KR20140075065A - 관중 추출물을 함유하는 면역 활성 증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 관중추출물을 함유하는 면역 활성 증강용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 약용식물인 관중의 친수성 유기용매 추출물을 함유하여 대식세포의 일산화질소, 종양괴사인자-알파 및 인터루킨-1 베타의 생성을 유도하는 면역 활성 증강용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 기능성 식품을 투여 또는 섭취하면, 대식세포의 활성화를 통해, 특히 면역력이 약한 환자나 노약자의 면역기능을 효과적으로 향상시킬 수 있어, 낮아진 면역력에 따른 바이러스, 미생물 등의 감염에 대비할 수 있게 된다.

Description

관중 추출물을 함유하는 면역 활성 증강용 조성물{Composition for increasing immunity comprising extracts of Dryopteris crassirhizoma}

본 발명은 관중추출물을 함유하는 면역 활성 증강용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 약용식물인 관중의 친수성 유기용매 추출물을 함유하여 대식세포의 일산화질소, 종양괴사인자-알파 및 인터루킨-1 베타의 생성을 유도하는 면역 활성 증강용 조성물에 관한 것이다.

다양한 병원체로부터 신체를 보호하기 위한 1차적 중요 방어체계는 면역체계이다. 이러한 면역체계는 비특이적으로 병원체를 인식하고 반응하는 대식세포와 호중구의 내재면역(innate immunity), 그리고 특정 항원에 대하여 반응하고 기억세포를 만들어 같은 항원에 노출 시 빠른 반응을 일으키는 림프구의 적응면역(adaptive immunity)으로 구분된다.

대식세포는 세균 표면에 있는 공통성분을 인지하고 결합할 수 있는 표면 수용체를 통해서 세균을 방어한다. 바이러스감염, 진균감염, 기생충에 대해서도 마찬가지 방법으로 방어한다. 활성화된 대식세포는 활성산소(oxygen radicals)를 분비하여 세균에 독성을 유발하며, 싸이토카인(cytokines)을 분비하여 내피세포(endothelial cell)의 부착성을 증가시켜 순환하는 백혈구가 혈관을 빠져나와 감염부위로 이동하게 한다. 또한, 이들 세포는 케모카인(chemokines)을 분비하여 호중구(neutrophil)나 단구(monocyte)와 같은 세포들을 감염조직에 대량으로 끌어들인다. 유입된 이 세포들도 대식세포와 같이 세균성분을 인지하여 침입한 미생물을 잡아먹고 파괴시킨다. 단구는 대식세포로 빠르게 분화된다. 감염 후기에는 림프구가 국소 림프절로 유입된 항원을 함유한 수지상세포에 의해 활성화된다. 이와 같이, 내재면역인 대식세포는 면역계의 중추적 역할을 수행한다. 대식세포는 직·간접적인 방법으로 세균의 침입 및 종양(tumour) 세포를 인식하여 사멸시키는 역할을 수행한다. 구체적으로, 이러한 직접적인 방법으로는 일산화질소(nitric oxide), 초산화물(superoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide) 등과 같은 활성산소(oxygen radicals)가 활성화된 대식세포에서 생성되어 세균이나 종양세포에 작용하는 방법이다. 일산화질소는 일산화질소 생합성 효소(NOS)의 작용에 의해서, L-아르기닌(L-arginine)이 NADPH가 존재하는 상태에서 일산화를 통하여 시트룰린(citrulline)과 함께 생성된 자유 라디컬(free radical)이다. 일산화질소 생합성은 iNOS(inducible NOS), nNOS(neuronal NOS), eNOS(endothelial NOS)의 3종류로 분류된다. 일산화질소는 미토콘드리아 호흡 사슬(mitochondrial respiratory chain)의 복합체(complexes) Ⅰ과 Ⅳ, 리보뉴클레오티드 환원효소(ribonucleotide reductase), GAPDH 등의 효소 작용을 억제하거나 DNA 변형을 유도하여 세균 및 바이러스에 대한 면역학적 방어를 형성한다. 간접적인 방법으로는 활성화된 대식세포가 싸이토카인을 분비하여 자가분비(autocrine), 측분비(paracrine) 작용으로 면역세포의 활성을 유도하며, T 세포에 항원(antigen)을 제시(presentation)하여 항세균 또는 항종양 작용을 한다.

대식세포는 병원성 세균(pathogenic bacteria), 균류(fungi), 원생동물(protozoa)과 같은 병원체 및 종양(tumour)에 대한 인식으로 활성화되어 염증성 싸이토카인 TNF-α, IL-1β, 일산화질소를 분비시키며, 연쇄적인 면역반응을 유도하여 감염 혹은 전이성 질병을 방어한다.

