WO2009150281A1 - Empleo de lauril galato en la prevención y tratamiento de infecciones causadas por el virus de la peste porcina africana (vppa) - Google Patents

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WO2009150281A1 PCT/ES2009/070220 ES2009070220W WO2009150281A1 WO 2009150281 A1 WO2009150281 A1 WO 2009150281A1 ES 2009070220 W ES2009070220 W ES 2009070220W WO 2009150281 A1 WO2009150281 A1 WO 2009150281A1
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vppa
swine fever
prevention
treatment
virus
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PCT/ES2009/070220
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Pedro GONZÁLEZ PORQUÉ
Ángel LÓPEZ CARRASCOSA
Yolanda Revilla Novella
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario Ramón Y Cajal
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    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to the use of lauryl gallate (LG) as a therapeutic agent, in particular as an antiviral agent in the prevention and treatment of infections caused by the African swine fever virus (VPPA).
  • LG lauryl gallate
  • VPPA African swine fever virus
  • the African swine fever virus is a large virus with icosahedral morphology that causes severe disease in both domestic and wild pigs. Morphologically, the virus is very similar to irido viruses that infect vertebrates, and was initially considered a member of that family. However, their genomic structure, as well as other biochemical characteristics are similar to those of poxviruses. Recently, the VPPA has been classified in a new family called Asfarviridae of which it is the only member.
  • VPPA is an important porcine pathogen that can be transmitted by contact or by bites of arthropods of the genus Ornithodoros.
  • the incubation period is between 5 and 15 days.
  • Acute disease caused by this virus is characterized by high fever, hemorrhages in the reticuloendothelial system and a high mortality rate. Since its discovery in 1921 in East Africa, the disease has spread to Europe and the Western Hemisphere, and importantly to Spain, causing the death of several hundred thousand domestic pigs. There is no vaccine or specific treatment against African swine fever (PPA).
  • the only effective strategy for disease control is based on rapid and sensitive diagnosis in the focus of infection, followed by the slaughter of the entire swine population of the establishment, and its isolation and disinfection to ensure the disappearance of both the pathogen as of the possible transmitting agents of the disease, mainly ticks.
  • gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid) have been extensively studied, not only for their antioxidant properties but also Because tannins, compounds found in a wide variety of plants used as food, as well as in wine and tea, have aroused great scientific interest, especially in areas where the consumption of these foods is high.
  • esters of gallic acid e.g. propyl, octyl or lauryl gallate
  • antioxidant properties such as food additives to prevent fat fattening in sauces, melted cheeses, pastry, etc.
  • esters of gallic acid as antiviral agents as well as agents for the proliferation of tumor cell lines has been described.
  • the use of ethyl gallate and propyl gallate has been described as an antiviral agent against adenovirus, herpesvirus simplex type 1 (HSV-I), influenza virus, vesicular stomatitis virus (VSV), poliovirus, rabies, hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus type 1 (HIV-I) and cytomegalovirus (CMV); as well as the use of octyl gallate as an antiviral agent against influenza viruses, VSV, poliovirus, HIV-I and CMV, among others.
  • HSV herpesvirus simplex type 1
  • influenza virus influenza virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • poliovirus rabies
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV human immunodeficiency virus type 1
  • CMV cyto
  • Lauryl gallate also known as dodecyl gallate, is the ester of dodecanol and gallic acid and is widely used as a food additive with the E312 code, as an antioxidant and as a preservative; however, its use has also been described to inhibit the proliferation of tumor cell lines [Serrano et al, Arch. Biochem. Biophys 1998, 350, 49-54] and to induce cellular apoptosis [Roy et al, Arch. Biochem.
  • LG lauryl gallate
  • Vero as in pig macrophages (Example 3), thus preventing the productive infection of said cells and, therefore, the spread of the infection caused by the VPPA.
  • the invention relates to the use of LG, or a derivative thereof, in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of diseases caused by the infection caused by VPPA.
  • the invention relates to LG, or a derivative thereof, for the treatment and / or prevention of diseases caused by the infection caused by VPPA.
  • the invention relates to a method for the prevention and / or treatment of a disease caused by the infection caused by the VPPA in a subject, comprising the administration to said subject of a therapeutically effective amount of LG or of a derivative thereof.
  • Figure IA is a graph showing the effect caused by LG on the cell viability of different cell cultures: (•) Vero cells; ( ⁇ ) Sw Mac (porcine alveolar macrophages); and in cultures of BHK cells (m) [Example I].
