KR20000057128A - 사이클로펜테논, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

사이클로펜테논, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

(a)우론산 또는 우론산 유도체; (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당 화합물; 및 (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당 화합물 함유 물질 중에서 선택된 적어도 하나의 멤버를 가열처리함을 특징으로 하는 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
화학식 1

Description

사이클로펜테논, 이의 제조방법 및 용도{CYCLOPENTENONES, PROCESS FOR PREPARING THE SAME, AND THE USE THEREOF}
임상요법에 사용되어온 약제에는 항암제, 항생물질, 면역강화제, 면역조정제 등과 같은 다수의 약제(예를 들면, 알킬화제, 항-대사물질 및 식물 알카로이드)가 포함되지만, 이러한 약물요법이 이미 완전하게 자리잡았다고 말하기는 어렵다.
이러한 제제들 가운데서, 천연물질로부터 유도된 프로스타글란딘 중 사이클로펜테논 환을 지닌 프로스타글란딘 A 및 J는 이들의 DNA 합성억제에 기인하여 고도로 안전한 항암제로 사용될 가능성이 있는 것으로 보고되어 왔으며 이들의 각종 유도체가 합성되어 왔다(일본 공개 특허공보 소-62/96438 참조).
발명의 해결과제
본 발명의 목적은 항암작용과 같은 생리작용을 지닌 고도로 안전한 사이클로펜테논 화합물의 개발 및 이러한 화합물의 제조방법, 이러한 화합물을 유효성분으로 함유하는 약제 및 이러한 화합물을 함유하는 식품이나 음료의 제공이다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 화합물 및 또한 이들 화합물에 관련된 기타 화합물의 사용방법의 제공이다.
과제 해결수단
본 발명은 하기와 같이 요약된다. 따라서, 본 발명의 제 1 특징은 하기 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열시킴을 특징으로 하는, 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법에 관한 것이다.
(a)우론산 또는 우론산 유도체;
(b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물; 및
(c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
본 발명의 제 2 특징은 하기 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열시킨 다음 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 상기 가열처리 산물로부터 수집해 냄을 특징으로 하는, 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법에 관한 것이다.
(a):우론산 또는 우론산 유도체;
(b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물; 및
(c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
본 발명의 제 3 특징은 하기 단계를 포함함을 특징으로 하는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
(A)하기 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열하여 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 생성시키는 단계.
(a):우론산 또는 우론산 유도체,
(b):우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물, 및
(c):우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질;
(B):생성되는 가열처리 산물로부터 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 분리시키는 임의 단계; 및
(C):4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 광학 분할하는 단계.
본 발명의 제 4 특징은 선광도가-105。 (C = 0.30, 에탄올)인 (-)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 특징은 선광도가+104。 (C = 0.53, 에탄올)인 (+)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 관한 것이다.
본 발명의 제 6 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항암제에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 암세포 분화 유도제에 관한 것이다.
본 발명의 제 8 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제에 관한 것이다.
본 발명의 제 9 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항균제에 관한 것이다.
본 발명의 제 10 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 암세포 분화 유도방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 11 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 12 특징은 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물이 함유, 희석 및/또는 첨가됨을 특징으로 하는 식품 또는 음료에 관한 것이다.
본 발명의 제 13 특징은 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질에 있어서, 우론산, 우론산 유도체, 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 대한 중간체 또는 화학식 1로 표현되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온과 반응성을 지닌 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 단백질의 반응성의 적어도 일부가 소실 및/또는 반응성 물질의 적어도 일부가 제거됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질에 관한 것이다.
본 발명자는 화학식 1로 표현되는 화합물, 즉 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온(이하, 단지 "사이클로펜테논"으로만 언급함)이 우론산, 우론산 유도체, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 적어도 하나의 물질의 가열처리 산물에서 생성되고 가열처리 산물로부터 분리해낸 상기 화합물이 항암작용, 아폽토시스 유도작용 및 항균작용과 같은 다양한 생리활성을 보인다는 것을 밝혀내었으며 또한 이러한 화합물의 광학 활성 물질의 제조에도 성공하여, 본 발명이 완성되었다.
본 발명은 항암작용과 같은 생리활성이 있고 안전성이 높은 사이클로펜테논, 및 더욱 구체적으로 말하면, 이러한 화합물의 제조방법 및 또한 이러한 화합물을 유효성분으로 함유하는 약제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 식품, 음료 분야 등에 유용한 일련의 발명에 관한 것이다.
도 1은 사이클로펜테논의 질량 스펙트럼도.
도 2는 사이클로펜테논의1H-NMR 스펙트럼도.
도 3은 알긴산의 가열처리 산물로부터 제조된 사이클로펜테논의 아폽토시스 유도작용도.
도 4는 사이클로펜테논의 IR 흡수 스펙트럼도.
도 5는 사이클로펜테논의 UV 흡수 스펙트럼도.
도 6은 사이클로펜테논의 작용 곡선도.
도 7은 글루쿠론산의 가열처리 산물의 가스 크로마토그래피 결과도.
도 8은 보존시간과 사이클로펜테논 양의 관계도.
도 9는 (-)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 용출 곡선도.
도 10은 (+)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 용출 곡선도.
도 11은 (-)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의1H-NMR 스펙트럼도.
도 12는 (+)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의1H-NMR 스펙트럼도.
도 13은 배양시간과 배지내 생존세포 수의 관계도.
도 14는 배양시간과 배양세포내 성숙 골수세포에 의해 점유된 비율의 관계도.
도 15는 사이클로펜테논의 항암작용도.
본 발명의 바람직한 양태
본 발명을 이하에서 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 있어서, 우론산, 우론산 유도체, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질은 사이클로펜테논이 이들의 가열처리 산물에서 생성되는 한은 특별한 제한이 없다.
본 발명에 따라 비로서 적당량의 생리활성 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 식품이나 음료에 함유시키는 것이 가능해졌다. 그러한 화합물의 항암작용, 항균작용 등으로 해서, 본 발명의 식품이나 음료는 항암 및 항균 식품으로서 또는 항암 및 항균 음료로서 매우 유용하다.
또한, 본 발명은 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 약학 조성물을 제공하며 이러한 약학 조성물은 암 치료제 또는 예방제로서 및 또한 방부제, 항균성 치마제, 항균성 화장품, 항균성 목욕제 등을 위한 항균제로서 유용하다.
본 발명은 또한, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 사용함에 의한 암세포 분화 유도방법 및 또한 아폽토시스 유도방법을 제공하며 이러한 방법들은 생화학 연구 및 암세포 분화제와 아폽토시스 유도 억제제와 같은 약제의 선별에 유용하다.
본 발명에 사용된 사이클로펜테논은 (a)우론산 또는 우론산 유도체; (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물; 및 (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 물질을 가열함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 물리적, 화학적, 효소적 수단 또는 기타 수단에 의해 (a), (b) 또는 (c) 어느 것도 함유하지 않는 물질로부터 생성되는 (a), (b) 또는 (c)를 가열함으로써 본 발명의 사이클로펜테논을 제조하는 것이 또한 가능하다.
본 발명에서는 사이클로펜테논을 함유하는 가열처리 산물 또는 이러한 가열처리 산물로부터 정제된 사이클로펜테논 또는 부분 정제된 사이클로펜테논을 사용하는 것도 가능하다.
우론산은 종종 글리쿠론산으로 불리우며 알도스상의 알데하이드 그룹이 그 자체로 잔류하면서 다른 말단의 1차 알콜 그룹만이 카복실 그룹으로 산화되는 하이드록시알데하이드 카복실산에 대한 총칭이다. 이는 자연에서 동식물의 각종 폴리사카라이드에 대한 구성성분으로서 존재한다. 우론산을 함유하는 폴리사카라이드의 예로는 펙틴, 펙트산, 알긴산, 하이알루론산, 헤파린, 헤파란 설페이트, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴, 더마탄 설페이트 등을 들 수 있으며 이들은 다양한 생리학적 기능을 보이는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 우론산에는 특별한 제한이 없다. 따라서, 우론산의 예로는 갈락투론산, 글루쿠론산, 굴루론산, 만뉴론산 및 이듀론산이 있고 우론산 유도체의 예로는 전술한 것들의 락톤, 에스테르, 아미드, 염 등이 있으며, 가열시 사이클로펜테논을 생성하는 여타 물질도 본 발명의 유도체에 포함된다. 우론산 락톤의 예로는 글루쿠로노-6,3-락톤(이하, 글루쿠로노락톤으로 약칭), 만뉴로노-6,3-락톤 및 이듀로노-6,3-락톤이 있다. 우론산 에스테르의 예로는 우론산으로부터 제조될 수 있는 메틸, 에틸, 프로필렌 글리콜 및 카복시메틸 우로네이트가 있다. 우론산 아미드는 우론산의 아미드화에 의해 제조될 수 있다. 이들의 염은 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
본 명세서에서 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물에는 특별한 제한이 없으며 적용될 수 있는 예로는 펙틴, 펙트산, 알긴산, 하이알루론산, 헤파린, 헤파란 설페이트, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴 및 더마탄 설페이트를, 이들의 화학적, 효소학적 또는 물리적 처리산물인 이들의 분해산물, 분해산물의 유도체 및 분해산물의 염을 포함하여 들 수 있다.
전술한 화학처리에 있어서, 출발 화합물은 예를 들면, 실온 내지 200℃에서 수 초 내지 수 시간 동안, 또는 바람직하게는 50 내지 130℃에서 수 초 내지 60 분 동안 가열된다. 이러한 처리가 산성 조건하에서 수행될 때, 글리코사이드 결합이 가수분해되고, 펙틴의 경우에, 갈락투론산 및/또는 갈락투론산 에스테르를 함유하는 분해산물이 생성된다. 또는, 예를 들면, pH 6.8, 95℃에서 수 분 내지 수 십분 동안 처리할 경우, 베타 제거반응이 일어나 235 nm 부근에서의 흡광도가 증가되는 불포화 우론산 및/또는 불포화 우론산 에스테르를 함유하는 사카라이드 화합물이 생성된다. 본 발명의 사카라이드 화합물은 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 폴리사카라이드 화합물의 베타 제거반응에 의해 제조된, 비-환원성 말단에 불포화 우론산 및/또는 불포화 우론산 에스테르를 함유하는 사카라이드 화합물을 포함한다.
전술한 효소학적 처리의 예로는 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 출발 사카라이드 화합물을 우론산 및/또는 우론산 에스테르 함유 사카라이드에 대한 펙티나제 및 하이알루로니다제와 같은 하이드롤라제로 분해시키는 공지의 분해방법이 있다. 다른 예로는 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 사카라이드를 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 사카라이드에 대한 리아제로 분해시키는 공지의 분해방법이 있다. 예를 들면, 펙틴 또는 펙트산의 경우, 분해과정을 공지의 펙틴 리아제(EC 4.2.2.10), 펙티에이트 리아제(EC 4.2.2.2) 또는 엑소폴리갈락트- 우론산 리아제(EC 4.2.2.9)로 수행하여 비-환원성 말단에 4-데옥시-L-트레오-헥스-4-에노피라노실 우로네이트 또는 이의 메틸 에스테르를 갖는 사카라이드 화합물을 생성시킨다. 하이알루론산의 경우, 하이알루로네이트 리아제(EC 4.2.2.1)가 사용되는 반면에, 알긴산의 경우 알기네이트 리아제(EC 4.2.2.3)가 사용된다. 첨언하면, 알긴산의 경우, 비-환원성 말단에 4-데옥시-L-에리스로-헥스-4-에노피라노실 우로네이트를 갖는 사카라이드 화합물이 수득된다. 이와 같이 제조된 4-데옥시-L-트레오-헥스-4-에노피라노실 우로네이트, 4-데옥시-L-에리스로-헥스-4-에노피라노실 우로네이트 또는 이의 메틸 에스테르를 비-환원성 말단에 갖는 효소 분해산물 또한 본 발명의 사카라이드 화합물에 포함된다.
전술한 물리적 처리의 예로는 근적외선, 적외선, 마이크로파, 초음파 등에 의한 원료 사카라이드 화합물의 처리가 있다. 따라서, 예를 들면, 펙틴 및/또는 펙트산을 중성(pH) 또는 알칼리성 용액에 넣고 적당한 환원성 조작하에, 예를 들면, 아스코브산의 존재하에 1 초 이상, 또는 바람직하게는 5 초 내지 1 시간 동안 실온보다 낮지 않은 적정 온도에서 진동 에너지를 적용하기 위해 초음파 처리한다. 초음파 외에도, 마이크로파, 근적외선, 적외선 등, 또는 이들을 조합하여 조사시키는 것도 효과적이다. 조사는 연속적으로 또는 단속적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질은 이러한 물질이 전술한 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물을 함유하는 한 특별한 제한은 없다. 우론산 또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질의 예는 다음과 같다. 즉, 사과, 밀감류(예를 들면, 만다린 오렌지 및 레몬), 바나나, 내퍼 캐비지, 양배추, 상추, 페릴라, 호박, 셀러리, 우엉, 에철롯(echalote), 브로콜리, 그린 페퍼, 시금치, 양파, 당근, 당근잎, 다이콘(일본 무)잎, 차잎, 참깨, 콩류, 감자 등과 같은 쌍자엽 식물의 과일, 야채, 잎, 종자 등; 밀 및 벼와 같은 단자엽 식물의 곡물; 갈조류(예를 들면, 다시마 및 와카메 wakame 해초), 홍조류, 녹조류 및 단세포 녹조류와 같은 조류; 담자균류(예를 들면, 라이오파일럼 울마리움 Lyophyllum ulmarium, 라이오파일럼 디케이스츠 Lyophyllum decastes, 폴리오타 나메코 Pholiota nameko, 코티넬러스 시이타케 Cortinellus shiitake, 플라물리나 버루타이피스 Flammulina verutipes, 애거리쿠스 오스트레아투스 Agaricus ostreatus 및 패설리오타 캠페스트리스 Pasalliota campestris), 자낭균류(예를 들면, 코디셉스 밀리터리스 Cordyceps militaris 및 기타 코디셉스 종), 효모, 사상균(예를 들면, 애스퍼질러스 종) 및 세균(예를 들면, 바실러스 내토 Bacillus natto 및 유산균)과 같은 미생물; 및 돼지 피부, 소 피부, 상어 연골, 고래 연골 등을 포함한 척추동물 및 무척추동물과 같은 동물. 본 발명에 있어서, 전술한 식물, 미생물 또는 동물로부터 유도된 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 다음과 같은 농작물 및 수산물 또는 가공식품이 그 자체로 또는 건조/분쇄 후에 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물로서 사용될 수 있다. 이들은 과피, 과일의 걸러낸 찌꺼기(예를 들면, 사과 및 만다린 오렌지의 것들), 야채의 걸러낸 찌꺼기, 곡물의 걸러낸 찌꺼기(예를 들면, 사케(일본 곡주), 맥주, 소주(일본 증류주) 및 위스키의 제조시 수득된 것 들)), 콩의 걸러낸 찌꺼기(예를 들면, 오카라(일본 콩-경화 찌꺼기)) 및 해조류의 걸러낸 찌꺼기 등이다.
본 발명에 사용된 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질은 그 자체로 사용되거나 예비처리로서 끓임, 베이킹, 파칭(parching), 로우스팅, 데콕팅(decocting), 스티밍, 후라잉, 딥-후라잉 등과 같은 통상적인 공정에 투입할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질은 전술한 화학적, 효소적(미생물을 이용한 발효 포함) 또는 물리적 예비처리에 투입할 수 있으며 처리되어 생성되는 물질 또는 이러한 생성 물질로부터 제조된 정제 물질도 또한 사용될 수 있다.
우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질은 우론산, 우론산 유도체, 사이클로펜테논의 생산을 위한 중간체 및 사이클로펜테논과 반응성인 물질, 예를 들면, 아민, 아미노산, 펩타이드 및/또는 단백질을 함유하며, 사이클로펜테논 제조시 예비처리를 수행하는 것이 바람직하며 이렇게 함으로써 이러한 반응성 물질의 반응성의 적어도 일부가 소실 및/또는 이러한 반응성 물질의 적어도 일부가 제거된다. 건식가열이 바람직하기는 하지만 예비처리에는 특별한 제한이 없다. 예를 들면, 물을 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질로부터 제거시킨 다음 60 내지 400 ℃에서 수 초 내지 수 일 동안 가열하여 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드를 함유하는 물질을 수득한다. 단백질 등이 비가용화, 변성 또는 불활성화되는 본 발명의 사이클로펜테논 또는 이의 광학 활성 물질의 제조에 적합하다. 건식가열 처리법의 예로는 일본 공개 특허 공보 제 평-02/79965호에 언급된 고온 공기를 사용하는 로우스팅/파칭 처리가 있으며, 이러한 방법에 의해 다량의 가열처리 물질, 즉 로우스팅/파칭된 물질이 효율적으로 제조될 수 있다. 로우스팅/파칭된 물질에는 특별한 제한이 없으며 예를 들면, 로우스팅/파칭된 야채, 과일, 곡물, 버섯, 해조류, 피층 및 연골과 같은 로우스팅/파칭된 식물, 동물 및 미생물이 있다. 다른 예로는 사카라이드-함유 물질을 프로테아제로 처리한 다음 이로부터 분해된 단백질을 제거함으로써 제조되는 분획이 있다. 다른 예로는 사카라이드-함유 물질을 분쇄한 다음 물로 세척하여 수득된 분획, 사카라이드-함유 물질을 산으로 예비처리하여 수득한 분획 및 사카라이드-함유 물질을 알칼리로 예비처리하여 수득한 분획이 있다. 사이클로펜테논의 제조에 적당한 예비처리된 사이클로펜테논-생성 물질 모두 그 자체는 본 발명에 의해 정의되는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질에 포함된다.
사이클로펜테논 생산을 위한 중간체란 우론산, 우론산 유도체, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 및 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질의 가열처리 중에 생성되어 추가 반응시 사이클로펜테논으로 변화하는 물질을 의미한다. 사이클로펜테논 생산용 중간체의 예는 우론산, 우론산의 탈수물 및 우론산의 탈카복실화/탈수물이다.