염증반응에 있어서 TNF-α, IL-1β는 혈액과 조직 사이의 구조물인 내피세포(endothelial cell)를 자극하여 ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1과 같은 접착(adhesion) 분자의 생산을 촉진하여 백혈구를 염증부위로 이동하게 한다. 따라서, 염증부위에 축적된 백혈구는 싸이토카인을 지속적으로 분비하여 미생물과 종양세포에 대한 독성을 나타낸다. TNF-α, IL-1β는 일산화질소와 함께 미생물과 종양에 대항하는 면역물질로 널리 규명된 물질이다.

질병 또는 다른 원인으로 인한 면역기능의 저하는 미생물 감염 기회의 증가와 종양세포의 증가를 유도할 수 있어, 면역계의 항상성 유지는 매우 중요하다. 따라서 이러한 면역활성의 유도는 선척적/후천적으로 면역기능이 약한 사람들, 특히 암환자의 암 수술 후 재발 방지 또는 치료에 선택적으로 많은 도움을 줄 수 있을 것이다. 이와 관련하여 여러 연구자들이 면역력을 증가시킬 수 있는 물질을 개발하기 위하여 노력하였고, 특히 인체에 부작용이 적으며 다양한 생리활성 효과를 갖는 한약재에 관심을 갖고 이러한 한약재를 대상으로한 연구들이 이루어지고 있다. 일례로 아타루 쿠로이와 등이 10가지 약용식물로 구성되는 보중익기탕(Hochu-ekki-to, Bu-Zhong-Yi-Qi Tang)의 면역력 증가 효과를 조사하여 보고한 바 있다(선행기술문헌 참조).

이에 본 발명자는 이러한 연구들과 더불어, 그 구성이 보다 간단하면서도 면역력 증가 효과가 우수하여, 면역력이 약한 환자나 노약자를 외부로부터 침입되는 바이러스나 미생물 등의 감염으로부터 보호할 수 있는 약제를 개발하고자 하였으며, 인체에 부작용이 적은 천연물질 중에서도 특히 식물의 추출물을 대상으로 연구하였다.

이의 결과, 한약재로도 사용되는 관중의 추출물이 면역반응에서 매우 중요한 역할을 하는 대식세포를 활성화하고, 일산화질소, 종양괴사인자-알파 및 인터루킨-1 베타의 생성을 유도하며, 이러한 효과가 세균의 침입에 의해서 유도되는 것이 아니라, 관중 추출물 고유의 효과임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

학술지 논문 : International Immunopharmacology 4 (2004) 317 -324. Effect of a traditional Japanese herbal medicine, Hochu-ekki-to(Bu-Zhong-Yi-Qi Tang), on immunity in elderly persons.

본 발명의 주된 목적은 면역력이 약한 환자나 노약자의 면역력을 증가시킬 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 면역력을 증가시킬 수 있는 식품첨가제 및 이 식품첨가제를 포함하는 식품을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역력을 증가시킬 수 있는 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 포함하는 사료를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma, 貫中) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 관중 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 식품첨가제 및 이 식품첨가제를 포함하는 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 관중 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 포함하는 기능성 사료를 제공한다.

본 발명의 관중 추출물은 관중으로부터 용매를 이용하여 관중의 일부 성분을 추출한 것을 의미하며, 관중에 친수성 유기용매를 첨가하고 분쇄 및 여과하여 수득한 여과액에서 용매를 제거하여 제조하는 것이 바람직하다. 친수성 유기용매로는 알코올을 사용하는 것이 바람직하며, 최종 추출물을 인체에 투여하거나 섭취해야 하므로 알코올 중에서도 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 친수성 유기용매 중 인체에 유해할 수 있는 용매를 사용해야 하는 경우에는 추출 후 용매를 완전히 제거할 필요가 있다. 보다 자세하게는 예를 들어 건조 중량 기준으로 관중 100중량부에 친수성 유기용매 200 내지 600중량부를 첨가하고 1 내지 3주간 0 내지 10℃에 보관한 다음 이 상태로 믹서기 등을 이용하여 관중을 분쇄하고, 여과하는 방법으로 제조할 수 있다. 수득한 여과액의 용매를 제거하면 보다 높은 농도의 순수한 관중 추출물을 제조할 수 있다. 용매의 제거는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있으며, 감압 농축 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 상기 관중 추출물은 대식세포의 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 인터루킨-1 베타(interleukin-1 beta, IL-1β) 및 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현을 유도하고, 결과적으로 TNF-α, IL-1β 및 일산화질소의 생성을 유도한다. 즉, 대식세포를 활성화하여 면역력을 증가시킨다. 통상 이러한 효과는 세균이 침입하여 세균으로부터 파생된 물질에 의해 유도되는데 관중 추출물에 따른 위와 같은 효과는 이와는 전혀 다른 별개의 효과이며, 관중 추출물 고유의 효과이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 충분한 약리적 효과를 발휘하기 위해, 사람 또는 가축의 몸무게를 기준으로 ㎏당 하루에 관중 추출물이 50 내지 200㎎으로 투여될 수 있도록 이루어지는 것이 바람직하다. 이는 대식세포를 대상으로 한 약리효과 실험 및 비장세포를 대상으로 한 세포독성 검사를 통해 결정된 함량이며, 보다 바람직하게는 80 내지 120㎎, 더욱 바람직하게는 약 100㎎으로 투여될 수 있도록 이루어지는 것이 좋다.

