KR19990087665A - 우론산의 가열-처리 산물, 이를 함유하는 식품, 음료 또는 약제 - Google Patents

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스즈 데구치
가츠시게 이카이
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아키히로 곤도
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Abstract

하기의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열함으로써 수득된 산물 및 이 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는 식품, 음료 또는 약학 조성물.
(a) 우론산 또는 우론산 유도체;
(b) 우론산 함유 당 화합물 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물; 및
(c) 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질.

Description

우론산의 가열-처리 산물, 이를 함유하는 식품, 음료 또는 약제
근년에, 자기-파괴성 세포 사멸 또는 자살성 세포 사멸인 "아폽토시스"라고 불리는 현상이 세포 조직의 사멸과 관련하여 관심을 끌고 있다.
병리학적 세포 사멸인 괴사와 달리, 아폽토시스는 본래 세포 자체의 유전자에 프로그래밍된 사멸인 것으로 사려된다. 따라서, 외부 또는 내부 인자가 아폽토시스를 프로그래밍하는 유전자의 활성화를 일으키고 이렇게 하여 프로그래밍된 사멸 유전자 단백질이 유전자를 기초로하여 생합성되고 세포 자체가 생성된 프로그래밍된 사멸 유전자 단백질에 의해서 분해되고 이렇게 하여 사멸이 일어난다고 여겨진다.
이러한 아폽토시스가 목적하는 조직 또는 세포에서 발현될 수 있는 경우, 암세포와 같이 불필요하거나 병리적인 세포를 자연적인 방법으로 생체로부터 제거할 수 있으므로 매우 중요할 것이다.
본 발명의 목적은 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 매우 안전하고 생리학적으로 활성인 물질을 함유하는 산물을 개발하고 이렇게 하여 이러한 산물 및 또한 이러한 산물을 함유하는 식품 또는 음료의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 화합물을 함유하는 항균제 및 아폽토시스 유도제와 같은 약제를 제공하는 것이고 이 산물을 유효 성분으로서 사용하는 아폽토시스 유도 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 개요는 하기와 같을 것이다. 따라서, 본 발명의 제 1 발명은 하기의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열함으로써 수득된 산물이다.
(a) 우론산 또는 우론산 유도체;
(b) 우론산 함유 당 화합물 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물; 및
(c) 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질.
본 발명의 제 2 발명은 방법이 하기의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 가열-처리 산물의 제조 방법이다.
(a) 우론산 또는 우론산 유도체;
(b) 우론산 함유 당 화합물 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물; 및
(c) 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질.
본 발명은 우론산, 우론산 유도체, 우론산 함유 당 화합물, 우론산 유도체 함유 당 화합물, 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 및 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질 중에서 선택된 적어도 하나의 물질의 가열-처리 산물(이후 본원에서, 이 산물은 "본 발명의 가열-처리 산물"로서 언급될 것이다)이 강력한 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용, 항균 작용 및 항궤양 작용을 갖고 이에 의해 본 발명이 달성됨이 밝혀졌다.
본 발명의 목적은 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 매우 안전하고 생리학적으로 활성인 물질을 함유하는 산물을 개발하는 것이고 이 산물을 함유하는 높은 생리학적 효과를 나타내는 기능성 식품 또는 음료를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 이 산물을 유효 성분으로서 함유하는 항균제, 치약, 방부제, 아폽토시스 유도제, 항암제 및 항궤양제를 제공한다. 본 발명은 또한 방법이 아폽토시스의 메카니즘을 해명하고 아폽토시스 억제제를 스크리닝함에 유용한 아폽토시스 유도 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 생리학적 활성 물질을 함유하는 산물의 제조 방법을 제공한다.
도 1은 펙틴의 가열-처리 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 2는 샘플의 투석 전후 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 3은 한외여과에 의해 수득된 여과물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 4는 겔 여과에 의해 수득된 분획의 여과물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 5는 우론산의 가열-처리 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 6은 우론산이 가열될 때의 pH와 가열-처리 산물의 암세포에 대한 작용 간의 관계를 도시한다.
도 7은 펙틴을 산성 조건하에서 가열함으로써 수득된 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 8은 펙틴을 산성 조건하에서 가열함으로써 수득된 산물의 용매 추출에 의해서 수득된 분획의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 9는 펙틴을 먼저 알칼리 조건하에서, 이어서 산성 조건하에서 가열함으로써 수득된 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 10은 갈락튜론산을 산성 조건하에서 가열함으로써 수득된 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 11은 글루큐론산을 산성 조건하에서 가열함으로써 수득된 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 12는 펙틴의 가열-처리 용액 I의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 13은 글루큐론산의 가열-처리 산물의 희석율과 세포의 생존율 간의 관계를 도시한다.
도 14는 알긴산의 가열-처리 산물의 암세포에 대한 작용을 도시한다.
도 15는 펙틴의 가열-처리 산물의 백혈병 세포주에 대한 항암 작용을 도시한다.
도 16은 우론산의 가열-처리 산물의 백혈병 세포주에 대한 항암 작용을 도시한다.
도 17은 우론산의 가열-처리 산물의 분화-유도 작용을 도시한다.
본 발명은 이후 본원의 특정 방법으로 설명될 것이다.
본 발명에서, 우론산, 우론산 유도체, 우론산 함유 당 화합물, 우론산 유도체 함유 당 화합물, 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 및 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질에 있어 특별한 제한은 없으며, 단, 이들을 가열함으로써 수득된 산물은 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 나타내고 항암 물질 및/또는 아폽토시스-유도 물질은 가열-처리 산물에서 생성된다.
우론산은 종종 글리큐론산으로 불리어지는데 알도즈상의 알데히드 그룹이 그대로 유지되고 반면에 다른 말단의 제 1 알콜 그룹이 카복실 그룹으로 산화된 하이드록시알데히드 카복실산에 대한 일반명이다. 이것은 동물 및 식물의 다양한 당류에 대한 구성 성분으로서 자연에서 존재한다. 우론산을 함유하는 다당류의 예는 펙틴, 펙틴산, 알긴산, 히알루론산, 헤파린, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트 등이고 이들은 다양한 생리 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 우론산에 있어 특별한 제한은 없다. 따라서, 우론산의 예는 갈락튜론산, 글루큐론산, 글루론산, 매뉴론산 및 이듀론산이고 반면에 우론산 유도체의 예는 상술된 것들의 락톤, 에스테르, 아미드, 염 등이고 항암 물질 및/또는 아폽토시스-유도 물질을 열 처리에 의해서 생성하는 물질이 본 발명의 유도체에 포함된다. 우론산 락톤의 예는 글루큐로노-6,3-락톤(이후, 본원에서 글루큐로노락톤으로 단축됨), 매뉴로노-6,3-락톤 및 이듀로노-6,3-락톤이다. 우론산 에스테르의 예는 우론산으로부터 제조될 수 있는 메틸, 에틸, 프로필렌 글리콜 및 카복시메틸 우로네이트이다. 우론산 아미드는 우론산의 아미드화에 의해 제조될 수 있다. 이들의 염은 통상의 방법에 의해서 제조될 수 있다.
본 발명의 우론산 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물은 우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당 화합물을 의미하고 이에 대한 특별한 제한은 없다. 따라서, 이것은 예를 들면, 펙틴, 펙틴산, 알긴산, 히알루론산, 헤파린, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴 및 더마탄 설페이트를 포함하고, 화학적으로, 효소적으로 또는 물리적으로 처리된 산물인 분해 산물, 분해 산물의 유도체 및 분해 산물의 염을 포함한다.
상술된 화학 처리에서, 출발 당 화합물을 예를 들면, 실온 내지 200℃에서 수 초 내지 수 시간 동안, 또는 바람직하게는 50 내지 130 ℃에서 수 초 내지 수 시간 동안 처리(펙틴의 경우에, 예를 들면, pH 6.8, 95℃에서 수 분 내지 수십분 동안 처리)하고 이때 베타-제거가 발생하여 약 235nm의 흡광도가 증가되는 불포화 우론산 및/또는 불포화 우론산 에스테르를 갖는 당 화합물을 생성한다. 본 발명의 당 화합물은 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 다당 화합물의 베타-제거에 의해서 제조된 비-환원 말단에 불포화 우론산 및/또는 불포화 우론산 에스테르를 함유하는 당 화합물을 망라한다.
상술된 효소 처리의 예는 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 출발 당 화합물이 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 당류에 대한 하이드롤라제로 분해되는 공지된 분해 방법이다. 다른 예는 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 당류가 우론산 및/또는 우론산 에스테르를 함유하는 당류에 대한 리아제로 분해되는 공지된 분해 방법이다. 예를 들면, 펙틴 또는 펙틴산의 경우에, 분해는 공지된 펙틴 리아제 (EC 4.2.2.10), 펙트산 리아제 (EC 4.2.2.2) 또는 엑소폴리갈락튜론산 리아제 (EC 4.2.2.9)에 의해서 수행되어 비-환원 말단에 4-디옥시-L-트레오-헥스-4-에노피라노실 우로네이트 또는 이의 메틸 에스테르를 갖는 당 화합물을 생성한다. 히알루론산의 경우에, 히알루로네이트 리아제 (EC 4.2.2.1)를 사용하지만, 알긴산의 경우에, 알기네이트 리아제 (EC 4.2.2.3)를 사용한다. 이와 같이 제조된 비-환원 말단에 4-디옥시-L-트레오-헥스-4-에노피라노실 우로네이트 또는 이의 메틸 에스테르를 갖는 효소적으로 분해된 산물이 또한 본 발명의 당 화합물에 포함된다.
상술된 물리적 처리의 예는 출발 당 화합물의 근적외선, 적외선, 극초단파, 초음파 등으로의 처리이다. 따라서, 예를 들면, 펙틴 및/또는 펙트산을 중성(pH의 의미에서) 또는 알칼리 용액에 배치하고, 실온 이상의 적합한 온도에서, 적합한 환원 작업하에서, 예를 들면, 아스코르브산의 존재하에, 1초 이하 동안 또는 바람직하게는, 5초 내지 1시간 동안 진동 에너지를 적용하기 위해 초음파에 투입한다. 초음파 외에도, 또한 극초단파, 근접 적외선, 적외선 등 또는 이들의 조합을 조사함이 효과적이다. 조사는 연속적으로 또는 간헐적으로 수행한다.
또한, 본 발명에서, 상술된 우론산 및/또는 이의 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질, 예를 들면, 과일, 과일의 과피, 과일의 걸러낸 재강, 채소, 채소의 걸러낸 재강, 해조류 등은 그 자체로 또는 건조하고 분쇄한 후 사용될 수 있다. 또한, 상술된 우론산 및/또는 이의 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 상술된 물질을 추출함으로써 수득된 우론산 및/또는 유도체 함유 당 화합물의 액체 또는 추출된 액체로부터 수득된 정제 물질이 또한 사용될 수 있다. 우론산 및/또는 이의 유도체 함유 당 화합물의 추출액의 제조 및 정제는 공지된 방법에 의해서 수행할 수 있고 이에 대해 특별한 제한은 없다.
우론산 또는 우론산 에스테르 함유 당 화합물을 함유하는 물질의 예는 하기와 같다. 사과, 구연산 과일(예를 들면, 만다린 오렌지 및 레몬), 바나나, 나파 양배추, 양배추, 상추, 퍼릴라, 호박, 셀러리, 우엉, 에찰롯, 브로콜리, 그린 페퍼, 시금치, 당근, 당근 잎, 다이콘(일본 래디시), 차 잎, 참깨, 콩, 감자 등과 같은 쌍자엽식물의 과일, 채소, 잎, 종자 등; 밀과 쌀과 같은 단자엽 식물의 곡류; 황조류(예를 들면, 해양 다시마, 워케임 해초), 홍조류, 녹조류 및 단세포 녹조류와 같은 조류; 바시디오마이세츠(Basidiomycetes) (예를 들면, 리오필럼 울마리움(Lyophyllum ulmarium), 리오필럼 데카스테스(Lyophyllum decastes), 폴리오타 나메코(Pholiota nameko), 코르티넬러스 쉬타케(Cortinellus shiitake), 플라뮬리나 베루티페스(Flammulina verutipes), 아가리쿠스 오스트레아투스(Agaricus ostreatus) 및 파살리오타 캄페스트리스(Pasalliota campestris)), 아스코마이세츠(Ascomycetes) (예를 들면, 코르디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 및 기타 코르디셉스 종), 효모, 사상균(예를 들면, 아스퍼길러스(Aspergillus) 종) 및 세균(예를 들면, 바실러스 나토(Bacillus natto) 및 유산균)과 같은 미생물; 및 척추동물과 무척추동물과 같은 동물. 본 발명에서, 상술된 식물, 미생물 또는 동물로부터 유도된 우론산 및/또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질을 사용할 수 있다.
우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당 화합물인 다당류는 공지된 화학적, 효소적 또는 물리적 방법에 의해서 제조할 수 있다. 예를 들면, 펙틴의 경우에, 예를 들면, 구연산 과일 또는 사과의 과피로부터 추출된 고분자 다당류를 사용할 수 있다. 산업적 규모의 펙틴의 제조를 위한 물질은 과일이고, 레몬 및 라임과 같은 구연산 과일의 쥬스 제조후 걸러낸 재강(대부분 내과피를 포함) 외에도, 애플 쥬스 제조후 걸러낸 재강이 또한 사용된다. 이러한 걸러낸 재강은 대부분 불용성 프로토펙틴을 함유하고 이것은 펙틴을 제조하기 위해서 제조 과정에 용해(추출)된다. 용해는 산성의 따뜻하거나 뜨거운 물로 추출함으로써 수행되고, 온도, pH 및 시간과 같은 조건이 출발 물질의 유형에 따라 적당히 조절될 경우, 예정된 분자량 및 에스테르화도를 지닌 펙틴을 높은 수율로 제조함이 가능하다. 추출물은 원심분리 또는 여과에 의해서 정제되고 농축되며 펙틴이 침전되고 회수될 수 있도록 여기에 알콜이 첨가된다. 회수된 침전물이 건조되고 분쇄되어 건조 펙틴이 제조된다.
펙틴의 주된 구조는 부분적으로 메틸화된 갈락튜론산 중합체이다. 카복실 그룹이 메틸화되고 유리산으로 남거나 암모늄염, 칼륨염 또는 나트륨염과 같은 염으로 제조된다. 메틸화도(DM; 메톡실 그룹 대 총 카복실 그룹의 비)에 따라, 펙틴을 높은 DM을 지닌 HM 펙틴과 낮은 DM을 갖는 LM 펙틴으로 분류하고 [참조문헌: "Handbook of Materials for Developing New Food Products" edited by Satoshi Yoshizumi, et al., published by K. K. Korin, pages 114-119 (1991)], 본 발명에서 식품 첨가제로서 시판되는 펙틴[참조문헌: "Handbook of Natural Products" edited by Akio Toyoma, et al., published by Shokuhin To Kagakusha, 12th Edition, page 138 (1993)], 시판 HM 펙틴 및 LM 펙틴 등[참조문헌: "Handbook of Materials for Developing New Food Products"]을 사용할 수 있다.
우론산 및/또는 우론산 유도체를 함유하는 당 화합물의 분해 산물을 공지된 화학적, 효소적 또는 물리적 처리 방법에 의해서 제조할 수 있다. 합성 방법에 의해서 제조된 우론산, 우론산 유도체, 올리고당류 등이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 사용되는 가열-처리 산물을 (a) 우론산 또는 우론산 유도체; (b) 우론산 함유 당 화합물 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물 및 (c) 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질 중에서 선택된 물질 중에서 제조할 수 있다.
본 발명의 가열-처리 산물의 제조시 가열 처리 방법에 있어서, 우론산, 우론산 유도체, 우론산 함유 당 화합물, 우론산 유도체 함유 당 화합물, 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 및/또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질을 예를 들면, 60 내지 350 ℃의 온도에서 수 초 내지 수 일 동안, 또는 바람직하게는 80 내지 150 ℃의 온도에서 수 분 내지 수 일 동안 가열한다. 펙틴의 경우에, 항암 작용 또는 아폽토시스-유도 작용과 같은 생리학적 활성을 지닌 가열-처리 산물을 펙틴을 예를 들면, 80 내지 150 ℃에서 수 분 내지 수 일 동안 가열함으로써 제조할 수 있고, 우론산, 우론산 락톤 및 우론산 에스테르의 경우에, 바람직한 가열-처리 산물을 60 내지 150 ℃에서 수 분 내지 수 일 동안 가열함으로써 제조할 수 있다.
