護基としてＣ末
端側から遂次ペプチド鎖を延長することにより０．２５
ｍｍｏｌスケールで合成を行った。縮合反応をすべて終
えた後、アミノ末端のｔ−Ｂｏｃ基を除去し、無水酢酸
でこれをアセチル化した。ＨＦ処理によりペプチドの樹
脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧
濃縮によりＨＦを除去し目的の粗Ａｃ−ウシＬＦ（２４
−３９）−ＮＨ₂を得た。この粗ペプチドを実施例１と
同様にしてＨＰＬＣで精製し、純度９１％の精製ペプチ
ド４２ｍｇを得た。

【００３０】

【実施例８】ウシＬＦ（１−５１）、〔¹⁹Cys(Acm),³⁶Cys(Acm) 〕ウ
シＬＦ（１−５１）および〔⁹CysSH,¹⁹Cys(Acm),³⁶Cys
(Acm),⁴⁵CysSH〕ウシＬＦ（１− ５１）の合成ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、
パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基とし、
¹⁹Cys および³⁶Cys のＳＨ基をアセトアミドメチル（Ａ
ｃｍ）基で保護してＣ末端側から遂次ペプチド鎖を延長
することにより０．２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペ
プチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチ
ド２７６７ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオー
ル、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護
基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去
した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、こ
れを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖
粗ペプチド８６５ｍｇは、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデ
シル４ＰＷ（２１．５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶
出：０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルにてグラ
ジエント溶出〕により精製し直鎖精製ペプチド〔⁹CysS
H,¹⁹Cys( Acm),³⁶Cys(Acm),⁴⁵CysSH 〕ウシＬＦ（１−
５１）５８９ｍｇを得た。得られた精製ペプチドの純度
は、ＨＰＬＣによる分析の結果９５％であった。このペ
プチドをフェリシアン化カリウム存在下空気酸化により
⁹Cys,⁴⁵CysにＳ−Ｓ結合を形成させさらにＨＰＬＣにて
精製することで、純度８８％の〔¹⁹Cys(Acm),³⁶Cys(Ac
m) 〕ウシＬＦ（１−５１）４６７ｍｇを得た。さらに
このペプチドをヨウ素処理しＡｃｍ基の除去とＳ−Ｓ結
合の形成を同時に行い、ＨＰＬＣで精製することでウシ
ＬＦ（１−５１）１０１ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分
析の結果このペプチドの純度は８７％であった。

【００３１】

【実施例９】ウィルス感染、増殖抑制剤の製造本実施例においては、上記実施例１〜６の方法により得
ることのできたペプチドの注射製剤の生産例を示した。ヒトＬＦ（２５−４０） 100mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。ヒトＬＦ（２５−５２) 100mg ツイーン80 1mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００３２】ヒトＬＦ（１−５２) 100mg ツイーン80 1mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。Ａｃ−ヒトＬＦ（２５−４０）−ＮＨ₂ 100mg ツイーン80 2mg ソルビトール 4ｇ上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。ウシＬＦ（２４−３９） 4ｇツイーン80 2mg グリシン 2ｇ上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。ウシＬＦ（２４−５１） 4g ツイーン80 1mg ソルビトール 2g グリシン 1g 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００３３】ウシＬＦ（１−５１） 4g ツイーン80 1mg ソルビトール 2g グリシン 1g 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。Ａｃ−ウシＬＦ（２４−３９）−ＮＨ₂ 4g ソルビトール 4g ヒト血清アルブミン 50mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００３４】

【発明の効果】本発明の実施により、ウィルス感染・増
殖抑制剤が提供される。本発明によるウィルス感染・増
殖阻止作用のある組成物の作用効果を要約すると次のと
おりである。（１）ウィルスの感染を防ぐことができ、また、既感染
者に対しては、体内でさらにウィルスが増殖して感染細
胞が増加することを防ぐことができる。（２）通常食品として摂取している成分を有効成分とす
る組成であるため、投与することによる副作用の心配が
少ない。（３）低分子であるため、ＬＦなど結合性タンパク質
に比べ化学合成法などで比較的容易にしかも大量に調製
できる。ゆえに特定の患者の治療に使用が限定されるこ
とがなく、広くウィルスの感染・増殖を予防することも
できる。本発明のウィルス感染・増殖抑制剤は、インフルエンザ
あるいはエイズの予防または治療や臓器移植の際のサイ
トメガロウィルス感染防御に有用である。以下に実験例
を示し、本発明の効果をさらに詳細に説明する。