  • the Figure IB is a graph that shows that a Vero cell culture, incubated for 48 hours in the presence of 10 ⁇ M LG and released from it, behaves similarly to a Vero cell control culture in terms of cell proliferation.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of increasing concentrations of LG on viral production in cultures of Vero cells infected with a VPPA adapted to said cell line.
  • Figure 3 is a graph showing the production performance of different VPPA field isolates (Mozam'86, E70 and Kenya) in pig phage crops according to the amount of LG administered to these crops.
  • the invention relates to the use of lauryl gallate (LG), or a derivative thereof, in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of diseases caused by infection caused by the virus of African swine fever (VPPA).
  • LG lauryl gallate
  • VPPA African swine fever
  • LG is a known compound that can be obtained synthetically by direct esterification reaction of gallic acid with lauryl alcohol (dodecanol) [J. Am. Chem. Soc, 1947, 69, 2003-2005]. However, it is also commercially available.
  • the term "derivative" of LG includes esters and ethers obtained by reacting 1, 2 or 3 of the free hydroxyl groups of LG with organic acids or with alcohols, respectively; These compounds (esters and ethers) can be hydrolyzed inside the cell, releasing the LG since in the cells there are the intracellular enzymatic systems necessary to break those bonds and release the active substance inside the cells.
  • Such derivatives of LG would, in general, be more hydrophobic than LG, which would facilitate greater absorption through cell membranes.
  • Illustrative, non-limiting examples of such derivatives include methoxy, epoxy derivatives, etc. (within the ethers) and acetates, propanoates, etc. (inside the esters).
  • the term "subject” includes any animal that possesses an immune system, preferably a mammal, for example, a domestic and wild suida (eg, pigs, wild boars, etc.).
  • VPPA refers to the African swine fever virus (VPPA) and includes any strain of VPPA, regardless of its origin, for example, the Spanish strain Spain 70 (E70); the Spanish strain Spain 75 (E75), a highly virulent strain; the Spanish strain BA71V, which corresponds to a strain of VPPA isolated in Badajoz in 1971 and adapted to the stable Vero monkey kidney cell line; said strain (BA71V) is apatogenic and completely sequenced (accession number Ul_8466) (Yanez RJ et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus.
  • vehicle, adjuvant and / or excipient refers to molecular entities or substances with which the active ingredient is administered.
  • Such pharmaceutical vehicles, adjuvants or excipients may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum or animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like, excipients, disintegrants, humectants, diluents, etc.
  • Suitable pharmaceutical vehicles are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin.
  • compositions may be administered by any appropriate route of administration, for example, orally, parenterally (for example, subcutaneously, intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, etc.), etc., preferably, orally.
  • said pharmaceutical compositions may be in a pharmaceutical form for oral administration, either in solid form or liquid
  • pharmaceutical forms of oral administration include tablets, capsules, granules, solutions, suspensions, etc., and may contain conventional excipients, such as binders, diluents, disintegrants, lubricants, humectants, etc., and may be prepared. by conventional methods.
  • the pharmaceutical compositions can also be adapted for parenteral administration, in the form of, for example, sterile lyophilized solutions, suspensions or products, in the appropriate dosage form; in this case, said pharmaceutical compositions will include suitable excipients, such as buffers, surfactants, etc.
  • the excipients will be chosen based on the pharmaceutical form of administration selected.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and their preparation can be found in the book "Galenica Pharmacy Treaty", by C. Faul ⁇ i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzán 5, SA de Ediations.
  • the LG, or a derivative thereof will preferably be in a pharmaceutically acceptable or substantially pure form, that is, that the LG, or derivative thereof, has a pharmaceutically acceptable level of purity excluding pharmaceutically acceptable excipients. and not including material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for LG, or derivative thereof are preferably greater than 50%, more preferably, greater than 70%, more preferably, greater than 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95%.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of active component (LG or derivative thereof) calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the proper characteristics. of LG, or derivative thereof, and the therapeutic effect to be achieved. It will also depend on the subject to be treated, the severity of the disease suffered by said subject, the chosen form of administration, etc. For this reason, the doses mentioned in this invention should be considered only as guidelines for the person skilled in the art, and he must adjust the doses according to the variables mentioned above.
  • the LG can be administered, one or more times a day, for example, 1, 2, 3 or 4 times a day, in a typical total daily amount between 1 and 10 mg / kg body mass / day, preferably 1 mg / kg body mass / day.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be used to treat any subject, in a particular embodiment, the pharmaceutical composition of the invention is especially useful for treating suids.