가열 처리 동안 pH에 대한 특별한 제한은 없지만, 사용된 물질에 따라 중성 내지 산성 조건하에서 가열을 수행함이 바람직하므로 가열 도중 pH를 조정할 수 있다. 그러나, 보통 항암 물질, 아폽토시스-유도 물질 등과 같은 생리학적으로 활성인 물질의 생성은 산성 조건하에서 가열함으로써 촉진된다.
가열도중 물질의 농도에 대한 특별한 제한은 없고, 단, 농도는 항암 물질, 아폽토시스-유도 물질 등과 같은 생리학적으로 활성인 물질이 가열 처리에 의해서 생성될 수 있도록 하는 범위내이다. 따라서, 농도는 작업능, 수율 등을 고려함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 가열 처리는 습윤 가열 또는 건조 가열일 수 있다. 습윤 가열의 경우에, 증기 가열, 고압하 증기 가열, 고압하 가열 등과 같은 습윤 가열 방법을 사용할 수 있지만, 건조 가열의 경우에, 건조 및 고온 대기를 사용하는 직접 가열과 구획을 통한 열원으로부터의 간접 가열과 같은 건조 가열 방법을 사용할 수 있다. 직접 가열의 예는 기류에 의한 건조 가열과 분무에 의한 건조 가열이고, 간접 가열의 예는 드럼 등에 의한 건조 가열이다. 또한, 본 발명의 가열 처리를 위한 물질은 보일링, 토스팅, 로스팅, 디콕팅, 스티밍, 프리즐링, 프라잉 등과 같은 가열 방법에 의해서 처리할 수 있다.
본 발명의 가열-처리 산물은 상술된 가열 방법에 의해서 수득된 가열-처리 산물 및 가열-처리 산물내 생물학적 활성 물질을 함유하는 분획이다.
본 발명의 가열-처리 산물은 아폽토시스-유도 작용, 항암 작용, 항균 작용, 항바이러스 작용 등을 나타내는 둘 이상의 물질을 함유한다. 또한, 항산화 작용을 갖는 리덕톤이 또한 본 발명의 가열 처리 도중 생성된다. 그러므로, 가열 처리를 위한 조건을 목적에 따라서 변화시킬 경우, 목적하는 물질을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 제조함이 가능하다. 본 발명의 가열-처리 산물은 생리학적 활성을 지표로서 사용하여 분별할 수 있다. 예를 들면, 가열-처리 산물의 분자량 분별은 높은 활성을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물이 제조될 수 있도록 겔 여과 또는 분자량 분별 막을 사용하여 각 분자량 분획을 제조하는 분별과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 또한, 목적하는 분획을 용매 추출, 분별 증류 및 이온 교환 수지를 사용하는 다양한 크로마토그래피 방법 등에 의해서 제조할 수 있다.
겔 여과의 예는 Cellulofine GCL-300을 사용할 경우, 분자량이 MW>25,000; 25,000≥MW>10,000; 10,000≥MW>5,000; 및 5,000≥MW인 것과 같은 분자량 분획을 제조함이 가능하고, Cellulofine GCL-25를 사용할 경우, 예를 들면, 5,000≥MW의 분획을 5,000≥MW>3,000; 3,000≥MW>2,000; 2,000≥MW>1,000; 1,000≥MW>500 및 500≥MW것과 같은 분자량 분획으로 분별함이 가능하다.
한외여과막을 사용할 경우, 분자량 분별을 산업적 규모로 수행할 수 있다. 예를 들면, FE10-FUSO832(Daicel 제조)일 경우, 30,000 이하의 분자량을 갖는 분획을 제조함이 가능하고, FE-FUS-T653(동일한 회사에서 제조)일 경우, 6,000 이하의 분자량을 갖는 분획을 제조함이 가능하다. 또한, 나노섬유 막의 사용으로 500 이상의 분자량을 갖는 분획을 제공할 수 있다. 상술된 겔 여과 및 분자량 분별을 조합할 경우, 분자량 분획을 제조할 수 있다.
본 발명의 가열-처리 산물에서, 30,000 이하의 분자량을 갖는 분획은 강한 항암 및 아폽토시스-유도 활성을 지니고, 특히, 10,000 이하, 바람직하게는 500 이하의 분자량을 갖는 분획은 아폽토시스-유도 및 항균 활성을 지닌다. 그러므로, 목적에 따라서, 본 발명의 가열-처리 산물의 분자량 분별된 분획을 본 발명의 가열-처리 산물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 가열-처리 산물은 암세포 생장 억제 활성을 지닌다. 본 발명의 가열-처리 산물의 작용 메커니즘은 본 발명을 전혀 제한하지 않고, 예를 들면, 암세포에 대한 아폽토시스-유도 작용은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 가열-처리 산물은 인간 전골수구 백혈병 세포(HL-60), 인간 급성 임파아구 백혈병 세포(MOLT-3), 폐암 세포(A-549), SV40 형질전환 폐 세포(WI-38VA13), 간암 세포(Hep G2), 대장암 세포(HCT 116), 인간 대장암 세포(SW 480), 인간 대장암 세포(WiDr), 위암 세포(AGS) 및 골수종 세포와 같은 암세포에 대한 생장-억제 작용 및 아폽토시스-유도 작용을 하고 본 발명의 가열-산물의 항암 물질의 양은 항암 활성 단위의 의미로 표현될 수 있다.
본 명세서에 사용된 항암 활성은 하기와 같이 정의된다. 따라서, 본 발명의 가열-처리 용액이 샘플로서 사용되고 이의 희석 용액 0.5㎖를 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 4.5 ㎖에 첨가하고, 2.5 x 105인간 전골수구 백혈병 세포 (HL-60) (ATCC CCL-240)를 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 살아있는 세포의 수를 세고 세포 생존율이 대조군의 50%일 경우 배지 ㎖당 항암 활성을 1 단위로 정의한다. 따라서, 배지 ㎖당 항암 활성이 1 유닛으로서 계산될 경우, 샘플 1 ㎖는 10 유닛의 항암 활성을 지닌다.
%로 세포 생존율 (R)을 하기의 공식으로 계산한다.
R = Vs/(Vs + Ds) x 100 + Dc/(Vc + Dc) x 100
식에서, Vs와 Ds는 각각 샘플이 첨가된 섹션에서 산 세포와 죽은 세포의 수이고, Vs와 Dc는 각각 물이 첨가된 섹션에서 산 세포와 죽은 세포의 수이다.
본 발명의 가열-처리 산물은 천연 식품으로부터 유도된 물질이고 마우스로의 경구 및 비경구 투여시 독성은 관찰되지 않는다.
본 발명의 식품 및 음료에 대한 특별한 제한은 없고 이의 예는 가공된 농업 및 임업 산물, 가공된 낙농 산물, 가공된 해양 산물 등, 예를 들면, 제과류, 빵류, 면류, 음료(알콜성 및 비알콜성), 조미료, 양조 산물(콩 페이스트, 콩 소스 및 식초), 알콜 음료 및 곡류, 감자, 전분, 감미제, 지방/오일, 종자, 콩, 어류/어패류, 동물, 조류 및 고래의 고기, 알, 우유, 채소, 과일, 버섯, 조류 등과 같은 생물질로부터 제조된 양념류이다.
본 발명의 식품 또는 음료 제조 방법에 대한 특별한 제한은 없고, 이의 예는 식품 및 음료를 위한 쿠킹, 가공 및 통상-사용되는 제조 방법이다. 제조된 식품 또는 음료가 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 한 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
쿠킹 및 가공의 경우에, 쿠킹 또는 가공 후 산물이 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 한 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 가열-처리 산물을 쿠킹 또는 가공 전, 도중 또는 이후에 첨가할 수 있다. 또한, 이의 물질의 쿠킹 또는 가공 산물을 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물에 첨가하고, 이렇게 하여 가열-처리 산물을 희석할 수 있다.
이어서, 식품 또는 음료의 제조시, 가열 처리를 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물이 이에 함유되어 제조되도록 원하는 단계에서 수행할 수 있고; 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 이에 첨가할 수 있거나; 또는 식품, 음료 또는 이의 물질을 가열-처리 산물이 희석되도록 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물에 첨가할 수 있다. 첨가를 일시에 또는 여러 시간에 걸쳐 분할하여 수행할 수 있다. 그러므로, 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 신규한 식품 또는 음료를 쉽게 제조함이 가능하다. 본 발명은 또한 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르, 우론산 및/또는 우론산 에스테르 함유 당 화합물 또는 이러한 당 화합물을 함유하는 물질이 제조 도중 생성된 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 가열-처리 산물로 이루어져 제조되도록 이의 제조 도중 함유되어 제조되는 식품 또는 음료를 포함한다. 산물이 이러한 단계로 제조될 경우, 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물 및 본 발명의 가열-처리 산물을 첨가하고/하거나 희석함으로써 제조된 것들을 함유하는 식품 또는 음료가 본 발명의 식품 또는 음료로서 정의된다.
항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물의 함량에는 특별한 제한은 없으나 감각 수용성 및 생리학적 활성의 의미에서 적합하게 선택될 수 있다. 그러나, 예를 들면, 식품 100부내 가열-처리 산물의 함량은 고체 상태의 가열-처리 산물의 의미에서 0.001부 이상이고, 식품으로 감각 수용성, 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 및 항균 작용과 같은 생리학적 활성, 및 비용을 고려하여 함량은 바람직하게는 0.05 내지 10 부, 좀더 바람직하게는 0.01 내지 1 부이다.
음료에서 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용, 항균 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물의 양에는 특별한 제한은 없고 감각 수용성 및 생리학적 활성의 의미에서 적합하게 선택될 수 있다. 그러나, 예를 들면, 음료 100부내 가열-처리 산물의 함량은 고체 상태의 가열-처리 산물의 의미에서 0.001부 이상이고, 음료로서의 맛, 항암 작용, 아폽토시스-유도 작용 및 항균 작용과 같은 생리학적 활성 및 비용을 고려하여, 함량은 바람직하게는 0.005 내지 10 부 또는 좀더 바람직하게는 0.01 내지 1 부이다. 또한, 부는 본 명세서에서 중량부를 의미한다.
항암 작용을 갖는 본 발명의 식품내 가열-처리 산물의 양이 항암 활성을 고려하여 적합하게 선택될 수 있지만, 식품 100 g당 양은 항암 활성 단위로 0.1 유닛 이상, 바람직하게는 10 유닛 이상, 좀더 바람직하게는 100 유닛 이상이다.
본 발명의 항암 작용을 갖는 가열-처리 산물의 양에는 특별한 제한은 없고 양은 항암 활성을 고려하여 적합하게 선택될 수 있지만, 음료 100g당 양은 항암 활성 단위로 0.1 유닛 이상, 바람직하게는 10 유닛 이상, 좀더 바람직하게는 100 유닛 이상이다.
항암 작용, 아폽토시스-유도 작용, 항균 작용 등을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물이 여기에 함유되고, 첨가되고/되거나 희석되는 한 본 발명의 식품 또는 음료의 유형에는 특별한 제한은 없고 정제, 과립, 캡슐, 겔, 졸 등과 같이 경구 투여될 수 있는 유형이 채택된다.
본 발명의 식품 또는 음료는 대량으로 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하고 항균 작용, 아폽토시스-유도 작용, 항암 작용, 항바이러스 작용, 궤양 방지 작용, 맥관형성 방지 작용, 간 기능 개선 작용, 식이 섬유 작용, 철 및 중금속 등과 같은 불필요한 금속의 제거 작용과 같은 가열-처리 산물의 다양한 생리학적 활성으로 인하여 발암 방지 효과, 암 억제 효과, 궤양 방지 효과, 간 기능 개선 효과, 변비 방지 효과, 인플루엔자에 의한 감기 방지 효과 및 알츠하이머 질병 방지 효과를 나타내는 건강성 또는 기능성 식품 또는 음료이다. 식품 또는 음료가 특히 위장 및 장을 건강하게 유지하기에 특히 유용하다. 또한, 이것은 항균 작용으로 인하여 매우 양호한 보존능을 갖는 식품 또는 음료이다.
본 발명의 가열-처리 산물은 식품 또는 음료의 보존능을 개선하기 위한 방부제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 가열-처리 산물은 식품 또는 음료에 첨가함으로써 식품 또는 음료 제조 방법으로 사용할 수 있다.
항균 작용을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물은 우론산, 우론산 락톤, 우론산 에스테르, 우론산을 함유하는 당류 및/또는 우론산 에스테르 등을 함유하는 당 화합물 등을 가열함으로써 쉽게 제조할 수 있고 천연 식품 내지 식품 또는 음료로부터 유도된 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 항균제의 사용은 안전성의 의미에서 매우 우수하다.
식품 또는 음료로의 첨가시 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 항균제의 형태는 액체, 페이스트, 분말, 플레이크, 과립 등일 수 있다. 기타 첨가제와의 혼합에 의한 쉬운 작업 또는 사용이 고려될 경우, 시제를 건조에 의해서 분말, 플레이크 또는 과립으로 제조함이 바람직하다. 건조 방법에 관하여, 분무-건조, 드럼 건조, 선반 건조, 진공 건조, 동결-건조 등과 같은 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 항균제와 방부제를 당해분야 전문가들에게 공지된 방법에 의해서 제조할 수 있다. 제조시, 벌킹제, 안정제, 붕해제, 결합제, 보조 용해제 등과 같이 제형 제조를 위해 투과성 공지된 첨가제를 적합하게 첨가할 수 있다. 에탄올, 글리신, 나트륨 아세테이트, 아스코르브산, 글리세롤 지방산 에스테르, 염, EDTA 등과 같은 기타 항균 물질을 이들과 함께 사용할 수 있다.
식품 또는 음료에 첨가될 본 발명의 가열-처리 산물의 양은 식품 또는 음료의 유형에 따라 변할 수 있고 목적을 달성할 양을 첨가할 수 있다.
본 발명의 항균제를 사용하는 한 방법은 시제를 적합한 방법에 의해서 식품 또는 음료로 첨가하는 것이다. 첨가 방법에 대한 특별한 제한은 없지만 본 발명의 가열-처리 산물이 여타 방법에 의해서 식품 또는 음료에 함유될 경우, 최후로 수행될 것이다. 따라서, 본 발명의 항균제의 사용시, 용어 "첨가"는 모든 방법을 포함하고 이렇게 하여 본 발명의 가열-처리 산물을 식품 또는 음료에 함유하여 제조한다. 통상의 방법은 이것을 식품 또는 음료 제조 단계 도중에 첨가하는 것이지만, 식품을 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 용액에 침지하는 방법을 또한 사용할 수 있다. 식품을 용액에 침지하는 방법으로 식품에 함께 첨가하는 방법을 수행함이 가능하다. 침지 방법으로 적합한 식품의 예는 어류 또는 축육 페이스트 (예를 들면, 가마보코[끊인 어류 페이스트]와 비엔나 소세지), 면류(예를 들면, 끊인 면류) 및 동결전 어류, 어패류, 새우의 냉동 제품과 같이 물에서도 형태를 상실하지 않는 식품이다.
본 발명의 항균제가 방부제로서 사용될 경우, 식품 또는 음료의 보존능은 추가로 개선될 수 있다. 냉동 식품 및 냉동 디저트의 경우에, 냉동전 가공 단계의 오염 미생물의 생장이 억제될 수 있고 이렇게 하여 위생면에서 매우 유리한 결과가 수득될 수 있다. 본 발명의 항균제는 그람-양성 및 그람-음성 세균 모두에서 유효하고, 예를 들면, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스와 같은 약물-내성 세균, 살모넬라, 장독소-생성 스타필로코쿠스 아우레우스, 구토형 바실러스 세레우스, 설사형 바실러스 세레우스 및 장출혈성 이. 콜라이 O-157과 같은 식중독을 유발하는 세균에 매우 효과적이다. 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 방부제는 식중독에 대한 천연 예방제로서, 멸균제로서 특히 매우 유용하다. 또한, 의류, 침대 시이트 등의 멸균을 본 발명의 항균제를 사용하여 수행할 수 있고, 본 발명의 항균제를 분무할 경우 또는 본 발명의 항균제로 와이핑-오프를 수행할 경우, 멸균되어야 할 물체를 멸균함(세균을 제거하고 세균을 사멸시킴)이 가능하다.