식품첨가제, 식품, 사료첨가제 및 사료 또한 위와 같은 기준에 따라 관중 추출물이 함유될 수 있도록 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 관중 추출물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다. 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시킬 수 있다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조할 수 있다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 관중 추출물 50 내지 200㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

상기 관중 추출물의 유효량을 기준으로, 본 발명은 관중 추출물 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 포함하는 식품첨가제 및 이 식품첨가제를 포함하는 식품을 제공한다. 이때 식품은 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수일 수 있다. 본 발명의 관중 추출물 또는 담체를 혼합한 조성물을 포함하여 식품첨가제 및 식품을 제조할 때, 식품의 종류, 형태, 원료, 용도, 조리방법 등에 따른 적절한 방법을 선택하여 적용할 수 있으며, 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 이의 구체적인 조리 방법이나 생산 방법의 기재는 생략하기로 한다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 상술한 약제학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있다.

상기 관중 추출물의 유효량을 기준으로, 본 발명은 관중 추출물 그 자체 또는 사료첨가용으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 포함하는 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 포함하는 사료를 제공하는데, 사료를 공급할 대상 가축의 종류, 사료의 형태, 원료, 용도, 제조방법 등에 따라 적절한 방법을 선택하여 적용할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 이의 구체적인 제조 방법이나 생산 방법의 기재는 생략하기로 한다.

본 발명의 약제학적 조성물 또는 기능성 식품을 투여 또는 섭취하면, 대식세포가 활성화되고 대식세포의 일산화질소 생성, 종양괴사인자-알파 생성 및 인터루킨-1 베타의 생성을 유도하여, 특히 면역력이 약한 환자나 노약자의 면역기능을 효과적으로 향상시킬 수 있어, 바이러스, 미생물 등의 감염에 대비할 수 있게 된다.

도 1은 관중 추출물(30, 100㎍/㎖)의 처리 후 대식세포의 일산화질소(Nitric oxide) 생성을 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 2는 폴리믹신 B의 첨가 유무에 따른 관중 추출물과 지질다당류(LPS)의 대식세포 일산화질소(Nitric oxide)의 생성 유도 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비장세포를 대상으로한 관중 추출물의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 관중 추출물의 처리에 따른 대식세포의 TNF-alpha, IL-1beta 및 iNOS의 mRNA 발현 양상을 나타낸 그래프이다.
도 5는 관중 추출물과 리포테익코익(LTA)에 의한 대식세포의 일산화질소(Nitric oxide) 생성효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 관중 추출물과 리포테익코익(LTA)에 의한 대식세포의 일산화질소(Nitric oxide) 생성에 있어서 소태아혈청(FBS)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 관중 추출물과 리포테익코익(LTA)의 처리에 따른 대식세포의 TNF-alpha, IL-1beta 및 iNOS의 mRNA 발현 양상을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 관중 추출물의 제조

약재상에서 판매하는 건조 상태의 관중(貫中)을 1차 및 3차 증류수로 각각 2 ~ 3회 씻어서 준비하였다. 준비된 관중 500g에 에탄올 2ℓ를 첨가하고 2주간 4℃에서 보관한 다음 교반기로 분쇄하였다. 분쇄물을 여과지로 1차 여과한 다음 0.4㎛ 필터로 2차 여과하여 여과액을 수득하였다. 회전 감압 농축기를 이용하여 수득한 여과액에서 용매를 완전히 제거하여 최종 관중 추출물을 제조하였다.

