WO2020099696A1 - Uso de ésteres derivados del ácido gálico como antivirales - Google Patents

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WO2020099696A1
WO2020099696A1 PCT/ES2019/070731 ES2019070731W WO2020099696A1 WO 2020099696 A1 WO2020099696 A1 WO 2020099696A1 ES 2019070731 W ES2019070731 W ES 2019070731W WO 2020099696 A1 WO2020099696 A1 WO 2020099696A1
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virus
vfa
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pharmaceutically acceptable
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PCT/ES2019/070731
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Inventor
Patricia DE LEÓN VALDES
María José BUSTOS SÁNCHEZ
Ángel Luis LOPEZ CARRASCOSA
Francisco Sobrino Castello
Elisa TORRES LORITE
Rodrigo CAÑAS ARRANZ
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • esters derived from gallic acid as antivirals
  • the invention relates to a new use of esters derived from gallic acid, in particular Iauryo gallate (hereafter, GL) as an antiviral agent! in the treatment and / or prevention of FMDV infections.
  • esters derived from gallic acid in particular Iauryo gallate (hereafter, GL) as an antiviral agent! in the treatment and / or prevention of FMDV infections.
  • Gallic acid derivatives have previously been used as antioxidant or antitumor agents.
  • Various gallic acid esters have been used as antioxidants under several different conditions, including as part of a pharmaceutical composition or formulation. It has also been described that alkyl esters (propyl, octyl and Iauru) of! Gallic acid, known as antioxidant food additives (E-310, E-311, and E-312, respectively), inhibit the proliferation of tumor cell lines (Calcabrini A., Garcia-Martinez JM, González L, et ai. Carcinogenesis 2008; 27: 1699-1712; Roy G., Lombardia M., Palacios C., et al.
  • a cell-directed antiviral drug against AFV would have numerous advantages, such as activity against various virus serotypes, prevention of livestock infections in which vaccination is not routinely applied (developing countries), reduction of spread virus and as a complementary tool even at sites where vaccination against AFV is provided.
  • the present invention provides esters derived from gallic acid as a cell-directed antiviral drug against AFV.
  • This invention provides compounds with antiviral properties and the method of using them. It includes the use of lauryl gallate (GL), an ester of gallic acid, to protect animals from foot and mouth disease (FMDV) infections.
  • the invention is directed at the field of drugs that affect cellular processes, rather than targeting proteins or viral functions, to control the spread of the virus.
  • the inventors have observed consistent antiviral activity in cells infected by the old fever virus (AFV) of two different serotypes, in concentrations of the drug that were non-toxic, reducing the productivity of the virus to 2 log u .
  • the drug (GL) should be present prior to viral infection since GL-inhibited passage occurs very early during the virus cycle.
  • VFA production is specific for GL between different ios derived from alkyl gaiates, where GP (propyl gallate) and AG (gallic acid) are totally ineffective against VFA in non-cytotoxic concentrations.
  • the present invention refers to a compound having the following formula (I):
  • the compound of formula (I) is a known compound that can be obtained by synthesis by direct esterification reaction of gallic acid with lauric alcohol (dodecanol) (J. Am. Chem. Soc., 1947, 89, 2003-2005). However, they are also available on the market. Unless otherwise indicated, the compounds used in the invention are intended to include compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms. For example, compounds having the present structures except for the substitution of a hydrogen atom for a deuterium atom or a tritium atom, or the substitution of a carbon atom enriched in 13 C or 14 C or a nitrogen atom enriched in 15 N, fall within the scope of this invention.
  • the term "derivatives” includes esters and ethers obtained by reacting 1, 2 or 3 of the free hydroxyl groups of the compound of formula (i) with organic acids or with alcohols, respectively; therefore, the present invention includes derivatives in which 1, 2 or 3 of the free hydroxyl groups (-OH) of the compound of formula ( ⁇ ) are replaced in formula (I) by -O-alky! groups or (C1-C4) or -OCO-alkyl (C1-C4).
  • These compounds (esters and ethers) can be hydrolyzed inside the cell releasing the compound of formula (I), since in the cells there are intracellular enzymatic systems necessary to break these bonds and release the active principle inside the cells.
  • derivatives would, in general, be more hydrophobic than the compound of formula (I), or that would facilitate greater absorption through cell membranes.
  • Illustrative, nonimitative examples of such derivatives include methoxy, ethoxy derivatives, etc. (inside the ethers) and acetates, propanoates, etc. (inside the esters).
  • (C1-C4) aky refers to a saturated hydrocarbyl radical of straight or branched chain configuration of 1 to 4 carbon atoms. Methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutiium, tertiary butyl and the like are included within the scope of this term.
  • pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that are physiologically tolerable and do not typically cause an allergic reaction or similar unfavorable reaction, such as gastric distress, dizziness, and the like, when administered to a subject.
  • pharmaceutically acceptable means approved by a regulatory agency of a federal government or state or listed in the US Pharmacopeia. and another generally recognized pharmacopoeia for use in animals and, more particularly, in humans.
  • the compounds used in the invention may be in crystalline form, either as free compounds or as solvates (eg, hydrates), and both forms are understood to be within the scope of the present invention. Soivation methods are generally known in the state of the art. Suitable solvates are pharmaceutically acceptable solvates. In a particular embodiment, the solvate is a hydrate.
  • Tautomers are understood to be the two isomers that differ only in the position of a functional group because between the two forms there is a chemical equilibrium in which the migration of a group or an atom occurs.
  • treatment or prevention refers to reversing, alleviating and inhibiting the progress of, or avoiding the disorder or condition to which it is applied in said terms, one or more symptoms of said disorder or condition.
  • the term "subject” includes any animal that has an immune system, preferably a mammal, eg, domestic or wild pigs, wild boars, etc., and livestock in general. Humans are also included within that term.
