EA001535B1

EA001535B1 - Индуцирующий апоптоз продукт и способ его получения, индуктор апоптоза и способ индуцирования апоптоза, индуктор для дифференциации канцерогенных клеток, пищевой продукт, фармацевтические композиции и гигиеническое средство

Info

Publication number: EA001535B1
Application number: EA199800829A
Authority: EA
Inventors: Нобуто Кояма; Хироаки Сагава; Ейдзи Кобаяси; Тацудзи Еноки; Хуа-Канг Ву; Ейдзи Нисияма; Сузу Дегути; Кацусиге Икаи; Хирому Охноги; Мотоко Уеда; Акихиро Кондо; Икуносин Като
Original assignee: Такара Сузо Ко., Лтд.
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-02-25
Publication date: 2001-04-23
Also published as: TW510798B; JP4302186B2; CN1213310A; US6482806B1; EP0888776A4; US20050202064A1; WO1997033593A1; AU1735097A; KR19990087665A; CN1114410C; EP0888776A1; CA2248648A1; EA199800829A1; US20030176393A1

Abstract

Индуцирующий апоптоз продукт, полученный тепловой обработкой при температуре, начиная от комнатной до 350°С, в течение от нескольких секунд до нескольких дней в условиях от кислых до нейтральных, по меньшей мере, одного вещества, выбранного из нижеследующих: (a) уроновая кислота или производное уроновой кислоты; (b) сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты, способ его получения, способ индуцирования апоптоза, индуктор для дифференциации канцерогенных клеток, пищевой продукт и фармацевтические средства и гигиеническое средство на основе вышеупомянутого индуцирующего апоптоз продукта.

Description

Цель данного изобретения заключается в разработке продукта, содержащего высокобезопасное и физиологически активное вещество, имеющее противораковое действие, апоптозиндуцирующее действие, и т.д., и в предложении продукта питания или напитка, демонстрирующего высокое физиологическое действие, содержащего указанный продукт. Данное изобретение, кроме того, предлагает антибактериальные средства, средства для чистки зубов, антисептические средства, индукторы апоптоза, противораковые средства и противоязвенные средства, содержащие указанный продукт в качестве эффективного компонента. Данное изобретение предлагает также способ индуцирования апоптоза, и этот указанный способ является полезным, например, для выяснения механизма апоптоза и скринирования ингибиторов апоптоза. Данное изобретение, кроме того, дополнительно предлагает способ получения продукта, содержащего физиологически активное вещество данного изобретения.

Предшествующий уровень техники

В последние годы феномен, называемый «апоптозом», который означает самодеструктивную смерть клетки или суицидальную смерть клетки, привлекает внимание с точки зрения отмирания клеточных тканей.

В отличие от некроза, который представляет патологическую смерть клетки, апоптоз, как полагают, означает смерть, которая по природе запрограммирована в генах самих клеток. Таким образом, полагают, что внешние или внутренние факторы включают механизм активации генов, которые программируют апоптоз, в соответствии с чем белок гена программированной смерти биосинтезируется на основе генов, и клетки, сами по себе, разлагаются образующимся белком гена программированной смерти, результатом чего является их смерть.

Если бы такой апоптоз проявлялся в требуемой ткани или клетке, то это было бы вполне осмысленно, потому что излишние или патологические клетки, такие как раковые клетки, могут быть удалены из живого организма естественным путем.

Проблемы, подлежащие решению с помощью данного изобретения

Цель данного изобретения состоит в разработке продукта, содержащего высокобезопасное и физиологически активное вещество, имеющее противораковое действие, апоптозиндуцирующее действие, и т.д., предлагается также способ получения указанного продукта и, кроме того, пищевой продукт или напиток, содержащий указанный продукт. Другая цель данного изобретения состоит в разработке фармацевтических препаратов, таких как антибактериальные средства, индукторы апоптоза, содержащих указанное соединение, и в разработке способа индуцирования апоптоза, использующего указанный продукт в качестве щего указанный продукт в качестве эффективного компонента.

Средство решения данных проблем

Сущность данного изобретения можно представить следующим образом. Так, первым аспектом данного изобретения является индуцирующий апоптоз продукт, полученный тепловой обработкой при температуре, начиная от комнатной до 350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней в условиях от кислых до нейтральных, по меньшей мере, одного вещества, выбранного из нижеследующих: (а), (Ь) и (с):

(a) уроновая кислота или производное уроновой кислоты;

(b) сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты.

Вторым аспектом данного изобретения является способ получения индуцирующего апоптоз продукта, предусматривающий теплообработку при температуре начиная от комнатной до 350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней в условиях от кислых до нейтральных, по меньшей мере, одного вещества, выбранного из нижеследующих: (а), (Ь) и (с):

Настоящим изобретением установлено, что теплообработанный продукт (здесь и далее, указанным продуктом называют «теплообработанный продукт данного изобретения»), по меньшей мере, одного вещества, выбранного из уроновой кислоты, производного уроновой кислоты, сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту, сахаридного соединения, содержащего производное уроновой кислоты, вещества, содержащего сахаридное производное, содержащее уроновую кислоту, и вещества, содержащего сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты, имеет сильнодействующее противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, антибактериальное действие и противоязвенное действие, что и является предметом данного изобретения.

Краткое описание рисунков данного изобретения

Фиг. 1 демонстрирует действие теплообработанного продукта - пектина на раковые клетки;

фиг. 2 демонстрирует действие на раковые клетки образцов до и после диализа;

фиг. 3 демонстрирует действие на раковые клетки фильтрата, полученного ультрафильтрацией;

фиг. 4 демонстрирует действие на раковые клетки фракции, полученной гель-фильтрацией;

фиг. 5 демонстрирует действие на раковые клетки теплообработанных продуктов уроновых кислот;

фиг. 6 демонстрирует взаимосвязь между рН, при котором уроновую кислоту подвергают нагреванию, и действием теплообработанного продукта на раковые клетки;

фиг. 7 демонстрирует действие на раковые клетки продукта, полученного нагреванием пектина в кислых условиях;

фиг. 8 демонстрирует действие на раковые клетки фракции, полученной экстракцией в растворителе продукта, полученного нагреванием пектина в кислых условиях ;

фиг. 9 демонстрирует действие на раковые клетки продукта, полученного нагреванием пектина сначала в щелочных условиях и затем в кислых условиях;

фиг. 10 демонстрирует действие на раковые клетки продукта, полученного нагреванием галактуроновой кислоты в кислых условиях;

фиг. 11 демонстрирует действие на раковые клетки продукта, полученного нагреванием глюкуроновой кислоты в кислых условиях;

фиг. 1 2 демонстрирует действие подвергнутого тепловой обработке раствора I пектина на раковые клетки;

фиг. 1 3 демонстрирует взаимосвязь между степенью разбавления подвергнутого тепловой обработке продукта глюкуроновой кислоты и степенью выживания клеток;

фиг. 1 4 демонстрирует действие теплообработанного продукта альгиновой кислоты на раковые клетки;

фиг. 1 5 демонстрирует противораковое действие теплообработанного продукта пектина на лейкозную клеточную линию;

фиг. 1 6 демонстрирует противораковое действие теплообработанного продукта уроновых кислот на лейкозную клеточную линию и фиг. 1 7 демонстрирует действие, вызывающее дифференциацию теплообработанного продукта уроновой кислоты.

Варианты воплощения изобретения

Данное изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.

В данном изобретении нет конкретного ограничения для уроновой кислоты, производного уроновой кислоты, сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту, сахаридного соединения, содержащего производное уроновой кислоты, вещества, содержащего сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, и вещества, содержащего сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кисло ты, при условии, что продукт, полученный их нагреванием, демонстрирует противораковое действие, апоптоз-индуцирующие действия, и т.д., и что противораковое вещество и/или апоптоз-индуцирующее вещество продуцируют(ет)ся в указанном подвергнутом тепловой обработке продукте.

Уроновой кислотой иногда называют глюкуроновую кислоту и это есть общее название для гидроксиальдегид карбоновых кислот, в которых альдегидная группа на альдозе остается как таковая, в то время как только первичная спиртовая группа на другом конце окислена в карбоксильную группу. Она присутствует в природе как составляющий компонент различных полисахаридов у животных и растений. Примерами полисахаридов, содержащих уроновые кислоты, являются пектин, пектиновая кислота, альгиновая кислота, гиалуроновая кислота, гепарин, фукоидан, хондроитин сульфат, дерматан сульфат, и т.д., и они, как известно, демонстрируют различные физиологические функции.

Нет конкретного ограничения для уроновой кислоты, используемой в данном изобретении. Так, например, примерами уроновой кислоты являются галактуроновая кислота, глюкуроновая кислота, мануроновая кислота и идуроновая кислота, в то время как примерами производного уроновой кислоты являются лактоны, сложные эфиры, амиды, соли, и т. д. вышеупомянутых уроновых кислот, и любое вещество, которое продуцирует противораковое вещество и/или апоптоз-индуцирующее вещество путем тепловой обработки, подпадает под производное данного изобретения. Примерами лактона уроновой кислоты являются глюкуроно6,3-лактон (здесь и далее, обозначаемый как глюкуронолактон), мануроно-6,3-лактон и идуроно-6,3-лактон. Примерами сложного эфира уроновой кислоты являются метил, этил, пропиленгликоль и карбоксиметил уронаты, которые можно получить из уроновой кислоты. Амид уроновой кислоты можно получить амидированием уроновой кислоты. Соли их можно получить с помощью стандартных способов.

Сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту или производное уроновой кислоты, данного изобретения означает сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производное уроновой кислоты, и нет конкретного ограничения для них. Так, оно охватывает, например, пектин, пектиновую кислоту, альгиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, гепарин, фукоидан, хондроитин сульфат, хондроитин и дерматан сульфат, включая продукты разложения, производные продуктов разложения и соли продуктов их разложения, которые являются продуктами химической, ферментативной или физической обработки.

В вышеупомянутой химической обработке, исходное сахаридное соединение, например, обрабатывают при комнатной температуре до 200°С в течение от нескольких секунд до нескольких часов или, предпочтительно, при 50130°С в течение от нескольких секунд до часа (в случае пектина, обрабатывают, например, при рН 6,8, 95°С в течение от нескольких минут до нескольких десятков минут), при этом происходит бета-элиминирование с получением сахаридного соединения, имеющего ненасыщенную уроновую кислоту и/или сложный эфир ненасыщенной уроновой кислоты, в котором поглощение вблизи 235 нм увеличивается. Сахаридное соединение данного изобретения охватывает сахаридное соединение, содержащее ненасыщенную уроновую кислоту и/или сложный эфир ненасыщенной уроновой кислоты на невосстановленном конце, полученном бетаэлиминированием полисахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты.

Примером вышеупомянутой ферментативной обработки является известный способ расщепления, в котором исходное сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты, расщепляют гидралазой для сахарида, содержащего уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты. Другим примером является известный способ расщепления, в котором сахарид, содержащий уроновую кислоту и/или сложный, эфир уроновой кислоты, расщепляют лиазой для сахарида, содержащего уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты. В случае, например, пектина или пектиновой кислоты, расщепление проводят с помощью известной пектин лиазы (ЕС 4.2.2.10), лиазы пектиновой кислоты (ЕС 4.2.2.2) или лиазы экзополигалактуроновой кислоты (ЕС 4.2.2.9) с получением сахаридного соединения, имеющего 4-дезоксиЬ-трео-гекс-4-енопиранозил уронат или его сложный метиловый эфир на невосстановленном конце. В случае гиалуроновой кислоты, используют гиалуронат лиазу (ЕС 4.2.2.1), в то время как в случае альгиновой кислоты, используют альгинат лиазу (ЕС 4.2.2.3). Ферментативно расщепленные продукты, имеющие 4дезокси-Ь-трео-гекс-4-енопиранозил уронат или его сложный метиловый эфир на невосстановленном конце, полученные как таковые, также входят в объем сахаридного соединения данного изобретения.

Примерами вышеупомянутой физической обработки является обработка исходного сахаридного соединения ближним инфракрасным светом, инфракрасными лучами, микроволнами, ультразвуковыми волнами, и т.д. Так, например, пектин и/или пектиновую кислоту помещают в нейтральный (в терминах рН) или щелочной раствор и подвергают ультразвуковому облучению для приложения вибрационной энергии при соответствующей температуре не ниже, чем комнатная температура, в соответствующих условиях восстановительного режима в присутствии, например, аскорбиновой кислоты, в течение не менее, чем одна секунда или, предпочтительно, от пяти секунд до одного часа. Помимо ультразвукового облучения, эффективно также облучение микроволновое, ближними инфракрасными лучами, инфракрасными, и т. д. или их комбинацией. Облучение можно проводить либо непрерывно, либо периодически.

Кроме того, в данном изобретении вещество, которое содержит вышеуказанное сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или ее производное, такое как фрукт, кожица от фрукта, процеженные остатки фрукта, овощ, процеженные остатки овоща, морские водоросли, и т. д., может быть использовано либо как таковое, либо после сушки и дробления. Кроме того, жидкость сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или ее производное, полученная экстракцией вышеупомянутого вещества, которая содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или ее производное, или очищенное вещество, полученное из указанной экстрагированной жидкости, можно использовать также успешно. Получение такой экстрагированной жидкости сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту и/или ее производное, и очистку от экстрагируемой жидкости можно выполнить с помощью известных способов и не существует ограничений для них.

Примерами веществ, содержащих сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты, являются следующие. Так, фрукты, овощи, листья, семена, и т. д. двудольных растений, таких как яблоко, цитрусовые фрукты (например, мандарин оранжевый и лимон), банан, наппа (парра) капуста, салат, перилла многолетняя, тыква, сельдерей, лопух, экалот, брокколи, зеленый перец, шпинат, морковь, листья моркови, листья дайкона (японская редька), чайные листья, кунжут, бобы, картофель, и т.д.; зерновые однодольных, такие как пшеница и рис; водоросли, такие как бурые водоросли (например, морская капуста и закате морская водоросль), красные водоросли, одноклеточные зеленые водоросли; микроорганизмы, такие как Вак1бютуее!ек (например, Ьуорйу11ит и1тагшт, Ьуорбубит бееак!ек, ΡΗοΙίοΙα патеко, Сойшебик кЫйаке, Иаттибпа уегибрек, Лдапсик окбеа!ик и Рака11ю!а еатрекбгк), Лксотусе!ек (например, Согбусерк тбйапк и другие Согбусерк кр.), дрожжи, нитчатые грибы (например, ЛкрегдШик кр.) и бактерии (например, ВаеШик пабо и бактерии молочной кислоты); и животные, такие как позвоночные и беспозвоночные. В данном изобретении может быть использовано вещество, которое содержит сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или производные уроновой кислоты, полученные из выше указанных растений, микроорганизмов или животных.

Полисахариды, которые представляют сахаридные соединения, содержащие уроновую кислоту и/или производные уроновой кислоты, можно получить с помощью известных химических, ферментативных или физических способов. В случае, например, пектина, можно использовать высокомолекулярный полисахарид, экстрагированный, например, из кожицы цитрусовых фруктов или яблока. Материалами для получения пектина в промышленном масштабе являются фрукты и, помимо процеженных остатков (большей частью включающих эндокарпий) после получения сока цитрусовых фруктов, таких как лимон и цитрус померанцеволистный, с успехом используют процеженные остатки после получения яблочного сока. Такие процеженные остатки большей частью содержат нерастворимый протопектин и его растворяют (экстрагируют) в ходе переработки, чтобы получить пектин. Растворение можно проводить, экстрагируя кислой теплой и горячей водой и, когда условия, такие как температура, рН и время, контролируются надлежащим образом в зависимости от типа исходного материала, то возможно получение с высоким выходом пектина, имеющего заданную молекулярную массу и степень этерификации. Экстракт очищают центрифугированием или фильтрацией и концентрируют и туда добавляют спирт, вследствие чего пектин может быть осажден и выделен. Выделенный осадок сушат и измельчают, получая сухой пектин.

Основная структура пектина представляет собой частично метилированный полимер галактуроновой кислоты. Карбоксильная группа либо метилирована, оставлена в виде свободной кислоты, либо превращена в соль, такую как соль аммония, соль калия или соль натрия. В зависимости от степени метилирования (СМ; отношение метоксильных групп к суммарному содержанию карбоксильных групп), пектин классифицируют как ВМ (НМ) пектин, имеющий высокую степень метилирования, и НМ (ЬМ) пектин, имеющий низкую степень метилирования [«НапбЬоок о! Ма1епаЕ Гог Эсус1оршд №\ν Рооб Ргобисй» ебйеб Ьу 8а!о5Й Υοδίιίζιιιηί. е! а1., риЫщйеб Ьу К.К. Копп, радек 114119 (1991)] и, в данном изобретении можно использовать пектин, который коммерчески доступен как пищевая добавка [«НапбЬоок о! №11ига1 Ргобисй», ебйеб Ьу Лкю Тоуата, е! а1., риЬ1Ы1е6 Ьу 8йокиЫп То Кадакикйа, 12'¹' Ебйюп, раде 138 (1993)], коммерчески доступный ВМ пектин и НМ пектин и т.д. [ссылка на вышеупомянутую «НапбЬоок о! Ма1епаК Гог Эете1ор1пд №\ν Рооб Ргобисй»].

Расщепленный продукт сахаридного соединения, содержащий уроновую кислоту и/или производное уроновой кислоты, можно получить с помощью известных химических, фер ментативных и физических способов. Уроновая кислота, производные уроновой кислоты, олигосахариды, и т.д., которые получают синтетическим способом, также охватываются данным изобретением.