본 발명의 항균제는 충치의 세균 및 치주 질병 세균에 대한 항균 활성을 나타내고 본 발명의 항균제를 함유하는 구강용 제제를 제공할 수 있다. 구강 제제의 형태는 액체 또는 페이스트와 같이 공지된 것일 수 있다. 구강 제제의 예가 치약이다. 치약은 액체, 페이스트 또는 분말과 같은 공지된 형태일 수 있다. 치약내 본 발명의 가열-처리 산물의 양에 대한 특별한 제한은 없고 충치 및 치주 질병에 대한 세균에 유효한 농도를 함유할 경우, 이것으로 충분할 것이다. 습윤제, 계면활성제, 결합제, 향료, 감미제 등과 같은 공지된 첨가제를 치약에 첨가할 수 있다. 상술된 바와 같이, 우론산 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물, 예를 들면, 펙틴 함유 물질(예를 들면, 채소와 과일)을 함유하는 물질의 가열-처리 산물을 또한 사용할 수 있고 치약과 같이 펙틴-함유 채소의 가열-처리 산물을 함유하는 구강 제제를 본 발명의 범위내에 포함할 수 있다.
본 발명의 아폽토시스 유도제를 제조하기 위해서, 아폽토시스-유도능을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 활성 성분으로서 사용하고 공지된 약학 담체와 화합하여 약학 제제를 제공한다. 보통, 본 발명의 가열-처리 산물을 약학적으로 허용되는 액체 또는 고체 담체와 화합한 다음, 필요할 경우, 용매, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 벌킹제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등을 첨가하고 정제, 과립, 희석 분말, 분말, 캡슐 등과 같은 고체 제제 또는 용액, 현탁액, 에멀션 등과 같은 액체 제제를 제조한다. 생성된 제제를 건조물로 가공한 다음 적합한 담체를 첨가함으로써 사용하기 전에 액화한다.
본 발명의 아폽토시스 유도제를 경구 또는 예를 들면, 주사 또는 정맥 주사에 의해서 비경구 투여할 수 있다.
약학 담체는 상술된 바와 같이 투여 경로 및 조제 형태에 따라 적합하게 선택할 수 있다. 전분, 락토스, 수크로스, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분, 무기염 등을 경구 제제의 경우에 사용할 수 있다. 경구 제제의 제조시, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 유동 개선제, 교정제, 착색제, 향료 등을 첨가함이 또한 가능하다.
한편, 비경구 투여의 경우에, 본 발명의 활성 성분인 아폽토시스-유도 활성을 갖는 가열-처리 산물을 주사용 증류수, 생리식염수, 글루코스 수용액, 주사용 식용유, 호마유, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 희석제에 통상적인 방법으로 용해시키거나 현탁한 다음 필요한 경우, 항균제, 안정제, 등장제, 진통제 등을 첨가하여 목적하는 비경구 제제를 수득한다.
본 발명의 아폽토시스 유도제를 조제 형태에 따라 적합한 투여 경로에 의해서 투여한다. 투여 방법에 대한 특별한 제한은 없고 내부 및 외부 경로와 주사에 의한 경로를 선택할 수 있다. 주사를 예를 들면, 정맥, 근육내, 피하 및 피내 경로에 의해서 투여할 수 있고 외용제에는 좌약이 포함된다.
본 발명의 아폽토시스 유도제의 용량은 특별히 기재되지 않지만 조제 형태, 투여 방법, 사용의 목적 및 유도제가 투여될 환자의 나이, 체중, 상태 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 그러나, 보통 성인용 제제에 함유되는 본 발명의 가열-처리 산물이 용량은 1일당 20 내지 2,000 mg/kg이다. 당연한 일로서, 용량은 다양한 인자에 의해서 변할 수 있고, 그러므로, 상기의 용량 이하가 일부의 경우에 충분할 수 있고, 다른 경우에, 상기의 용량 이상이 필요할 수 있다. 본 발명의 제제를 그 자체로 경구에 투여할 수 있고, 또한 제제를 통상의 식품 및/또는 음료로의 첨가후 매일 취할 수 있다.
항암 작용을 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 활성 성분으로서 사용하고 공지된 약학 담체와 함께 약학 제제로 제조할 경우 항암제를 제조할 수 있다. 항암제를 상술된 방법에 따라서 제조할 수 있다. 보통, 본 발명의 가열-처리 산물을 악학적으로 허용되는 액체 또는 고체 담체로 화합한 다음 필요한 경우, 용매, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 벌킹제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등을 첨가하여 정제, 과립, 희석 분말, 분말, 캡슐 등과 같은 고체 제제 또는 용액, 현탁액, 에멀션 등과 같은 액체 제제를 제공한다. 또한, 이것을 건조 제제로 가공할 수 있고 적합한 담체를 실제 사용전에 첨가함으로써 액화할 수 있다.
본 발명의 항암제를 경구 또는 예를 들면, 주사 또는 정맥 주입 방법에 의해서 비경구 투여할 수 있다.
약학 담체를 상술된 투여 방법 및 조제 형태에 따라서 선택할 수 있고 상술된 아폽토시스 유도제의 경우와 동일한 방법에 의해서 사용할 수 있다.
항암제를 조제 형태에 따라 적합한 투여 경로에 의해서 투여한다. 투여 방법에 대한 특별한 제한은 없고, 예를 들면, 내부 및 외부 경로와 주사에 의한 경로를 수행할 수 있다. 주사를 예를 들면, 정맥, 근육내, 피하 및 피내 경로에 의해서 투여할 수 있고 외용제에는 좌약이 포함된다.
본 발명의 항암제의 용량은 특별히 기재되지 않지만 조제 형태, 투여 방법, 사용의 목적 및 투여될 환자의 나이, 체중, 상태 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 그러나, 보통 성인용 제제에 함유되는 본 발명의 가열-처리 산물이 용량은 1일당 20 내지 2,000 mg/kg이다. 당연한 일로서, 용량은 다양한 인자에 의해서 변할 수 있고, 그러므로, 상기의 용량 이하가 일부의 경우에 충분할 수 있고, 다른 경우에, 상기의 용량 이상이 필요할 수 있다. 본 발명의 시제를 그 자체로 경구 투여할 수 있고, 또한 시제를 통상의 식품 및/또는 음료로의 첨가후 매일 취할 수 있다.
본 발명의 가열-처리 산물은 항암 작용을 갖고, 낮은 농도에서 암세포의 분화를 유도하는 능력이 있어 본 발명의 가열-처리 산물은 또한 분화-유도제(항암제)로서 유용하다. 활성 성분으로 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 암세포 분화 유도제를 상술된 항암제의 경우와 동일한 방법에 의해서 제제로 제조할 수 있고 항암제의 경우와 동일한 방법에 의해서 투여할 수 있다.
암세포 분화 유도제로서 시제의 용량은 특별히 기재되지 않지만, 조제 형태, 투여 방법, 사용의 목적 및 유도제가 투여될 환자의 나이, 체중, 상태 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 그러나, 보통 성인용 제제에 함유되는 본 발명의 가열-처리 산물의 용량은 1일당 0.2 내지 500 mg/kg이다. 당연한 일로서, 용량은 다양한 인자에 의해서 변할 수 있고, 그러므로, 상기의 용량 이하가 일부의 경우에 충분할 수 있고, 다른 경우에, 상기의 용량 이상이 필요할 수 있다. 본 발명의 시제를 그 자체로 경구에 투여할 수 있고, 또한 시제를 통상의 식품 및/또는 음료로의 첨가후 매일 취할 수 있다.
본 발명의 가열-처리 산물은 항바이러스 효과 및 간 기능 개선 작용을 지닌다. 따라서, 활성 성분으로서 본 발명이 가열-처리 산물을 함유하는 항바이러스제 및 간 기능 개선제를 상술된 항암제의 경우와 동일한 방법에 의해서 제조할 수 있고 항암제의 경우와 동일한 방법에 의해서 투여할 수 있다.
항바이러스제로서 용량은 특별히 기재되지 않지만, 조제 형태, 투여 방법, 사용의 목적 및 시제가 투여될 환자의 나이, 체중, 상태 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 그러나, 보통 성인용 제제에 함유되는 본 발명의 가열-처리 산물의 용량은 1일당 0.2 내지 2,000 mg/kg이다. 당연한 일로서, 용량은 다양한 인자에 의해서 변할 수 있고, 그러므로, 상기의 용량 이하가 일부의 경우에 충분할 수 있고, 다른 경우에, 상기의 용량 이상이 필요할 수 있다. 본 발명의 시제를 그 자체로 경구에 투여할 수 있고, 또한 시제를 통상의 식품 및/또는 음료로의 첨가후 매일 취할 수 있다. 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 제제 투여시, 인플루엔자 바이러스에 의해 유도되는 통상의 감기와 같은 바이러스 질병을 예방 및 치료할 수 있고, 또한 간 기능 장애를 개선하고 이렇게 하여 GOT와 GPT 값이 정상이 된다.
본 발명의 가열-처리 산물은 예를 들면, 70-k 달톤의 열 쇼크 단백질을 유도하는 작용을 지니고 RNA 바이러스 및 DNA 바이러스, 예를 들면, 헤파티티스 바이러스, AIDS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 허프스 바이러스 등에 대해 항바이러스 작용을 나타낸다. 이것은 소염 작용과 같은 생체예방 작용을 나타낸다.
항궤양제를 공지된 약학 담체와 함께 활성 성분으로 갖는 본 발명의 가열-처리 산물을 사용한 다음 약학 제제로 가공하여 제조함으로써 제조할 수 있다. 항궤양제를 상술된 방법에 따라서 제조할 수 있다. 보통, 본 발명의 가열-처리 산물은 약학적으로 허용되는 액체 또는 고체 담체와 화합한 다음 필요할 경우, 용매, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 벌킹제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등을 첨가하고 이렇게 하여 정제, 과립, 희석 분말, 분말, 캡슐 등과 같은 고체 제제 또는 용액, 현탁액, 에멀션 등과 같은 액체 제제를 제조한다. 또한 사용전 적합한 담체의 첨가에 의해 액체로 할 수 있는 건조 산물을 제조함이 가능하다.
항궤양제를 경구 경로 또는 예를 들면, 주사 또는 정맥 주사 방법과 같은 비경구 경로에 의해서 투여할 수 있다.
약학 담체를 상술된 투여 방법 및 조제 형태에 따라서 선택할 수 있고 상술된 아폽토시스 유도제의 경우와 동일한 방법에 의해서 사용할 수 있다.
항궤양제를 조제 형태에 따라 적합한 투여 경로에 의해서 투여할 수 있다. 투여 방법은 특별히 제한되지 않고 내부 또는 외부 경로에 의한, 또는 주사에 의한 투여를 수행할 수 있다. 주사를 예를 들면, 정맥, 근육내, 피하 또는 피내 경로에 의해서 투여할 수 있다. 외용제에는 좌약이 포함된다.
항궤양제로서 용량은 특별히 기재되지 않지만, 조제 형태, 투여 방법, 사용의 목적 및 시제가 투여될 환자의 나이, 체중, 상태 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 그러나, 보통 성인용 제제에 함유되는 본 발명의 가열-처리 산물의 용량은 1일당 20 내지 2,000 mg/kg이다. 당연한 일로서, 용량은 다양한 인자에 의해서 변할 수 있고, 그러므로, 상기의 용량 이하가 일부의 경우에 충분할 수 있고, 다른 경우에, 상기의 용량 이상이 필요할 수 있다. 본 발명의 시제를 그 자체로 경구에 투여할 수 있고, 또한 시제를 통상의 식품 및/또는 음료로의 첨가후 매일 취할 수 있다.
본 발명은 항암 작용 및 아폽토시스-유도 작용과 같은 생리학적 활성을 갖고 암 또는 바이러스 질환을 앓고 있는 환자의 병원성 세포에서 항암 작용 및 아폽토시스 작용을 유도하며 이러한 질병의 예방 또는 치료에 유효한 식품 또는 음료를 제공한다. 특히 위암 또는 대장암과 같은 소화 기관의 암의 경우에, 식품 또는 음료로서 경구 경로에 의해서 본 발명의 가열-처리 산물을 제공함으로써 암세포의 생장을 억제하고 암세포의 아폽토시스를 유발함이 가능하고, 그러므로, 본 발명의 가열-처리 산물이 함유되고, 첨가되고/되거나 희석된 식품 또는 음료는 소화 기관 암의 치료 및 예방에 있어 우수한 효과를 지닌다.
또한, 본 발명의 가열-처리 산물은 항바이러스 및 항균 작용을 지닌다. 그러므로, 항바이러스제, 항균제, 내구강제(예를 들면, 치약) 및 식품 또는 음료의 방부제로서, 항궤양 작용으로 인하여 유용하고 또한 궤양에 대한 항궤양제 및 궤양 예방제로서 유용하다. 또한 간 기능 개선 작용으로 인하여, 간 기능 개선제로서 또한 유용하다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 식품 또는 음료가 생리학적 활성을 갖는 대량의 본 발명의 가열-처리 산물을 함유함이 가능하다. 본 발명의 식품 또는 음료는 아폽토시스-유도 작용, 항세균 작용, 항암 작용, 항바이러스 작용, 항맥관형성 작용 억제, 비정상적 증식 세포에 대한 작용, 항궤양 작용, 간 기능 개선 작용, 식이 섬유 작용, 철 및 중금속과 같은 불필요한 금속의 제거 작용 등과 같은 가열-처리 산물의 다양한 생리학적 활성으로 인하여 발암 예방 효과, 항암 효과, 항균 효과, 항바이러스 효과, 항궤양 효과, 변비 예방 효과, 간 기능 개선 효과, 알츠하이머 질병 예방 효과, 아폽토시스-유도 효과 등과 같은 생체의 항상성 유지 작용을 나타내는 건강성 또는 기능성 식품 또는 음료이다. 따라서, 본 발명에 따라서, 기능성 물질을 함유하는 식품 또는 음료는 위장 및 장을 건강하게 유지하기에 유용하다. 다양한 생리학적 작용으로 인하여, 본 발명의 가열-처리 산물(특히 10,000 이하, 바람직하게는 500 이하의 분자량을 갖는 분획)을 식품 또는 음료에 사용할 경우, 식품 또는 음료에 다양한 생리학적 기능을 용이하게 제공함이 가능하다. 따라서, 가열-처리 산물은 예를 들면, 식품 또는 음료로의 항균 첨가제로서, 또한 식품 또는 음료를 위한 방부제로서 매우 유용하다.
본 발명은 추가로 병리적 세포의 증식을 억제하고 항암 및 아폽토시스-유도 작용으로 인하여 병원성 세포에 아폽토시스를 유도함으로써 암 및 바이러스 질병으로부터 고통받는 환자들의 예방 및 치료에 유용한 아폽토시스 유도제 및 항암제를 추가로 제공한다. 특히 위암 및 대장암과 같은 소화 기관의 암의 경우에, 식품 또는 음료로서 경구 경로에 의해서 본 발명의 가열-처리 산물을 투여함으로써 암세포의 생장을 억제하고 암세포의 아폽토시스를 유발함이 가능하고, 그러므로, 본 발명의 가열-처리 산물이 함유되고, 첨가되고/되거나 희석된 식품 또는 음료는 소화 기관 암의 치료 및 예방에 있어 우수한 효과를 지닌다. 본 발명은 또한 질병으로 고통받는 환자를 위한 궤양 예방 및 치료에 유용한 항궤양 작용을 갖는 항궤양제를 제공한다. 소화 기관의 궤양의 경우에, 본 발명의 가열-처리 산물은 식품 또는 음료로서 경구로 취함으로써 항궤양활성 작용을 달성하고, 그러므로, 본 발명의 가열-처리 산물이 첨가되고/되거나 희석된 식품 또는 음료는 소화 기관의 궤양의 치료 및 예방에 우수한 효과를 지닌다. 본 발명의 약학 조성물을 식용 과일 과피, 식용 조류 등을 출발 물질로서 사용하여 저비용으로 대량 공급할 수 있고 다른 장점은 이것이 식품으로부터 유도되므로 높은 안전성을 지닌다는 점이다. 또한, 아폽토시스를 유도하기 위한 단순한 방법을 본 발명에 의해서 제공할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용할 때, 아폽토시스 메카니즘 규명 연구 및 아폽토시스 유도에 대한 억제제 개발이 가능하다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해서 추가로 설명될 것이지만, 본 발명은 이들 실시예로 또한 이에 의해서 결코 제한되지 않는다. 또한, 실시예에 사용된 용어 %는 중량%를 의미한다.