실험예 1. 관중 추출물의 면역 증강 효과

1-1. 대식세포의 배양 및 처리

본 실험에 사용된 세포주는 RAW264.7(murine macrophage cell line)로 ATCC로부터 분양받아 액체 질소에 보관하면서 사용하였다. 이 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovin serum, FBS), L-글루타민(glutamin) 292㎍/㎖, 페니실린-스트렙토마이신(100units/㎖ penicillin, 100㎍/㎖ streptomycin)이 함유된 완전 DMEM 배지(complete DMEM medium)에서 배양하였으며, 세포의 관찰은 위상차 현미경을 통해 이루어졌다.

1-2. 일산화질소(nitric oxide) 분석에 의한 관중 추출물의 대식세포 활성효과의 검증

일산화질소는 대식세포의 활성에 의해서 분비되는 대표적인 물질중에 하나로, 세균, 진균, 원생동물, 암(tumour) 등에 대하여 독성을 나타낸다. 따라서, 관중 추출물 처리 시 대식세포로부터 생성되는 일산화질소를 측정함으로써 대식세포의 활성화 정도를 조사하였다.

1-2-1. 일산화질소 분석 방법

활성화된 대식세포로부터 생성된 일산화질소(nitric oxide)는 산소와 빠르게 반응하여 아질산염(nitrite)으로 전환된다. 따라서, 일산화질소의 분석을 위해 활성화된 대식세포 배양액의 상층액으로부터 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하여 아질산염을 측정하였다. 아질산염 측정을 위해 그리스 시약(1% sulphanilamide, 0.1% N-1-napthyletylenediamine dihydrochloride, 5% phosphoric acid)(Sigma, St Louis, MO, USA) 100㎕와 배양 상층액 100㎕를 혼합하여 반응시켰으며, 10분 동안 항온에서 정치한 후 540nm 마이크로 플레이트 리더(Bio-Tek Instrument Inc, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 아질산염 농도는 아질산나트륨(Sigma, St Louis, MO, USA)의 표준곡선과 비교하여 결정하였다. 각 실험은 3번 반복하였다.

1-2-2. 일산화질소 분석을 통한 관중 추출물의 대식세포 활성효과

상기 실시예 1의 관중 추출물을 DMSO(최종농도 0.05%)를 포함하는 PBS에 녹이고, 이를 배양액에 첨가하여 배양액 중 관중 추출물의 최종 농도가 각각 30㎍/㎖ 및 100㎍/㎖가 되도록 준비한 다음, 각 배양액에서 대식세포(1×10⁶ cell/well, 24 well plate)를 배양하면서 4, 8, 12, 24시간 별로 상기 1-2-1의 방법을 이용하여 일산화질소를 분석하였다.

이의 결과, 도 1과 같이 관중 추출물에 의해 시간 의존적으로 대식세포의 일산화질소 생성이 증가하였다. 8시간부터 일산화질소가 생성되어 24시간까지 지속적으로 증가하였는데, 이러한 결과는 병원체의 인체 내 침범 시 관중 추출물이 빠르게 초기 면역반응을 유도하여 병원체에 대한 방어를 할 수 있음을 보여주고 있다.

1-3. 일산화질소 생성에 있어서 관중 추출물과 그람음성세균 세포벽 물질인 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)의 효과 차별성 비교

내재면역세포는 그람음성 세균 세포벽물질(LPS)을 비특이적으로 인식하여 면역 활성이 유도된다. 병원체들은 이러한 세포벽 물질을 공통적으로 함유하고 있어, 이들에 감염되면 신체 면역세포들의 인식 및 제거반응이 이루어지고, 이를 통하여 신체가 보호된다. 이렇게 LPS는 세균으로부터의 성분이라는 근본적인 물질의 특성상 면역세포의 연쇄반응 및 과잉반응을 유도할 수 있기 때문에 매우 제한적 범위에서 낮은 농도로 이용될 수 있다. 그렇지만, 천연물이나 생약으로부터 추출한 물질은 상대적으로 안전성을 확보하기가 용이하여 면역활성제로 사용하기에 더욱 적합하다.

이에 따라, 본 발명의 관중 추출물과 LPS에 의한 대식세포의 일산화질소 생성능을 비교하기 위해, 최종농도 0.05%의 DMSO를 포함하는 PBS에 상기 실시예 1의 관중 추출물을 녹이고 이를 배양액에 첨가하여 배양액 중 관중 추출물의 최종 농도가 각각 10㎍/㎖, 30㎍/㎖, 100㎍/㎖인 배양액과 LPS가 100ng/㎖의 농도로 포함된 배양액을 준비한 다음, 이 배양액에서 대식세포(1×10⁶ cell/well, 24 well plate)를 24시간 배양한 다음 일산화질소를 분석하였다.