Теплообработанный продукт, который используют в данном изобретении, можно получить из вещества, выбранного из (а) уроновой кислоты или производного уроновой кислоты;

(b) сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту, или сахаридного соединения, содержащего производное уроновой кислоты; и (c) вещества, содержащего сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или вещества, содержащего сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты.

Что касается способа обработки нагреванием для получения подвергнутого тепловой обработке продукта данного изобретения, уроновую кислоту, производное уроновой кислоты, сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты, вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, и/или вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты, нагревают, например, при 60-350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней или, предпочтительно, при 80150°С в течение от нескольких минут до нескольких дней. В случае пектина, теплообработанный продукт, имеющий физиологическую активность, такую как противораковое действие или апоптоз-индуцирующее действие, можно получить нагреванием пектина например, при 80-150°С в течение от нескольких минут до нескольких дней, в то время как в случае уроновых кислот, лактонов уроновой кислоты и сложных эфиров уроновой кислоты, требуемый теплообработанный продукт можно получить нагреванием их при 60-150°С в течение от нескольких минут до нескольких дней.

Хотя не существует конкретного ограничения для рН во время обработки нагреванием, предпочтительно проводить нагревание в условиях от нейтральных до кислых и, в зависимости от используемого вещества, рН во время нагревания можно регулировать. Обычно, однако, получение физиологически активных веществ, таких как противораковое вещество, апоптоз-индуцирующее вещество, и т.д., промотируют нагреванием в кислых условиях.

Не существует конкретного ограничения для концентрации вещества при нагревании, при условии, что концентрация находится в диапазоне, в котором физиологически активные вещества, такие как противораковое вещество, апоптоз-индуцирующее вещество, и т.д., можно получить обработкой нагреванием. Так, концентрация может быть подобрана, принимая во внимание способность подвергаться обработке, выход, и т.д.

Обработка нагреванием в данном изобретении может быть либо влажным нагреванием, либо сухим нагреванием. В случае влажного нагревания любой из влажных способов нагревания, такой как нагревание с паром, нагревание с паром под высоким давлением, нагревание под высоким давлением, и т.д., может быть использован, в то время как в случае сухого нагревания, можно использовать любой из способов сухого нагревания, такой как прямое нагревание с использованием сухого и горячего воздуха и непрямое нагревание от источника нагрева через перегородку. Примерами прямого нагревания являются сухое нагревание воздушным потоком и сухое нагревание посредством распыления, в то время как примерами непрямого нагревания являются сухое нагревание с помощью барабана, и т.д. Кроме того, вещество для тепловой обработки данного изобретения может быть обработано любым обычным способом нагревания, таким как кипячение, подрумянивание на огне, обжаривание, отваривание, поджаривание (с шипением), обработка на пару, поджаривание и т. п.

Теплообработанный продукт данного изобретения представляет теплообработанный продукт, полученный вышеуказанными способами нагревания, и фракцию, содержащую физиологически активное вещество в указанном, подвергнутом тепловой обработке продукте.

Теплообработанный продукт данного изобретения содержит два или более веществ, которые проявляют апоптоз-индуцирующее действие, противораковое действие, антибактериальное действие, противовирусное действие, и т.д. Кроме того, редуктоны, имеющие антиокислительное действие, также получают во время тепловой обработки данного изобретения. Поэтому, если условия обработки нагреванием изменять в соответствии с объектом, то возможно получить теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий требуемое вещество. Теплообработанный продукт данного изобретения можно фракционировать, используя его физиологическую активность как показатель. Например, проводят фракционирование по молекулярной массе подвергнутого тепловой обработке продукта известным способом, таким как гель-фильтрация или фракционирование с использованием мембраны, фракционирующей по молекулярной массе, получая фракцию каждой молекулярной массы, после чего можно получить теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий высокую активность. Кроме того, требуемую фракцию можно также получить путем экстракции растворителем, фракционной дистилляцией и различными хроматографическими методами, используя ионообменную смолу, и т. д.

Примерами гель-фильтрации являются те, когда при использовании Се11и1оПпе ОСЬ-300, возможно получить любую из фракций по мо лекулярной массе, такие как фракции, где молекулярная масса (ММ) составляет ММ > 25000; 25000 > ММ > 10000; 10000 > ММ > 5000; и 5000 > ММ, в то время как при использовании Се11и1о1ше ОСЬ-25, возможно фракционировать фракцию 5000 > ММ в любую из фракций по молекулярной массе, такие как 5000 > ММ > 3000; 3000 > ММ > 2000; 2000 > ММ > 1000; 1000 > ММ > 500; и 500 > ММ.

Если использовать ультрафильтрационную мембрану, то фракционирование по молекулярной массе можно выполнить в промышленном масштабе. Например, когда применяют ЕЕ10ЕИ8О382 (производство Оа1се1), то можно получить фракцию, имеющую молекулярную массу 30 000 и менее, в то время как, когда применяют ЕЕ-Еи8-Т653 (производство той же компании), то можно получить фракцию, имеющую молекулярную массу 6 000 и менее. Далее, использование нанофильтрационной мембраны дает возможность получить фракцию, имеющую молекулярную массу 500 или менее. Если комбинировать вышеупомянутую гельфильтрацию и фракционирование по молекулярным массам, то можно получить любую из молекулярно-массовых фракций.

В теплообработанном продукте данного изобретения, фракция, имеющая молекулярную массу 30 000 или менее, имеет сильную противораковую и апоптоз-индуцирующую активности и, в частности, фракция, имеющая молекулярную массу 1 0 000 или менее или, предпочтительно, фракция с молекулярной массой 500 или менее, имеет сильную противораковую, апоптоз-индуцирующую и антибактериальную активности. Так, в зависимости от цели, фракционированная по молекулярной массе фракция теплообработанного продукта данного изобретения может быть использована как эффективный компонент теплообработанного продукта данного изобретения.

Теплообработанный продукт данного изобретения имеет ингибирующую активность на рост раковых клеток. Механизм действия теплообработанного продукта данного изобретения не ограничивает данное изобретение и, например, апоптоз-индуцирующее действие на раковые клетки включено в объем данного изобретения.

Теплообработанный продукт данного изобретения имеет рост-ингибирующее действие и апоптоз-индуцирующее действие на раковые клетки, такие как клетки промиелоцидного лейкоза человека (НЬ-60), клетки острого лимфобластного лейкоза человека (МОЬТ-3), клетки рака легких (А-549), 8У-40 трансформированные клетки легкого (^1-38УА13), раковые клетки печени (Нер 02), раковые клетки ободочной кишки (НСТ-116), раковые клетки толстой кишки человека (νίΌτ), раковые клетки желудка (АО8) и клетки миеломы, и количество противоракового вещества в теплообработанном продукте данного изобретения может быть выражено в терминах единицы противораковой активности.

Используемую в данном описании единицу противораковой активности определяют следующим образом. Так, в качестве образца используют теплообработанный раствор данного изобретения, 0,5 мл его разбавленного раствора добавляют к 4,5 мл ΚΡΜΙ 1640 среды, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 2,5 х 1 0⁵ клеток промиелоцидного лейкоза человека (НЬ-60) (АТСС ССЬ-240), инкубируют в присутствии 5% углекислого газа при 37°С в течение 24 ч, подсчитывают количества жизнеспособных клеток и противораковую активность на мл среды определяют как одну единицу, когда степень выживания клеток составляет 50% контроля. Таким образом, когда противораковая активность на мл среды составляет одну единицу, тогда 1 мл образца имеет 1 0 единиц противораковой активности.

Степень выживания (К) клеток в терминах % рассчитывают по следующей формуле:

К = У8/(У8+И8) х 100 + Ис^Ус+ИС) х 100.

В формуле V и И 8 представляют число жизнеспособных клеток и погибших клеток, соответственно, в секции, куда добавляют образец; и Ус и Ис представляют число жизнеспособных и погибших клеток, соответственно, в секции, куда добавляют воду.

Теплообработанный продукт данного изобретения представляет вещество, полученное из природного продукта питания, и при его оральном и парентеральном применении мышам токсичность не наблюдается.

Нет конкретного ограничения на пищевые продукты и напитки данного изобретения и примерами их являются переработанные сельскохозяйственные продукты и продукты леса, и т.д., такие как кондитерские изделия, хлеб, лапша, напитки (как алкогольные, так и безалкогольные), приправы, продукты пивоварения (соевая паста, соевый соус и уксус), алкогольные напитки и приправы, полученные из сырых веществ, таких как хлебные злаки, картофель, крахмал, сладости, жир/масло, семена, бобы, рыба/моллюск, мясо животных, птиц и китов, яйца, молоко, овощи, фрукты, съедобные грибы, водоросли, и т.д.

Нет конкретного ограничения для способов получения продуктов питания или напитков данного изобретения и примерами их являются приготовление продукта питания, переработка и обычно используемые способы получения продуктов питания и напитков. Любой способ можно использовать, поскольку получаемый продукт питания или напиток содержит теплообработанный продукт данного изобретения.

В случае приготовления продукта питания и переработки, любой способ может быть использован, поскольку продукт после приготов ления продукта питания или переработки содержит теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д.

Таким образом, теплообработанный продукт данного изобретения можно добавлять до, во время или после приготовления продукта питания или переработки. Альтернативно, приготовленный или переработанный продукт может быть добавлен в теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д., в результате чего указанный теплообработанный продукт разбавляется.

Затем, при получении продукта питания или напитка, обработку нагреванием можно проводить на любой требуемой стадии так, чтобы теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д., образовался в нем; теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д., может быть добавлен туда; или продукт питания, напиток, или вещество его могут быть добавлены в теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д., так, чтобы разбавить теплообработанный продукт. Добавление можно проводить сразу или по частям несколько раз. Поэтому, без труда можно получить новый продукт питания или напиток, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д. Кроме того, данное изобретение охватывает продукт питания или напиток, где уроновая кислота, лактон уроновой кислоты, сложный эфир уроновой кислоты, сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту и/или сложный эфир уроновой кислоты, или вещество, содержащее такое сахаридное соединение, образуется во время его получения так, что в продукт питания или напиток оказывается включенным его теплообработанный продукт, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, и т.д., продуцируемый во время получения. Когда продукт получают любой из этих стадий, продукт питания или напиток, содержащий теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптозиндуцирующее действие, и т.д., и продукт питания или напиток, получаемый путем добавления и/или разбавления теплообработанного продукта данного изобретения, определяют как продукт питания или напиток данного изобретения.

Нет конкретного ограничения на содержание теплообработанного продукта данного изобретения, имеющего противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, антибактериальное действие и т.д., но его можно подходящим образом подобрать, исходя из органолептического свойства и физиологической активно13 сти. Например, однако, содержание теплообработанного продукта на 100 частей продукта питания составляет 0,001 части или более в терминах теплообработанного продукта в твердом состоянии и, с точки зрения органолептического свойства как продукта питания, физиологической активности, такой как противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие и антибактериальное действие, и стоимости, содержание предпочтительно составляет 0,005-10 частей или, более предпочтительно, 0,01-1 части.

Нет конкретного ограничения для количества теплообработанного продукта данного изобретения, имеющего противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, антибактериальное действие, и т.д., в напитке и его можно подходящим образом подобрать в терминах его органолептического свойства и физиологической активности. Однако, например, содержание теплообработанного продукта на 1 00 частей напитка составляет 0,001 часть или более в терминах теплообработанного продукта в твердом состоянии и, с точки зрения вкуса как напитка, физиологической активности, такой как противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие и антибактериальное действие, и стоимости, содержание предпочтительно составляет 0,005-10 частей или, более предпочтительно, 0,01-1 часть. Между прочим, в данном описании часть означает весовую часть.

Хотя количество теплообработанного продукта в продукте питания данного изобретения, имеющего противораковое действие, можно подходящим образом подобрать исходя из противораковой активности, количество на 1 00 г продукта питания составляет 0,1 единицы или более в терминах единицы противораковой активности, предпочтительно 1 0 единиц или более или, более предпочтительно, 1 00 единиц или более.

Хотя нет конкретного ограничения на количество теплообработанного продукта, имеющего противораковое действие, данного изобретения, но количество можно подходящим образом подобрать исходя из противораковой активности, количество на 1 00 г напитка составляет 0,1 единицы или более в терминах единицы противораковой активности, предпочтительно 1 0 единиц или более или, более предпочтительно, 1 00 единиц или более.

Нет конкретного ограничения на форму продукта питания или напитка данного изобретения, поскольку теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, апоптоз-индуцирующее действие, антибактериальное действие, и т.д., содержится в нем, добавленный туда и/или разбавленный в нем, и формы, в которых они могут приниматься орально, такие как таблетки, гранулы, капсулы, гель, золь, и т.д., являются признанными.

Продукт питания или напиток данного изобретения содержит теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий физиологическую активность, в большом количестве и является полезным или функциональным продуктом питания или напитком, демонстрирующим предотвращающее карциногенез действие, действие, подавляющее злокачественную опухоль, противоязвенное действие, улучшающее функцию печени действие, действие, предотвращающее запор, действие, предотвращающее простуду, вызванную вирусом гриппа, и действие, предотвращающее болезнь Альцгеймера, благодаря различным физиологическим активностям указанного теплообработанного продукта, таким как антибактериальное действие, апоптоз-индуцирующее действие, противораковое действие, противовирусное действие, противоязвенное действие, противоангиогенное действие, действие, улучшающее функцию печени, диетическое действие клетчатки, действие по удалению ненужных металлов, таких как железо и тяжелые металлы, и т.д. Продукт питания или напиток, в частности, используют для поддержания в здоровом состоянии желудка и кишечника. Кроме того, он представляет продукт питания или напиток, имеющий очень хорошую способность к консервированию благодаря своему антибактериальному действию.

Теплообработанный продукт данного изобретения можно использовать в качестве антисептического средства для улучшения способности к консервированию продукта питания или напитка. Кроме того, теплообработанный продукт данного изобретения можно использовать в способе приготовления антисептического продукта питания или напитка, путем добавления его к продукту питания или напитку.

Теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий антибактериальное действие, можно легко получить путем нагревания уроновой кислоты, лактона производной кислоты, сложного эфира уроновой кислоты, сахаридного соединения, содержащего уроновую кислоту, и/или сахаридного соединения, содержащего сложный эфир уроновой кислоты, и т.д., и использование антибактериального средства, содержащего теплообработанный продукт данного изобретения, полученный из натурального продукта питания, в продукте питания или напитке превосходно в плане безопасности.

Форма антибактериального средства, содержащего теплообработанный продукт данного изобретения, при его добавлении в продукт питания или напиток может быть любой: жидкостью, пастой, порошком, хлопьями, гранулами, и т.д. С учетом легкости функционирования или использования путем смешения с другими добавками, предпочтительно получать средство порошкообразным, хлопьевидным или гранулированным при сушке. Что касается способа сушки, то можно использовать обычно исполь зуемые виды сушки, такие как сушка распылением, сушка в барабане, сушка на полке, вакуумная сушка, сушка вымораживанием, и т.д.

Антибактериальное средство и антисептическое средство данного изобретения можно получить любым из способов, которые известны специалистам в данной области. При получении могут быть добавлены соответствующим образом известные добавки, которые допустимы для получения состава, такие как наполнители, стабилизаторы, дезинтеграторы, связующие, вспомогательные солюбилизаторы, и т.д. Совместно с ними можно использовать другие антибактериальные вещества, такие как этанол, глицин, ацетат натрия, аскорбиновая кислота, глицериновые сложные эфиры жирных кислот, соль, ΕΌΤΑ, и т.д.

Количество теплообработанного продукта данного изобретения, подлежащего добавлению в продукт питания или напиток, можно варьировать в зависимости от типа продукта питания или напитка, и можно добавлять количество, отвечающее цели.

Один способ использования антибактериального средства данного изобретения заключается в том, что средство добавляют в продукт питания или напиток соответствующим способом. Нет конкретного ограничения на способ добавления, но, в конечном счете, он должен быть таким, как если бы теплообработанный продукт данного изобретения был введен в продукт питания или напитка любым способом. В соответствии с этим, при использовании антибактериального средства данного изобретения, термин «добавление» охватывает все способы, посредством которых теплообработанный продукт становится содержимым продукта питания или напитка. Хотя общий способ заключается в добавлении его во время стадий получения продукта питания или напитка, с таким же успехом можно использовать способ, когда продукт питания погружают в раствор, содержащий теплообработанный продукт данного изобретения. Можно также осуществить способ добавления его в продукт питания вместе со способом погружения продукта питания в раствор. Примерами продукта питания, который пригоден для способа погружения, являются продукты питания, которые не теряют своей формы даже в воде, такие как рыбный паштет или паштет из мяса домашнего скота (например, камабоко [паштет из вареной рыбы] и венские сосиски (У1еииа заизаде)), лапша (например, вареная лапша) и замороженный продукт из рыбы, моллюски и креветки до заморозки.

Когда антибактериальное средство данного изобретения используют в качестве антисептического средства, способность к консервированию продукта питания или напитка может быть дополнительно улучшена. В случае замороженного продукта питания и замороженного десерта, рост загрязняющих микроорганизмов на стадии переработки до замораживания может быть подавлен, посредством чего можно получить очень благоприятный результат в плане гигиены. Антибактериальное средство данного изобретения эффективно как по отношению к грам-положительным, так и грам-отрицательным бактериям и очень эффективно, например, по отношению к бактериям, устойчивым к лекарственным средствам, таким как §1арйу1ососсиз аигеиз, устойчивые к метициллину, и бактериям, которые вызывают отравление продукта питания, таким как 8а1тоие11а, энтеротоксинпродуцирующая 81арйу1ососсиз аигеиз, ВасШиз сегеиз рвотного типа. ВасШиз сегеиз диарейного типа и энтероррагиальная (вызывающая кишечное кровотечение) ЕзсйепсЫа со11 0-157. Указанное средство с таким же успехом эффективно по отношению к микроорганизмам, таким как дрожжи и грибы. Антисептическое средство, содержащее теплообработанный продукт данного изобретения, является особенно полезным в качестве природного консерванта против отравления продукта питания и в качестве стерилизующего средства. Кстати, используя антибактериальное средство данного изобретения, можно проводить стерилизацию одежды, спальных простыней и т.д., и, когда антибактериальное средство данного изобретения разбрызгивают или когда проводят обтирание с помощью антибактериального средства данного изобретения, возможна стерилизация (как удаление, так и уничтожение бактерий) объекта, подлежащего стерилизации.