실시예 1
사과로부터 제조된 펙틴(Wako Pure Chemicals 제조) (500mg)을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제 50㎖에 현탁하고 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하여 가열-처리 펙틴 용액을 제조한다.
인간 전골수구 백혈병 세포 HL-60 (ATCC CRL-1964)을 56℃에서 30분 동안 처리된 10% 태송아지 혈청(Gibco 제조)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Nissui 제조)에서 배양한 다음 ASF 104 배지(Ajinomoto 제조)에 현탁하여 세포 농도를 5 x 105세포/9㎖로 만든다.
이 현탁액에 가열-처리 펙틴 용액 1 ㎖를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 16시간 동안 5% 이산화탄소의 존재하에 배양한다. 확인을 위해서, 아폽토시스-유도제로 공지된 악티노마이신 D(Sigma 제조)의 수용액(0.1mg/㎖) 0.1㎖을 제외하고는 상기와 동일한 배양을 수행하고 생리식염수 용액 0.9㎖를 상술된 펙틴 용액 대신에 사용한다.
배양된 세포를 광학 현미경 하에서 관찰하고 핵의 응축, 세포의 수축 및 아폽토틱 바디의 생성이 열-처리 펙틴 용액과 악티노마이신 D-첨가 배양 세포 모두에서 확인된다. 또한, 생리식염수 용액 1㎖를 첨가한 세포를 배양하는 대조군에서, 이러한 현상은 관찰되지 않는다.
이러한 결과로부터, 가열-처리 펙틴 용액이 HL-60 세포에서 아폽토시스를 유도함이 밝혀졌다.
실시예 2
펙틴 최종 농도를 10mg/㎖로 만들기 위해서 사과로부터 제조된 시판 펙틴을 120mM NaCl을 함유하는 50mM PEPES 완충제(pH 7.0)에 용해시킨 다음 용액의 pH를 1N NaOH로 7.0으로 조정한다. 이것을 121℃에서 30분 동안 가열하고 자외선 흡수 스펙트럼을 측정해 보니, 가열-처리 산물의 약 235nm에서의 흡광도가 가열전에 비하여 증가했다.
이러한 샘플을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 아폽토시스-유도 활성을 실시예 1에 기재된 방법에 의해서 측정한다. 그러나, 이러한 모든 실시예에서, 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640을 ASF 104 배지 대신 사용하고, HL-60 (ATCC CCL-240)을 세포로서 사용하고, 아폽토시스-유도 활성의 측정시, 각각의 샘플을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 이렇게 하여 아폽토시스 유도 활성을 측정하는 일부의 예외가 존재한다. 세포 현탁액에 트리판 블루의 0.4% 수용액 2배만큼의 용적을 첨가하고 관찰을 광학 현미경 하에서 수행하고 이렇게 하여 트리판 블루를 분비하고 무색 세포와 청색 세포를 생존 세포와 죽은 세포 각각에 대해서 센다.
이의 결과로서, 가열-처리 펙틴 산물은 HL-60 세포에 대해 상당한 아폽토시스-유도 활성을 나타낸다.
레몬으로부터의 시판 펙틴을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 pH 5.0인 펙틴의 농도를 10mg/㎖로 만든다. 이것을 121℃에서 30분 동안 가열하고 자외선 흡수 스펙트럼을 측정해 보니, 약 235nm에서의 흡광도가 가열-처리 산물에서 증가했다.
이러한 샘플을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고, HL-60으로의 아폽토시스-유도 활성을 상술된 방법에 의해서 측정시, 가열-처리 산물이 상당한 아폽토시스-유도 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
결과가 도 1에 도시되어 있다. 따라서, 도 1은 가열-처리 레몬 펙틴 용액을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 펙틴의 농도를 1mg/㎖로 만들 경우, 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)이고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)이다. 도 1에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고 백색 사방형은 가열-처리 레몬 펙틴을 첨가하는 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 레몬 펙틴은 항암 작용을 나타낸다.
실시예 3
(1) 사과로부터 제조된 시판 펙틴을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 펙틴의 농도를 10 mg/㎖로 만들고 121℃에서 20분 동안 가열하여 가열-처리 용액을 제조한다. 이것의 일부를 동결 건조하여 동결-건조 상태로 제조된 가열-처리 용액을 생성한다.
가열-처리 용액의 잔여부를 Seamless 셀룰로스 튜빙(컷오프 분자량: 12,000-14,000; Sanko Junyaku 제조) 또는 Spectra/Por 7 투석막(차단 분자량: 1,000; Spectrum 제조)을 사용하여 청정수에 대하여 투석하고 투석후 내부 액체 각각을 동결-건조하고 무게를 달아 보니, 동결-건조 내부 액체 각각에서 가열 처리전 펙틴과 비교해서 약 10%의 중량 손실이 있었다.
동결-건조된 가열-처리 용액을 물에 용해시키고 반면에 투석후 동결-건조된 내부 액체를 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 두 용액의 각각의 최종 농도를 10mg/㎖로 만든다. 용액을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성을 실시예 2에 기재된 방법에 의해서 측정한다.
결과는 가열-처리 펙틴 용액은 활성을 나타내고 반면에 투석후 내부 액체는 감소된 활성을 나타낸다는 것이다.
결과가 도 2에 도시되어 있다. 따라서, 도 2는 동결-건조된 가열-처리 용액, 셀룰로스 막을 사용하여 투석한 후의 동결-건조 액체 또는 Spectra/Por 7 투석막을 사용하여 투석한 후의 동결-건조 내부 액체를 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 농도를 1mg/㎖로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 2에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고; 백색 사방형은 가열-처리 용액의 동결-건조 산물을 첨가하는 경우를 나타내며; 백색 원은 셀룰로스 막을 통한 투석후 내부 액체의 동결-건조 산물을 첨가하는 경우를 나타내며; 백색 삼각형은 Spectra/por 7 투석막을 통한 투석후 내부 액체의 동결-건조 산물을 사용하는 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 용액은 항암 작용을 나타낸다.
(2) 상술된 바와 같이 한 후, 가열-처리 펙틴 용액을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 Centriplus 10(분획화 분자량: 10,000; Amicon 제조)을 사용하여 한외여과하여 막을 통과하는 분획을 제조한다. 이러한 분획의 아폽토시스-유도 활성을 실시예 2에 기재된 방법에 의해 측정해 보니, 이것은 한외여과전 샘플과 동일한 활성을 지닌다.
결과가 도 3에 도시되어 있다. 따라서, 도 3은 Centriplus 10을 통과하는 가열-처리 펙틴 용액의 분획을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 농도를 1mg/㎖로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 3에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고 백색 사방형은 막을 통과하는 분획을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 펙틴 용액은 백색 사방형의 경우와 동일한 결과를 나타내고 가열-처리 펙틴 용액과 막을 통과하는 분획은 항암 작용을 나타낸다.
실시예 4
사과로부터 제조된 시판 펙틴을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 펙틴의 농도를 10 mg/㎖로 만들고 용액을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 121℃에서 30분 동안 가열한다. 이러한 샘플(20㎖)을 청정수로 평형을 이룬 Sephacryl S-300 Hiload 26/60 High Resolution(Pharmacia 제조)의 컬럼에 적용하고 겔 여과에 투입한다. 청정수를 이동상을 위해 1㎖/분의 유동율로 사용하고 검출을 차동 굴절계로 수행한다.
분획 1(샘플을 컬럼으로 적용하여 110 내지 190분 후 용출), 분획 2(190 내지 270분 후 용출) 및 분획 3(270 내지 400분 후 용출) 각각을 증발기로 농축한다. 각각의 분획에 NaCl과 HEPES를 첨가하여 최종 농도를 120mM와 50mM로 만들고, 각각 용적을 20㎖로 제조한다. 이것을 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정한다.
HL-60 세포로의 아폽토시스-유도 활성을 실시예 2의 방법에 의해서 측정해 보니 강한 활성이 최저 분자량의 분획 3에서 발견되었다.
결과가 도 4에 도시되어 있다. 따라서, 도 4는 상술된 분획 3을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 농도를 1mg/㎖으로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 4에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고 백색 사방형은 분획 3을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 분획 3은 항암 작용을 나타낸다.
실시예 5
D-α-갈락튜론산 또는 D-글루큐론산을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 산 농도를 10mg/㎖로 만든다. 생성된 용액을 121℃에서 20분 동안 가열하고 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정한다. 이들 샘플의HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성을 실시예 2의 방법에 의해서 측정해 보니, 샘플 모두 상당한 활성을 나타낸다.
결과가 도 5에 도시되어 있다. 따라서, 도 5는 가열-처리 갈락튜론산 용액 또는 가열-처리 글루큐론산 용액을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 산 농도를 1mg/㎖으로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 5에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 사방형은 가열-처리 갈락튜론산 용액을 첨가한 경우를 나타내며, 백색 원은 가열-처리 글루큐론산 용액을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 두 가열-처리 산물 모두 항암 작용을 나타낸다.
(2) 갈락튜론산을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 산 농도를 10mg/㎖로 만든다. 용액을 1N NaOH로 pH 7.0 및 pH 8.0으로 조정한다. 이들 각각을 121℃에서 20분 동안 가열한 다음 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정한다. 이들 샘플의 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성을 실시예 2의 방법에 의해서 측정해 보니, pH 7.0에서 가열된 샘플이 pH 8.0에서 가열된 샘플보다 더 강한 활성을 나타낸다.
결과가 도 6에 도시되어 있다. 따라서, 도 6은 pH 7.0또는 pH 8.0에서의 갈락튜론산 가열-처리 용액을 첨가하여 농도를 1mg/㎖으로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 6에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 사방형은 pH 7.0에서 가열된 갈락튜론산 용액을 첨가한 경우를 나타내며, 백색 원은 pH 8.0에서 가열된 갈락튜론산 용액을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, pH 7.0에서 가열된 산물이 항암 작용을 나타낸다.
실시예 6
사과로부터 제조된 펙틴을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH: 7.0)에 용해시켜 펙틴의 농도를 10mg/㎖로 만들고 용액을 121℃에서 20분 동안 가열하여 가열-처리 샘플 1을 생성한다. 이것을 상술된 셀룰로스 투석막을 사용하여 내부 액체 샘플 2를 제조한다. 투석후 내부 액체 샘플 2를 121℃에서 1시간 동안 추가로 가열한 다음 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정한 다음 재-가열 샘플 3으로 제조한다.
샘플 1 내지 3을 각각 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성을 실시예 2의 방법에 의해서 측정해 보니, 샘플 1 및 3은 활성을 나타내지만, 샘플 2의 경우에 활성이 감소된다.
이러한 결과로부터 투석에 의해 감소된 활성을 갖는 투석후의 가열-처리 펙틴의 내부 액체는 재-가열에 의해서 활성을 회복함이 명백해진다.
실시예 7
사과로부터 제조된 시판 펙틴을 1N HCl에 용해시켜 펙틴 농도를 10mg/㎖으로 만들고 121℃에서 1.5 시간 동안 가열하여 가열-처리 산물을 제조한다. 이어서 가열-처리 산물을 NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 인간 전골수구 백혈병 세포 (HL-60)에 대한 활성을 하기와 같이 측정한다.
따라서, HL-60(ATCC CCL-240)을 10% 태송아지 혈청(Gibco 제조)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Nissui 제조)에서 배양하고 56℃에서 30분 동안 처리한 다음 RPMI 1640 배지에 현탁하여 세포 농도를 2.5 x 105세포/4.5㎖로 만든다.
이 현탁액 4.5㎖에 상술된 가열-처리 펙틴 용액 0.5㎖를 첨가하고 혼합물을 5% 탄소 옥사이드의 존재하에 37℃에서 16시간 동안 배양한다. 확인을 위해서, 동일한 배양을 아폽토시스-유도제로 공지된 악티노마이신 D(Sigma 제조) 수용액(0.1mg/㎖) 0.05㎖를 제외하고 상기와 같은 동일한 배양을 수행하고 생리식염수 용액 0.45㎖를 상술된 가열-처리 펙틴 용액 대신에 사용한다.
배양된 세포를 광학 현미경 하에서 관찰하고 핵의 응축, 세포의 수축 및 아폽토틱 바디의 생성이 열-처리 펙틴 용액과 악티노마이신 D-첨가 배양 세포 모두에서 확인된다. 또한, 생리식염수 용액 0.5㎖를 첨가한 세포를 배양하는 대조군에서, 이러한 현상은 관찰되지 않는다.
또한, 세포 현탁액에 트리판 블루의 0.4% 수용액의 용적의 2배만큼 첨가하고 관찰을 광학 현미경 하에서 수행하고 이렇게 하여 트리판 블루를 분비하고 무색 세포와 청색 세포를 생존 세포와 죽은 세포 각각에 대해서 센다.
결과가 도 7에 도시되어 있다. 따라서, 도 7은 가열 처리 펙틴 용액을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 펙틴 농도를 1mg/㎖로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 7에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 사방형은 가열-처리 펙틴 용액을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 펙틴은 항암 작용을 나타낸다.
실시예 8
사과로부터 제조된 시판 펙틴을 물에 용해시켜 펙틴 농도를 10mg/㎖으로 만들고 NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 121℃에서 1시간 동안 가열한다. 가열후 pH는 4.5이다. 이어서 가열-처리 산물을 NaOH로 다시 pH 7.0으로 조정하고 불용성 물질을 원심분리(10분 동안 10,000 x g)와 0.22㎛의 필터를 사용하여 여과한 다음, 동일한 용적의 에탄올을 첨가하고, 혼합물을 원심분리(10분 동안 10,000 x g)하고, 생성된 상등액 분획과 침전물 분획 각각을 진공에서 증발 건조하고 이들 각각을 초기 단계에서 펙틴을 용해시키기 위해서 사용한 것와 동일한 양의 물에 용해시킨다. 에탄올 처리 상등액 분획 및 침전물 분획의 각각의 수용액을 NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 이들 각각의 0.5㎖를 HL-60 세포의 배양 배지 4.5㎖에 첨가하여 실시예 7의 방법에 의해서 아폽토시스-활성을 측정한다.
결과적으로, HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성이 상등액 분획에 존재함이 밝혀졌다. 에탄올 대신에 2-프로판올을 사용할 경우 동일한 결과가 수득된다. 결과가 도 8에 도시되어 있다. 따라서, 도 8은 에탄올 또는 2-프로판올로 처리한 후 상등액 분획 또는 침전물 분획의 수용액을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가할 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 8에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 원은 에탄올-처리 침전물 분획을 첨가한 경우를 나타내며, 흑색 원은 에탄올-처리 상등액 분획을 첨가한 경우를 나타내며, 백색 삼각형은 2-프로판올-처리 침전물 분획을 첨가한 경우를 나타내며, 흑색 삼각형은 2-프로판올-처리 상등액 분획을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 상등액 분획이 항암 작용을 나타낸다.