본 실험에서는 관중 추출물에 의한 면역활성을 더욱 확실히 검증하기 위하여, LPS의 억제물질인 폴리믹신(polymyxin) B를 처리하고 미처리 군과 비교함으로써 추출물에 함유될 수 있는 LPS의 효과를 제거하였다.

이의 결과, 도 2와 같이 관중 추출물 30㎍/㎖, 100㎍/㎖은 일산화질소 생성에 효과적이였으며, 폴리믹신 B 처리 시에도 일산화질소의 생성은 억제되지 않았다. 반면, 관중 추출물에 대한 양성대조군인 LPS를 처리한 군에서는 폴리믹신 B를 처리하지 않은 경우 일산화질소를 효과적으로 분비시켰지만, 여기에 폴리믹신 B를 첨가하면 그 효능이 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 관중 추출물과 LPS가 작용하는 메커니즘이 다르다는 것을 나타내고 또한 이와 같은 관중 추출물의 효과는 LPS가 혼합되어 나타나는 효과가 아니라는 것을 보여준다. 즉, 생약인 관중 추출물 고유의 성분이 대식세포의 활성화를 유도하여 면역활성 효과가 있음을 나타낸다.

1-4. 세포독성검사

1-4-1. 비장세포를 이용한 세포독성 분석

관중 추출물의 인체 내 세포독성검사를 위해 마우스로부터 적출한 비장세포를 이용하였다. 세포독성검사는 세포 카운팅 키트(cell counting kit, CCK-8)(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 이용하여 제조사의 지시에 따라서 수행하였다. 간략히 설명하면, 키트에 포함된 WST-8은 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해서 환원되어 오렌지 색깔을 띄는 포마잔(formazan)을 형성한다. 포마잔의 양은 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례한다.

8주령의 C57BL/6 암컷 마우스로부터 분리한 비장세포를 10% FBS를 함유한 RPMI-1640 배지에 2×10⁴ cell/well의 농도로 준비하고, 96 웰 U-자형 바닥 플레이트(96 well U-bottom plate)에 분주한 다음, 상기 실시예 1의 관중 추출물을 첨가하여 배양액 중 관중 추출물의 최종 농도가 100㎍/㎖이 되도록 하였다. 2일간 배양 후 관중 추출물을 첨가군과 미첨가군에 각각 CCK-8을 넣고 3시간 추가 배양하였다. 이후 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

이의 결과, 관중 추출물 100㎍/㎖를 투여하였을 때 대조군과 비교하여 세포독성은 나타나지 않았다(도 3 참조).

1-5. 대식세포 활성 표지(marker) 싸이토카인의 RNA분석

1-5-1. 실시간(Real-time) PCR 분석

1-5-1-1. RNA 분리

관중 추출물로 자극된 대식세포를 차가운 PBS로 3번 씻어낸 후, 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(Qiagen, Hilden, Germany)의 RLT 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 균질화(homogenization)시켰다. 이후 RNA(total RNA)를 제조사의 프로토콜에 따라서 분리하였다.

1-5-1-2. 역전사(Reverse transcription)

추출한 RNA의 순도는 A260/A280 비율 1.8 이상에서 결정하였다. ImProm-Ⅱ(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였고, 이후 70℃에서 15분간 반응시켜 RTase를 변성시킨 후 PCR(중합효소연쇄반응, ploymerase chain reaction)을 실시하였다.

1-5-1-3. 택맨(TaqMan) 탐침을 이용한 PCR

TNF-α(alpha), IL-1β(beta), iNOS의 발현수준을 실시간 PCR(real-time PCR)에 의해서 결정하였다. PCR은 ABI PRISM 7500 서열 탐지 시스템(Sequence Detection System)을 이용하여 수행하였다. 각 반응액의 조성은 주형 cDNA, 택맨 유니버셜 PCR 마스터 믹스(TaqMan Universal PCR Master Mix)(Applied Biosystems, USA), 각 TNF-α, IL-1β, iNOS 유전자에 대한 프라이머(primer) 및 택맨 탐침(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 제조사 프로토콜에 따라서 수행하였다.

반응 조건은 다음과 같이 진행하였다. 샘플은 마우스 GAPDH의 발현을 내부 컨트롤로 이용하여 표준화하였다. 반응은 다음 조건에서 수행되었다.