【００３５】

【実験例１】ＬＦ由来ペプチドのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に
対する感染・増殖抑制効果方法：ＬＦ由来ペプチドを２％血清添加ＭＥＭ培地に
溶解し、濾過滅菌しストック溶液とした。このストック
溶液を必要に応じて２％血清添加ＭＥＭ培地により希釈
して用いた。ヒト胎児繊維芽細胞（ＨＥＬ細胞）を試料
を含む２％血清添加ＭＥＭ培地に懸濁させ１０分間イン
キュベートした。遠心分離により細胞を取り出しさらに
２％血清添加ＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄した後、細胞
を２％血清添加ＭＥＭ培地に懸濁させた。これにヒトＣ
ＭＶ（ＴＡＮＡＫＡ株）を添加し、２４時間培養後、ヒ
トＣＭＶ陽性血清で蛍光染色し細胞へのヒトＣＭＶの吸
着能力を測定した。

【００３６】結果：表１にヒトＬＦ由来ペプチドのＣ
ＭＶに対する感染・増殖阻害効果を示す。表１に示すペ
プチドのうち抗ウィルス活性をもつペプチドに共通する
配列から、２５〜４０残基部分が活性に必須な構造を含
むものと推察された。これは、ウシＬＦの場合２４〜３
９残基部分に相当する。また表２では、ヒトＬＦ由来ペ
プチドがＣＭＶの感染・増殖を、コントロールと比較し
て９０％阻害するのに必要な最少濃度を示している。こ
の結果より、本発明によるペプチドは、天然のＬＦやこ
れまで知られていたＬＦ由来のペプチドより低濃度で抗
ウィルス効果を示すことが明らかとなった。なおここで
使用したペプチドのうち本発明を構成するペプチド以外
のものについても、実施例１に示した方法と同様にして
化学的に合成したものであり、その純度はＨＰＬＣによ
る分析の結果いずれも８５％以上であることを確認して
いる。

【００３７】

【表１】ヒトＬＦ由来ペプチドのＣＭＶに対する感染増殖阻害効果 ──────────────────────────────────── ペプチド^*1 Ｓ−Ｓ結合感染阻害率（％） ──────────────────────────────────── ＬＦ（１−５２） ¹⁰Cys-⁴⁶Cys,²⁰Cys-³⁷Cys ９５ＬＦ（１−５２） ¹⁰Cys-⁴⁶Cys, ９５ＬＦ（１−５２）９７ＬＦ（１８−５２）２４ＬＦ（２５−５２）９１ＬＦ（１−４０）９７ＬＦ（２８−４０）０ＬＦ（１９−３１）２ＬＦ（２−１９）１４ＬＦ（４−２９）０ＬＦ（１８−４２）９７ ────────────────────────────────────^*1 ペプチド濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌ

【００３８】

【表２】ＬＦ由来ペプチドの抗ＣＭＶ効果における最少活性発現濃度 ──────────────────────────────────── サンプル最少活性発現濃度^*1（ｍｇ／ｍｌ） ──────────────────────────────────── ヒトＬＦ１．０ウシＬＦ１．０ヒトＬＦ（２５−４０）１．０ヒトＬＦ（２５−５２）０．５ヒトＬＦ（１−５２）０．０５ウシＬＦ（２４−３９）１．０ウシＬＦ（２４−５１）０．５ウシＬＦ（１−５１）０．０５ヒトＬＦ（１８−４２）１．５ウシＬＦ（１７−４１）２．０ ──────────────────────────────────── ^*1 ９０％の感染阻止率を示す濃度