샘플을 상술된 바와 동일한 방법으로 가열-처리 펙틴에 첨가될 에탄올 또는 2-프로판올의 양을 0.5, 1.5 및 2-배 용적으로 변화시킴으로써 제조하여, 동용적의 에탄올 또는 2-프로판올 첨가한 경우와 같이, 활성이 상등액 분획에서 주지됨을 발견하였다. 또한, 아폽토시스-유도 활성을 하기의 방법으로 측정한다. 따라서, 96 웰 마이크로타이터 플레이트 각각의 웰에 5,000 HL-60 세포, 샘플 10㎕ 및 알라마블루(Alamar Bioscience 제조) 10㎕를 함유하는 10% 태송아지 혈철을 함유하는 RPMI 1640 배지 100㎕를 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 5% 이산화탄소 가스의 존재시에 배양을 수행한다. 이런 다음, 560nm에서의 흡광도에서 590nm에서의 흡광도를 뺌으로써 수득된 값을 측정하고 세포 증식도로서 정의한다.
실시예 9
사과로부터 제조된 펙틴을 0.1M 카보네이트 완충제에 용해시켜 펙틴의 농도를 10mg/㎖로 만들고 pH를 9.5로 조정한다. 이 용액을 121℃에서 30분 동안 가열한다. 가열-처리 산물의 pH는 9.2이다. 가열-처리 산물의 일부를 HCl(샘플 A)로 pH 7.0으로 조정하고 나머지를 pH 4.5로 조정한다. pH 4.5로 조정된 샘플을 121℃에서 30분 동안 다시 가열하고 pH를 pH 7.0으로 조정한다 (샘플 B). 샘플 A 및 B의 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성을 실시예 7의 방법에 의해서 측정해 보니, 샘플 A는 활성을 나타내지 않지만, 샘플 B(가열-처리 펙틴 용액 2)는 활성을 나타낸다.
결과가 도 9에 도시되어 있다. 따라서, 도 9는 샘플A 또는 B를 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가할 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 9에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 사방형은 샘플 A를 첨가한 경우를 나타내며, 백색 원은 샘플 B를 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 펙틴 용액은 항암 작용을 나타낸다.
실시예 10
(1) D-α-갈락튜론산을 물에 용해시켜 농도를 10mg/㎖로 만들고 이때 pH는 2.4이다. 이것을 121℃에서 20분 동안 가열한다. 가열-처리 산물의 pH는 2.2이다. 이러한 가열-처리 산물의 pH를 pH 7.0으로 조정하고, HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 작용을 HL-60 세포 수를 3 x 105세포/4.5㎖로 조정한 세포 현탁액을 사용함을 제외하고는 실시예 7의 방법에 의해서 측정하고 이렇게 하여 이 샘플이 활성을 지님을 발견했다.
결과가 도 10에 도시되어 있다. 따라서, 도 10은 산성 조건하의 갈락튜론산의 가열-처리 산물을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 농도를 1mg/㎖로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 10에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 사방형은 가열-처리 갈락튜론산을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 산물은 항암 작용을 나타낸다.
(2) D-글루큐론산을 120mM NaCl을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH 7.0)에 첨가하여 농도를 10mg/㎖로 만들고 이때 pH는 3.18이다. 이 용액을 121℃에서 20분 동안 가열하고, 가열-처리 용액의 pH를 NaOH로 pH 7.0으로 조정하고, HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 작용을 실시예 7의 방법에 의해서 측정하고 이렇게 하여 이 샘플이 활성을 지님을 발견했다.
결과가 도 11에 도시되어 있다. 따라서, 도 11은 가열-처리 글루큐론산을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 농도를 1mg/㎖로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 11에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 원은 가열-처리 글루큐론산을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 글루큐론산은 항암 작용을 나타낸다.
실시예 11
D-α-갈락튜론산을 물에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 이때 pH는 2.4이다. 이 용액을 121℃에서 20분 동안 가열할 경우, 가열-처리 산물의 pH는 2.2이다. 이것을 진공에서 40배 정도로 농축하고 농축물 20㎕를 Palpak Type S(4.6 x 250 mm; Takara Shuzo 제조)를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피에 투입한다. 산성 조건 하에서 가열한 갈락튜론산을 아세토니트릴의 수용액을 사용하여 1㎖/분의 유동율로 분리한다. 처음 30분 동안, 90% 용액을 사용하고, 그다음 20분 동안 선형 농도 구배를 90% 내지 50% 용액을 사용하여 적용한다. 분획화를 매 90초 수행하고, 각각의 분획을 진공에서 증발 건조시킨 다음, 물 80㎕에 용해시키고 용액의 각 10㎕를 하기에 제공된 MTT 방법에 의해서 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성 측정에 투입한다.
결과적으로, 활성이 4.5 내지 12 분 및 45 내지 48 분의 용출 시간을 갖는 두 분획에서 발견되었다.
MTT 방법: 각각의 샘플 액체의 희석 용액 5㎕ 또는 물 5㎕ 각각을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 배치한다. 이것에 5,000 HL-60 세포를 함유하는 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 100㎕를 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 5% 탄소 옥사이드의 존재하에 배양을 수행한다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma 제조) 5mg/㎖를 함유하는 포스페이트 완충 염수 10㎕ 첨가한 후, 4시간 이상 배양을 수행하고 세포의 생장 단계를 현미경하에서 관찰한다. 한편, 0.04N HCl을 함유하는 2-프로판올 100㎕를 여기에 첨가하고, 혼합물을 잘 교반하고 590nm에서의 흡광도를 측정하고 세포의 증식도로서 사용한다.
실시예 12
사과로부터 제조된 시판 펙틴을 물에 현탁하여 펙틴 농도를 25%로 만든다. 현탁액을 NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 분획화 분자량이 12,000 내지 14,000인 투석 튜브에 배치하고 물의 용적 15배에 대해서 4회 투석한다. 투석후, 용액을 pH 7.0으로 다시 조정하고 121℃에서 1시간 동안 가열하여 가열-처리 용액을 제조한다. 이러한 가열-처리 용액의 pH는 5.4이다. 이러한 가열-처리 용액의 pH를 NaOH로 7.0으로 조정하고 원심분리에 투입하여 불용성 물질을 제거하고 순서대로 0.8㎛, 0.45㎛ 및 0.22㎛의 필터를 사용하여 여과하여 필터-처리 용액을 제조한다. 이어서 이 필터-처리 용액을 10,000의 분획화 분자량을 갖는 한외여과막을 통하여 여과시킨다. 한외여과막을 통과한 여과물을 농축하고 진공에서 증발건조하고 건조된 산물을 초기 단계에서 펙틴을 용해시키기 위해서 사용한 것의 40분의 1의 양의 물에 용해시켜 가열-처리 펙틴 용액을 제조한다.
가열-처리 펙틴 용액을 물로 평형을 이룬 TOYOPEARL HW-40C의 컬럼(4.4 x 92 cm; Toso 제조)에 적용하고 각 분획의 아폽토시스-유도 활성을 알라마블루를 실시예 8에서 기재된 바와 같이 사용하는 방법에 의해서 측정한다. 결과적으로, 448 내지 472 분의 용출 시간 동안 용출된 분획이 활성을 나타낸다.
(2) D-α-갈락튜론산을 물에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 용액을 NaOH로 7.0으로 조정한다. 이것을 121℃에서 20분 동안 가열하고 이러한 가열-처리 용액의 HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성을 실시예 7의 방법에 의해서 측정해 보니, 가열-처리 산물이 아폽토시스-유도 활성을 나타낸다.
실시예 13
펙틴(Wako Pure Chemicals 제조; 코드 167-00542), 알긴산(비팽윤성; Wako Pure Chemicals 제조; 코드 011-13341), D-α-갈락튜론산(Nacalai Tesque 제조; 코드 165-18) 또는 D-글루큐론산(Nacalai Tesque 제조; 코드 169-28)을 증류수에 용해시켜 용액을 제조하여 농도를 1%로 만든다. 펙틴의 경우에, 1N 아세트산 수용액을 용해시킴으로써 또한 다른 용액을 제조한다.
이들 1% 용액 각각을 121℃에서 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 16시간 동안 가열하고 0.22㎛의 필터에 의해서 멸균하여 아폽토시스-유도 활성을 측정하기 위한 샘플을 제조한다.
이와 같이 제조한 샘플을 2, 5, 10, 20, 50 및 100배의 정도로 희석하고 이의 아폽토시스-유도 활성을 실시예 11에 기재된 MTT 방법에 의해서 분석한 다음 생성된 활성과 비교한다. 결과를 표 1 내지 5에 예시하였다.
(A) 펙틴의 1% 수용액의 pH는 3.4이다. 가열-처리 펙틴의 활성은 활성이 여전히 주지되는 최대 희석액의 의미에서 제시되었다. 표 1에 예시된 바와 같이, 활성은 120℃에서 4시간 동안의 가열 처리에 의해서 상당히 증가되었다.
펙틴 수용액의 가열 처리
가열 시간 가열전 pH 가열후 pH 조정후 pH 활성 (최대 희석)
2시간 3.4 3.3 7.0 2배
4시간 3.4 3.2 7.2 10배
16시간 3.4 3.5 7.0 20배
(B) 아세트산 1% 수용액 중의 펙틴의 pH는 2.6이다. 아세트산 용액의 활성은 활성이 여전히 주지되는 최대 희석액의 의미에서 제시되었다. 표 2에 예시된 바와 같이, 활성은 120℃에서 16시간 동안의 가열에 의해서 상당히 증가되었다.
펙틴-아세트산 수용액의 가열 처리
가열 시간 가열전 pH 가열후 pH 조정후 pH 활성 (최대 희석)
2시간 2.6 2.7 7.0 2배
4시간 2.6 2.6 7.2 5배
16시간 2.6 2.8 7.1 20배
(C) 가열전 갈락튜론산 수용액의 pH는 2.5이다. 가열-처리 갈락튜론산의 활성은 활성이 여전히 주지되는 최대 희석액의 의미에서 예시되었다. 표 3에 예시된 바와 같이, 활성은 120℃에서 1시간 동안의 가열에 의해서 상당히 증가되었다.
갈락튜론산 수용액의 가열 처리
가열 시간 가열전 pH 가열후 pH 조정후 pH 활성 (최대 희석)
30분 2.5 2.4 6.8 2배
1시간 2.5 2.4 6.9 10배
2시간 2.5 2.4 6.9 20배
4시간 2.5 2.4 6.8 50배
16시간 2.5 2.6 6.9 100배
(D) 가열전 글루큐론산 수용액의 pH는 2.4이다. 가열-처리 글루큐론산의 활성은 활성이 여전히 주지되는 최대 희석액의 의미에서 제시되었다. 표 4에 예시된 바와 같이, 활성은 120℃에서 30분 동안의 가열에 의해서 상당히 증가되었다.
글루큐론산 수용액의 가열 처리
가열 시간 가열전 pH 가열후 pH 조정후 pH 활성 (최대 희석)
30분 2.4 2.6 6.9 10배
1시간 2.4 2.7 6.9 20배
2시간 2.4 2.7 6.9 50배
4시간 2.4 2.6 7.0 100배
16시간 2.4 2.8 7.0 100배
(E) 가열전 알긴산 수용액의 pH는 3.3이다. 가열-처리 알긴산의 활성은 활성이 여전히 주지되는 최대 희석액의 의미에서 예시되었다. 표 5에 예시된 바와 같이, 활성은 120℃에서 2시간 동안의 가열에 의해서 상당히 증가되었다.
알긴산 수용액의 가열 처리
가열 시간 가열전 pH 가열후 pH 조정후 pH 활성 (최대 희석)
1시간 3.3 2.6 6.8 2배
2시간 3.3 2.5 6.9 10배
4시간 3.3 2.7 7.0 10배
16시간 3.3 2.9 7.3 20배
실시예 14
에탄올-세척 펙틴(Wako Pure Chemicals 제조; 코드 167-00542) (80% 에탄올로 세척하고, 50% 에탄올로 세척하고, 80% 에탄올로 세척하고 최종적으로 100% 에탄올로 세척한 다음 진공에서 건조하여 분말 형태의 거칠게 정제된 펙틴을 제조), 비세척 펙틴(Wako Pure Chemicals 제조; 코드 167-00542), 알긴산(비-팽윤성; D-맨뉴론산 유형; Wako Pure Chemicals 제조; 코드 011-13341), 알긴산(팽윤성; L-굴루론산 유형; Wako Pure Chemicals 제조; 코드 014-13331), D-글루큐론산(Nacalai Tesque 제조; 코드 169-28) 또는 D-α-갈락튜론산(Nacalai Tesque 제조; 코드 165-18)을 0.5g의 양으로 10개 시험 튜브(한 시험 튜브는 대조군으로서 사용되어 비가열)에 배치하고 샘플의 색채 변화를 검사하면서 공기중에서 120℃, 150℃ 또는 180℃에서 건조 상태에서 가열한다. 색채 변화에 따라서, 샘플링을 세 시점에서 수행하고 활성 성분을 하기의 방법으로 추출한다.
따라서, 이렇게 제조된 각각의 건조 샘플을 50% 에탄올 12.5 ㎖에 현탁한다. 현탁액을 실온에서 16시간 동안 교반하고 원심분리하여 추출물을 생성한다. 추출물을 농축하고 진공에서 건조하고 증류수에 재-용해시켜 초기 샘플의 양을 기준으로 농도를 1%로 만든다. 생성된 용액의 pH를 약 7로 조정하고 0.22㎛의 필터에 의해 멸균하여 활성 측정을 위한 샘플을 제조한다. 생성된 샘플을 실시예 11에 기재된 MTT 방법에 의해서 활성을 분석한다. 결과가 건조 가열 온도, 시간, 재-용해시 pH 및 조정후 pH와 함께 표 6 내지 11에 제시되어 있다. 또한 동일한 작업을 비가열 샘플에 대해서도 수행하지만 어떠한 활성도 주지되지 않는다. 표 6 내지 11에서, 활성은 여전히 활성을 나타내는 샘플의 희석도의 의미에서 제시되었다.
이러한 결과로부터, 활성 물질이 건조 가열에 의해서도 생성됨이 밝혀졌다.
EtOH-세척 펙틴의 열 처리
건조 가열 온도 (℃) 시간 (분) 재-용해시 pH 조정후 pH 활성(희석도)
180 60 3.7 6.9 1
180 120 3.5 6.8 1
펙틴의 열 처리
건조 가열 온도 (℃) 시간 (분) 재-용해시 pH 조정후 pH 활성(희석도)
180 120 3.9 7.0 1
알긴산의 열 처리 (D-맨뉴론산 유형)
건조 가열 온도 (℃) 시간 (분) 재-용해시 pH 조정후 pH 활성(희석도)
150 40 3.0 6.8 1
150 60 3.0 6.8 1
180 20 3.0 6.8 1
180 30 3.0 6.8 1
180 40 3.1 6.9 1
알긴산의 열 처리 (L-글루론산 유형)
건조 가열 온도 (℃) 시간 (분) 재-용해시 pH 조정후 pH 활성(희석도)
150 60 3.3 6.7 1
180 20 3.3 6.7 1
180 30 3.3 6.7 1
180 40 3.2 6.8 1
글루큐론산의 열 처리
건조 가열 온도 (℃) 시간 (분) 재-용해시 pH 조정후 pH 활성(희석도)
150 20 3.2 6.8 1
150 30 3.3 6.9 1
150 40 3.3 6.9 1
180 10 3.1 7.0 1
180 20 3.3 6.8 1
180 30 3.3 6.9 2
갈락튜론산의 열 처리
건조 가열 온도 (℃) 시간 (분) 재-용해시 pH 조정후 pH 활성(희석도)
120 60 2.9 6.9 1
120 120 2.9 6.9 1
150 20 2.9 6.8 2
150 30 2.9 6.9 2
150 40 2.9 6.8 2
180 10 2.9 7.1 2
180 20 2.9 6.8 2
180 30 2.9 6.8 1
실시예 15
사과로부터 제조된 시판 펙틴을 용해시켜 농도를 1%로 만들고 용액을 환류 응축기로 설비된 배-형 플라스크에 배치하고 110 내지 120 ℃로 18시간, 42시간 또는 66시간 동안 유지된 오일조에서 가열한다. 가열 동안 펙틴 용액의 온도는 100 내지 102 ℃이다.
생성된 펙틴 용액을 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 3배 또는 10배의 정도로 물로 희석하여 샘플을 제조한다. 희석된 샘플(10㎕)과 5,000 HL-60 세포를 함유하는 10% 태송아지 혈청을 함유하는 PRMI 1640 배지 100㎕를 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 5% 이산화탄소 존재시 37℃에서 48시간 동안 배양하고 활성을 실시예 11에 기재된 MTT 방법에 의해서 측정한다.
