KR101727731B1

KR101727731B1 - 담죽엽 추출물을 포함하는 항염증과 혈관계 질환 개선 효과 및 고혈압 예방과 치료 개선을 위한 약학 조성물

Info

Publication number: KR101727731B1
Application number: KR1020090063070A
Authority: KR
Inventors: 황성연; 안성훈; 금경수; 이호섭; 강대길; 이성원
Original assignee: 주식회사 케미메디
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2017-04-17
Also published as: KR20110005483A

Abstract

본 발명은 담죽엽 추출물을 포함하는 염증 질환 및 혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 담죽엽 추출물을 포함하여 면역세포에서 iNOS를 억제하여 NO 생성을 저해함으로써 항염 효과를 나타내고, 혈관내피세포에서 eNOS를 증진시켜 NO 생성을 유도함으로써 혈관 이완을 유도하는, 항염증과 혈관계 질환 개선 효과 및 고혈압 예방과 치료 개선을 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

담죽엽, 항염, 혈관 이완, 염증 질환, 혈관계 질환

Description

담죽엽 추출물을 포함하는 항염증과 혈관계 질환 개선 효과 및 고혈압 예방과 치료 개선을 위한 약학 조성물{Pharmaceutical composition for improving anti-inflammatory effect and vascular diseases, and preventing and treating hypertension comprising Lophatherum gracile Brongn extract}

산화질소(nitric oxide, NO)는 신경계의 약리학적 전달자로서 뿐만 아니라, 염증 반응, 면역계 및 세포 독성 이외에도 세포의 분화나 세포내 신호 전달 등의 중요한 조절 물질로 알려져 있다.

산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)는 크게 구성적 산화질소 합 성효소(constitutive nitric oxide synthase, cNOS) 및 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 두 가지로 분류되며, 구성적 산화질소 합성효소의 이성체는 내피세포성 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)와 뉴론성 산화질소 합성효소(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)를 포함한다. 내피세포성 산화질소 합성효소는 혈관내피세포 및 혈소판에 존재하여 혈관을 이완시키고 혈관항상성을 조절하며, 뉴론성 산화질소 합성효소는 중추신경체계와 말초신경체계에서 신경전달물질과 같이 작용하는 산화질소를 생성하고, 유도성 산화질소 합성효소는 대식세포, 간세포, 호중성 백혈구 등의 면역세포에 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, nNOS와 eNOS는 세포내에 항상 존재하지만 iNOS는 인터페론, LPS(lipopolysaccaride) 및 다양한 염증 유도 사이토카인에 노출되는 경우에만 발현되는 것으로 알려져 있다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증 반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암과 같은 질환을 발생시킨다.

염증반응이 일어나면 여러 가지 염증인자들 (pro-inflammatory mediatos)이 만들어지는데, 염증 인자에는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)에 의해 만들어지는 NO와 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해 만들어지는 prostagradnin E₂(PGE₂) 등이 있다. 이러한 염증 인자는 염증반응의 전사인자인 nuclear factor-kB (NF-kB)를 활성화시키며, 그 결과 과량의 NO와 PGE₂를 생성하여 염증을 일으킨다. iNOS의 경우 Interferon-gamma, lipopolysaccharide(LPS), 그리고 여러 가지 염증성 사이토카인의 자극 있을 때 발현된다. PGE₂는 cyclooxygenase(COX)에 의해서 Arachidonic acide로부터 생산된다. COX는 유사형태가 2가지 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, prostagrandin을 생산하여 신장의 혈액 흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다. 반대로 COX-2의 경우는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포 (Macrophage)에서 발현된다. 즉 iNOS와 COX-2의 발현과 NO, PEG₂의 생산은 면역세포의 대표적인 염증 인자이다. 또한 염증 인자로 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)인 tumor necrosis factor-alpha(TNF-), interleukin-1beta(IL-1) 등이 포함된다.