  • compositions comprising the compound of formula (i), its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates, as defined above for use in the prevention and / or treatment of an infection by the old fever virus.
  • the composition of the invention is a pharmaceutical composition.
  • pharmaceutical composition means the composition that includes the compound of formula I (including its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates), and at least one pharmaceutically acceptable excipient, adjuvant and / or carrier.
  • excipients, adjuvants, and / or supports refers to molecular entities or substances through which the active ingredient is administered.
  • Said excipients, adjuvants or pharmaceutical supports can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like, excipients, disintegrating agents, wetting agents, or diuents.
  • Suitable pharmaceutical excipients and supports are described in "Remington's Pharmaceuticai Sciences” by EW Martin.
  • the pharmaceutical composition is administered in a therapeutically effective amount and can be administered by any suitable route of administration, eg, topically or intraperitoneally, now.
  • said pharmaceutical compositions can be in an oral dosage form, either solid or liquid.
  • oral dosage forms for oral administration include tablets, capsules, granules, solutions, suspensions, etc., and may contain conventional excipients such as binders, diuents, disintegrating agents, lubricants, humectants, etc., and can be prepared by conventional methods.
  • the pharmaceutical compositions can also be adapted for parenteral administration, in the form of, for example, sterile solutions, suspensions or lyophilized products in the suitable dosage form; In this case, said pharmaceutical compositions will include suitable excipients, such as buffers, surfactants, etc. In either case, the excipients are chosen according to the selected pharmaceutical form of administration.
  • the compound of formula (I) will be in a substantially pure or pharmaceutically acceptable form, that is, that the compound of formula (I) has a pharmaceutically acceptable level of purity, excluding pharmaceutically acceptable excipients and that do not include a material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for a compound of formula (I) are preferably above 50%, more preferably above 70%, more preferably above 90%. In a preferred embodiment, they are above 95%.
  • the term "therapeutically effective amount” means the amount of a compound necessary for the treatment or prevention of the disease, disorder or condition to be effective. It will also depend on the subject to be treated, the severity of the disease suffered by said subject, the chosen form of administration, etc.
  • the doses mentioned in this invention should only be considered as guidelines for the person skilled in the art, and he or she should adjust the doses according to the variables mentioned above.
  • the compound of formula (I), its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates can be administered one or more times a day, for example, once or twice a day, in a usual total daily amount between 100 and 200 mg / per kg of body weight / day, preferably 100 mg / per kg of body mass / day.
  • composition of the invention can be a nutritional composition or a cosmetic composition.
  • the expression "nutritional composition” of the present invention refers to a food that beneficially affects one or several functions of the organism, so as to provide a better state of health and well-being.
  • the nutritional composition can be used for the prevention or treatment of a disease.
  • the term "nutritional composition” of the present invention can be used as a synonym for food or functional food for a particular nutritional purpose or medicinal food.
  • cosmetic composition refers to a composition that is intended to be applied to the skin or coat of an animal to regulate the condition of the skin or coat and / or improve appearance, hygiene, aroma, etc. of the animal.
  • composition provided by this invention can be used to treat any subject, including humans, in a particular embodiment, the composition of the invention is especially useful for treating livestock.
  • the compound of formula (i), its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates, in addition to the compositions containing them can be used in conjunction with other additional antiviral drugs useful in prevention and / or treatment of diseases caused by infections caused by viruses.
  • Said additional drugs may form part of the same composition or, alternatively, may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or sequential administration to the composition comprising the compound of formula (I), its derivatives, tautomers and / or solvates pharmaceutically acceptable.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the prevention and / or treatment of a foot-and-mouth disease virus infection in a subject, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of the compound of the formula ( I), its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates.
  • a therapeutically effective amount of the compound of the formula ( I), its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of the compound of the formula ( I), its pharmaceutically acceptable derivatives, tautomers and / or solvates.
  • F1G Toxicity on the virus direct of the GL on the VFA.
  • FIG. 2 In vitro inhibition of VFA by GL
  • FIG. 3 Effect of gallate esters on VFA infection
  • FIG. 4 Effect of GL time addition on VFA infections
  • FIG. 5 Effect of GL on VFA protein expression
  • FIG. 6 In Vitro Effect of GL on VFA RNA Synthesis
  • FIG. 7. Survival rates after challenge test in mice treated with GL
  • FIG. 8. Effect “in vivo” of GL on VFA RNA synthesis
  • the inventors established for the first time the range of GL concentrations to be used in these studies, through cell viability tests, and confirmed the absence of virucidal effect of this drug on the viral particle.
  • Cell viability determination was performed using the MT ⁇ assay, as previously described (Hurtado C. et al. Antiviral Therapy. 2008, 13: 909-91). Briefly, cell monolayers were grown in 96-well plates prior to the addition of the corresponding GL concentration (Sigma), using six wells for each dose. After 24h incubation the medium was replaced with a culture medium containing MTT, incubated 2h and lysed with an iisis solution containing SDS. Absorbance at 550 nm was determined after 15 min of incubation, and the mean values (of 6 wells) obtained were subtracted from the background levels (in the absence of cells) and compared with the scoring data in the absence of drug (100% viability).
  • VFA suspensions (10 5 pfu) in 0.9 ml of culture medium were added with 0.1 ml of GL solutions to obtain the indicated GL concentration (0 to 300 mM); Controls with viruses incubated in 2% ethanol in the absence of the drug were incubated in parallel. After 1h incubation at room temperature, factor 10 dilutions of each sample were immediately prepared in culture medium and plated on monolayers of virus sensitive BHK-21 cells. Virus titers were compared in duplicate samples with those obtained in virus samples incubated in the absence of the drug. As shown in Fig. 1, no direct toxicity was observed in the VFA samples when incubated with GL in the indicated concentration range.
  • Monolayers of BHK-21 cells were grown in 96-well plates and incubated for 1 hr with the indicated concentrations of GL.