Антибактериальное средство данного изобретения показывает антибактериальную активность по отношению к бактериям, вызывающим кариес зубов, и бактериям, вызывающим периодонтальное заболевание, и могут быть разработаны внутриоральные препараты, содержащие антибактериальное средство данного изобретения. Форма внутриорального препарата может быть известной формой, такой как жидкость или паста. Примером внутриорального препарата является средство для чистки зубов. Средство для чистки зубов может быть в известной форме, такой как жидкость, паста или порошок. Нет конкретного ограничения на количество теплообработанного продукта данного изобретения в средстве для чистки зубов, и, если в нем содержится эффективная концентрация для бактерий, вызывающих кариес зубов, и бактерий, вызывающих периодонтальное заболевание, то этого будет достаточно. В средство для чистки зубов могут быть добавлены известные добавки, такие как увлажняющие средства, поверхностноактивные вещества, связующие, отдушки, подслащивающие вещества, и т.д. Как уже упоминалось, с таким же успехом можно использовать теплообработанный продукт веществ, которые содержат сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту или сложный эфир уроновой кислоты, такое как пектинсодержащее вещество (например, овощи и фрукты), и в объем данного изобретения может быть включен внутриоральный препарат, содержащий теплообработанный продукт пектинсодержащего овоща, такой как средство для чистки зубов.

Чтобы получить индуктор апоптоза данного изобретения, в качестве активного ингредиента используют теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий апоптозиндуцирующую активность, и его смешивают с известными фармацевтическими носителями, получая фармацевтический препарат. Обычно теплообработанный продукт данного изобретения смешивают с фармацевтически приемлемыми жидкими или твердыми носителями, с последующим, при необходимости, добавлением туда растворителей, диспергирующих веществ, эмульгаторов, буферов, стабилизаторов, наполнителей, связующих, дезинтеграторов, смазок и т.п., посредством чего получают твердые препараты, такие как таблетки, гранулы, разбавленные порошки, порошки, капсулы, и т.д., или жидкие препараты, такие как растворы, суспензии, эмульсии, и т.д. Полученный препарат может быть переработан в сухой препарат, который затем может быть растворен до использования путем добавления в него соответствующего носителя.

Индуктор апоптоза данного изобретения можно применять либо орально, либо парентерально путем, например, инъекции или внутривенного капельного вливания.

Фармацевтические носители можно надлежащим образом подобрать в зависимости от пути введения и лекарственной формы, упомянутой выше. В случае оральных препаратов могут быть использованы крахмал, лактоза, сахароза, маннит, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганические соли и т.п. При получении оральных препаратов, можно также добавлять связующие, дезинтеграторы, поверхностно-активные вещества, смазки, улучшающие текучесть средства, корригенты, красители, ароматизирующие вещества и т.п.

С другой стороны, в случае парентеральных препаратов, теплообработанный продукт, имеющий апоптоз-индуцирующую активность, который является активным ингредиентом данного изобретения, растворяют или суспендируют обычным способом в растворителе, таком как дистиллированная вода для инъекции, физиологический соляной раствор, водный раствор глюкозы, растительное масло для инъекции, кунжутное масло, арахисовое масло, соевое масло, кукурузное масло, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, с последующим, при необходимости, добавлением бактерицидов, стабилизаторов, изотонического средства, анальгетиков, и т.д., после чего получают требуемый парентеральный препарат.

Индуктор апоптоза данного изобретения вводят соответствующим путем в зависимости от лекарственной формы. Нет конкретного ограничения на способ введения, и, поэтому может быть выбран любой из внутренних или внешних путей и путь с помощью инъекции. Можно применять инъекции, например, внутривенные, внутримышечные, подкожные и внутридермальные, в то время как препараты для наружного использования включают суппозитории.

Доза индукторов апоптоза данного изобретения не оговаривается особо, но она может быть соответствующим образом определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования и возраста, массы тела, состояний, и т.д. пациента, которому вводят индуктор. Обычно, однако, доза теплообработанного продукта данного изобретения, содержащаяся в препарате, для взрослого составляет 20-2000 мг/кг в день. Само собой разумеется, дозу можно варьировать в зависимости от различных факторов и, поэтому, в некоторых случаях может быть достаточна доза, меньшая, чем вышеупомянутая, в то время как в других случаях, доза, большая, чем вышеупомянутая, может быть необходима. Средство данного изобретения можно применять орально как таковое, и, кроме того, с таким же успехом средство можно принимать ежедневно после добавления к обычной пище и/или напитку.

Противораковое средство можно получить, когда в качестве активного ингредиента используют теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противораковое действие, и когда его вводят в фармацевтический препарат вместе с известными фармацевтическими носителями. Противораковое средство можно получить в соответствии с вышеупомянутым способом. Обычно теплообработанный продукт данного изобретения смешивают с фармацевтически приемлемыми жидкими или твердыми носителями с последующим, при необходимости, добавлением растворителей, диспергирующих средств, эмульгаторов, буферов, стабилизаторов, наполнителей, связующих, дезинтеграторов, смазок, и т.д., с получением твердых препаратов, таких как таблетки, гранулы, разбавленные порошки, порошки, капсулы, и т.д., или жидких препаратов, таких как растворы, суспензии, эмульсии, и т.д. Альтернативно, он может быть переработан в сухой препарат, который можно растворить путем добавления соответствующего носителя к нему до фактического использования.

Противораковое средство данного изобретения можно применять либо перорально, либо парентерально посредством, например, инъекции или внутривенного капельного вливания.

Фармацевтические носители можно соответственно подобрать в зависимости от вышеуказанного пути введения и лекарственной формы, и их можно использовать таким же об19 разом, как в случае уже упомянутого индуктора апоптоза.

Противораковое средство применяют, используя соответствующий путь введения в зависимости от лекарственной формы. Нет конкретного ограничения на способ введения, и, например, введение можно осуществлять внутренним путем или наружным путем или путем инъекции. Можно применять инъекции, например, внутривенные, внутримышечные, подкожные и внутридермальные, в то время как препараты для наружного использования включают суппозитории.

Доза противоракового средства данного изобретения не оговаривается особо, но она может быть соответствующим образом определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования и возраста, массы тела, состояний, и т.д. пациента, которому вводят средство. Обычно, однако, доза теплообработанного продукта данного изобретения, содержащаяся в препарате, для взрослого составляет 20-2000 мг/кг в день. Само собой разумеется, дозу можно варьировать в зависимости от различных факторов и, поэтому, в некоторых случаях может быть достаточна доза, меньшая, чем вышеупомянутая, в то время как в других случаях, доза, большая, чем вышеупомянутая, может быть необходима. Средство данного изобретения можно применять орально как таковое, и, кроме того, с таким же успехом средство можно принимать ежедневно после добавления к обычной пище и/или напитку.

Теплообработанный продукт данного изобретения имеет противораковое действие, и при низких концентрациях он имеет способность индуцировать дифференциацию раковых клеток, в силу чего теплообработанный продукт данного изобретения также полезен в качестве средства, продуцирующего дифференциацию (деканцерогенное средство). Индуктор дифференциации раковых клеток, содержащий теплообработанный продукт данного изобретения в качестве активного ингредиента, может быть введен в препараты тем же способом, как в случае вышеупомянутого противоракового средства, и его можно применять тем же способом, как и в случае с противораковым средством.

Доза средства как индуктора дифференциации раковых клеток не оговаривается особо, но она может быть соответствующим образом определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования и возраста, массы тела, состояний, и т.д. пациента, которому вводят индуктор. Обычно, однако, доза теплообработанного продукта данного изобретения, содержащаяся в препарате, для взрослого составляет 0,2-500 мг/кг в день. Само собой разумеется, дозу можно варьировать в зависимости от различных факторов и, поэтому, меньшая, чем вышеупомянутая доза может быть достаточна в некоторых случаях, в то время как в других случаях, доза, большая, чем вышеупомянутая, может быть необходима. Средство данного изобретения можно применять орально как таковое, и, кроме того, с таким же успехом средство можно принимать ежедневно после добавления к обычной пище и/или напитку.

Теплообработанный продукт данного изобретения имеет противовирусное действие и действие, улучшающее печеночную функцию. Соответственно этому, противовирусное средство и средство, улучшающее печеночную функцию, содержащее теплообработанный продукт данного изобретения в качестве активного ингредиента, можно получить тем же способом, как и в случае вышеупомянутого противоракового средства, и его можно применять тем же способом, как и в случае противоракового средства.

Доза как противовирусного средства, так и средства, улучшающего печеночную функцию, не оговаривается особо, но она может быть соответствующим образом определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования и возраста, массы тела, состояний, и т.д. пациента, которому вводят средство. Обычно, однако, доза теплообработанного продукта данного изобретения, содержащаяся в препарате, для взрослого составляет 0,2-2000 мг/кг в день. Само собой разумеется, дозу можно варьировать в зависимости от различных факторов и, поэтому, меньшая, чем вышеупомянутая доза может быть достаточна в некоторых случаях, в то время как в других случаях, доза, большая, чем вышеупомянутая, может быть необходима. Средство данного изобретения можно применять орально как таковое, и, кроме того, с таким же успехом средство можно принимать ежедневно после добавления к обычной пище и/или напитку. Когда применяют препарат, содержащий теплообработанный продукт данного изобретения, вирусные заболевания, такие как простуда, вызванная вирусом гриппа, можно предотвратить или лечить и, кроме того, также можно улучшить печеночную функцию при расстройстве, в силу чего ООТ и ОРТ значения становятся нормальными.

Теплообработанный продукт данного изобретения имеет действие, заключающееся в индуцировании белка теплового шока, например, 70-к дальтон, и демонстрирует противовирусное действие на РНК вирусы и ДНК вирусы, такие как вирус гепатита, вирус СПИДа, вирус гриппа, вирус герпеса, и т.д. Он демонстрирует биозащитное действие, такое как противовоспалительное действие.

Противоязвенное средство можно получить, используя теплообработанный продукт данного изобретения, имеющий противоязвенное действие, в качестве активного ингредиента вместе с известными фармацевтическими носителями с последующей переработкой в фармацевтический препарат. Противоязвенное сред21 ство можно получить в соответствии со способом, описанным выше. Обычно, теплообработанный продукт данного изобретения смешивают с фармацевтически приемлемыми жидкими или твердыми носителями с последующим, при необходимости, добавлением растворителей, диспергирующих средств, эмульгаторов, буферов, стабилизаторов, наполнителей, связующих, дезинтеграторов, смазок, и т.д., посредством чего получают твердые препараты, такие как таблетки, гранулы, разбавленные порошки, порошки, капсулы, и т.д., или жидкие препараты, такие как растворы, суспензии, эмульсии, и т.д. Возможно также получение сухого продукта, который можно превратить в жидкость путем добавления соответствующего носителя до использования.

Противоязвенное средство можно применять оральным путем или парентеральным путем в виде инъекций или внутривенного капельного вливания.

Фармацевтический носитель может выбираться в зависимости от вышеупомянутого способа введения и лекарственной формы, и его можно использовать тем же самым способом, как и в случае вышеупомянутого индуктора апоптоза.

Противоязвенное средство можно применять, используя соответствующий путь введения в зависимости от лекарственной формы. Нет конкретного ограничения на способ введения, и, например, введение можно осуществлять внутренним путем или наружным путем или путем инъекции. Можно применять инъекции, например, внутривенные, внутримышечные, подкожные и внутридермальные. Препараты для наружного использования включают суппозитории.

Доза противоязвенного средства не оговаривается особо, но она может быть соответствующим образом определена в зависимости от лекарственной формы, способа введения, цели использования и возраста, массы тела, состояний, и т. д. пациента, которому вводят средство. Обычно, однако, доза теплообработанного продукта данного изобретения, содержащаяся в препарате, для взрослого составляет 20-2000 мг/кг в день. Само собой разумеется, дозу можно варьировать в зависимости от различных факторов и, поэтому, меньшая, чем вышеупомянутая доза может быть достаточна в некоторых случаях, в то время как в других случаях, доза, большая, чем вышеупомянутая, может быть необходима. Средство данного изобретения можно применять орально как таковое и, кроме того, с таким же успехом средство можно принимать ежедневно после добавления к обычной пище и/или напитку.

Данное изобретение предлагает продукт питания или напиток, который имеет физиологическую активность, такую как противораковое действие и апоптоз-индуцирующее дейст вие, индуцирует противораковое действие или апоптоз в больных клетках у пациентов, страдающих от рака или вирусных заболеваний, и является эффективным для предотвращения и лечения указанной болезни. Особенно в случае рака пищеварительных органов, таких как опухоль желудка или толстой кишки (ободочной кишки), возможно ингибирование роста раковых клеток или можно вызвать апоптоз в раковых клетках, принимая теплообработанный продукт данного изобретения оральным путем в виде продукта питания или напитка и, поэтому, продукт питания или напиток, в котором содержится теплообработанный продукт данного изобретения, добавленный туда и/или разбавленный в нем, имеет превосходное действие в лечении и профилактике злокачественных образований пищеварительных органов.

Кроме того, теплообработанный продукт данного изобретения имеет противовирусное и антибактериальное действия. Поэтому его используют в качестве противовирусного средства, антибактериального средства, внутриорального средства (такого как средство для чистки зубов) и антисептического средства для продукта питания или напитка и, вследствие его противоязвенного действия, его также используют в качестве противоязвенного средства и профилактического средства от язвы. Кроме того, благодаря его действию, заключающемуся в улучшении печеночной функции, его также используют в качестве средства, улучшающего печеночную функцию.

В соответствии с данным изобретением продукт питания или напиток данного изобретения содержит большое количество теплообработанного продукта данного изобретения, имеющего физиологическую активность. Продукт питания или напиток данного изобретения является здоровым или функциональным продуктом питания или напитком, демонстрирующим действие поддержания гомеостаза живого организма, такое как действие, предотвращающее карциногенез, противораковое действие, антибактериальное действие, противовирусное действие, противоязвенное действие, действие, предотвращающее запор, действие, улучшающее печеночную функцию, действие, предотвращающее болезнь Альцгеймера, апоптозиндуцирующее действие, и т.д., благодаря различным физиологическим активностям указанного теплообработанного продукта, таким как, апоптоз-индуцирующее действие, антибактериальное действие, противораковое действие, противовирусное действие, антиангиогенное действие, действие на аномально пролиферирующие клетки, противоязвенное действие, улучшающее печеночную функцию действие, диетическое действие клетчатки, действие по удалению ненужных металлов, таких как железо и тяжелые металлы, и т.д. Таким образом, в соответствии с данным изобретением, продукт питания или напиток, содержащий функциональные вещества, используют для поддержания в здоровом состоянии желудка и кишечника. Если добавить теплообработанный продукт данного изобретения, особенно фракцию, имеющую молекулярную массу 500 или менее, антибактериальную активность продукта питания или напитка можно легко сделать высокой и, поэтому, теплообработанный продукт данного изобретения также используют в качестве антисептического средства для продукта питания и напитка. Благодаря различным физиологическим функциям, когда теплообработанный продукт данного изобретения (в частности фракцию, имеющую молекулярную массу 10 000 или менее или, предпочтительно, фракцию, имеющую молекулярную массу 500 или менее) используют в продукте питания или напитке, теперь можно легко придать продукту питания или напитку различные физиологические функции. Так, теплообработанный продукт вполне полезен, например, в качестве антибактериальной добавки к продукту питания или напитку и также в качестве антисептического средства для продукта питания или напитка.

Кроме того, данное изобретение предлагает индуктор апоптоза и противораковое средство, которые используют для профилактики и лечения пациентов, страдающих от рака и вирусных заболеваний, путем ингибирования пролиферации патогенных клеток и индуцирования апоптоза в патогенных клетках благодаря противораковому и апоптоз-индуцирующему действиям. Особенно в случае рака пищеварительных органов, таких как рак желудка или толстой кишки, можно ингибировать рост раковых клеток или вызвать апоптоз в раковых клетках, применяя теплообработанный продукт данного изобретения оральным путем в виде продукта питания или напитка, и поэтому продукт питания или напиток, содержащий теплообработанный продукт данного изобретения, добавленный и/или разбавленный в нем, имеет превосходное действие в лечении и профилактике рака пищеварительных органов. Данное изобретение, кроме того, предлагает противоязвенное средство, имеющее противоязвенное действие, которое используют для профилактики и лечения язвы у пациентов, страдающих от указанной болезни. В случае язвы пищеварительных органов, теплообработанный продукт данного изобретения обеспечивает противоязвенное действие при приеме его перорально в виде продукта питания или напитка и, поэтому, продукт питания или напиток, где теплообработанный продукт данного изобретения добавляют и/или разбавляют в нем, имеет превосходное действие в лечении и профилактике язв пищеварительных органов. Фармацевтическое средство данного изобретения может удовлетворять требованиям низкой стоимости и получению в большом количестве, используя съедобную кожицу фруктов, съедоб тов, съедобные водоросли, и т.д. в качестве исходного материала и другое преимущество заключается в том, что оно является высокобезопасным, поскольку получают его из продукта питания. Кроме того, в данном изобретении предлагается простой способ индуцирования апоптоза и, используя способ данного изобретения, возможно исследование, направленное на выяснение механизма апоптоза, и разработка ингибиторов индуцирования апоптоза.