  • the LG or derivative thereof as well as the pharmaceutical compositions containing them can be used together with other additional antiviral drugs useful in the prevention and / or treatment of diseases caused by infections caused by viruses.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or sequential administration to that of the pharmaceutical composition comprising LG or a derivative thereof.
  • the invention relates to LG, or a derivative thereof, for the treatment and / or prevention of diseases caused by the infection caused by VPPA.
  • the invention relates to a method for the prevention and / or treatment of a disease caused by the infection caused by VPPA in a subject, which comprises administering to said subject a therapeutically effective amount of LG or a derived from it.
  • LG those of its derivatives, those of the VPPA and those of the subject have already been mentioned previously.
  • said subject is a zero, domestic or wild, e.g., a pig, a wild boar, etc.
  • a zero, domestic or wild e.g., a pig, a wild boar, etc.
  • Vero cells, BHK cells and macrophage pig phage were used.
  • Vero cells from African monkey kidney
  • BHK cells from hamster kidney
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle medium
  • Alveolar pig macrophages were collected by broncho-alveolar lavage [Carrascosa AL, Santaren JF and Vinuela E. Production and titration of African swine fever virus in porcine alveolar macrophages. J. Virol. Methods, 1982; 3: 303-10.
  • VPPA African swine fever virus
  • BA71V strain of VPPA adapted to Vero cells was propagated and titrated by a plaque assay on Vero cells (Rinse L et al. Titration of African swine fever (ASF) virus. J. Gen. Virol., 1976; 32: 471- 7).
  • Other VPPA field isolates (E70, Kenya and Mozam'86) were propagated from frozen stocks on pig macrophages (Carrascosa AL, Santaren JF and Vinuela E. Production and titration of African swine fever virus in porcine alveolar macrophages. J Virol.
  • lysis buffer containing sodium dodecyl sulfate SDS
  • 20 g of SDS, 50 mL of N, N-dimethylformamide, 2.5 mL of 99% acetic acid, 2.5 mL of 1N HCl was added , completed up to 100 mL with distilled water.
  • cell cultures were incubated for 15 minutes at 37 0 C with gentle shaking.
  • the cell viability was determined by measuring the color change experienced by the MTT indicator at 550 nm in a microplate reader. Background values were subtracted from the average absorbance values obtained for each LG concentration tested and referred to the value obtained in the absence of LG (100% viability).
  • CC50 should be determined, that is, the concentration of inhibitor (LG) that reduces cell viability to 50%.
  • LG concentration of inhibitor
  • Vero cells were incubated for 48 hours in the presence of 10 ⁇ M LG; After that period of time, Vero cell cultures were released from LG. As a control, Vero cell cultures were used with the same initial Vero cell number but without LG. The results are shown in Figure IB where it can be seen that Vero cell cultures incubated 48 hours in the presence of 10 ⁇ M LG and released from LG, behaved the same as Vero cell control cultures (without LG) in terms of cell proliferation .
  • the stock solution of LG was prepared at a concentration of 40 mM in ethanol and stored in the dark at -2O 0 C until use. From that stock, a 10 mM solution of LG in ethanol was prepared, from which other more dilute ones (eg, 1 and 0.1 mM) can be derived in culture medium without the LG Vero cells cultured in multiwell plates (MW6), with 7 cm 2 of surface / well, at approximately 100,000 cells / cm 2 , were pretreated, before infection with VPPA, for 1 hour, with the corresponding dose of LG (0 - 100 ⁇ M).
  • MW6 multiwell plates
  • the medium was removed and the VPPA BA71V virus (adapted to Vero cells) was inoculated at a multiplicity of infection (mdi) of 2 plaque forming units (pfu) / cell, in a reduced volume (around 30%) maintaining the corresponding concentration of LG during viral adsorption, and allowed to incubate for 1-2 hours. After that time, the inoculum was removed and washed twice with fresh medium to remove the non-adsorbed virus.
  • mdi multiplicity of infection
  • pfu plaque forming units
  • EC50 For comparison purposes, EC50 must be determined, that is, the concentration of inhibitor (LG) that reduces viral production by 50%. The results obtained are shown in Figure 2, where it can be seen that the EC50 is 1.5 ⁇ M for LG.
  • This test was carried out to analyze the effect of LG on the infectivity of different VPPA field isolates in pig macrophages.