선천 면역은 박테리아나 바이러스 감염, 스트레스에 대해 방어할 수 있도록 다양한 작용기전을 통해 빠르게 활성화 되는 고전적 숙어방어 형태이다. 그러나 지속적으로 과도한 면역반응은 도리어 조직손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 패혈증과 만성염증을 유발하게 된다[Brown 등, 2007]. 염증과정 중 염증유도 사이토카인(pro-inflammatory cytokines), nitric oxide(NO)와 prostaglandin E2(PEG2)가 inducible NO synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해 다량 생성된 다[Posadas 등, 2000].

한편, 심혈관계 질환은 초기 증상이 미약하여 평소의 무관심으로 인해 발병하는 경우가 많다. 심혈관계 질환중 대표적인 질병인 고혈압 (hypertension)의 경우 침묵의 살인자 (silent killer)라 불리는 이유가 여기에 있다. 고혈압은 30세 이상 성인에서 30%이상 (남자 34.4%, 여자 26.5%)으로 유병률이 매우 높은 질환 중 하나이며, 더욱이 나이가 증가함에 따라 이와 비례하여 급격히 증가 (30대 2.3%. 40대 8.7%, 50대 23.2%, 60대 35.6% 70세 이상 42.4%)한다고 보고되어 지고 있다. 고혈압 자체와 관련되는 장기손상에는 심비대, 울혈성심부전, 망막병증, 뇌혈관손상, 그리고/혹은 신부전 등이 있다. 혈압은 심장의 역동적인 수축에 의해서 박출된 혈액이 혈관 내를 흐르면서 혈관 벽에 가하는 압력을 의미하는 혈압의 하강은 허혈성 심장질환과 뇌졸중 증세를 상당히 완화시키며 특히 고지혈증, 당뇨병 등 다른 위험요인이 있을 때는 고혈압을 긴급히 완화 시켜 주어야 한다.

혈관평활근 (vascular smooth muscle)에서 수축과 이완을 조절하는 기전은 매우 다양하다. 이러한 기전 중에서 가장 중요한 기전 중 하나는 혈관 내피세포 유래 이완 인자 (endothelium-derived relaxing factor)로서 본체는 산화질소(NO)이다. 혈관에서의 산화질소는 L-아르기닌(L-arginine)을 기질로 해서 산화질소 합성효소(Nitric oside synthase, NOS)에 의해 혈관 내피세포에서 생성된다.

혈관 내피세포 유래 이완 인자는 내피세포에서 정상 상태에서도 합성 및 분비가 이루어지고 아세틸콜린, 히스타민(histamine), 물질 P(substance P) 및 이소 프로테레놀(isoproterenol) 등의 효능제에 의해서 합성 및 분비가 증가된다. 혈관 내피 세포에서 산화질소의 생성을 증가시켜 혈관을 이완시키는 한약이나 생약 또한 최근에 몇 가지 보고된 바 있는데, 쿠라모키(Kuramochi) 등 (Kuramochi T, et al., Life Sci., 54(26), pp2061-2069, 1994)은 조구등 전탕액이 산화질소 의존적으로 혈관이완 효과를 증가시킨다는 보고를 한 바 있고, 고토(Goto) 등(Goto H, et al., Am. J. Chinese Med., 27(3-4), pp339-345, 1999)은 연속되는 연구 결과에서 조구등 전탕액이 자연발증 고혈압의 혈압을 강하시키고 메탄올 추출물이 산화질소 의존적으로 흉부 대동맥의 혈관을 이완시킨다고 보고하였다. 또한, 단삼의 리토스페르민산 B(lithospermic acid B), 동충하초의 단백질 성분 등도 산화질소 의존적으로 혈관 이완을 증가시키는 것으로 알려졌다. 특히 첸(Chen) 등(Chen ZY, et al., Life Sci., 63(22), pp1983-1991, 1998)은 산사의 에탄올 추출물이 장간막 동맥을 산화질소 의존적으로 이완시킨다고 보고하였고, 김(Kim) 등(Kim, SH., et al., Life Sci., 67, pp121-131, 2000)은 산사로부터 분리한 프로시아니딘 (procyanidins)이 산화질소 의존적으로 혈관을 이완시키고 혈관 cGMP의 생성을 증가시킨다고 보고 하였으며, 강(Kang) 등(Kang, DG., et al., Vascul. Pharmacol., 39(6), pp281-286, 2002) 또한 황련으로부터 분리한 알칼로이드 화합물인 베르베린 (berberine)이 NO/cGMP계 의존적으로 혈관을 이완시킨다고 보고하였고, 또한 겨우살이, 은행잎, 방풍, 당귀, 익모초 등의 한약재 추출물도 혈관 내피세포 의존적 또는 비의존적으로 혈관 이완 효과를 보이고, 이들의 유효 성분으로는 글리코시드 (glycoside), 프로시아니딘 (procyanidine), 플라보노이드 (flavonoid) 및 세스퀴 테르펜 락톤 (sesquiterpene lactone) 화합물들이 밝혀졌다 (Nishida S, et al., Life Sci., 72(23), pp2659-67, 2003; Lee TH, et al., Planta. Med., 68(6), pp492-6, 2002; Yuzurihara M, et al., Eur. J. Pharmacol., 444(3), pp183-9, 2002).