  • Lauryl gallate (GL) stock solutions were diluted in 2% ethanol (a concentration previously shown to retain more than 80% cell viability) in DMEM to obtain working stock solutions.
  • the duplicate cultures were infected with VFA (C-S8c1) at the indicated MGI (multiplicity of infection) in a reduced volume of the medium containing the GL for 1-2 h, released from the virus inoculum and washed twice with medium, before adding the drug containing fresh medium (supplemented with 2% FCS). The cultures were then incubated until a massive cytopathic effect was observed. Total production! virus was assessed by plaque assay on BHK-21 cells As shown in Fig 2, a consistent decrease of more than 1 og u in VFA production was regularly observed in BHK-21 cells at different MG! in the presence of 10 mM GL.
  • GL was the only compound that inhibited VFA infection in a concentration range (10 to 30 mM) that still maintained cell viability.
  • Gallic acid and propyl gaiate did not inhibit the growth of AFV in non-toxic concentrations (up to 100 mM), while octyl gaiate reduced virus production by 2 log or 100 mM, an effect that could be due to the cellular toxicity exerted by this concentration of GO.
  • an assay was performed adding a compound at different times pi (post-infection).
  • BHK-21 cells were grown in 96-well plates and infected with VFA (CS8c1) at an MOI of 0.1, 1, or 5 pfu / cell. After 1 h virus adsorption (0 h pi), the cultures were washed twice to remove the non-adsorbed virus and further incubated at 37 ° C in culture medium.
  • GL was added to duplicate wells at a final concentration of [10 mM], and the cultures were further incubated up to 24 h pi, when they were collected and the virus produced was quantified by plaque assay.
  • Antiviral Tberapy 13: 909-91). The production of the virus was inhibited when GL was added up to 5 h pi and the maximum production of the virus was released to from 15 h pi, which implies the replication of viral DNA as the sensitive step to GL in the inhibition of the virus. When the infection was performed at a higher MOI of 1 or 5 pfu / cell, this effect, which results in a double curve due to two cycles of infection, disappeared.
  • the protein extracts were separated by 12% polyacrylamide gel electrophoresis and then subjected to electro-biotting and incubated with SD6 or 2D2 antiserum (specific for VP1 and 3C proteins, respectively , Garc ⁇ a-Briones M. et ai Virology, 2008, 349: 409-421) and were revealed by ECL autoradiography.
  • VRC VFA RNA
  • RNA intraceiuiar and extracellular
  • extracellular RNA was extracted.
  • CDNA was synthesized using reverse transcriptase and qPCR was performed with primers that amplified a conserved region previously described in the 3D polymerase sequence (Sáiz M. et a !. Vet f ⁇ es, 2003 34 (1): 1Q5-17).
  • a standard curve was prepared using factor ten dilutions of the cDNA obtained from the RNA of the PMT28 clone, which contained the target sequence.
  • C57 mice were selected for in vivo studies, as this mouse strain is clinically susceptible to VFA infection (Salguero FJ et ai Viroiogy, 2005, 332: 384-396).
  • a preliminary test to determine the toxicity of GL in C57 mice revealed non-toxic working concentrations of just 200 mg / Kg administered twice daily for 5 consecutive days.
  • We next evaluated the protective efficacy of GL against the intraperitoneal challenge test of CS8 isolate of VFA in C57 mice (n 10 per group).
  • a dose of 100 mg / Kg or 200 mg / Kg of GL was administered intraperitoneally once a day for three (groups 0) or four consecutive days (groups -1).
  • mice were challenged with 1000 pfu of VFA CS8 after 1b (groups 0) or 24 b (groups-1) after GL administration. Mice were monitored daily to determine survival rate and clinical evaluation. As described, VFA produced limited mortality in G57 mice, with a survival rate of 40% in control infected with viruses not treated with GL (Fig. 7). Simultaneous inoculation of GL and VFA did not confer any protection (groups 0), while inoculation of GL 24h before the viral challenge test (groups -1), increased the survival rate to 70% in GL doses of 100 mg / Kg and 200 mg / Kg. Although both doses conferred the same protection, mice treated with 200mg / Kg showed higher clinical scores than those treated with 100mg / dose.
  • RNA intracellular and extracellular
  • CDNA was synthesized using reverse transcriptase, and qPCR was performed with primers in the 3D sequence described above (Sáiz M. et al. Vet Res, 2003, 34 (1): 105-17).
  • a significant reduction in copies of the viral RNA (CRV) was observed in all samples from C57 mice infected with VFA who had received a daily dose of GL (100 mg / Kg), starting 24 h before virus inoculation.

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Abstract

La invención hace referencia a un nuevo uso de ésteres derivados del ácido gálico, en particular, galato de laurilo, sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, como agentes antivirales en el tratamiento y/o prevención de infecciones por el virus de la fiebre aftosa (VFA). Además, la presente invención hace referencia a composiciones que comprenden dichos compuestos.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de ésteres derivados del ácido gálico como antivirales
La invención hace referencia a un nuevo uso de ésteres derivados dei ácido gálico, en particular, galato de Iaurüo (de aquí en adelante, GL) como un agente antivira! en el tratamiento y/o prevención de infecciones por el virus de la fiebre aftosa (VFA).