우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물인 폴리사카라이드는 공지의 화학적, 효소학적 또는 물리적 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 펙틴의 경우, 예를 들면 감귤류 또는 사과의 과피로부터 추출된 고분자량 폴리사카라이드가 사용될 수 있다. 공업적 규모의 펙틴 제조를 위한 물질은 과일이며, 레몬 및 라임과 같은 감귤류의 쥬스 제조 후의 걸러낸 찌꺼기(대부분 내과피로 이루어짐) 외에도, 사과 쥬스 제조 후의 걸러낸 찌꺼기도 사용된다. 이러한 걸러낸 찌꺼기는 대부분 불용성 프로토펙틴을 함유하며 펙틴 제조과정 중에 가용화(추출)된다. 가용화는 산성을 띠는 온수 내지 고온수로 추출함으로써 수행될 수 있고, 추출시의 온도, pH 및 시간과 같은 조건이 출발물질의 유형에 따라 적절히 조절될 때, 예정된 분자량과 에스테르화도를 지닌 펙틴을 고수율로 제조할 수 있다. 추출물은 원심분리 또는 여과에 의해 정제한 다음 농축하고 여기에 알콜을 가하며 이에 따라 펙틴을 침전시키고 회수할 수 있다. 회수된 침전물을 건조시키고 분쇄하여 건조 펙틴을 제조한다.
펙틴의 주요 구조는 부분 메틸화된 갈락투론산 중합체이다. 카복실 그룹은 메틸 에스테르화되거나, 유리산으로 남거나 암모늄 염, 칼륨 염 또는 나트륨 염과 같은 염으로 된다. 메틸에스테르화도(DM; 메톡시 그룹 : 전체 카복실 그룹의 비)에 따라, 펙틴은 높은 DM을 갖는 HM 펙틴과 낮은 DM을 갖는 LM 펙틴으로 분류되며[참조문헌: "Handbook of Materials for Developing New Food Products" edited by Satoshi Yoshizumi, et al., published by K.K. Korin, pages 114-119 (1991)], 본 발명에 있어서, 식품 첨가제로서 시판되고 있는 펙틴[참조문헌: "Handbook of Natural Products", edited by Akio Toyama, et al., published by Shokuhin To Kagakusha, 12th Edition, page 138 (1993)], 시판 HM 펙틴 및 LM 펙틴 등(전술한 "Handbook of Materials for Developing New Food Products" 참조)이 사용될 수 있다.
합성수단에 의해 합성되는 우론산, 우론산 유도체, 올리고사카라이드 등도 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 가열처리 물질은 (a)우론산 또는 우론산 유도체, (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 물질을 출발물질로 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 사이클로펜테논이 생성될 수 있는 한은 본 발명에 사용된 가열처리 물질 제조시의 가열처리 방법에는 특별한 제한이 없다. 따라서, 예를 들면, 우론산, 우론산 유도체, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 또는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질을 60 내지 350℃에서 수 초 내지 수 일간, 또는 바람직하게는 80 내지 150℃에서 수 분 내지 수 일간 가열한다. 펙틴의 경우, 사이클로펜테논을 함유하는 가열처리 물질은 가열, 예를 들면 80 내지 150℃에서 수 분 내지 수 일간 가열하여 수득할 수 있다. 이와 달리, 우론산, 우론산 락톤 또는 우론산 에스테르를 60 내지 150℃에서 수 분 내지 수 일간 가열시킬 때, 사이클로펜테논을 함유하는 목적하는 가열처리 물질이 수득될 수 있다. 이러한 가열처리 물질은 트랜스-사이클로펜테논과 소량의 시스-사이클로펜테논을 함유하며, 여기에서 4 위치와 5 위치의 하이드록실 그룹은 각각 트랜스 및 시스 배치로 있다. 이러한 가열처리 물질로부터 정제된 사이클로펜테논을 무수 피리딘 중에서 아세트산 무수물과 반응시키고 생성되는 4,5-디아세틸사이클로펜테논을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한 다음 각각의 분획을 핵자기 공명에 의해 구조분석하였을 때, 트랜스-사이클로펜테논과 소량의 시스-사이클로펜테논이 이러한 가열처리 물질에 함유되어 있음이 확인된다.
가열처리시 pH에 대한 특별한 제한은 없으며 중성 내지 산성조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 가열처리하는 동안의 pH는 사용된 물질 유형에 따라 조정될 수 있지만, 통상적으로 사이클로펜테논의 생성은 산성조건하에서의 가열에 의해 촉진된다.
농도가 사이클로펜테논이 생성될 수 있도록 하는 범위내에 있는 한은 가열처리시 물질의 농도에는 특별한 제한이 없으며, 이들은 작업성, 수율 등을 감안하여 설정될 수 있다.
본 발명에서의 가열처리는 습식가열 또는 건식가열 일 수 있지만 본 발명의 사이클로펜테논의 생산 효율면에서 볼 때 습식가열이 바람직하다. 습식가열의 경우, 증기가열, 고압 증기가열, 고압가열 등과 같은 여타 습식가열법이 사용될 수 있으며, 반면에 건식가열의 경우, 건조고온 공기를 이용한 직접가열 및 구획을 통한 열원으로부터의 간접가열과 같은 여타 건식가열법이 사용될 수 있다. 직접가열의 예로는 공기 스트림에 의한 건식가열 및 분무에 의한 건식가열이 있으며 간접가열로는 드럼 등에 의한 건식가열이 있다.
본 발명에 사용된 가열처리 산물내 사이클로펜테논은 항암작용, 항균작용, 아폽토시스-유도작용 등을 지표로 이용하여 수집해 낼 수 있다. 수집수단의 경우, 화학적 방법 및 물리적 방법과 같은 공지의 여타 정제 및 분리수단이 사용될 수 있다. 따라서, 겔 여과, 분자량 분별막을 이용한 분별, 용매추출, 분별증류, 이온 교환 수지, 순상 또는 역상의 각종 크로마토그래피법 등과 같이 이미 공지되어 있는 정제방법을 함께 사용함으로써 가열처리 물질에 생성된 사이클로펜테논이 수집될 수 있다.
예를 들면, D-글루쿠론산이 우론산으로 사용되고 이의 1 % 용액이 121℃에서 4 시간 동안 가열될 때, 사이클로펜테논이 가열처리 물질에 생성된다. 이러한 가열처리 물질내의 사이클로펜테논을 용매로 추출하며 추출물을 농축시킨다. 이어서, 이 농축 추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하고, 용출된 사이클로펜테논 분획을 농축한 다음 사이클로펜테논을 농축물로부터 클로로포름으로 추출하여 가열처리 물질내 사이클로펜테논을 분리해낸다.
다른 방법으로, 전술한 가열처리 글루쿠론산을 이온 교환 수지 칼럼, 바람직하게는 음이온 교환 수지 칼럼으로 처리하고, 비-흡착 분획을 수집하여 사이클로펜테논을 정제한다. 다른 대안으로, 전술한 가열처리 글루쿠론산을 활성탄 칼럼으로 처리하고, 비-흡착 분획을 제거한 다음 칼럼을 세척하고 에탄올 수용액(바람직하게는, 농도 40% 이상의 에탄올 수용액)과 같은 친수성 유기 용매로 용출시킴으로써 정제된 사이클로펜테논을 수득한다. 이러한 방법을 조합할 경우, 고순도의 사이클로펜테논이 수득될 수 있다.
분리해 낸 사이클로펜테논을 광학 분할할 경우, 본 발명의 (-)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및 (+)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온이 수득될 수 있다. 물론 합성방법에 의해 수득된 사이클로펜테논도 본 발명에 의해 광학 분할시킬 수 있다.
광학 활성 물질의 분리는 라세미체 혼합물을 기계적 분할, 우선 결정화, 부분입체이성체 염 또는 봉입 화합물로서의 결정화에 의한 분할, 효소 또는 미생물을 이용한 동역학적 분할, 크로마토그래피에 의한 분할 등에 의해 수행될 수 있다.
크로마토그래피 분할의 경우 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등이 사용될 수 있으며 이들 각각에 적합한 키랄 고정상이 이용될 수 있다.
키랄 고정상을 이용하는 방법, 키랄 용출물을 이용하는 방법, 부분입체이성체로서의 분리 등이 액체 크로마토그래피에 의한 광학 분할에 이용될 수 있다.
아미드형의 고정상, 우레아형의 고정상, 리간드 교환형의 고정상, 폴리사카라이드-폴리사카라이드 유도체 고정상, 단백질 고정상, 폴리메타크릴산 에스테르 고정상, 폴리메타크릴아미드 고정상 등이 키랄 고정상으로서 사용될 수 있다.
용출액으로는, 헥산형, 알콜형, 수성(완충제)형 등의 것이 전술한 고정상과 함께 고려에 넣어 적절히 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 사이클로펜테논의 제조방법은 임의 방법일 수 있다. 따라서, 사이클로펜테논은 본 발명에 기술된 방법에 의해 또는 화학적 합성방법[참조문헌:Carbohydrate Research, volume 247, pages 217-222 (1993)]; [참조문헌:Helvetica Chimica Acta, volume 55, pages 2838-2844 (1972)]에 의해 제조될 수 있으며 사이클로펜테논의 트랜스- 및 시스- 화합물이 본 발명에 사용된다. 물론, 화학적 합성방법에 의해 수득된 사이클로펜테논의 광학 활성 물질도 본 발명의 광학 활성 물질에 포함된다. 또한, 우론산, 우론산 유도체, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 적어도 하나의 가열처리 물질에 생성되는 사이클로펜테논과 이의 정제산물 및 이들의 광학 활성 물질이 또한 사용될 수 있다.
사이클로펜테논 및 이의 광학 활성 물질은 인간 전골수성 백혈병 세포 HL-60, 인간 급성 림프아구성 백혈병 세포 MOLT-3, 폐암세포 A-549, SV40-형질전환된 폐암세포 WI-38VA13, 간암세포 Hep G2, 결장암 세포 HCT 116, 인간 결장암 세포 SW 480, 인간 결장암 세포 WiDr, 위암세포 AGS 및 골수암 세포와 같은 암세포에 대한세포 성장 억제작용 및 항암작용을 보인다. 따라서, 사이클로펜테논 및 이의 광학 활성 물질은 항암제의 유효성분으로서 사용될 수 있다. 이들은 또한 이러한 암 세포에 대한 아폽토시스-유도작용도 있다. 본 발명의 사이클로펜테논 및 이의 광학 활성 물질의 암 세포 성장 억제에 대한 작용 메커니즘은 결코 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 예를 들면, 암 세포에 대한 아폽토시스 유도작용은 본 발명에 포함된다.
항암작용이 있는 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 사용하여 공지의 약학 담체와 배합하여 약제로 조제될 때, 비로서 항암제의 제조가 가능하게 된다. 일반적으로, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 약학적으로 허용되는 액체 또는 고체 담체와 배합되며, 필요에 따라 용매, 분분말제, 유화제, 완충제, 안정제, 충진제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등이 여기에 첨가되어 정제, 과립제, 희석 분말제, 분말제, 캡슐제 등과 같은 고형제, 또는 액제, 현탁제, 에멀션제 등과 같은 액제일 수 있는 항암제를 생성한다. 또한, 이는 사용에 앞서 적당한 담체를 첨가함으로써 액상으로 만들 수 있는 건조 제제 형태일 수 있다.
약학 담체는 제제의 전술한 투여 방식 및 형태에 따라 선택될 수 있다. 경구용 제제의 경우, 전분, 락토스, 설탕, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분, 무기염 등이 사용될 수 있다. 경구용 제제의 제조시, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 유동성 촉진제, 미각-교정제, 착색제, 향미제 등이 추가로 배합될 수 있다.
한편, 비경구용 제제의 경우, 이들은 본 발명의 유효성분인 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 주사용 증류수, 생리 식염수 용액, 글루코스 수용액, 주사용 식물성 오일, 호마유, 낙화생유, 대두유, 콘 오일, 프로필렌 글리콜 등과 같은 희석제에 용해시키거나 현탁시킨 다음, 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장제, 진통제 등을 첨가하는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항암제는 제제 형태에 따라 적당한 경로로 투여된다. 물론, 투여방법에는 특별한 제한이 없으며 내용, 외용 및 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 투여 등이 되며, 반면에 외용제로는 좌제 등이 포함된다.
항암제로서의 용량은 제제 형태, 투여방법, 사용 목적 및 치료하고자 하는 환자의 연령, 체중 및 증상에 의해 적절히 결정되며, 일정한 것은 아니지만, 제제에 함유된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 양은 통상적으로 0.1 ㎍ 내지 200 mg/kg/일(성인의 경우)이다. 물론, 용량은 각종 조건에 따라 다양할 수 있으며, 따라서 어떤 경우에는 상기의 양 이하의 용량으로도 충분할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 상기의 양 이상의 용량이 필요할 수 있다. 본 발명의 약제는 직접 경구 투여될 수 있으며, 또한 약제가 일상적으로 섭취될 수 있도록 식품 및 음료에 첨가될 수 있다.
사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 항암작용이 있고, 저농도에서도 암 세포의 분화 유도능을 보이므로 암 세포에 대한 분화 유도제(제암제)로서 유용하다. 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 함유하는 암 세포 분화 유도제는 전술한 방법에 따라 항암제용 약제로 조제될 수 있으며 항암제에 대한 방법과 유사한 방법으로 투여될 수 있다.
암세포 분화 유도제로서의 용량은 제제 형태, 투여방법, 사용 목적 및 치료하고자 하는 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 적당히 결정되며, 일정한 것은 아니지만 통상적으로는, 제제에 함유되는 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 양은 0.1 ㎍ 내지 100 mg/kg/일(성인의 경우)이다. 물론, 용량은 각종 조건에 따라 다양할 수 있으며, 따라서 어떤 경우에는 상기의 양 이하의 용량으로도 충분할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 상기의 양 이상의 용량이 필요할 수 있다. 본 발명의 약제는 직접 경구 투여될 수 있으며, 또한 약제가 일상적으로 섭취될 수 있도록 식품 및 음료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 암 세포 분화 유도제는 암 세포 분화 유도방법에 사용될 수 있다. 따라서, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 유효성분으로 사용될 때, 암 세포를 분화시키는 것이 가능하며 이러한 방법은 암 세포 분화 유도 메커니즘의 규명, 분화 유도제의 스크리닝 등에 유용하다.
사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 유효성분으로 사용되어 공지의 약학 담체와 배합하여 약제로 조제될 때, 비로서 본 발명의 항균제의 제조가 가능하게 된다. 일반적으로, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 약학적으로 허용되는 액체 또는 고체 담체와 배합되며, 필요에 따라 용매, 분분말제, 유화제, 완충제, 안정제, 충진제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등이 여기에 첨가되어 정제, 과립제, 희석 분말제, 분말제, 캡슐제 등과 같은 고형제, 또는 액제, 현탁제, 에멀션제 등과 같은 액체 제제를 생성한다. 또한, 이는 사용에 앞서 적당한 담체를 첨가함으로써 액체로 조제될 수 있는 건조 제제 형태일 수 있다.
약학 담체는 전술한 투여 방식 및 제제 형태에 따라 선택될 수 있다. 경구용 제제의 경우, 전분, 락토스, 설탕, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분, 무기염 등이 사용될 수 있다. 경구용 제제의 제조시, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 유동성 촉진제, 미각-교정제, 착색제, 향미제 등이 추가로 배합될 수 있다.
한편, 비경구용 제제의 경우, 이들은 본 발명의 유효성분인 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 주사용 증류수, 생리 식염수 용액, 글루코스 수용액, 주사용 식물성 오일, 호마유, 낙화생유, 대두유, 콘 오일, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 희석제에 용해시키거나 현탁시킨 다음, 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장제, 진통제 등을 첨가하는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항균제는 제제 형태에 따라 적당한 경로로 투여된다. 투여방법에는 또한 특별한 제한이 없으며 내용, 외용 및 주사에 의해 투여될 수 있다. 주사는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 투여 등이 되며, 반면에 외용제로는 좌제 등이 포함된다.
항균제로서의 용량은 제제 형태, 투여방법, 사용 목적 및 치료하고자 하는 환자의 연령, 체중 및 증상에 의해 적절히 결정되며, 일정한 것은 아니지만, 통상적으로, 제제에 함유된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 양은 10 ㎍ 내지 20 mg/kg/일(성인의 경우)이다. 물론, 용량은 각종 조건에 따라 다양할 수 있으며, 따라서 어떤 경우에는 상기의 양 이하의 용량으로도 충분할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 상기의 양 이상의 용량이 필요할 수 있다. 본 발명의 약제는 직접 경구 투여될 수 있으며, 또한 약제가 일상적으로 섭취될 수 있도록 식품 및 음료에 첨가될 수 있다. 추가로, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 물질은 항균식품 및 음료용 재료로서 사용될 수 있다. 또한, 이들은 에탄올, 글라이신, 나트륨 아세테이트, 아스코브산, 글리세롤 지방산 에스테르, 염, EDTA 및 기타 항생물질과 함께 사용될 수 있다.
사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 항균제는 식품 또는 음료의 보존성 향상을 위한 방부제로서 사용될 수 있다. 또한, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 식품 또는 음료에 첨가되어 식품 또는 음료 방부제 제조방법에 사용될 수 있다.
사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 식품 또는 음료에 첨가될 때 이를 함유하는 항균제의 형태는 액체, 페이스트, 분말, 플레이크, 과립 등의 형태일 수 있다. 용이한 조작 또는 기타 첨가제와 혼합하여 사용하는 것이 고려될 때, 건조에 의해 제제를 분말, 플레이크 또는 과립상으로 만드는 것이 바람직하다. 건조방법의 경우, 분무 건조, 드럼 건조, 쉘프 건조, 진공 건조, 동결 건조 등과 같은 통상적으로 사용되는 것이 사용될 수 있다.
식품 또는 음료에 첨가될 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 양은 식품 또는 음료 유형에 따라 다양할 수 있고 목적과 부합되는 양이 사용될 수 있다.
