CN1117057C - 环戊烯酮及其生产方法和应用 - Google Patents

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Abstract

此处公开了一种制备由以下化学结构式(1)代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其特征在于加热至少一种选自下列(a)、(b)和(c)的物质：(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物；(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物；和(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。

Description

环戊烯酮及其生产方法和应用
技术领域
本发明涉及具有诸如抗癌作用的生理活性和高度安全性的环戊烯酮，更具体地，涉及所述化合物的生产方法和含有所述化合物作为活性组分的药物。本发明也涉及一系列在食品，饮料等领域有用的发明。
现有技术
已用于临床治疗的药物包括许多试剂如抗癌剂、抗生素物质、免疫强化剂、免疫调节剂等(如烷基化试剂，抗代谢物和植物性生物碱)，但很难说这样一种药物治疗已经完全建立。
在那些试剂中，在来源于天然物质的前列腺素中，具有环戊烯酮环的前列腺素A和J由于它们对DNA合成的抑制，已被报道有用作高度安全抗癌剂的可能性，并且它们的各种衍化物已得到合成(参考日本专利公开昭和62/96438)。
本发明要解决的问题
本发明的一个目的是开发具有诸如抗癌作用的生理作用的高度安全的环戊烯酮化合物，并提供该化合物的生产方法、含有所述化合物作为有效成分的药物和含有所述化合物的食品或饮料。本发明的另一目的是提供所述化合物和与所述化合物相关的其它化合物的使用方法。解决此问题的方法
本发明概括如下。本发明的第一个特征涉及由下面化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的生产方法，此方法的特征在于加热选自下列(a)，(b)和(c)的至少一种物质：
(a)：糖醛酸或糖醛酸衍生物；
(b)：含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物；和
(c)：包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。
Figure C9719782200111
本发明第二个特征涉及4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的生产方法，而此方法的特征在于加热选自下列(a)，(b)和(c)的至少一种物质，并且从上述加热处理的产物中收集由化学结构式[1]代表的4，5-二羟-2-环戊烯-1-酮。
(a)：糖醛酸或糖醛酸衍生物；
(b)：含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物；和
(c)：包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。
本发明第三个特征涉及4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的生产方法，此方法特征在于包括下列步骤：
(A)：加热选自下列(a)，(b)和(c)的物质以产生4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮：
(a)：糖醛酸或糖醛酸衍生物，
(b)：含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物，和
(c)：包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质；
(B)：选择性地，从所得的加热处理产物中收集4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮；并且
(C)：对4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮进行旋光拆开。
本发明第四个特征涉及旋光度为[α]D 20-105°(C＝0.30，乙醇)的(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
本发明第五个特征涉及旋光度为[α]D 20+104°(C＝0.53，乙醇)的(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮。
本发明第六个特征涉及抗癌剂，其特征在于含有由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
本发明第七个特征涉及癌细胞分化诱导剂，其特征在于含有由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
本发明第八个特征涉及细胞程序性死亡诱导剂，其特征在于含有由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
本发明第九个特征涉及抗细菌剂，其特征在于含有由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
本发明第十个特征涉及诱导癌细胞分化的方法，其特征在于使用由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物作为有效成分。
本发明第十一个特征涉及诱导细胞程序性死亡的方法，其特征在于使用由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物作为有效成分。
本发明第十二个特征涉及食品或饮料，其特征在于已将含有由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物包含、稀释和/或加入其中。
本发明第十三个特征涉及包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，其特征在于在包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的所述物质中，具有与糖醛酸、糖醛酸衍生物、由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的中间体或由化学结构式[1]所代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮反应的反应活性的氨基、氨基酸、肽或蛋白质的至少部分反应活性消失和/或至少部分所述的反应物质被去除。
本发明人已发现，由化学结构式[1]所代表的化合物，即4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(下文中称为环戊烯酮)在选自糖醛酸、糖醛酸衍生物、含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物、包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物糖类化合物的物质的至少一种物质的加热处理产物中产生，并且从加热处理产物中分离的所述化合物有各种生理活性，如抗癌作用，细胞程序性死亡诱导作用和抗细菌作用；本发明人也已成功地制备了所述化合物的旋光物，由此本发明得到实施。
附图简述
图1：表示环戊烯酮的质谱。
图2：表示环戊烯酮的1H-NMR谱。
图3：表示从藻酸的加热处理产物制备的环戊烯酮的细胞程序性死亡诱导作用。
图4：表示环戊烯酮的红外吸收光谱。
图5：表示环戊烯酮的紫外吸收光谱。
图6：表示环戊烯酮的作用曲线。
图7：表示葡萄糖醛酸的加热处理产物的气相色谱结果。
图8：表示环戊烯酮的量和保存时间之间的关系。
图9：表示(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的洗脱曲线。
图10：表示(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的洗脱曲线。
图11：表示(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的1H-NMR谱。
图12：表示(+)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的1H-NMR谱。
图13：表示培养基中培养时间和存活细胞数之间的关系。
图14：表示培养细胞中成熟骨髓细胞所占比例与培养时间之间的关系。
图15：表示环戊烯酮的抗癌作用。
本发明优选的实施方案
本发明将在下文中更具体地说明。
在本发明中，就环戊烯酮在其加热处理产物中产生来说，对糖醛酸、糖醛酸衍生物、含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质没有特定的限制。
根据本发明，目前有可能在食品或饮料中包含适量的具生理活性的环戊烯酮和/或其旋光物。作为那些化合物的抗癌作用、抗细菌作用等作用的结果，本发明的食品或饮料作为抗癌和抗细菌食品或作为抗癌和抗细菌饮料是很有用的。
此外，本发明提供含环戊烯酮和/或其旋光物的药物组合物，所述的药物组合物可用作肿瘤的治疗或预防剂，并用作防腐剂、抗细菌洁齿剂、抗细菌美容化妆品、抗细菌洗浴剂等产品中的抗细菌剂。
本发明进一步提供了通过使用环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分诱导癌细胞分化和细胞程序性死亡的方法，并且那些方法在生化研究和药物如癌细胞分化剂和细胞程序性死亡诱导抑制剂的筛选中有用。
用于本发明的环戊烯酮可以通过加热选自(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物；(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物；(c)含有包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的物质制备。相应地，加热通过物理、化学、酶或其它方法从不含(a)、(b)和(c)的物质产生的(a)、(b)或(c)，也可以制备本发明的环戊烯酮。
在本发明中也有可能使用含环戊烯酮的加热处理产物或从上述加热处理产物纯化的环戊烯酮或部分纯化的环戊烯酮。
糖醛酸有时也称为葡萄糖醛酸，是其中醛糖残基上是醛基基团而另一端的伯醇基团氧化成为羧基基团的羟基醛羧酸的总称。糖醛酸在自然界作为动物和植物的各种多糖的组成成分存在。含有糖醛酸的多糖的例子是果胶、果胶酸、藻酸、透明质酸、肝素、硫酸肝素、岩藻聚糖，硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素等，并且已知它们表现各种生理功能。
对本发明所用的糖醛酸没有特定的限制。即糖醛酸的例子是半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸和艾杜糖醛酸，而糖醛酸衍生物的例子是上述物质的内酯、酯、酰胺、盐等，并且本发明的衍生物包括加热时产生环戊烯酮的任何物质。糖醛酸内酯的例子是葡萄糖醛酸-6，3-内酯(下文缩写为葡萄糖醛酸内酯)，甘露糖醛酸-6，3-内酯和艾杜糖醛酸-6，3-内酯。糖醛酸酯的例子是可从糖醛酸制备的甲基、乙基、丙二醇和羟甲基糖醛酸酯。糖醛酸酰胺可以通过糖醛酸的酰胺化制备。糖醛酸盐可以通过常用方法制备。
本说明书对含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物没有特定的限制，可应用的例子是果胶、果胶酸、透明质酸、肝素、硫酸肝素、岩藻聚糖、硫酸软骨素、软骨素和硫酸皮肤素，并包括其分解产物、分解产物的衍生物和分解产物的盐，这些是其经化学、酶或物理处理的产物。
在上述的化学处理中，例如，起始化合物在室温至200℃下处理几秒至几小时，或优选地在50-130℃处理几秒至60分钟。当所述的处理在酸性条件下进行时，糖苷键被水解，以果胶为例，产生含有半乳糖醛酸和/或半乳糖醛酸酯的降解产物。或者例如当于pH6.8，95℃处理几分钟至几十分钟时，发生β-消去产生含有不饱和糖醛酸和/或不饱和糖醛酸酯的糖类化合物，其在235nm周围的吸光度增加。本发明的糖类化合物包括通过含有糖醛酸和/或糖醛酸酯的多糖化合物的β-消去而制备的在非还原末端含有不饱和糖醛酸和/或不饱和糖醛酸酯的糖类化合物。
上述酶处理的例子是一种已知的分解方法，其中通过用于含糖醛酸和/或糖醛酸酯的糖类的水解酶如果胶酶和透明质酸酶来分解含有糖醛酸和/或糖醛酸酯的起始糖类化合物。另一个例子是已知的其中含有糖醛酸和/或糖醛酸酯的糖类通过用于含糖醛酸和/或糖醛酸酯的糖类化合物的裂解酶分解的分解方法。例如以果胶或果胶酸例，分解通过已知的果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、果胶酸酯裂解酶(EC 4.2.2.2)或外聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)进行，产生在非还原末端含有其4-脱氧-L-苏-hex-4-enopyranosyl uronate或甲基酯的糖类化合物。以透明质酸为例，使用透明质酸裂解酶(EC 4.2.2.1)，而以藻酸为例，使用藻酸裂解酶(EC 4.2.2.3)。另外，以藻酸为例，可以得到在非还原末端含有其4-脱氧-L-赤-hex-4-enopyranosyl uronate的糖类化合物。本发明的糖类化合物也包括象这样制备的在非还原末端含有其4-脱氧-L-苏-hex-4-enopyranosyl uronate、4-脱氧-L-赤-hex-4-enopyranosyl uronate或甲基酯的酶分解产物。