한편, 담죽엽의 성질은 차며[寒] 맛은 달고[甘] 독이 없다. 담을 삭이고 열을 내리며 중풍으로 목이 쉬어 말 못하는 것, 열이 세게 나고 머리가 아픈 것[壯熱頭痛] 등을 낫게 한다. 경계증, 온역(瘟疫)으로 발광하며 안타까워하는 것[狂悶], 기침하면서 기운이 치미는 것, 임신부가 어지럼증이 나서 넘어지는 것, 어린이의 경간(驚癎), 천조풍(天弔風) 등을 낫게 한다.

담죽엽의 잎으로 차를 끓여 마시는 사람은 있지만 이 담죽엽이 갖가지 난치병에 놀랄만큼 효과가 있다는 사실을 아는 사람은 많지 않다. 담죽엽은 인삼을 훨씬 능가한다고 할 만큼 놀라운 약성을 지닌 약초이다. 대나무 중에서 약성이 제일 강하여 담죽엽 한 가지만 써서 당뇨병, 고혈압, 위염, 위궤양, 만성간염, 암 등의 난치병이 완치된 경우가 적지 않다. 담죽엽에는 열을 내리고 독을 풀며, 가래를 없애고 소변을 잘 나오게 하며, 염증을 치료하고 암세포를 억제 하는 등의 효과가 있다. 담죽엽은 암세포를 억제 하면서 정상세포에는 아무런 피해를 주지 않는다. 일본에서 실험한 것에 따르면 담죽엽 추출물은 간 복수, 암세포에 대해 100% 억제 작용이 있고, 동물실험에 암세포를 옮긴 흰쥐한테 담죽엽 추출물을 먹였더니 30일 뒤에 종양세포의 70~90% 가 줄어들었다고 한다.

담죽엽의 성분으로는 줄기, 잎에는 triterpenoid 화합물인 arundoin, cylindrin, taraxerol 및 friedelin이 들어 있다. 이 밖에 지상부에는 phenolrP성분, amono acids, 유기산, 당류도 들어 있다고 한다.

본 발명자들은 다양한 천연물, 특히 한약재를 대상으로 NO 생성과 관련된 항염 및 혈관 이완효과를 연구하던 중, 담죽엽 추출물이 세포의 종류에 따라 NO 생성 정도를 조절하여 탁월한 항염증 효과 및 혈관 이완 효과를 내는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 담죽엽 추출물을 유효 성분으로 포함하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 담죽엽 추출물을 유효 성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 담죽엽 추출물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 이용하여 염증 질환 또는 혈관계 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 담죽엽 추출물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 담죽엽 추출물을 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 담죽엽 추출물을 유효 성분으로 포함하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 이용되는 담죽엽 추출물은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 담죽엽 추출물을 제조하는 방법은 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할수 있다. 구체적으로, 건조, 동결 상태 또는 자연 그대로의 답죽엽을 적절히 세절하여 건조중량의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 10 내지 15배 부피의 정제수(물), 탄소수 1내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 에탄올, 가장 바람직하게는 99% 에탄올을 사용한다. 추출 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 냉침 및 초음파 추출한다. 또한, 상기 추출물을 정제 및 농축하기 위해 여과하여 동결건조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 주요한 유효 성분인 담죽엽 추출물은 iNOS(inducible nitric oxide synthase, 유도성 산화질소 합성효소) 억제 활성을 갖는다. 또한, 상기 담죽엽 추출물은 면역세포에서 NO(nitric oxide) 생성을 억제함으로써, 염증 반응을 저해할 수 있다.