결과는 3배 희석된 펙틴 용액을 18시간 가열한 섹션과 또한 3배 및 10배 희석된 펙틴 용액을 42시간 및 66시간 동안 가열한 섹션에서 어떠한 생존 세포도 발견되지 않고 이렇게 하여 이러한 희석도의 농도에서, 100℃에서 가열된 펙틴이 활성을 나타낸다는 것이다.
한편, 18시간 동안 가열된 펙틴의 10배 희석 용액을 첨가한 섹션에서, 거의 모든 세포가 살아있으나 물을 첨가한 섹션인 대조군과 비교할 때, 590nm에서의 흡광도가 더 낮다.
실시예 16
포모신 펙틴 LM-13CG(Hercules 제조) (5kg)를 탭 워터 100ℓ에 첨가하고, 액체 온도가 28 내지 120℃로 상승하도록 증기를 35분 동안 쏘이고 120℃에서 5시간 동안 교반하면서 유지하고 냉각하여 냉각된 액체 135ℓ를 생성한다. 이러한 냉각된 액체에 Celite #545(Celite 제조) 1.35kg과 Silica #600-S(Chuo Silica 제조) 1.35kg을 필터로서 첨가하고 혼합물을 Celite #545(Celite 제조) 0.1kg과 Silica #600-S 0.1kg으로 예비코팅된 조밀한 필터(Advantec #327; 16 단계의 6-인치 여과지)를 통하여 여과한다. 생성된 여과물을 Plate Heater(Nichihan Seisakusho 제조)에 의해서 연속 순간 가열(98℃에서 60초 동안)로 투입한 다음 냉각함으로써 가열 처리 펙틴 용액 I 150ℓ를 제조한다.
가열-처리 펙틴 용액 I의 pH, 산도 및 당 함량은 각각 약 3.5, 6.2㎖ 및 5.8 Brix%이다. 또한, pH를 pH 측정계로 측정하고, 산도를 샘플 10㎖를 pH 7.0으로 중화하기 위해 요구되는 0.1N NaOH의 양(㎖)으로 제시하고 당 함량을 Brix 검당계에 의해 측정한다.
상기 가열-처리 용액 I의 사람 전골수구 백혈병 세포(HL-60 세포)에 대한 활성이 하기와 같이 측정된다.
따라서, HL-60(ATCC CRL-240)을 56℃에서 30분 동안 처리된 10% 태송아지 혈청(Nissui 제조)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco 제조)에서 37℃에서 배양하고 상기 배지로 현탁하여 농도를 2.5 x 105세포/4.5㎖로 만든다. 이러한 현탁액 4.5㎖에 물로 희석한 상기의 가열-처리 펙틴 용액 0.5㎖를 첨가하여 20mg/㎖, 10mg/㎖, 5mg/㎖, 2mg/㎖, 1mg/㎖, 0.5mg/㎖, 0.2mg/㎖ 또는 0.1mg/㎖의 농도를 만들고 혼합물을 37℃에서 5% 이산화탄소의 존재하에 24 또는 48 시간 동안 배양한다.
배양 세포에 트리판 블루 수용액을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 수 분 동안 방치하고 관찰을 광학 현미경 하에서 수행하고 이렇게 하여 트리판 블루를 분비하고 무색 세포 및 청색 세포를 생존 세포와 죽은 세포 각각에 대해 센다. 배양된 세포는 또한 광학 현미경 하에서 관찰해 보니, 핵의 응축, 세포의 수축 및 아폽토틱 바디의 생성이 가열-처리 펙틴을 1mg/㎖ 이상 첨가한 섹션에서 확인된다. 또한, 가열-처리 펙틴을 5mg/㎖ 이상 첨가한 섹션과 물 0.5㎖를 첨가한 대조군에서, 이러한 현상을 주지되지 않는다.
결과가 도 12에 도시되어 있다. 따라서, 도 12는 다양한 농도의 가열-처리 펙틴 용액을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가할 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 12에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 역삼각형은 가열-처리 펙틴 2mg/㎖를 첨가한 경우를 나타내며, 흑색 사각형은 가열-처리 펙틴 1mg/㎖를 첨가한 경우를 나타내며, 흑색 사방형은 가열-처리 펙틴 0.5mg/㎖를 첨가한 경우를 나타내며, 흑색 원은 가열-처리 펙틴 0.2mg/㎖를 첨가한 경우를 나타내며, 흑색 삼각형은 가열-처리 펙틴 0.1mg/㎖를 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 가열-처리 펙틴 50 내지 20 mg/㎖를 첨가한 경우에, 백색 역삼각형으로 도시된 바와 같이 가열-처리 펙틴 2mg/㎖를 첨가한 경우와 유사한 활성을 나타내고, 가열-처리 펙틴 1mg/㎖을 첨가한 경우, 항암 활성이 주지된다.
실시예 17
시판 D-글루큐론산(Sigma 제조; G5269)을 물에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 121℃에서 4시간 동안 가열하고 NaOH로 pH 7.0으로 중화하고 물로 10-, 40-, 80- 및 160-배로 희석한다. 희석된 가열-처리 글루큐론산 용액(0.5㎖) 각각을 2.5 x 105HL-세포를 함유하는 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 4.5㎖에 첨가하고, 배양을 37℃에서 24시간 동안 5% 이산화탄소 가스의 존재시에 수행하고 항암 활성을 세포 증식 억제를 위한 활성의 의미에서 실시예 7의 방법에 의해서 측정한다. 결과적으로, 10- 내지 80-배 희석 용액을 첨가한 섹션에서, 세포수 및 세포 생존율에 있어서의 감소가 주지된다. 40- 내지 80-배 희석 용액에서, DNA가 저분자로 됨이 밝혀졌다. 또한, %로의 세포의 생존율(R)을 하기의 공식에 의해 계산한다.
R = Vs/(Vs + Ds) x 100 + Dc(Vc + Dc) x 100
이 공식에서, Vs와 Ds는 샘플을 첨가한 섹션에서 각각 생존 세포와 죽은 세포의 수이고 Vc와 Dc는 물을 첨가한 섹션에서 각각 생존 세포와 죽은 세포의 수이다. R이 50%일 경우 배지 1㎖의 항암 활성을 1 유닛으로 정의한다.
세포의 생성된 생존율을 가열-처리 글루큐론산의 희석도의 통상의 대수값으로 작도할 경우, 모든 점은 하나의 직선 상에 존재하고 가열-처리 글루큐론산의 생존율 R(%)을 하기의 공식으로 계산한다.
R = 58.656X - 31.884
[이 공식에서, X는 가열-처리 글루큐론산의 희석도이다]
이 직선으로부터, 비희석 가열-처리 글루큐론산이 250 유닛/㎖에 해당함이 밝혀졌다.
결과가 도 13에 도시되어 있다. 따라서, 도 13은 다양한 희석도의 가열-처리 글루큐론산을 HL-60 세포에 첨가한 다음 24시간 동안 배양할 경우 희석도와 배양 배지내 세포의 생존율 간의 관계를 도시한다. 횡좌표는 희석도(배; 대수로)를 나타내고 종좌표는 세포의 생존율(%)을 나타낸다.
실시예 18
(1) 사과의 벗긴 과피의 퓨레(Maruzen Shokuhin Kogyo 제조), 바나나 퓨레(Ogawa Koryo 제조), 그린 비프스테이크 플랜트 추출물 1/4(Dan Foods 제조), 호박 추출물 60(Dan Foods 제조), 잘게 썬 호박(Dan Foods 제조), 셀러리 퓨레(Dan Foods 제조), 우엉 퓨레(Dan Foods 제조) 또는 에찰롯 추출물 60(Dan Foods 제조)의 25% 용액을 제조한다. 이들 각각을 121℃에서 40분 동안 가열한다. 동일한 방법에 의해서 제조된 용액을 121℃에서 4시간 동안 가열한다. 가열된 용액 각각을 냉각하고 여과하여 가열-처리 용액을 생성한다.
121℃에서 20분 동안 가열된 용액의 당 함량 및 pH가 표 12에 제시되어 있다.
출발 물질 당 함량(Brix) pH
사과의 벗긴 과피의 퓨레 3.6 3.6
바나나 퓨레 6.0 5.9
그린 비프스테이크 플랜트추출물 1/4 2.2 5.8
호박 추출물 60 16.8 5.3
잘게 썬 호박 4.0 5.7
셀러리 퓨레 1.6 5.5
우엉 퓨레 2.4 5.8
에찰롯 추출물 60 15.6 5.9
121℃에서 4시간 동안 가열된 용액의 당 함량 및 pH가 표 13에 제시되어 있다.
출발 물질 당 함량(Brix) pH
사과의 벗긴 과피의 퓨레 3.6 3.6
바나나 퓨레 5.5 4.6
그린 비프스테이크 플랜트추출물 1/4 2.5 5.3
호박 추출물 60 16.6 4.7
잘게 썬 호박 3.0 5.0
셀러리 퓨레 1.6 4.9
우엉 퓨레 2.5 4.8
에찰롯 추출물 60 13.8 4.3
각각의 가열-처리 용액의 경우에, 10,000 이하의 분자량을 갖는 분획이 실시예 17에 기재된 항암 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
이어서 당 함량(Brix)을 1로 조정하고 감각 수용성 시험을 각각의 가열-처리 용액에 대해 수행하고 이렇게 하여 모든 가열-처리 용액은 식품 또는 음료로서 양호한 감각 수용성을 나타낸다.
(2) 121℃에서 4시간 동안 가열된 바나나 퓨레, 사과 퓨레 및 셀러리 퓨레의 25% 수용액을 참고 실시예로 취하고 이의 항암 활성 유닛을 실시예 17의 방법에 의해서 측정한다. 결과가 표 14에 제시되어 있다. 따라서, 가열 처리의 결과로서, 항암 활성 물질이 각각의 처리 용액에 생성된다.
사용된 퓨레 활성 (단위/㎖)
바나나 퓨레 23.4
사과 퓨레 9.5
셀러리 퓨레 0.5
실시예 19
물(160㎖)을 (1)래디시 잎, (2)당근 잎, (3)당근, (4)양배추, (5)과피 없이 가지, (6)바나나 또는 (7)알베도의 하사쿠 오렌지 및 각각의 혼합물을 혼합기를 사용하여 균질화한다. 일부를 121℃에서 4시간 동안 가열하고 원심분리하고 이의 상등액을 NaOH로 pH 6으로 조정하여 샘플 A를 제조하고 반면에 나머지는 HCl로 pH 3로 조정하고 121℃에서 4시간 동안 가열하고 원심분리후의 상등액을 NaOH로 pH 6으로 조정하여 샘플 B를 제조한다.
(1) 내지 (7)로 제조된 샘플 (A)와 (B) 각각을 희석하고 희석된 용액 10㎕를 실시예 11에 기재된 MTT 방법에 의해서 항암 활성에 대한 측정을 수행한다. 결과가 표 15에 제시되어 있다. 표 15에 예시된 데이터는 활성이 여전히 주지되는 희석도이고 표시 "-"는 비희석 용액을 첨가한 섹션에서 어떠한 활성도 주지되지 않음을 나타낸다. 모든 과일과 채소에서, 활성의 생성이 가열-처리 산물에서 주지된다. 표에서, 희석도는 세포가 완전히 사멸되는 희석도이고 괄호의 값은 세포가 영향을 받는 희석도이다.
사용된 채소 및 과일 샘플 A의 희석도 샘플 B의 희석도
래디시 잎 1 (4) 2 (4)
당근 잎 - 1
당근 2 (4) 1 (2)
양배추 1 (4) 1
가지 1 (2) 1
바나나 2 (4) 2 (4)
웨이브 패킷 4 (8) 4 (8)
실시예 20
비팽윤성 알긴산(Wako Pure Chemicals 제조; 011-13341) 또는 팽윤성 알긴산(Wako Pure Chemicals 제조; 014-13331)을 물에 현탁시켜 농도를 1%로 만들고 pH는 3.32와 3.38이다. 이들 각각을 121℃에서 20분 동안 가열하고 항암 활성을 실시예 7의 방법에 의해서 HL-60 세포에 대한 증식 억제 활성으로서 측정한다. 또한, 배양 초기의 HL-60 세포 수는 3 x 105세포/5㎖이다.
결과가 도 14에 도시되어 있다. 따라서, 도 14는 가열-처리 비팽윤성 알긴산 또는 팽윤성 알긴산 용액을 HL-60 세포의 배양 배지에 첨가하여 농도를 1mg/㎖으로 만들 경우 배양 시간과 배양 배지내 생존 세포 수 간의 관계를 도시한다. 횡좌표는 배양 시간(시간)을 나타내고 종좌표는 배양 배지내 생존 세포 수(x 105세포/5㎖)를 나타낸다. 도 14에서, 백색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 대조군을 나타내고, 백색 사방형은 가열-처리 비팽윤성 알긴산을 첨가한 경우를 나타내며, 백색 삼각형은 가열-처리 팽윤성 알긴산을 첨가한 경우를 나타낸다. 따라서, 높은 활성이 가열-처리 비팽윤성 알긴산에서 주지된다.
실시예 21
알긴산 HFD(Dainippon Pharmaceutical 제조)의 1% 수성 현탁액을 제조하고 120℃에서 4시간 동안 가열 처리한다. 원심분리후 가열-처리 용액의 상등액을 실시예 17에 기재된 방법에 의해서 항암 활성을 측정하여 항암 활성 유닛을 계산한다. 따라서, 활성 물질의 생성이 가열-처리 알긴산에서 주지된다.
가열-처리 알긴산 HFD 활성 (단위/㎖)
가열된 1% 용액 83.3
실시예 22
알긴산 HFD(Dainippon Pharmaceutical 제조)(1g)를 물 50㎖에 혀탁하고 121℃에서 30분, 1시간, 2시간 또는 14시간 동안 가열한다. 각각의 가열-처리 용액을 원심분리에 의해서 제조하고 분자량을 측정한다. 분자량 측정을 하기의 조건하에서 수행한다.
가드 컬럼: TSK 가드 컬럼 PWH
컬럼: TSK 겔 G3000PW
용출 용액: 0.2M NaCl
검출: 210nm에서의 흡수에 의해서
가열 시간이 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 14시간일 경우, 주 피크로서 분자량 1,800; 1,200 및 630; 1,100 및 630; 1,100 및 630; 및 620 및 400의 저분자량 분해 산물을 각각 생성하고, 동시에 기타 저분자량 분해 산물을 또한 생성한다. 또한, 10,000 이상의 고분자량 물질을 함유하지 않고 항암 및 항균 활성이 500 이하의 분자량을 갖는 분획에서 발견되지 않는다.
실시예 23
(1) 시판 글루큐로노락톤(Merck 제조; 코드 번호 100282)을 물에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 용액을 121℃에서 0.5, 1, 2, 4 또는 16시간 동안 가열한다. 이렇게 제조된 각각의 가열 용액의 항암 활성을 실시예 17의 방법에 의해서 측정한다. 0.5 시간 동안 가열된 용액에서, 항암 물질의 생성이 주지된다. 가열 시간이 길수록, 더 많은 항암 물질이 생성되고, 4 및 16 시간 동안 가열된 각각의 산물에서, 생성은 0.5시간 동안 가열된 것의 약 10배임이 밝혀졌다.
(2) 상술된 글루큐로노락톤을 물에 용해시켜 농도를 0.1%, 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20%로 만들고 각각의 용액을 121℃에서 4시간 동안 가열한다. 각각의 가열-처리 용액의 항암 활성을 실시예 17의 방법에 의해서 측정한다. 항암 물질의 생성이 모든 농도에서 주지되지만, 사용된 글루큐로노락톤당 가열-처리 산물의 항암 활성의 효능은 글루큐로노락톤의 0.1% 수용액을 사용할 경우 가장 높다.