  • the assay was performed under conditions analogous to those described in Example 1, except in the use of another type of cell culture (pig macrophages) that was infected with VPPA field isolates. (Mozam'86, E70 or Kenya strains) in the presence of increasing concentrations of LG. Infectious virus production was analyzed by hemadsorption (Rinse L et al. Titration of African swine fever (ASF) virus, 1976; J. Gen. Virol. 32: 471-7) and plating (Bustos MJ et al.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de lauril galato, o un derivado del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica antiviral para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades provocadas por la infección causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA).

Description

EMPLEO DE LAURIL GALATO EN LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE INFECCIONES CAUSADAS POR EL VIRUS DE LA PESTE PORCINA
AFRICANA (VPPA)
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el empleo del lauril galato (LG) como agente terapéutico, en particular, como agente antiviral en la prevención y tratamiento de las infecciones causadas por el virus de la peste porcina africana (VPPA).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus de la peste porcina africana (VPPA) es un virus de gran tamaño con morfología icosaédrica que causa una grave enfermedad en cerdos tanto domésticos como salvajes. Morfológicamente, el virus es muy similar a los irido virus que infectan a vertebrados, e inicialmente fue considerado como un miembro de dicha familia. Sin embargo, su estructura genómica, así como otras características bioquímicas son similares a las de los poxvirus. Recientemente, el VPPA ha sido clasificado en una nueva familia denominada Asfarviridae de la que es el único miembro.
El VPPA es un importante patógeno porcino que puede transmitirse por contacto o mediante picaduras de artrópodos del género Ornithodoros. El periodo de incubación está comprendido entre 5 y 15 días. La enfermedad aguda causada por este virus se caracteriza por fiebre alta, hemorragias en el sistema retículoendotelial y una alta tasa de mortalidad. Desde su descubrimiento en 1921 en el Este de África, la enfermedad se ha extendido a Europa y al hemisferio occidental, y de forma importante a España, causando la muerte de varios cientos de miles de cerdos domésticos. No existe vacuna ni tratamiento específico contra la peste porcina africana (PPA). La única estrategia eficaz para el control de la enfermedad se basa en el diagnóstico rápido y sensible en el foco de infección, seguido del sacrificio de la totalidad de la población porcina del establecimiento, y de su aislamiento y desinfección para asegurar la desaparición tanto del patógeno como de los posibles agentes transmisores de la enfermedad, fundamentalmente garrapatas.
Por otra parte, los derivados de ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico) han sido extensamente estudiados, no solo por sus propiedades antioxidantes sino también porque los taninos, compuestos que se encuentran en gran variedad de plantas utilizadas como alimentos, así como en el vino y en el té, han suscitado un gran interés científico, especialmente en zonas donde el consumo de estos alimentos es elevado.
Se ha descrito el empleo de algunos esteres del ácido gálico, e.g. propil, octil o lauril galato, debido a sus propiedades antioxidantes, como aditivos alimentarios para evitar el enranciamiento de grasas en salsas, quesos fundidos, pastelería, etc.
Asimismo, se ha descrito el empleo de algunos esteres de ácido gálico como agentes antivirales así como agentes inhibidores de la proliferación de líneas celulares tumorales. En este sentido, se ha descrito el empleo del etil galato y del propil galato como agente antiviral frente a adenovirus, herpesvirus simplex tipo 1 (HSV-I), virus influenza, virus de la estomatitis vesicular (VSV), poliovirus, virus de la rabia, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-I ) y citomegalovirus (CMV); así como el empleo del octil galato como agente antiviral frente a virus influenza, VSV, poliovirus, HIV-I y CMV, entre otros. Sin embargo, no se ha descrito el empleo de ningún éster del ácido gálico como agente antiviral frente al VPPA.
El lauril galato (LG), también conocido como dodecil galato, es el éster de dodecanol y ácido gálico y se utiliza ampliamente como aditivo alimentario con el código E312, como antioxidante y como conservante; no obstante, también se ha descrito su empleo para inhibir la proliferación de líneas celulares tumorales [Serrano et al, Arch. Biochem. Biophys. 1998, 350, 49-54] y para inducir apoptosis cellular [Roy et al, Arch. Biochem. Biophys., 2000, 383, 206-214], así como su empleo como agente antiviral general frente adenovirus, HSV-I, HIV-I, virus de la rabia y frente al virus de la leucemia de células T humanas tipo 1 (HTLV-I) [JP 2006306836; Chavez, JH et al, Veterinary Microbiology (2006), 1 16 (1-3), 53-59; Savi, LA et al., Arzneimittel Forschung (2005), 55 (1), 66-75; Nakashima, H et al. Antiviral Research (1992), 18 (1), 91-103].