上述物理处理的例子是用近红外线、红外线、微波、超声波等处理起始糖类化合物。即例如在适当的不低于室温的温度条件下和适当还原处理例如存在抗坏血酸时，将置于中性(根据pH值)或碱性溶液中的果胶和/或果胶酸用于超声波处理以施加振动能，处理时间不少于1秒，或优选地5秒至1小时。除了超声波以外，用微波、近红外线、红外线等或它们的组合照射也是有效的。
在本发明中，目前对包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质没有特殊的限制，该物质包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物。包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的例子如下，即双子叶植物如苹果、柑桔类水果(例如，柑桔和柠檬)、香蕉、白菜、卷心菜、莴苣、紫苏、南瓜、芹菜、牛蒡、echalote、花茎甘蓝、青椒、菠菜、洋葱、胡萝卜、日本萝卜、茶叶、芝麻、豆角、马铃薯等的果实、蔬菜、叶子、种子等；单子叶植物的谷类如小麦和水稻；海藻类如褐藻(例如，海带和裙带菜海藻)、红藻、绿藻和单细胞绿藻；微生物如担子菌纲(如Lyophyllum ulmarium，荷叶离褶伞，光帽鳞伞，Cortinellus shiitake，Flammulina verutipes，Agaricus ostreatus和Pasalliota campestris)、子囊菌纲(如蛹虫草和其它虫草属种类)、酵母、丝状真菌(例如曲霉属种类)和细菌(例如纳豆芽孢杆菌和乳酸菌)；及动物如脊椎动物和无脊椎动物，包括猪皮、牛皮、鲨鱼软骨，鲸鱼软骨等。在本发明中可以使用来自上述植物、微生物或动物的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。
而且，在本发明中，农产品和水产品或加工食品本身或经干燥/破碎后可用作包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。这些物质是水果的果皮、水果的滤渣(如苹果和柑桔的滤渣)、蔬菜的滤渣、谷类的滤渣(如制备日本米酒、啤酒、威士忌和日本烧酒时得到的滤渣)、豆的滤渣(如日本豆腐渣)和海藻的滤渣，等。
在本发明中所用的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，可直接使用或通过任何传统方法如煮、熬、烤、焙、炒、煎、蒸、炸等进行预处理。
而且，在本发明中，可以对包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质进行上述化学、酶(包括使用微生物发酵)或物理预处理，并且也可以使用经这样处理所得的物质或从上述所得物质制备的纯化物质。
包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质含有与糖醛酸、糖醛酸衍生物、环戊烯酮生产的中间产物反应的物质和与环戊烯酮反应的物质如氨基、氨基酸、肽、和/或蛋白质，并且，优选地可以进行预处理以制备环戊烯酮，由此这样的反应物质的至少部分反应活性消失和/或至少部分上述反应物质得以去除。尽管干燥加热是优选的，但是对所述预处理没有特殊的限制。例如，将水从包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质中去除，然后在60-400℃加热几秒至几天以得到包含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。其中蛋白质等是不溶的、变性的或钝化的情况时，也对制备本发明的环戊烯酮或其旋光物合适。用于干燥加热处理的方法的例子是如日本专利公报特开平02/79965所述的采用热空气焙/烤处理，并且按照所述方法，可以有效地制备大量加热处理的物质，即焙/烤的物质。对于焙/烤的物质没有特殊的限制，并且这样的例子有焙/烤植物、动物和微生物，如焙/烤蔬菜、水果、谷类、蘑菇、海藻、皮质和软骨。另一个例子是通过用蛋白酶处理上述含糖物质接着去除由此分解的蛋白质而制备的组分。其它的例子有通过破碎上述含糖物质接着水洗制备的组分、通过用酸预处理上述含糖物质制备的组分、通过用碱预处理上述含糖物质制备的组分。本发明所定义的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质包括所有预处理的本身适合环戊烯酮的环戊烯酮生产性物质。
生产环戊烯酮的中间产物是指在加热处理糖醛酸、糖醛酸衍生物、含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的过程中产生的物质，并且一旦进一步反应即生成环戊烯酮。生成的环戊烯酮中间产物的例子有糖醛酸的脱羧基产物、糖醛酸的脱水产物和糖醛酸的脱水/脱羧基产物。
多糖，即含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物，可以通过已知的化学、酶或物理方法制备。以果胶为例，可以使用从例如柑桔或苹果皮中提取的高分子多糖。用于工业规模生成果胶的原料是水果，此外也用生产柑桔类水果如柠檬和酸橙的果汁产生的滤渣(主要含内果皮)和生产苹果汁产生的滤渣。这样的滤渣大部分含有不溶的原果胶，并且原果胶在制备果胶的生产过程中可溶化(提取)。可以通过使用酸性温至热水提取，并且当提取的条件如温度，pH和时间根据起始原料的类型适当控制时，有可能以高产率生产具有预定分子量和酯化度的果胶。提取物通过离心或过滤纯化并浓缩，并向其中加入乙醇以沉淀和回收果胶。将回收的沉淀物干燥破碎以制备成干果胶。
果胶的主要结构是部分甲基化的半乳糖醛酸聚合物。羧基基团或是甲酯化的，或以游离酸形式存在，或制成盐如氨盐、钾盐或钠盐。根据甲酯化程度(DM；甲氧基团与总羧基基团之比)，可以将果胶分成具高DM的HM果胶和具低DM的LM果胶[“新食品开发材料手册”，吉积智司等编，光琳出版社出版，114-119页，(1991)]，并且在本发明中，可以使用市售的食品添加剂果胶[天然产品手册，外山章夫编，食品科学出版社出版，第12版，138页，(1993)]，市售的HM果胶和LM果胶等(参考上述的“新食品开发材料手册”)。
通过合成方法合成的糖醛酸、糖醛酸衍生物、低聚糖也可用于本发明。
用于本发明的加热处理物质可以使用选自下列物质的物质来制备：(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物，(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物，和(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。
只要本发明的环戊烯酮可以得到制备，对在本发明中使用的制备加热处理物质的加热处理方法没有特殊限制。例如，将糖醛酸和/或糖醛酸衍生物、含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物、或包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质于60-350℃加热几秒至几天，优选地于80-150℃加热几分钟至几天。以果胶为例，可以通过例如于80-150℃加热几分钟至几天得到含环戊烯酮的加热处理物质。选择性地，当将糖醛酸、糖醛酸内酯或糖醛酸酯在60-150℃加热几分钟至几天时，可得到所需的含环戊烯酮的加热处理物质。这样一种加热处理物质含有反-环戊烯酮和少量顺-环戊烯酮，其中4位和5位的羟基分别是反式和顺式的。如果使从此加热处理物质纯化的环戊烯酮在无水吡啶中与醋酸酐反应，并通过硅胶柱层析分离所得4，5-二乙酰环戊烯酮，然后通过核磁共振法对每一组分进行结构分析，可确定反-环戊烯酮和少量顺-环戊烯酮都存在于这种加热处理的物质中。
对加热处理时的pH值没有特殊限制，但优选在中性至酸性条件下进行。加热处理过程中的pH值可以根据所用原料的种类调整，但通常通过酸性条件下加热促进环戊烯酮的生产。
对加热处理的原料浓度没有特殊的限制，只要浓度处在可以生产出环戊烯酮的浓度范围之内，并且可以通过考虑可操作性、产率等设定浓度。
尽管本发明中的加热处理可以是湿法加热或干法加热，但考虑到本发明环戊烯酮的生产效率，优选湿法加热。以湿法加热为例，可以使用任何湿式加热方法，如用蒸汽加热，高压下用蒸汽加热，高压下加热；而以干法加热为例，可以使用任何干式加热方法，如用干热气体直接加热、由分离的热源间接加热。直接加热的例子有通过气流干式加热、喷雾法干式加热，而间接加热的例子有转鼓干式加热。
使用抗癌作用、抗细菌作用、细胞程序性死亡诱导作用等作为参考，可以收集在本发明中使用的加热处理产物中的环戊烯酮。关于收集方法，任何已知的纯化和分离方法如化学法和物理法均可使用。这样，已知的纯化法如凝胶过滤、利用分子量分级分离膜的分级分离、用溶剂抽提、分馏、采用离子交换树脂或正相或逆相的各种层析法等均可结合使用，由此可收集在加热处理产物中生成的环戊烯酮。
例如，当使用D-葡萄糖醛酸作为糖醛酸时，其1％溶液于121℃加热4个小时，即在加热处理的物质中生成环戊烯酮。用溶剂提取加热处理物质中的环戊烯酮，并将提取物浓缩。然后，浓缩的提取物通过硅胶柱层析法分离，将稀释的环戊烯酮组分浓缩，并用氯仿从浓缩物中提取环戊烯酮，于是加热处理物质中的环戊烯酮得到分离。
选择性地，用离子交换树脂柱优选阳离子树脂柱处理上述加热处理的葡萄糖醛酸，收集未吸附组分，由此环戊烯酮得到纯化。另一种替代方法是用活性炭柱处理上述加热处理的葡萄糖醛酸，除去未吸附的组分，用亲水性有机溶剂如乙醇水溶液(优选40％或浓度更高的乙醇水溶液)洗柱并洗脱，从而得到纯化的环戊烯酮。当这些方法结合起来时可以得到高纯度的环戊烯酮。
当将分离的环戊烯酮进行旋光折分时，可以得到本发明的(-)-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羟基-环戊烯-1-酮。当然，在本发明中，由合成法得到的环戊烯酮也可用于旋光拆分。
旋光物的分离可以通过将外消旋混合物机械分解进行，优选结晶通过结晶作用拆分为非对映体盐类或包接化合物，使用酶或微生物动态拆分、用色谱法拆分等进行。
气相色谱法，液相色谱法，薄层色谱法等，可以在通过色谱法拆分时使用，并且可以使用适合于每种色谱法的手性固定相。
在使用液相色谱的旋光拆分中可以使用手性固定相法、手性洗脱法、非对映体分离等。
胺类、尿素类、配位体交换类固定相、多糖-多糖衍生物固定相、蛋白质固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等可以用作手性固定相。
关于洗脱液，考虑与上述固定相结合，可以适当地使用己烷类、乙醇类、水(缓冲液)类等洗脱液。
用于本发明生产环戊烯酮的方法可以是任何方法。这样，环戊烯酮可以按照本发明公开的方法或化学合成法[碳水化合物研究，247卷，217-222页(1993)；Halvetica Chimica Acta，55卷，2838-2884页(1972)]制备，并且在本发明中可以使用环戊烯酮的反式和顺式化合物。当然，通过化学合成法制备的环戊烯酮的旋光物也包括在本发明的旋光物之内。进一步说，在至少一种选自糖醛酸、糖醛酸衍生物、含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的物质的加热处理产物中产生的环戊烯酮及其纯化产物和旋光物也可以使用。
环戊烯酮及其旋光物表现对癌细胞如人类前骨髓白血病细胞HL-60、人类急性成淋巴细胞白血病细胞MOLT-3、肺癌细胞A-549、SV40转化肺癌细胞WI-38VA13、肝癌细胞HepG2、肠癌细胞HCT116、人肠癌细胞SW480、人类肠癌细胞WiDr、胃癌细胞AGS和骨髓瘤细胞有细胞生长抑制作用和抗肿瘤作用，。这样，环戊烯酮及其旋光物可用作抗癌药剂的有效成分。它们也具有对癌细胞的细胞程序性死亡诱导作用。本发明环戊烯酮及其旋光物的抑制癌细胞生长的作用机理并不限制本发明的范围，并且，例如，对癌细胞的细胞程序性死亡诱导作用包括在本发明的范围之内。
当具有抗癌作用的环戊烯酮和/或其旋光物用作有效成分并通过与已知的药物载体混合制成药物制品时，就有可能制备抗癌剂。一般地，环戊烯酮和/或其旋光物与药学上可接受的液体或固体载体相混合，并且如有必要，可以向其中加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等以使抗癌剂成为固体如片剂、丸粒、稀释粉剂、粉剂、胶囊等，或成液体如溶液、悬浮液、乳化液等。此外，也可以制成干燥制品，在使用前加入适当载体以制成液体。
药物载体可以根据上述给药模式和制备方法来选择。在口服制剂中，可以使用淀粉、乳糖、糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在生产口服药剂时，可以进一步与结合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、调味剂、色素、香味剂等混合。
另一方面，以胃肠外药剂为例，可以采用常规方法来制备，其中将本发明的有效成分环戊烯酮和/或其旋光物溶解或悬浮于稀释剂中，如注射用的蒸馏水、生理盐水溶液、葡萄糖水溶液、注射用菜子油、香油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀释剂中，必要时，可向其中加入杀细菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等。
本发明的抗癌剂可以根据制剂形式通过适当途径来施用。对施用方法没有特殊的限制，可以通过口服、外用和注射来施用。例如，注射用药可以采用静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等，而外用包括栓剂等。
抗癌剂的剂量根据其制品形式、用药方法、使用目的和受治疗的患者的年龄、体重及症状适当决定，并且可以变化，但是，通常制剂中所含环戊烯酮和/或其旋光物的量是每日0.1微克至200毫克/kg(成人)。当然剂量可以根据不同条件来变化，因此，在某些情况下小于上述剂量也是足够的。而在其它情况下，多于上述剂量可能是必须的。本发明的药剂可以直接口服，此外，也可以添加在任何食品和饮料中，这样药剂可以常规服用。