ESTADO DEL ARTE
Los derivados del ácido gálico se han utilizado anteriormente como agentes antioxidantes o antitumorales. Se han utilizado diversos ésteres del ácido gálico como antioxidantes bajo varias condiciones diferentes, incluyendo como parte de una composición o formulación farmacéutica. También se ha descrito que ésteres de alquilo (propilo, octilo y Iaurüo) de! ácido gálico, conocidos como aditivos alimentarios antioxidantes (E-310, E-311 y E-312, respectivamente), inhiben la proliferación de líneas celulares tumorales (Calcabrini A., Garcia-Martinez J.M., González L, et ai. Carcinogenesis 2008; 27:1699-1712; Roy G., Lombardia M., Palacios C., et al. Arch Biochem Biophys 2000; 383:206-214; Ortega E., Sadaba M.C., Qrtiz A.I., et ai. Br J Cáncer 2003; 88:940-943) desencadenando la apoptosis de la célula (Serrano et ai. Arch. Biochem. Biophys. 1998, 350, 49-54) y la inhibición concomitante de las proteínas tirosina quinasas (Palacios et ai. J. Enzyme inhib. 2001. 18, 527-533), proporcionando de este modo un posible efecto protector contra la carcinogénesis.
Diversos informes en la literatura ilustran la actividad antiviral de los gaiatos de alquilo, por ejemplo, con agentes anticancerígenos que se muestran prometedores contra ios Orthopoxvirus y quizás otros virus también (Kane C.J., Menna J.H., Sung C.C., Yeh Y.C. Biosci Rep 1988; 8:95-102), o más específicamente, el efecto del galato de octilo y Iaurüo sobre diversas infecciones de virus producidas por especies de virus ARN y ADN envueltos (Uozaki M., Yamasaki H., Katsuyama Y., Higuchi M., Higuti Ϊ., Koyama A.H. Antiviral Res 2007; 73:85-91 ; Yamasaki H., Uozaki M., Katsuyama Y. et ai. Int J Mol Med 2007; 19:685-688; Hurtado C., Bustos M.J., Sabina P., et al. Antivir Ther 2008; 13:909-917). El efecto del GL podría estar mediado por su interacción con fosfolípidos en membranas biológicas (Jurak M., Miñones J, Jr. Biochim Biophys Acta 2016; 1858:1821-1832), con efectos tensoactiavos que desestabilízan las envolturas celulares y virales. Además de la actividad antioxidante o antitumoral, los derivados de! ácido gálico también han sido descritos por su actividad antiviral como posibles herramientas para ¡a prevención de la diseminación de virus ADN y ARN.
Los compuestos antivirales que están dirigidos a! metabolismo celular en lugar de a los componentes víricos se han convertido en una cuestión interesante para la prevención y el control de la propagación de infecciones víricas, ya sea como tratamiento único o como un complemento de la vacunación. Ya se han realizado estudios en referencia al efecto de! GL, uno de estos antivirales dirigidos a la célula, (Yamasaki H, Uozaki M, Katsuyama Y, et a!. IniJ Mo! Med 2007; 19:685-688), que confirman su acción antivira! “¡n vitro”.
La búsqueda de antivirales eficientes contra infecciones por VFA ha producido únicamente una información poco sólida, donde la baja restricción de la infección vírica depende de diferentes aproximaciones (Annebel R. De Vieeschauwer, David J. Lefebvre y Kris De Ciercq. Antiviral Therapies for Foot-and-mouth Disease. En“Foot-and-mouth Disease Virus: Current Research and Emerging Trends” 2017, pp 370-395. Eds. F. Sobrino y E. Domingo (Caister Academic Press)).
Un fármaco antiviral dirigido a la célula contra el VFA tendría numerosas ventajas, como actividad contra diversos serotipos de virus, la prevención de infecciones del ganado en el que la vacunación no se aplica de forma rutinaria (países en desarrollo), la reducción de la propagación de virus y como herramienta complementaria incluso en emplazamientos en ios que se proporciona vacunación contra el VFA. En este sentido, ¡a presente invención proporciona ésteres derivados dei ácido gálico como un fármaco antiviral dirigido a la célula contra el VFA.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona compuestos con propiedades antivirales y el método de utilización de ios mismos. Incluye ei uso de galato de lauriio (GL), un éster dei ácido gálico, para proteger animales de infecciones por el virus de la fiebre aftosa (VFA). La invención está dirigida ai campo de ios fármacos que afectan a los procesos celulares, en lugar de dirigirse a las proteínas o funciones virales, para controlar la diseminación del virus. En el caso del GL, los inventores han observado una consistente actividad antiviral en células infectadas por el virus de la fiebre añosa (VFA) de dos serotipos diferentes, en concentraciones del fármaco que resultaron no tóxicas, reduciendo la productividad del virus hasta 2 log u. Preferiblemente, el fármaco (GL) debería estar presente antes de la infección vírica ya que el paso inhibido por el GL ocurre muy temprano durante el ciclo del virus.
La inhibición de la producción del VFA es específica para el GL entre ios diferentes derivados de los gaiatos de alquilo, donde el GP (galato de propilo) y el AG (ácido gálico) resultan totalmente inefectivos contra el VFA en concentraciones no citotóxicas.
Además, se observó una reducción de la mortalidad, ios signos clínicos y ¡as copias de ARN viral en diferentes tejidos en el día 2 posterior a la infección en ratones C57 infectados con VFA que habían recibido una dosis diaria de GL (100 mg/Kg), comenzando 24 h antes de la inoculación del virus.
Estos resultados confirman el potencial del GL como inhibidor in vivo de la infección por
VFA.
Entonces, en un primer aspecto, la presente invención hace referencia a un compuesto que tiene la siguiente fórmula (I):
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sus derivados, faufómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables,
para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el virus de ia fiebre aftosa.
El compuesto de fórmula (I) es un compuesto conocido que puede ser obtenido mediante síntesis por reacción de esterificación directa del ácido gálico con alcohol láurico (dodecanol) (J. Am. Chem. Soc., 1947, 89, 2003-2005). Sin embargo, se encuentran también disponibles en el mercado. A menos que se indique de otro modo, se pretende que ¡os compuestos utilizados en ¡a invención incluyan compuestos que difieran únicamente en ia presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, compuestos que tengan las presentes estructuras excepto para la sustitución de un átomo de hidrógeno por un átomo de deuterio o un átomo de tritio, o ¡a sustitución de un átomo de carbono enriquecido en 13C o 14C o un átomo de nitrógeno enriquecido en 15N, entran dentro del alcance de esta invención.