1) 95℃, 10분

2) 95℃, 15초

3) 60℃, 1분

- 2), 3)단계 40회 반복

1-5-2. 대식세포 활성 표지 싸이토카인의 mRNA 분석

본 발명의 관중 추출물에 의한 대식세포의 싸이토카인 및 iNOS mRNA 발현을 분석하기 위해서 다음과 같이 세포를 배양하였다. 관중 추출물 10㎍/㎖, 30㎍/㎖, 100㎍/㎖와 LPS 100ng/㎖를 대식세포(1×10⁶ cell/well, 24 well plate)에 각각 투여하고 4, 8 시간 배양한 후 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 또한, 관중 추출물에 의한 대식세포의 활성화에 있어서 폴리믹신 B에 의한 영향을 비교하기 위해서 폴리믹신 B의 처리군 또는 미처리군으로 나누어 실험하였다.

TNF-α, IL-1β는 활성화된 대식세포에 의해 분비되는 대표적 싸이토카인이다. 따라서, 관중 추출물의 면역활성 효과를 검증하기 위한 표지로서 사용하였다. 이의 결과, 도 4와 같이 관중 추출물이 대식세포의 TNF-α mRNA의 발현을 시간 의존적으로 증가시켰으며 100㎍/㎖에서 가장 효과적이었고, 폴리믹신 B를 첨가하여도 TNF-α mRNA 발현이 전혀 억제되지 않았다. 그러나, LPS와 함께 폴리믹신 B를 처리한 군에서는 TNF-α mRNA 발현이 폴리믹신 B에 의해서 현저히 억제되어 관중 추출물에 의한 결과와 큰 차별성을 보여주고 있다. 또한, 관중 추출물은 대식세포의 IL-1β mRNA 발현을 시간 의존적으로 증가시켰으며, 100㎍/㎖에서 효과적이었다. 특히, 폴리믹신 B와 함께 관중 추출물을 처리한 경우에는 IL-1β mRNA 발현이 오히려 증가하는 현상을 나타냈다. 이는 LPS와 함께 폴리믹신 B를 처리했을 경우 IL-1β mRNA 발현이 완전히 억제되는 현상과는 반대 양상을 보여줌으로써 대식세포의 활성화에 있어서 관중 추출물은 LPS에 의한 효과와 큰 차별성을 보여주고 있다(도 4 참조).

일산화질소 합성효소인 iNOS의 mRNA 발현에 있어서도 관중 추출물은 큰 효과를 나타내었고 폴리믹신 B 처리 후 4시간이 경과하여도 거의 감소하지 않았다(도 4 참조). 그러나 LPS에 의한 iNOS mRNA 발현에 있어서 폴리믹신 B 처리 후 4시간이 경과하면 완전히 억제되어 두 물질의 작용에 큰 차별성을 보여주고 있다.

결과적으로, 본 실험을 통해 관중 추출물이 대식세포 활성화를 통해 면역활성 및 항균성 작용을 강화할 수 있는 싸이토카인인 TNF-α, IL-1β과 더불어 iNOS의 분비에 효과적임을 규명하였다. 또한, 관중 추출물과 LPS의 작용에 있어서 폴리믹신 B 처리 시 두 물질의 작용에는 큰 차별성을 보여주었다. 이는 관중 추출물과 LPS가 작용하는 메커니즘이 서로 다르다는 것을 나타내며, 더불어 관중 추출물에 의한 면역활성 작용이 LPS가 오염되어 나타나는 효과가 아니라 추출물 고유의 효능이라는 것을 규명하고 있다.

1-6. 일산화질소 생성에 있어서 관중 추출물과 그람양성세균 세포벽물질인 리포테익코산(Lipoteichoic acid) 작용의 차별성 검증

상기 실험을 통해 관중 추출물이 대식세포의 활성화에 효과적이며 이는 그람음성세균 성분인 LPS 오염으로 인한 효과가 아님을 확인하였다. 본 실험에서는 관중 추출물의 효과와 그람양성세균 성분인 리포테익코산(Lipoteichoic acid, LTA) 효과의 차별성을 검증하였다.

본 발명의 관중 추출물과 LTA에 의한 대식세포의 일산화질소 생성능을 비교 확인하기 위해서 상기 실시예 1의 관중 추출물 30㎍/㎖, 100㎍/㎖와 LTA 1㎍/㎖, 3㎍/㎖를 대식세포(1×10⁶ cell/well, 24 well plate)에 각각 투여하고 24시간 배양한 다음 일산화질소를 분석하였다. 또한, 관중 추출물과 LTA를 대식세포에 처리 시 폴리믹신 B에 의한 영향을 알아보기 위해 처리 또는 미처리 군으로 나누어 비교 실험을 하였다.