环戊烯酮和/或其旋光物具有抗癌作用，并且，在低浓度时它们表现诱导癌细胞分化的能力，因此，它们/它可以用作癌细胞的分化诱导剂(防癌剂)。含有环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分的癌细胞分化诱导剂可以按照上述制备抗癌剂的方法制备，并通过与用于抗癌剂相同的方法用药。
癌细胞分化诱导剂的剂量根据其制品形式、用药方法、使用目的和受治疗的患者的年龄、体重和症状适当决定，并且可以变化，但是，通常制剂中所含环戊烯酮和/或其旋光物的量是每日0.1微克至200毫克/kg(成人)。当然剂量可以根据不同条件来变化，因此，在某些情况下小于上述药剂量也是足够的。而在其它情况下，多于上述剂量可能是必须的。本发明的药剂可以直接口服，此外，也可以添加在任何食品和饮料中，这样药剂可以常规服用。
本发明的癌细胞分化诱导剂可以在诱导癌细胞分化的方法中使用。这样，当环戊烯酮和/或其旋光物用作有效成分时，就有可能分化癌细胞，并且这样的方法对于阐明癌细胞分化诱导机理，筛选分化诱导剂等有用。
当环戊烯酮和/或其旋光物用作有效成分，并通过与已知药物载体混合制成药物制品时，就有可能制备本发明的抗细菌剂。一般来说，环戊烯酮和/或其旋光物与药学上可接受的液体或固体载体相混合，并且，如有必要，可以向其中加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等以得到固体制品如片剂、丸粒、稀释粉剂、粉剂、胶囊等或液体制剂如溶液、悬浮液、乳化液等。此外，也可以制成干燥制品，在使用前添加合适的载体以制成液体。
药物载体可以根据上述给药模式和制备方法来选择。在口服制剂中，可以使用淀粉、乳糖、糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。在生产口服药剂时，可以进一步与结合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、调味剂、色素、香味剂等混合。
另一方面，以胃肠外药剂为便，可以采用常规方法来制备，其中将本发明的有效成分环戊烯酮和/或其旋光物溶解或悬浮于稀释剂中，如注射用的蒸馏水、生理盐水溶液、葡萄糖水溶液、注射用菜子油、香油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀释剂中，必要时，可向其中加入抗细菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等。
本发明的抗细菌剂可以根据制剂方式通过合适的途径来施用。对施用方法没有特殊的限制，可以通过口服，外用和注射来服用。例如，注射用药可以采用静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等，而外用包括栓剂等。
抗细菌剂的剂量根据其制品形式、用药方法、使用目的和受治疗的患者的年龄、体重和症状适当决定，并且可以变化，但是，通常制剂中所含环戊烯酮和/或其旋光物的量是每日0.1微克至200毫克/kg(成人)。当然剂量可以根据不同条件来变化，因此，在某些情况下小于上述剂量也是足够的。而在其它情况下，多于上述剂量可能是必须的。本发明的药剂可以直接口服，此外，也可以添加在任何食品和饮料中，这样药剂可以常规服用。此外，含有环戊烯酮和/或其旋光物的物质可以用作抗细菌食物和饮料的原料。并且，它可以与乙醛、甘氨酸、乙酸钠、抗坏血酸、甘油脂肪酸酯、盐、乙二胺四乙酸和其它抗生素物质一起使用。
本发明的含有环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分的抗细菌剂可以用作防腐剂以改进食品或饮料的贮藏。此外，将环戊烯酮和/或其旋光物添加到食品或饮料中，由此它们/它可以在制备食品和饮料防腐剂的方法中使用。
添加到食品和饮料中的含有环戊烯酮和/或其旋光物的抗细菌剂的形态可以是液体、膏状、粉状、片状、颗粒状等形态中的任一种。当考虑到方便操作或通过与其它添加剂混合使用时，优选通过干燥使试剂成粉状、片状或颗粒状。关于干燥的方法，可以采用常用的方法，如喷雾干燥、转鼓式干燥、柜式干燥、真空干燥、冷冻干燥等。
加入到食品和饮料中的环戊烯酮和/或其旋光物的量可依据食品和饮料的类型来变化，并且添加的量应与目的一致。
使用本发明抗细菌剂的一种方法是用合理的方法将抗细菌剂添加到食物和饮料中。对添加方法没有特殊的限制，只要环戊烯酮和/或其旋光物以任何方法添加到食品和饮料中。因此，在使用本发明的抗细菌剂时，“添加”定义包含了所有使食品和饮料中含有环戊烯酮和/或其旋光物的方法。虽然常用的方法是在食物和饮料的生产环节中添加，也可使用将食品浸入含环戊烯酮和/或其旋光物的溶液的方法。也可能将添加药物到食物中的方法和将食物浸入溶液中的方法结合使用。适用于浸泡法的食物的例子是即使在水中不会改变形状的食物，如鱼或家畜肉糜[例如，鱼丸(煮沸鱼肉糜)和维也纳香肠]、面条(例如煮沸的面条)和冷冻前的鱼、贝壳、虾的冷冻产品。
当本发明的抗细菌剂用作防腐剂时，食品和饮料的贮藏性可以得到进一步改善。用于冷冻食品和冷冻甜食时，可以抑制冷冻之前加工阶段中所污染微生物的生长，因此，就卫生而言可以得到非常有利的结果。本发明的抗细菌剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，并且对一些抗药性细菌如抗甲氧苯青霉素的金黄葡萄球菌和引起食物中毒的细菌如沙门菌、生成肠毒素的金黄葡萄球菌、呕吐型的蜡状芽孢杆菌，腹泻型蜡状芽孢杆菌和肠出血性大肠杆菌O-157很有效。它对hiochi细菌也很有效。此外，它表现对引起由微生物引起的疾病的微生物如嗜肺性军团杆菌(引起军团病的微生物)、副溶血性弧菌(引起食物中毒的微生物)、幽门螺旋杆菌(引起溃疡的微生物)、空肠弯曲杆菌(引起肠胃炎的微生物)等，包括嗜肺性军团杆菌(ATCC 33153)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、幽门螺旋杆菌(NCTC 11637)、空肠弯曲杆菌(ATCC 29428)等的抗细菌作用。它对诸如酵母、真菌的微生物也有效。含有来自天然食物的环戊烯酮和/或其旋光物的防腐剂作为食物中毒的天然预防剂和消毒剂是特别有效的。同样，可以采用本发明的抗细菌剂进行衣物、床单等的消毒，并且当喷洒本发明的抗细菌剂或当用本发明的抗细菌剂擦拭时，就可能已消毒要消毒的物品(清除和杀死细菌)。例如当将其加入用于办公室空调器的水中时，可以预防军团病。
本发明的抗细菌剂表现针对引起龋齿和牙周疾病的细菌的抗细菌活性，并且可提供含本发明抗细菌剂的口内制剂。口内制剂的剂型可以为已知的任何一种如液体或膏状。口内制剂的例子有洁齿剂。洁齿剂可以是已知的诸如液体、膏状或粉状的形式。对洁齿剂中环戊烯酮和/或其旋光物的量没有特殊限制，并且只要其中包含对引起龋齿和牙周疾病的细菌有效的浓度就足够了。洁齿剂中可以加入已知的添加剂如保湿剂、表面活性剂、结合剂、香味剂、甜味剂等。关于本发明洁齿剂中的有效成分，也可使用含有环戊烯酮的物质，如加热处理的蔬菜、水果等，并且，包含含有环戊烯酮的这样一种加热处理制品的口内制剂如洁齿剂也包括在本发明的范围之内。
采用本发明抗细菌剂可能提供抗细菌的美容化妆品。本发明的美容化妆品例子有含有效量环戊烯酮和/或其旋光物的基本化妆品形式如润肤霜、牛奶洗剂、洗剂、洗脸用品；上妆化妆品如口红和粉底；洗澡皂和香皂。这对头发也有效，并且可以制成护发产品，包括头发化妆用品如护发营养品、发液、发型剂、吹发剂、发乳、发套；洗发用品如洗发香波、冲洗和头发处理剂。通常，化妆品中的用量是每100份化妆品制剂中含约10-3至10份(按重量比，以下以相同意义使用)，或优选地10-2至1份环戊烯酮和/或其旋光物。关于其它成分，已在化妆品中通用的那些成分均可以使用。本发明的美容化妆品对引起特异反应性皮炎的微生物也十分有效，并对改善和防止特异反应性皮炎有显著作用。
采用本发明的抗细菌剂也可能提供洗浴剂。本发明的洗浴剂可以制成含有有效量环戊烯酮和/或其旋光物的粉状、颗粒状、固体和液体等。加入到洗浴剂的混合量通常是每100份洗浴剂中加入约10-100份(按重量比，下面以相同意义使用)或优选地20-90份环戊烯酮和/或其旋光物。200升热水中通常加入约5-25g按此方法制备的洗浴剂。关于洗浴剂的其它成分，那些已在洗浴剂中通用的成分均可以使用。本发明的洗浴剂对引起的特异反应性皮炎的微生物十分有效，并对改善和防止特异反应性皮炎有显著作用。它对根除浴室中产生的微生物十分有效。
由此，本发明提供了可以有效地用于药物、美容化妆品和洗浴剂的抗细菌剂。进一步而言，含有环戊烯酮的食品和饮料对改善和/或防止食物中毒、肠胃炎等十分有效。
本发明的细胞程序性死亡诱导剂含有诱导细胞程序性死亡的环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分。它可以用与上述抗癌剂相同的方法制成药物并按照与抗癌剂相同的用药方法给药。
对细胞程序性死亡诱导剂的剂量没有特殊规定，但应根据剂量形式、用药方法、使用目的和接受诱导剂患者的年龄、体重和情况适当决定。然而，通常制剂中所含环戊烯酮和/或其旋光物的量是每日0.1微克至100毫克/kg(成人)。当然剂量可以根据不同因素来变化，因此，在某些情况下，剂量小于上述剂量可能是足够的，而在其它情况下，剂量大于上述剂量也是必须的。本发明的药剂可以直接口服，此外，也可以添加在任何食品和饮料中每日服用。
认为细胞程序性死亡与细胞致病性死亡的坏死不同，是细胞本身原始整合的基因引起的死亡。其中，编程细胞程序性死亡的基因由某种外部和内部原因激活，从而程序性死亡基因蛋白质根据该基因得到生物合成，然后细胞本身被所产生的程序性死亡蛋白质分解并死亡。
本发明的细胞程序性死亡诱导剂是十分有用的，因为它能够在特定的组织和细胞表达这种细胞程序性死亡，并且能在自然状态下从活体中排除不必要的或致病的细胞。
本发明的细胞程序性死亡诱导剂可以在诱导细胞程序性死亡的方法中使用。其中，当环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分使用时，可以诱导细胞程序性死亡，并且该方法可用于，例如，阐述细胞程序性死亡诱导机理和筛选细胞程序性死亡诱导剂和细胞程序性死亡诱导抑制剂。
对本发明的抗细菌食品或饮料没有特殊限制，其例子有加工的农产品和林产品、加工的牲畜制品、加工的水产品等，如加工的谷类(例如加工的面粉、加工的淀粉、加工的预混合物、面条、通心粉、面包、豆沙、soba(荞麦面条)、fu(面筋面包)、米粉(用米粉制作的中国面条)、腐竹(豆皮棍)和袋装米饼、加工的脂肪/油(例如可塑性脂肪/油、炸油、沙拉油、蛋黄酱和填料)、加工的大豆制品[例如豆腐(大豆凝乳)、豆沙(豆膏)、豆酱(发酵大豆)]、加工的肉制品(如火腿、熏肉、压缩火腿和香肠)、水产品[冻鱼酱、kamaboko(煮熟的鱼酱)、chikuwa(一种鱼糊制品)、hampen(捣碎的鱼肉制成的鱼饼)、satsutma-age(煎鱼丸)、tsumire(煮鱼丸)、suji(煮生鱼糊)、鱼肉火腿、香肠、干燥的东方狐鲣、加工的鱼籽产品、罐装水产品和tsukudani(在酱油中煮制的食品)]、奶制品(例如鲜牛奶、奶油、酸奶、黄油、奶酪、炼乳、奶粉和冰激凌)、加工的蔬菜和水果制品(例如冻、酱、成菜、水果饮料、蔬菜饮料和混合饮料)、糖果[例如巧克力、饼干、小面包、点心、mochigashi(米球饼)和米制薄饼干]、酒精饮料[例如sake(日本米酒)、中国白酒、葡萄酒、威士忌、烧酒(日本烈酒)、伏特加、白兰地、杜松子酒、ram、啤酒、清凉酒精饮料、果酒和烈酒)、享受饮料(例如绿茶、茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料和乳酸饮料)、调味料[例如酱油、精制酱油、醋和mirin(日本甜米酒)]、罐装、瓶装和袋装食品[例如牛肉饭、kamameshi(罐装大米饭)、sekihan(节日红米饭)、咖喱米饭和其它熟食品]、半干或浓缩食品[例如肝酱和其它涂抹食品、soba和udon汤(二者皆为典型日本面条)和浓缩汤]、干燥食品(例如方便面、速食咖喱、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、速食豆酱汤、调制食品、调制饮料和调制汤)、冷冻食品[例如冷冻sukiyaki、chawanmushi(砂锅杂烩)、烤鳗鱼、汉堡包、中国烧麦、饺子、各种排骨和水果鸡尾酒、固体食品和液体食品(例如汤)和调料]。
对生产本发明食品和饮料的方法没有特殊限制，只要最终产品中含有环戊烯酮和/或其旋光物，食品和饮料的烹饪、加工和常用生产的方法都可应用。
烹饪和加工应这样进行以使加热处理产物中含有环戊烯酮和/或其旋光物，其中加热处理产物通过加热选自(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物，(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的物质得到。
因此，可以在烹饪/加工前、中间和以后添加含有环戊烯酮和/或其旋光物的加热处理产物，其中加热处理产物通过加热选自(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物，(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的物质得到，选择性地将烹饪/加工产品或其原料加入到含有环戊烯酮和/或其旋光物的选自(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物，(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化物和(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的物质加热处理产物中，由此在所述加热处理物质中的环戊烯酮和/或其旋光物可以得到稀释。