Tal como se utiliza en la presente patente, el término“derivados” incluye ásteres y éteres obtenidos por reacción de 1 , 2 o 3 de los grupos hidroxilo libres del compuesto de fórmula (i) con ácidos orgánicos o con alcoholes, respectivamente; por lo tanto, la presente invención incluye derivados en ¡os que 1 , 2 o 3 de los grupos hidroxilo libres (-OH) del compuesto de fórmula (¡) se sustituyen en la fórmula (I) por grupos -O- alqui!o(C1-C4) o -OCO-alquiio(C1-C4). Estos compuestos (ásteres y éteres) pueden ser hidrolizados dentro de la célula liberando el compuesto de fórmula (I), ya que en ¡as células existen sistemas enzimáticos intracelulares necesarios para romper estos enlaces y liberar el principio activo en el interior de las células. Estos derivados serían, en general, más hidrófobos que el compuesto de fórmula (I), ¡o que facilitaría una mayor absorción a través de las membranas celulares. Ejemplos Ilustrativos, no ¡imitativos de tales derivados incluyen metoxi, derivados de etoxi, etc. (dentro de los éteres) y acetatos, propanoatos, etc. (dentro de los ésteres).
Tal como se utiliza en ia presente patente el término“a¡qui¡o(C1 -C4)” hace referencia a un radical de hidrocarbilo saturado de configuración de cadena recta o ramificada de 1 a 4 átomos de carbono. Se incluyen dentro del alcance de este término metilo, etilo, n~ propilo, isopropilo, n-butilo, isobutiio, butilo terciario y similares.
El término“farmacéuticamente aceptable” hace referencia a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen habitualmente una reacción alérgica o una reacción similar desfavorable, tal como malestar gástrico, mareo y efectos secundarios similares, cuando se administran a un sujeto. Preferiblemente, el término“farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno o estado federal o recogido en ¡a Farmacopea de EE.UU. y otra farmacopea reconocida en general para el uso en animales y, más en particular, en humanos. Los compuestos utilizados en la invención pueden encontrarse en forma cristalina, ya sea como compuestos libres o como solvatos (p ej : hidratos), y se entiende que ambas formas entran dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de soivatación son conocidos en general en el estado del arte. Son solvatos adecuados ios solvatos farmacéuticamente aceptables. En una realización en particular, el solvato es un hidrato.
Se entiende que los“Tautómeros” son los dos isómeros que difieren únicamente en la posición de un grupo funcional porque entre las dos formas existe un equilibrio químico en el que ocurre la migración de un grupo o un átomo.
El término“tratamiento o prevención” tal como se utiliza en la presente patente, a menos que se indique de otro modo, hace referencia a revertir, aliviar e inhibir el progreso de, o evitar el trastorno o condición a la que se aplica en dichos términos, uno o más síntomas de dicho trastorno o condición.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término“sujeto” incluye cualquier animal que tenga un sistema inmunológico, preferiblemente, un mamífero, por ejemplo, cerdos domésticos o salvajes, jabalíes, etc., y ganado en general. Los seres humanos también se incluyen dentro de dicho término.
Otro aspecto de la presente invención hace referencia a una composición que comprende el compuesto de fórmula (i), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, según se define anteriormente para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el virus de la fiebre añosa.
En una realización en particular, la composición de la invención es una composición farmacéutica. El término “composición farmacéutica” significa la composición que incluye el compuesto de fórmula I (incluyendo sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables), y al menos un excipiente, adyuvante y/o soporte farmacéuticamente aceptable.
El término “excipientes, adyuvantes y/o soportes” hace referencia a entidades moleculares o sustancias a través de las cuales se administra el ingrediente activo. Dichos excipientes, adyuvantes o soportes farmacéuticos, pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tal como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y aceites similares, excipientes, agentes disgregantes, humectantes o diiuyentes. Excipientes farmacéuticos y soportes adecuados se describen en "Remington's Pharmaceuticai Sciences" por E.W. Martin.
La composición farmacéutica se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva y puede ser administrada por cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo, vía ora!, tópica o intraperítoneal.
En una realización en particular, dichas composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en una forma farmacéutica de administración ora!, ya sea sólida o líquida. Entre los ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración oral se incluyen comprimidos, cápsulas, granulos, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener excipientes convencionales tales como aglutinantes, diiuyentes, agentes disgregantes, lubricantes, humectantes, etc., y pueden prepararse mediante métodos convencionales. Las composiciones farmacéuticas pueden también adaptarse para su administración por vía parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles en la forma de dosificación adecuada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se eligen de acuerdo con la forma farmacéutica de administración seleccionada. Un resumen de las diferentes formas farmacéuticas de administración de fármacos y su preparación puede encontrarse en el libro "Treatise on Gaienic Pharmacy " por C. Faulí i Trillo, 10a Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones, o en cualquier otro libro de características similares en cada país.
Para su aplicación en la terapia, el compuesto de fórmula (I) se encontrará en una forma sustancialmente pura o farmacéuticamente aceptable, es decir, que el compuesto de fórmula (I) tenga un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable, excluyendo excipientes farmacéuticamente aceptables y que no incluya un material considerado tóxico en niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para un compuesto de fórmula (I) se encuentran preferiblemente por encima del 50%, más preferiblemente por encima del 70%, más preferiblemente por encima del 90%. En una realización preferida, están por encima del 95%. Tal como se utiliza en la presente patente, la expresión“cantidad terapéuticamente efectiva” significa la cantidad necesaria de un compuesto para que el tratamiento o la prevención de la enfermedad, trastorno o condición sean efectivos. También dependerá del sujeto a ser tratado, la gravedad de la enfermedad sufrida por dicho sujeto, la forma de administración elegida, etc. Por esta razón, las dosis mencionadas en esta invención deberían considerarse únicamente como guías para el experto en el arte, y éí o ella debería ajustar las dosis de acuerdo a las variables mencionadas anteriormente. Sin embargo, el compuesto de fórmula (I), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables pueden ser administrados una o más veces el adía, por ejemplo, una o dos veces al día, en una cantidad total diaria habitual entre 100 y 200 mg / por kg de peso corporal / ai día, preferiblemente 100 mg / por kg de masa corporal / día.