본 발명의 항균제 제조방법 중 하나는 제제를 식품 또는 음료에 적당한 방법에 의해 첨가하는 것이다. 첨가방법에는 특별한 제한이 없지만, 궁극적으로는 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 임의 수단에 의해 식품 또는 음료에 함유되어 있으면 된다. 따라서, 본 발명의 항균제 사용시, "첨가"란 용어는 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 식품 또는 음료에 포함되도록 하는 모든 방법을 포함한다. 비록, 통상의 방법에 의해 식품 또는 음료 제조단계 중에 첨가되지만, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 용액에 식품을 침지시키는 방법도 사용될 수 있다. 식품을 용액에 침지시키는 방법과 함께 식품에 첨가하는 방법을 수행하는 것도 가능하다. 침지법에 적당한 식품은 예를 들면, 어류 또는 축산육 페이스트(예를 들면, 카마보코[끓인 어류 페이스트] 및 비엔나 소시지), 국수(예를 들면, 끓인 국수) 및 냉동전 어패류, 및 새우의 동결제품과 같이 수중에서도 자체 형상을 잃지 않는 식품이다.
본 발명의 항균제가 방부제로 사용될 때, 식품 또는 음료의 보존성은 더욱 향상될 수 있다. 동결 식품 및 동결 디저트의 경우, 냉동전 가공단계에서 오염 미생물의 성장이 억제될 수 있어 위생면에서 매우 호적한 결과가 수득될 수 있다. 본 발명의 항균제는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에 효과적이고, 예를들면, 메티실린- 내성균인 스태필로코커스 아우레우스와 같은 내약성 세균 및 살모넬라, 엔테로톡신-생성 스태필로코커스 아우레우스, 구토형 바실러스 세레우스, 설사형 바실러스 세레우스 및 장출혈성 이. 콜라이 O-157과 같은 식중독을 일으키는 세균에 매우 효과적이다. 화락균(hiochi)에도 또한 효과적이다. 또한, 본 발명의 항균제는 레지오넬라 뉴모필라(ATCC 33153), 비브리오 파라헤모리티쿠스(ATCC 17802), 헬리코박터 파일로리(NCTC 11637), 캠필로박터 제주니(ATCC 29428) 등을 포함한 레지오넬라 뉴모필라(레지오넬라 병을 일으키는 미생물), 비브리오 파라헤모리티쿠스(식중독을 일으키는 미생물), 헬리코박터 파일로리(궤양을 일으키는 미생물), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni, 위장염을 일으키는 미생물) 등과 같은 미생물에 의해 야기되는 질환을 일으키는 미생물에 대한 항균작용을 보인다. 본 발명의 항균제는 또한 효모 및 진균과 같은 미생물에도 효과적이다. 천연식품으로부터 유도된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 방부제는 천연의 식중독 예방제 및 멸균제로서 특히 고도로 유용하다. 첨언하면, 의복, 침대 시이트 등의 멸균은 본 발명의 항균제를 사용하여 수행될 수 있으며, 본 발명의 항균제가 살포되거나 본 발명의 항균제로 박멸할 때, 멸균 대상 물체를 멸균시키는 것(제균 및 살균 모두)이 가능하다. 예를 들면, 사무실용 대형 빌딩의 에어 컨디셔닝수에 첨가될 때, 레지오넬라 병이 예방될 수 있다.
본 발명의 항균제는 충치균 및 치근막 질환균에 대한 항균 활성을 보이며 본 발명의 항균제를 함유하는 구내용 제제가 제공될 수 있다. 구내용 제제의 예는 치마제이다. 치마제는 액체, 페이스트 또는 분말과 같은 공지의 형태일 수 있다. 치마제내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 양에는 특별한 제한이 없으며, 충치균 및 치근막 질환균에 대한 유효농도가 함유되어 있으면 충분하다. 보습제, 계면활성제, 결합제, 방향제, 감미제 등과 같은 공지의 첨가제가 치마제에 첨가될 수 있다. 본 발명의 치마제의 유효성분으로는, 가열처리 야채, 과일 등과 같은 사이클로펜테논-함유 물질이 또한 사용될 수 있으며 치마제와 같이 사이클로펜테논을 함유하는 가열처리 산물을 함유하는 구내용 제제가 또한 본 발명의 범위내에 포함될 수 있다.
본 발명의 항균제를 사용하여 항균 화장품을 제공하는 것이 가능하다. 본 발명의 화장품의 예는 크림, 밀크 로션, 로션, 세안재 및 팩과 같은 기초 화장품; 립스틱 및 화운데이션과 같은 메이크업 화장품; 바디 소우프 및 유효량의 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 비누 형태이다. 본 발명의 화장품은 두발에도 또한 유용하며 헤어 토닉, 헤어 리퀴드, 헤어 셋 로션, 헤어 블로잉 제제, 헤어 크림 및 헤어 코트와 같은 두발 용품; 및 샴푸, 린스 및 헤어 트리트먼트와 같은 헤어 토일레트리 용품을 포함한 헤어 케어 제품으로 만들 수 있다. 통상적으로, 화장품 안의 양은 화제품 제제 100 부내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질 약 10-3내지 10 부(중량부, 이하 동일), 또는 바람직하게는 10-2내지 1 부이다. 기타 성분의 경우, 화장품과 통상적으로 배합되는 것들이 사용될 수 있다. 본 발명의 화장품은 아토피성 피부염을 일으키는 미생물에 효과적으로 작용하며 아토피성 피부염의 개선 및 예방에 상당한 효과를 보인다.
또한, 본 발명의 항균제를 사용하여 목욕제를 제공하는 것도 가능하다. 본 발명의 목욕제는 유효량의 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 분말, 과립, 고체, 액체 등의 형태로 조제될 수 있다. 목욕제에 배합되는 양은 목욕제 100 부내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질 통상적으로 약 10 내지 100부(중량부, 이하 동일), 또는 바람직하게는 20 내지 90 부이다. 이와 같이 제조된 목욕제 약 5 내지 25 g이 통상적으로 고온수 200 리터에 첨가된다. 목욕제를 위한 기타 성분으로는, 목욕제와 통상적으로 배합되는 것들이 사용될 수 있다. 본 발명의 목욕제는 아토피성 피부염을 일으키는 미생물에 효과적으로 작용하며 아토피성 피부염의 개선 및 예방에 상당한 효과를 보인다. 욕실로부터의 병원성 미생물 박멸에도 효과적이다.
이와 같이 본 발명은 약제, 화장품 및 목욕제로 유용한 항균제를 제공한다. 또한, 사이클로펜테논을 함유하는 식품 또는 음료 등은 식중독, 위장염 등의 개선 및/또는 예방에도 매우 유용하다.
본 발명의 아폽토시스 유도제는 아폽토시스-유도성 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 함유한다. 이는 전술한 항암제의 경우에서와 동일한 방식으로 약제로 조제될 수 있으며 항암제에서와 동일한 방법에 의해 투여된다.
아폽토시스 유도제로서의 용량은 특별히 규정되지는 않지만, 용량 형태, 투여방법, 사용 목적, 유도제가 투여되는 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 적당히 결정된다. 그러나, 통상적으로는, 성인의 경우 제제에 함유되는 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 양은 0.1 ㎍ 내지 100 mg/kg/일이다. 물론, 용량은 각종 요인에 따라 다양할 수 있으며, 따라서 어떤 경우에는 상기의 양 이하의 용량으로도 충분할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 상기의 양 이상의 용량이 필요할 수 있다. 본 발명의 약제는 그 자체로 경구 투여될 수 있으며, 또한 약제는 일상 식품 및/또는 음료에 첨가된 후 일상적으로 섭취될 수 있다.
세포의 병원성 치사인 괴사와는 달리, 아폽토시스는 세포 자신의 유전자에 초기에 통합되는 치사인 것으로 추측된다. 따라서, 아폽토시스를 프로그램하는 유전자는 특정 외부 또는 내부 원인에 의해 활성화되어 프로그램된 치사 유전자 단백질이 상기 유전자에 기초하여 생합성되고 이어서 세포 자신은 생성되는 프로그램된 치사 단백질에 의해 분해되고 사멸된다.
본 발명의 아폽토시스 유도제는 목적하는 조직 및 세포에서 그러한 아폽토시스를 발현할 수 있고 자연상태에서 불필요하거나 병원성인 세포를 살아있는 유기체로부터 배제할 수 있으므로 매우 유용하다.
본 발명의 아폽토시스 유도제는 아폽토시스 유도방법에 사용될 수 있다. 따라서, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 유효성분으로 사용될 때, 아폽토시스를 유도하는 것이 가능하고 이러한 방법은 예를 들면, 아폽토시스 유도 메커니즘의 규명 및 아폽토시스 유도제 및 아폽토시스 유도 억제제의 스크리닝에 유용하다.
본 발명의 항균 식품 또는 음료에는 특별한 제한이 없으며 이의 예로는 예를 들면, 가공 곡류(예를 들면, 가공 밀가루, 가공 전분, 가공 예비혼합물, 국수, 마카로니, 빵, 콩 페이스트, 소바[메밀국수], 후[밀-글루텐 빵], 비이푼[쌀가루로 만든 중국 국수], 하루사메[콩 젤리 스틱] 및 포장 라이스 케이크), 가공 지방/오일(예를 들면, 가요성 지방/오일, 딥 후라이용 오일, 샐러드 오일, 마요네즈 및 드레싱), 가공 대두(예를 들면, 두부[대두 커드], 미소[대두 페이스트] 및 낫토[발효 대두]), 육가공품(예를 들면, 햄, 베이컨, 압축 햄 및 소시지), 수산품(냉동 어류 페이스트, 카마보코[끓인 생선 페이스트], 치쿠와[어류 페이스트 제품의 일종], 함펜[갈아만든 생선 케이크], 사츠마-아게[튀긴 생선 볼], 츠미레[증기로 찐 생선 볼], 스지[끓인 날 생선 페이스트], 어육 햄, 소시지, 건조 보니토, 가공 어란 제품, 생선 통조림 제품 및 츠쿠다니[간장에서 끓인 식품], 유제품(예를 들면, 원유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 응축 우유, 분유 및 아이스 크림), 가공 야채 및 과일 제품(예를 들면, 페이스트, 잼, 피클, 과일 음료, 야채 음료 및 혼합 음료), 제과류(예를 들면, 쵸콜릿, 비스킷, 번, 케이크, 모치가시[쌀 볼 케이크] 및 쌀 크래커), 알콜 음료(예를 들면, 사케[일본술], 중국술, 와인, 위스키, 소주[일본 증류주], 보드카, 브랜디, 진, 럼, 맥주, 알콜성 청량음료, 과실주 및 독주), 기호품(예를 들면, 녹차, 차, 우롱차, 커피, 청량음료 및 유산균 음료), 조미료(예를 들면, 간장, 우스터 소스, 식초 및 미린(단 일본 곡주), 통조림, 병조림 또는 자루에 넣은(bagged) 식품(예를 들면, 양념 쇠고기와 곁들인 쌀밥, 가마메시[작은 솥에 넣어 익힌 쌀밥, 세키한[명절용 붉은 쌀밥], 카레 라이스 및 기타 조리 완료된 식품), 반-건조 또는 농축 식품(예를 들면, 리버 페이스트 및 기타 스프레드, 소바 및 우동[둘다 전형적인 일본 국수] 수프 및 농축 수프), 건조 식품(예를 들면, 인스턴트 국수, 인스턴트 카레, 인스턴트 커피, 분말 쥬스, 분말 수프, 인스턴트 대두 페이스트 수프, 레토르트 식품, 레토르트 음료 및 레토르트 수프), 냉동식품(예를 들면, 동결 스키야키, 차완무시[폿-스티밍 잡탕찜], 카바야키[그릴링한 장어], 햄버그 스테이크, 중국 샤오-마이, 교자[잘게 저민 돼지고기로 채운 후라이드 덤플링], 각종 스틱 및 과일 칵테일), 고형식품, 액체식품(예를 들면, 수프) 및 스파이스와 같은 가공 농산물 및 임산물, 가공 축산물, 가공 수산물 등이 있다.
본 발명의 식품 및 음료의 제조방법에는 특별한 제한이 없지만, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 제조 식품 또는 음료에 함유되어 있는 한 식품 및 음료의 조리, 가공 및 통상적으로 사용되는 제조법이 적용될 수 있다.
조리 및 가공은 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 (a)우론산 또는 우론산 유도체, (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 물질의 가열처리 산물에 함유되도록 하는 방식으로 수행되어야 한다.
따라서, 조리/가공 전, 동안, 후에, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 (a)우론산 또는 우론산 유도체, (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 (c)사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 물질의 가열처리 산물을 첨가할 수 있거나, 이와 달리, 조리/가공품 또는 이의 재료를 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 (a)우론산 또는 우론산 유도체, (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질 중에서 선택된 물질의 가열처리 산물에 첨가하여 가열처리 물질내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 희석시킬 수 있다.
이어서, 식품 또는 음료의 제조시, 가열처리는 단계 중 아무 때나 수행될 수 있어, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 가열처리 물질에 함유되도록 할 수 있거나, 이와 달리 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 가열처리 물질을 거기에 첨가할 수 있다. 또한, 가열처리 물질내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 희석될 수 있도록 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 가열처리 물질에 식품, 음료 또는 이의 재료를 첨가하는 것이 가능하다. 첨가는 한번에 또는 수 차례 나누어 수행될 수 있다. 따라서, 신규한 생리작용을 보이는 식품 또는 음료가 용이하고 편리하게 제조될 수 있다. 첨언하면, 제조 중에 (a)우론산 또는 우론산 유도체, (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 및 (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질을 가한 후 구성성분으로서 제조 중에 생성된 가열처리 물질내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 식품 또는 음료 또한 본 발명에 포함된다. 임의의 단계가 적용되는 경우, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 함유, 첨가 및/또는 희석되는 식품 또는 음료는 본 발명의 식품 또는 음료로서 정의된다.
식품에 함유된 생리작용을 지닌 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 함량에는 특별한 제한은 없지만, 함량은 관능성과 항암제 및 항균작용과 같은 생리활성의 견지에서 적절히 선택될 수 있다. 그러나, 예를 들면, 식품 100 부내 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 함량은 5 x 10-6부 이상이고, 식품으로서의 관능성 및 생리작용의 견지에서는 바람직하게는 10-5내지 5 부, 더욱 바람직하게는 10-4내지 2 부이다.
음료에 함유된 생리작용을 지닌 사이클로펜테논의 함량에는 특별한 제한은 없지만, 함량은 관능성과 항암제 및 항균성과 같은 생리활성의 견지에서 적절히 선택될 수 있다. 그러나, 예를 들면, 음료 100 부내 사이클로펜테논의 함량은 5 x 10-6부 이상이고, 음료의 관능성 및 생리작용의 견지에서 바람직하게는 10-5내지 5 부, 더욱 바람직하게는 10-4내지 2 부이다.
항암제 및 항균 활성과 같은 생리작용이 있는 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있는 한 본 발명의 식품 또는 음료의 형태에는 특별한 제한이 없다. 따라서, 이러한 형태에는 정제, 과립제, 캡슐, 겔 및 졸과 같은 경구 섭취 가능한 것이 포함된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 사용된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 저비용으로 제조될 수 있고, 이의 다양한 생리학적 기능에 기인하여, 이들은 식품 또는 음료 첨가제로서 사용될 수 있어, 다양한 생리학적 기능, 항균 활성, 아폽토시스-유도작용, 항암작용 등을 식품과 음료에 부여하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 식품 또는 음료 첨가제로서 매우 유용하다.
본 발명에 사용된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 임의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 이들은 본 발명에 기재된 방법이나 화학적 합성방법으로 제조할 수 있다. 따라서, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 식품, 음료, 항균제, 항암제, 암 세포 분화 유도제 및 아폽토시스 유도제 모두 본 발명에 포함된다. 또한, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 사용하는 암 세포 분화 유도방법 및 아폽토시스 유도방법 모두 또한 본 발명에 포함된다.
사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 100 mg/kg 경구투여로 마우스에 독성을 보이지 않는다.
전술한 바와 같이, 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 저비용으로 용이하게 제조될 수 있고, 이의 다양한 생리학적 기능에 기인하여 약제 및 식품을 포함한 광범위 분야에 매우 유용한 화합물이다.
본 발명은 이하에서 하기 실시예로 더욱 상세히 설명되지만 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다. 아울러, 실시예에서 사용된 용어 % 및 "부"는 달리 언급하지 않는 한 중량 기준이다.
실시예 1
(1)사과로부터 제조된 시판 펙틴을 물에 용해시켜 1% 농도로 만들고 용액을 환류 냉각기가 구비된 가지형 플라스크에 넣어 110 내지 120℃에서 18, 42 및 66 시간 유지시킨 오일조에서 가열시킨다. 가열 중 펙틴용액의 온도는 100 내지 102℃이다.
펙틴 용액을 원심분리하여 침전물을 제거한 다음 상등액을 물로 3배 및 10배 희석하여 샘플을 제거한다. 이어서, 가열처리 산물을 NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하고 후술되는 MTT법을 이용하여 인간 전골수성 백혈병 세포(HL-60 세포)(ATCC CCL-240)에 대한 세포 성장 억제작용을 측정한다.
따라서, 희석 샘플 10 ㎕ 및 56℃에서 30 분 처리한 10% 태 송아지 혈청(Gibco 제조)을 함유하는 RPMI 1640 배지내 37℃에서 배양시킨 5000 HL-60 세포를 함유하는 RPMI 1640 배지(Nissui 제조) 100 ㎕를 96-웰 미세역가판의 웰에 가하고, 5% 이산화탄소 존재하 37℃에서 48 시간 배양한 다음, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma 제조) 5 mg/ml를 함유하는 포스페이트 완충 식염수 10 ㎕를 가하고, 혼합물을 추가로 4 시간 배양한 다음 세포의 성장상태를 현미경하에 관찰한다. 아울러, 0.04N HCl을 함유하는 2-프로판올 100 ㎕을 가하여 혼합물을 잘 교반하고 590 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 성장도로서 사용한다.
그 결과, 18 시간 가열 펙틴의 3배 희석액 첨가 분획 및 42 및 66 시간 가열 펙틴의 3배 및 10배 희석액 첨가 분획에서 어떠한 생존 세포도 관찰되지 않았으며, 그러한 희석 농도에서, 100℃에서 가열한 펙틴은 세포 성장에 대한 억제활성을 보였다.