【００３９】

【実験例２】ＬＦ由来ペプチドのＨＩＶに対する感染・増殖抑制効果方法：ＨＩＶの一株であるＨＴＬＶ−III _B持続感染
株であるＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−III _B（以下ＭＴ−
４と略記する）細胞の培養上清をウィルス液として用い
た。上清は−８０℃に保存した。検定に用いる細胞はヒ
トＴ細胞系のＭＴ−４を用いた。ＭＴ−４は１０％牛胎
児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて
継代した。試料（ＬＦ由来ペプチド）は、培地（ＲＰＭ
Ｉ１６４０）に溶解し目的の濃度として細胞に１ｍｌ添
加した。６０分間インキュベートした後、ＨＩＶをｍｏ
ｉ（細胞／感染ウィルス比）＝０．０１となるようにＭ
Ｔ−４細胞に感染させ、３×１０⁵／ｍｌに調製した細
胞液を１ｍｌ加えた。細胞を３日間培養後、ＨＩＶ感染
細胞を間接蛍光抗体法を用いて測定した。ＨＩＶ感染細
胞は、ＨＩＶ感染患者血清を一次抗体とした間接蛍光抗
体法で測定した。蛍光顕微鏡下で細胞５００個以上を観
察し、蛍光染色された細胞の割合を算出した。なお、陽
性コントロールとして試料を加えずに培養したＨＩＶ感
染ＭＴ−４細胞、陰性コントロールとしてウィルス液を
添加しない細胞培養を同時に行った。

【００４０】結果：実験結果を表３に示す。結果はＨＩ
Ｖの感染を９０％阻止するのに必要な濃度を示してい
る。この結果より、本発明によるペプチドは、天然のＬ
Ｆやこれまで知られていたＬＦ由来のペプチドより低濃
度で抗ウィルス効果を示すことが明らかとなった。

【００４１】

【表３】ＬＦ由来ペプチドの抗ＨＩＶ効果における最少活性発現濃度 ──────────────────────────────────── サンプル最少活性発現濃度^*1（ｍｇ／ｍｌ） ──────────────────────────────────── ヒトＬＦ０．１ウシＬＦ０．１ヒトＬＦ（２５−４０）０．０５ヒトＬＦ（２５−５２）０．０５ヒトＬＦ（１−５２）０．０２ウシＬＦ（２４−３９）０．０５ウシＬＦ（２４−５１）０．０５ウシＬＦ（１−５１）０．０５ヒトＬＦ（１８−４２）０．１ウシＬＦ（１７−４１）０．１ ──────────────────────────────────── ^*1 ９０％の感染阻止率を示す濃度

【００４２】

【実験例３】ＬＦ由来ペプチドのインフルエンザウィルスに対する感
染・増殖抑制効果方法：インフルエンザウィルスに対するＬＦ由来ペプ
チドの感染・増殖抑制効果は、ウィルス実験学総論、国
立予防衛生研究所学友会編、ｐ．１１３−１２９丸善
（１９７３）に従い、ふ化鶏卵内培養法によって行っ
た。ヒトＬＦ、ウシＬＦおよび実施例１─６で調製した
ペプチドを生理食塩水に溶解し、濾過滅菌した。卵令１
０日のふ化鶏卵５０個を５個ずつ１０群にわけ、コント
ロール群には生理食塩水のみを、他の群には試料溶液１
００μｌを尿液腔内に接種した。３時間後、各ふ化鶏卵
にインフルエンザウィルスＡ／ＰＲ／８／３４のウィル
ス液１００μｌを尿液腔内に接種した。なおここで用い
たウィルス量は、尿液腔内に接種した後採取した尿液を
６４倍希釈した溶液で赤血球凝集（ＨＡ）反応を示すこ
とのできるウィルス量である。２日後それぞれの卵を氷
室中で一夜静置しその後尿液を採取した。得られた尿液
を生理食塩水で段階的に希釈しこれにヒヨコ安定化赤血
球（武田薬品）を加え、ＨＡ反応を行うことでウィルス
を定量した。

【００４３】結果：実験結果を表４に示す。結果はイン
フルエンザウィルスの感染を９０％阻止するのに必要な
濃度を示している。この結果より、本発明によるペプチ
ドは、天然のＬＦやこれまで知られていたＬＦ由来のペ
プチドより低濃度で抗ウィルス効果を示すことが明らか
となった。

【００４４】

【表４】ＬＦ由来ペプチドの抗インフルエンザウィルス効果における最少活性発現濃度 ──────────────────────────────────── サンプル最少活性発現濃度^*1（ｍｇ／ｍｌ） ──────────────────────────────────── ヒトＬＦ２．０ウシＬＦ２．０ヒトＬＦ（２５−４０）０．５ヒトＬＦ（２５−５２）０．５ヒトＬＦ（１−５２）０．２ウシＬＦ（２４−３９）０．５ウシＬＦ（２４−５１）０．２ウシＬＦ（１−５１）０．２ヒトＬＦ（１８−４２）１．０ウシＬＦ（１７−４１）１．０ ──────────────────────────────────── ^*1 ９０％の感染阻止率を示す濃度