Примеры

Данное изобретение далее иллюстрируется с помощью нижеследующих примеров, хотя данное изобретение никоим образом не ограничивается этими примерами. Кстати, термин «%», используемый в примерах, означает весовой процент.

Пример 1.

Пектин, который получают из яблока (поставляемый Аако Риге С11С1шеа15) (500 мг) суспендируют в 50 мл 50 мМ НЕРЕ8 буфера (рН 7,0), содержащего 120 мМ ИаС1, и автоклавируют при 121°С в течение 20 мин, получая теплообработанный раствор пектина.

Клетки промиелоцидного лейкоза человека НЬ-60 (АТСС СНЕ-1964) инкубируют в КРМ1 1640 среде (произв. Νίδδυί). содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. 01Ьео), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в А8Е 104 среде (произв. А_риошо1о), получая концентрацию клеток 5 х 10⁵клеток/9 мл.

К этой суспензии добавляют 1 мл раствор теплообработанного пектина и смесь инкубируют при 37°С в течение 16 ч в присутствии 5% диоксида углерода. Для подтверждения проводят такую же инкубацию, как упомянуто выше, за исключением того, что 0,1 мл водного раствора (0,1 мг/мл) актиномицина Ό (произв. 81дша), который известен как апоптозиндуцирующий реагент, и 0,9 мл физиологического соляного раствора используют вместо вышеупомянутого раствора пектина.

Инкубированные клетки исследуют под оптическим микроскопом, при этом подтверждается конденсация ядер, контракция клеток и получение апоптотического тела как в растворе теплообработанного пектина, так и в клетках, инкубированных с добавленным актиномицином Ό. Кстати, в контроле, где клетки инкубировали с добавлением 1 мл физиологического соляного раствора, такого явления не наблюдали.

Из этих результатов установлено, что теплообработанный раствор пектина индуцирует апоптоз в НЬ-60 клетках.

Пример 2.

Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в 50 мл НЕРЕ8 буфера (рН 7,0), содержащего 120 мМ №С1, так, чтобы получить конечную концентрацию пектина 10 мг/мл и затем раствор доводят до рН 7,0 с помощью 1н ΝαΟΗ. Полученный раствор нагревают при 121°С в течение 30 мин и измеряют спектр поглощения его в ультрафиолетовой области, при этом поглощение вблизи 235 нм теплообработанного продукта увеличивается по сравнению с образцом до нагревания.

Этот образец доводят до рН 7,0 при помощи 1н. ΝαΟΗ и измеряют апоптозиндуцирующую активность способом, указанным в примере 1. В этом и всех последующих примерах, однако, существуют некоторые исключения, заключающиеся в том, что вместо Л8Р 104 сыворотки используют ΒΡΜΙ 1640 среду, содержащую 10% фатальной бычьей сыворотки, что в качестве клеток используют НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) и что, при измерении апоптозиндуцирующей активности, каждый из образцов доводят до рН 7,0 с помощью 1н. ΝαΟΗ, после чего измеряют апоптоз-индуцирующую активность. К суспензии клеток добавляют в два раза большем количестве, по объему, 0,4% водного раствора трипанового синего и проводят наблюдение под оптическим микроскопом за экскрецией трипанового синего и подсчитывают неокрашенные клетки и окрашенные в синий цвет клетки как жизнеспособные и погибшие клетки, соответственно.

В результате было обнаружено, что продукт теплообработанного пектина демонстрирует значительную апоптоз-индуцирующую активность по отношению к НЬ-60 клеткам.

Коммерчески доступный пектин из лимона растворяют в 50 мМ НЕРЕ8 буфере (рН: 7,0), содержащем 120 мМ №С1, получая концентрацию пектина 10 мг/мл, после чего рН составляло 5,0. Раствор нагревают при 121°С в течение 30 мин и регистрируют спектр поглощения в ультрафиолетовой области, при этом поглощение вблизи 235 нм в теплообработанном продукте увеличивается.

Этот образец доводят до рН 7,0 с помощью 1н. ΝαΟΗ и, при измерении апоптозиндуцирующей активности по отношению к НЬ-60 клеткам вышеуказанным способом, было обнаружено, что теплообработанный продукт проявляет значительную апоптоз-индуцирующую активность.

Результаты представлены на фиг. 1 . На фиг. 1 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда теплообработанный раствор пектина из лимона добавляют к культуральной среде НЬ-60 клеток, получая концентрацию пектина 1 мг/мл, где абсцисса представляет время инкубации (часы), а ордината представляет число жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг.1 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где образец не добавляют, в то время как незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют подвергнутый теплообработке пектин из лимона. Таким образом, пектин из лимо на, подвергнутый теплообработке, демонстрирует противораковое действие.

Пример 3.

(1 ) Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в 50 мМ НЕРЕ8 буфере (рН: 7,0), содержащем 120 мМ №С1, получая концентрацию пектина 1 0 мг/мл, и нагревают при 1 21 °С в течение 20 мин, получая теплообработанный раствор. Часть его лиофильно сушат, получая теплообработанный раствор, превращенный в лиофильно-высушенное состояние.

Затем оставшуюся часть теплообработанного раствора диализуют от чистой воды, используя трубку из 8еаш1е55 целлюлозы (отсекаемая молекулярная масса: 12000-14000; произв. 8аиео 1ипуаки) или 8рес1га/Рог 7 мембрану для диализа (отсекаемая молекулярная масса: 1000; произв. 8рес1гиш) и каждую из внутренних жидкостей после диализа лиофильно сушат и взвешивают, после чего, для каждой из лиофильно-высушенных внутренних жидкостей потеря в весе составляла приблизительно 1 0% по сравнению с пектином до его обработки нагреванием.

Лиофильно-высушенный теплообработанный раствор растворяют в воде, в то время как лиофильно-высушенную внутреннюю жидкость после диализа растворяют в 50 мМ НЕРЕ8 буфере (рН: 7,0), содержащем 120 мМ №С1, после чего конечная концентрация каждого из обоих растворов составляет 1 0 мг/мл. Раствор доводят до рН 7,0 с помощью 1н. NаΟΗ и измеряют апоптоз-индуцирующую активность к НЬ-60 клеткам способом, указанным в примере 2.

Результаты показывают, что подвергнутый теплообработке раствор пектина демонстрирует активность, в то время как внутренняя жидкость после диализа проявляет сниженную активность.

Результаты представлены на фиг. 2. Так на фиг. 2 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда лиофильновысушенный теплообработанный раствор, лиофильно-высушенную внутреннюю жидкость после диализа с использованием целлюлозной мембраны или лиофильно-высушенную внутреннюю жидкость после диализа с использованием 8рес1га/Рог 7 диализующей мембраны добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, получая концентрацию 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 1 0⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 2 незакрашенный квадрат означает контроль, где не добавляют образец; незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют лиофильно-высушенный продукт теплообработанного раствора; незакрашенный кружок обозначает случай, где добавляют лиофильновысушенный продукт внутренней жидкости после диализа через целлюлозную мембрану; и незакрашенный треугольник обозначает случай, когда используют лиофильно-высушенный продукт внутренней жидкости после диализа через 8рес!га/Рог 7 диализирующую мембрану. Таким образом, теплообработанный раствор демонстрирует противораковое действие.

(2) После доведения вышеупомянутого теплообработанного раствора пектина до рН 7,0 с помощью 1н. ΝαΟΗ и после того как его подвергнут ультрафильтрации, используя Сеи1пр1и8 1 0 (фракционирование молекулярной массы: 10000; производимой Лткои), получают фракцию, которая проходит через мембрану. Измеряют апоптоз-индуцирующую активность этой фракции способом, указанным в примере 2, при этом эта фракция имеет ту же самую активность, как и образец до ультрафильтрации.

Результаты представлены на фиг. 3. На фиг. 3 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда фракцию теплообработанного раствора пектина, проходящую через Сеп1пр1и5 10, добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, получая концентрацию 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 3 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавлен образец, и незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют фракцию, проходящую через мембрану. Таким образом, теплообработанный раствор пектина демонстрирует тот же самый результат, как в случае с незакрашенным ромбом, и теплообработанный раствор пектина и фракция, проходящая через мембрану, демонстрируют противораковое действие.

Пример 4.

Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в 50 мМ НЕРЕ8 буфере (рН 7,0), содержащем 120 мМ №С1, получая концентрацию пектина 1 0 мг/мл, и раствор доводят до рН 7,0 с помощью 1н. Ναί'Ί и нагревают при 121°С в течение 30 мин. Этот образец (20 мл) вводят в колонку из 8ер11асгу1 8-300 НБоаб 26/60 высокого разрешения (произв. Р11агшас1а). уравновешенную чистой водой, и подвергают гель-фильтрации. Используют чистую воду для подвижной фазы при скорости потока 1 мл/мин и осуществляют детектирование с помощью дифференциального рефрактометра.

Каждую из фракции 1 (которая элюируется после 110-190 мин после нанесения образца в колонку), фракции 2 (элюированную после 190270 мин) и фракции 3 (элюированную после 270-400 мин) концентрируют посредством испарителя. К каждой из фракций добавляют №1С1 и НЕРЕ8, получая их конечные концентрации 120 мМ и 50 мМ, соответственно, и получая объем 20 мл. Доводят рН до 7,0 с помощью 1н №1ОН.

Измеряют апоптоз-индуцирующую активность по способу, указанному в примере 2, при этом устанавливают сильную активность для фракции 3, имеющей наименьшую молекулярную массу.

Результаты представлены на фиг. 4. Таким образом, на фиг. 4 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, где вышеупомянутую фракцию 3 добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, получая концентрацию 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 1 0⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 4 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, и незакрашенный треугольник обозначает случай, где добавляют фракцию 3. Таким образом, фракция 3 демонстрирует противораковое действие.

Пример 5.

Ό-α-галактуроновую кислоту или Όглюкуроновую кислоту растворяют в 50 мМ НЕРЕ8 буфере (рН 7,0), содержащем 120 мМ №С1, получая концентрацию кислот 10 мг/мл. Полученные растворы нагревают при 121°С в течение 20 мин и доводят до рН 7,0 с помощью 1н. №1ОН. Измеряют апоптоз-индуцирующую активность этих образцов к НЬ-60 клеткам по способу примера 2, при этом оба образца демонстрируют значительную активность.

Результаты представлены на фиг. 5. Таким образом, на фиг. 5 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда теплообработанный раствор галактуроновой кислоты, подвергнутый теплообработке, или глюкуроновую кислоту, подвергнутую обработке, добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, получая концентрацию кислот 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 5 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют галактуроновую кислоту, подвергнутую теплообработке, и незакрашенный кружок обозначает случай, где добавляют глюкуроновую кислоту, подвергнутую термообработке. Таким образом, оба из теплообработанных продуктов демонстрируют противораковое действие.

(2) Галактуроновую кислоту растворяют в мМ НЕРЕ8 буфере (рН 7,0), содержащем 120 мМ №С1, получая концентрацию кислот 10 мг/мл. Раствор доводят до рН 7,0 и до рН 8,0 с помощью 1н. №1ОН. Каждый из них нагревают при 121°С в течение 20 мин и затем доводят до рН 7,0 с помощью 1н. №1ОН. Измеряют апоп29 тоз-индуцирующую активность этих образцов к НЬ-60 клеткам по способу примера 2, при этом образец, нагретый при рН 7,0, демонстрирует более сильную активность, чем образец, нагретый при рН 8,0.

Результаты представлены на фиг. 6. Таким образом, на фиг. 6 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда растворы галактуроновой кислоты, подвергнутые теплообработке при рН 7,0 или 8,0, добавляют, получая концентрацию кислот 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 6 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют галактуроновую кислоту, нагретую при рН 7,0, и незакрашенный кружок обозначает случай, где добавляют галактуроновую кислоту, нагретую при рН 8,0. Таким образом, продукт, нагретый при рН 7,0, демонстрирует противораковую активность.

Пример 6.

Пектин, полученный из яблока, растворяют в 50 мМ НЕРЕБ буфере (рН: 7,0), содержащем 120 мМ №С1, получая концентрацию пектина 1 0 мг/мл и раствор нагревают при 1 21 °С в течение 20 мин, получая теплообработанный образец 1. Его диализуют против 50 мМ НЕРЕБ буфера (рН: 7,0), содержащего 120 мМ №С1, используя вышеупомянутую целлюлозную диализирующую мембрану, получая образец внутренней жидкости 2. Образец внутренней жидкости 2 после диализа дополнительно нагревают при 121°С в течение одного часа с последующим доведением рН до 7,0 с помощью 1н. ΝαΟΗ, получая повторно нагретый образец 3.

Каждый из образцов 1-3 доводят до рН 7,0 с помощью 1н. ΝαΟΗ и измеряют их апоптозиндуцирующую активность к НЬ-60 клеткам по способу примера 2, при этом было установлено, что образцы 1 и 3 проявляют активность, в то время как в случае образца 2, активность уменьшается.

Из этих результатов следует, что внутренняя жидкость пектина, подвергнутого термообработке, после диализа, имеющая пониженную активность вследствие диализа, восстанавливает свою активность посредством повторного нагревания.

Пример 7.

Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в 1н. НС1, получая концентрацию пектина 1 0 мг/мл и раствор нагревают при 121°С в течение 1,5 ч, получая теплообработанный продукт. Затем указанный теплообработанный продукт доводят до рН 7,0 с помощью №1ОН и исследуют его апоптозиндуцирующую активность на клетках промие лоцидного лейкоза человека НЬ-60 следующим образом.

Так, НЬ-60 (АТСС ССЬ-240) инкубируют в КРМ1 1640 среде (произв. N1551.11), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (произв. С1Ьсо), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и затем суспендируют в КРМ1 1640 среде, получая концентрацию клеток 2,5 х 10⁵ клеток/4,5 мл.

К 4,5 мл этой суспензии добавляют 0,5 мл вышеупомянутого раствора пектина, подвергнутого теплообработке, и смесь инкубируют при 37°С в течение 16 ч в присутствии 5% диоксида углерода. Для подтверждения проводят такую же инкубацию, за исключением того, что 0,05 мл водного раствора (0,1 мг/мл) актиномицина Ό (произв. Б1дта), который известен как апоптоз-индуцирующий реагент, и 0,45 мл физиологического соляного раствора используют вместо вышеупомянутого теплообработанного раствора пектина.

Инкубированные клетки исследуют под оптическим микроскопом, при этом подтверждается конденсация ядер, контракция клеток и получение апоптотического тела как в растворе теплообработанного пектина, так и в клетках, инкубированных с добавленным актиномицином Ό. Кстати, в контроле, где клетки инкубировали с добавлением 0,5 мл физиологического соляного раствора, такого явления не наблюдали.

Кроме того, к суспензии клеток добавляют в два раза большем количестве, по объему, 0,4% водного раствора трипанового синего и проводят наблюдение под оптическим микроскопом, при этом трипановый синий зкскретируется и производят подсчет неокрашенных клеток и окрашенных в синий цвет клеток как жизнеспособных и погибших клеток, соответственно.

Результаты представлены на фиг. 7. Таким образом, на фиг. 7 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда раствор пектина, подвергнутый теплообработке, добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, получая концентрацию пектина 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 7 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют раствор пектина, подвергнутый теплообработке. Таким образом, пектин, подвергнутый теплообработке, демонстрирует противораковую активность.

Пример 8.

Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в воде, получая концентрацию пектина 1 0 мг/мл и раствор доводят до рН 7,0 с помощью №1ОН и нагревают при

121°С в течение одного часа. рН после нагрева31 ния равен 4,5. Затем этот теплообработанный продукт доводят до рН 7,0 с помощью ΝαΟΗ снова, нерастворимые вещества в нем удаляют посредством центрифугирования (10000 х д в течение десяти минут) и фильтрации, используя фильтр 0,22 мкм, затем туда добавляют этанол в таком же объеме, и смесь центрифугируют (10000 х д в течение десяти минут), каждую фракцию полученного супернатанта и фракцию осадка испаряют досуха в вакууме и каждую из них растворяют в воде в таком же количестве, которое используют для растворения пектина на начальной стадии. Каждый из водных растворов обработанной этанолом фракции супернатанта и фракции осадка доводят до рН 7,0 с помощью ΝαΟΗ и 0,5 мл каждого из них добавляют к 4,5 мл культуральной среды НЬ-60 клеток, для того, чтобы измерить апоптоз-индуцирующую активность по способу.

Примера 7.

В результате установлено, что в супернатантной фракции присутствует апоптозиндуцирующая активность по отношению к НЬ60 клеткам. Тот же самый результат получают, когда используют 2-пропанол вместо этанола. Результаты представлены на фиг. 8. Таким образом, на фиг. 8 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда водный раствор супернатантной фракции или фракции осадка после обработки этанолом или 2-пропанолом добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 8 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный кружок обозначает случай, где добавляют фракцию осадка, обработанную этанолом, закрашенный кружок обозначает случай, где добавляют обработанную этанолом супернатантную фракцию, незакрашенный треугольник обозначает случай, где добавляют обработанную 2-пропанолом фракцию осадка, и окрашенный треугольник обозначает случай, когда добавляют обработанную 2-пропанолом супернатантную фракцию. Таким образом, обработанные растворителем супернатантные фракции демонстрируют противораковую активность.