본 발명에서 "iNOS"는 칼모듈린 비의존성 효소로서, 대식세포, 간세포, 호중성 백혈구 등의 면역세포에서 IL-1β(interlukin-1β), IFN-γ(interferon-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등과 같은 사이토카인류(cytokines)와 내독소인 세균성 LPS(lipopolysaccharide) 등의 염증유발인자 등에 의해 유도되어, NO를 생성시킴으로써 다양한 염증 반응을 일으킨다. 본 발명의 담죽엽 추출물을 포함하는 조성물은 이러한 iNOS 억제 활성을 나타내므로, 면역세포에서 NO 생성을 억제하여 염증유발인자에 의한 염증 반응을 저해시킴으로써, 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서, "염증 질환"은 염증 반응에 의해 발생될 수 있는 모든 염증 질환, 특히 NO 매개성 염증 질환을 의미하며, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 자가면역질환, 파킨슨(Parkinson)병, 동맥경화증, 다발성 경화증, 부종, 패혈증, 패혈성 쇼크, 건선, 암, 뇌척수염, 수막염, 췌장염, 복막염, 맥관염, 임파구 맥락수막염, 사구체신염, 포도막염, 회장염, 간염, 신장염 및 염증성 대장질환 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 담죽엽 추출물을 유효 성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에 포함되는 주요한 유효 성분인 담죽엽 추출물은 eNOS(endothelial nitric oxide synthase, 내피세포성 산화질소 합성효소) 증진 활성을 갖는다. 또한, 상기 담죽엽 추출물은 혈관내피세포에서 NO(nitric oxide) 생성을 증진시킴으로써, 혈관 평활근의 이완 작용을 유도할 수 있다. 또한, 이러한 혈관 이완 작용을 통해 혈압을 강하시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 특히, 고혈압의 예방 및 치료용 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명에서 "eNOS"는 칼슘이나 칼모듈린 의존성이고, 혈관내피세포에 존재하며, NO를 생성시킴으로써 혈관 확장 및 혈류량을 조절한다. 본 발명의 담죽엽 추출물을 포함하는 조성물은 이러한 eNOS 증진 활성을 나타내므로, 혈관내피세포에서 NO 생성을 증진시킴으로써, 혈관 평활근을 이완시키고, 이를 통해 혈관을 확장시켜 혈압을 낮출 수 있으므로, 다양한 혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 NO/cGMP 신호전달계를 경유하여 혈관을 이완시킴을 특징으로 한다. 혈관 내피 세포 유래의 NO는 혈관 평활근으로 확산되어 가용성 구아닐산 고리화 효소 (soluble guanylate cyclase)를 활성화하며 cGMP를 증가 시킴으로써 혈관 평활근을 이완시키는데 중요한 역할을 하게 된다.

본 발명에서, "혈관계 질환"은 혈관의 압력 이상에 의해 발생될 수 있는 모든 혈관계 질환을 포함하며, 예를 들면, 고혈압, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환, 대동맥질환, 신장기능장애, 발기부전, 고혈압성 심장질환, 당뇨병, 심부전증 및 시력장애를 포함하며, 바람직하게는 고혈압이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 '예방'이란 담죽엽 추출물 포함하는 조성물을 투여함으로써 염증 질환 및 혈관계 질환의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, '치료'란 상기 조성물을 투여함으로써 염증 질환 및 혈관계 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 담죽엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.