【００４５】

【実験例４】ｉｎｖｉｖｏにおけるＣＭＶ感染防御試験方法：４週令雄のＢａｌｂｃ／ＡＪｃｌマウス（１群１
０匹）を用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に試
料を溶かし、マウス腹腔内に投与した。６時間後、１×
１０⁶ＰＦＵのマウスＣＭＶを腹腔内に投与し、１０日
後のマウスの生存率で感染防御率を評価した。

【００４６】結果：実験結果を表５に示す。本発明によ
るペプチドは０．０１ｇ／体重ｋｇ以上の投与でマウス
ＣＭＶに対して感染防御効果をもつことが明らかとなっ
た。

【００４７】

【表５】ｉｎｖｉｖｏにおけるマウスＣＭＶ感染防御試験 ─────────────────────────────────── 試料投与量（ｇ／体重ｋｇ）生存率（％） ─────────────────────────────────── ─ ─ １００ＣＭＶ ─ ０ＣＭＶ＋ヒトＬＦ（１−５２）０．００２４００．００５６００．０１１０００．０２１０００．０５１００ＣＭＶ＋ウシＬＦ（１−５１）０．００２２００．００５４００．０１１０００．０２１０００．０５１００ ───────────────────────────────────

【００４８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg 1 5 10 15

【００４９】配列番号：２配列の長さ：５２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu 1 5 10 15 Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly 25 30 Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Glu 50

【００５０】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg 1 5 10 15 Asp-Ser-Pro-Ile-Gln-Cys-Ile-Gln-Ala-Ile-Ala-Glu 20 25

【００５１】配列番号：４配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg 1 5 10 15

【００５２】配列番号：５配列の長さ：５２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Pro Arg Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln Pro Asp Ser 1 5 10 15 Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 20 25 30 Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala Leu Glu Cys Ile Arg Ala 35 40 45 Ile Ala Glu Lys 50

【００５３】配列番号：６配列の長さ：２８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg 1 5 10 15 Ala Phe Ala Leu Glu Cys Ile Arg Ala Ile Ala Glu 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者田中重明神奈川県綾瀬市小園1431−６ (72)発明者山本直樹東京都渋谷区恵比寿南３−11−17−501

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の〔化１〕で表されるアミノ酸配列を
有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするウィルス感染・増殖抑制剤【化１】A-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-
Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg-B 但しＡは、アミノ末端、アセチル基、ペプチド残基のい
ずれかであり、Ｂはカルボキシル末端、アミド、ペプチ
ド残基のいずれかを示す。
【請求項２】次の〔化２〕で表されるアミノ酸配列を
有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするウィルス感染・増殖抑制剤【化２】Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Al
a-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys-Phe-Gln-Trp-
Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Val-Se
r-Cys-Ile-Lys-Arg-Asp-Ser-Pro-Ile-Gln-Cys-Ile-Gln-
Ala-Ile-Ala-Glu （ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内
の２個のCys が結合して−Ｓ−Ｓ−結合を形成した酸化
型であってもよい)
【請求項３】次の〔化３〕で表されるアミノ酸配列を
有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするウィルス感染・増殖抑制剤【化３】Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Va
l-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg-Asp-Ser-Pro-Ile-Gln-Cys-Ile-
Gln-Ala-Ile-Ala-Glu （ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内
の２個のCys が結合して−Ｓ−Ｓ−結合を形成した酸化
型であってもよい)
【請求項４】次の〔化４〕で表されるアミノ酸配列を
有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするウィルス感染・増殖抑制剤【化４】A-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-
Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-B 但しＡは、アミノ末端、アセチル基、ペプチド残基のい
ずれかであり、Ｂはカルボキシル末端、アミド、ペプチ
ド残基のいずれかを示す。
【請求項５】次の〔化５〕で表されるアミノ酸配列を
有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするウィルス感染・増殖抑制剤【化５】Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Il
e-Ser-Gln-Pro-Asp-Ser-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-
Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cy
s-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-
Ile-Ala-Glu-Lys （ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内
の２個のCys が結合して−Ｓ−Ｓ−結合を形成した酸化
型であってもよい)
【請求項６】次の〔化６〕で表されるアミノ酸配列を
有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするウィルス感染・増殖抑制剤【化６】Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Il
e-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-
Arg-Ala-Ile-Ala-Glu （ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内
の２個のCys が結合して−Ｓ−Ｓ−結合を形成した酸化
型であってもよい)