Образцы получают тем же способом, как упомянуто выше, изменяя количество этанола или 2-пропанола, подлежащего добавлению к теплообработанному пектину, в 0,5, 1,5 и 2-раза, по объему, в результате было установлено, что подобно случаям, где добавляют эквивалентный объем этанола или 2-пропанола, отмечается активность в супернатантных фракциях. В связи с этим, измеряют апоптоз-индуцирующую активность следующим способом. Так, в каждую из лунок 96-луночного микротитрационного планшета добавляют 100 микролитров ΚΡΜΙ

1640 среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, содержащей 5000 НЬ-60 клеток, 10 микролитров образца и 10 микролитров а1атагВ1ие (произв. А1атаг Вюкшепсе) и проводят инкубацию при 37°С в течение 48 ч в присутствии 5% диоксида углерода-газа. После этого, измеряют значение, полученное вычитанием поглощения при 590 нм из поглощения при 560 нм, и эта разница в поглощениях служит выражением степени пролиферации клеток.

Пример 9.

Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в 0,1 М карбонатном буфере, получая концентрацию пектина 1 0 мг/мл и доводят рН до 9,5. Этот раствор нагревают при 121°С в течение 30 мин. рН теплообработанного продукта составляло 9,2. Затем часть теплообработанного продукта доводят до рН 7,0 с помощью НС1 (образец А), в то время как остаток доводят до рН 4,5. Образец, доведенный до рН 4,5, нагревают снова при 121°С в течение 30 мин и доводят рН до 7,0 (образец В). Измеряют апоптоз-индуцирующую активность образцов А и В по отношению к клеткам НЬ-60 способом примера 7, при этом было установлено, что образец А не проявляет активности, в то время как образец В (теплообработанный раствор пектина ΙΙ) проявляет активность.

Результаты представлены на фиг. 9. Таким образом, на фиг. 9 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда образец А или В добавляют к культуральной среде НЬ-60 клеток, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 1 0⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 9 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют образец А, незакрашенный кружок обозначает случай, где добавляют образец В. Таким образом, теплообработанные растворы пектина демонстрируют противораковую активность.

Пример 1 0.

(1) Когда Ό-α-галактуроновую кислоту растворяют в воде, получая концентрацию 1 0 мг/мл, при этом рН равен 2,4. Раствор нагревают при 121°С в течение 20 мин. рН подвергнутого теплообработке продукта равен 2,2. рН этого теплообработанного продукта доводят до рН 7,0 и измеряют апоптоз-индуцирующую активность по отношению к НЬ-60 клеткам по способу примера 7 за исключением того, что используют суспензию клеток, в которой число НЬ-60 клеток доводят до 3 х 10⁵ клеток/4,5 мл, в результате чего было установлено, что данный образец имеет активность.

Результаты представлены на фиг. 1 0. Таким образом, на фиг. 1 0 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда теплообработанный продукт галактуроновой кислоты в кислых условиях добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, получая концентрацию 1 мг/мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 10, незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют теплообработанную галактуроновую кислоту. Таким образом, теплообработанный продукт демонстрирует противораковую активность.

(2) Ό-Глюкуроновую кислоту добавляют к 50 мМ НЕРЕ8 буферу (рН 7,0), содержащему 120 мМ №1С1. получая концентрацию 10 мг/мл, при этом рН равен 3,18. Раствор нагревают при 121°С в течение 20 мин, рН теплообработанного раствора доводят до 7,0 с помощью ΝαΟΗ и измеряют апоптоз-индуцирующую активность по отношению к НЬ-60 клеткам по способу примера 7, при этом данный образец, как установлено, имеет активность.

Результаты представлены на фиг. 11. Таким образом, на фиг. 11 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда теплообработанную глюкуроновую кислоту, добавляют к культуральной среде НЬ-60 клеток, получая концентрацию 1 мг/1 мл, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵ клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 11 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, в то время как незакрашенный кружок обозначает случай, где добавляют теплообработанную глюкуроновую кислоту. Таким образом, продукт теплообработанной глюкуроновой кислоты демонстрирует противораковую активность.

Пример 11.

Когда Ό-α-галактуроновую кислоту растворяют в воде, получая концентрацию 1%, то при этом рН составляет 2,4. После нагревания этого раствора при 121°С в течение 20 мин, рН теплообработанного раствора становится 2,2. Его концентрируют в 40 раз в вакууме и 20 микролитров концентрата подвергают жидкостной хроматографии высокого разрешения, используя колонку Ра1рак Туре 5 (4,6 х 250 мм; произв. Такага 81шхо) . Затем галактуроновую кислоту, которую нагревают в кислых условиях, отделяют, используя водный раствор ацетонитрила при скорости потока 1 мл/мин. В течение первых 30 мин, используют 90% раствора, в течение последующих 20 мин, применяют градиент линейной концентрации, используя растворы с концентрацией от 90 до 50%. Фракционирование проводят каждые 90 с, каждую фракцию выпаривают досуха в вакууме, затем растворяют в 80 микролитрах воды и каждые 10 микролитров раствора подвергают измерению апоптоз-индуцирующей активности к НЬ-60 клеткам с помощью МТТ метода, который будет представлен ниже.

В результате, была установлена активность в двух фракциях, имеющих времена элюирования 4,5-12 мин и 45-48 мин.

МТТ Метод: каждые 5 микролитров разбавленного раствора каждого образца-жидкости или 5 микролитров воды помещают в лунку 96луночного микротитрационного планшета. В нее добавляют 100 микролитров КРМ1 1640 среды, содержащей 1 0% фетальной бычьей сыворотки, содержащей 5000 НЬ-60 клеток, и инкубацию проводят при 37°С в течение 48 ч в присутствии 5% углекислого газа. После добавления туда 1 0 микролитров забуференного фосфатом физиологического раствора, содержащего 5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолий бромида (МТТ; произв. 81дта), проводят инкубацию еще в течение 4 ч и наблюдают за ростом клеток под микроскопом. С другой стороны, туда добавляют 1 00 микролитров 2-пропанола, содержащего 0,04н. НС1, смесь тщательно перемешивают и измеряют поглощение при 590 нм и его используют как степень пролиферации клеток.

Пример 1 2.

(1 ) Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, суспендируют в воде, получая концентрацию пектина 2,5%. Суспензию доводят до рН 7,0 с помощью №ОН, помещают в трубку для диализа, чья фракционирующая молекулярная масса составляет 1 2000-1 4000, и диализуют против 15-кратного, по объему, количества воды четыре раза. После диализа, раствор доводят до рН 7,0 снова и нагревают при 121°С в течение одного часа с получением теплообработанного раствора. рН этого теплообработанного раствора составляет 5,4. рН этого теплообработанного раствора доводят до 7,0 с помощью №ОН, подвергают центрифугированию, чтобы удалить нерастворимые вещества, и подвергают фильтрации, используя фильтры в следующем порядке: 0,8 микрометра, 0,45 микрометра и 0,22 микрометра, получая обработанный фильтром раствор. Затем этот обработанный фильтром раствор фильтруют через ультрафильтрационную мембрану с фракционирующей молекулярной массой 1 0000. Фильтрат, проходящий через ультрафильтрационную мембрану, концентрируют и выпаривают досуха в вакууме и высушенный продукт растворяют в воде в количестве, которое составляет 1 /40 (часть) воды, используемой для растворения пектина на начальной стадии, получая при этом теплообработанный раствор пектина.

Теплообработанный раствор пектина наносят на колонку ТОУО-РЕАКЬ Н\У-40С (4,4 х см; произв. Тою), уравновешенную водой, проводят гель-фильтрацию при скорости потока

2,5 мл/мин и измеряют апоптоз-индуцирующую активность каждой из фракций способом, в котором используют аламарблю (а1атагВ1ие) , как упомянуто выше в примере 8. В результате, фракция, которая была элюирована в течение 448-472 мин, проявила активность.

(2) Ό-α-галактуроновую кислоту растворяют в воде, получая концентрацию 1%, и раствор доводят до 7,0 с помощью ΝαΟΗ. Его нагревают при 121°С в течение 20 мин и измеряют апоптоз-индуцирующую активность этого теплообработанного раствора по отношению к НЬ60 клеткам по способу примера 7, при этом теплообработанный продукт показал апоптозиндуцирующую активность.

Пример 13.

Пектин (произв. \Уако Риге Сйеткак, собе 167-00542), альгиновую кислоту (ненабухающая; произв. \Уако Риге Сйеткак; собе 01113341), Ό-α-галактуроновую кислоту (произв. №1сакн Теэдие; собе 165-18) или Ό-глюкуроновую кислоту (произв. №1са1а1 Теэдие; собе 169-28) растворяют в дистиллированной воде, получая раствор с концентрацией 1 %. В случае пектина, с таким же успехом получают другой раствор путем растворения в водном растворе 1н уксусной кислоты.

Каждый из этих 1 % растворов нагревают при 121°С в течение 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч и 16 ч, и каждый из нагретых растворов доводят до рН 7 с помощью Ν;·ιΟΗ и подвергают стерилизации с помощью фильтра 0,22 микромеров, получая образец для измерения апоптоз-индуцирующей активности.

Приготовленные таким образом образцы разбавляют в 2, 5, 10, 20, 50 и 100 раз и их апоптоз-индуцирующую активность анализируют с помощью МТТ способа, упомянутого в примере 11, а затем сравнивают полученные активности. Результаты даны в таблицах 1-5.

(А) рН 1 % водного раствора пектина составляет 3,4. Активность теплообработанного пектина показана в терминах максимальных разбавлений, где активность все еще заметна. Как показано в таблице 1 , активность существенно увеличивается путем тепловой обработки при 120°С в течение четырех часов.

Таблица 1. Тепловая обработка водного раствора пектина

Время нагревания	рН до нагревания	рН после нагревания	рН после доведения	Активность (макс.разб.)
2 ч	3,4	3,3	7,0	2-кратное
4 ч	3,4	3,2	7,2	10-кратное
16 ч	3,4	3,5	7,0	20-кратное

(В) рН пектина в 1 % водном растворе уксусной кислоты составил 2,6. Активность раствора пектина в растворе уксусной кислоты дана в терминах максимального разбавления, где все еще заметна активность. Как показано в таблице 2, активность существенно увеличивается путем нагревания при 120°С в течение 16 ч.

Таблица 2. Тепловая обработка раствора пектин-уксусной кислоты

Время нагревания	рН до нагревания	рН после нагревания	рН после доведения	Активность (макс.разб.)
2 ч	2,6	2,7	7,0	2-кратное
4 ч	2,6	2,6	7,2	5-кратное
16 ч	2,6	2,8	7,1	20-кратное

(С) рН водного раствора галактуроновой кислоты до нагревания составлял 2,5. Активность подвергнутой тепловой обработке галактуроновой кислоты дана в терминах максимального разбавления, где все еще заметна активность. Как показано в таблице 3, активность существенно увеличивается путем нагревания при 1 20°С в течение одного часа.

Таблица 3. Тепловая обработка водного раствора галактуроновой кислоты

Время нагревания	рН до нагревания	рН после нагревания	рН после доведения	Активность (макс.разб.)
30 мин	2,5	2,4	6,8	2-кратное
1 ч	2,5	2,4	6,9	10-кратное
2 ч	2,5	2,4	6,9	20-кратное
4 ч	2,5	2,4	6,8	50-кратное
16 ч	2,5	2, 6	6,9	100-кратное

(Ό) рН водного раствора глюкуроновой кислоты до нагревания составлял 2,4. Активность теплообработанной глюкуроновой кислоты дана в терминах максимального разбавления, где все еще заметна активность. Как показано в таблице 4, активность существенно увеличивается путем нагревания при 120°С в течение 30 мин.

Таблица 4. Тепловая обработка водного раствора глюкуроновой кислоты

Время нагревания	рН до нагревания	рН после нагревания	рН после доведения	Активность (макс.разб.)
30 мин	2,4	2,6	6,9	2-кратное
1 ч	2,4	2,7	6,9	20-кратное
2 ч	2,4	2,7	6,9	50-кратное
4 ч	2,4	2,6	7,0	100-кратное
16 ч	2,4	2,8	7,0	100-кратное

(Е) рН водного раствора альгиновой кислоты до нагревания составлял 3,3. Активность теплообработанной альгиновой кислоты дана в терминах максимального разбавления, где все еще заметна активность. Как показано в таблице 5, активность существенно увеличивается путем нагревания при 120°С в течение двух часов.

Таблица 5. Тепловая обработка водного раствора альгиновой кислоты

Время нагревания	рН до нагревания	рН после нагревания	рН после доведения	Активность (макс.разб.)
1 ч	3,3	2,6	6,8	2-кратное
2 ч	3,3	2,5	6,9	10-кратное
4 час	3,3	2,7	7,0	10-кратное
16 час	3,3	2,9	7,3	20-кратное

Пример 1 4.

Промытый этанолом пектин (произв. \Уако

Риге Сйеткак; код 167-00542) (промыт 80% этанолом, промыт 50% этанолом, промыт 80% этанолом и окончательно промыт 1 00% этанолом, а затем высушен в вакууме с получением грубо очищенного пектина в порошкообразной форме), непромытый пектин (произв. \Уако Риге Скеткак; код 167-00542), альгиновую кислоту (ненабухающая; тип Ό-маннуроновой кислоты; произв. \Уако Риге Скеткак; код 011-13341), альгиновую кислоту (набухающая; типа Ьгулуроновой кислоты; произв. \Уако Риге

Скеткак; код 014-13331), Ό-глюкуроновую кислоту (произв. №1са1а1 Теэдие; код 169-28) или Ό-α-галактуроновую кислоту (произв. ЫасаЫ Теэдие; код 165-18) в количестве 0,5 г помещают в десять пробирок для испытания (одну тестпробирку, которую не подвергают нагреванию, используют в качестве контроля) и нагревают на воздухе при 120, 150 или 180°С в сухих условиях, проверяя изменение окраски образца. В зависимости от изменения окраски, отбор проб проводят в трех точках и активный ингредиент эстрагируют следующим способом.

Каждый из сухих образцов, полученных таким образом, суспендируют в 12,5 мл 50% этанола. Суспензию встряхивают при комнатной температуре в течение 1 6 ч и центрифугируют, получая экстракт. Экстракт концентрируют и сушат в вакууме и повторно растворяют в дистиллированной воде, получая концентрацию 1 %, в расчете на количество первоначального образца. рН полученного раствора доводят до приблизительно 7 и стерилизуют с помощью фильтра 0,22 микрометра, получая образец для измерения активности. Полученный образец анализируют на активность с помощью МТТ метода, упомянутого в примере 11. Результаты представлены в таблицах 6-11 наряду с температурой сухого нагревания, временем, рН после повторного растворения и рН после доведения. В этой связи, ту же самую операцию проводят для не нагретого образца, но не находят никакой активности. В таблицах 6-11, активность дана в терминах степени разбавления образца, который все еще демонстрирует активность.

Из этих результатов найдено, что активное вещество также получают способом сухого нагревания.

Таблица 6. Тепловая обработка ЕЮН-промытого пектина

Темп. сухого нагревания (°С)	Время (мин)	рН после повторного растворения	рН после доведения	Активн. (степень разб.)
180	60	3,7	6,9	1
180	120	3,5	6,8	1

Таблица 7. Тепловая обработка пектина

Темп. сухого нагревания (°С)	Время (мин)	рН после повторного растворения	рН после доведения	Активн. (степень разб.)
180	120	3,9	7,0	1
Таблица 8. Тепловая обработка альгиновой кислоты (тип I)маннуроновой кислоты)
Темп. сухого нагревания(°С)	Время (мин)	рН после повторного растворения	рН после доведения	Активн. (макс, разб.)
150	40	3,0	6,8	1

150	60	3,0	6,8	1
180	20	3,0	6,8	1
180	30	3,0	6,8	1
180	40	3,1	6,9	1

Таблица 9. Тепловая обработка альгиновой кислоты (тип Е гулуроновой кислоты)

Темп. сухого нагревания (°С)	Время (мин)	рН после повторного растворения	рН после доведения	Активн. (макс. разб.)
150	60	3,3	6,7	1
180	20	3,3	6,7	1
180	30	3,3	6,7	1
180	40	3,2	6,8	1

Таблица 10. Тепловая обработка глюкуроновой кислоты

Темп. сухого нагревания (°С)	Время (мин)	рН после повторного растворения	рН после доведения	Активн. (макс. разб.)
150	20	3,2	6,8	1
150	30	3,3	6,9	1
150	40	3,3	6,9	1
180	10	3,1	7,0	1
180	20	3,3	6,8	1
180	30	3,3	6,9	2

Таблица 11. Тепловая обработка галактуроновой кислоты

Темп. сухого нагревания (°С)	Время (мин)	рН после повторного растворения	рН после доведения	Активн. (макс. разб.)
120	60	2,9	6,9	1
120	120	2,9	6,9	1
150	20	2,9	6,8	2
150	30	2,9	6,9	2
150	40	2,9	6,8	2
180	10	2,9	7,1	2
180	20	2,9	6,8	2
180	30	2,9	6,8	1

Пример 15.

Коммерчески доступный пектин, полученный из яблока, растворяют в воде, получая концентрацию 1 % и раствор помещают в колбу грушевидной формы, снабженной обратным холодильником, и нагревают на масляной бане, поддерживая 110-120°С в течение 18, 42 или 66

ч. Температура раствора пектина во время нагревания составляла 1 00-1 02°С.

Полученный раствор пектина центрифугируют, удаляя остаток, и супернатант разбавляют водой в три или десять раз, получая образец. Разбавленный образец (10 микролитров) и 100 микролитров ΚΡΜΙ 1640 среды, содержащей 1 0% фетальной бычьей сыворотки, содержащей 5000 НЬ-60 клеток добавляют в лунку 96луночного микротитрационного планшета и инкубируют при 37°С в течение 48 ч в присутствии 5% диоксида углерода и активность измеряют МТТ способом, упомянутым в примере 11.