한편, 18 시간 가열 펙틴의 10배 희석액 첨가 분획에서는, 거의 모든 세포가 생존을 지속하였으며, 대조군으로 사용된 물 첨가 분획에 비하여 590 nm에서의 흡광도는 낮았다.
(2)100℃에서 18 내지 66 시간 가열한 펙틴 200 ㎕에 메탄올(200 ㎕)을 가한 다음 혼합하고, 혼합물을 원심분리하여 상등액 200 ㎕을 진공 농축건고시킨다. 이를 메탄올의 50% 수용액 10 ㎕에 용해시키고 이 중 1 ㎕를 실리카겔 60 시이트 F254(Merck 제조)에 스포팅하여 전개용매(부틸 아세테이트, 아세트산 및 증류수의 3:1:1 혼합물의 상부층)으로 전개시킨다. 전개 후 박층 실리카겔을 건조시키고, AgNO3-NH3용액(0.1M AgNO3와 5N NH3의 동량 혼합물)으로 분무한 다음 가열하여 스폿을 검출한다. 그 결과, Rf = 약 0.3 부근의 스폿이 18 시간 가열한 펙틴에서 나타나고, 18 시간 가열한 펙틴에 비해 42 시간 가열한 펙틴에서 증가가 보이며, 66 시간 가열한 펙틴의 경우, 증가량은 42 시간 가열한 펙틴에서와 거의 동일하다.
(3)실시예 1(1)에서 언급한 100℃에서 66 시간 가열한 펙틴 1 ml에 메탄올(1 ml)을 가한 다음 혼합하고 원심분리하여 상등액을 수득한다. 이를 진공 농축건고하여 잔사를 메탄올 100 ㎕에 현탁시킨다. 이 현탁액을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 상등액을 실리카겔 60 시이트 F254에 스포팅한 다음 실시예 1(2)에서 언급한 용매를 사용하여 전개시킨다. 박층 일부를 절단하여 실시예 1(2)의 방법으로 착색하여 Rf =약 0.3 부근에서의 스폿 출현을 확인하고 이러한 Rf 값에 상응하는 실리카겔 부분을 비착색 박층으로부터 긁어낸다.
긁어낸 실리카겔을 각각 메탄올 1 ml로 3회 추출하고 추출물을 진공 농축건고하여 Rf 값이 약 0.3인 스폿을 분리시킨다. 이 건조된 물질을 물 250 ㎕에 용해시키고, 용액을 10배 추가 희석하여 희석액 10 ㎕를 실시예 1(1)에서 언급한 MTT법에 의해 HL-60 세포에 대한 세포 성장 억제 활성 측정을 위한 샘플로 사용한다.
그 결과 물이 첨가된 웰의 경우, 세포의 대부분은 성장한 반면에, 이러한 희석액이 첨가된 웰의 경우, 어떠한 생존 세포도 관찰되지 않았다. 따라서, 암 세포 성장에 대한 이러한 긁어낸 분획의 억제작용이 확인되었다.
(4)DX302 질량 스펙트로미터(Nippon Denshi 제조)로 실시예 1(3)에서 분리한 Rf = 0.3 부근의 암 세포 성장 억제 물질의 질량 분광분석을 수행한다. 또한, 용매로서 헤비 클로로포름을 이용하여 핵자기 공명법 (NMR)에 의해 구조 분석을 수행한다. 사용된 NMR 장치는 JNM-A500(Nippon Denshi 제조)이다. 결과는 다음과 같다.
FAB-MS m/z 115 [M+H]+
글리세롤을 매트릭스로 사용한다.
1H-NMR (CDCl3): δ4.20 (1H, d, J = 2.4 Hz, 5-H), 4.83 (1H, m, 4-H), 6.30 (1H, dd, J = 1.2, 6.1 Hz, 2-H), 7.48 (1H, dd, J = 2.1, 6.1 Hz, 3-H).
첨언하면,1H-NMR의 화학 쉬프트 값은 CHCl3의 화학 쉬프트 값이 7.26 ppm이 되도록 주어진다.
이러한 값은 문헌[참조:T. Ahmad, et al. in Carbohydrate Research, Volume 247, pages 217-222 (1993)]에 보고된 트랜스-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 대한 데이터와 일치한다.
도 1은 질량 스펙트럼을 도시하며, 여기에서 종좌표는 상대 강도(%)이고 횡좌표는 m/z 값이다.
도 2는1H-NMR 스펙트럼을 도시하며, 여기에서 종좌표는 시그널 강도이며 횡좌표는 화학 쉬프트 값(ppm)이다.
실시예 2
(1)알긴산(비-팽윤성; Wako Pure Chemicals 제조)(25 g)을 물 475 ml에 현탁시키고, 121℃에서 2 시간 가열한 다음 원심분리하며, 생성되는 상등액을 0.22 ㎛의 막 필터를 통해 여과시켜 여액을 20 ml가 될 때까지 진공농축한다. 이를 에탄올 180 ml와 혼합하여, 20℃에서 1 시간 정치시킨 다음 원심분리하여 상등액을 수득한다. 상등액을 진공농축하여 20 ml가 되게 하고, 아세토니트릴 180 ml를 가하여, 혼합물을 원심분리한 다음, 생성되는 상등액을 진공농축하여 20 ml가 되게 하고, 아세토니트릴 180 ml를 가한 후 농축액을 다시 원심분리하여 상등액을 진공농축하여 15 ml가 되게 한다. 농축용액(4 ml)을 진공농축하여 약 400 ㎕가 되게 하고 부틸 아세테이트, 아세트산 및 물의 3:2:2 혼합물로 이루어진 동량의 상부층으로 교반한 다음 원심분리 상등액을 수집한다. 이 과정을 반복하여 추출액 8 ml를 수득한다.
추출액(4 ml)을 칼럼 크로마토그래피를 위해 실리카겔(BW-300SP; 2 x 28 cm; Fuji Silycia 제조)에 적용한 다음 부틸 아세테이트, 아세트산 및 물의 3:2:2 혼합물의 상부층을 용출제로 사용하여, 압축기를 이용하여 0.18 kg/cm2의 압력하에 약 5 ml/분의 유속으로 분리시킨다. 하나의 분획이 6 내지 7 ml의 용적이 되도록 분획화하고 각 분획의 일부를 박층 크로마토그래피로 분석하며, 이에 의해 고순도의 사이클로펜테논이 31 번 내지 35 번 분획에 함유되어 사이클로펜테논 35 mg을 수득한다.
분획을 PALPACK형 S 칼럼을 이용한 순상 HPLC 에 의해 분리하며, 215 nm에서의 자외선 흡수에 의해 검출하였을 때, 순도는 95.8%인 것으로 밝혀졌다.
(2)실시예 2-(1)에서 제조한 사이클로펜테논을 2.86 mM, 955 μM, 318 μM, 106 μM, 35 μM, 12 μM 및 0.18 μM 농도의 사이클로펜테논 수용액 제조에 사용한다. 이어서, 가열처리 물질을 NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정한 다음 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도활성을 다음과 같이 측정한다.
56℃에서 30 분 처리한 10% 태 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지내 37℃에서 배양한 HL-60 세포를 10% 태 소 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁시켜 5.8 x 104세포/1.35 ml의 농도로 만든다.
이 현탁액 1.35 ml에 전술한 사이클로펜테논 용액 0.15 ml를 가하고 혼합물을 5% 이산화탄소 가스의 존재하에 37℃에서 20 시간 배양한다.
그 결과, 배양 20 시간 후 사이클로펜테논 106 μM 이상을 가한 분획의 경우(최종 농도: 10.6 μM), 생존세포수 및 세포 생존력이 감소하였고, 사이클로펜테논 35 μM을 가한 분획의 경우(최종 농도: 3.5 μM), 아폽토시스의 유도 결과로 DNA의 분자량이 작아졌고 세포 형태가 변하였다(즉, 핵의 응축, 세포의 수축 및 아폽토시스체의 생성).
결과를 도 3에 도시하였다. 따라서, 도 3은 HL-60 세포의 배양액에 다양한 농도의 사이클로펜테논을 첨가하였을 때 배양시간과 생존세포수의 관계를 도시하며, 여기에서 종좌표는 배양시간(hr)이고 횡좌표는 배양액내 생존 세포수(x 104/1.5 ml)를 나타낸다.
도 3에 있어서, 흰색 사각형은 어떠한 샘플도 첨가되지 않은 분획이고(대조군); 흰색 마름모는 2.86 mM 사이클로펜테논이 첨가된 분획이며; 흰색 원은 955 μM 사이클로펜테논이 첨가된 분획이며; 흰색 삼각형은 318 μM 사이클로펜테논이 첨가된 분획이며; 검은색 사각형은 106 μM 사이클로펜테논이 첨가된 분획이며; 검은색 마름모는 35 μM 사이클로펜테논이 첨가된 분획이며; 검은색 원은 12 μM 사이클로펜테논이 첨가된 분획이다.
실시예 3
(1)D-글루쿠론산(G 5269; Sigma 제조)(10 g)을 물 1 리터에 용해시키고, 121℃에서 4 시간 가열한 다음 약 10 ml가 될 때까지 진공농축한다. 이를 부틸 아세테이트, 아세트산 및 물의 3:2:2 혼합물의 상부층 40 ml와 혼합하고 원심분리하여 생성되는 상등액을 약 10 ml가 될 때까지 진공농축한다.
상기 추출물을 칼럼 크로마토그래피를 위해 실리카겔(BW-300SP; 2 x 28 cm; Fuji Silycia 제조)에 적용하고 부틸 아세테이트, 아세트산 및 물의 3:2:2 혼합물의 상부층을 용출제로 사용하여, 압축기를 이용하여 0.2 kg/cm2의 압력하에 약 5 ml/분의 유속으로 분리시킨다. 하나의 분획이 10 ml의 용적이 되도록 분획화하고 각 분획의 일부를 박층 크로마토그래피로 분석하며, 이에 의해 고순도의 사이클로펜테논이 61 번 내지 80 번 분획에 함유된다. 이러한 분획을 수집하고, 진공농축하여, 클로로포름 40 ml로 추출한 다음 추출물을 진공농축하여 사이클로펜테논 100 mg을 수득한다.
분획을 PALPACK형 S 칼럼을 이용한 순상 HPLC에 의해 분리하며, 215 nm에서의 자외선 흡수에 의해 검출하였을 때, 순도는 98%인 것으로 밝혀졌다.
(2)질량 스펙트로미터 DX302를 사용하여 상기 사이클로펜테논의 질량 분광분석을 수행한다. 또한, 용매로서 헤비 클로로포름을 사용하여 NMR에 의해 구조 분석을 수행한다. 사용된 핵자기 공명장치는 JNM-A500이다. DIP-370 선광계(Nippon Bunko 제조)로 비(specific) 선광도를 측정하고; UV-2500 스펙트로미터(Shimadzu 제조)로 자외선 흡수 스펙트럼을 측정하며; FTIR-8000 적외선 스펙트로미터(Shimadzu 제조)로 적외선 흡수 스펙트럼(IR)을 측정한다. 질량 분광분석 및 NMR 결과는 실시예 1-(4)에서의 결과와 동일하다. 다른 것들은 다음과 같다.
선광도0。 (C = 1.3, 물)
IR(KBr법: 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm-1에서 흡수가 관찰된다.
UV: λmax215 nm (물)
도 4는 IR 스펙트럼을 도시하며, 여기에서 종좌표는 파수(cm-1)이고 횡좌표는 투과율이다.
도 5는 UV 흡수 스펙트럼을 도시하며, 여기에서 종좌표는 파장(nm)이며 횡좌표는 흡광도이다.
실시예 4
D-글루쿠론산의 1% 수용액(G 5269; Sigma 제조)을 121℃에서 4 시간 가열하고 1N NaOH를 사용하여 pH 7로 조정한다. 물로 평형시킨 HiTrap Q 칼럼(5 ml; Pharmacia 제조)에 샘플(5 ml)을 적용하고 칼럼을 물 25 ml로 세척한다. 칼럼으로부터 제일 먼저 용출된 분획(5 ml)을 PO 분획으로 명명하고; 제 2 분획(5 ml)을 P1 분획으로 명명하며; 제 3 분획(10 ml)을 P2 분획으로 명명하며; 마지막 분획(10 ml)을 P3 분획으로 명명한다. 이렇게 한 후, 칼럼을 0.5M 아세트산 25 ml로 용출시킨다. 칼럼으로부터 제일 먼저 용출된 분획(5 ml)을 EO 분획으로 명명하고; 제 2 분획(5 ml)을 E1 분획으로 명명하며; 제 3 분획(5 ml)을 E2 분획으로 명명하며; 마지막 분획(10 ml)을 E3 분획으로 명명한다.
분획 각각의 일부를 박층 크로마토그래피로 분석하고 그 결과 사이클로펜테논이 P1 분획에 함유되어 있으며 이 분획에 정량적으로 회수된 것으로 판명되었다. P1 분획에 있어서, HiTrap Q 칼럼에 의한 정제에 앞서 함유되어 있던 미반응 글루쿠론산 또는 반응산물인 환원산 어느 것도 존재하지 않았다.
실시예 5
(1)실시예 3-(1)에서 언급한 정제된 사이클로펜테논 샘플을 물에 용해시켜 0.67 mg/ml의 농도가 되게 만든다. 한편, n-옥타코산(Nacalai Tesque 제조)을 n-헥산(Nacalai Tesque 제조)에 용해시켜 1 mg/ml 농도가 되게 만든다. 5 개의 튜브 각각에, n-옥타코산 용액 각 100 ㎕(100 ㎍)를 가하고 사이클로펜테논 수용액에는 각각 15 ㎕(10 ㎍), 45 ㎕(30 ㎍), 90 ㎕(60 ㎍), 135 ㎕(90 ㎍) 및 180 ㎕(120 ㎍)를 가한다. 튜브를 진공건조시키고 각각에 트리메틸실릴화 용액[N,O-비스(트리메틸실릴)-아세트아미드(Nacalai Tesque 제조), 트리메틸클로로실란(G.L. Science 제조) 및 피리딘(Pierce 제조)의 4:1:1 혼합용액] 100 ㎕를 가하여 내용물을 완전히 용해되게 한다.
2% OV17 Uniport HP 60/80 메쉬(G.L. Science 제조)를 길이 2.1 m, 직경 3.2 mm의 글래스 칼럼(Shimadzu 제조)에 충진하고 가스 크로마토그래피 장치 GC-7AG(Shimadzu 제조)를 사용하여 15 시간 동안 20 ml/분의 유속으로 캐리어 가스(N2)에서 연소시킨다.
전술한 트리메틸실릴화 샘플(1 ㎕) 각각을 상기 가스 크로마토그래피 시스템에 적용한다. 분석조건은 다음과 같다.
캐리어 가스: N2
유속: 50 ml/분
주입구 온도: 280℃
초기온도: 80℃, 4 분
온도 상승율: 8℃/분
최종온도: 270℃
검출: 수소 화염 이온화 검출기 사용
그 결과 사이클로펜테논의 단일 피크가 약 9.7 분의 체류시간에서 검출된 반면에, n-옥타코산의 피크는 약 26.7 분의 체류시간에서 검출되었다. 이 때 수득된 피크 면적은 다음과 같다.
사이클로펜테논의 양 사이클로펜테논의 피크면적(a) n-옥타코산의 피크면적(b) (a)/(b)의 비
10 ㎍ 19,981 285,798 0.06991
30 ㎍ 90,980 285,398 0.3188
60 ㎍ 174,284 251,439 0.6931
90 ㎍ 272,524 256,356 1.063
120 ㎍ 368,573 255,545 1.442
이와 같이 수득된 사이클로펜테논의 양과 "[사이클로펜테논의 피크면적(a)]/[n-옥타코산의 피크면적(b)]" 간의 관계를 그래프로, 즉 도 6에 도시하였다. 따라서, 도 6은 사이클로펜테논의 작용곡선을 보여주는 그래프이며, 여기에서 종좌표는 사이클로펜테논의 피크면적 : n-옥타코산의 피크면적의 비이며 횡좌표는 사이클로펜테논의 양(㎍)이다.
따라서, 사이클로펜테논의 양이 알려져 있지 않은 샘플에 n-옥타코산 100 ㎍을 첨가하여 진공건조시키고, 트리메틸실릴화하여 전술한 방법에 따라 가스 크로마토그래피 분석하고 "사이클로펜테논의 피크면적" : "n-옥사코산의 피크면적"의 비(y)를 계산해냄으로써 사이클로펜테논의 양을 측정할 수 있다.
(2)1%(중량%)의 농도로 제조된 글루쿠론산 수용액(Nacalai Tesque 제조)을 가압하 오토클레이브내 120℃에서 4 시간 가열한다. 이를(100 ㎕)(글루쿠론산 1 mg에 해당) 튜브에 넣고, n-옥타코산 100 ㎍을 가한 다음 혼합물을 진공건조시키고 트리메틸실릴화한다. 이를 전술한 동일방법으로 가스 크로마토그래피 분석하여 도 7에 도시된 바와 같은 패턴을 수득한다. 따라서, 도 7은 가열처리된 글루쿠론산의 가스 크로마토그래피 결과를 도시하며, 여기에서 종좌표는 검출 강도이며 횡좌표는 체류시간(분)이다. 각각의 단일 피크가 체류시간 약 10.2 분에서 사이클로펜테논에 대해[피크 (a)] 및 체류시간 약 27.8 분에서 n-옥타코산에 대해(피크 (b)] 검출되었다.
결과는 하기와 같고 글루쿠론산의 가열처리에 의한 사이클로펜테논으로의 전환율은 몰로 환산하여 약 15%이다.
사이클로펜테논의 피크면적(a): 203,794
n-옥타코산의 피크면적(b): 305,444
(a)/(b): 0.6672
사이클로펜테논의 양(㎍): 88.4
실시예 6
시판 글루쿠로노락톤(Merck 제조; 코드번호 100282)을 물에 용해시켜 농도 1%가 되게 만들고 121℃에서 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 16 시간 가열한다. 가열처리 용액을 실시예 5-(1)에서 언급한 방법에 따라 트리메틸실릴화하여 가스 크로마토그래피 분석한다.
분석결과는 다음과 같다.