본 발명의 상기 조성물은 본 발명의 담죽엽 추출물을 포함하는 캡슐에 부형제 없이 충전하거나 미립화된 고체 담체, 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조될 수 있으며, 필요한 경우 생성물을 바람직한 제제로 성형하여 사용할 수 있다. 적합한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 링거액 및 덱스트로스 용액 등을 들 수 있으며, 문헌(Remington`s Pharmaceutical Science, 19^thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)등에 개시되어 있는 바에 따라 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제로 제제화할 수 있다.

이때, 본 발명의 담죽엽 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 건조 중량 기준으로 0.0001 ~ 30중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 10중량%의 함량으로 포함되어 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 담죽엽 추출물을 포함하는 조성물을 투여 하는 것을 포함하는, 염증 질환 또는 혈관계 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 경구 투여한다.

본 발명의 치료방법은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 전술한 사항을 고려하여 결정할 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 담죽엽 추출물의 건조 중량 기준으로 0.0001 내지 100mg/kg, 바람직하게는 0.001~10mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 염증 질환 또는 혈관계 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로 사용하거나, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 염증 질환 또는 혈관계 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 이러한 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 담죽엽 추출물을 포함하는 염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 담죽엽 추출물을 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 상기 담죽엽 추출물은 염증 질환 또는 혈관계 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품은 최종 제품의 상품성과 소비자 기호도에 따라 다른 식품소재를 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 답죽엽 추출물의 유효한 첨가량은 사용 목 적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 바람직하게는 총 원료에 대하여 담죽엽 건조 중량을 기준으로 1 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 1~5중량%로 첨가될수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다. 특히, 본 발명의 담죽엽 추출물은 식품학적으로 허용가능한 식품첨가제를 추가로 포함하여 제제화함으로써 제제 형태의 건강기능식품으로 제조할 수 있으며, 제제의 형태로는 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등이 가능하다.

또한, 본 발명의 건강기능식품은 다양한 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부 범위에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 담죽엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역세포에서 iNOS를 억제하여 NO 생성을 저해함으로써 항염 효과를 나타내고, 혈관내피세포에서 eNOS를 증진시켜 NO 생성을 유도함으로써 혈관 이완을 유도하므로, 다양한 염증 질환 또는 혈관계 질환의 예방 및 치료를 위한 약제 및 식품 개발에 유용하게 적용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1. 담죽엽 추출물의 제조

담죽엽을 구입한 다음, 먼저 파쇄기로 거칠게 파쇄한 후 마쇄기를 이용하여 다시 미세하게 분쇄하여 분말화하였다. 분말화된 담죽엽 1.2kg을 99% 에탄올 10L에 시료가 충분히 추출될 수 있도록 침적한 후, 상온에서 10여일 동안 담가두었다. 이때, 초음파분해기(100 W, 40kHz)를 이용하여 시료가 충분히 추출될 수 있도록 하였다.

10여일간 추출된 담죽엽 추출물을 1차적으로 무명 베를 이용하여 잡질과 찌꺼기를 걸러주고, 2차적으로 분리된 맑은 전탕액만을 취하여 Watman NO.3 여과지를 사용하여 진공압을 걸어 여과하였다. 최종적으로 여과된 담죽엽 에탄올 추출물을 감압 농축기를 이용하여 농축시킨 후 -21℃에서 완전히 얼려 약 2내지 3일에 걸쳐 진공상태로 동결건조시켜 알코올을 제거하였다. 동결 건조하여 만들어진 본 발명의 조성물 분말을 잘게 분쇄하여 체에 걸러 분말상태로 만든 후 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

상기 제조방법에 의해 동결건조된 담죽엽 추출물을 38.21g을 수득하였다. 또한, 분말상태의 담죽엽 추출물은 정수된 깨끗한 물에 녹여 실험에 사용하였다.

실시예 2. 항염 효과 확인

2-1. 담죽엽 추출물의 세포 독성 확인

실시예 1에서 제조된 담죽엽 추출물의 마우스 대식세포(Raw 264.7)에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Raw 264.7 세포에 담죽엽 추출물을 다양한 농도로 처리한 후, Raw 264.7 세포생존율을 조사하였다(도 1).