Результаты были таковы, что жизнеспособные клетки не были найдены в секциях, в которые добавляют разбавленный в три раза раствор пектина, в течение 1 8 ч, и также в которые добавляют разбавленные в три и в десять раз растворы пектина, нагретые в течение 42 и 66 часов, тем самым, при концентрациях с такими степенями разбавления, пектин, нагретый при 1 00°С, показывает активность.

С другой стороны, в секции, в которую добавляют в десять раз разбавленный раствор пектина, нагретый в течение 18 ч, почти все клетки были жизнеспособными, но при сравнении с контролем, который представлял секцию, в которую добавляют воду, поглощение при 590 нм было ниже.

Пример 16.

Помозин пектин ЬМ-13С6 (произв. Негси1е8) (5 кг) добавляют к 100 литрам водопроводной воды, продувают через нее пар в течение 35 мин, так чтобы температура жидкости поднялась с 28 до 120°С и жидкость поддерживают при 1 20°С в течение пяти часов при перемешивании и охлаждают, получая 135 л охлажденной жидкости. К этой охлажденной жидкости добавляют 1,35 кг целита-Се11Ре #545 (произв. СеШе) и 1,35 кг диоксида кремния-81 1юа #600-3 (произв. С1шо 8Шса) в качестве ускорителя фильтрации и смесь фильтруют через плотный фильтр (АбуалРес #327; из 6-дюймовой фильтровальной бумаги в 1 6 слоев, предварительно покрытый 0,1 кг целита (Се11Ре #545) и 0,1 кг диоксида кремния (8Шса #600-8).

Полученный фильтрат подвергают непрерывному мгновенному нагреванию (при 98°С в течение 60 с) с помощью нагревателя-пластины (Р1аРе НеаРег) (произв. МсЫкаи 8е18аки8Йо) с последующим охлаждением, получая 150 л теплообработанного раствора пектина I.

рН, кислотность и содержание сахара теплообработанного раствора пектина I составляли приблизительно 3,5, 6,2 мл и 5,8 Впх%. соответственно. При этом, рН измеряют рН-метром, кислотность определяют по количеству (мл) 0,1н №1ОН, требуемому для нейтрализации 10 мл образца до рН 7,0, и содержание сахара измеряют с помощью Впх сахарометра.

Активность вышеуказанного теплообработайного раствора пектина I по отношению к клеткам промиелоцидного лейкоза человека (НЬ-60 клетки) измеряют следующим образом.

Так, НЬ-60 (АТСС СКЬ-240) инкубируют при 37°С в КРМ1 1640 среде (производство N18§и1), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (производство 61Ьсо), обработанной при 56°С в течение 30 мин, и суспендируют в вышеупомянутой среде, получая концентрацию 2,5 х 10⁵ клеток/4,5 мл. К 4,5 мл этой суспензии добавляют 0,5 мл вышеупомянутого теплообработанного раствора пектина, разбавленного водой с получением концентрации 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 или 0,1 мг/мл, и смесь инкубируют при 37°С в присутствии 5% углекислого газа в течение 24 или 48 ч.

К культивируемым клеткам добавляют водный раствор трипанового синего, смеси дают возможность постоять при комнатной температуре в течение нескольких минут и проводят наблюдение в оптическом микроскопе, причем трипановый синий экскретируется, и подсчитывают бесцветные клетки и окрашенные в синий цвет клетки как жизнеспособные и мертвые клетки, соответственно. Инкубированные клетки также наблюдают в оптическом микроскопе, при этом подтверждается уплотнение ядер, уменьшение клеток и продуцирование апоптотического тела в секции, в которую добавляют 1 мг/мл или более теплообработанного пектина. При этом, в секции, в которую добавляют 0,5 мг/мл или менее теплообработанного пектина, и в контроле, где добавляют 0,5 мл воды, такие явления не отмечаются.

Результаты показаны на фиг. 12. Так, на фиг. 1 2 показана зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток, когда теплообработанный раствор пектина различных концентраций добавляют в культуральную среду НЬ-60 клеток, где абсцисса обозначает время инкубации (часы), а ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵клеток/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 1 2 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, перевернутый незакрашенный треугольник обозначает случай, где добавляют 2 мг/мл теплообработанного пектина, закрашенный квадрат обозначает случай, где добавляют 1 мг/мл теплообработанного пектина, закрашенный ромб обозначает случай, где добавляют 0,5 мг/мл теплообработанного пектина, закрашенный кружок обозначает случай, где добавляют 0,2 мг/мл теплообработанного пектина и закрашенный треугольник обозначает случай, где добавляют 0,1 мг/мл теплообработанного пектина. Таким образом, в случаях, где добавляют 50-20 мг/мл теплообработанного пектина, наблюдается активность, подобная случаю, где добавляют 2 мг/мл теплообработанного пектина, как показано для перевернутого незакрашенного треугольника, и, когда добавляют 1 мг/мл или более теплообработанного пектина, наблюдается противораковая активность.

Пример 1 7.

Коммерчески доступную Ό-глюкуроновую кислоту (произв. 8щта; 65269) растворяют в воде, получая концентрацию 1 % и раствор нагревают при 1 21 °С в течение четырех часов, нейтрализуют до рН 7,0 с помощью №ЮН и разбавляют в 10, 40, 80 и 160 раз водой. Каждый из разбавленных растворов теплообработанной глюкуроновой кислоты (0,5 мл) добавляют к 4,5 мл КРМ1 1640 среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, содержащей 2,5 х 10⁵НЬ-60 клеток, инкубацию проводят при 37°С в течение 24 ч в присутствии 5% углекислого газа и измеряют противораковую активность по способу примера 7 в терминах активности в ингибировании пролиферации клеток. В результате, в случаях добавления растворов с разбавлением от 10- до 80-кратного, отмечается уменьшение числа клеток и степени выживания клеток. В случае растворов с разбавлением от 40- до 80кратного, было установлено, что ДНК расщеп ляются на небольшие фрагменты (становятся маленькими молекулами). При этом, степень выживания (Я) клетки, выраженную в %, рассчитывают по следующей формуле:

Я = Ук/(Ук + ϋδ) х 100 + Пс/(Ус + Бс) х 100.

В этой формуле Ук и Όκ представляют число жизнеспособных клеток и погибших клеток, соответственно, в секции, где добавляют образец; и Ус и Ός представляют число жизнеспособных клеток и погибших клеток, соответственно, в секции, где добавляют воду. Противораковую активность в 1 мл среды, когда Я равно 50%, определяют как одну единицу.

Если полученные степени выживания клеток нанести на график в логарифмических значениях от степени разбавления теплообработанной глюкуроновой кислоты, то все точки ложатся на прямую линию и степень выживания Я (%) в теплообработанной глюкуроновой кислоте, рассчитывают из следующей формулы:

Я = 58,656Х - 31,884 (в формуле X представляет степень разбавления теплообработанной глюкуроновой кислоты).

Из этой прямой линии найдено, что теплообработанная неразбавленная глюкуроновая кислота соответствует 250 единиц/мл.

Результаты представлены на фиг. 13. Так, на фиг. 1 3 представлена зависимость между степенью разбавления и степенью выживания клеток в культуральной среде, когда теплообработанную глюкуроновую кислоту с различными степенями разбавления добавляют к НЬ60 клеткам с последующей инкубацией в течение 24 ч. Абсцисса обозначает степень разбавления (кратность; в логарифмах), в то время как ордината обозначает степень выживания клеток (%).

Пример 18.

(1) Получают 25% раствор пюре из ободранной кожуры яблока (произв. Маги/еи БНокиΙιίη Кодуо), бананового пюре (произв. Ода\\а Когуо), 1/4 экстракта зеленой периллы многолетней (дгееи ЬееШеак р1аи! ех!гас!) (произв. Эап Рообк), экстракта тыквы пепо (ришркги ех1гас1) 60 (произв. Паи Рообк), измельченной тыквы пепо (ттсеб ритркт) (произв. Паи Рообк), пюре сельдерея (се1егу ригее) (произв. Паи Рообк), пюре лопуха (Ьигбоск ригее) (произв. Паи Рообк) или экстракта экалота 60 (произв. Паи Рообк). Каждый из них нагревают при 121°С в течение 40 мин. Каждый из растворов, полученных таким же способом, нагревают при 1 21 °С в течение четырех часов. Каждый из подвергнутых тепловой обработке растворов охлаждают и фильтруют, получая теплообработанный раствор.

Содержание сахара и рН раствора, прогретого при 1 21 °С в течение 20 мин, представлены в таблице 1 2.

Таблица 12

Исходное вещество

Содерж. сахара

рН

	(Впх)
Пюре из ободранной яблочной кожуры	3,6	3,6
Банановое пюре	6,0	5,9
Экстракт зеленой периллы многолетней 1/4	2,2	5,8
Экстракт тыквы пепо 60	16,8	5,3
Измельченная тыква пепо	4,0	5,7
Пюре сельдерея	1,6	5,5
Пюре лопуха	2,4	5,8
Экстракт экалота 60	15,6	4,9

Содержание сахара и рН раствора, прогретого при 1 21 °С в течение четырех часов, представлены в таблице 13.

Таблица 13

Исходное вещество	Содерж. сахара (Впх)	рН
Пюре из ободранной яблочной кожуры	3,6	3,6
Банановое пюре	5,5	4,6
Экстракт зеленой периллы многолетней 1/4	2,5	5,3
Экстракт тыквы пепо 60	16,6	4,7
Измельченная тыква пепо	3,0	5,0
Пюре сельдерея	1,6	4,9
Пюре лопуха	2,5	4,8
Экстракт экалота 60	13,8	4,3

В каждом из подвергнутых тепловой обработке растворов, фракции, имеющие молекулярную массу 10,000 или менее, как установлено, демонстрируют противораковую активность, как указано в примере 17.

Затем содержание сахара (Впх) доводят до 1 и проводят органолептический тест для каждого из теплообработанных растворов, при этом все из теплообработанных растворов демонстрируют хорошее органолептическое свойство как пищевой продукт или напиток.

(2) 25% водные растворы бананового пюре, яблочного пюре и пюре сельдерея, нагретые при 1 21 °С в течение четырех часов, берут в качестве иллюстративных примеров и их противораковую активность в единицах измеряют по способу примера 1 7. Результаты представлены в таблице 1 4. Таким образом, в результате тепловой обработки, в каждом из обработанных растворов получают противораковое активное вещество.

Таблица 1 4

Используемое пюре	Активность (единиц/мл)
Банановое пюре	23,4
Яблочное пюре	9,5
Пюре сельдерея	0,5

Пример 19.

Воду (1 60 мл) добавляют к 40 г (1 ) листьев редьки, (2) листьев моркови, (3) моркови, (4) капусты, (5) баклажан без кожицы, (6) банана или (7) альбедо хассаки апельсина и каждую из смесей гомогенизируют, используя миксер. Часть смеси нагревают при 121°С в течение четырех часов и центрифугируют и супернатант доводят до рН 6 с помощью №1ОН, получая образец А, в то время как остаток доводят до рН 3 с помощью НС1 и нагревают при 121°С в течение четырех часов и супернатант после центри фугирования доводят до рН 6 с помощью ΝαΟΗ, получая образец В.

Каждый из образцов А и В, полученных из (1)-(7) разбавляют и 10 микролитров разбавленного раствора подвергают измерению на противораковую активность по МТТ способу, упомянутому в примере 11. Результаты представлены в таблице 15. Данные, представленные в таблице 15, представляют степени разбавления, при которых активность все еще проявляется и обозначение «-» показывает, что активность не наблюдается в секциях, где добавляют неразбавленный раствор. У всех фруктов и овощей, отмечается генерация активности в их теплообработанных продуктах. В таблице степени разбавления представляют степени, где клетки полностью погибают, в то время как значения в скобках представляют значения, где клетки подвергались воздействию.

Таблица 15

Используемые овощи и фрукты	Степень разбавления для
Образца А	Образца В
Листья редьки	1 (4)	2 (4)
Листья моркови	-	1
Морковь	2 (4)	1 (2)
Капуста	1 (4)	1
Баклажан	1 (2)	1
Банан	2 (4)	2 (4)
Аауе Раске!	4 (8)	4 (8)

Пример 20.

Ненабухающую альгиновую кислоту (произв. Аако Риге Скетюак; 011-13341) или набухающую альгиновую кислоту (произв. Аако Риге Скеткак; 014-13331) суспендируют в воде, получая концентрацию 1%, при этом рН составляет 3,32 и 3,38, соответственно. Каждую из них нагревают при 121°С в течение 20 мин и измеряют их противораковую активность как активность, ингибирующую клеточную пролиферацию клеток, на НЬ-60 клетках по способу примера 7. При этом число НЬ-60 клеток в начале инкубации составляло 3 х 1 0⁵ клеток/5 мл.

Результаты представлены на фиг. 1 4. Так, на фиг. 1 4 представлена зависимость между временем инкубации и числом жизнеспособных клеток в культуральной среде, когда теплообработанные растворы ненабухающей альгиновой кислоты или набухающей альгиновой кислоты добавляют в культуральную среду НЬ60 клеток, получая концентрацию 1 мг/мл. Абсцисса обозначает время инкубации (часы), в то время как ордината обозначает число жизнеспособных клеток (х 10⁵ се1к/5 мл) в культуральной среде. На фиг. 1 4 незакрашенный квадрат обозначает контроль, где не добавляют образец, незакрашенный ромб обозначает случай, где добавляют теплообработанную ненабухащую альгиновую кислоту, и незакрашенный треугольник обозначает случай, где добавляют теплообработанную набухающую альгиновую кислоту. Таким образом, отмечается высокая активность в теплообработанной ненабухающей альгиновой кислоте.

Пример 21 .

Получают 1 % водную суспензию альгиновой кислоты ΗΡΌ (произв. Οοίηίρροη Ркагтасеи11са1) и подвергают ее тепловой обработке при 120°С в течение четырех часов. Супернатант подвергнутого тепловой обработке раствора после центрифугирования подвергают измерению на противораковую активность способом, упомянутым в примере 1 7, для того, чтобы рассчитать противораковую активность в единицах. Результаты показаны в таблице 1 6. Таким образом, генерацию активного вещества наблюдают в теплообработанной альгиновой кислоте.

Таблица 16

Теплообработанная альгиновая кислота I ΙΙ·Ί )	Активность (единицы/мл)
Прогретый 1% раствор	83,3

Пример 22.

Альгиновую кислоту ΗΡΌ (произв. Οοίηίρροη Ркагтасеи1ка1) (1 г) суспендируют в 50 мл воды и нагревают при 121°С в течение 30 мин, 1

4, 2 ч или 1 4 ч. Каждый из подвергнутых тепловой обработке растворов получают с помощью центрифугирования и определяют его молекулярную массу. Определение молекулярной массы проводят при следующих условиях.

Сиагб Со1ити: Т8К Сиагб Колонка РАН

Колонка: Т8К гель О3000РА Элюирующий раствор: 0,2М №1С4 Детектирование: по поглощению при 21 0 нм Когда время нагревания составляет 30 мин, 1 , 2, 4 и 1 4 ч, то в качестве основных пиков получают низкомолекулярные продукты разложения с молекулярными массами: 1800; 1200 и 630; 1100 и 630; 1100 и 630; и 620 и 400, соответственно, и, в то же самое время, с таким же успехом получают другие низкомолекулярные продукты разложения. При этом, высокомолекулярные вещества, имеющие молекулярную массу 1 0000 и более, не содержатся, и противораковая и антибактериальная активность обнаружена во фракциях, имеющих молекулярную массу 500 или менее.

Пример 23.

(1 ) Коммерчески доступный глюкуронолактон (производимый Мегск; Собе Νο. 100282) растворяют в воде, получая концентрацию 1 %, и раствор нагревают при 121°С в течение 0,5, 1, 2, 4 или 1 6 ч. Противораковую активность каждого из подвергнутых теплообработке растворов измеряют по способу примера 1 7. В растворе, нагретом в течение 0,5 ч, отмечается продуцирование противоракового вещества. Установлено, что чем длиннее время нагревания, тем больше продуцируется противоракового вещества и, в каждом из продуктов, нагретых в течение 4 и 1 6 ч, продуцирование было приблизительно в 1 0 раз больше, чем в случае продукта, прогретого в течение 0,5 ч.

(2) Вышеуказанный глюкуронолактон растворяют в воде, получая концентрацию 0,1, 1, 2,

5, 1 0 или 20%, и каждый из растворов нагрева45 ют при 121°С в течение четырех часов. Противораковую активность каждого из подвергнутых теплообработке растворов измеряют по способу примера 17. Хотя продуцирование противоракового вещества отмечалось в растворах всех концентраций, потенция противораковой активности теплообработанного продукта на используемый глюкуронолактон была наивысшей в том случае, когда использовали 0,1% водный раствор глюкуронолактона.

(3) рН вышеупомянутого 1% водного раствора глюкуронолактона доводят до 1, 2, 3 или 4,5 с помощью НС1 или с помощью ΝαΟΗ и каждый из растворов нагревают при 1 21 °С в течение четырех часов. Противораковую активность каждого из подвергнутых теплообработке растворов, полученных как таковых, измеряют по способу примера 1 7. Хотя продуцирование противоракового вещества отмечалось во всех случаях вышеупомянутых рН значений, потенция противораковой активности теплообработанного продукта при рН 3-4,5 была приблизительно в 1 5 раз выше, чем при рН 1 на используемый глюкуронолактон.