而且，在食品或饮料的生产中，加热处理可以在任一阶段进行，从而使环戊烯酮和/或其旋光物存在于加热处理物质中，或者是将含有环戊烯酮和/或其旋光物的经加热处理的物质加入进去。也可以将食品、饮料或其原料加入到含有环戊烯酮和/或其旋光物的加热处理物质中，由此所述加热处理物质中的环戊烯酮和/或其旋光物可以得到稀释。添加可以一次完成或分成几次进行。这样，可能容易和方便地生产表现新的生理作用的食品和饮料。同时提及的是，在制备过程中添加(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物，(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质作为组成成分之后含有在制备过程中产生的加热处理物质中的环戊烯酮和/或其旋光物的食物和饮料也包括在本发明之中。采用所述任何步骤，将环戊烯酮和/或其旋光物包含、添加/或稀释于其中的食品或饮料都定义为在本发明的食品或饮料。
对食品中所含的具有生理作用的环戊烯酮和/或其旋光物的含量没有特殊限制，但其含量应根据感官性质和生理活性如抗癌和抗细菌作用适当选择。例如，100份食品中环戊烯酮和/或其旋光物的含量为5×10-6份或更多，根据食品的感官性质和生理作用，优选10-5至5份，更优选10-4至2份。
对饮料中有生理作用的环戊烯酮的含量没有特殊限制，但其含量应根据感官性质和生理活性如抗癌和抗细菌特性适当选择。例如，100份饮料中环戊烯酮的含量为5×10-6份或更多，根据饮料的感官性质和生理作用，优选10-5至5份，更优选10-4至2份。
只要将诸如具有抗癌和抗细菌活性的生理作用的环戊烯酮和/或其旋光物包含、添加和稀释于其中，对本发明的食品或饮料的形状没有特殊限制。因此其形状包括口服药片、颗粒、胶囊、胶体和溶胶。
如上所述，可以以低成本生产用于本发明的环戊烯酮和/或其旋光物，并且因为其各种生理功能，它们/它可以用作食品或饮料的添加剂，因此现已可能容易地带给食品和饮料各种生理功能、抗细菌活性、细胞程序性死亡诱导作用、抗癌作用等。因此作为食品或饮料的添加剂，本发明的环戊烯酮和/或其旋光物是十分有用的。
可以采用任何方法来制备用于本发明的环戊烯酮和/或其旋光物。因此，它/它们可以通过本发明公开的方法或化学合成法来制备。因此，所有含有环戊烯酮和/或其旋光物的食品、饮料、抗细菌剂、抗癌剂、癌细胞分化诱导剂、细胞程序性死亡诱导剂均包括在本发明之内。进一步而言，所有采用环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分诱导癌细胞分化和诱导细胞程序性死亡的方法也包括在本发明之内。
环戊烯酮和/或其旋光物对于口服100mg/kg的小鼠未表现毒性。
如以上充分说明的，环戊烯酮和/或其旋光物可以容易地以低成本制备，由于其各种生理功能，它/它们是包括医药和食品的广泛领域中十分有用的化合物。
实施例
本发明将通过以下实施例进一步说明，然而本发明的范围不受此限制。而且除非另有说明，实施例中所用的术语％和“份”是指按重量比。
实施例1
(1)将市售的由苹果制成的果胶溶于水以使其浓度为1％，将溶液置于带有回流冷凝器的茄型烧瓶中，在温度维持在110-120℃的油浴中加热18、42和66小时。加热过程中果胶溶液的温度为100-102℃。
将果胶溶液离心以除去沉淀物，并将上清液用水稀释3-10倍以制备样品。然后，用NaOH将加热处理的产物调至pH7.0，并用下述的MTT法测量其对人类前骨髓性白血病细胞(HL-60细胞)(ATCCCCL-240)的细胞增殖抑制作用。
因此，将10μl的稀释样品和100μl含有5000个HL-60细胞的PRMI 1640培养基在含10％胎牛血清(Gibco制备，已于56℃处理30分钟)的PRMI 1640培养基(Nissui制备)中于37℃培养，将其加入到96孔微量滴定板的孔中，在5％二氧化碳条件下，于37℃培养48小时，加入10μl含有5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MMT；Sigma制备)的磷酸缓冲盐水，再将混合物培养基4小时并在显微镜下观察细胞生长状态。同时加入100μl含0.04NHCl的2-丙醇，充分搅拌混合物，于590nm测定吸光度并用作细胞增殖的度量。
结果是，加热18个小时的3倍稀释的果胶溶液组分和加热42和66个小时的3倍和10倍稀释的果胶溶液组分中未见到存活细胞，以同样的稀释浓度，于100℃加热的果胶表现对细胞生长的抑制活性。
另一方面，加热18小时的10倍稀释的果胶溶液组分中几乎所有细胞都是存活的，而与用作对照的加水组分相比，于590nm处的吸光度低。
(2)将甲醇(200μl)加入到200μl于100℃加热18-66小时的果胶中并混合，混合物离心，并将200μl上清液在真空中浓缩至干燥。然后将其溶解在10μl 50％甲醇水溶液中，从其中取1μl样品点在硅胶60板F254(Merck制备)上，用显影液(乙酸丁酯、乙酸和蒸馏水的3∶1∶1混合物的上层液体)显影。显影后将薄层硅胶干燥，喷上AgNO3-NH3溶液(0.1M AgNO3和5N NH3的等体积混合物)并加热以检测斑点。结果如下：在加热18小时的果胶中出现接近于Rf＝约0.3的点，与加热18小时的果胶比较，加热42小时的果胶中斑点有所增长，加热66小时的果胶与加热42小时的果胶中的斑点几乎相同。
(3)将甲醇(1ml)加到实施例1(1)所述的于100℃加热66小时的1ml果胶中，随后进行混合，离心得到上清液。将混合物在真空中浓缩至干燥，然后将剩余物悬浮于100μl甲醇中。将悬浮物离心以除去不溶物质，将上清液点到硅胶板60F254(Merck制备)上，并采用实施例1(2)所述溶剂进行显影。切下部分薄层并用实施例1(2)的方法显色以确认斑点出现在Rf＝约0.3的周围，将对应于这一Rf值的硅胶从无色的薄层上刮下。
刮下的硅胶用甲醇抽提三次，每次使用1ml，然后将抽提液在真空中浓缩至干燥以分离Rf＝约0.3的斑点。将这一干燥物质溶解在250μl水中，将此溶液进一步稀释10倍，取10μl稀释溶液用作样品按照实施例1(1)所述的MTT法测定对HL-60细胞的细胞生长抑制活性。
结果是，在加入水的加样孔中大多数细胞生长，而在加入稀释溶液的加样孔中未见到存活细胞。由此刮下的组分对癌细胞生长的抑制作用得到确认。
(4)采用DX302质谱仪(日本电子公司生产)，对实施例1(3)在接近Rf＝约0.3处分离的癌细胞生长抑制物质进行质谱分析。此外，使用重三氯甲烷作为溶剂，用核磁共振法(NMR)进行结构分析。所用NMR仪为JNM-A500(日本电子公司生产)。结果如下。
FAB-MS m/z 115[M+H]+
采用甘油作为基质。
1H-NMR(CDCl3)：δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)，4.83(1H，m，4-H)，6.30(1H，dd，J-1.2，6.1Hz，2-H)，7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)。
同时，1H-NMR的化学位移值按照CHCI3的化学位移值为7.26ppm的方式给出。
这些数值与T.Ahmad等在碳水化合物研究，247卷，217-222页(1993)中报道的反-4，5-二羟基-2-环戊烯酮-1-酮的数据相符。
图1表示质谱，其中纵坐标为相对强度(％)，横坐标为m/z值。
图2表示1H-NMR质谱，其中纵坐标为信号强度，而横坐标为化学位移值(ppm)。
实施例2
(1)将25g藻酸(非膨胀型；Wako Pure Chemicals制备)悬浮在475ml水中，于121℃加热2小时并离心，使所得上清液通过0.22微米滤膜过滤，将滤液在真空中浓缩直至变为20ml。将浓缩液与180ml甲醇混合，于20℃放置一小时，然后离心得到上清液。使上清液在真空中浓缩至20ml，加入180ml乙腈，将混合物离心，使得到的上清液在真空中浓缩到20ml，在加入180ml乙腈后将浓缩液再次离心，并使得到的上清液在真空中浓缩到15ml。将4ml浓缩液在真空中浓缩到约400μl，然后与等体积的乙酸丁酯、乙酸和蒸馏水的3∶1∶1混合物的上层液体搅拌混合，并收集离心得到的上清液。重复这一操作得到8ml提取液。
将4ml提取液上样到硅胶(BW-300SP；2×28cm；Fuji Siliycia制备)上以进行柱层析，采用乙酸丁酯、乙酸和蒸馏水的3∶1∶1混合物的上层液体作洗出液，以约5ml/分钟的流速和由压缩机提供的0.18kg/cm2压力进行分离。采用分级分离法使每个级分的体积为6-7ml，对每个级分的一部分通过薄层色谱进行分析，由此在第31至35个级分中含有高纯度的环戊烯酮，可得到35mg环戊烯酮。
通过使用PALPACK型S柱的正相HPLC法分离组分，通过215nm的紫外吸收进行检测，发现纯度达到95.8％。
(2)使用实施例2-(1)中制备的环戊烯酮来制备浓度为2.86mM，955μM，106μM，35μM，12μM和0.18μM的环戊烯酮水溶液，用NaOH将所述加热处理物质的pH值调节至7.0，然后如下测定对HL60细胞的细胞程序性死亡诱导活性。
将于37℃，在含10％胎牛血清(于56℃处理30分钟)的PRMI 1640培养基中培养的HL-60细胞悬浮在含10％胎牛血清的PRMI 1640培养基中以得到5.8×104细胞/1.35ml的浓度。
将0.15ml上述环戊烯酮溶液加入到1.35ml这种悬浮液中，然后将混合物在37℃，存在5％二氧化碳气体的情况下培养20小时。
作为结果，注意到，在其中的组分(最终浓度为10.6μM)中，培养20小时后存活细胞的数目和细胞的生存力降低；而在其中加了35μM环戊烯酮的组分(最终浓度为3.5μM)中，DNA分子量变小并且细胞形状发生改变(即细胞核凝聚，细胞皱缩和细胞程序性死亡小体生成)，其结果是诱导细胞程序性死亡。
结果在图3中表示。由此图3表明了将不同浓度的环戊烯酮加入HL-60细胞培养物时，培养时间与存活细胞数的关系，这里横坐标是培养时间，纵坐标是培养液中的存活细胞数(×104/1.5ml)。
图3中，空心方块是没有加样品的组分(对照组)；空心菱形为加了2.86mM环戊烯酮的组分；空心圆圈为加了955μM环戊烯酮的组分；空心三角为加了318μM环戊烯酮的组分；黑方块为加了106μM环戊烯酮的组分；黑菱形为加了35μM环戊烯酮的组分；黑圆圈为加了12μM环戊烯酮的组分。
实施例3
(1)将D-葡萄糖醛酸(10g)(G5269，Sigma制备)溶于1升水中，于121℃加热4小时，在真空中浓缩至约10ml。将产物与40ml乙酸丁酯、乙酸和蒸馏水的3∶1∶1混合物的上层液体混合并离心，并将得到的上清液在真空中浓缩至10ml。
将上述提取物加样到硅胶(BW-300SP；2×28cm；由Fuji Silycia制备)上进行柱层析，并用乙酸丁酯、乙酸和蒸馏水的3∶1∶1混合物的上层液体作洗脱液，以约5ml/分钟的流速和由压缩机提供的0.2kg/cm2压力进行分离。采用分级分离法使每个级分的体积为10ml，对每个级分的一部分进行薄层色谱分析，由此在第61至80个级分中含有高纯度环戊烯酮。收集这些组分，在真空中浓缩，用40ml氯仿提取，并将提取液在真空中浓缩，共得到100mg环戊烯酮。
通过使用PALPACK型S柱的正相HPLC法分离组分，用215nm处的紫外吸收进行检测，发现纯度达到98％。
(2)使用DX302质谱仪进行上述环戊烯酮的质谱分析。此外，还使用重三氯甲烷作为溶剂借助核磁共振法(NMR)进行结构分析。所用NMR仪为JNM-A500。使用DIP-370旋光计(日本Bunko生产)测定比旋度；采用UV-2500分光光度计(Shimadzu生产)测定紫外吸收光谱；采用FTIR-8000红外分光光度计(Shimadzu生产)测定红外吸收光谱(IR)。质谱与NMR的分析结果与实施例1-(4)相同。其它结果如下：
旋光度：[α]D 200°(c＝1.3，水)
IR(KBr法)：在3400，1715，1630，1115，1060，1025cm-1观察到吸收。
UV：λmax215nm(水)
图4表示IR谱，其中横坐标为波数(cm-1)，而纵坐标为透射率。
图5表示紫外吸收光谱，其中横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度。
实施例4
将1％D-葡萄糖醛酸水溶液(G5269，Sigma制备)于121℃加热4小时并用1N NaOH将pH值调节至7。将样品(5ml)加样到用水平衡的HiTrap Q柱(5ml，Pharmacia制备)上，并用25ml水洗柱。从柱中最先洗脱的组分(5ml)称为P0组分；第二组分(5ml)称为P1组分；第三组分(10ml)称为P2组分；最后组分称为P3组分。此后，用25ml0.5M醋酸洗脱柱。从柱子中最先洗脱的组分(5ml)称为E0组分；第二组分(5ml)称为E1组分；第三组分(5ml)称为E2份；最后组分(10ml)称为E3组分。
采用薄层色谱对每个级分进行分析，发现环戊烯酮包含在P1组分中，从此组分中定量回收环戊烯酮。在P1组分中既没有未反应的葡萄糖醛酸，也没有在用HiTrap Q柱纯化之前包含的反应物1，2-二羟基-3-酮环戊烯。
实施例5
(1)将实施例3-(1)中所述的环戊烯酮样品溶于水使其浓度为0.67mg/ml。同时将n-二十八碳烷(Nacalai Tesque公司制备)溶解在n-己烷(Nacalai Tesque公司制备)中，使其浓度为1mg/ml。向5个试管中的每一个加入100μl(100μg)n-二十八碳烷溶液，而对于环戊烯酮水溶液，加入15μl(10μg)，45μl(30μg)，90μl(60μg)，135μl(90μg)和180μl(120μg)。将试管在真空中干燥，向每支试管加入100μl三甲基甲硅烷基化溶液[N，O-双-三甲基甲硅烷-乙酰胺(Nacalai Tesque公司制备)、三甲基氯硅烷(G.L.Science公司制备)和吡啶(Pierce公司制备)的4∶1∶1混合溶液]以使内容物完全溶解。
将2％OV17 Uniport HP60/80筛网(G.L.Science公司制备)填充到直径3.2mm、长2.1m的玻璃柱(岛津公司生产)内，并用GC-7AG气相色谱仪(岛津公司生产)，以20ml/分钟的流速将其在载体气体(N2)中焦化15小时。
将每一种上述三甲基甲硅烷基化样品应用于此气相色谱系统。分析条件如下。
载体气体：N2
流速：50ml/分钟
入口处温度：280℃
起始温度：80℃，4分钟.
温度：8℃/分钟.