A la vista de lo anterior, sigue existiendo la necesidad de proporcionar compuestos útiles como agentes antivirales potencialmente útiles en la prevención y/o tratamiento de infecciones causadas por el VPPA. Ventajosamente, dichos compuestos antivirales deberían ser eficaces y no deberían provocar efectos secundarios indeseables. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han encontrado que el lauril galato (LG) reduce significativamente la producción viral en modelos celulares inoculados con el VPPA. Los resultados se pueden extrapolar con fines terapéuticos o profilácticos en la población animal de riesgo. Dado que se trata de un compuesto con un perfil de toxicidad muy bajo, su uso como agente antiviral resulta muy adecuado y no requiere de ensayos clínicos complejos como ocurre con otros agentes antivirales.
Este nuevo uso terapéutico del LG se basa en el resultado de unas investigaciones llevadas a cabo por los inventores sobre modelos de cultivos de células Vero que permiten el crecimiento del virus VPPA, en donde se puso de manifiesto, por una parte, que la viabilidad de células Vero se mantenía en presencia de LG hasta una concentración de aproximadamente 60 μM (Ejemplo 1), y, por otra parte, que el LG reducía, de forma eficaz, la producción de diferentes aislados del VPPA tanto en células
Vero (Ejemplo 2) como en macrófagos de cerdo (Ejemplo 3), impidiendo de este modo la infección productiva de dichas células y, por tanto, la diseminación de la infección causada por el VPPA.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el empleo del LG, o de un derivado del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de enfermedades provocadas por la infección causada por el VPPA.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el LG, o un derivado del mismo, para el tratamiento y/o prevención de enfermedades provocadas por la infección causada por el VPPA.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por la infección causada por el VPPA en un suj eto, que comprende la administración a dicho suj eto de una cantidad terapéuticamente efectiva de LG o de un derivado del mismo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura IA es una gráfica que muestra el efecto provocado por el LG en la viabilidad celular de diferentes cultivos celulares: (•) células Vero; (Δ) Sw Mac (macrófagos alveolares porcinos); y en cultivos de células BHK (m) [Ejemplo I]. La Figura IB es una gráfica que pone de manifiesto que un cultivo de células Vero, incubado durante 48 horas en presencia de LG 10 μM y liberado del mismo, se comporta de forma semejante a un cultivo control de células Vero en cuanto a proliferación celular. La Figura 2 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones crecientes de LG sobre la producción viral en cultivos de células Vero infectados con un VPPA adaptado a dicha línea celular.
La Figura 3 es una gráfica que muestra el rendimiento en la producción de distintos aislados de campo de VPPA (Mozam'86, E70 y Uganda) en cultivos de macró fagos de cerdo en función de la cantidad de LG administrado a dichos cultivos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con el empleo del lauril galato (LG), o de un derivado del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de enfermedades provocadas por la infección causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA).
El LG es un compuesto conocido que se puede obtener sintéticamente mediante reacción de esterificación directa del ácido gálico con lauril alcohol (dodecanol) [J. Am. Chem. Soc, 1947, 69, 2003-2005]. No obstante, también se encuentra disponible comercialmente.
Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" del LG incluye esteres y éteres obtenidos por reacción de 1 , 2 ó 3 de los grupos hidroxilo libres del LG con ácidos orgánicos o con alcoholes, respectivamente; estos compuestos (esteres y éteres) se pueden hidrolizar dentro de la célula liberando el LG puesto que en las células existen los sistemas enzimáticos intracelulares necesarios para romper esas uniones y liberar el principio activo dentro de las células. Dichos derivados del LG (esteres y éteres) serían, en general, más hidrofóbicos que el LG, lo que facilitaría una mayor absorción a través de las membranas celulares. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos derivados incluyen los derivados metoxi, epoxi, etc. (dentro de los éteres) y acetatos, propanoatos, etc. (dentro de los esteres). Tal como se utiliza en esta descripción, el término "sujeto" incluye a cualquier animal que posee sistema inmunitario, preferentemente, un mamífero, por ejemplo, un suido tanto doméstico como salvaje (e.g., cerdos, jabalíes, etc.).