구체적으로, 담죽엽 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 Raw 264.7 세포 3×10⁴ cells/mL를 96 well plate 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 담죽엽 추출물을 다양한 농도 처리하여 18시간 동안 배양한 후, PBS(phosphate buffered saline)에 녹인 5 ㎎/mL의 MTT용액 50 ㎕를 각 well에 넣고 37℃ 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 버리고 DMSO 100㎕ 씩 넣어 formazin을 용해한 후, microplate reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 담죽엽 추출물은 Raw 264.7 세포에 농도 의존적 생존율은 감소하지 않았다, 이와 같은 결과는 담죽엽 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않음을 보여주는 것이다.

2-2. 담죽엽 추출물을 처리한 면역세포의 NO 생성량 확인

염증반응은 외부항원에 의해 활성화된 다양한 면역세포들에 의해 매개되는 복잡한 과정이며, 대식세포는 LPS와 같은 염증 유발물질에 의해 NO, PGs, 염증유도 사이토카인 TNF-, IL-1등의 다양한 염증매개 물질이 유도된다.

본 실험에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포를 LPS에 18시간 노출시키게 되면 NO의 생성 정도를 확인할 수 있는데, 담죽엽 추출물이 이러한 NO의 생성량에 미치는 영향를 알아보기 위하여, RAW 264.7 세포에 담죽엽 추출물 농도별로 처리하고 동시 LPS 1㎍/mL 를 처리하여 18 시간 배양하였다. 배양액 100 ㎕와 같은 양의 Griess Reagent(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid +1% -naphthylamide in H₂O)를 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite(NO₂ ^-)의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.

그 결과, Raw 264.7 세포에 LPS 단독처리시 대조군 5.33 ± 0.21 uM에 비하여 NO 생성량이 10.64 ± 0.53 uM로 유의있게 증가하였으며, 담죽엽 추출물과 함께 처리한 실험군에서는 LPS 단독 처리군에 비하여 담죽엽 추출물 처리시 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소함을 나타내었다.

2-3. 담죽엽 추출물을 처리한 면역세포의 iNOS 발현 수준 측정

NO생성 억제에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 Raw 264.7 세포의 세포질 내 iNOS 단백질의 발현량을 조사하였다(도 3). LPS (1ug/ml) 단독 처리와 LPS와 담죽엽 추출물을 처리한 실험군에서는 iNOS의 발현량이 현저히 감소하여 LPS와 담죽엽 추출물을 동시 처리시 iNOS 단백질량이 감소되는 것을 관찰 할 수 있었다.

실시예 3. 혈관 이완 효과 확인

3-1. 흉부 대동맥의 분리

실시예 1에서 제조된 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과를 측정하기 위해, 몸무게 약 250 내지 300g의 건강한 SD (Sprague-Dawley)계 백서를 경추탈골을 한 후, 흉부대동맥을 분리하였다. 분리된 흉부 대동맥을 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.1 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.5 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃, 10 mM glucose가 들어있는 차가운 크랩스 (Krebs) 용액 (pH 7.4)에 넣고 연결조직과 지방을 제거한 수 약 3 mm 길 이의 절편으로 만들었다.

3-2. 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과 측정

실시예 1에서 제조된 담죽엽 추출물이 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 혈관 이완 효과를 나타내는지를 조사하였다. 특히, 이러한 혈관 이완 효과가 혈과내피세포 의존적인지를 알아보기 위해, 내피세포를 완전히 제거 한 후 비교 실험을 수행하였다(도 4).

흉부 대동맥 절편에 95% O₂-5% CO₂ 기체로 포화시킨 37 ℃ 의 Krebs 용액에서 고정시킨 후 isometric tension을 force-displacement transducer (Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA)가 장착된 생리 기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 먼저 1x 10^-6 M의 phenylephrine으로 수축시키고 10 분후 1 x 10^-6 M의 acetylcholine (ACh)으로 이완 반응을 시켜 혈관 내피 세포의 안전성을 측정한 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다.

여러 가지 약물들에 의한 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과 변화 측정은 먼저 약물을 20 분간 전 처리하고 phenylephrine으로 수축시켰고 이어서 담죽엽 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 수행할 때에는 혈관 내피 세포를 작은 면봉으로 제거한 후 phenylephrine 수축과 ACh 이완 반응으로 혈관 내피 세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.