가열시간(hr) 사이클로펜테논의 양 (㎍/100 ㎕) 전환율 (%; 몰로 환산)
0.5 9.28 1.43
1 21.0 3.26
2 52.8 8.15
4 119 18.3
16 132 20.4
결과는 가열처리에 의한 글루쿠로노락톤의 사이클로펜테논으로의 전환율이 약 20%(몰로 환산)였다.
또한, 실시예 3-(1)에서 언급한 방법에 의해 16 시간 가열한 글루쿠로노락톤의 용액으로부터 순수한 사이클로펜테논이 수득되었다.
실시예 7
물(100 ml)을 시판 양배추 100 g에 가한 다음 믹서로 분쇄한다. 이를 50 ℃에서 1 시간 동안 프로테이나제 K(20 mg/ml; #9033, Takara Shuzo 제조) 5 ml와 반응시키고 여과하여 침전물을 물 1.5 리터로 세척한다. 물(100 ml)을 세척 침전물에 가하고 pH 6.5의 생성 현탁액을 121℃에서 두 시간 가열한 다음 여과하여 pH 4.7의 여액을 수득한다. 여액을 진공농축하여 14 ml로 되게 하고, 메탄올 36 ml와 혼합한 다음 4000 x g로 10 분간 원심분리하고 생성되는 상등액을 진공농축하여 농축액 3.5 ml를 수득한다.
상기 농축액에 함유된 사이클로펜테논의 양을 실시예 5-(1)에 언급된 방법으로 측정하고 그 결과 24.9 ㎍인 것으로 판명되었다. 프로테이나제 K 처리 및 수세에 의한 단백질 제거가 믹서 분쇄 후에 수행되지 않고 그 자체로 바로 가열되었을 때, 사이클로펜테논이 전혀 생성되지 않았다. 이러한 결과로부터, 양배추 100 g을 프로테이나제 K로 처리하여, 물로 세척하여 단백질을 제거한 다음 상기 조건에서 가열하였을 때 사이클로펜테논 0.87 mg이 생성되었음이 자명하다.
그 후, 사이클로펜테논을 이러한 농축액으로부터 실시예 3-(1)의 방법에 의해 순수한 형태로 분리해낸다.
실시예 8
(1)펙티나제(8.1 단위/mg 단백질; P9932, Sigma 제조)를 펙틴(사과로부터; Wako Pure Chemicals 제조)의 1% 수용액 8 ml에 1.36 단위, 0.68 단위 또는 0.14 단위의 양으로 가하고 25℃에서 밤새 정치시킨다. (1)효소 반응산물 및 (2)원심분리 후 효소 반응산물의 상등액에 HCl을 가하여 pH 3으로 조정한 다음 121℃에서 4 시간 가열하여 가열처리 산물을 수득한다. 가열처리 산물에 함유된 사이클로펜테논을 실시예 5-(1)의 방법에 의해 트리메틸실릴화하고 가열처리 산물내 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 측정한다.
결과를 표 1에 나타내었다.
첨가된 펙티나제의 양(단위/80 mg 펙틴) 전환율(중량%) (1) (2)
1.36 4.46 4.75
0.68 4.52 4.62
0.14 3.39 3.43
0 2.71 2.73
결과는 펙틴을 펙티나제로 가수분해하고 가열하였을 때, 가열한 경우에 비해 사이클로펜테논의 생성이 25 내지 75%까지 증가하였음을 보여준다.
(2)알긴산(비-팽윤성; Wako Pure Chemicals 제조) (1 g)을 (1)0.1N HCl 또는 (2)0.1M Na2CO3100 ml에 현탁시키거나 용해시키고, 95℃에서 15 시간 동안 가열한 다음 분말상 Na2CO3를 (1)에 또는 6N HCl을 (2)에 가하여 pH 2.7로 조정한다. 한편, 알긴산 1 g을 (3)물 100 ml(생성 pH: 2.7)에 또는 (4)0.1M Na2CO3100 ml에 현탁시킨 다음 6N HCl을 사용하여 pH 2.7로 조정한다. 121℃에서 4 시간 가열한 (1) 내지 (4)(이하, 샘플 (1) 내지 (4)로 약칭)에 함유된 사이클로펜테논의 양을 하기 방법으로 측정한다.
샘플 (1) 내지 (4)에 함유된 불용성 물질을 원심분리로 제거하고 상등액 10 ㎕를 TSK 겔 G 2000 PW 칼럼(7.5 mm x 30 cm; Tosoh 제조)을 사용하는 겔 여과 HPLC로 분석한다. 물을 이동상으로 사용하고, 유속 및 칼럼 온도를 각각 1 ml/분 및 40℃로 만든 다음, 215 nm에서의 흡광도를 이용하여 검출을 수행한다. 실시예 3-(1)에서 언급한 순수한 사이클로펜테논을 표준물질로 사용하고 2-사이클로펜텐-1-온(Aldrich 제조)을 내부 표준물질로 사용한다.
그 결과, 샘플 (1), (2), (3) 및 (4)는 각각 사이클로펜테논 414 ㎍/ml, 279 ㎍, 289 ㎍/ml 및 296 ㎍/ml를 함유한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 121℃에서 4 시간 가열한 샘플(3)과 비교하여, 121℃에서 4 시간 가열하기 전에 0.1N HCl 중 95℃에서 15 시간 가열한 경우 1.43배의 사이클로펜테논을 생성하였다.
실시예 3-(1)에 언급된 방법에 의해 각각의 이들 샘플로부터 순수한 사이클로펜테논이 제조된다.
(3)물(120 ml)을 시판 오카라(두부 찌꺼기) 50 g에 가하고 실온에서 진탕시킨 다음 고형물을 원심분리 제거하고 여과한다. 여액 50 ml에 1N H2SO4를 가하여 pH 2로 조정한 다음 121℃에서 4 시간 가열하여 샘플 (5)를 수득한다.
아세톤(300 ml)을 오카라 100 g에 가하고, 교반한 다음 여과하여 잔사 55 g을 수득한다. 잔사(27.5 g)를 물 1 리터로 세척하고, 물을 가하여 150 ml가 되게 한 다음, 1N H2SO4로 pH 2로 조정하고 혼합물을 121℃에서 4 시간 가열하여 샘플 (6)을 수득한다.
아세톤 처리를 위한 잔류 잔사(27.5 g)를 물 200 ml에 현탁시켜 50℃에서 2 시간 동안 프로테이나제 K(20 mg/ml; Takara Shuzo 제조) 500 ㎕와 반응시킨다. 반응산물을 물 1 리터로 세척하고 여기에 물을 가하여 180 ml로 만든 다음, 1N H2SO4로 pH 2로 조정하고 121℃에서 4 시간 가열하여 샘플(7)을 수득한다.
샘플 (5) 내지 (7) 각각을 여과하고, 여액을 진공농축하여 10 ml로 만든 다음, 4배량의 아세톤을 가하고 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득한다. 상등액을 진공하에 추가 농축하며 이에 따라 농축액 5.5 ml, 3.8 ml 및 3.0 ml이 각각 샘플 (5), (6) 및 (7)로부터 수득된다. 농축액에 함유된 사이클로펜테논의 양은 실시예 8-(2)에 언급될 방법에 의해 측정된다.
그 결과 오카라 50 g을 출발물질로 하여, 사이클로펜테논 0.54 mg, 2.79 mg 및 3.98 mg이 각각 샘플 (5), (6) 및 (7)로부터 수득되었다. 아울러, 121℃에서 4 시간 가열하기에 앞서 샘플 (5) 내지 (7)을 제조하는 동안 어떤 샘플에서도 사이클로펜테논이 함유되어 있지 않았다. 따라서, 프로테이나제 처리에 의한 단백질 제거로, 사이클로펜테논의 생산이 약 40%까지 증가되었다.
실시예 3-(1)에 언급된 방법에 의해 샘플 (5) 내지 (7) 각각으로부터 순수한 사이클로펜테논을 제조한다.
오카라(50 g)를 물 200 ml에 현탁시키고 6N HCl로 pH 1.5로 조정한 다음 50℃에서 3 시간 가열한다. 이를 NaOH로 pH 5.0으로 조정하고 여과하여 여액을 수득한다. 여액을 6N HCl로 pH 2.05로 조정하고 121℃에서 4 시간 가열하여 샘플 (8)을 수득한다. 샘플 (8)에 함유된 사이클로펜테논의 양은 실시예 8-(2)에 언급된 방법에 의해 측정한다.
그 결과, 오카라 50 g으로부터 사이클로펜테논 5.0 mg이 생성되었다. 첨언하면, 121℃에서 4 시간 가열하기 전 여액에는 사이클로펜테논이 함유되어 있지 않았다.
(4)시판 사과 섬유(건조 분말; Nichiro 제조)를 다음과 같이 처리한다.
사과 섬유(0.5 g)를 물 50 ml에 현탁시키고, 121℃에서 4 시간 가열한 다음 원심분리하여 샘플 (9)로 명명되는 상등액 37 ml를 수득한다.
사과 섬유(5 g)를 물 50 ml에 현탁시키고, 121℃에서 4 시간 가열하고 원심분리하여 샘플 (10)으로 명명되는 상등액 20 ml를 수득한다.
사과 섬유(5 g)를 물 50 ml에 현탁시키고 실온에서 2 시간 진탕시킨 다음 원심분리하고 상등액을 121℃에서 4 시간 가열하고 원심분리하여 샘플 (11)로 명명되는 상등액 25 ml를 수득한다.
샘플(11)의 제조시 실온에서 2 시간 진탕 후 원심분리로 수득한 침전물을 물 50 ml에 현탁시키고, 121℃에서 4 시간 가열한 다음 원심분리하여 샘플 (12)로 명명되는 상등액 31 ml를 수득한다.
샘플 (9) 내지 (12)에 함유되어 있는 사이클로펜테논의 양을 실시예 8-(2)에 언급된 방법에 의해 측정한다.
그 결과, 샘플 (9), (10), (11) 및 (12)는 각각 사이클로펜테논 14.8 ㎍/ml, 76.3 ㎍/ml, 54.0 ㎍/ml 및 34.2 ㎍/ml를 함유하였다. 샘플(9)을 제조하기 위한 121℃에서 4 시간 가열하기 전의 샘플은 사이클로펜테논을 함유하지 않았다. 따라서, 사과 섬유 1 g은 각각 샘플 (9), (10), (11) 및 (12)에 대한 제조방법에 의해 사이클로펜테논 1.09 mg, 0.305 mg, 0.270 mg 및 0.212 mg을 생성하였다.
실시예 3-(1)에 언급된 방법에 의해 샘플 (9) 내지 (12) 각각으로부터 순수한 사이클로펜테논이 제조되었다.
실시예 9
시판 센차(중급 녹차), 호지차(볶은차), 우롱차 또는 차의 잎(2 g)을 물 100 ml와 함께 믹서로 분쇄하고, 1N 황산으로 pH 3으로 조정한 다음 121℃에서 16 시간 가열한다. 가열처리 산물에 함유되어 있는 사이클로펜테논의 양은 실시예 8-(2)에 언급된 겔 여과 HPLC로 측정한다. 결과적으로 센차, 호지차, 우롱차 및 차 각각으로부터 사이클로펜테논 0.19 mM, 0.28 mM, 0.34 mM 및 0.12 mM이 생성되었다. 이러한 물질을 제조단계 중에 건열처리되며 사이클로펜테논이 효율적으로 생성된다.
실시예 10
펙틴(Wako Pure Chemicals 제조; 코드 167-00542), 알긴산(비-팽윤성;Wako Pure Chemicals 제조; 코드 011-13341), D-α-갈락투론산(Nacalai Tesque 제조; 코드 165-18) 또는 D-글루쿠론산(Nacalai Tesque 제조; 코드 169-28)을 증류수에 용해시켜 1% 용액을 제조한다. 펙틴의 경우, 아세트산의 1N 수용액에 용해된 용액도 제조한다.
펙틴의 1% 수용액의 pH는 3.4이고; 아세트산 중 펙틴의 1% 용액의 pH는 2.6이며; 가열 전 갈락투론산 수용액의 pH는 2.5이며; 가열 전 글루쿠론산 수용액의 pH는 2.4이며; 가열 전 알긴산 수용액의 pH는 3.3이다.
이들 1% 용액을 121℃에서 2, 4 또는 16 시간 가열한다. 가열처리 용액 각각을 NaOH로 pH 7로 조정하고 0.22 ㎛ 필터로 멸균하여 사이클로펜테논 생성량 측정을 위한 샘플을 제조한다.
사이클로펜테논을 실리카겔 시이트 60F254(Merck 제조)에 스포팅하고 전개제(부틸 아세테이트, 아세트산 및 증류수의 3:1:1 혼합물의 상부층)로 전개시킨 다음 전개 완료 후 실리카겔의 박층을 건조시켜, AgNO3-NH3용액(0.1M AgNO3및 5N NH3동량 혼합물)으로 분무한 다음 가열하며, 이렇게 함으로써 사이클로펜테논이 Rf = 0.3 부근에서 스폿으로 검출된다.
상기에서 제조한 "사이클로펜테논 생성량 측정용 샘플"을 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 및 100배로 희석하여 생성되는 희석액을 상기에서와 같이 TLC 분석한다. 첨언하면, 펙틴의 1% 수용액의 2 시간 가열처리 산물의 2배 희석액으로부터의 사이클로펜테논 생성량을 1 단위로 정의하고 가열처리 산물 각각에 생성된 사이클로펜테논의 양을 측정한다. 결과를 표 2에 나타내었다.
각각의 샘플에서, 사이클로펜테논의 생성은 가열시간 증가에 따라 증가하였고, 갈락투론산 수용액의 가열처리 산물의 경우 각각 30 분 및 1 시간 후 사이클로펜테논 1 단위 및 5 단위가 생성된 반면에, 글루쿠론산 수용액의 가열처리 산물의 경우 각각 30분 및 1 시간 후 사이클로펜테논 5 단위 및 10 단위가 생성되었다.
가열될 샘플 가열시간(hrs) 가열전 pH 가열후 pH 조정후 pH 생성된 사이클로펜테논 단위
펙틴 1% 수용액 2 3.4 3.3 7.0 1
4 3.4 3.2 7.2 5
16 3.4 3.5 7.0 10
아세트산내 펙틴 1% 수용액 2 2.6 2.7 7.0 1
4 2.6 2.6 7.2 2
16 2.6 2.8 7.1 10
갈락투론산 1%수용액 2 2.5 2.4 6.9 10
4 2.5 2.4 6.8 25
16 2.5 2.6 6.9 50
글루쿠론산 1% 수용액 2 2.4 2.7 6.9 25
4 2.4 2.6 7.0 50
16 2.4 2.8 7.0 50
알긴산 1% 수용액 2 3.3 2.5 6.9 5
4 3.3 2.7 7.0 5
16 3.3 2.9 7.3 10
실시예 11
(1)시판 글루쿠로노락톤(Merck 제조; 코드 번호 100282)을 물에 용해시켜 1% 수용액을 제조하고 이를 121℃에서 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 16 시간 가열한다. 가열용액을 실시예 5-(1)의 방법에 의해 트리메틸실릴화하고 생성되는 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 분석한다.
측정 결과를 표 3에 나타내었다.
가열시간(hrs) 사이클로펜테논의 양 (㎍/100㎕) 전환율(%) (몰 환산)
0.5 9.28 1.43
1 21.0 3.26
2 52.8 8.15
4 119 18.3
16 132 20.4
그 결과, 16 시간 가열에 의한 글루쿠로노락톤의 사이클로펜테논으로의 전환율은 몰로 환산하여 약 20%였다.
실시예 3-(1)에 언급된 방법에 의해 글루쿠로노락톤을 16 시간 가열하여 제조한 상기 용액으로부터 사이클로펜테논을 정제/분리한다.
(2)상기 글루쿠로노락톤을 물에 용해시켜 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20% 용액을 제조한 다음 121℃에서 4 시간 가열한다. 이 가열처리 용액을 실시예 5-(1)에 언급된 방법에 의해 트리메틸실릴화하고 생성되는 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 측정한다. 결과를 표 4에 나타내었다.
글루쿠로노락톤의 농도(%) 사이클로펜네톤의 양 (㎍/100㎕) 전환율(%) (몰 환산)
0.1 15.1 23.2
1 99.2 15.3
3 229 11.8
5 365 11.3
10 455 7.03
20 592 4.58
그 결과, 글루쿠로노락톤 0.1% 수용액이 사용되었을 때, 가열시 글루쿠로노락톤의 사이클로펜테논으로의 전환율은 몰로 환산하여 약 23%였다.
(3)상기의 글루쿠로노락톤 1% 수용액의 pH를 HCl 또는 NaOH로 pH 1, 2, 3 또는 4.5로 조정한 다음 121℃에서 4 시간 가열한다. 가열처리 용액을 실시예 5-(1)에 언급된 방법으로 트리메틸실릴화하고 생성되는 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 측정한다. 결과를 표 5에 나타내었다.
pH 사이클로펜테논의 양(㎍/100㎕) 전환율(%)(몰 환산)
1 7.85 1.21
2 15.9 2.46
3 108 16.7
4.5 125 19.3
그 결과, pH가 4.5일 때, 가열에 의한 글루쿠로노락톤의 사이클로펜테논으로의 전환율은 몰로 환산하여 약 19%였다.
(4)갈락투론산 1% 수용액의 pH를 HCl 또는 NaOH로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로 조정한 다음 121℃에서 4 시간 가열한다. 가열처리 용액을 실시예 5-(1)에 언급된 방법으로 트리메틸실릴화하고 생성되는 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 측정한다.
결과를 표 6에 나타내었다.
pH 사이클로펜테논의 양 (㎍/100㎕) 전환율(%) (몰 환산)
1 16.6 2.83
2 66.6 11.3
3 42.7 7.27
4 7.36 1.25
5 5.47 0.931
6 5.45 0.927
7 0 0
그 결과, pH가 2일 때, 가열에 의한 글루쿠론산의 사이클로펜테논으로의 전환율은 몰로 환산하여 약 11%였다.