最终温度：270℃
检测：用氢气火焰离子化检测器(hydrogen flame ionizationdetector)
结果是，在保留时间约为9.7分钟处检测到环戊烯酮的单峰，而在保留时间约为26.7分钟时检测到n-二十八碳烷的单峰。以下给出了在那时的峰面积。
 环戊烯酮用量  环戊烯酮峰面积(a)  n-二十八碳烷峰面积(b)  (a)/(b)的比例
   10μg     19，981     285，798     0.6991
   30μg     90，980     285，398     0.3188
   60μg     174，284     251，439     0.6931
   90μg     272，524     256，356     1.063
   120μg     368，573     255，545     1.442
当用图来表示所得到的环戊烯酮用量与“环戊烯酮峰面积(a)/n-二十八碳烷峰面积(b)之比”的关系时，在图6中表示了这种关系。因此图6表示了环戊烯酮的工作曲线，其中纵坐标为环戊烯酮峰面积(a)与n-二十八碳烷峰面积(b)之比，横坐标为环戊烯酮的μg用量。
由此，如果向其中环戊烯酮的量未知的样品中加入100μg n-二十八碳烷并在真空中干燥，三甲基甲硅烷基化，并按照上述方法用气相色谱进行分析，计算出环戊烯酮峰面积/n-二十八碳烷峰面积之比，那么就可确定环戊烯酮的量。
(2)将制备的浓度为1％(按重量比)的葡萄糖醛酸水溶液(Nacalai Tesque公司制备)在高压灭菌器的压力下于120℃加热4小时。将该溶液(100μl)(相应于1mg葡萄糖醛酸)置于试管中，向其加入100μg n-二十八碳烷，然后将混合物在真空中干燥并使之三甲基甲硅烷基化。采用上述相同方法对其进行气相色谱分析以得到如图7所示的图形。图7表示加热处理的葡萄糖醛酸的气相色谱结果，其中纵坐标为所测强度，横坐标为保留时间(分钟.)。环戊烯酮的单峰[峰(a)]每次都在保留时间约为10.2分钟时检测到，n-二十八碳烷单峰[峰(b)]在保留时间为27.8分钟时检测到。
结果表示如下，并且根据摩尔数，葡萄糖醛酸通过加热处理转化成环戊烯酮的转化率为15％。
环戊烯酮的峰面积(a)为：203，794
n-二十八碳烷的峰面积(b)为：305，444
(a)/(b)：0.6672
环戊烯酮数量(μg)：88.4
实施例6
将市售的葡萄糖醛酸内酯(Merck公司制备；代码100282)溶解在水中使其浓度为1％，121℃加热0.5小时，1小时，2小时，4小时或16小时。按实施例5-(1)中所述的方法将加热处理的溶液三甲基甲硅烷基化，并用于气相色谱分析。
分析结果如下。
   加热时间(小时)     环戊烯酮数量(μg/100μl)     转化率(％，摩尔量)
     0.5        9.28      1.43
     1        21.0      3.26
     2        52.8      8.15
     4        119      18.3
     16        132      20.4
结果是，根据摩尔量，葡萄糖醛酸通过加热处理转化为环戊烯酮的比率是20％。
此外，按照实施例3-(1)所述方法从加热16小时的葡萄糖醛酸溶液可以得到纯的环戊烯酮。
实施例7
将水(100ml)加入到100g市售卷心菜中，然后用搅拌机粉碎。使其与5ml的蛋白酶K(20mg/ml；#9033；TakaraShuzo公司制备)一起于50℃反应一小时，然后过滤并用1.5升水冲洗沉淀。将水(100ml)加入到洗过的沉淀中，将所得的pH值为6.5的悬浮液在121℃加热2小时，然后过滤得到pH4.7的滤液。将滤液在真空中浓缩至14ml，与36ml甲醇混合后，在4000xg下离心10分钟，并将所得的上清液在真空中浓缩得到3.5ml浓缩液。
用实施例5-(1)所述方法测定浓缩液中所含环戊烯酮的量为24.9μg。如果用搅拌机粉碎后不用蛋白酶K处理和用水冲洗除去蛋白质而仅进行加热，不产生环戊烯酮。由这一结果，现在清楚地知道，100g卷心菜用蛋白酶K处理，用水冲洗除去蛋白质，并按上述条件加热时，可以得到0.87mg环戊烯酮。
此后，按实施例3-(1)的方法从浓缩液分离纯化形式的环戊烯酮实施例8
将1.36单位，0.68单位，0.14单位用量的硅胶酶(8.1单位/mg蛋白质，P9932，由Sigma公司生产)加入到8ml 1％果胶水溶液(来自苹果，Wako Pure Chemical公司制备)中，25℃放置过夜。将HCI加入到(1)酶反应产物和(2)离心后酶反应产物的上清液中以将pH值调至3，121℃加热4小时以得到加热处理产物。加热处理产物中所含的环戊烯酮用实施例5-(1)的方法进行三甲基甲硅烷基化并用气相色谱方法测定加热处理产物中环戊烯酮的量。
结果由表1给出。表1
    所加果胶酶的量(单位/80mg果胶)   转化率(重量百分数，％)
    (1)     (2)
        1.36     4.46     4.75
        0.68     4.52     4.62
        0.14     3.39     3.43
        0     2.71     2.73
结果表明，当用果胶酶水解果胶并加热时，环戊烯酮的产量与仅进行加热的的情况相比增加了25-75％。
(2)将1g藻酸(非膨胀型；由Wako Pure Chemical制备)悬浮或溶解在100ml(1)0.1N HCl或(2)0.1M Na2CO3中，95℃加热15小时，通过向(1)中加入Na2CO3粉末或向(2)加入6N HCl将pH值调节至2.7。同时，将1g藻酸悬浮于(3)100ml水中(所得的pH：2.7)或(4)100ml 0.1ml Na2CO3中，然后用6N HCl将其pH值调节至2.7。121℃加热4小时的(1)-(4)[以下称为样品(1)-(4)]中所含的环戊烯酮的量用以下方法来测定。
通过离心除去样品(1)-(4)中所含的不溶物质，取10μl上清液，使用TSK胶G2000 PW柱(7.5mm×30cm；由Tosoh公司生产)通过HPLC凝胶过滤法进行分析。用水作为流动相，流量和柱温分别定在1ml/分钟和40℃，在215nm处检测吸收率。实施例3-(1)中所述的纯环戊烯酮作为标准物而2-环戊烯酮-1-酮(Aldrich制备)用作内部标准物。
由此得到的结果发现样品(1)，(2)，(3)和(4)分别含有414μg/ml，279μg/ml，286μg/ml和296μg/ml环戊烯酮。而且与121℃加热4小时的样品(3)相比，在121℃加热4小时之前已在0.1NHCl中95℃加热15小时的情况可得到1.43倍的环戊烯酮。
按照实施例3-(1)所述的方法，从每一种样品制备纯环戊烯酮。
(3)将120ml水加入50g市售okara(豆腐渣)中，室温振荡，通过离心和过滤除去固体。向50ml滤液加入1N H2SO4以调至pH2，接着于121℃加热4小时得到样品(5)。
将丙酮(300ml)加入到100g豆腐渣中，搅拌过滤后得到55g滤渣。将滤渣(27.5g)用1升水洗后，加水至150ml，并用1N H2SO4将pH调节至2，并于121℃加热混合物4小时得到样品(6)。
将丙酮处理的剩余滤渣(27.5g)悬浮于200ml水中并使其与500μl蛋白酶K(20mg/ml；Takara Shuzo公司制备)一起在50℃反应两小时。反应产物用1升水冲洗后，向其加水至180ml，用1N H2SO4将pH调节至2，121℃加热4小时得到样品(7)。
分别将样品(5)-(7)进行过滤，将滤液在真空中浓缩成10ml，加入4倍体积的丙酮，然后将混合物离心得到上清液。将上清液进一步在真空中浓缩，从样品(5)，(6)和(7)分别得到5.5ml，3.8ml和3.0ml浓缩液。按照实施例(8)-2所述的方法测定浓缩液中所含环戊烯酮的量。
其结果是，由50g豆腐渣起始，分别从样品(5)，(6)和(7)得到0.54mg，2.79mg，和3.98mg环戊烯酮。同时，在样品(5)，(6)和(7)的制备过程中的任何样品在121℃加热4小时之前不含环戊烯酮。因此，用蛋白酶处理清除蛋白质的结果是环戊烯酮的产量增加了大约40％。
按照实施例3-(1)所述的方法，分别从样品(5)-(7)制备纯环戊烯酮。
将50g豆腐渣悬浮在200ml水中，用6N HCl将其pH值调节到1.5，50℃加热3小时。用NaOH将pH调节到5.0，并过滤得到滤液。用6NHCl将滤液pH调节到2.05，121℃加热4小时得到样品(8)。按照实施例8-(2)所述方法测定样品(8)中所含的环戊烯酮的量。
结果是，由50g豆腐渣得到5.0mg环戊烯酮。同时，在121℃加热4小时之前滤液中不含环戊烯酮。
(4)如下所述处理市售的苹果纤维(干粉；Nichiro制备)。
将0.5g苹果纤维悬浮在50ml水中，121℃加热4小时，离心得到37ml上清液，称为样品(9)。
将5g苹果纤维悬浮在50ml水中，121℃加热4小时，离心得到20ml上清液，称为样品(10)。
将5g苹果纤维悬浮在50ml水中，室温振荡2小时，离心并将上清液在121℃加热4小时，离心得到25ml上清液，称为样品(11)。
将在样品(11)制备中室温振荡2小时后离心得到的沉淀悬浮在50ml水中，121℃加热4小时，离心得到31ml上清液，称为样品(12)
按照实施例8-(2)所述方法测定样品(9)-(12)中所含的环戊烯酮量。
结果是，样品(9)，(10)，(11)和(12)分别含有14.8μg/ml，76.3μg/ml，54μg/ml和34.2μg/ml环戊烯酮。在制备样品(9)时121℃加热4小时之前的样品不含环戊烯酮。因此，按照制备样品(9)，(10)，(11)和(12)的方法，从1g苹果纤维可分别得到1.09mg，0.305mg，0.270mg和0.212mg环戊烯酮。
用实施例3-(1)所述的方法分别从样品(9)-(10)制备纯环戊烯酮。
实施例9
将市售的sencha(中度绿茶)、hojicha(焙茶)、乌龙茶或红茶的叶子(2g)用搅拌机与100ml水一起破碎，用1N硫酸将pH调节至3，121℃加热16小时。用实施例8-(2)所述的凝胶过滤HPLC法测定加热处理产品中所含环戊烯酮的量。结果是分别从sencha、hojicha、乌龙茶或红茶得到0.19mM，0.28mM，0.34mM和0.12mM环戊烯酮。在制备阶段将这些物质进行干燥加热处理，并且环戊烯酮得到有效制备。
实施例10
将果胶(Wako Pure Chemicals制备；代码167-00542)，藻酸(非膨胀型；Wako Pure Chemicals制备；代码011-13341)，D-α-半乳糖醛酸(Nacalai Tesque制备；代码165-18)或D-葡萄糖醛酸(Nacalai Tesque制备；代码169-28)溶于蒸馏水中以制备1％溶液。关于果胶，也制备溶于1N乙酸的水溶液。
1％果胶水溶液的pH值为3.4；在乙酸中，1％果胶溶液的pH值为2.6；加热前半乳糖醛酸水溶液的pH值为2.5；加热前葡萄糖醛酸水溶液的pH值为2.4；加热前藻酸水溶液的pH值为3.3。
将那些1％溶液在121℃加热2，4小时或16小时。用NaOH将每一种加热处理溶液的pH调节至7，并且用0.22μm滤器灭菌，以制备用来测定环戊烯酮生成数量的样品。
将环戊烯酮点在硅胶板60F254(Merck制备)上，并用显色液(乙酸丁酯，乙酸和蒸馏水的3∶1∶1混合物的上层)显色，显色完成后干燥硅凝胶薄层，喷上AgNO3-NH3溶液(等量0.1M AgNO3和5N NH3的混合物)并加热，由此检测到环戊烯酮在Rf＝0.3周围的一点。
将上述准备好的“用来测定环戊烯酮生成数量的样品”稀释2-，5-，10-，20-，50-，和100-倍，并且将所得稀释溶液按照上述方法进行TLC。同时，来自1％果胶水溶液加热处理2小时的产物的2倍稀释液的环戊烯酮的量定义为一个单位，并测定每一种加热处理产物中形成的环戊烯酮量。结果在表2中表示。
在每一种样品中，环戊烯酮的产量随着加热时间的增加而增加，在半乳糖醛酸水溶液加热处理30分钟和1小时后的产物中，分别得到1个单位和5个单位的环戊烯酮，而在葡萄糖醛酸水溶液加热处理30分钟和1小时后的产物中，分别得到5个单位和10个单位的环戊烯酮。表2
  要加热的样品   加热时间   加热前pH值   加热后pH值   调节后pH值  生成的环戊烯酮单位
  ％1果胶水溶液     2416     3.43.43.4     3.33.23.5     7.07.27.0       1510
  ％1果胶于乙酸中     2416     2.62.62.6     2.72.62.8     7.07.27.1       1210
  ％1半乳糖醛酸水溶液     2416     2.52.52.5     2.42.42.6     6.96.86.9       102550
  ％1葡萄糖醛酸水溶液     2416     2.42.42.4     2.72.62.8     6.97.07.0       255050
  ％1藻酸水溶液     2416     3.33.33.3     2.52.72.9     6.97.07.3       5510
实施例11
(1)将商业上可获得的葡萄糖醛酸内酯(Merck制备；代码100282)溶于水中以制备1％水溶液，并在121℃加热0.5小时，1小时，2小时，4小时或16小时。加热处理后的溶液按照实施例5-(1)的方法进行三甲基甲硅烷基化，并用气相色谱法测定产生的环戊烯酮量。
结果在表3中给出。表3
  加热时间(小时)    环戊烯酮的量(μg/100μl)     转化率(％)(以摩尔量计算)
    0.5        9.28        1.43
    1        21.0        3.26
    2        52.8        8.15
    4        119        18.3
    16        132        20.4
结果是，当以摩尔量计算时，葡萄糖醛酸内酯通过加热16小时转化为环戊烯酮的比率是约20％。
按照实施例3-(1)中所述的方法，从上述加热葡萄糖醛酸内酯16小时制备的溶液中纯化/分离环戊烯酮。
(2)将上述环戊烯酮溶于水中以制备1％，2％，5％，10％或20％的溶液，然后于121℃加热4小时。此加热处理的溶液按照实施例5-(1)中所述的方法进行三甲基甲硅烷基化，并用气相色谱法测定所得环戊烯酮的量。结果在表4中表示。表4
 葡萄糖醛酸内酯浓度(％)     环戊烯酮的量(μg/100μl)      转化率(％)(以摩尔量计算)
      0.1         15.1         23.2
      1         99.2         15.3
      3         229         11.8
      5         365         11.3
      10         455         7.03
      20         592         4.58
结果是，当使用0.1％葡萄糖醛酸内酯水溶液时，如果以摩尔量计算，葡萄糖醛酸内酯通过加热转化为环戊烯酮的转化率为约23％。
(3)将上述1％葡萄糖醛酸内酯水溶液的pH用HCl或NaOH调节至1，2，3，或4.5，然后于121℃加热4小时。此加热处理的溶液按照实施例5-(1)中所述的方法进行三甲基甲硅烷基化，并用气相色谱法测定所得环戊烯酮的量。结果在表5中表示。表5
    pH     环戊烯酮的量(μg/100μl)      转化率(％)(以摩尔量计算)
    1        7.85         1.25
    2        15.9         2.46
    3        108         16.7
    4.5        125         19.3
结果是，当pH值为4.5时，如果以摩尔量计算，葡萄糖醛酸内酯通过加热转化为环戊烯酮的转化率为约19％。
(4)将1％半乳糖醛酸水溶液的pH用HCl或NaOH调节至1，2，3，4，5，6或7，然后于121℃加热4小时。此加热处理的溶液按照实施例5-(1)中所述的方法进行三甲基甲硅烷基化，并用气相色谱法测定所得环戊烯酮的量。结果在表6中表示。表6
   pH     环戊烯酮的量(μg/100μl)      转化率(％)(以摩尔量计算)
    1         16.6         2.83
    2         66.6         11.3
    3         42.7         7.27
    4         7.36         1.25
    5         5.47         0.931
    6         5.45         0.927
    7         0         0
结果是，当pH值为2时，如果以摩尔量计算，半乳糖醛酸通过加热转化环戊烯酮的转化率为约11％。
(5)将1％藻酸(非膨胀型)水溶液的pH用HCl或NaOH调节至1，2，3，4。另一方面，将藻酸(非膨胀型)溶解在0.1M乙酸盐缓冲液中以制备成1％溶液，然后将pH调节至5；或将其溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，然后将pH调节至6或7。将溶液在121℃加热4小时。在如下条件下，用HPLC法来测定加热溶液中所含环戊烯酮的量。
柱：TSK胶α-2500(7.8×800mm；Tosoh制备)
柱温：40℃
流动相：0.01％三氟乙酸水溶液
流速：1ml/分钟
检测：215nm处吸光度
实施例3-(1)中所制备的纯环戊烯酮可用作标准物，并且测量约10.0分钟时洗脱的环戊烯酮峰面积，由此测定环戊烯酮的浓度。
结果在表7中表示。表7
    pH  加热后pH    环戊烯酮的数量(μg/100μl)   转换比例(％)以摩尔量计算
    1    1.07       0      0
    2    1.98       0.536      0.611
    3    2.76       2.00      2.28
    4    4.01       1.05      1.20
    5    5.02       0.167      0.190