그 결과, 담죽엽 추출물은 흉부대동맥에서 농도 의존적으로 이완효과를 보이 고 있음을 확인 할 수 있었다. 또한 물리적인 방법으로 내피세포를 제거한 후( (-)endothelium) 담죽엽 추출물의 이완 효과를 알아본 결과 이완이 이루어 지지 않았음을 알 수 있었다. 이는 담죽엽 추출물이 내피세포 의존적으로 이완되어 지고 있다는 것을 알 수 있다.

혈관 평활근에서 수축과 이완을 조절하는 기전은 매우 다양한데 그 중 가장 중요한 것은 혈관 내피 세포 유래 이완인자 (endothelium-derived relaxing factor, EDRF)로 가장 대표적인 물질이 산화 질소 (NO)이다. 혈관에서의 산화질소는 L-아르기닌 (L-arginine)을 기질로 해서 산화질소 합성효소 (Nitric oside synthase, NOS)에 의해 혈관 내피세포에서 생성된다. 이러한 NOS의 이소형태 (isoform)들 중 이와 관련된 것은 혈관 내피 세포에 주로 분포하면서 혈관을 이완시키는데 작용하는 혈관 내피 세포형 산화질소 합성 효소(eNOS)이다. eNOS에 의해 생성된 산화질소 (NO)는 혈관평활근 세포내에서 soluble guanylate cyclase (sGC)를 활성화 하여 cyclic guanosin-3, 5-mono-phosphate (cGMP)의 생성을 증가시켜 신호전달체계를 통해 혈관 평활근을 이완시킨다. 증가된 cGMP는 cGMP dependent prtein kinase를 활성화 시켜 myosin light chain kinase (MLCK)는 불 활성화 시키고, myosin light chain (MLC) phosphatase를 활성화시킨다. 또한, 증가된 cGMP는 평활근 세포내 Ca²⁺을 증가시키는 여러 경로들을 억제하여 세포내 Ca2+ 농도를 낮추어 혈관 평활근을 이완시킨다.

상기한 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과가 산화질소계와 관련이 있는지 알아보기 위하여 비 특이적인 산화질소 억제제인 L-NAME (1×10^-4M)을 처리한 후, 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과를 측정하였다(도 5). 또한, 이러한 담죽엽 추출물에 의한 혈관 이완효과가 cGMP와 관련이 있는지 알아보기 위하여 세포질 sGC 억제제인 ODQ (1×10^-3 M)를 전처리하고 담죽엽 추출물의 혈관 이완효과를 측정하였다(도 5).

그 결과, L-NAME를 전 처리한 혈관에서 담죽엽 추출물의 혈관 이완효과는 현저히 억제되었다. 이러한 결과는, 담죽엽 추출물이 eNOS를 통해 NO 생성을 증가시키며, 증가한 NO는 혈관 평활근으로 확산되어 혈관 평활근을 이완시켰음을 증명하는 것이다. ODQ로 혈관에 전 처리하였을 때 역시, 담죽엽 추출물에 의한 혈관 이완효과는 현저히 억제되었다. 이러한 결과들로 볼때, 담죽엽 추출물에 의한 혈관 이완 효과는 NO/cGMP 신호전달계를 경유하는 것을 확인할 수 있다.

3-3. cGMP (cyclic guanosin-3,5,-monophosphate)의 측정

본 발명에 따른 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 농도에 따른 cGMP 생성량을 알아보았다(도 6). 담죽엽 추출물의 농도는 1×10^-4 g/ml, 3×10^-4 g/ml, 1×10^-3 g/ml를 사용하였다.

또한, 본 발명에 따른 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 NO/cGMP 경로를 통한 cGMP 생성량을 알아보기 위하여 L-NAME (1×10^-4M) 및 ODQ (1×10^-5M)를 전처리 한 후 cGMP 생성량을 알아보았다(도 7).