(5)알긴산(비-팽윤성) 1% 수성 현탁액을 HCl 또는 NaOH로 pH 1, 2, 3 또는 4로 조정한다. 한편, 알긴산(비-팽윤성)을 용해시켜 0.1M 아세테이트 완충액 중의 1% 용액을 제조한 다음 pH 5로 조정하거나 0.1M 포스페이트 완충액 중의 1% 용액으로 제조한 다음 pH 6 또는 7로 조정한다. 용액을 121℃에서 4 시간 가열한다. 가열용액에 함유된 사이클로펜테논의 양을 하기 조건하에서 겔 여과 HPLC로 측정한다.
칼럼: TSK 겔 α-2500 (7.8 x 800 mm; Tosoh 제조)
칼럼온도: 40℃
이동상: 트리플루오로아세트산의 0.01% 수용액
유속: 1 ml/분
검출: 215 nm에서의 흡광도로 검출
실시에 3-(1)에서 제조한 순수한 사이클로펜테논을 표준물질로 사용하여 약 10.0 분에서 용출된 사이클로펜테논의 피크 면적을 측정하여 사이클로펜테논의 농도를 측정한다.
결과를 표 7에 나타내었다.
pH 가열후 pH 사이클로펜테논의 농도(㎍/100㎕) 전환율(%) (몰로 환산)
1 1.07 0 0
2 1.98 0.536 0.611
3 2.76 2.00 2.28
4 4.01 1.05 1.20
5 5.02 0.167 0.190
6 5.95 0 0
7 6.90 0 0
그 결과, pH가 3일 때, 가열에 의한 알긴산의 사이클로펜테논으로의 전환율은 몰로 환산하여 약 2.3%였다.
실시예 12
포모신 펙틴형 LM-13CG(Hercules 제조), 알긴산 HFD(Dainippon Pharmaceutical 제조), D-글루쿠론산(Nacalai Tesque 제조) 또는 글루쿠로노락톤(Merck 제조)을 물에 용해시키거나 현탁시켜 1% 농도로 만든 다음 30℃, 60℃, 95℃, 121℃ 또는 132℃에서 16 시간 가열한다. 가열처리 물질내 사이클로펜테논을 실시예 5-(1)에 언급된 방법으로 트리메틸실릴화하고 가열처리 물질에 생성된 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 측정한다. 결과를 표 8에 나타내었다.
우론산 화합물 가열온도(℃) 생성된 사이클로펜테논의 양 (μ/ml)
펙틴 121 132 176 128
알긴산 121 132 466 75
글루쿠론산 95 121 132 302 718 132
글루쿠로노락톤 95 121 132 274 781 161
실시예 13
(1)콘드로이틴 설페이트 A(Seikagaku 제조), 콘드로이틴(나트륨 염; Seikagaku 제조), 더마탄 설페이트(나트륨 염; Serbio 제조), 헤파린(나트륨 염; Wako Pure Chemicals 제조) 또는 하이알루론산(Seikagaku 제조)을 물에 용해시켜 1% 용액을 제조한 다음 1N HCl로 pH 3으로 조정한다. 이들을 121℃에서 4 시간 또는 16 시간 가열하여 가열처리 용액을 제조한다.
(2)실시예 13-(1)에서 제조한 콘드로이틴 설페이트 A, 콘드로이틴, 더마탄 설페이트 또는 헤파린의 가열처리 용액(100 ㎕)을 n-헥산(Nacalai Tesque 제조)내 n-옥타코산(Nacalai Tesque 제조)의 용액(1 mg/ml; 100 ㎕/ml)과 혼합한 다음 진공건조시킨다. 여기에 상기 트리메틸실릴화 용액 100 ㎕를 가하여 완전히 용해시키고 가열처리 물질내 사이클로펜테논의 양을 실시예 5-(1)에 언급된 방법으로 측정한다.
결과를 표 9에 나타내었다.
가열용액내 사이클로펜테논의 양(㎍/100㎕) 4 시간 16 시간
콘드로이틴 설페이트 A 9.26 15.71
콘드로이틴 7.47 9.11
더마탄 설페이트 32.81 47.60
헤파린 5.09 5.12
(3)하이알루론산의 가열용액(100 ㎕)을 진공건조시키고, 메탄올 10 ㎕에 현탁시킨 다음 불용성 물질을 원심분리 제거한다. 원심분리 후 상등액(1 ㎕)을 실리카겔 60F254(Merck 제조) 시이트에 스포팅하고 전개제로서 부틸 아세테이트, 아세트산 및 물의 3:2:2 혼합물의 상부층을 이용하여 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행한다. 전개 후, 오르시놀-설페이트법으로 착색시키고 표준 사이클로펜테논의 스폿과 비교한다. 그 결과, 4 시간 가열한 하이알루론산 산물에서 사이클로펜테논 생성이 관찰되었고, 16 시간 가열한 경우 증가된 양이 관찰되었다.
실시예 14
더마탄 설페이트(1 g)를 물 100 ml에 용해시키고 용액을 1N HCl로 pH 3으로 조정한 다음 121℃에서 16 시간 가열하여 가열처리 용액을 제조한다. 이어서, 사이클로펜테논을 실시예 3-(1)의 방법에 따라 가열처리 물질로부터 정제하여 순수한 사이클로펜테논 30 mg을 수득한다.
실시예 15
(1)실시예 3-(1)에서 언급된 정제/분리된 사이클로펜테논을 물, 10 mM 트리스-HCl(pH 7) 또는 10 mM 트리스(pH 10)에 용해시켜 농도 25 mM이 되도록 만들고, 실온에서 또는 4℃에서 정치시킨 다음 실시예 13-(3)에서 언급된 TLC로 분석한다. 그 결과, 물 또는 10 mM 트리스-HCl(pH 7)에 용해시켰을 때, 실온 및 4℃에서 정치시킨 두 용액 모두 1 개월 후 약간의 분해된 물질이 생성되었지만 대부분은 분해되지 않았다. 10 mM 트리스(pH 10)에 용해시킨 용액의 경우, 실온에서 급속한 분해가 관찰되며, 용해 직후 TLC로 분석하였을 때, 사이클로펜테논에 대한 어떠한 스폿도 관찰되지 않았다.
물에 용해시킨 사이클로펜테논을 121℃에서 30 분 가열하여 TLC로 분석하였을 때, 약간의 분해산물이 관찰되었지만 사이클로펜테논의 대부분은 분해되지 않은 채로 남았다.
(2)D-글루쿠론산의 1% 수용액을 121℃에서 4 시간 가열하여 pH가 조정되지 않은 샘플과 pH를 NaOH로 6.6으로 조정한 다른 샘플로 만든다. 이들 각각 1 ml를 약간씩 분리하여 -20℃, 4℃ 또는 37℃에서 보존한 다음 실시예 5-(1)의 방법으로 트리메틸실릴화한다. 이렇게 한 후, 샘플내 사이클로펜테논의 양을 가스 크로마토그래피로 측정한다.
25 일 보존한 후의 결과는, 37℃에서 보존한 경우 사이클로펜테논의 양이 약간 감소한 것으로 나타난 반면에, 4℃ 및 -20℃에서 보존한 경우에는 상태가 거의 안정하였다. 결과를 도 8에 도시하였다. 따라서, 도 8은 보존시간과 사이클로펜테논의 양의 관계를 도시하는 그래프이며, 여기에서 종좌표는 보존시간(일)이고 횡좌표는 사이클로펜테논 농도(mg/ml)를 나타낸다. 도 8에서, 흰색 사각형은 pH가 조정되지 않고 -20℃에서 보존한 경우를 나타내고; 검은색 사각형은 pH가 6.66이고 -20℃에서 보존한 경우를 나타내며; 흰색 원은 pH가 조정되지 않고 4℃에서 보존한 경우를 나타내며; 검은색 원은 pH가 6.66이고 4℃에서 보존한 경우를 나타내며; 흰색 삼각형은 pH가 조정되지 않고 37℃에서 보존한 경우를 나타내며; 검은색 삼각형은 pH가 6.66이고 37℃에서 보존한 경우를 나타낸다.
실시예 16
(1)실시예 3-(1)에서 언급된 정제/분리된 사이클로펜테논(113.9 mg)을 에탄올 2.85 ml에 용해시킨다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6) 3.85 ml를 가하여 사이클로펜테논 용액(17 mg/ml)을 제조한다. 이를 0.5 ㎛ 필터를 통해 여과하여 광학 분할 HPLC용 샘플 용액을 제조한다.
이 샘플 용액을 광학 분할 HPLC에 투입하고, 초기 피크 및 후기 피크에서의 사이클로펜테논 분획 각각을 수집하여 진공증발 건고시켜 초기 피크의 사이클로펜테논 43.2 mg 및 후기 피크의 사이클로펜테논 43.0 mg을 수득한다.
광학 분할 HPLC를 위한 조건.
칼럼: Chiral Pack AS(Daicel 제조) 2.0 cm x 25.0 cm
칼럼온도: 40℃
이동상: 헥산/에탄올 (94/6)
유속: 14.0 ml/분
검출: UV 210 nm
충진 샘플량: 150 ㎕(2.55 mg)
초기 및 후기 피크 모두에서의 사이클로펜테논 각각은 에난티오머 약 1%를 함유하므로, 이들을 전술한 조건하에서 광학 분할에 재투입한다. 그 결과, 어떠한 에난티오머도 함유하지 않는 사이클로펜테논 19.7 mg이 초기 피크의 것 30.0 mg으로부터 수득된 반면에, 후기 피크의 것 37.4 mg으로부터는 어떠한 에난티오머도 함유하지 않는 사이클로펜테논 27.7 mg이 수득되었다. 이와 같이 수득된 초기 및 후기 피크로부터의 사이클로펜테논의 선광도는 각각-105。 (C = 0.30, 에탄올) 및+104。 (C = 0.53, 에탄올)였다. 따라서, 초기 피크 물질은 (-)-트랜스-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온[이하, (-)-사이클로펜테논으로 약칭]이고 후기 피크 물질은 (+)-트랜스-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온[이하, (+)-사이클로펜테논으로 약칭]이다. 첨언하면, 선광도를 앞서 언급한 DIP:-370형 선광계(Nippon Bunko 제조)로 측정한다.
(-)-사이클로펜테논 및 (+)-사이클로펜테논의 광학 분할 HPLC의 용출곡선을 도 9와 도 10에 각각 도시하였다. 따라서, 도 9는 (-)-사이클로펜테논의 용출곡선이며, 여기에서 종좌표는 흡광도를 나타내고 횡좌표는 용출시간(분)을 나타낸다. 도 10은 (+)-사이클로펜테논의 용출곡선이며, 여기에서 종좌표는 흡광도를 나타내고 횡좌표는 용출시간(분)을 나타낸다.
이어서, (-)- 및 (+)-사이클로펜테논 각각을 실시예 3-(2)에서 언급된 방법에 따라 질량 분광분석, 핵자기 공명(NMR)에 의한 구조 분석, UV 흡수 스펙트럼 측정 및 적외선 흡수 분석 측정한다. 그 결과, 두 광학 활성 물질 모두 광학 분할 전 사이클로펜테논의 것과 동일한 결과를 나타냈다.
도 11은 (-)-사이클로펜테논의1H-NMR을 나타내며, 여기에서 종좌표는 시그널 강도를 나타내고 횡좌표는 화학 쉬프트 값(ppm)을 나타낸다.
도 12는 (+)-사이클로펜테논의1H-NMR을 나타내며, 여기에서 종좌표는 시그널 강도를 나타내고 횡좌표는 화학 쉬프트 값(ppm)을 나타낸다.
(2)앞서 언급된 문헌 "Carbohydrate Research"에 언급된 방법으로 트랜스-사이클로펜테논을 합성한다. 또한, 앞서 언급된 문헌 "Helvetica Chimica Acta"에 언급된 방법으로 시스-사이클로펜테논을 합성한다. 이들의 각 광학 활성 물질을 광학 분할 수단에 의해 제조한다.
제조된 (+)-트랜스-사이클로펜테논, (-)-트랜스-사이클로펜테논, (+)-시스-사이클로펜테논 및 (-)-시스-사이클로펜테논 각각을 상응하는 예에 대한 방법으로 세포성장 억제, 아폽토시스 유도 활성, 암 세포 분화 유도 활성 및 항균 활성 측정을 하며 그 결과 (+)-트랜스-사이클로펜테논, (-)-트랜스-사이클로펜테논, (+)-시스-사이클로펜테논 및 (-)-시스-사이클로펜테논 각각은 세포성장 억제 활성, 아폽토시스 유도 활성, 암 세포 분화 유도 활성 및 항균활성을 나타내었다.
실시예 17
실시예 16에서 수득한 (-)- 및 (+)-사이클로펜테논 각각의 에탄올 용액(1 mg/ml)을 75% 수성 에탄올 용액으로 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 및 2048배 희석하여 이들 각각 5 ㎕를 96-웰 미세역가판의 웰 각각에 충진한 다음 공기로 건조시킨다. 5000 개의 인간 전골수성 백혈병 세포 HL-60(ATCC CCL-240)을 함유하는 10% 태 소 혈청 함유 RPMI 배지(100 ㎕)를 각각의 웰에 가하고 5% 이산화탄소 존재하에 37℃에서 48 시간 배양한다. 광학 현미경하에 세포의 형태를 관찰한 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma 제조) 5 mg/ml를 함유하는 포스페이트 완충 식염수 10 ㎕를 가하고, 추가로 4 시간 더 배양한 다음 현미경하에서 세포 성장상태를 관찰한다. 또한, 0.04N HCl을 함유하는 2-프로판올 100 ㎕를 가한 다음 잘 교반하고 590 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 성장도로 정의한다.
그 결과, 사이클로펜테논의 광학 활성 물질 각각의 128배 희석액이 첨가된 분획(최종농도: 0.39 ㎍/ml)에서 조차도 세포 성장 억제 활성이 관찰되었다. 더욱이, 아폽토시스 유도 작용도 관찰되었다.
실시예 18
(1)1 x 105/ml의 HL-60 세포를 함유하는 10% 태 소 혈청 함유 RPMI 배지 1640에 사이클로펜테논 10, 1, 0.1 또는 0.01 ㎍/ml를 가한 다음, 5% 이산화탄소 가스의 존재하에 37℃에서 3 일 또는 6 일 배양하고 생존 세포수를 계수한다. 배양 6 일째 되는 날의 결과는 사이클로펜테논을 첨가하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 사이클로펜테논 10 ㎍/ml을 첨가한 분획에서는 어떠한 생존 세포도 발견되지 않은 반면에, 1 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml 및 0.01 ㎍/ml를 가한 분획에서는 각각 약 90%, 약 55% 및 약 40% 정도까지의 세포 성장 억제가 관찰되었다.
결과를 도 13에 나타내었다. 따라서, 도 13은 사이클로펜테논을 다양한 농도로 HL-60 세포의 배양액에 첨가하였을 때 배양시간과 배양액내 생존 세포수 간의 관계를 보여주며, 여기에서 종좌표는 배양시간(일)을 나타내고 횡좌표는 배양액내 생존 세포수(x 104/ml)를 나타낸다. 곡선에서, 흰색 사각형은 샘플이 첨가되지 않은 경우를 나타내고(대조군); 흰색 마름모는 사이클로펜테논 10 ㎍/ml를 첨가한 경우를 나타내며; 흰색 원은 1 ㎍/ml를 첨가한 경우를 나타내며; 흰색 삼각형은 0.1 ㎍/ml를 첨가한 경우를 나타내며; 검은색 사각형은 0.01 ㎍/ml를 첨가한 경우를 나타낸다.
(2)HL-60 세포에 사이클로펜테논 10-4㎍/ml를 가하고 실시예 15-(1)에서와 동일한 방법으로 3 일간 배양한다. 세포의 일부를 취하여 슬라이드 글래스에 도말하여, 문헌[참조:"Techniques of Tissue Culture" edited by Japan Society of Tissue Culture; published by Asakura Shoten; 1982, page 191]에 언급되어 있는 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색을 수행하여 광학 현미경하에서 관찰한다. 결과는 분화된 세포가 사이클로펜테논을 첨가하지 않은 대조군에서는 약 10%였고, 사이클로펜테논이 첨가된 분획에서는 50% 이상의 세포가 단핵구- 또는 대식구-유사 세포로 분화되었다.
(3)HL-60 세포에 사이클로펜테논 0.5 ㎍/ml 또는 0.005 ㎍/ml를 가하고 실시예 18-(1)에서와 동일한 방법으로 3 일 또는 6 일간 배양한다. 세포의 일부를 취하여 슬라이드 글래스에 도말한 다음 라이트-김사 염색하고 광학 현미경하에서 관찰한다. 결과는 사이클로펜테논이 첨가되지 않은 대조군에서는 분화된 세포가 대략 10%였고 사이클로펜테논 0.005 ㎍/ml를 첨가한 분획에서는 25% 이상의 세포가 성숙한 골수 세포로 분화된 것으로 나타났다. 결과를 도 14에 나타내었다. 따라서, 도 14는 배양시간과 배양세포내 성숙 골수 세포 비율의 관계를 나타내며, 여기에서 종좌표는 배양시간(일)을 나타내고 횡좌표는 배양세포에서 점유하는 성숙 골수 세포의 비율(%)을 나타낸다. 도 14에서, 흰색 사각형은 샘플이 첨가되지 않은 경우를 나타내고(대조군); 흰색 원은 사이클로펜테논 0.5 ㎍/ml이 첨가된 경우를 나타내며; 흰색 삼각형은 0.005 ㎍/ml를 첨가한 경우를 나타낸다.
실시예 19
(1)실시예 3-(1)에 언급된 정제/분리된 사이클로펜테논의 항균작용을 다음과 같은 균주를 이용하여 측정한다. 따라서, 측정에 사용된 균주는 다음과 같다. 즉, 시험 미생물 (1): 살모넬라 엔테리티디스(식중독 사례균); 시험 미생물 (2): 살모넬라 티피무리움(식중독 사례균); 시험 미생물(3): 스태필로코커스 아우레우스 FRI 722(A형 엔테로톡신 생성균); 시험 미생물(4): 스태필로코커스 아우레우스(메티실린 내성); 시험 미생물(5): 바실러스 세레우스(구토형 식중독균); 및 시험 미생물(6): 바실러스 세레우스(설사형 식중독균). 이들 균주 모두 Department of Hygienics, Kagawa Nutrition College에 보존되어 있다.