(4) Коммерчески доступную Όглюкуроновую кислоту (производство 81дта; 05269) растворяют в воде, получая концентрацию 1%, и нагревают при 121°С в течение четырех часов, при этом получают образец (рН 2,6), где рН не регулируют, и другой образец, где рН доводят до 6,6 с помощью ΝαΟΗ. Каждый 1 мл из них хранят при -20°С, 4°С и 37°С, и измеряют противораковую активность по способу примера 1 7.

Результат, после хранения в течение 25 дней, состоит в том, что при хранении при 37°С, противораковая активность теплообработанного продукта несколько уменьшается, в то время как в случае хранения при 4°С и -20°С, активность была стабильной.

Пример 24.

Помозин пектин типа ЬМ-1300 (произв. Нсгси1с5). альгиновую кислоту ΗΡΌ (произв. Όαίηίρροη Рйагтасеи!1са1), Ό-глюкуроновую кислоту (произв. №1са1;н Тезсще) или глюкуронолактон (произв. Мегск) растворяют или суспендируют в воде, получая концентрацию 1 %, и раствор или суспензию нагревают при 95°С, 121°С или 132°С в течение 16 ч. Измеряют противораковую активность в единицах этих теплообработанных продуктов по способу примера 17. Результаты представлены в таблице 17.

Таблица 17

Нагреваемое вещество	Температура нагревания (°С)	Активность (единицы/ мл)
Пектин	95	1,2
	121	32,3
	132	1/4
Альгиновая кислота	95	1,0
	1 21	57,8
	132	25,7
Глюкуроновая кислота	95	40,8
	1 21	345
	132	30,2

Глюкуронолактон	95	42,7
	1 21	5,376
	132	33,8

Пример 25.

(1) Пектин яблока (1,5 г; произв. \Уако Риге Сйет1са1з) суспендируют в 100 мл воды и суспензию доводят до рН 12 с помощью ΝαΟΗ. Эту суспензию перемешивают при 4°С, поддерживая рН при 1 2 постепенным добавлением ΝαΟΗ. По истечении восьми часов, снижения рН не наблюдается. Спустя 24 ч, суспензию доводят до рН 5 с помощью НС1, туда добавляют 4-х кратное количество, по объему, этанола и смесь перемешивают при 4°С в течение одного часа и фильтруют через фильтровальную бумагу.

Полученный осадок промывают 65% этанолом и затем 99,5% этанолом с последующей сушкой в вакууме, получая 1,32 г пектиновой кислоты.

(2) Пектиновую кислоту (200 мг), полученную выше (1), растворяют в 200 мл воды и постепенно туда добавляют 2 мл концентрированной НС1. Смесь нагревают при 80°С в течение 66 ч и центрифугируют при 20000 х д в течение 30 мин, получая супернатант и осадок. Супернатант доводят до рН 7 с помощью ΝαΟΗ, диализуют от воды, используя мембрану для диализа с отсечением молекулярной массы 1 000 и сушат вымораживанием, получая 18,4 мг фракции, растворимой в кислоте. Осадок суспендируют в 30 мл воды, доводят до рН 6 при помощи ΝαΟΗ, диализуют против воды, используя мембрану для диализа с отсечением молекулярной массы 1 000 и лиофильно сушат, получая 114 мг фракции, нерастворимой в кислоте.

(3) Каждую из растворимой в кислоте и нерастворимой в кислоте фракций, полученных в вышеуказанном (2), растворяют в воде, получая 1 % раствор, и раствор доводят до рН 3 с помощью НС1 и нагревают при 121°С в течение 20 мин. Противораковую активность полученных теплообработанных продуктов определяют, измеряя активность в ингибировании клеточной пролиферации посредством способа, использующего аламарблю (а1атагВ1ие), как описано в примере 2. В результате, противораковая активность обнаружена в растворимой в кислоте фракции теплообработанного продукта.

Пример 26.

(А) Ό-глюкуроновую кислоту (произв. №1са1;ц Тезцие, сойе 169-28) растворяют в дистиллированной воде, получая концентрацию 1%, раствор нагревают при 120°С в течение ночи и рН доводят до приблизительно 7 с помощью ΝαΟΗ. Антибактериальную активность этой теплообработанной глюкуроновой кислоты исследуют следующим образом.

Микроорганизм, подлежащий испытанию, подвергают действию посевной культуры в Ь47 бульоне (содержащем 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,5% ЫаС1; рН 7.0) на протяжении ночи. Культурированную посевом жидкость (5 микролитров) инокулируют в среду, полученную без добавления или с добавлением 50, 100, 250, 500 или 1000 микролитров теплообработанной глюкуроновой кислоты к 5 мл Ь-бульона, и культуру инкубируют при 37°С при встряхивании, при этом наблюдается рост. В начале инкубации и спустя восемь часов, измеряют помутнение культуры, используя Еир Э|д|1а1 Турбидиметр (поставляемый Рир Коду о КК; производимый Акуата Эепк| 8е1закизко) при условии, что шкала регулирования составляет 82,3, и, рост испытываемого микроорганизма определяют посредством значения (рост мутности), получаемого вычитанием значения на начальной стадии из значения спустя восемь часов. При этом, в случае испытываемого организма (6), используют среду инфузии центральной части мозга (ЬгаШ 11еаП тГизюп теШит) вместо Ь-бульона.

Испытываемыми микроорганизмами являлись ЕзсйепсШа со11 НВ 101 (АТСС 33694; испытываемый микроорганизм (1)); 8а1топе11а [урЫтигшт ЬТ-2 (АТСС 27106; испытываемый микроорганизм (2)); Рзеиботоиаз аегидтоза (ΙΕΘ 3080; испытываемый микроорганизм (3)); 81арЬу1ососсиз аигеиз 3А (ЫСТС 8319; испытываемый микроорганизм (4)); ВасШиз зиЫШз (ΙΕΘ 3034; испытываемый микроорганизм (5)); и 81гер1ососспз тп!апз 685 (штамм, хранимый в №11юпа1 Iпз111и1е оГ Неа1Ш; испытываемый микроорганизм (6)).

Таблица 18 (Рост мутности)

Испытываемый микроорганизм	Количество теплообработанного продукта (мкл/5мл среды)
0	50	100	250	500
(1)	239	183	89	6	10
(2)	247	177	36	5	11
(3)	273	262	212	237	61
(4)	285	251	247	20	11
(5)	280	258	205	73	13
(6)	140	136	131	125	10

Теплообработанный продукт демонстрирует антибактериальную активность на каждом из испытываемых микроорганизмов при любом из добавлений 100-500 микролитров/5 мл. Кроме того, теплообработанный продукт также демонстрирует антибактериальную активность по отношению к устойчивому к метициллину 81ар11у1ососсиз аигеиз, энтеротоксин-продуктивному 8. аигеиз. ВасШиз сегеиз рвотного типа, В. сегеиз диарейного типа и энтероррагической (еп1егогг11ад1ас) Е.со11 0-157.

(В) Альгиновую кислоту для пищевой добавки (А1д1п1с АсШ ΗΕΌ; произв. Эапиррон Р11агтасеиРса1 Со., ЬШ) растворяют в дистиллированной воде, получая концентрацию 1 %, и раствор нагревают при 1 20°С на протяжении ночи и доводят до рН приблизительно 7 с помощью №1ΘΗ. Подобно вышеупомянутому спо собу, этот теплообработанный раствор альгиновой кислоты добавляют в количестве от 250 до 1 000 микролитров и исследуют его антибактериальную активность по отношению к испытываемым микроорганизмам (1)-(6). В случае испытываемого микроорганизма (6), раствор добавляют до 1500 микролитров. Результаты представлены в таблице 19.

Таблица 19 (Рост мутности)

Испытываемый микроорганизм	Количество теплобработанного продукта (мкл/5мл среды)
0	250	500	1000	1500
(1)	239	30	8	13
(2)	247	10	8	12
(3)	273	233	188	30
(4)	285	222	12	15
(5)	280	158	22	13
(6)	140	138	130	101	12

Теплообработанный продукт демонстрирует антибактериальную активность по отношению к каждому из испытываемых микроорганизмов при любом из добавлений 250-1500 микролитров/5 мл. Кроме того, теплообработанный продукт демонстрирует также антибактериальную активность по отношению к устойчивому к метициллину 81арНу1ососснз аигеиз, энтеротоксин-продуктивному 8. аигеиз. ВасШиз сегеиз рвотного типа, В. сегеиз диарейного типа и энтероррагической (еп!егоггНад1ас) Е. со11 0157.

Пример 27.

Коммерчески доступный яблочный пектин (5 г) растворяют в 500 мл 200 мМ №1С1 и доводят до рН 7,0 с помощью №1ΘΗ. Этот раствор нагревают при 121°С в течение 30 мин и вновь доводят до рН 7.0 с помощью №1ΘΗ. Раствор центрифугируют при 12000 об/мин (около 10 000 х д) в течение 30 мин и исследуют противораковое действие полученного супернатанта (здесь и далее обозначаемый как «образец»).

Мышиную твердую карциному МеШ А (4 х 1 0⁶ клеток/мышь) подкожно инъецируют в брюшную область ВАЬВ/с мыши десятинедельного возраста (самка; вес тела прибл. 20 г). После этого в то же самое место подкожно инъецируют образец (100 мг/кг/день) в течение последующих десяти дней.

С другой стороны, контрольной группе тем же способом вместо образца подкожно инъецируют физиологический соляной раствор. Спустя две недели, ткань твердой карциномы, образованную в брюшной области мыши, иссекают и измеряют ее массу. Результаты представлены в таблице 20. Таким образом, в контрольной группе, средняя масса карциномы составляла 1,26 г, в то время как в группе, которой вводили образец, масса карциномы составляла 0,88 г, в результате чего степень ингибирования злокачественной опухоли составила приблизительно 30,1% и для образца наблюдается противораковое действие.

Контрольная группа

Группа с введенным образцом

Таблица 20

Масса иссеченной карци- Степень номы (граммы) ингибиров ания(% )

1,23

1,21

1,34

1,52

1,74

1,15

1,09

0,76

1,26 ± 0,10 в среднем 0%

1,69 ,61

0,33

0,14

0,17

0,99 ,21

0,88 ± 0,25 в среднем

30,1%

Пример 28.

Клеточную линию лейкоза мышей Р-388 (1 х 10⁶ клеток/мл) инкубируют ш уйго в течение шести часов вместе с образцом (1 мг/мл), полученным в примере 27, в ΚΡΜΙ 1640 среде, содержащей 1 0% фетальной бычьей сыворотки и, после этого, 1 мл/мышь полученного раствора вводят путем инъекции внутрибрюшинно ΌΒΑ/2 мыши в возрасте пяти недель (самка; масса тела, прибл. 20 г). (Р-388: 1 х 10⁶ клеток/мышь; образец: 50 мг/кг).

С другой стороны, в контрольной группе, Р-388, инкубированную в тех же условиях, вводят путем инъекции мыши вместе с физиологическим соляным раствором вместо образца.

У двух групп (каждая, включающая восемь мышей), рассчитывают число выживших, дни среднего выживания и степень выживания. Результаты представлены на фиг. 15. Таким образом, на фиг. 1 5 представлено противораковое действие образца на лейкозные клетки, где абсцисса и ордината представляют дни выживания и число выживших (клеток) у мышей, соответственно. На фигуре прерывистая линия и сплошная линия представляют контрольную группу и группу, которой вводят образец, соответственно. Таким образом, в контрольной группе среднее выживание в днях составляло 8,0 дней, в то время как в группе с вводимым образцом среднее выживание в днях составляло 14,6 дней, при этом степень выживания составляла 182,5%, и в случае с образцом наблюдается значительное выживание.

В опытах, которые проводились в то же самое время, не наблюдалось различия в терминах степени выживания Р-388 клеток после ш У1!го инкубации в течение шести часов между группами, к которым добавляли образец и не добавляли образец, и степень выживания для обеих групп составляла 1 00%.

Пример 29.

Галактуроновую кислоту или глюкуроновую кислоту растворяют в дистиллированной воде, получая концентрацию 50 мг/мл, и раствор нагревают при 1 21 °С в течение 20 мин и доводят до рН 7,0 с помощью 1н. ЫаОН. Раствор разбавляют физиологическим соляным раствором до требуемой концентрации и подвергают следующим испытаниям.

(1) Ме111 А клетки (4 х 10⁶ клеток/мышь) подкожно инъецируют в брюшинную область ВАЬВ/с мыши в возрасте восьми недель (самка; масса тела прибл. 20 г). После этого, в то же самое место в течение последующих десяти дней подкожно инъецируют теплообработанную галактуроновую кислоту (100 мг/кг/день) или теплообработанную глюкуроновую кислоту (1 00 мг/кг/день).

Спустя две недели иссекают ткань карциномы, образовавшуюся в брюшной области мыши, и измеряют ее массу. Результаты представлены в таблице 21. Так, в контрольной группе средняя масса карциномы составила 1,48 г, в то время как в группах, которым вводили теплообработанную галактуроновую кислоту и теплообработанную глюкуроновую кислоту, средние массы составляли 0,94 г и 0,86 г, соответственно, в силу чего степени ингибирования составили 26,5% и 41,9%, соответственно. Таким образом, в обеих группах наблюдалось значительное противораковое действие (р < 0,05 по отношению к контрольной группе).

Таблица 21

	Число мышей	Карцинома масса (г) (среднее ± СО)	Степень ингибирования
Контрольная группа	8	1,48 ± 0,54	-
Группа с введенной теплообработанной галактуроновой кислотой	6	0,94 ± 0,25	26,5%
Теплообработанной глюкуроновой кислотой	7	0,86 ± 0,31	41,9%

(2) Саркому-180 (5,5 х 10⁶ клеток/мышь) подкожно инъецируют в брюшную область 1 6 самкам 1СР мышей (масса тела: прибл.26 грамм) шестинедельного возраста и делят на контрольную группу, содержащую восемь мышей, и на группу из восьми мышей, которой вводят теплообработанную глюкуроновую кислоту.

Группу, которой вводят теплообработанную глюкуроновую кислоту, кормят без ограничения теплообработанной глюкуроновой кислотой из подающей воду бутылочки, где кислота разбавлена водопроводной водой так, чтобы получить дозу теплообработанной глюкуроновой кислоты приблизительно 1 г/кг/день. В контрольной группе дают водопроводную воду тем же самым способом. Что касается корма, то обе группы имеют возможность принимать его без ограничения во время эксперимента.

Число выживших (мышей) после 35 дней с момента подкожной инъекции Саркомы-180 составляло две из восьми в контрольной группе, в то время как в группе, которой вводят теплообработанную глюкуроновую кислоту, число выживших мышей составляло восемь из восьми. Таким образом, наблюдался значительный эффект выживания при оральном введении теплообработанной глюкуроновой кислоты.

Пример 30.

Клеточную линию Р-388 лейкоза мышей (1 х 1 0⁶ клеток/мл) инкубируют в течение шести часов ш уйго в КРМ1 1640 среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки вместе с теплообработанной галактуроновой кислотой (1 мг/мл) или теплообработанной глюкуроновой кислотой (1 мг/мл), полученными в примере 29, и затем 1 мл этого раствора инъецируют внутрибрюшинно ΌΒΑ/2 мыши (самка; масса тела, прибл. 20 г) (Р-388: 1 х 10⁶ клеток/мышь; теплообработанная кислота: 50 мг/кг). Контрольной группе инъецируют Р-388 клетки (1 х 10⁶ клеток/мышь), инкубированные в тех же условиях вместе с физиологическим соляным раствором. При этом в опыте, проводимом в то же самое время, не наблюдалось различия в терминах степени выживания Р-388 клеток после ш уйго инкубации в течение шести часов между группой с вводимой теплообработанной кислотой и группой с вводимым физиологическим соляным раствором, и степени выживания в обеих группах составляли 1 00%.

Восемь мышей использовали для каждой группы и среднее выживание, в днях, и степени выживания рассчитывали исходя из числа выживших мышей.

Результаты представлены на фиг. 1 6. Таким образом, на фиг. 1 6 представлена зависимость между днями после трансплантации Р-388 клеток и числом выживших мышей в каждой из групп, где ордината представляет число выживших мышей, в то время как абсцисса представляет дни выживания мышей. На фигуре сплошная линия, пунктирная линия и штрихпунктирная линия представляют контрольную группу, группу с вводимой теплообработанной галактуроновой кислотой и группу с вводимой теплообработанной глюкуроновой кислотой, соответственно.

Рассчитанные из результатов фиг. 1 6 дни среднего выживания составляли 11,4 дней для контрольной группы, в то время как в группе с вводимой теплообработанной галактуроновой кислотой (50 мг/кг), дни среднего выживания составляли 23,5 дня или более и степень выживания составляла 206,1% или более на 24-ый день после трансплантации клеток, и в группе с вводимой теплообработанной глюкуроновой кислотой (50 мг/кг), дни среднего выживания составляли 16,8 дня и степень выживания составляла 147,3%, что указывает на то, что по сравнению с контрольной группой наблюдается значительный эффект выживания.

Пример 31.

Б-глюкуроновую кислоту (10 г) (С5269 произв. 81дта) растворяют в одном литре воды, нагревают при 121°С в течение четырех часов и нейтрализуют до рН 7,0 с помощью ЫаОН.