이의 결과, 도 5에서와 같이 관중 추출물 30㎍/㎖과 100㎍/㎖이 대식세포에 의한 일산화질소 생성에 효과적이었으며, 폴리믹신 B를 처리하여도 앞서 설명한 것과 같이 억제되지 않았다. 그러나, LTA 1㎍/㎖와 3㎍/㎖을 폴리믹신 B와 함께 대식세포에 처리한 경우 LTA를 단독으로 처리한 경우에 비해 일산화질소 생성이 각각 85%, 68% 억제되는 것으로 나타났다. 여기서 대식세포 TLR(Toll like receptor) 4의 억제제인 폴리믹신 B가 TLR 2 에도 억제효과를 나타내었는데, 이것은 두 가지의 TLR이 유사한 신호전달 체계이기 때문에 나타나는 결과로 보여진다. 결과적으로, 본 발명 관중 추출물의 작용 메카니즘은 LPS나 LTA의 메카니즘과는 차별적이라는 것을 보여주고 있다. 이러한 결과들은 관중 추출물의 면역활성이 LPS, LTA가 오염되어 나타나는 현상이 아니라는 것을 명확히 보여주고 있다.

1-7. 관중 추출물과 리포테익코산(Lipoteichoic acid)에 의한 일산화질소 생성에 있어서 소태아혈청이 끼치는 차별성 검증

관중 추출물과 그람양성세균 성분의 면역활성의 차별성을 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)을 통하여 더욱 비교검증하였다. 이러한 실험은 LTA에 의한 대식세포의 활성이 FBS에 의해서 억제된다고 보고한 Mueller(J Biol Chem, 2006)의 보고서를 인용한 것이다.

본 발명의 관중 추출물과 LTA에 의한 대식세포의 일산화질소 생성능에 있어서 FBS의 영향을 비교 확인하기 위하여 관중 추출물 30㎍/㎖, 100㎍/㎖와 LTA 1㎍/㎖, 3㎍/㎖를 대식세포(1×10⁶ cell/well, 24 well plate)에 각각 투여하였다. 이때, 각 실험군들에 FBS 0%, 10%, 20%를 넣어 24시간 배양 후 일산화질소를 분석하였다. 폴리믹신 B는 모든 실험군에 처리되었다.

이의 결과, 도 6에서와 같이 LTA로 처리된 대식세포가 FBS의 함량이 증가할수록 일산화질소 생성 효과가 감소되는 것으로 나타났다. 도 5에서 LTA 1㎍/㎖와 3㎍/㎖를 단독처리 하였을 때 일산화질소 생성에 효과적이었던 것과는 다르게 도 6에서와 같이 10% FBS를 첨가하였을 때 LTA 1㎍/㎖의 효과는 현저히 감소하였으며, 20% FBS를 첨가하였을 때는 LTA 1㎍/㎖과 3㎍/㎖ 모두 대식세포로부터 일산화질소 생성효과가 현저히 감소하였다. 그렇지만, 관중 추출물 30㎍/㎖과 100㎍/㎖을 처리한 경우 10% FBS를 첨가하여도 대식세포로부터 일산화질소 생성이 억제되지 않았다. 20% FBS를 첨가하였을 때 관중 추출물 100㎍/㎖은 FBS를 넣으면 오히려 일산화질소 생성량을 증가시켰다. 이와 같이, FBS를 추가한 상태에서 관중 추출물에 의한 대식세포의 활성은 LTA에 의한 효과와는 큰 차별성을 보여주었다.

결과적으로, 관중 추출물에 의한 대식세포의 활성화는 그람음성 및 그람양성세균 세포벽 성분에 의한 효과를 비교했을 때 큰 차별성을 보여준다. 이러한 결과는 관중 추출물에는 세균 세포벽 성분의 오염으로 나타나는 면역활성 효과가 아닌, 관중 추출물 본래의 효능이 면역활성 효과가 있음을 나타낸다.