    6    5.95       0      0
    7    6.90       0      0
结果是，当pH值为3时，如果以摩尔量计算，藻酸通过加热转化为环戊烯酮的转化率为约2.3％。实施例12
将Pomosin果胶LM-13CG型(Hercules制备)，藻酸HFD(Dainippon Pharmaceutical制备)，D-葡萄糖醛酸(NacalaiTesque制备)，或葡萄糖醛酸内酯(Merck制备)溶于或悬浮于水中以制备1％水溶液，然后在30℃，60℃，95℃，121℃或132℃加热16小时。此加热处理的溶液按照实施例5-(1)中所述的方法进行三甲基甲硅烷基化，并用气相色谱法测定加热处理物质中生成的环戊烯酮量。结果在表8中表示。表8
    糖醛酸化合物   加热温度(℃)    生成的环戊烯酮量(μg/ml)
    果酸     121132          176128
    藻酸     121132          46675
    葡萄糖醛酸     95121132          302718132
    葡萄糖醛酸内酯     95121132          274781161
实施例13
(1)将硫酸软骨素A(Seikagaku制备)，软骨素(钠盐；Seikagaku制备)，硫酸皮肤素(钠盐；Serbio制备)，肝素(钠盐；Wako Pure Chemical制备)或透明质酸(Seikagaku制备)溶于水以制备1％溶液，然后用1N HCl将pH调节至3。将这些溶液在121℃加热4或16小时以制备加热处理的溶液。
(2)将在实施例13-(1)中制备的硫酸软骨素A，软骨素，硫酸皮肤素或肝素的加热处理溶液(100μl)与n-己烷(Nacalai Tesque制备)中的n-二十八碳烷(Nacalai Tesque制备)溶液(1mg/ml；100μl)混合，然后在真空中干燥。向其中加入100μl上述三甲基甲硅烷基化溶液以完全溶解，并用实施例5-(1)中所述的方法测定加热处理物质中生成的环戊烯酮量。结果在表9中表示。表9
  加热溶液中环戊烯酮的量(μg/100μl)
    加热4小时      加热16小时
 硫酸软骨素A       9.26        15.71
 软骨素       7.47        9.11
 硫酸皮肤素       32.81        47.60
 肝素       5.09        5.12
(3)将透明质酸的加热溶液(100μl)在真空中干燥，悬浮于甲醇中，并且离心除去不溶物质。离心后将上清液(1μl)点在硅胶60F254板(Merck制备)上，并使用乙酸丁酯，乙酸和水的3∶2∶2混合物的上层作为显色液的进行薄层色谱(TLC)。显色后，用硫酸地衣酚法着色，并与标准环戊烯酮的点进行比较。结果是，在透明质酸加热4小时的产物中，可见环戊烯酮的生成，并且在加热16小时的产物中，可见其含量的增长。
实施例14
将硫酸皮肤素溶于100ml水中，用1NHCl调节pH至3，于121℃加热16小时以制备加热处理的溶液。然后按照实施例3-(1)中的方法从加热处理物质纯化环戊烯酮，得到30mg纯环戊烯酮。
实施例15
将实施例3-(1)中所述的纯化/分离环戊烯酮溶于水、10mMtris-HCl(pH7)或10mM tris(pH10)中以形成25mM浓度，室温或4℃下放置，通过实施例13-(3)中所述的TLC进行分析。结果是，当环戊烯酮溶于水或10mM tris-HCl(pH7)中时，置于室温或4℃的两种溶液在一个月后产生一些分解物质，尽管大多数并未分解。在环戊烯酮溶于10mM tris(pH10)的情况下，在室温时可见迅速分解，如果溶解后立即进行TLC分析，没有出现环戊烯酮的斑点。
当溶于水的环戊烯酮于121℃加热30分钟并用TLC进行分析时，可见一些降解产物，尽管大多数环戊烯酮保持未分解。
(2)将1％葡萄糖醛酸水溶液在121℃加热4小时，并且制成不调节pH的样品和另一个用NaOH调节至pH6.6的样品，从两种样中各取1ml分别放在-20℃、4℃或37℃，然后按照实施例5-(1)中所述的方法进行三甲基甲硅烷基化，之后用气相色谱法测定样品中环戊烯酮的量。
放置25天后的结果是，放置于37℃的情况中，环戊烯酮的数量出现一些减少，而放置于4℃和-20℃的情况中，状态几乎稳定。该结果如图8所示。因此，图8是表示保存时间和环戊烯酮的量之间关系的图，其中横坐标为保存时间(天数)，纵坐标为环戊烯酮浓度(mg/ml)。图8中，空心正方形表示未调节pH并放置于-20℃的情况；黑正方形表示pH调节至6.6并放置于-20℃的情况；空心圆形表示未调节并放置于4℃的情况；黑圆形表示pH调节至6.6并放置于4℃的情况；空心三角形表示未调节pH并放置于37℃的情况；黑三角形表示pH调节至6.6并放置于37℃的情况。
实施例16
(1)将实施例3-(1)中所述的纯化/分离环戊烯酮(113.9mg)溶于2.85ml乙醇中。向此乙醇溶液加入3.85ml己烷/乙醇(94/6)以制备环戊烯酮溶液(17mg/ml)。将其通过0.5μm滤器过滤以制备用于HPLC旋光拆分的样品溶液。
将此样品溶液用于HPLC旋光拆分，收集早期峰和晚期峰中环戊烯酮的每个组分，并在真空中挥发至干燥得到早期峰环戊烯酮43.2mg，晚期峰环戊烯酮43.0mg。
旋光拆分HPLC条件如下。
柱：手性填充物AS(Daicel制备)，2.0cm×25.0cm
柱温：40℃
流动相：己烷/乙醇(94/6)
流速：14.0ml/分钟
检测：UV210nm
填充样品量：150μl(2.55mg)
在早期峰和晚期峰中的环戊烯酮分别含有1％的对映体，因此将它们再次在上述条件下进行一次旋光拆分。结果，从早期峰的30.0mg环戊烯酮得到不含对映体的19.7mg环戊烯酮，从晚期峰的37.4mg环戊烯酮得到不含对映体的27.7mg环戊烯酮。象这样得到的来自早期峰和晚期峰的环戊烯酮的旋光度分别是[α]D 20-105°(C＝0.30，乙醇)和[α]D 20+104°(C＝0.53，乙醇)。由此，早期峰物质是(-)-反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮[下文称为(-)-环戊烯酮]，而晚期峰物质是(+)-反-4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮[下文称为(+)-环戊烯酮]。顺便提一下，旋光度使用上文所述的DIP-370型旋光计(Nippon Bunko生产)测量。
(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮的旋光分拆的洗脱曲线分别在图9和图10中表示。由此，图9是(-)-环戊烯酮的洗脱曲线，其中纵坐标是吸光度，而横坐标表示洗脱时间(分钟)。图10是(+)-环戊烯酮的洗脱曲线，其中纵坐标是吸光度，而横坐标表示洗脱时间(分钟)。
按照实施例3-(2)中所述的方法分别对(-)-环戊烯酮和(+)-环戊烯酮进行质谱分析，核磁共振结构分析，紫外吸收谱测量和红外吸收分析测量。结果是，两种旋光物都显示与旋光拆分前环戊烯酮相同的结果。
图11表示(-)-环戊烯酮的1H-NMR，其中纵坐标表示信号强度，横坐标表示化学位移值(ppm)。
图12表示(+)-环戊烯酮的1H-NMR，其中纵坐标表示信号强度，横坐标表示化学位移值(ppm)。
(2)按照已经引用的“碳水化合物研究”中所述的方法合成反-环戊烯酮。另外，按照已经引用的“Helvetica  Chimica  Acta”中所述的方法合成顺-环戊烯酮。其每种旋光物通过旋光拆分制备。
按对应实施例的方法分别对已制备的(+)-反-环戊烯酮、(-)-反-环戊烯酮、(+)-顺环戊烯酮和(-)-顺-环戊烯酮进行细胞生长抑制、细胞程序性死亡诱导活性、癌细胞分化诱导活性和抗细菌活性评估，由此(+)-反-环戊烯酮、(-)-反-环戊烯酮、(+)-顺-环戊烯酮和(-)-顺-环戊烯酮分别表现细胞生长抑制活性，细胞程序性死亡诱导活性，癌细胞分化诱导活性和抗细菌活性。
实施例17
分别将在实施例16中得到的(+)-环戊烯酮和(-)-环戊烯酮的乙醇溶液(1mg/ml)用75％乙醇水溶液稀释至2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024和2048倍。这些溶液各取出5ml加入96孔微量滴定板中每个孔，然后空气干燥。每孔加入含5000个人早幼粒白血病细胞HL-60(ATCC CCL-240)的加有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(100μl)，在5％二氧化碳气体存在时，于37℃培养48小时。在光学显微镜下观察细胞的形态学后，加入10μl含5mg/ml 3-(4，5-二甲基噻唑-2-羟基)-2，5-二苯基四唑-溴化物(MTT：Sigma制备)的磷酸缓冲液，然后再培养4小时，在显微镜下观察细胞的生长状态。进一步地，加入100ml含0.04N HCl的2-丙醇，接着进行加样孔搅拌，在590nm处测量吸光度，并由此了解细胞生长程度。
结果是，即使在加入每种环戊烯酮旋光物的128倍稀释溶液(终浓度：0.39μg/ml)的组分中，也可见细胞生长抑制活性，并可见细胞程序性死亡诱导作用。
实施例18
(1)在含1×105/mlHL-60细胞的加有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中加入10，1，0.1或0.01μg/ml环戊烯酮，然后在5％二氧化碳气体存在时，于37℃培养3或6天，计算存活的细胞数。培养第六天的结果是，与没有加入环戊烯酮的对照组相比，加入10μg/ml环戊烯酮的组分中，没有发现存活的细胞；而在加入1μg/ml环戊烯酮、0.1μg/ml或0.01μg/ml的组分中，细胞生长抑制分别达到约90％、约55％和约40％。
结果如图13所示。因此，图13表示将不同浓度环戊烯酮加到HL-60细胞培养液时，培养液中培养时间和存活细胞数之间的关系，其中横坐标表示培养时间(天数)，而纵坐标表示培养液中存活细胞数(×104/ml)。在曲线中，空心正方形表示没有加入样品的情况(对照组)，空心菱形表示加入10μg/ml环戊烯酮时的情况，空心圆环表示加入1μg/ml环戊烯酮时的情况，空心三角形表示加入0.1μg/ml环戊烯酮时的情况，黑正方形表示加入0.01μg/ml环戊烯酮时的情况。
(2)将10-4μg/ml环戊烯酮加入HL-60细胞中，并按照与实施例15-(1)中相同的方法培养3天。取出部分细胞，涂在玻璃载片上，进行“组织培养技术”(日本组织培养学会编辑；Asakara S hoten出版；1982)，191页中提到的Wright-Giemsa染色，并在光学显微镜下观察。结果是，在没有加入环戊烯酮的对照组中，分化细胞约占10％，而在加入环戊烯酮的组分中，50％或更多的细胞分化成单核细胞或巨嗜样细胞。
(3)将0.5μg/ml或0.005μg/ml环戊烯酮加入HL-60细胞中，并按照与实施例18-(1)中相同的方法培养3天或6天。取出部分细胞，涂在玻璃载片上进行Wright-Giemsa染色，并在光学显微镜下观察。结果是，在没有加入环戊烯酮的对照组中，分化细胞约占10％，而在加入0.005μg/ml环戊烯酮的组分中，25％或更多的细胞分化为成熟骨髓细胞。结果如图14所示。由此，图14表示在培养细胞中，成熟骨髓细胞的比例与培养时间之间的关系，其中横坐标表示培养时间(天数)，而纵坐标表示成熟骨髓细胞在培养细胞中所占的比例(％)。图14中，空心正方形表示没有加入样品的情况(对照组)，空心圆环表示加入0.5μg/ml环戊烯酮的情况，空心三角形表示加入0.005μg/ml环戊烯酮的情况。
实施例19
(1)使用如下菌株评估实施例3-(1)中所述的纯化/分离的环戊烯酮的抗细菌作用。即用于评估的菌株如下：受检微生物(1)：肠炎沙门菌(引起食物中毒病例的菌株)；受检微生物(2)：鼠伤寒沙门菌(引起食物中毒病例的菌株)；受检微生物(3)：金黄色葡萄球菌FRI T22(产生A型肠毒素的菌株)；受检微生物(4)：金黄色葡萄球菌(抗甲氧苯青霉素)；受检微生物(5)：蜡状芽孢杆菌(引起呕吐型食物中毒的菌株；受检微生物(6)：蜡状芽孢杆菌(引起腹泻型食物中毒的菌株)。所有这些菌株都保存在Kagawa营养学院卫生系。
用对每种受检微生物的生长抑制影响作为参数来进行抗细菌作用评估。将一定数量的每种受检微生物加入含一定浓度环戊烯酮的培养基中，将所得受检微生物溶液培养16或48小时，然后比较存活细胞的数量。
首先，将一定浓度的环戊烯酮加到敏感性检测液体培养基(Nissui制备)中进行连续2n倍稀释。然后，用在敏感性检测液体培养基中已于37℃预培养16小时的微生物溶液以106细胞/ml的量接种，并于37℃培养。在将培养液稀释到某一浓度并涂在固体培养基表面之后，计算对应于每种菌株每一培养时间的存活细胞数。在计算每种微生物的细胞数时，DHL(Eiken生产)，Baird P arker琼脂(BBL生产)和NGKG琼脂(Nissui生产)被分别用于沙门菌，金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌。只有蜡状芽孢杆菌在32℃进行培养。在每一培养时间测定的细胞数用常用对数表示为CFU(克隆形成单位)/ml。下面表10表示培养16小时后受检微生物的数量。表11表示在培养48小时后受检微生物的数量。环戊烯酮表现出针对任何受检微生物的抗细菌作用。同时，在表10-13中，表中符号(-)是指未见到受检微生物的生长。表10
受检微生物培养液中所加样品的浓度(ppm)             培养16小时后受检微生物的数量(CFU/ml)
                 受检微生物(1)    (2)      (3)     (4)     (5)     (6)
        1563   -      -        -       -       -       -
        781   -      -        -       -       -       -
        391   -      -        6.1     -       -       -
        195   3.0    3.0＞    4.9     4.3     -       -
        98   5.2    5.0      4.7     5.5     5.8     3.0
        49   7.0    6.7      6.9     6.1     6.9     6.8
        0   8.8    8.3      8.7     8.4     8.4     7.8
表11
受检微生物培养液中所加样品的浓度(ppm)          培养48小时后受检微生物的数量(CFU/ml)
                   受检微生物(1)    (2)    (3)    (4)   (5)    (6)
        1563      -      -      -      -     -      -
        781      -      -      -      -     -      -
        391      -      -      -      -     -      -
        195      -      -      -      -     -      -
        98      -      -      -      -     8.1    5.0
        49      9.0    8.5    8.5          8.4    7.9
(2)测量上述环戊烯酮对大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌的抗细菌作用。受检微生物如下：
受检微生物(7)：大肠杆菌(S-O157：H7，VT1，2-生成菌株)；受检微生物(8)：大肠杆菌(Y.3-O157：H7，VT1，2-生成菌株)；受检微生物(9)：大肠杆菌(Y.1-O157：H7，VT1-生成菌株)；受检微生物(10)：大肠杆菌(S-O26：HNM，VT1-生成菌株)；受检微生物(11)：大肠杆菌(S-O111：HNM，VT1，2-生成菌株)；受检微生物(12)：大肠杆菌(从食物中分离得来)。
所有菌株都保存在Kagawa营养学院卫生系。
首先，将一定浓度的环戊烯酮加到敏感性检测液体培养基(Nissui生产)中进行连续2n倍稀释。然后，用已在敏感性检测液体培养基中于37℃预培养16小时的微生物溶液，以106细胞/ml的量接种，并于37℃培养。在将培养液稀释到某一浓度之后，通过表面涂布培养，计算对应于每种菌株每一培养时间的存活细胞数。在计算菌株细胞数时，使用DHL(Eiken生产)。在每一培养时间所测的细胞数使用与上述相同的对数值表示。结果在下面表12和表13中列出。环戊烯酮表现出针对任何受检微生物的抗细菌作用。表12
 受检微生物培养液中所加样品的浓度(ppm)       培养16小时后受检微生物的数量(CFU/ml)
                受检微生物(7)   (8)   (9)     (10)  (11)    (12)
         1563  -     -     -       -     -       3.0＞
         781  -     -     3.0＞   -     -       6.4
         391  3.6   2.2   3.0＞   -     3.6     5.8
         195  4.7   4.7   3.0＞   -     6.2     6.6
         98  7.0   7.0   7.1     6.1   7.4     8.3
         49  6.3   6.9   7.1     7.1   8.0     8.2
         0  8.5   8.0   8.6     8.5   8.5     8.5
表13
 受检微生物培养液中所加样品的浓度(ppm)        培养16小时后受检微生物的数量(CFU/ml)
                受检微生物(7)    (8)    (9)    (10)    (11)    (12)