Alternativamente, la composición de la invención puede ser una composición nutricional o una composición cosmética.
La expresión“composición nutricional” de ia presente invención hace referencia a un alimento que afecta beneficiosamente a una o a diversas funciones dei organismo, de manera que proporcione un mejor estado de salud y bienestar. La composición nutricional puede ser utilizada para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. La expresión“composición nutricional” de la presente invención puede ser utilizada como sinónimo de comida o comida funcional para un propósito nutricional en particular o comida medicinal.
Tal como se utiliza en la presente patente, la expresión“composición cosmética” hace referencia a una composición que pretende ser aplicada a ia piel o pelaje de un animal para regular la condición de la piel o pelaje y/o mejorar la apariencia, higiene, aroma, etc. del animal.
Aunque, en principio, la composición provista por esta invención puede ser utilizada para tratar a cualquier sujeto, incluyendo a seres humanos, en una realización en particular, la composición de la invención es especialmente útil para tratar ganado.
El compuesto de fórmula (i), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, además de las composiciones que los contienen pueden utilizarse en conjunto con otros fármacos antivirales adicionales útiles en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por infecciones causadas por virus. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición o, alternativamente, pueden proporcionarse en forma de una composición independiente para la administración simultánea o secuencial a la composición que comprende el compuesto de fórmula (I), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la invención hace referencia a un método para la prevención y/o tratamiento de una infección por el virus de la fiebre aftosa en un sujeto, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la fórmula (I), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables. Las características del compuesto de fórmula (i), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, ya han sido mencionadas anteriormente
A menos que se defina de otro modo, todos ios términos técnicos y científicos utilizados en la presente patente tienen ei mismo significado que ei que se entiende comúnmente por un experto habitual en el arte al que esta invención pertenece. Pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica de ia presente invención. A lo largo de ia descripción y reivindicaciones ei término“comprender” y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes, o pasos. Objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para ios expertos en el arte ai examinar la descripción, o pueden ser aprendidos mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
F1G. 1. Toxicidad sobre el virus directa dei GL sobre el VFA.
FIG. 2. Inhibición“in vitro” dei VFA por el GL
FIG. 3. Efecto de los Esteres de galato sobre la infección por VFA
FIG. 4. Efecto de la adición de tiempo del GL en las infecciones por VFA
FIG. 5. Efecto del GL sobre la expresión de proteínas del VFA
FIG. 6. Efecto“in vitro” del GL sobre la síntesis de ARN del VFA
FIG. 7. Tasas de supervivencia tras prueba de provocación en ratones tratados con GL FIG. 8. Efecto“¡n vivo” del GL sobre la síntesis de ARN del VFA
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deberían ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
Los inventores establecieron por primera vez el rango de concentraciones del GL que se van a utilizar en estos estudios, a través de ensayos de viabilidad celular, y confirmaron la ausencia de efecto virucida de este fármaco sobre la partícula viral.
Otros ásteres de galato han sido también sometidos a ensayo para determinar su inhibición de ¡a productividad del VFA, para evaluar la especificidad del efecto inhibidor del GL
En referencia ai modo de acción del GL, ios experimentos sobre el efecto de los tiempos de su adición en cultivos de células infectadas indicaron que este compuesto inhibía una etapa tardía en la infección por VFA. La presencia del antiviral redujo significativamente la inducción de las proteínas específicas del virus.
1 , Citotoxicidad del GL en la línea celular BHK-21 ,
La determinación de viabilidad celular se realizó mediante el ensayo de MTΪ, tai como ha sido descrito previamente (Hurtado C. et ai. Antiviral Therapy. 2008, 13:909-91). Brevemente, se cultivaron monocapas celulares en placas de 96 pocilios antes de la adición de la correspondiente concentración de GL (Sigma), utilizando seis pocilios para cada dosis. Después de 24h de incubación el medio se reemplazó con un medio de cultivo que contenía MTT, se incubó 2h y se sometió a lisis con una solución de iisis que contenía SDS. La absorbencia a 550 nm se determinó después de 15 min de incubación, y ios valores medios (de 6 pocilios) obtenidos se restaron de los niveles de fondo (en ausencia de células) y se compararon con ios datos puntuados (scoring) en ausencia del fármaco (100% de viabilidad). A partir de las curvas de viabilidad de cada célula (no se muestran) calculamos el valor CC50 (concentración del GL con una producción del 50% de viabilidad celular) (Tabla 1). A partir de estos resultados, se eligieron las concentraciones de trabajo de 1 a 40 mM para realizar los experimentos bajo condiciones no citotóxicas.
Tabla 1 :
Figure imgf000011_0001
2. Toxicidad sobre el virus directa del GL sobre el VFA.
Para determinar un posible efecto virucida directo del GL sobre la partícula del virus, se añadieron suspensiones de VFA (105 pfu) en 0,9 mi de medio de cultivo con 0,1 mi de soluciones de GL para obtener la concentración de GL indicada (de 0 a 300 mM); controles con virus incubados en 2% de etanol en ausencia del fármaco se incubaron en paralelo. Después de 1h de incubación a temperatura ambiente, se prepararon inmediatamente diluciones de factor 10 de cada muestra en medio de cultivo y se titularon por ensayo en placa en monocapas de células BHK-21 sensibles al virus. Los títulos de los virus se compararon en muestras duplicadas con los obtenidos en muestras de virus incubadas en ausencia del fármaco. Tal como se muestra en la Fig. 1 , no se observó ninguna toxicidad directa en las muestras de VFA cuando se incubaron con GL en el rango de concentraciones indicado.