혈관 조직에서 cGMP를 측정할 수 있는 방법으로는 흉부 대동맥 절편을 95% O₂-5% CO₂ 가스를 공급해 주면서 Krebs 용액에서 30분간 평형을 시킨 후 1 x 10^-4 M 3-isobutyl- 1-methylxanthine (IBMX) 넣어주었다. 1 x 10^-6 M의phenylephrine을 넣어 10 분간 더 평형을 시킨 후 농도별로 하백초 에탄올 추출물 (3 x 10^-5, 1 x 10^-4, 3 x 10^-4 g/ml)과 함께 3분간 반응을 시켰다. 혈관 조직은 바로 액체 질소에 넣어 반응을 정지시킨 후 -76 ℃에 보관한 후 cGMP 농도 측정에 이용하였다. 무게 (wet weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재 하에서 균질화 시킨 후 13,000 g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethylether를 이용하여 4회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP 측정은 방사면역 분석법을 이용하여 분석하였다. 간단히 설명하면, 시료와 표준물질을 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 4.8)에 최종 용적이 100 μl 가 되게 첨가한 후 100 μl 의 희석된 cGMP 항체 (Calbiochem-Novabiochem, Co., San Diego, CA, USA) 와 ¹²⁵I 가 결합된 cGMP (10,000 cpm per 100 μl, specific activity 2200 ci/mM, Dupont-New England Nuclear, Wilmington, DE, USA)를 함께 넣은 후 4℃ 에서 24시간 반응시켰다. 항체와 결합한 ¹²⁵I-cGMP와 비 결합형 ¹²⁵I-cGMP은 charcoal을 이용하여 분리하였으며 -카운터를 이용하여 방사능을 측정하였다.

그 결과, 담죽엽 추출물을 통한 cGMP 생성량의 증가는 농도 의존적으로 나타났으며, L-NAME를 전 처리한 혈관에서 담죽엽 추출물의 cGMP 생성량은 현저히 억제되었다. 이러한 결과는, 담죽엽 추출물이 eNOS를 통해 NO 생성을 증가시키며, 증가한 NO는 혈관 평활근으로 확산되어 cGMP 생성에 관여됨을 증명하는 것이다. 또한, ODQ로 혈관에 전 처리하였을 때, 담죽엽 추출물에 의한 cGMP 생성량은 현저히 억제되었다. 이들은 담죽엽 추출물이 NO/cGMP 신호전달계를 통해, 혈관 이완 작용을 한다는 점을 보여주는 결과이다.

도 1은 본 발명에 따른 마우스 대식세포에서 담죽엽 추출물이 세포독성을 갖는지 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 NO에 대한 담죽엽 추출물의 억제 효과를 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS에 대한 담죽엽 추출물의 억제 효과를 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 이완효과와 혈관 이완효과가 내피세포 의존적인지 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 이완효과가 산화질소계 및 cGMP와의 연관성을 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명에 따른 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 cGMP 생성량을 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 SD계 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물의 cGMP 생성량에 있어 산화질소계 및 sGC와의 연관성을 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims

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담죽엽(Lophatherum gracile Brongn) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물로,

상기 담죽엽 추출물은 혈관 평활근 이완 작용을 유도하고,

상기 혈관계 질환은 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환, 대동맥질환 및 발기부전으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인, 혈관계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 담죽엽 추출물은 eNOS(endothelial nitric oxide synthase) 증진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈관계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 담죽엽 추출물은 혈관내피세포에서 NO(nitric oxide) 생성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 혈관계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
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제5항에 있어서, 상기 담죽엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 용매로 추출된 것임을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 담죽엽 추출물의 함량은 조성물 전체 중량에 대하여 건조 중량 기준으로 0.0001 내지 30중량%인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 담죽엽 추출물의 투여량은 건조 중량 기준으로 1일에 0.0001 내지 100mg/kg인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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담죽엽(Lophatherum gracile Brongn) 추출물을 포함하는 혈관계 질환 개선용 건강기능식품으로,

상기 담죽엽 추출물은 혈관 평활근 이완 작용을 유도하고,

상기 혈관계 질환은 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환, 대동맥질환 및 발기부전으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인, 혈관계 질환 개선용 건강기능식품.