         1563  -      -      -      -       -       -
         781  -      -      -      -       -       -
         391  -      -      -      -       -       -
         195  -      -      -      -       4.1     -
         98  8.9    5.3    8.6    7.4     8.5     5.0
         49  8.5    9.3    8.5    9.8     8.5     10.1
(3)下述是评估上述环戊烯酮抗细菌作用时所用的受检微生物。它们是受检微生物(13)：大肠杆菌HB101(ATCC 33694)；受检微生物(14)：鼠伤寒沙门菌LF-2(ATCC 27106)；受检微生物(15)：绿脓杆菌(IFO 3080)；受检微生物(16)：金黄色葡萄球菌3A(NCTC 8319)；受检微生物(17)：枯草杆菌(IFO 3034)；受检微生物(18)：突变链球菌(GSS；保存在国家健康研究所)。
将受检微生物接种培养到L-液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母萃取液，和5％氯化钠，PH值7.0)中过夜。将接种培养物接种于已加入25-200μg/ml环戊烯酮的5mlL-液体培养基和未加环戊烯酮的液体培养基中，37℃摇动培养以评估其生长。然后，在培养开始和第八小时以后，使用Fuji数字浊度计(Fuji Kogyo kk出售，AkiyamaDenki Seisakusho制备)在调整刻度为82.3的条件下测量培养物的混浊度，用培养后第八小时的混浊度减去培养开始时的混浊度所得到的数值(生长混浊度)评估受检微生物的生长。
同时，在用受检微生物(18)的情况下，使用脑心浸出液替代L-液体培养基。
结果在表14中表示，其中“-”是指未检测到。表14(生长混浊度)
  受检微生物            所加环戊烯酮的数量(μg/ml培养基)
    0     25      50     100     200
    (13)     222     0      0     0     0
    (14)     273     -      -     0     0
    (15)     239     2      0     0     0
    (16)     243     203      158     0     0
    (17)     267     145      9     0     0
    (18)     140     133      130     34     6
因此，环戊烯酮表现针对所有受检微生物的抗细菌作用。
(4)用如下方法检测环戊烯酮对hiochi细菌的抗细菌作用。将受检微生物放入含10％乙醇的SI培养基(日本Brewery学会)静置培养5天以提供接种微生物。将接种微生物(0.1％)加入100ml其中以0，25，50，75，或100μg/ml(根据终浓度)的含量加了环戊烯酮的含10％乙醇的SI培养基中，然后静置培养5天，并测量混浊度。在计算混浊度时，使用吸光度计来测量OD600值，然后从上述数值中减去没有接种任何受检微生物的培养基的OD600值，并用此(生长混浊度)来表示受检微生物的生长。
受检微生物如下。即食果糖乳杆菌(IFO 13118)(受检微生物A)，食果糖乳杆菌(JCM 1198)(受检微生物B)和同型腐酒乳杆菌(IFO 13120)(受检微生物C)用作真正hiochi细菌，而鼠李糖乳杆菌(IFO 3532)(受检微生物D)用作hiochi乳杆菌。结果在表15中表示。表15(生长混浊度)
  受检微生物      所加环戊烯酮的数量(μg/ml培养基)
   0    25    50     75
      A    0.96    0.17    0.02     0
      B    2.03    0.01    0     0
      C    1.61    0.32    0.08     0
      D    0.35    0.04    0.01     0
受检微生物A，C和D的生长在浓度为75μg/ml时受到完全抑制，而受检微生物B的生长在浓度为50μg/ml时便受到完全抑制。因此，环戊烯酮也表现对hiochi细菌的抗细菌作用。
此外，环戊烯酮在高浓度下也表现对真菌如酿酒酵母ATCC 9763，白色念珠菌TIMM 0136和烟曲霉菌TIMM 1776的抗微生物活性。
实施例20
(1)将副溶血性弧菌4837-61和副溶血性弧菌T4144-1(二者保存于国立卫生科学研究院)接种于含800，400，200，100，50，25，12.5，6.15，3.13，或1.56μg/ml环戊烯酮的胰蛋白胨-大豆肉汤培养基中得到106细胞/ml浓度，于37℃静置培养24小时。结果是，当加入12.5μg/ml或更多环戊烯酮时，在任何菌株中都没有见到微生物的生长。
将没有见到微生物生长的培养物(50μl)涂布在20ml不含环戊烯酮的胰蛋白胨-大豆肉汤琼脂培养基上，于37℃培养24小时。结果是，对于任何菌株，涂布某一组分(其中加了50μg/ml或更多环戊烯酮)的琼脂培养基上都没有见到微生物的生长。
综上所述，环戊烯酮在12.5μg/ml浓度时，表现对副溶血性弧菌4837-61和副溶血性弧菌T4144-1的抗细菌作用，在50μg/ml浓度时，表现对两种菌株的抗细菌作用。
(2)将空肠弯曲菌A3309(保存在卫生科学研究所)接种于含2％小牛血清(Dainippon seiyaku生产)的脑心浸出液(Difco生产)中，于37℃振荡预培养16小时。将培养物(50μl)涂布于20ml含0.5％NaCl的Muller-Hinton平板培养基(BBL生产)上，其中含800，400，200，100，50，25，12.5，6.15，3.13或1.56μg/ml环戊烯酮，于37℃静置培养48小时。
结果是，加入12.5μg/ml或更多环戊烯酮的培养基平板上没有见到微生物的生长。
因此，环戊烯酮表现对弯曲菌有抗细菌作用。
(3)采用对每种受检微生物的生长抑制作用作为参数，对环戊烯酮对嗜肺性军团杆菌[从人支气管洗液中分离；受检微生物(1)]和嗜肺性军团杆菌[从热泉浴缸水中分离；受检微生物(2)](二者皆保存在Kagawa营养学院卫生系)的抗细菌作用进行评估。由此，取一定量每种微生物加至含一定浓度环戊烯酮的液体培养基中，并将所得受检微生物悬浮液培养16小时，48小时，72小时或96小时，并检测培养后存活细胞的数目。
首先，将某一浓度的环戊烯酮加到BCYEα液体培养基(Oxoid生产)中进行2n倍连续稀释。向其中加入在BCYEα液体培养基中于37℃预培养16小时的细菌悬浮液，使细胞数目达到106/ml，并于37℃培养。通过适当稀释培养物，再涂布在BCYEα琼脂(Oxoid生产)上来测定对应于每种微生物每一培养时间的存活细胞数。
在每一培养时间测定的细胞数用常用对数表示为CFU(集落形成单位)/ml。结果在下面表16中列出。环戊烯酮表现对任何微生物都有抗细菌作用。同时，表中“-”表示没有见到受检微生物的生长。表16
受检微生物培养物中所加样品的浓度(ppm)       每次培养后受检微生物细胞数(CFU/ml)
     16小时培养      96小时培养
     受检微生物(1)         (2)      受检微生物(1)        (2)
        24    -     -     -    -
        12    5.7     6.1     8.3    8.6
        0    6.9     7.4     8.7    8.6
(4)就幽门螺旋杆菌菌株而言，使用标准菌株NCTC 11637(ATCC 43504)和临床上从人胃中分离的菌株(206和3401；二者都保存在Hyogo医学院细菌学系)。使用Aneropack Campiro(Mitsubishi Gas Chemical生产)，在些微需氧条件下，将每种菌株放在含有7％马血清(Bio Whittacker生产)的Brucella液体培养基(BBL生产)中于37℃振荡培养。用Brucella液体培养基稀释处于对数生长期的微生物并用于检测。实验中使用24孔板(Falcon生产)。将环戊烯酮以0.1ml(1000μg)/孔的比例加入加样孔，使用PBS进行二步稀释，然后通过加入0.9ml/孔培养基[含7％马血清(BBL生产)的Brucella琼脂培养基(pH6.0)]固定。Brucella琼脂培养基先用HCl调整pH至6.0，然后用于实验。每种微生物以104/50μl/孔的比例接种。在微生物接种后，在些微需氧条件下，于37℃培养3-4天以判断其抗细菌活性。表现90％或更多抑制的样品量(μg/ml)定义为MIC。结果是，对于所有检测的菌株，MIC是32μg/ml，并且环戊烯酮表现对螺旋杆菌菌株有抗细菌作用。
实施例21.环戊烯酮对实体癌的抗癌作用。
将实施例3-(1)所述的环戊烯酮用生理盐水溶液稀释到某一浓度后，进行如下测试。
(1)在雌性8周龄BALB/C小鼠(体重：约20克)腹部皮下注射Meth A细胞(2×106细胞/小鼠)。此后，在同一部位连续5天皮下注射环戊烯酮(5mg/kg/天)。另一方面，对照组按相同方法皮下注射生理盐水溶液。两周后，切下小鼠腹部生成的癌组织并称重。结果在表17中给出。在对照组，肿瘤块平均重量为1.41g，而在环戊烯酮用药组(5mg/kg/天)，重量为0.0g。因此根本没有生成癌组织，抑制率为100％。表17
   小鼠(％)   (n)     肿瘤重量(g)(平均值±标准差)    抑制率
对照组   (7)     1.41±0.55     -
环戊烯酮用药组   (8)     0.00±0.00     100.0
(2)使用16只6周龄的ICR种系雌性小鼠(体重：约26克)。用肉瘤-180细胞(5.5×106细胞/小鼠)进行腹部皮下注射得到对照组(8只小鼠)和环戊烯酮用药组(8只小鼠)。
用自来水稀释环戊烯酮，并用供水瓶自由供给环戊烯酮用药组，以使环戊烯酮的剂量为约80mg/kg/天。相似地，同样供给对照组自来水。在实验的过程中对两组动物自由供给食物。
肉瘤细胞-180皮下移植后第40天存活小鼠的数目在对照组中为8只中的2只，而在环戊烯酮用药组中为7只，因此可注意到施用环戊烯酮产生明显的延长生命的作用。
(3)将小鼠白血病细胞(1.1×106细胞/小鼠)腹膜内注射到七周龄DBA/2雌性小鼠(体重：约20克)中。然后，连续5天腹膜内注射环戊烯酮(10mg/kg/天)。同时，对照组按照相同方法腹膜内注射生理盐溶液。计算两组中(每组含8只小鼠)小鼠存活的数目，平均存活天数和延长生命的比例。结果如图15所示。其中在对照组中平均存活天数为10.3天，而在环戊烯酮用药组平均存活天数为31.4天，生命延长比例为306.1％，显示出明显的生命延长效应。图15表示环戊烯酮的抗癌作用，其中纵坐标表示存活小鼠的数目，而横坐标为存活天数。图15中，实线表示环戊烯酮用药组，虚线表示对照组。
相似地，使用16只五周龄ICR种系雌性小鼠(体重：约25克)，并用肉瘤细胞-180进行腹膜内注射(5.5×106细胞/小鼠)以建立对照组(包含8只小鼠)和环戊烯酮用药组(包含8只小鼠)。同时，使用16只七周龄CDF1种系雌性小鼠(体重：约20克)，并用IMC进行腹膜内注射(2.0×106细胞/小鼠)以建立对照组(含8只小鼠)和环戊烯酮用药组(含8只小鼠)。
此外，使用16只五周龄DDY种系雌性小鼠(体重：约25克)，并用EAC进行腹膜内注射(1.2×106细胞/小鼠)以建立对照组(含8只小鼠)和环戊烯酮用药组(含8只小鼠)。
结果是，在注射肉瘤细胞-180，IMC，和EAC细胞的情况下，对照组的平均存活时间分别为22.6天，10.8天和15.8天，而环戊烯酮用药组平均存活时间分别为33.4天，20.3天和40.3天，其中寿命分别增长148％，188％和255％，表明施用环戊烯酮的明显生命延长效应。
实施例22注射
(1)将环戊烯酮以1％的浓度加入生理盐水溶液(JapanesePharmacopolia)中以制备注射溶液。
(2)将环戊烯酮和甘草次酸分别以0.5％和0.1％的浓度加入生理盐水溶液(与上述相同)中以制备注射溶液。
实施例23片剂
(1)每片含100mg环戊烯酮和一定量微晶纤维素的药片得到制备后，通过糖衣包裹制成片剂。
(2)每片含0.1mg环戊烯酮、10mg甘草次酸氢二钾和一定量微晶纤维素的药片得到制备后，通过糖衣包裹制成片剂。
实施例24软膏
软膏按照如下配方制备。
环戊烯酮     1g
吸收软膏(Japanese Pharmacoplia)     99g
首先，将环戊烯酮与一小块吸收软膏很好地揉在一起，然后向其中逐渐地加入其它吸收软膏，接着捏至得到均一产物以制备成软膏。
每天4-5次将此软膏涂于损伤处。
实施例25美容化妆品
按如下配方配制由抗细菌化妆品材料形成的清洗液。
乙醇                  10份
甘油                  1份
柠檬酸                0.3份
甲基-P-羟基苯甲酸盐   0.2份
环戊烯酮              0.1份
香料                  少许
纯水                  加入至100份
实施例26洗浴剂
抗细菌洗浴剂按如下配方配制。
无水硫酸钠                  20份
碳酸氢钠                    40份
琥珀酸                      10份
环戊烯酮                    30份
染料                        适量
香料                        适量
(以片剂形式制备)
实施例27洁齿剂
按照如下配方制备洁齿剂。
碳酸钙                       50.00％
甘油                     20.00％
爱兰苔胶                 0.50％
羟甲基纤维素             1.00％
十二烷基二乙醇胺         1.00％
蔗糖单月桂酸盐           2.00％
香料                     1.00％
甜味剂                   0.10％
环戊烯酮                 0.10％
水                       平衡
总计                     100.00％
实施例28
按如下配方制备糖片。
糖                       74.9％
乳糖                     20.0％
蔗糖单月桂酸盐           0.2％
香料                     0.5％
纯水                     4.3％
环戊烯酮                 0.001％
实施例29
按如下配方制备抗细菌饮料。
(1)将果胶(Pomosin果胶LM-13CG，Herculus生产)(5Kg)加到100升自来水中，在35分钟期间通过向其中吹入蒸汽将混合物从液体温度28℃加热至120℃。保持在120℃5小时，同时不停搅拌，然后冷却以制备135升冷却混合物。向混合物中加入1.35KgCelite#545(Celite生产)和1.35Kg Silica#600-S(Chuo Silica生产)作为助滤剂，并使用以0.1Kg Celite#545和0.1Kg Silica#600-S覆盖的密封过滤器(16层6英寸滤纸；ADVANTEC#327)进行过滤。用平板加热器(Nichihan Seisakusho生产)对所得滤液立即进行连续加热处理(98℃60秒)，然后冷却以制备150升含环戊烯酮的加热处理的果胶溶液。
所述的含有环戊烯酮的加热处理的果胶溶液具有约3.5的pH值，6.2ml的酸度和5.8％Brix的糖度。同时，pH值用pH计测量，酸度以中和至pH7.0时所需的0.1N NaOH的数量(ml)来表示，而糖度用Brix糖度计测量。
(2)通过传统方法使用10g绿茶叶，0.2g维生素C和1000ml去离子水制备绿茶。将已制备好的加热处理的含环戊烯酮的果胶溶液以200mg(在固体基础上，含环戊烯酮1.6mg)的数量加入100ml绿茶中以制备本发明的产品(1)。对照组是未加果胶溶液的一组。由20名专门小组成员进行感觉评估(使用5分制法，其中5分是好，1分是不好)，表18中列出结果的平均值。表18感官评估
   产品(1)    对照组
   味觉范围     4.3     3.2
   味觉平衡     3.9     3.4
   总味觉     4.3     3.3
从表18来看，与对照组相比，评价是本发明的产品(1)具有更宽广和匀称的味道，由此茶的香味和味道得到改善，并且取得“隐密香味”的效果。
实施例30
按照如下配方配制饮料。
果糖-葡萄糖-液体糖             5.00％
糖                             4.00％
酸味剂                         1.20％
香料                           0.30％
含环戊烯酮的物质               0.5％
纯水                           平衡
总计                           100.00％
使用实施例29-(1)中所述的含环戊烯酮的加热处理果胶溶液作为含环戊烯酮的物质，并且加入按固体基础计算出的数量。此饮料(100ml)含4mg环戊烯酮。
实施例31
将新鲜甘蓝(200g)切成条状，每100g分别在水(对照)中或0.2％环戊烯酮溶液中浸泡5分钟。然后小心将水除去，并将甘蓝放入合成树脂制成的袋中，放在室温(20℃)下。24小时后观察，与浸在水(对照)中的甘蓝相比，浸在环戊烯酮水溶液中的甘蓝保持新鲜。
随着时间的流逝，这种差别变得更清楚，并且在四天后观察，与浸在水(对照)中的甘蓝相比，浸在环戊烯酮水溶液中的甘蓝没有一点坏味仍保持新鲜。
本发明的价值