3. Inhibición del VFA por GL,
Se cultivaron monocapas de células BHK-21 en placas de 96 pocilios y se incubaron durante 1 h con las concentraciones indicadas de GL. Se diluyeron soluciones madre de galato de lauriio (GL), en etanol al 2% (una concentración que mostró previamente que conserva más del 80% de viabilidad celular), en DMEM para obtener las soluciones madre de trabajo. Después de la incubación con GL, los cultivos duplicados se infectaron con VFA (C-S8c1) a la MGI (multiplicidad de infección) indicada en un volumen reducido del medio que contiene el GL durante 1-2 h, se liberaron del inoculo del virus y se lavaron dos veces con medio, antes de la adición del fármaco que contenía medio fresco (complementado con FCS al 2%). Los cultivos se incubaron a continuación basta que se observó un efecto citopático masivo. La producción tota! del virus se evaluó mediante ensayo en placa en células BHK-21 Tal como se muestra en la Fig 2, se observó regularmente una disminución consistente de más de 1 ¡og u en la producción de VFA en las células BHK-21 a diferente MG! en presencia de 10 mM de GL.
4, Efecto de tos ásteres de gaiato en la infección por VFA,
Para determinar la especificidad del GL en la inhibición de ia multiplicación dei VFA, se analizó el efecto de diversos ásteres de gaiato (gaiato de propilo, octilo y lauriro), incluyendo el ácido gálico (Uozaki M, et al. Antivira i Res. 2007 73:85-91), en células BHK-21 infectadas con VFA. Tai como se muestra en la Fig. 3, el GL fue el único compuesto que inhibió la infección por VFA en un rango de concentraciones (10 a 30 mM) que aún mantenía la viabilidad celular. No el ácido gálico ni el gaiato de propilo inhibieron el crecimiento dei VFA en concentraciones no tóxicas (hasta 100 mM), mientras que el gaiato de octilo redujo ia producción del virus en 2 log u a 100 mM, un efecto que podría ser debido a la toxicidad celular ejercida por esta concentración de GO.
5. Efecto de los tiempos de adición del GL en las infecciones por VFA.
Para abordar la etapa en el ciclo de crecimiento dei VFA al que está dirigido el GL, se realizó un ensayo añadiendo un compuesto en diferentes tiempos pi (posterior a ¡a infección). Se cultivaron células BHK-21 en placas de 96 pocilios y se infectaron con VFA (CS8c1) a una MOI de 0,1 , 1 o 5 pfu/célula. Después de 1h de adsorción del virus (0 h pi), ios cultivos se lavaron dos veces para retirar el virus no adsorbido y se incubaron adicionalmente a 37°C en medio de cultivo. En tiempos diferentes (desde 3 h antes de ia infección a 24 h pi), se añadió GL a pocilios duplicados a una concentración final de [10 mM], y se incubaron los cultivos adicionalmente hasta 24 h pi, cuando fueron recogidos y el virus producido se cuantificó por ensayo en placa. El GL bloqueó el crecimiento del virus cuando se añadió hasta 7 h pi a una MOI de >0,1 pfu/célula (Fig. 4A), lo que indica que el paso inhibido por el fármaco fue tardío en cuanto a ia infección - la MOI de un ciclo dei VFA de 1-5 se logra en aproximadamente 8-10 h. Cuando el experimento se realiza con una MOi de 0,1 pfu/célula, es de esperar que tengan lugar dos ciclos de virus consecutivos a 24 h pi, tal como se observa en la segunda parte de ia curva que se muestra en la Fig. 4B. En este caso, se observa una meseta de 8 a 15 h pi (cuando el segundo ciclo del virus se inhibe por ia adición del GL), y la productividad total del virus es restablecida en 20-24 h pi. Un resultado similar se describió para la acción inhibidora del GL sobre la infección por el VPPA en células Vero (Hurtado C, Bustos, MJ, Sabina P, Nogal ML, Granja AG, González ME, González-Porqué P, Revilla, Y y Carrascosa AL. (2008). Antiviral activity of lauryl gállate against animal viruses. Antiviral Tberapy 13:909-91).): la producción del virus fue inhibida cuando el GL se añadió hasta 5 h pi y la producción máxima del virus fue liberada a partir de las 15 h pi, lo que implica la replicación del ADN viral como el paso sensible al GL en la inhibición del virus. Cuando la infección se realizó a una MOI más elevada de 1 o 5 pfu/célula, este efecto, que da lugar a una doble curva debido a dos ciclos de infección, desapareció.
6 Efecto del GL sobre la expresión de proteínas del VFA
La presencia de GL 10 mM produjo un 90% de inhibición de los títulos de los virus en cultivos de células BHK-21 infectadas con el VFA. Para determinar el efecto del GL en la síntesis de proteínas del virus, analizamos la expresión de proteínas del VFA estructurales (VP1) y no estructurales (3C) en diferentes tiempos tras la infección del virus en la presencia o ausencia del antiviral. Para este fin, se trataron previamente células BHK-21 durante 1 h con GL 10 mM y se infectaron con un aislado de CS8c1 (MOI 1 pfu/célula) en presencia del fármaco. En ios tiempos indicados, los extractos celulares se recogieron para realizar un análisis wetern biot. Brevemente, los extractos de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de políacrilamida al 12% y a continuación se sometieron a electro-transferencia por absorción (electro-biotting) y se incubaron con antisuero SD6 o 2D2 (específico para las proteínas VP1 y 3C, respectivamente, García-Briones M. et ai Virology, 2008, 349:409-421) y se revelaron mediante autorradiografía ECL.