El término "VPPA", tal como se utiliza en esta descripción, se refiere al virus de la peste porcina africana (VPPA) e incluye cualquier cepa de VPPA, independientemente de su procedencia, por ejemplo, la cepa española España 70 (E70); la cepa española España 75 (E75), una cepa altamente virulenta; la cepa española BA71V, que corresponde a una cepa de VPPA aislada en Badajoz en 1971 y adaptada a la línea celular estable Vero de riñon de mono; dicha cepa (BA71V) es apatógena y está secuenciada completamente (número de acceso Ul_8466) (Yanez RJ et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. Virology, 1995 Apr 1; 208(1 ):249-78); los aislados de campo Mozam'86, Uganda y E70 se han utilizado en previas publicaciones (Bustos MJ et al. Plaque assay for African swine fever virus on swine macrophages. Arch. Virol., 2002; 147:1453-9) y forman parte de la colección propiedad de los inventores. En una realización particular, para su administración en la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por el VPPA, el LG, o un derivado del mismo, se formulará en una composición farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "vehículo, adyuvante y/o excipiente" se refiere a entidades moleculares o sustancias con las que se administra el ingrediente activo. Tales vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como aguas y aceites, incluyendo aquéllos de petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, excipientes, disgregantes, humectantes, diluyentes, etc. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, oral, parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, etc.), etc., preferentemente, por vía oral.
En una realización particular, dichas composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma farmacéutica de administración por vía oral, bien en forma sólida o líquida. Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas, granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser preparadas por métodos convencionales. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones.
Para su aplicación en terapia el LG, o un derivado del mismo, se encontrará preferiblemente en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que el LG, o derivado del mismo, tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los excipientes farmacéuticamente aceptables y no incluyendo material considerado tóxico a los niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el LG, o derivado del mismo, son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente, superiores al 70%, más preferiblemente, superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95%.
Tal como aquí se utiliza, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de componente activo (LG o derivado del mismo) calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias del LG, o derivado del mismo, y el efecto terapéutico a conseguir. Dependerá asimismo del sujeto que vaya a ser tratado, de la severidad de la enfermedad que padezca dicho sujeto, de la forma de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. No obstante, se puede administrar el LG, una o más veces al día, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces al día, en una cantidad típica total diaria comprendida entre 1 y 10 mg/kg masa corporal/día, preferentemente 1 mg/kg masa corporal/día.
Aunque, en principio, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede ser utilizada para tratar cualquier sujeto, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es especialmente útil para tratar suidos
(e.g., cerdos, jabalíes, etc.).
El LG o derivado del mismo así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos antivirales adicionales útiles en la prevención y/o tratamiento de enfermedades provocadas por infecciones causadas por virus. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o secuencial a la de la composición farmacéutica que comprende el LG o un derivado del mismo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el LG, o un derivado del mismo, para el tratamiento y/o prevención de enfermedades provocadas por la infección causada por el VPPA. Las características del LG, así como las de sus derivados y las del
VPPA ya han sido mencionadas previamente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por la infección causada por el VPPA en un sujeto, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de LG o de un derivado del mismo. Las características del
LG, las de sus derivados, las del VPPA y las del sujeto ya han sido mencionadas previamente. En una realización particular, dicho sujeto es un cero, doméstico o salvaje, e.g., un cerdo, un jabalí, etc. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLOS
Materiales Para la realización de estos ensayos se utilizaron las células y los virus que se indican a continuación. Células
Se utilizaron células Vero, células BHK y macró fagos alveolares de cerdo. Las células Vero (procedentes de riñon de mono africano) y las células BHK (procedentes de riñon de hámster) fueron obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L-glutamina 2 mM, 100 U de gentamicina/mL y aminoácidos no esenciales. Los macrófagos alveolares de cerdo fueron recogidos mediante lavado bronco-alveolar [Carrascosa AL, Santaren JF y Vinuela E. Production and titration of African swine fever virus in porcine alveolar macrophages. J. Virol. Methods, 1982; 3 :303-10. Se cultivaron las células a 370C en medio suplementado bien con 5% de suero de ternera recién nacido (células Vero), o bien con 5% de suero de ternera fetal inactivado por calor (células BHK), o bien con 10% de suero homólogo porcino (macrófagos alveolares de cerdo).