(3) 상술된 글루큐로노락톤 1% 수용액의 pH를 HCl 또는 NaOH로 1, 2, 3 또는 4.5로 조정하고 각각의 용액을 121℃에서 4시간 동안 가열한다. 이렇게 제조된 가열-처리 용액 각각의 항암 활성을 실시예 17의 방법에 의해서 측정한다. 항암 물질의 생성이 상기 pH값의 모든 경우에 주지되지만, 사용된 글루큐로노락톤당 pH 3 내지 4.5에서의 가열-처리 산물의 항암 활성은 pH 1에서의 활성의 15배이다.
(4) 시판 D-글루큐론산(Sigma 제조; G5269)을 물에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 121℃에서 5시간 동안 가열하고 pH가 조정되지 않은 샘플(pH: 2.6)과 pH가 NaOH로 6.6으로 조정된 샘플을 -20℃, 4℃ 및 37℃에서 저장하고 항암 활성을 실시예 17의 방법에 의해서 측정한다.
25일 동안의 저장후의 결과는 37℃에서 저장시, 가열-처리 산물의 항암 활성이 다소 감소되지만, 4℃ 및 -20℃의 경우에 활성이 가장 안정하다는 것이다.
실시예 24
포모신 펙틴 유형 LM-13CG(Hercules 제조), 알긴산 HFD(Dainippon 제조), D-글루큐론산(Nacalai Tesque 제조) 또는 글루큐로노락톤(Merck 제조)을 물에 용해시키고 현탁하여 농도를 1%로 만들고 용액 또는 현탁액을 90℃, 121℃ 또는 132℃에서 16시간 동안 가열한다. 이러한 가열-처리 산물의 항암 활성 유닛을 실시예 17의 방법에 의해서 측정한다. 결과가 표 17에 제시되어 있다.
가열된 물질 가열 온도 (℃) 활성 (단위/㎖)
펙틴 95 1.2
121 32.3
132 1.4
알긴산 95 1.0
121 57.9
132 25.7
글루큐론산 95 40.8
121 345
132 30.2
글루큐로노락톤 95 42.7
121 5,376
132 33.8
실시예 25
(1) 사과 펙틴(1.5g; Wako Pure Chemicals 제조)을 물 100㎖에 현탁하고 현탁액을 NaOH로 pH 12로 조정한다. 이것을 NaOH의 점진적인 첨가에 의해서 pH를 유지하면서 4℃에서 교반한다. 그후 8시간 경과시, pH 감소가 관찰된다. 24시간 후, 현탁액을 HCl로 pH 5로 조정하고 에탄올 용적에 의해 4배를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 교반하고 여과지를 통하여 여과한다. 생성된 침전물을 65% 에탄올, 이어서 99.5% 에탄올로 세척한 다음 진공에서 건조하여 펙트산 1.32g을 생성한다.
(2) 상기의 (1)에서 수득된 펙트산(200mg)을 물 200㎖에 용해시키고 농축된 HCl 2㎖를 여기에 서서히 첨가한다. 혼합물을 80℃에서 66시간 동안 가열하고 20,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 상등액과 침전물을 생성한다. 상등액을 NaOH로 pH 7로 조정하고 절단 분자량 1000을 갖는 투석막을 사용하여 물에 대해서 투석하고 동결건조하여 산-용성 분획 18.4mg을 생성한다. 침전물을 물 30㎖에 현탁하고 NaOH로 pH 6으로 조정하고 절단 분자량 1000을 갖는 투석막을 사용하여 물에 대해서 투석하고 동결건조하여 산-불용성 분획 114mg을 생성한다.
(3) 상기의 (2)에서 수득된 산-용성 및 산-불용성 분획을 물에 용해시켜 1% 용액을 제조하고 용액을 HCl로 pH 3으로 조정하고 121℃에서 20분 동안 가열한다. 생성된 가열-처리 산물의 항암 활성을 실시예 2에 기재된 바와 같이 알라마블루를 사용하는 방법에 의해서 세포 증식 억제 활성을 측정함으로써 측정한다. 결과적으로, 항암 활성이 가열-처리 산물의 산-용성 분획에서 주지된다.
실시예 26
(A) D-글루큐론산(Nacalai Tesque 제조, 코드 169-28)을 증류수에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 용액을 120℃에서 밤새 가열하고 pH를 NaOH로 약 7로 조정한다. 이러한 가열-처리 글루큐론산의 항균 활성을 하기와 같이 조사한다.
따라서, 시험될 미생물을 L-육즙의 시드 배양액(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 0.5% NaCl; pH: 7.0)에서 밤새 배양한다. 시드-배양액(5㎕)을 가열-처리 글루큐론산 50, 100, 250, 500 또는 1000 ㎕를 L-육즙 5㎖에 첨가함으로써 제조하고 배양액을 37℃에서 교반하면서 배양하여 생장을 관찰한다. 배양 초기 및 시간 후에, 배양액의 탁도를 Fuji 디지탈 탁도계(Fuji Kogyo KK에 의해 시판; Akiyama Denki Seisakusho 제조)를 사용하여 조정 규모가 82.3인 조건하에서 8시간 후의 값에서 초기 단계의 값을 뺌으로써 수득된 값(생장 탁도)에 의해서 측정하여 시험 미생물의 생장을 측정한다. 또한, 시험 미생물(6)의 경우에, 뇌 심장 주입 배지를 L-육즙 대신에 사용한다.
시험된 미생물은 이. 콜라이 HB 101 (ATCC 33694; 시험 미생물(1)); 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) LT-2 (ATCC 27106; 시험 미생물 (2)); 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (IFO 3080; 시험 미생물 (3)); 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 3A (NCTC 8319; 시험 미생물 (3)); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (IFO 3034; 시험 미생물 (5)); 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)GS5 (the National Institute of Health에 보관; 시험 미생물 (6))이다.
(생장 탁도)
시험 미생물 가열-처리 산물의 양(㎕/5㎖ 매질)
0 50 100 250 500
(1) 239 183 89 6 10
(2) 247 177 36 5 11
(3) 273 262 212 237 61
(4) 285 251 247 20 11
(5) 280 258 205 73 13
(6) 140 136 131 125 10
가열-처리 산물은 100 내지 500 ㎕/5㎖ 첨가시 각 시험 미생물의 항균 활성을 나타낸다. 또한, 가열-처리 산물은 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 장독소-생성 S. 아우레우스, 구토형 바실러스 세레우스, 설사형 바실러스 세레우스 및 장출혈성 이. 콜라이 O-157에 대한 항균 활성을 나타낸다.
(B) 식품 첨가제(알긴산 HFD; Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. 제조)용 알긴산을 증류수에 용해시켜 농도를 1%로 만들고 용액을 120℃에서 밤새 가열하고 pH를 NaOH로 약 pH 7로 조정한다. 상술된 방법에서와 같이, 이러한 가열-처리 알긴산 용액을 250 내지 1000 ㎕의 양으로 첨가하고 시험 미생물 (1) 내지 (6)에 대한 항균 활성을 시험한다. 시험 미생물 (6)의 경우에, 용액을 1500㎕ 정도로 첨가한다. 결과가 표 19에 제시되어 있다.
(생장 탁도)
시험 미생물 가열-처리 산물의 양(㎕/5㎖ 매질)
0 250 500 1000 1500
(1) 239 30 8 13 -
(2) 247 10 8 12 -
(3) 273 233 188 30 -
(4) 285 222 12 15 -
(5) 280 158 22 13 -
(6) 140 138 130 101 12
가열-처리 산물은 250 내지 1500㎕/5㎖ 첨가시 각각의 시험 미생물에 대한 항균 활성을 나타낸다. 또한, 가열-처리 산물은 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 장독소-생성 S. 아우레우스, 구토형 바실러스 세레우스, 설사형 바실러스 세레우스 및 장출혈성 이. 콜라이 O-157에 대한 항균 활성을 나타낸다.
실시예 27
시판 사과 펙틴(5g)을 200mM NaCl 500㎖에 용해시키고 NaOH로 pH 7.0으로 조정한다. 이 용액을 121℃에서 30분 동안 가열하고 NaOH로 pH 7.0으로 재조정한다. 이것을 12,000 rpm(약 10,000 x g)에서 30분 동안 원심분리하고 생성된 계면활성제(이후 본원에서 "샘플"로 언급함)의 항암 작용을 시험한다.
마우스 충실성 암종 Meth A (4 x 106세포/마우스)를 10주된 BALB/c 마우스(암컷; 체중 약 20g)의 복부에 피하 주사한다. 그런 다음, 샘플(100mg/kg/일)을 이후 10일 동안 동일한 장소에 피하 주사한다.
한편, 샘플 대신에 생리식염수 용액을 동일한 방법으로 대조군 그룹에 피하 주사한다. 2주후, 마우스의 복부에 형성된 충실성 암종 조직을 절제하여 중량을 측정한다. 결과가 표 20에 제시되어 있다. 따라서, 대조군 그룹에서 암종의 평균 중량은 1.26g이고 반면에, 샘플을 투여한 그룹에서 0.88g이며, 이렇게 하여 암에 대한 억제율은 약 30.1%이고 항암 작용이 샘플에서 주지된다.
절제된 암종의 중량 (g) 억제율 (%)
대조군
1.23
1.21
1.34
1.52
1.74
1.15
1.09
0.76
평균 1.26±0.10 0%
샘플이 투여된 그룹
1.69
1.61
0.33
0.14
0.17
0.99
1.21
평균 0.88±0.25 30.1%
실시예 28
쥐 백혈병 세포주 P-388(1 x 106세포/㎖)를 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중의 실시예 27에서 제조된 샘플(1mg/㎖)과 함께 시험관에서 6시간 동안 배양하고, 그런 다음, 생성된 것의 1㎖/마우스를 그 자체로 5주된 DBA/2 마우스(암컷; 체중 약 20g)에 복강 주사한다. (P-388: 1 x 106세포/마우스; 샘플: 50mg/kg)
한편, 대조군 그룹에서, 동일한 조건하에서 배양된 P-388을 샘플 대신에 생리식염수 용액과 함께 쥐로 주사한다.
두 그룹(각각의 그룹은 8마리의 쥐를 포함)에서, 생존수, 평균 생존일 및 생존율을 계산하고 결과를 도 15에 도시하였다. 따라서, 도 15는 백혈병 세포에 대한 샘플의 항암 작용을 나타내는데, 횡좌표와 종좌표는 각각 마우스의 생존일 및 생존수이다. 도에서, 점선과 실선은 각각 대조군 그룹과 샘플로 투여된 그룹이다. 따라서, 대조군 그룹에서 평균 생존일은 8.0일이고, 반면에 샘플을 투여한 그룹에서 평균 생존일은 14.6일이며, 이렇게 하여 생존율은 182.5%이고 상당한 생존 효과가 샘플에서 주지된다.
동시에 수행하는 실험에서, 6시간 동안의 시험관 배양후 샘플을 첨가하고 첨가하지 않은 그룹 사이에 P-388의 생존율의 의미에서 차이는 없고 세포 생존율은 두 그룹 모두에서 100%이다.
실시예 29
갈락튜론산 또는 글루큐론산을 증류수에 용해시켜 농도를 50mg/㎖로 만들고 121℃에서 20분 동안 가열하고 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정한다. 이것을 목적하는 농도로 생리식염수 용액으로 희석하고 하기의 시험에 투입한다.
(1) Meth A 세포(4 x 106세포/마우스)를 8주된 BALB/c 마우스(암컷; 체중 약 20g)의 복부에 피하 주사한다. 그런 다음, 가열-처리 갈락튜론산(100mg/kg/일) 또는 가열-처리 글루큐론산(100mg/kg/일)을 이후 10일 동안 동일한 장소에 피하 주사한다.
2주후, 마우스의 복부에 형성된 암종 조직을 절제하여 중량을 측정한다. 결과가 표 21에 제시되어 있다. 따라서, 대조군 그룹에서 암종의 평균 중량은 1.48g이고 반면에, 가열-처리 갈락튜론산을 투여한 그룹과 가열-처리 글루큐론산을 투여한 그룹에서 각각 0.94g과 0.86g이며, 이렇게 하여 억제율은 각각 약 26.5%와 41.9%이다. 따라서, 상당한 항암 작용(대조군에 대해 p<0.05)이 두 그룹 모두에서 주지된다.
마우스의 수 암종 중량(g)(평균 ± SD) 억제율
대조군 8 1.48 ± 0.54 -
하기로 투여된 그룹
가열-처리 갈락튜론산 6 6 0.94 ± 0.25 26.5%
가열-처리 글루큐론산 7 7 0.86 ± 0.31 41.9%
(2) 육종-180 (5.5 x 106세포/마우스)을 6주된 16마리 암컷 ICR 마우스(체중: 약 26g)의 복부에 피하 주사하고 대조군을 위한 8마리 마우스와 가열-처리 글루큐론산을 투여한 그룹을 위한 8마리 마우스로 분리한다.
가열-처리 글루큐론산 투여 그룹은 가열-처리 글루큐론산이 가열-처리 글루큐론산의 용량을 약 1g/kg/일로 제조하기 위해서 산을 탭 워터로 희석하는 물-공급 병으로부터 자유롭게 공급된다. 대조군 그룹에서, 탭 워터가 동일한 방법으로 제공된다. 공급물에 관하여, 두 그룹 모두 실험 기간 동안 자유롭게 취하도록 한다.
Sarcoma-180의 피하 주사로부터 35일 후 생존수는 대조군 그룹에서 8마리 중 2마리이고 반면에 가열-처리 글루큐론산 투여 그룹에서 8마리 중 8마리이다. 따라서, 가열-처리 글루큐론산의 경구 투여에 의한 현저한 생존 효과가 주지된다.
실시예 30
마우스 백혈병 세포주 P-388(1 x 106세포/㎖)을 실시예 29에서 제조된 가열-처리 갈락튜론산(1mg/㎖) 또는 가열-처리 글루큐론산(1mg/㎖)과 함께 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 시험관에서 6시간 동안 배양한 다음 1㎖를 DBA/2 마우스(암컷; 체중 약 20g)에 복강 주사한다 (P-388:1 x 106세포/마우스; 가열-처리 산: 50mg/kg). 대조군에 생리식염수 용액과 함께 동일한 조건하에서 배양된 P-388 세포(1 x 106세포/마우스)를 주사한다. 또한, 동시에 수행하는 실험에서, 6시간 동안의 시험관 배양후 가열-처리 산을 투여한 그룹과 생리식염수 용액을 투여한 그룹 사이에 P-388의 생존율의 의미에서 차이는 없고 생존율은 두 그룹 모두에서 100%이다.
각각의 8마리의 마우스를 각각의 그룹에 대해 사용하고 평균 생존일 및 생존율을 마우스의 생존수로부터 계산한다.
결과가 도 16에 도시되어 있다. 따라서, 도 16은 P-388 세포의 이식후 일수와 각 그룹 마우스의 생존수 사이의 관계를 도시하는데, 횡좌표는 마우스의 생존수를 나타내고 종좌표는 마우스의 생존일을 나타낸다. 도에서, 실선, 점선 및 두점 쇄선은 각각 대조군, 가열-처리 갈락튜론산을 투여한 그룹 및 가열-처리 글루큐론산을 투여한 그룹을 나타낸다.
도 16의 결과로부터 계산된 바와 같이, 대조군 그룹에서 평균 생존일은 11.4일이고, 반면에 가열-처리 갈락튜론산(50mg/kg)을 투여한 그룹에서 평균 생존일은 23.5일 이상이고 생존율은 세포 이식 24일 후 206.1% 이상이며, 가열-처리 글루큐론산(50mg/kg)을 투여한 그룹에서 평균 생존일은 16.8일이고 생존율은 146.3%이며, 이렇게 하여 대조군과 비교하여 상당한 생존 효과가 주지된다.
실시예 31
D-글루큐론산(10g) (Sigma에 의해 제조된 G5269)을 물 1ℓ에 용해시키고, 121℃에서 4시간 동안 가열하고 NaOH로 pH 7.0으로 중화한다.