Tal como era de esperar, la expresión de ambas proteínas del virus fue claramente reducida (Fig. 5), lo que soporta el nivel de inhibición (1 log u) detectado en la producción del virus infeccioso.
7. Efecto de! GL en ía síntesis de ARN de! VFA
Para determinar el efecto del GL en ía síntesis del ARN viral, estimamos el número de copias del ARN del VFA (VRC) a partir de ¡a amplificación por RT-qPCR (PCR en tiempo real) de una región dentro de la secuencia de la polimerasa 3D viral, en células infectadas en presencia o ausencia del GL. Se trataron previamente células BHK-21 con GL durante 1 h y se infectaron con el aislado CS8 de! VFA (MOI 1 pfu/céluia) en presencia de GL 10 mM LG. El inoculo de! virus se retiró lavándolo y ios cultivos infectados se incubaron adicionaimente con GL en medio fresco a 37°C. En los tiempos indicados ios cultivos celulares se recogieron y se extrajo el ARN total (intraceiuiar y extracelular) o ARN extracelular. Se sintetizó el ADNc utilizando transcriptasa inversa y se realizó qPCR con cebadores que amplificaron una región conservada descrita previamente en la secuencia de la polimerasa 3D (Sáiz M. et a!. Vet fíes, 2003 34(1):1Q5-17). Para calcular la cantidad de VRC, se preparó una curva estándar utilizando diluciones de factor diez del ADNc obtenido del ARN del clon PMT28, que contenia la secuencia diana.
Nuestros resultados muestran que tan pronto como a las 2 h pi, se observó una severa reducción de la síntesis de ARN viral en presencia de! GL, lo que tuvo un especial efecto en la cantidad de virus extracelular a las 3 b pi (Fig. 6)
8 Actividad“in vivo” de! GL
Se seleccionaron ratones C57 para estudios in vivo, ya que esta cepa de ratón es clínicamente susceptible de una infección por VFA (Salguero F.J. et ai Viroiogy, 2005, 332:384-396). Un ensayo preliminar para determinar la toxicidad del GL en ratones C57 reveló concentraciones de trabajo no tóxicas de basta 200 mg/Kg administradas dos veces al día durante 5 días consecutivos A continuación evaluamos la eficacia protectora del GL contra la prueba de provocación intraperitoneai del aislado CS8 del VFA en ratones C57 (n=10 por grupo). Se administró una dosis de 100 mg/Kg o 200 mg/Kg de GL por vía intraperitoneai una vez ai día durante tres (grupos 0) o cuatro días consecutivos (grupos -1). Los ratones se sometieron a una prueba de provocación con 1000 pfu de CS8 del VFA después de 1b (grupos 0) o 24 b (grupos - 1) después de la administración de GL. Los ratones fueron monitorizados diariamente para determinar la tasa de supervivencia y la valoración clínica. Tal como se ha descrito, ei VFA produjo una mortalidad limitada en ratones G57, con una tasa de supervivencia del 40% en control infectado con virus no tratados con GL (Fig. 7). La inoculación simultánea de GL y VFA no confirió ninguna protección (grupos 0), mientras que la inoculación de GL 24h antes de la prueba de provocación viral (grupos -1), aumentó la tasa de supervivencia al 70% en dosis de GL de 100 mg/Kg y 200 mg/Kg. Aunque ambas dosis confirieron la misma protección, los ratones tratados con 200mg/Kg mostraron valoraciones clínicas más elevadas que ¡os tratados con 100 mg/dosis.
A continuación, estudiamos si el tratamiento con GL redujo ¡a carga vírica tras la infección de los ratones. Para este fin, se realizó un nuevo experimento utilizando el mismo protocolo. Se desangraron y se sacrificaron para su disección adicional en el día 2 p.i. Se extrajo el ARN total (intracelular y extracelular) de muestras de sangre, bazo, pulmón, corazón y timo. El ADNc se sintetizó utilizando transcriptasa inversa, y se realizó qPCR con cebadores en la secuencia de la 3D descrita anteriormente (Sáiz M. et al. Vet Res, 2003, 34(1):105-17).
Tal como se muestra en ¡a Fig. 8, se observó una reducción significativa de ¡as copias del ARN viral (VRC) en todas las muestras de ¡os ratones C57 infectados con el VFA que habían recibido una dosis diaria de GL (100 mg/Kg), comenzando 24 h antes de la inoculación del virus.
En general, estos resultados apoyan que el GL puede también ejercer un efecto antiviral in vivo, en un modelo de ratón, reduciendo la mortalidad del VFA y la carga viral en ratones C57 cuando se administró 24h antes de ¡a infección y durante el proceso de infección.

Claims

REIVINDICACIONES
1 Compuesto de la fórmula (I)
Figure imgf000016_0001
sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables para su uso en la prevención y/o tratamiento de una infección por el virus de la fiebre añosa
2. Compuesto para su uso, según la reivindicación 1 , en donde el compuesto de la fórmula (I), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables se administran en una dosis entre 100 y 200 mg / kg por peso corporal / día.
3. Composición que comprende un compuesto de la fórmula (I), sus derivados, tautómeros y/o solvatos farmacéuticamente aceptables según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el virus de la fiebre añosa
4. Composición para su uso, según la reivindicación 3, en donde dicha composición se administra en combinación con otro fármaco antivira!.
5. Composición para su uso, según la reivindicación 3 o 4, en donde la composición es una composición farmacéutica y comprende al menos un excipiente, adyuvante y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
6. Composición para su uso, según la reivindicación 5, en donde la composición está adaptada para su administración por vía oral, tópica, parenteral o rectal.
7. Composición para su uso, según la reivindicación 3 o 4, en donde la composición es una composición nutricional o una composición cosmética.
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