Virus
Asimismo, se utilizaron diversos aislados del virus de la peste porcina africana (VPPA). La cepa BA71V de VPPA adaptada a células Vero fue propagada y titulada mediante un ensayo en placa sobre células Vero (Enjuanes L et al. Titration of African swine fever (ASF) virus. J. Gen. Virol., 1976; 32:471-7). Otros aislados de campo de VPPA (E70, Uganda y Mozam'86) fueron propagados a partir de stocks congelados sobre macrófagos de cerdo (Carrascosa AL, Santaren JF y Vinuela E. Production and titration of African swine fever virus in porcine alveolar macrophages. J. Virol. Methods, 1982; 3:303-10; García Barreno et al. Monoclonal antibodies of African swine fever virus: antigenic differences among field virus isolates and viruses passaged in cell culture. J. Virol. 1986; 58(2):385-92) y titulados mediante hemadsorción y ensayo en placa (Enjuanes L et al. Titration of African swine fever (ASF) virus. J. Gen. Virol., 1976; 32:471-7; Bustos MJ et al. Plaque assay for African swine fever virus on swine macrophages. Arch. Virol. , 2002; 147:1453-9) EJEMPLO 1 Ensayo MTT de viabilidad y proliferación celular
Para determinar el efecto tóxico del tratamiento con LG en distintos cultivos celulares (células Vero, células BHK y macrófagos alveolares de cerdo) se realizó este ensayo c o n b ro muro d e 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, células Vero, células BHK y macrófagos alveolares de cerdo, a razón de 30.000 células por pocilio, fueron sembrados en placas de 96 pocilios (MW96) e incubados durante 24 horas antes de la adición de LG. Transcurrido ese tiempo, se retiró el medio de cultivo y se añadieron 100 μL de medio de cultivo con concentraciones crecientes de LG para proporcionar concentraciones finales comprendidas entre 0 y 100 μM en un volumen de 0, 1 mL por pocilio. Se utilizaron 6 pocilios para cada concentración de LG, y se mantuvieron 2 pocilios en paralelo con el medio correspondiente pero en ausencia de células con el fin de sustraer el valor de fondo (background) debido al LG en el medio de cultivo. Tras 24-48 horas de incubación, la placa se centrifugó a 1.000 rpm, durante 3 minutos y se retiraron 90 μL de sobrenadante. A continuación, se añadieron 10 μL/pocillo del indicador MTT (7,5 mg/mL en tampón fosfato salino (PBS)) y se llevó hasta 100 μL con medio de cultivo fresco. Posteriormente, los cultivos celulares se incubaron durante 2 horas a 370C y se mantuvieron en oscuridad durante el resto del ensayo. Seguidamente, se añadieron 100 μL de tampón de lisis que contenía dodecilsulfato sódico (SDS) [20 g de SDS, 50 mL de N,N-dimetilformamida, 2,5 mL de ácido acético 99%, 2,5 mL de HCl 1 N, completado hasta 100 mL con agua destilada]. A continuación, los cultivos celulares se incubaron durante 15 minutos a 370C con agitación suave. La viabilidad celular fue determinada mediante la medida del cambio de color experimentado por el indicador MTT a 550 nm en un lector de microplacas. Los valores del fondo (background) se restaron de los valores promedio de absorbancia obtenidos para cada concentración de LG ensayada y se refirieron al valor obtenido en ausencia de LG (100% viabilidad). A efectos comparativos se debe determinar la CC50, es decir, la concentración de inhibidor (LG) que reduce la viabilidad celular al 50%. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura IA, donde puede apreciarse que: la viabilidad de células BHK se mantiene en presencia de LG (tras 48 horas de incubación) hasta una concentración de aproximadamente 20 μM; la viabilidad de macró fagos alveolares porcinos se mantiene en presencia de LG (tras 24 horas de incubación) hasta una concentración de aproximadamente 30 μM; y la viabilidad de células Vero se mantiene en presencia de LG (tras 24 horas de incubación) hasta una concentración de aproximadamente 60 μM. A la vista de los resultados obtenidos se seleccionó una concentración de trabajo de LG de 10 μM para tratamientos no citotóxicos de 24-72 horas en cultivos celulares.
Adicionalmente, para analizar el comportamiento de las células Vero en cuanto a proliferación celular, se incubaron células Vero durante 48 horas en presencia de LG 10 μM; transcurrido ese periodo de tiempo, los cultivos de células Vero fueron liberados de LG. Como control se utilizaron cultivos de células Vero con el mismo número inicial de células Vero pero sin LG. Los resultados se muestran en la Figura IB donde puede apreciarse que los cultivos de células Vero incubados 48 horas en presencia de LG 10 μM y liberados del LG, se comportaron igual que los cultivos control de células Vero (sin LG) en cuanto a proliferación celular.