항균작용의 측정은 시험 미생물 각각에 대한 성장 억제 효과를 지표로 이용하여 수행된다. 따라서, 시험 미생물 각각의 특정량을 특정 농도의 사이클로펜테논을 함유하는 배지에 가하며, 생성되는 시험 미생물 용액을 16 시간 또는 48 시간 배양한 다음 생존 세포수를 비교한다.
먼저, 특정 농도의 사이클로펜테논을 감수성 시험 육즙(Nissui 제조)에 가하여 2n연속 희석을 수행한다. 이어서, 감수성 시험 육즙내 37℃에서 16 시간 예비배양한 미생물 용액을 106세포/ml의 양으로 접종하여 37℃에서 배양한다. 배양용액을 특정 범위로 희석한 다음 고형배지 표면에 도포한 각 균주에 대하여 각 배양시간에 대한 생존 세포수를 측정한다. 각 미생물에 대한 세포수 측정시, DHL(Eiken 제조), Baird Parker 한천(BBL 제조) 및 NGKG 한천(Nissui 제조)이 각각 살모넬라, 스태필로코커스 아우레우스 및 바실러스 세레우스에 대해 사용된다. 바실러스 세레우스의 경우에만 32℃에서 배양시킨다. 각 배양시간에서 측정된 세포수를 CFU(콜로니 형성 단위)/ml로 하여 상용로그로 표현하였다. 하기 표 10은 16 시간 배양 후 시험 미생물의 수를 나타내고 표 11은 48 시간 배양 후 시험 미생물의 수를 나타낸다. 사이클로펜테논은 시험 유기체 어느 것에도 항균작용을 보였다. 첨언하면, 표 10 내지 13에서, 표안의 부호 (-)는 시험 미생물의 성장이 전혀 관찰되지 않았음을 의미한다.
시험 미생물의 배양용액내 첨가된 샘플의 농도(ppm) 16 시간 배양 후 시험 미생물의 수(CFU/ml) 시험 미생물 (1) (2) (3) (4) (5) (6)
1563 781 391 195 98 49 0 - - - - - - - - - - - - - - 6.1 - - - 3.0 3.0＞ 4.9 4.3 - - 5.2 5.0 4.7 5.5 5.8 3.0 7.0 6.7 6.9 6.1 6.9 6.8 8.8 8.3 8.7 8.4 8.4 7.8
시험 미생물의 배양용액내 첨가된 샘플의 농도(ppm) 48 시간 배양 후 시험 미생물의 수(CFU/ml) 시험 미생물 (1) (2) (3) (4) (5) (6)
1563 781 391 195 98 49 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 8.1 5.0 9.0 8.5 8.5 8.4 7.9
(2)이.콜라이 및 장출혈성 이.콜라이에 대한 상기 사이클로펜테논의 항균작용을 측정한다. 시험 미생물은 다음과 같다.
시험 미생물(7): 이.콜라이(S-O157:H, VT1,2-생성균); 시험 미생물(8): 이.콜라이(Y.3-O157:H7, VT1,2-생성균); 시험 미생물(9): 이.콜라이(Y.1-O157:H7, VT1-생성균); 시험 미생물(10): 이.콜라이(S-O26:HNM, VT1-생성균); 시험 미생물(11): 이.콜라이(S-O111:HNM, VT1,2-생성균); 및 시험 미생물(12):이.콜라이(식품으로부터 분리).
이들 균주 모두는 Department of Hygienics, Kagawa Nutrition College에 보존되어 있다.
항균작용의 측정은 실시예 19-(1)에서와 동일한 방식으로 수행한다.
먼저, 특정 농도의 사이클로펜테논을 감수성 시험 육즙(Nissui 제조)에 가한다음 2n연속 희석을 수행한다. 이어서, 감수성 시험 육즙내 37℃에서 16 시간 예비배양한 미생물 용액을 106세포/ml의 양으로 접종하여 37℃에서 배양한다. 배양용액을 특정 범위로 희석한 후 표면 도말 배양에 의하여 각 균주에 대하여 각 배양시간에 대한 생존 세포수를 측정한다. 균주의 세포수 측정시, DHL(Eiken 제조)이 사용된다. 각 배양시간 후 측정된 세포수를 전술한 바와 같이 로그 값으로 표현하였다. 결과를 하기 표 12와 13에 나타내었다. 사이클로펜테논은 시험 미생물 어느 것에도 항균작용을 보였다.
시험 미생물의 배양용액내 첨가된 샘플의 농도(ppm) 16 시간 배양 후 시험 미생물의 수(CFU/ml) 시험 미생물 (7) (8) (9) (10) (11) (12)
1563 781 391 195 98 49 0 - - - - - 3.0＞ - - 3.0＞ - - 6.4 3.6 2.2 3.0＞ - 3.6 5.8 4.7 4.7 3.0＞ - 6.2 6.6 7.0 7.0 7.1 6.1 7.4 8.3 6.3 6.9 7.1 7.1 8.0 8.2 8.5 8.0 8.6 8.5 8.5 8.5
시험 미생물의 배양용액내 첨가된 샘플의 농도(ppm) 48 시간 배양 후 시험 미생물의 수(CFU/ml) 시험 미생물 (7) (8) (9) (10) (11) (12)
1563 781 391 195 98 49 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 4.1 - 8.9 5.3 8.6 7.4 8.5 5.0 8.5 9.3 8.5 9.8 8.5 10.1
(3)하기의 것들을 상기 사이클로펜테논의 항균활성 측정을 위한 시험 미생물로 사용한다. 이들은 시험 미생물(13): 이.콜라이 HB101(ATCC 33694); 시험 미생물(14):살모넬라 티피무리움 LT-2(ATCC 27106); 시험 미생물(15):슈도모나스 에어루지노사(IFO 3080); 시험 미생물(16):스태필로코커스 아우레우스 3A(NCTC 8319); 시험 미생물(17):바실러스 서브틸리스(IFO 3034); 및 시험 미생물(18):스트렙토코커스 뮤탄스(GS5; National Institute of Health 보존).
시험 미생물을 L-육즙(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 5% NaCl; pH 7.0)에서 밤새 시드 배양시킨다. 시드 배양액(5 ㎕)을 사이클로펜테논 25 내지 200 ㎍/ml를 L-육즙 5 ml에 첨가한 배지 및 또한 사이클로펜테논을 첨가하지 않은 배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양하여 성장을 측정한다. 배양 초기 및 8 시간 후, Fuji Digital Turbidimeter(Fuji Kogyo KK에서 판매; Akiyama Denki Seisakusho 제조)를 사용하여 조정된 스케일이 82.3인 조건하에서 배양액의 탁도를 측정하고 시험 미생물의 성장을 8 시간 후의 탁도로부터 배양초기에서의 탁도를 감하여 수득한 값(성장 탁도)으로부터 측정한다. 첨언하면, 시험 미생물(18)의 경우, L-육즙 대신 뇌 심장 침출액을 이용한다.
결과를 표 14에 나타내었으며, 여기에서 "-"는 조사되지 않았음을 의미한다.
성장 탁도
시험 미생물 첨가된 사이클로펜테논의 양(㎍/ml 배지) 0 25 50 100 200
(13) (14) (15) (16) (17) (18) 222 0 0 0 0 273 - - 0 0 239 2 0 0 0 243 203 158 0 0 267 145 9 0 0 140 133 130 34 6
따라서, 사이클로펜테논은 시험된 미생물 모두에 대해 항균활성을 나타냈다.
(4)화학균에 대한 사이클로펜테논의 항균활성을 하기 방법으로 시험한다. 시험 미생물을 10% 에탄올을 함유하는 SI 배지(Japan Brewery Association)에서 5 일간 정치배양하여 시드 미생물을 수득한다. 시드 미생물(0.1%)을 사이클로펜테논이 0, 25, 50, 75 또는 100 ㎍/ml의 양(최종 농도로 환산)으로 첨가된 10% 에탄올-함유 SI 배지 100 ml에 가한 다음 5 일간 정치배양하고 탁도를 측정한다. 탁도 측정에 있어서, OD600값을 흡광미터를 사용하여 측정한다. 어떠한 시험 미생물도 접종하지 않은 배지의 OD600의 값을 상기의 값으로부터 감하여 이(성장 탁도)를 시험 미생물의 성장에 이용한다.
시험 미생물은 다음과 같다. 따라서, 진성 화락균으로서 락토바실러스 프럭티보란즈(Lactobacillus fructivorans)(IFO 13118)(시험 미생물 A), 락토바실러스 프럭티보란즈(JCM 1198)(시험 미생물 B) 및 락토바실러스 호모히오치(L. homohiochii)(IFO T3120)(시험 미생물 C), 반면에 히오치 락토박테리아로서 락토바실러스 램노서스(L. rhamnosus)(IFO 3532))(시험 미생물 D)를 사용한다. 결과를 표 15에 나타내었다.
성장 억제
시험 미생물 첨가된 사이클로펜테논의 양(㎍/ml 배지) 0 25 50 75
A B C D 0.96 0.17 0.02 0 2.03 0.01 0 0 1.61 0.32 0.08 0 0.35 0.04 0.01 0
시험 미생물 A, C 및 D의 성장은 75 ㎍/ml에 의해 완전히 억제된 반면에 시험된 미생물 B의 성장은 50 ㎍/ml에 의해 완전히 억제되었다. 따라서, 사이클로펜테논은 화락균에 대해서도 항균작용을 보였다.
또한, 사이클로펜테논은 사카로마이세스 세레비지애 ATCC 9763, 캔디다 앨비칸즈 TIMM 0136 및 아스퍼질질러스 퓨미가터스 TIMM 1776과 같은 진균에 대해서도 고농도에서 항균 활성을 보였다.
실시예 20
(1)비브리오 파라헤모리티쿠스 4387-61 또는 비브리오 파라헤모리티쿠스 T4144-1(모두 National Institute of Hygienic Sciences에 보존)을 사이클로펜테논 800, 400, 200, 100, 5, 25, 12.5, 6.15, 3.13 또는 1.56 ㎍/ml를 함유하는 트립토-소야 부일론 배지(Nissui 제조)에 106세포/ml가 되도록 접종한 다음 37℃에서 24 시간 정치배양한다. 결과는 어떠한 균주에서도, 12.5 ㎍/ml 이상의 사이클로펜테논을 첨가한 분획에서 미생물의 성장이 관찰되지 않은 것으로 나타났다.
미생물 성장이 관찰되지 않은 배양액(50 ㎕)을 사이클로펜테논을 함유하지 않는 트립토-소야 부일론 한천 배지 20 ml에 도포하고 37℃에서 24 시간 배양한다. 결과는 어떠한 균주에서도, 분획(50 ㎍/ml 이상의 사이클로펜테논을 첨가한 것)을 도포한 한천 배지에서 미생물의 성장이 관찰되지 않았다.
상기의 사실로부터, 사이클로펜테논은 비브리오 파라헤모리티쿠스 4387-61 및 비브리오 파라헤모리티쿠스 T4144-1에 대해 12.5 ㎍/ml에서 항균작용을 나타냈으며 50 ㎍/ml에서 두 균주 모두에 대해 살균작용을 나타냈다.
(2)캠필로박터 제주니 A3309(Institute of Hygienic Sciences에 보존)를, 2% 태 송아지 혈청(Dainippon Seiyaku 제조)을 함유하는 뇌 심장 침출액 배지(Difco 제조)에 접종하여 37℃에서 16 시간 진탕 예비배양한다. 배양액(50 ㎕)을 사이클로펜테논 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 또는 1.56 ㎍/ml을 함유하는 0.5% NaCl-함유 뮐러-힌튼 평판 배지(BBL 제조) 20 ml에 도포하고 37℃에서 48 시간 정치배양한다.
결과는 12.5 ㎍/ml 이상의 사이클로펜테논이 첨가된 평판 배지에서 미생물의 성장이 관찰되지 않았다.
따라서, 사이클로펜테논은 캠필로박터에 대해 항균작용을 나타냈다.
(3)레지오넬라 뉴모필라(사람 기관지 세척물로부터 분리; 시험 미생물(1)) 및 레지오넬라 뉴모필라(온천 욕조수로부터 분리; 시험 미생물(2))(둘 다 Department of Hygienics, Kagawa Nutrition College에 보존)에 대한 사이클로펜테논의 항균작용 측정을 시험 미생물 각각에 대한 성장 억제 효과를 지표로 이용하여 수행한다. 따라서, 시험 미생물 각각의 특정량을 특정 농도의 사이클로펜테논을 함유하는 액체 배지에 가하며, 생성되는 시험 미생물 현탁액을 16 시간, 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 배양하고 배양 후 생존 세포수를 체크한다.
먼저, 특정 농도의 사이클로펜테논을 BCYE α육즙(Oxoid 제조)에 가한 다음 2n연속 희석한다. BCYE α육즙내 37℃에서 16 시간 예비배양한 세균 현탁액을 세포수 106/ml가 되게 가하여 37℃에서 배양한다. 배양액을 적절히 희석하고 이어서 BCYE α한천(Oxoid 제조)에 도포함으로써 각 미생물에 대하여 각 배양시간에 대한 생존 세포수의 측정을 수행한다,
각 배양시간에 대한 측정 세포수를 CFU(콜로니 형성 단위)/ml로서 사용로그로 나타내었다. 결과를 하기 표 16에 나타내었다. 사이클로펜테논은 시험 미생물 어느 것에도 항균작용을 보였다. 첨언하면, 표 안의 "-"는 시험 미생물의 어떠한 성장도 관찰되지 않았음을 의미한다.
시험 미생물 배양액내 첨가된 샘플의 농도(ppm) 각각의 배양 후 시험 미생물 세포의 수(CFU/ml) (16 시간 배양) (96 시간 배양) 시험 미생물 (1) (2) (1) (2)
24 12 0 - - - - 5.7 6.1 8.3 8.6 6.9 7.4 8.7 8.6
(4)헬리코박터 파일로리 균주의 경우, 표준 균주 NCTC 11637(ATCC 43504) 및 사람의 위에서 임상 분리 균주(206 및 3401; 둘 다 Department of Bacteriology, Hyogo Medical College 보존)를 사용한다. 각 균주를 7% 말 혈청(Bio Whittaker 제조)을 함유하는 브루셀라 육즙 배지(BBL 제조)에서 Aneropack Campiro(Mitsubishi Gas Chemical 제조)를 사용하여 미약한 호기성 조건하에 37℃에서 진탕배양시킨다. 대수 성장기에 있는 미생물을 브루셀라 육즙으로 희석시키고 시험용으로 사용한다. 23-웰 플레이트(Falcon 제조)를 실험용으로 사용한다. 사이클로펜테논을 0.1 ml(1,000 ㎍)/웰의 비율로 충진하고, PBS를 이용하여 2 단계 희석시킨 다음 배지[7% 말 혈청(BBL 제조)을 함유하는 브루셀라 한천 배지(pH 6.0)] 0.9 ml/웰을 가하여 부동화시킨다. 브루셀라 한천 배지를 사전에 HCl로 pH 6.0으로 조정하고 실험용으로 사용한다. 각 미생물을 약 104/50 ㎕/웰의 비율로 접종한다. 미생물을 접종한 후, 항균활성을 판단하기 위해 37℃에서 3 내지 4 일간 미약한 호기성 조건하에서 배양한다. 90% 이상 억제를 보이는 샘플의 양(㎍/ml)을 MIC로 정의한다. 결과는 시험 균주 모두에 대해, MIC는 32 ㎍/ml이고 사이클로펜테논은 헬리코박터 균주에 대한 항균작용을 나타내었다.
실시예 21. 고형암에 대한 사이클로펜테논의 항암작용
실시예 3-(1)에서 언급된 사이클로펜테논을 생리식염수 용액으로 특정 농도가 되도록 희석한 다음 다음의 시험을 수행한다.
(1)8주령의 BALB/c 마우스 암컷(체중 약 20 g)의 복부에 메트 A 세포(2 x 106세포/마우스)를 피하주사한다. 주사 후, 사이클로펜테논(5 mg/kg/일)을 연속 5 일간 동일부위에 피하주사한다. 한편, 생리식염수 용액을 동일한 방식으로 대조군에 피하주사한다. 2 주 후, 마우스 복부에 발생한 암 조직을 절개하여 중량을 측정한다. 결과를 표 17에 나타내었다.
따라서, 대조군의 경우, 암의 평균 중량은 1.41 g인 반면에, 사이클로펜테논(5 mg/kg/일) 투여 그룹의 경우 중량은 0.0 g으로 암 조직의 발생이 전혀 나타나지 않았고 억제율이 100%였다.
마우스(%) (n) 종양의 중량(g)(평균 ± SD) 억제율
대조군 (7) 1.41 ±0.55 -
사이클로펜테논 투여 (8) 0.00 ±0.00 100.0
(2)6주령의 ICR종 마우스 암컷 (체중 약 26 g) 16 마리를 사용한다. 육종-180(5.5 x 106세포/마우스)을 복부에 피하주사하여 대조군(8 마리의 마우스) 및 사이클로펜테논 투여 그룹(8 마리의 마우스)을 만든다.
사이클로펜테논을 수도물로 희석하고 급수병을 이용하여 사이클로펜테논 약 80 mg/kg/일의 용량이 되도록 사이클로펜테논-투여 그룹에 자유로이 공급한다. 수도물을 대조군에 이와 유사하게 부여한다. 두 그룹 모두에서, 실험과정 중에 먹이를 자유로이 공급한다.
육종-180의 피하이식 후 40 일 째 되는 날에 생존하는 마우스의 수는 대조군의 경우 8 마리 중 두 마리였고 사이클로펜테논-투여 그룹의 경우에는 7 마리였으며 따라서 사이클로펜테논 투여에 의한 상당한 생명 연장 효과가 관찰되었다.