1-8. 관중 추출물과 리포테익코산에 의한 싸이토카인 생성효과의 차별성 검증

관중 추출물에 의한 면역활성 효과의 완전한 검증을 위해서 LTA와 관중 추출물의 처리로 활성화된 대식세포로부터 싸이토카인 mRNA 발현을 비교분석 하였다. 본 실험을 위하여 관중 추출물 30㎍/㎖, 100㎍/㎖와 LTA 1㎍/㎖, 3㎍/㎖을 대식세포(1×10⁶ cell/well, 24 well plate)에 각각 투여하고, 4시간 배양한 다음 총 RNA를 분리하였다. 폴리믹신 B는 모든 실험군에 처리되었다.

이의 결과, 도 7과 같이 대식세포로부터의 TNF-α mRNA 발현에 있어서 관중 추출물 100㎍/㎖은 효과적으로 작용하지만, LTA 3㎍/㎖은 상대적으로 매우 낮은 수준으로 작용하여 두 물질 간 면역활성 작용에 큰 차별성을 보여주었다. IL-1β mRNA 발현에 있어서는 관중 추출물 100㎍/㎖과 LTA 3㎍/㎖은 비슷한 발현효과를 나타내었다. 일산화질소 합성 효소인 iNOS mRNA 발현에 있어서 LTA 1㎍/㎖과 3㎍/㎖은 관중 추출물과 비교하여 더 효과적으로 작용하였다. 그러나, 도 4에서 LTA에 의한 대식세포의 일산화질소 생성이 폴리믹신 B에 의해서 억제되어 관중 추출물에 비해서 효능이 작은 것으로 나타난 결과와 비교했을 때 이러한 결과는, LTA가 대식세포로부터 iNOS mRNA 발현단계에서는 효과적이지만 일산화질소 생성단계에서 억제되는 것을 보여준다. 이러한 일산화질소 억제에는 폴리믹신 B, FBS 등이 관여한 것으로 보여진다(도 2 및 6 참조). 관중 추출물은 iNOS mRNA 발현에 있어서 LTA에 비해서 상대적으로 낮은 발현량을 보였지만, 일산화질소 생성에 있어서는 FBS, 폴리믹신 B에 의해서 억제되지 않아 LTA에 비해서 높은 생성량을 보여주는 차별성을 보여주었다.

결론적으로, 관중 추출물은 대식세포의 활성화에 있어서 효과적으로 작용하여 면역활성화를 유도하였다. 이러한 내재면역의 활성화는 인체 내에 침투한 병원균을 초기에 효과적으로 제거하는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한, 내재면역의 활성화는 적응면역의 활성화를 유도하게 되어 세균 및 바이러스 침입에 대한 저항성을 증가시켜 제거할 수 있으며, 면역활성이 필요한 종양(tumour)의 치료에 있어서도 치료제로서 충분한 가치를 지니고 있다. 본 발명에서 사용된 최적의 관중 추출물 농도에서 대식세포의 활성화는 폴리믹신 B에 의해서 억제되지 않았으며, FBS에 의해서도 억제되지 않았다. 이러한 결과는 관중 추출물에 의한 면역활성이 그람음성 및 그람양성세균 세포벽 성분의 오염으로 나타나는 면역활성이 아니라 관중 추출물 본래 고유의 성분이 면역활성 효과를 나타내고 있음을 보여준다. 이러한 생약으로부터의 면역활성 유도제의 발견은 높은 희귀(稀貴)성을 갖고 있으면서 또한 다른 물질에 비해서 안전성을 갖고 있어서 그 발명가치가 높다고 할 수 있다. 또한, 인체 및 동물에 임상적용 이용가능성을 보여주고 있다.

Claims (11)

1. 관중(Dryopteris crassirhizoma) 추출물을 유효성분으로 함유하여 대식세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 관중 추출물은 관중에 친수성 유기용매를 첨가하고 분쇄 및 여과하여 수득한 여과액에서 용매를 제거한 것임을 특징으로 하는 면역 증강용 약제학적 조성물.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 친수성 유기용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약제학적 조성물.
4. 관중 추출물을 유효성분으로 함유하여 대식세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품첨가제.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 관중 추출물은 관중에 친수성 유기용매를 첨가하고 분쇄 및 여과하여 수득한 여과액에서 용매를 제거한 것임을 특징으로 하는 면역 증강용 식품첨가제.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 친수성 유기용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품첨가제.
7. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 식품첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품.
8. 관중 추출물을 유효성분으로 함유하여 대식세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 사료첨가제.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 관중 추출물은 관중에 친수성 유기용매를 첨가하고 분쇄 및 여과하여 수득한 여과액에서 용매를 제거한 것임을 특징으로 하는 면역 증강용 사료첨가제.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 친수성 유기용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 사료첨가제.
11. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 사료첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 사료.
    

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