本发明提供环戊烯酮及其旋光物，它们表现诸如抗癌作用，对癌细胞增殖的抑制作用，对癌细胞分化的诱导作用，细胞程序性死亡诱导作用，抗细菌作用等的生理活性，并且具有高度安全性。它也提供具有这些生理作用的含所述化合物的药物，食品和饮料。根据本发明，现在有可能以低费用容易和有效地从自然材料生产环戊烯酮，并提供其旋光物。
因为它们的生理活性，本发明所提供的环戊烯酮和/或其旋光物能用作有致癌性预防作用、抗癌作用和抗细菌作用的药物，并且该药物对保持活体内环境稳定，尤其是保持胃肠的良好健康有用。本发明也提供含有环戊烯酮和/或其旋光物作为有效成分的防腐剂，抗细菌美容化妆品，抗细菌洁齿剂和抗细菌洗浴剂。
根据本发明，现在有可能将适当数量的具有生理活性的环戊烯酮和/或其旋光物包含在食品或饮料中。因为环戊烯酮及其旋光物的各种生理活性，本发明的食物或饮料是健康食物或饮料，具有保持活体内环境稳定功能如致癌性预防作用，抗癌作用，抗细菌作用和细胞程序性死亡诱导作用，并且本发明提供含有用于保持胃肠良好健康的功能性物质的食物或饮料。而且，作为加入环戊烯酮的结果，食物或饮料的抗细菌作用可以容易地得到强化，并且作为食物或饮料的防腐剂，含有环戊烯酮和/或其旋光物的制品也是十分有用的。
此外，本发明提供包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，在所述包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质中，具有与糖醛酸、糖醛酸衍生物、环戊烯酮的中间体或环戊烯酮反应的反应活性的氨基、氨基酸、肽或蛋白质的至少部分反应活性消失和/或至少部分所述的反应物质被去除。当包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质被使用时，用于本发明的环戊烯酮和/或其旋光物能有效地得到生产。包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质的例子是干热的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。就干热处理而言，焙/烤处理是简单方便的，并且，焙/烤的植物、动物和微生物如焙/烤的蔬菜、水果、谷类、蘑菇、海藻、皮质和软骨在本发明的环戊烯酮和/或其旋光物的制备中十分有用。同时，干热处理的产品可通过在干热处理之前对要处理的物质进行脱水有效地得到制备。

Claims (70)

1.一种制备由以下化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其特征在于加热至少一种选自下列(a)、(b)和(c)的物质：
(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物；
(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物；和
(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。
2.一种制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其特征在于加热至少一种选自下列(a)，(b)和(c)的物质，并且由以下化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮从上述加热处理的产物中得到：
(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物；
(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物；和
(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质。
Figure C9719782200022
3.根据权利要求1或2所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中糖醛酸是半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸和/或艾杜糖醛酸。
4.根据权利要求1或2所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中糖醛酸的衍生物是糖醛酸的内酯、其酯、其酰胺，或其盐类。
5.根据权利要求1或2所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中糖类化合物是选自果胶，果胶酸，藻酸，透明质酸，肝素，硫酸肝素，岩藻聚糖，硫酸软骨素，软骨素，硫酸皮肤素和/或其分解产物的糖类化合物。
6.根据权利要求1或2所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在60-350℃加热几秒至几天得到。
7.根据权利要求3所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在60-350℃加热几秒至几天得到。
8.根据权利要求4所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在60-350℃加热几秒至几天得到。
9.根据权利要求5所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在60-350℃加热几秒至几天得到。
10.根据权利要求1或2所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
11.根据权利要求3所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
12.根据权利要求4所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
13.根据权利要求5所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
14.根据权利要求6所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
15.根据权利要求7所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
16.根据权利要求8所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
17.根据权利要求9所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
18.一种制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其特征在于包括下列步骤：
(A)：加热至少一种选自以下(a)、(b)和(c)的物质以制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮：
(a)糖醛酸和/或糖醛酸衍生物，
(b)含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物，和
(c)包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质；
(B)一个选择性步骤，从所得的加热处理产物中分离4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮；并且
(C)对4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮进行旋光拆分。
19.根据权利要求18所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其中糖醛酸是指半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸，古罗糖醛酸，甘露糖醛酸和/或艾杜糖醛酸。
20.根据权利要求18所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其中糖醛酸的衍生物是糖醛酸的内酯、其酯、其酰胺，或其盐类。
21.根据权利要求18所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其中糖类化合物是选自果胶，果胶酸，藻酸，透明质酸，肝素，硫酸肝素，岩藻聚糖，硫酸软骨素，软骨素，硫酸皮肤素和/或其分解产物的糖类化合物。
22.根据权利要求18-21中的任意一项所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其中经加热处理的产品通过在60-350℃加热几秒至几天得到。
23.根据权利要求18-21中的任意一项所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
24.根据权利要求22所述制备4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的旋光物的方法，其中经加热处理的产品通过在酸性至中性条件下加热得到。
25.一种抗癌剂，其特征在于含有由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
26.根据权利要求25的抗癌剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
27.根据权利要求25的抗癌剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
28.根据权利要求25的抗癌剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
29.一种癌细胞分化诱导剂，其特征在于含有由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
30.根据权利要求29的癌细胞分化诱导剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
31.根据权利要求29的癌细胞分化诱导剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
32.根据权利要求29的癌细胞分化诱导剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
33.一种细胞程序性死亡诱导剂，其特征在于含有以化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
34.根据权利要求33的细胞程序性死亡诱导剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
35.根据权利要求33的细胞程序性死亡诱导剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
36.根据权利要求33的细胞程序性死亡诱导剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
37.一种抗细菌剂，其特征在于含有由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
Figure C9719782200061
38.根据权利要求37的抗细菌剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
39.根据权利要求37的抗细菌剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
40.根据权利要求37的抗细菌剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
41.一种防腐剂，其特征在于含有根据权利要求37所述的抗细菌剂作为有效成分。
42.根据权利要求41的防腐剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
43.根据权利要求41的防腐剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
44.根据权利要求41的防腐剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
45.一种洁齿剂，其特征在于含有根据权利要求37所述的抗细菌剂作为有效成分。
46.根据权利要求45的洁齿剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
47.根据权利要求45的洁齿剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
48.根据权利要求45的洁齿剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
49.一种美容化妆品，其特征在于含有根据权利要求37所述的抗细菌剂作为有效成分。
50.根据权利要求49的美容化妆品，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
51.根据权利要求49的美容化妆品，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
52.根据权利要求49的美容化妆品，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
53.一种洗浴剂，其特征在于含有根据权利要求37所述的抗细菌剂作为有效成分。
54.根据权利要求53的洗浴剂，其特征在于含有通过根据权利要求1所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
55.根据权利要求53的洗浴剂，其特征在于含有根据权利要求1所述的经加热处理的产品作为有效成分。
56.根据权利要求53的洗浴剂，其特征在于含有通过根据权利要求2所述的方法制备的、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮作为有效成分。
57.食物或饮料，其特征在于将化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物包含、稀释和/或加入其中。
Figure C9719782200081
58.根据权利要求57所述的食品和饮料，其特征在于将通过根据权利要求1所述的方法得到的由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物包含、稀释和/或加入其中。
59.根据权利要求57所述的食品和饮料，其特征在于将根据权利要求1所述的经加热处理的产品包含、稀释和/或加入其中。
60.根据权利要求57所述的食品和饮料，其特征在于将通过根据权利要求2所述的方法得到的由化学式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物包含、稀释和/或加入其中。
61.根据权利要求57-60的任意一项所述的食品和饮料，其特征在于以每100份含有5×10-6份的数量含有由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮和/或其旋光物。
62.根据权利要求57-60任意一项所述的食品和饮料，是抗癌食品和/或抗癌饮料。
63.根据权利要求61所述的食品或饮料，是抗癌食品和/或抗癌饮料。
64.根据权利要求57-60中的任意一项所述的食品和饮料，是抗细菌食品和/或抗细菌饮料。
65.根据权利要求61所述的食品和饮料，是抗细菌食品和/或抗细菌饮料。
66.一种包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，其特征在于在上述包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质中，具有与糖醛酸、糖醛酸衍生物、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的中间体或由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮反应的反应活性的氨基、氨基酸、肽或蛋白质的至少部分反应活性消失，和/或部分上述反应物质被去除。
Figure C9719782200091
67.根据权利要求66所述的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，其特征在于通过干燥加热处理，具有与糖醛酸、糖醛酸衍生物、由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的中间体或由化学结构式[1]代表的4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮反应的反应活性的氨基，氨基酸、肽或蛋白质的至少部分反应活性消失，和/或部分上述反应物质被去除。
68.根据权利要求67所述的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，其特征在于干燥加热处理是通过用60-400℃的热气流焙/烤包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质几秒至几天进行的。
69.根据权利要求68所述的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，其特征在于包含含有含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质选自焙/烤植物、动物或微生物。
70.根据权利要求69所述的包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质，其特征在于包含含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的物质选自焙/烤蔬菜、水果、谷类、蘑菇、海藻、皮质或软骨。
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