(3)마우스 백혈병 P-388(1.1 x 106세포/마우스)을 7주령의 DBA/2 마우스 암컷(체중 약 20 g)에 복강내 주사한다. 주사 후, 사이클로펜테논(10 mg/kg/일)을 연속 5 일간 복강내 주사한다. 한편, 생리식염수 용액을 동일한 방식으로 대조군에 복강내 주사한다. 두 그룹에서(각각 8 마리의 마우스로 구성), 마우스의 생존수, 평균 생존일수 및 생명 연장율을 계산해 낸다. 결과를 도 15에 나타내었다. 따라서, 대조군에서 평균 생존일수는 10.3 일인 반면에, 사이클로펜테논-처리 그룹에서는 31.4 일이었고 생명 연장율은 306.1%로 상당한 생명 연장 효과를 보여준다. 도 15는 사이클로펜테논의 항암효과를 보여주며, 여기에서 종좌표는 마우스의 생존수를 나타내고 횡좌표는 생존일수를 나타낸다. 도 15에서, 실선은 사이클로펜테논-투여 그룹을 나타내고 파선은 대조군을 나타낸다.
이와 유사하게, 5주령의 ICR종 마우스 암컷(체중 약 25 g) 16 마리를 사용하고 육종-180(5.5 x 106세포/마우스)를 복강내 주사하여 대조군(8 마리의 마우스로 구성)과 사이클로펜테논-투여 그룹(8 마리의 마우스로 구성)을 설정한다.
한편, 7주령의 CDF1종 마우스 암컷(체중 약 20 g) 16 마리를 사용하고 IMC(2.0 x 106세포/마우스)를 복강내 주사하여 대조군(8 마리의 마우스로 구성) 및 사이클로펜테논-투여 그룹(8 마리의 마우스로 구성)을 설정한다.
추가로, 5주령의 DDY종 마우스 암컷(체중 약 25 g) 16 마리를 사용하여 EAC(1.2 x 106세포/마우스)를 복강내 주사하여 대조군(8 마리의 마우스로 구성) 및 사이클로펜테논-투여 그룹(8 마리의 마우스로 구성)을 설정한다.
결과는 육종-180, IMC 및 EAC의 경우에, 대조군의 평균 생존일수는 각각 22.6일, 10.8일 및 15.8일 이었고 반면에 사이클로펜테논-투여 그룹의 경우는 각각 33.4일, 20.3일 및 40.3일로서, 수명 증가율이 각각 148%, 188% 및 255%였으며 이는 사이클로펜테논 투여에 의한 상당한 생명연장 효과를 보여준다.
실시예 22. 주사제
(1)사이클로펜테논을 1% 농도로 생리식염수 용액(Japanese Pharmacopoeia)에 가하여 주사액을 제조한다.
(2)생리식염수 용액(상동)에 사이클로펜테논 및 글리시르레틴산을 각각 0.5% 및 0.1%의 농도로 가하여 주사액을 제조한다.
실시예 23. 정제
(1)각각 사이클로펜테논 100 mg 및 소정량의 미세결정상 셀룰로스를 함유하는 정제를 제조한 다음 당피를 입혀 정제를 제조한다.
(2)각각 사이클로펜테논 0.1 mg, 디칼륨 글리시르레틴산 10 mg 및 소정량의 미세결정상 셀룰로스를 함유하는 정제를 제조한 다음 당피를 입혀 정제를 제조한다.
실시예 24. 연고
하기 제형에 따라 연고를 제조한다.
사이클로펜테논 1g
흡수 연고(Japanese Pharmacopoeia) 99 g
우선, 사이클로펜테논을 소량의 흡수 연고와 잘 반죽하고 나머지 흡수 연고를 점진적으로 가한 다음 균질 산물이 생성될 때까지 반죽하여 연고를 제조한다.
이 연고를 병소에 1 일 4-5회 도포한다.
실시예 25. 화장품
항균 화장재 형태의 로션을 하기 제형에 따라 제조한다.
에탄올 10 부
글리세롤 1 부
시트르산 0.3 부
메틸 p-하이드록시벤조에이트 0.2 부
사이클로펜테논 0.1 부
방향제 소량
정제수 전체 100 부가 되게 하는 양
실시예 26. 목욕제
항균 목욕제를 하기 제형에 따라 제조한다.
무수 글라우버 염 20 부
중탄산나트륨 40 부
석신산 10 부
사이클로펜테논 30 부
염료 충분량
방향제 충분량
(정제형태로 제조)
실시예 27. 치마제
치마제를 하기 제형에 따라 제조한다.
탄산칼슘 50.00%
글리세롤 20.00%
카라기난 0.50%
카복시메틸셀룰로스 1.00%
라우릴 디에탄올아미드 1.00%
슈크로스 모노라우레이트 2.00%
방향제 1.00%
사카라이드 0.10%
사이클로펜테논 0.10%
물 나머지
총량 100.00%
실시예 28
정제 캔디를 하기 제형에 따라 제조한다.
설탕 74.9%
락토스 20.0%
슈크로스 모노라우레이트 0.2%
방향제 0.5%
정제수 4.3%
사이클로펜테논 0.001%
실시예 29
항균 음료를 하기 방법에 따라 제조한다.
(1)펙틴(Pomosin Pectin LM-13CG; Hercules 제조)(5 kg)을 수도물 100 리터에 가하고 혼합물을 35 분 동안 그 안으로 증기를 취입함으로써 액체 온도를 28℃에서 120℃로 가열하고, 120℃에서 5 시간 동안 교반하에 유지시킨 다음 냉각시켜 냉각 혼합물 135 리터를 제조한다. 여기에 셀라이트 #545(Celite 제조) 1.35 kg 및 실리카 #600-S(Chuo Silica 제조) 1.35 kg을 필터 보조제로 가하고 셀라이트 #545 0.1 kg 및 실리카 #600-S 0.1 kg으로 예비코팅한 컴팩트 필터(16 단의 6 인치 필터 페이퍼; ADVANTEC #327)를 사용하여 여과한다. 생성되는 여액을 플레이트 히터(Nichihan Seisakusho 제조)를 이용하여 연속 순간 가열처리시킨(98℃에서 60 초) 다음 냉각시켜 사이클로펜테논을 함유하는 가열처리 펙틴 용액 150 리터를 재조한다.
사이클로펜테논을 함유하는 가열처리 펙틴 용액은 pH가 약 3.5, 산도가 6.2 ml 및 당도가 5.8 Brix%였다. 첨언하면, pH는 pH 미터로 측정하며, 산도는 pH 7.0으로 중화하는 데 사용된 0.1N NaOH의 양(ml)으로 표현되며 당도는 Brix 당도계로 측정한다.
(2)녹차 잎 10 g, 비타민 C 0.2 g 및 탈이온수 1,000 ml를 사용하여 통상적인 수단에 의해 녹차를 제조한다. 사이클로펜테논을 함유하는 이미 제조된 가열처리 펙틴 용액을 200 mg의 양(고형물 기준; 사이클로펜테논 1.6 mg 함유)으로 녹차 100 ml에 가하여 본 발명의 산물(1)을 제조한다. 아무 것도 가하지 않은 것을 대조군으로 하였다. 20 명의 패널리스트에 의해 관능평가를 수행하고(5 포인트 법, 포인트 5는 양호, 포인트 1은 불량) 결과의 평균치를 표 18에 나타내었다.
관능평가
산물(1) 대조군
맛의 폭 4.3 3.2
맛의 균형 3.9 3.4
전체적인 맛 4.3 3.3
표 18로부터, 평가는 대조군과 비교하여, 본 발명의 산물(1)은 더 넓고 광대한 맛 및 잘 균형을 이룬 맛을 지니며, 따라서 차의 향과 맛이 개선되고 "은폐된 향미" 효과가 성취된다.
실시예 30
음료를 하기 제형에 따라 제조한다.
프럭토스-글루코스-액당 5.00%
설탕 4.00%
산성제 1.20%
방향제 0.30%
사이클로펜테논-함유 물질 0.5%
정제수 나머지
총량 100.00%
실시예 29-(1)에 언급된 사이클로펜테논을 함유하는 가열처리 펙틴 용액을 사이클로펜테논-함유 물질로 사용하고 고형물 기준으로 계산한 이의 양을 가한다. 이러한 음료(100 ml)는 사이클로펜테논 4 mg을 함유한다.
실시예 31
신선한 양배추(200 g)를 스트립으로 절단하여 각각 100 g을 물(대조군) 또는 사이클로펜테논의 0.2% 용액에 5 분간 침지시킨다. 이어서, 물을 부드럽게 제거한 다음 양배추를 합성수지재 백에 넣고 실온에서(20℃) 정치시킨다. 24 시간 후 관찰시, 사이클로펜테논 수용액에 침지시킨 양배추는 물(대조군)에 침지시킨 것에 비해 신선도가 유지되었다.
이러한 차이는 날이 지남에 따라 더욱 명백해지며, 4 일 후 관찰시, 사이클로펜테논 수용액에 침지시킨 양배추는 물에 침지시킨 것(대조군)에 비해 어떠한 악취도 보이지 않고 신선도를 유지하였다.
본 발명은 항암작용, 암 세포 증식 억제작용, 암 세포 분확 유도작용, 아폽토시스 유도작용, 항균작용 등과 같은 생리활성을 보이고 안정성이 높은 사이클로펜테논 및 이의 광학 활성 물질을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 함유하는 이러한 생리활성 기능을 지닌 약제, 식품 및 음료도 제공한다. 본 발명에 따라, 천연물질로부터 사이클로펜테논을 용이하고 효율적으로 제조하고 이의 광학 활성 물질을 저가로 제공할 수 있게 되었다.
본 발명에 의해 제공된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질은 이들의 생리활성에 기인하여, 발암 예방 효과, 항암 효과 및 항균 작용을 지닌 약제로서 사용될 수 있고 이러한 약제는 생명체의 항상성 유지, 특히 위와 장의 양호한 건강상태 유지에 유용하다. 본 발명은 또한 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 유효성분으로 함유하는 방부제, 항균 화장품, 항균 치마제 및 항균 목욕제를 제공한다.
본 발명에 따라, 생리활성을 지닌 적정량의 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 식품 또는 음료에 포함시킬 수 있게 되었다. 사이클로펜테논 및 이의 광학 활성 물질의 각종 생리활성으로 해서, 본 발명의 식품 또는 음료는 발암예방, 항암 효과, 항균 효과 및 아폽토시스 유도 작용과 같이 생체의 항상성 유지 기능을 지닌 건강 식품 또는 음료이며 본 발명은 위와 장의 양호한 건강상태 유지에 유용한 기능성 물질을 함유하는 식품 또는 음료를 제공한다. 또한, 사이클로펜테논의 첨가 결과, 식품 또는 음료의 항균작용이 용이하게 강화될 수 있고 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질을 함유하는 제제는 또한 식품 또는 음료용 방부제로도 매우 유용하다.
또한, 본 발명은 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질을 제공하며, 여기에서 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드를 함유하는 물질에서, 적어도 우론산, 우론산 유도체, 사이클로펜테논에 대한 중간체 또는 사이클로펜텐논과 반응성을 갖는 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 단백질의 반응성의 적어도 일부가 소실 및/또는 반응성 물질의 적어도 일부가 제거된다. 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질이 사용될 경우, 본 발명에 사용된 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질이 효율적으로 제조될 수 있다. 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질의 예는 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물을 함유하는 건열처리 물질이다. 건열처리의 경우, 로우스팅/파칭 처리는 간편하고 편리하며, 로우스팅/파칭 야채, 과일, 곡물, 버섯, 해조류, 피층 및 연골과 같은 로우스팅/파칭 식물, 동물 및 미생물이 본 발명의 사이클로펜테논 및/또는 이의 광학 활성 물질의 제조에 매우 유용하다.
첨언하면, 건열처리 산물은 건열처리 전에 처리 대상 물질을 탈수시킴으로써 효율적으로 제조될 수 있다.

Claims (44)

  1. (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열시킴을 특징으로 하는, 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
    (a)우론산 또는 우론산 유도체;
    (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물; 및
    (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
    화학식 1
  2. (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열시킨 다음 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 상기 가열처리 산물로부터 수집해 냄을 특징으로 하는, 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
    (a):우론산 또는 우론산 유도체;
    (b)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물; 및
    (c)우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
    화학식 1
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 우론산이 갈락투론산, 글루쿠론산, 글루론산, 만뉴론산 및/또는 이듀론산인 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
  4. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 우론산 유도체가 우론산의 염, 또는 우론산 락톤, 우론산 에스테르, 우론산 아미드 또는 이들의 염인 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
  5. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 사카라이드 화합물이 펙틴, 펙트산, 알긴산, 하이알루론산, 헤파린, 헤파란 설페이트, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴, 더마탄 설페이트 및/또는 이들의 분해산물 중에서 선택되는 사카라이드 화합물인 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
  6. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열처리 산물이 60 내지 350℃에서 수 초 내지 수 일간 가열함으로써 수득되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열처리 산물이 산성 내지 중성 조건하에서 가열함으로써 수득되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 제조방법.
  8. (A)(a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열하여 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 생성시키는 단계.
    (a):우론산 또는 우론산 유도체,
    (b):우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물, 및
    (c):우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질;
    (B):4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 생성되는 가열처리 산물로부터 분리시키는 임의 단계; 및
    (C):4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 광학 분할하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 우론산이 갈락투론산, 글루쿠론산, 글루론산, 만뉴론산 및/또는 이듀론산인 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 우론산 유도체가 우론산의 염, 또는 우론산 락톤, 우론산 에스테르, 우론산 아미드 또는 이들의 염인 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 사카라이드 화합물이 펙틴, 펙트산, 알긴산, 하이알루론산, 헤파린, 헤파란 설페이트, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴, 더마탄 설페이트 및/또는 이들의 분해산물 중에서 선택되는 사카라이드 화합물인 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법.
  12. 제 8 항 내지 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열처리 산물이 60 내지 350℃에서 수 초 내지 수 일간 가열함으로써 수득되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법.
  13. 제 8 항 내지 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열처리 산물이 산성 내지 중성 조건하에서 가열함으로써 수득되는 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온의 광학 활성 화합물의 제조방법.
  14. 선광도가-105。 (C = 0.30, 에탄올)인 (-)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온.
  15. 선광도가+104。 (C = 0.53, 에탄올)인 (+)-4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온.
  16. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항암제.
    화학식 1
  17. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 암 세포 분화 유도제.
    화학식 1
  18. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제.
    화학식 1
  19. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 함유함을 특징으로 하는 항균제.
    화학식 1
  20. 제 19 항에 따른 항균제를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 방부제.
  21. 제 19 항에 따른 항균제를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 치마제.
  22. 제 19 항에 따른 항균제를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 화장품.
  23. 제 19 항에 따른 항균제를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 목욕제.
  24. 제 1 항에 따른 방법에 의해 수득된 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는, 제 16 항에 따른 항암제, 제 17 항에 따른 암 세포 분화 유도제, 제 18 항에 따른 아폽토시스 유도제, 제 19 항에 따른 항균제, 제 20 항에 따른 방부제, 제 21 항에 따른 치마제, 제 22 항에 따른 화장품 또는 제 23 항에 따른 목욕제.
  25. 제 1 항에 따른 가열처리 산물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는, 제 16 항에 따른 항암제, 제 17 항에 따른 암 세포 분화 유도제, 제 18 항에 따른 아폽토시스 유도제, 제 19 항에 따른 항균제, 제 20 항에 따른 방부제, 제 21 항에 따른 치마제, 제 22 항에 따른 화장품 또는 제 23 항에 따른 목욕제.
  26. 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득된 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는, 제 16 항에 따른 항암제, 제 17 항에 따른 암 세포 분화 유도제, 제 18 항에 따른 아폽토시스 유도제, 제 19 항에 따른 항균제, 제 20 항에 따른 방부제, 제 21 항에 따른 치마제, 제 22 항에 따른 화장품 또는 제 23 항에 따른 목욕제.
  27. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 암 세포 분화 유도방법.
    화학식 1
  28. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도방법.
    화학식 1
  29. 제 27 항 또는 28 항에 있어서, 제 1 항에 따른 방법에 의해 수득된 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 27 항 또는 28 항에 있어서, 제 1 항에 따른 가열처리 산물을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 27 항 또는 28 항에 있어서, 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득된 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온을 유효성분으로 사용함을 특징으로 하는 방법.
  32. 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물이 함유, 희석 및/또는 첨가됨을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
    화학식 1
  33. 제 32 항에 있어서, 제 1 항에 따른 방법에 의해 수득된 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온이 함유, 희석 및/또는 첨가됨을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
  34. 제 32 항에 있어서, 제 1 항에 따른 가열처리 산물이 함유, 희석 및/또는 첨가됨을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
  35. 제 32 항에 있어서, 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득된 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온이 함유, 희석 및/또는 첨가됨을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
  36. 제 32 항 내지 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 및/또는 이의 광학 활성 화합물이 100 부당 5 x 10-6부 이상의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
  37. 제 32 항 내지 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 항암 식품 및/또는 항암 음료인 식품 또는 음료.
  38. 제 32 항 내지 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 항균 식품 및/또는 항균 음료인 식품 또는 음료.
  39. 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질에서, 우론산, 우론산 유도체, 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 대한 중간체 또는 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온과 반응성을 지닌 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 단백질의 반응성의 적어도 일부가 소실 및/또는 반응성 물질의 적어도 일부가 제거됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
    화학식 1
  40. 제 39 항에 있어서, 건열처리에 의해, 우론산, 우론산 유도체, 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 대한 중간체 또는 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온과 반응성을 지닌 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 단백질의 반응성의 적어도 일부가 소실 및/또는 반응성 물질의 적어도 일부가 제거됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
  41. 제 40 항에 있어서, 건열처리가 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질을 60 내지 400℃의 고온 공기로 수 초 내지 수 일간 로우스팅/파칭함으로써 수행됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
  42. 제 41 항에 있어서, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물을 함유하는 물질이 로우스팅/파칭된 식물, 동물 또는 미생물 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
  43. 제 42 항에 있어서, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질이 로우스팅/파칭된 야채, 과일, 곡류, 버섯, 해조류, 피층 또는 연골 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
  44. 제 39 항에 있어서, 프로테아제 처리에 의해, 우론산, 우론산 유도체, 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온에 대한 중간체 또는 화학식 1의 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온과 반응성을 지닌 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 단백질의 반응성의 적어도 일부가 소실 및/또는 반응성 물질의 적어도 일부가 제거됨을 특징으로 하는, 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 사카라이드 화합물 함유 물질.
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