Теплообработанный продукт (500, 5 или 0,05 микрограмм/мл) добавляют в ВРМ1 1640 среду, содержащую 1 0% фетальной бычьей сыворотки, содержащую 1 х 10⁵/мл НЬ-60 клеток (АТСС ССЬ-240), и инкубируют при 37°С в течение трех дней в присутствии 5% углекислого газа. Затем часть инкубированных клеток наносят в виде мазка на предметное стекло, подвергают \Упд1и-С|е1П5а прокрашиванию, как указано на странице 191 Т188ие СиЙиге Тес11пй.|иек (ебйеб Ьу 1арап Тйкие СиЙиге 8оае!у, рнЫйНеб Ьу Акакига 8йо!еп, 1982) и степень дифференциации наблюдают в оптическом микроскопе. Результат зависит от концентрации теплообработанной глюкуроновой кислоты, которую добавляют туда, раковые клетки дифференцируются в моноциты или в макрофагоподобные клетки и соотношение зрелых клеток костного мозга в инкубированных клетках увеличивается. Результаты показаны на фиг. 1 7. Таким образом, фиг. 1 7 показывает взаимосвязь между временем инкубации и соотношением зрелых клеток костного мозга в инкубированных клетках, где абсцисса и ордината представляют время инкубации (дни) и соотношение (%) зрелых клеток костного мозга в инкубированных клетках, соответственно. На фиг. 1 7 незакрашенный квадрат обозначает группу, где образец не добавляют (контроль); незакрашенный ромб обозначает группу, где добавляют 500 микрограмм/мл теплообработанной глюкуроновой кислоты; незакрашенный круг обозначает группу, где добавляют 5 микрограмм/мл теплообработанной глюкуроновой кислоты; и незакрашенный треугольник обозначают группу, где добавляют 0,05 микрограмм/мл теплообработанной глюкуроновой кислоты.

Пример 32.

Противоязвенное действие теплообработанной глюкуроновой кислоты.

Б-глюкуроновую кислоту (С5269 произв. 81дта) растворяют в дистиллированной воде, получая концентрацию 1 0 мг/мл, нагревают при 121°С в течение четырех часов, доводят до рН 7,0 1н. ЫаОН и концентрируют до 200 мг/мл с помощью лиофильной сушки, получая концентрат теплообработанной глюкуроновой кислоты. Его подвергают следующим экспериментам.

Крыс линии \Уй1аг (масса тела: 220-275 грамм) держат голодными в течение 24 ч и за три часа до начала эксперимента им не дают воды.

Один мл 99,5% этанола вводят орально крысе и через час после этого желудок иссекают при анастезии эфиром. Привратник (Ру1оги§) и кардиальную часть желудка (сагФа) иссеченного желудка лигируют, вливают 1 % раствор формалина и желудок погружают в указанный раствор на десять минут. Затем желудок рассекают вдоль большой кривизны и измеряют длину (мм) опухоли, образовавшейся в области желудочной железы.

В группе, которой вводили теплообработанную глюкуроновую кислоту, вышеупомянутый концентрат теплообработанной глюкуроновой кислоты давали при норме 1 г/кг за 30 мин до введения этанола. Дистиллированную воду контрольной группе давали аналогичным образом.

Длина язвы спустя один час после введения этанола составляла 78,2 ± 28,5 тт (среднее ± стандартное отклонение) в контрольной группе (Ν = 6) , в то время как в группе (Ν = 3) , которой вводили теплообработанную глюкуроновую кислоту, никакой язвы не обнаруживали совсем, что указывает на заметное противоязвенное действие.

Пример 33. Инъекция.

Образец, полученный выпариванием обработанной этанолом фракции супернатанта, как указано в примере 8, растворяют в дистиллированной воде для инъекции, получая 1 % раствор. Этот раствор помещают в пробирки для лиофильной сушки в количестве 1 0 мг/пробирка в расчете на вышеупомянутый образец из супернатантной фракции и затем лиофильно сушат. Физиологический соляной раствор (2 мл) добавляют туда отдельно, как растворитель для растворения.

Пример 34. Инъекция.

Галактуроновую кислоту растворяют в дистиллированной воде для инъекции, получая концентрацию 10 мг/мл, нагревают 121°С в течение 20 мин, охлаждают и нейтрализуют, получая нейтральный раствор теплообработанной кислоты. Этот раствор помещают в пробирки для лиофильной сушки в количестве 50 мг в расчете на высушенную теплообработанную кислоту и затем лиофильно сушат.

Физиологический соляной раствор (2 мл) добавляют туда отдельно, как растворитель для растворения.

Пример 35. Таблетки.

Таблетки получают в соответствии с нижеследующим составом: Теплообработанная пектиновая кислота 1 0 мг

Кукурузный крахмал 65 мг

Карбоксиметилцеллюлоза 20 мг

Поливинилпирролидон 3 мг

Стеарат магния 2 мг

Всего 1 00 мг на таблетку

Пектин нагревают способом, как указано в примере 7, нейтрализуют, лиофильно сушат и полученный лиофильно высушенный продукт используют в качестве теплообработанного пектина.

Пример 36.

Зеленый чай приготавливают согласно стандартному способу, используя 1 0 г листьев зеленого чая, 0,2 г витамина С и 1 000 мл деионизованной воды. Теплообработанный раствор пектина I, описанный в примере 16, добавляют в количестве 50 мг (в расчете на твердое вещество) к 1 00 мл продукта и при этом получают продукт (1 ) данного изобретения. К контролю ничего не добавляют. Органолептическую оценку (по пятибалльной шкале, где 5 означает хорошо и 1 означает плохо) проводят с помощью 20 волонтеров и средние из этих результатов представлены в таблице 22.

Таблица 22. Органолептическая оценка

	Продукт (1)	Контроль
Широта вкуса	4,1	3,2
Баланс вкуса	3,8	3,4
Общий вкус	4,1	3,3

Из таблицы 22 эта оценка такова, что по сравнению с контролем продукт (1) данного изобретения имеет более широкий и более глубокий вкус и хорошо сбалансированный вкус, при этом аромат и вкус чая улучшается и достигается эффект скрытого букета.

Пример 37.

Алкогольный напиток получают стандартным способом в соответствии со смешением, как показано в таблице 23.

Таблица 23. Таблица смешения

Замороженный концентрированный сок СИгиз Ш141Ш (45 Впх градусов)	110 г
Сахарный песок	80 г
Лимонная кислота	2 г
Цитрат натрия	0,5 г
Апельсиновая эссенция	2 г
5% (об/об) водный раствор спирта	баланс
Всего	1000 мл

Замечание: Полученный таким образом напиток охлаждают при 5°С и затем газируют углекислым газом с помощью сифона для содовой воды.

Теплообработанный раствор пектина I, описанный в примере 1 6, добавляют в количестве 45 мг (в расчете на твердое вещество) к 1 00 мл продукта и при этом получают продукт (2) данного изобретения. К контролю ничего не добавляют. Органолептическую оценку проводят тем же способом, как в примере 36. Результаты даны в таблице 24.

Таблица 24. Органолептическая оценка

	Продукт (1)	Контроль
Широта вкуса	3,9	3,3
Баланс вкуса	4,0	2,7
Общий вкус	4,9	3,0

Из таблицы 24 видно, что по сравнению с контролем продукт (2) данного изобретения имеет более широкий и более глубокий вкус. В частности, в этом продукте (2) кислый вкус становится более умеренным и в результате усили55 вается аромат и вкус большого мандарина (Сйги§ иикШи).

Пример 38.

Продукт (3) данного изобретения получают из стандартно получаемого сакэ (японская рисовая водка) путем добавления теплообработайного раствора пектина II примера 9 в количестве 35 мг (в виде твердого вещества) на 100 мл конечного продукта. Продукт, к которому не добавлен теплообработанный раствор пектина, используют в качестве контроля.

Органолептическую оценку проводят таким же способом, как в примере 36. Аромат и оценку вкусового ощущения на языке добавляют к пунктам оценки, и эти результаты даны в таблице 25.

Таблица 25. Органолептическая оценка

	Продукт (1)	Контроль
Широта вкуса	3,8	3,0
Баланс вкуса	3,4	2,9
Аромат	2,9	2,9
Ощущение на языке
Мягкость	3,8	2,6
Однородность	4,0	2,9
Общий вкус	3,6	2,8

Из таблицы 25, можно видеть что, по сравнению с контролем продукт (3) данного изобретения имеет более широкий и более глубокий вкус и улучшенное чувство вкуса на языке и, соответственно, вкус и ощущение после питья, как застольного удовольствия, улучшаются.

Пример 39.

Продукт (4) (мирин - сладкое сакэ) и продукт (5) (ферментированная приправа) данного изобретения получают из стандартно получаемого мирина и ферментированной приправы путем добавления теплообработанного раствора пектина I примера 16 в количестве 40 мг (в виде твердого вещества) на 1 00 мл каждого из конечных продуктов. Продукты, к которым не добавляют теплообработанный раствор пектина, используют в качестве контролей.

Органолептическую оценку проводят таким же способом, как в примере 36. Результаты даны в таблице 26.

Таблица 26. Органолептическая оценка

	Мирин	Ферментированная приправа
Продукт (4)	Контроль	Продукт (5)	Контроль
Ширина вкуса	3,8	3,0	2,9	2,4
Баланс вкуса	3,5	3,0	2,7	2,1
Общий вкус	3,6	3,1	2,8	2,2

Из таблицы 26 видно, что по сравнению с каждым из контролей продукты (4) и (5) данного изобретения показывают улучшения в балансе и широте вкуса и, следовательно, могут быть получены приправы, имеющие глубокий вкус.

Пример 40.

Рыбный порошок (4,7 кг), 0,8 кг морских водорослей, 2,5 кг кунжута, 1,0 кг соли и 0,5 кг глутамата натрия смешивают и смесь гранулируют стандартным способом, получая фурикакэ (приправленное рыбное блюдо).

Продукт (6) данного изобретения получают путем добавления 1000 мг (в виде твердого вещества) теплообработанного раствора пектина II примера 9 на 100 г продукта. Раствор пектина, неподвергнутый тепловой обработке, добавляют и используют в качестве контроля. Продукты разбрызгивают на вареный рис и проводят органолептическую оценку в терминах вкусовых ощущений таким же способом, как в примере 36.

В результате оказалось, что по сравнению с контролем продукт (6) данного изобретения хорошо сочетается с вареным рисом во рту, имеет хорошо сбалансированный вкус и мягко воспринимается организмом и, в целом, демонстрирует улучшенное качество как фурикакэ.

Пример 41 .

Приправу получают, используя подвергнутые тепловой обработке овощи и фрукты. Состав представлен в таблице 27.

Таблица 27

Морковь (корневище)	200 г
Ананас (фрукт)	500 г
Банан (фрукт)	500 г
Сахарный песок	76 г
Безводная лимонная кислота	2 г
Вода	баланс
Всего	2000 г

Морковь, ананас и банан, каждый, в составе, показанном в таблице 27, тщательно перемешивают и размельчают, используя коммерчески доступный миксер, получая пюре из каждого из них. Затем каждое их этих пюре нагревают при 1 21 °С в течение четырех часов в герметично закрытом состоянии и, после этого, их смешивают в соответствии с вышеуказанной таблицей, получая приправу данного изобретения.

С другой стороны, каждый их этих овощей/фруктов не нагревают, но их размельченный продукт смешивают согласно вышеуказанной таблице, получая контрольную приправу. Органолептическую оценку продукта данного изобретения и контроля проводят таким же способом как в примере 36. Результаты показаны в таблице 28.

Таблица 28. Органолептическая оценка

	Продукт изобретения	Контроль
Аромат	3,5	3,0
Вкус	4,0	2,6
Текстура	4,3	3,2
Общая оценка	4,0	2,8
Пояснения	Мягкий; хорошо сбалансированный вкус; ощущение общего аромата; ощущение мягкости на языке	Нет ощущения мягкости; раздельные вкусы; аромат не сбалансирован; и чуть-чуть грубоватый на язык

Из таблицы 28 видно, что по сравнению с контролем продукт данного изобретения имеет мягкое ощущение на вкус, показывает хорошо смешанный вкус, имеет объединенное чувство аромата и демонстрирует мягкое ощущение на язык, тем самым получают ценный напиток.

Преимущества изобретения

Фармацевтическое средство данного изобретения может быть использовано в качестве терапевтического средства при инфекционных заболеваниях, пониженной или повышенной иммунной функции, раковых заболеваниях, вирусных заболеваниях, язвы, периодонтальных заболеваниях и т. д. Кроме того, способ индуцирования апоптоза данного изобретения полезен для изучения взаимосвязи между апоптозом и механизмом защитной функции живого организма, иммунной функцией и раковыми и язвенными заболеваниями, а также для разработки ингибиторов для индуцирования апоптоза. В частности, сахаридные соединения данного изобретения в съедобных продуктах имеют давнюю историю как продукт питания, а теплообработанный продукт данного изобретения, полученный из них, является высокобезопасным при оральном применении. Кроме того, само собой разумеется, что продукт питания или напиток, содержащий теплообработанный продукт данного изобретения, и продукт питания, напиток, или антисептическое средство для продукта питания или напитка, полученные путем добавления и/или разбавления теплообработанного продукта данного изобретения являются высокобезопасными и, благодаря своим апоптозиндуцирующему действию, противораковому действию, антиангиогенному действию, противовирусному действию, противоязвенному действию, и т. д., они являются полезными для профилактики и лечения рака желудочнокишечного тракта, вирусного заболевания, такого как простуда, вызванная вирусом гриппа, язвы, и т. д., и также для улучшения печеночной функции.

Как упомянуто выше, теплообработанный продукт данного изобретения можно легко получить при низкой стоимости и, в том случае когда его используют в качестве добавки к продукту питания или напитку, он может придать им различные физиологические функции, антибактериальное действие, апоптоз-индуцирующее действие, противораковое действие, противовирусное действие и т.д., благодаря своим различным физиологическим функциям, в силу чего теплообработанный продукт данного изобретения является крайне полезным в качестве добавки в продукты питания или напиток, в частности, в качестве антисептического средства для продуктов питания и напитков.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Индуцирующий апоптоз продукт, полученный тепловой обработкой при температуре, начиная от комнатной до 350°С, в течение от нескольких секунд до нескольких дней в усло виях от кислых до нейтральных, по меньшей мере, одного вещества, выбранного из нижеследующих:

(a) уроновая кислота или производное уроновой кислоты;

(b) сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты; и (c) вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты.
2. Продукт по п. 1 , отличающийся тем, что уроновой кислотой является галактуроновая кислота, глюкуроновая кислота, гулуроновая кислота, маннуроновая кислота и/или идуроновая кислота.
3. Продукт по п. 1 , отличающийся тем, что производным является лактон уроновой кислоты, сложный эфир уроновой кислоты, амид уроновой кислоты или их соль.
4. Продукт по п. 1 , отличающийся тем, что сахаридным соединением является сахаридное соединение, которое выбирают из пектина, пектиновой кислоты, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, гепарина, фукоидана, хондроитин сульфата, хондроитина, дерматан сульфата и/или продуктов их разложения.
5. Продукт по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что теплообработанный продукт получают нагреванием при 60-350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней.
6. Продукт по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что теплообработанный продукт дополнительно фракционируют по молекулярной массе.
7. Пищевой продукт, отличающийся тем, что он содержит теплообработанный продукт по любому из пп. 1 -6.
8. Пищевой продукт, обладающий противораковым действием, отличающийся тем, что он содержит теплообработанный продукт по любому из пп. 1 -6.
9. Антибактериальное средство, отличающееся тем, что оно содержит любой из теплообработанных продуктов по любому из пп.1-6.
1 0. Антисептическое средство, отличающееся тем, что оно содержит антибактериальное средство по п.9.
11. Средство для чистки зубов, отличающееся тем, что оно содержит антибактериальное средство по п.9.
1 2. Индуктор апоптоза, отличающийся тем, что он содержит теплообработанный продукт по пп.1 -6.
1 3. Противораковое средство, отличающееся тем, что оно содержит теплообработанный продукт по пп. 1 -6.
1 4. Индуктор для дифференциации канцерогенных клеток, отличающийся тем, что он содержит теплообработанный продукт по пп. 1 -6.
1 5. Противоязвенное средство, отличающееся тем, что оно содержит теплообработанный продукт по пп. 1 -6.
1 6. Способ индуцирования апоптоза, отличающийся тем, что клетку-мишень обрабатывают теплообработанным продуктом по пп. 1 -6 в качестве эффективного компонента.
1 7. Способ получения индуцирующего апоптоз продукта, предусматривающий теплообработку при температуре, начиная от комнатной до 350°С, в течение от нескольких секунд до нескольких дней в условиях от кислых до нейтральных, по меньшей мере, одного вещества, выбранного из нижеследующих:

(a) уроновая кислота или производное уроновой кислоты;

(b) сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты; и (С) вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее уроновую кислоту, или вещество, содержащее сахаридное соединение, содержащее производное уроновой кислоты.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что уроновой кислотой является галактуроновая кислота, глюкуроновая кислота, гулуроновая кислота, маннуроновая кислота и/или идуроновая кислота.
19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что производным является лактон уроновой кислоты, сложный эфир уроновой кислоты, амид уроновой кислоты или их соль.
20. Способ по п. 1 7, отличающийся тем, что сахаридным соединением является сахаридное соединение, которое выбирают из пектина, пектиновой кислоты, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, гепарина, фукоидана, хондроитин сульфата, хондроитина, дерматан сульфата и/или продуктов их разложения.
21. Способ по любому из пп. 17-20, отличающийся тем, что тепловая обработка представляет обработку, которую проводят при 60350°С в течение от нескольких секунд до нескольких дней.
22. Способ по любому из пп. 1 7-21 , отличающийся тем, что тепловая обработка представляет обработку, которую проводят в условиях от кислых до нейтральных.
23. Способ по любому из пп. 17-22, который включает стадию проведения фракционирования по молекулярной массе теплообработанного продукта.