EJEMPLO 2
Efecto del LG en la producción viral de células Vero en cultivo Se realizó este ensayo para analizar el efecto del LG (Sigma) sobre la infectividad del VPPA en células Vero susceptibles de ser infectadas por el virus previamente tratadas con LG.
La solución stock de LG se preparó a una concentración 40 mM en etanol y se almacenó en oscuridad a -2O0C hasta su empleo. A partir de ese stock se preparó una solución 10 mM de LG en etanol, de la que se pueden derivar otras más diluidas (e.g., 1 y 0,1 mM) en medio de cultivo sin que precipite el LG Células Vero cultivadas en placas multipocillos (MW6), con 7 cm2 de superficie/pocilio, a aproximadamente 100,000 células/cm2, fueron pretratadas, antes de la infección con VPPA, durante 1 hora, con la dosis correspondiente de LG (0 - 100 μM). Posteriormente, se retiró el medio y se inoculó el virus VPPA BA71V (adaptado a células Vero) a una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 2 unidades formadoras de placa (ufp)/célula, en un volumen reducido (en torno al 30%) manteniendo la concentración correspondiente de LG durante la adsorción viral, y se dejó incubar durante 1-2 horas. Transcurrido ese tiempo, se retiró el inoculo y se lavó 2 veces con medio fresco para eliminar el virus no adsorbido. A continuación, se repusieron 2 mL de medio fresco a los pocilios, suplementando con la concentración correspondiente de LG, y se dejó incubar a 370C hasta observar un efecto citopático masivo en cultivos control de células Vero infectadas con VPPA pero en ausencia de LG (los cultivos control fueron infectados en paralelo en presencia de la misma cantidad de etanol presente en las muestras tratadas con LG). Normalmente, el efecto citopático total en dichos cultivos control se observaba a las 24 horas post-infección. Finalmente, se procedió a valorar la producción total de virus infectivo mediante un ensayo de plaqueo sobre monocapas de células Vero en muestras duplicadas, tal como se ha descrito previamente (Enjuanes et al. Titration of African swine fever (ASF) virus, 1976; J. Gen. Virol. 32:471-7).
Para comprobar que la infección viral no era inhibida por el disolvente (etanol), el experimento se realizó en paralelo añadiendo la cantidad correspondiente de etanol presente en los tratamientos con LG. En el caso de células Vero está confirmada la ausencia de efecto inhibitorio hasta 20 μL de etanol por pocilio (con 2 mL de medio de cultivo) en todos los ensayos realizados.
A efectos comparativos se debe determinar la EC50, es decir, la concentración de inhibidor (LG) que reduce la producción viral al 50%. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2, donde puede apreciarse que la EC50 es de 1,5 μM para el LG.
EJEMPLO 3 Efecto del LG en la producción de distintos aislados de campo del VPPA por macrófagos de cerdo
Se realizó este ensayo para analizar el efecto del LG sobre la infectividad de distintos aislados de campo del VPPA en macrófagos de cerdo. El ensayo se realizó en condiciones análogas a las descritas en el ejemplo 1, excepto en el uso de otro tipo de cultivo celular (macrófagos de cerdo) que se infectó con aislados de campo del VPPA (cepas Mozam'86, E70 ó Uganda) en presencia de concentraciones crecientes de LG. La producción de virus infectivo se analizó por hemadsorción (Enjuanes L et al. Titration of African swine fever (ASF) virus, 1976; J. Gen. Virol. 32:471-7) y plaqueo (Bustos MJ et al. Plaque assay for African swine fever virus on swine macrophages. Arch. Virol., 2002; 147: 1453-9) sobre cultivos de macrófagos de cerdo. En la Figura 3 se puede observar que la inhibición de la producción viral se produce también en el rango de 1 a 10 μM de LG para los 3 aislados virales, pudiéndose calcular una EC50 del orden de 2-3 μM para el LG.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de lauril galato o de un derivado del mismo en la elaboración de una composición farmacéutica antiviral para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades provocadas por la infección causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA).
2. Uso según la reivindicación 1, en donde dicha composición farmacéutica es una composición para su administración por vía oral, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa.
3. Uso según la reivindicación 1, en donde dicha composición farmacéutica es administrada en combinación con un fármaco antiviral.
4. Uso según la reivindicación 3, en donde dicho fármaco antiviral se administra en forma de una composición separada para su administración simultánea o secuencial a la de la composición farmacéutica que comprende lauril galato, o un derivado del mismo, según la reivindicación 1.
5. Lauril galato para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades provocadas por la infección causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA).
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