가열 처리 산물(500, 5 또는 0.05㎍/㎖)을 HL-60 세포(ATCC CCL-240) 1 x 105/㎖를 함유하는 10% 태송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 첨가하고 37℃에서 3일 동안 5% 29
이산화탄소 가스의 존재하에 배양한다. 이어서 배양 세포의 일부를 슬라이드 글래스에 바르고, 문헌(참조: page 191 of "Tissue Culture Techniques", edited by Japan Tissue Culture Society, published by Asakura Shoten, 1982)에 기재된 Wright-Giemsa 균주에 투입하고 분화도를 광학 현미경 하에서 관찰한다. 결과는 첨가된 가열-처리 글루큐론산의 농도에 따라서, 암세포가 단핵세포 또는 마크로파지형 세포로 분화되고 배양 세포내 성숙한 골수 세포의 비가 증가한다는 것이다. 결과가 도 17에 도시되어 있다. 따라서, 도 17은 배양 시간과 배양 세포내 골수 세포의 비 간의 관계를 나타내는데, 횡좌표와 종좌표는 각각 배양 시간(일)과 배양 세포내 성숙한 골수의 비(%)를 나타낸다. 도 17에서, 흰색 사각형은 샘플을 첨가하지 않은 그룹(대조군)을 나타내고; 백색 사방형은 가열-처리 글루큐론산 500㎍/㎖를 첨가한 그룹을 나타내며; 백색 원은 가열-처리 글루큐론산 5㎍/㎖를 첨가한 그룹을 나타내며; 백색 삼각형은 가열-처리 글루큐론산 0.05㎍/㎖를 첨가한 그룹을 나타낸다.
실시예 32
가열-처리 글루큐론산의 항궤양 작용
D-글루큐론산(Sigma에 의해 제조된 G5269)을 증류수에 용해시켜 농도를 10mg/㎖로 만들고 121℃에서 4시간 동안 가열하고, 1N NaOH로 pH 7.0으로 조정하고 동결 건조에 의해서 200mg/㎖로 농축하여 가열-처리 글루큐론산 농축물을 제조한다. 이것을 하기의 실험에 투입한다.
Wistar 균주 래트(체중: 220 내지 295 g)를 실험 개시 3시간 전에 물이 공급되지 않으므로 24시간 동안 절식시킨다.
99.5% 에탄올 1㎖를 래트에 경구로 공급하고, 한시간 후, 위장을 에테르 마취하에서 절제한다. 절제된 위장의 유문 및 분문을 결찰하고 1% 포르말린 용액을 주입시키고 위장을 용액에서 10분 동안 액침한다. 이어서 위장을 더욱 큰 만곡에 따라서 절단하고 위장 선 부위에 생성된 종양의 길이(mm)를 측정한다.
가열-처리 글루큐론산을 투여한 그룹에서, 상술된 가열-처리 글루큐론산 농출물을 에탄올의 투여 30분 전에 1g/kg의 비율로 경구로 제공한다. 희석된 물을 동일한 방법에 의해서 대조군으로 제공한다.
에탄올 투여로부터 1시간 후 궤양의 길이는 대조군(N = 6)에서 78.2 ± 28.5 mm(평균 ± 표준 유도)이고, 반면에 가열-처리 글루큐론산을 투여한 그룹(N = 3)에서 궤양은 전혀 주지되지 않고, 이렇게 하여 상당한 항궤양 작용이 주지된다.
실시예 33
주사
실시예 8에 기재된 바와 같이 에탄올-처리 상등 분획의 증발에 의해 제조된 샘플에 주사를 위해 증류수를 용해시켜 1% 용액을 제조한다. 이 용액을 상등 분획으로부터 상기에 기재된 샘플을 기준으로 10g/바이알의 양으로 동결건조를 위해 바이알에 패킹한 다음 동결 건조한다. 생리식염수 용액(2㎖)을 용해를 위한 용매로서 분리하여 부착한다.
실시예 34
주사
갈락튜론산을 주사를 위해 증류수에 용해시켜 농도를 10mg/㎖로 만들고, 121℃에서 20분 동안 가열하고, 냉각하고 중화하여 가열-처리 산의 중성 용액을 제조한다. 이 용액을 건조된 가열-처리 산을 기준으로 50mg의 양으로 바이알에 패킹한 다음 동결 건조한다. 생리식염수 용액(2㎖)을 용해를 위한 용매로서 분리하여 부착한다.
실시예 35
정제
정제를 하기의 제형에 따라 제조한다.
가열-처리 펙틴산 10mg
옥수수 전분 65mg
카복시메틸셀룰로스 20mg
폴리비닐피롤리돈 3mg
마그네슘 스테아레이트 2mg
총 정제당 100mg
펙틴을 실시예 7에 기재된 방법에 의해서 가열하고 중화하고 동결-건조하여 생성된 동결-건조 산물을 가열-처리 펙틴으로 사용한다.
실시예 36
녹차 잎 10g, 비타민 C 0.2g 및 탈이온수 1,000㎖를 사용하여 통상적인 방법에 따라 녹차를 제조한다. 실시예 16에 기재된 가열-처리 펙틴 용액 I을 50mg(고체를 기준으로)의 양으로 산물 100㎖에 첨가하여 본 발명의 산물 (1)을 제조한다. 대조군은 아무것도 첨가하지 않은 것이다. 감각 수용성 평가(점수 5가 양호하고 점수 1이 불리한 5-점수 방법에 의해서)를 20명의 패널리스트에 의해서 수행하고 결과의 평균을 표 22에 예시하였다.
감각 수용성 평가
산물 (1) 대조군
맛의 폭 4.1 3.2
맛의 균형 3.8 3.4
총 맛 4.1 3.3
표 22로부터, 평가는 대조군과 비교하여, 본 발명의 (1)이 더욱 방대하고 광범위한 맛과 잘-균형된 맛을 지녀, 차의 풍미 및 맛을 개선하고 "은닉된 풍미"의 효과가 달성된다는 것이다.
실시예 37
알콜 음료를 표 23에 예시된 바와 같은 조제에 따라서 통상적인 방법으로 제조한다.
조제의 표
Citrus unshiu의 냉동 농축 쥬스(45 Brix도) 110g
과립화 당 80g
시트러스산 2g
나트륨 시트레이트 0.5g
오렌지 에센스 2g
5% (v/v) 알콜 수용액 평형
총 1,000㎖
주의: 이렇게 제조된 음료를 5℃에서 냉각한 다음 소다 사이폰에 의해서 카본산을 함유하도록 제조한다.
실시예 16에 기재된 가열-처리 펙틴 용액 I을 산물 100㎖에 45mg(고체를 기준으로)의 양으로 첨가하여 본 발명의 산물 (2)를 제조한다. 대조군은 아무것도 첨가하지 않은 것이다. 감각 수용성 평가를 실시예 36에서와 동일한 방법으로 수행한다. 결과가 표 24에 제시되어 있다.
감각 수용성 평가
산물 (2) 대조군
맛의 폭 3.9 3.3
맛의 균형 4.0 2.7
총 맛 3.9 3.0
표 24에 예시된 바와 같이, 평가는 대조군과 비교하여, 본 발명의 산물 (2)가 더욱 방대하고 광범위한 맛과 잘-균형된 맛을 지님이 주지된다. 특히 이 산물 (2)에서, 산성 맛은 더욱 온화하게 되고 결론은 큰 만다린(Citrus unshiu)의 풍미와 맛이 증진된다는 것이다.
실시예 38
본 발명의 산물 (3)을 실시예 9의 가열-처리 펙틴 용액을 최종 산물 100㎖당 35mg(고체로서)의 양으로 첨가함으로써 통상적으로-제조된 사케(일본 곡주)로부터 제조한다. 가열-처리 펙틴 용액을 첨가하지 않은 것을 대조군으로서 사용한다.
감각 수용성 평가를 실시예 36에서와 동일한 방법에 의해서 수행한다. 향 및 혀에서의 미감을 평가 항목에 첨가하고 결과를 표 25에 제시하였다.
감각 수용성 평가
산물 (3) 대조군
맛의 폭 3.8 3.0
맛의 균형 3.4 2.9
향 2.9 2.9
혀에서의 미감
온화함 3.8 2.6
부드러움 4.0 2.9
총 맛 3.6 2.8
표 25에 예시된 바와 같이, 대조군과 비교하여, 본 발명의 산물 (3)이 더욱 방대하고 광범위한 맛 및 개선된 혀에서의 미감을 지니고 따라서 테이블 럭셔리로서 마실 때 맛과 느낌이 개선됨이 주지된다.
실시예 39
본 발명의 산물 (4)(미린-달콤한 사케)와 산물 (5)(발효 조미료)를 실시예 16의 가열-처리 펙틴 용액 I을 각각의 최종 산물 100㎖당 40mg(고체로서)의 양으로 첨가함으로써 통상적으로-제조된 미린 및 발효 조미료로부터 제조한다. 가열-처리 펙틴 용액을 첨가하지 않은 산물을 대조군으로서 사용한다.
감각 수용성 평가를 실시예 36에서와 동일한 방법에 의해서 수행한다. 결과를 표 26에 제시하였다.
감각 수용성 평가
미린 발효 조미료
산물(4) 대조군 산물(5) 대조군
맛의 폭 3.8 3.0 2.9 2.4
맛의 균형 3.5 3.0 2.7 2.1
총 맛 3.6 3.1 2.8 2.2
표 26에 예시된 바와 같이, 각각의 대조군과 비교하여, 본 발명의 산물 (4) 및 (5)는 맛의 균형 및 폭에서의 개선을 나타내고 따라서 깊은 맛을 갖는 조미료를 제조할 수 있음이 주지된다.
실시예 40
피시 분말(4.7kg), 해조류 0.8kg, 참깨 2.5kg, 소금 0.1kg 및 나트륨 글루타메이트 0.5kg을 혼합하고 혼합물을 통상적인 방법에 의해서 과립화하여 furikake(조미된 피시 풍미)를 제조한다.
본 발명의 산물 (6)을 산물 100g당 실시예 9의 가열-처리 펙틴 용액 II 1,000mg(고체로서)을 첨가함으로써 제조한다. 가열-처리 펙틴 용액을 첨가하지 않은 것을 대조군으로서 사용한다. 이들을 끊인 밥 위에 뿌리고 시식시 느낌으로의 감각 수용성 평가를 실시예 36에서와 동일한 방법으로 수행한다.
결과는 대조군과 비교하여, 입안에서 끓인 밥과 잘 어울리는 본 발명의 산물 (6)이 잘-균형된 맛과 온화한 끝맛을 갖고 대체로 furikake로서 개선된 질을 나타낸다.
실시예 41
음료를 가열-처리 음료와 과일을 사용하여 제조한다. 조제가 표 27에 예시되어 있다.
당근 (지하경) 200g
파인애플 (과일) 500g
바나나 (과일) 500g
과립화 당 76g
무수 시트르산 2g
물 균형
총 2000g
표 27에 예시된 바와 같이 조제시 각각의 당근, 파인애플 및 바나나를 잘 교반하고 시판 혼합기를 사용하여 분해하여 각각의 퓨레를 제조한다. 이어서 이들 퓨레 각각을 121℃에서 4시간 동안 밀폐 상태로 가열하고, 그런다음 이들을 상기 표에 따라서 혼합하여 본 발명의 음료를 제조한다.
한편, 이들 음료/과일 각각을 가열하지만, 이의 분해 산물을 상기의 표에 따라 혼합하여 대조군 음료를 제조한다. 본 발명의 산물 및 대조군의 감각 수용성 평가를 실시예 36에서와 동일한 방법으로 수행한다. 결과가 표 28에 예시되어 있다.
본 발명의 산물 대조군
향 3.5 3.0
맛 4.0 2.6
조직 4.3 3.2
총 평가 4.0 2.8
평 온화함; 잘-혼합된 맛;통합된 향의 느낌;혀에서의 온화한 미감 온화한 맛이 아님;분리된 맛;향은 잘-균형되지 않음;혀에서 약간 거침
표 28로부터, 대조군과 비교하여, 본 발명의 산물은 온화한 느낌을 지니고, 잘-혼합된 맛을 나타내며, 통합된 느낌의 향을 지니며, 혀에서의 온화한 미감을 나타내고 이렇게 하여 적합한 음료가 제조됨이 주지된다.
본 발명의 약제는 감염성 질환, 저하 또는 상승 면역 기능, 암 질환, 바이러스 질환, 궤양, 치근막 질환 등에 대한 치료제로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 아폽토시스-유도 방법은 아폽토시스와 생체의 방어 메커니즘, 면역 기능과 암 및 바이러스 질환 간의 관계의 연구 및 아폽토시스 유도를 위한 억제제 개발에 유용하다. 특히, 본 발명의 식용 산물의 당 화합물은 식품으로 오랜 역사를 지니고 이로부터 제조된 본 발명의 가열-처리 산물은 경구로 제공될 때 매우 안전하다. 또한, 본 발명의 가열-처리 산물을 함유하는 식품 또는 음료, 본 발명의 가열-처리 산물을 첨가하고/하거나 희석시킴으로써 제조된 식품 또는 음료, 식품 또는 음료에 대한 방부제는 아폽토시스-유도 작용, 항암 작용, 항맥관형성 작용, 항바이러스 작용, 항궤양 작용 등으로 인하여 매우 안전하고 위장암, 인플루엔자 바이러스에 의한 감기와 같은 바이러스 질환, 궤양 등의 예방 및 치료에, 또한 간 기능 개선에 매우 유용함이 당연한 일이다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명의 가열-처리 산물은 저비용으로 쉽게 제조할 수 있고, 식품 또는 음료에 첨가제로서 사용시, 다양한 생리학적 기능, 다양한 생리학적 기능으로 인한 항균 작용, 아폽토시스 유도 작용, 항암 작용, 항바이러스 작용 등을 제공할 수 있고 이렇게 하여 본 발명의 가열-처리 산물은 식품 또는 음료에 첨가제로서 , 특히 식품 및 음료에 대한 방부제로서 매우 유용하다.

Claims (25)

  1. 하기의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열함으로써 수득된 산물.
    (a) 우론산 또는 우론산 유도체;
    (b) 우론산 함유 당 화합물 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물; 및
    (c) 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질.
  2. 제 1 항에 있어서, 우론산이 갈락튜론산, 글루큐론산, 글루론산, 맨뉴론산 및/또는 이듀론산인 가열-처리 산물.
  3. 제 1 항에 있어서, 유도체가 우론산 락톤, 우론산 에스테르, 우론산 아미드 또는 이의 염인 가열-처리 산물.
  4. 제 1 항에 있어서, 당 화합물이 펙틴, 펙트산, 알긴산, 히알루론산, 헤파린, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴, 더마탄 설페이트 및/또는 이의 분해 산물 중에서 선택되는 당 화합물인 가열-처리 산물.
  5. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열-처리 산물이 60 내지 350℃에서 수 초 내지 수 일 동안 가열함으로써 수득되는 가열-처리 산물.
  6. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열-처리 산물이 산성 내지 중성 조건하에서 가열함으로써 수득되는 가열-처리 산물.
  7. 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열-처리 산물이 분자량 분획화에 의해서 수득되는 산물인 가열-처리 산물.
  8. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 기재된 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는 식품 또는 음료.
  9. 제 8 항에 있어서, 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 가열-처리 산물을 첨가하고/하거나 희석함으로써 제조되는 식품 또는 음료.
  10. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 기재된 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는, 항암 작용을 갖는 식품 또는 항암 작용을 갖는 음료.
  11. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 기재된 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는 항균제.
  12. 제 11 항의 항균제를 함유함을 특징으로 하는 방부제.
  13. 제 11 항의 항균제를 함유함을 특징으로 하는 치마제.
  14. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는 아폽토시스-유도제.
  15. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는 항암제.
  16. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 암세포 분화 유도제.
  17. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 가열-처리 산물을 함유함을 특징으로 하는 항궤양제.
  18. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항의 가열-처리 산물을 유효 성분으로서 사용함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도 방법.
  19. 하기의 (a), (b) 및 (c) 중에서 선택된 적어도 하나의 물질을 가열하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 가열-처리 산물의 제조 방법.
    (a) 우론산 또는 우론산 유도체;
    (b) 우론산 함유 당 화합물 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물; 및
    (c) 우론산 함유 당 화합물을 함유하는 물질 또는 우론산 유도체 함유 당 화합물을 함유하는 물질.
  20. 제 19 항에 있어서, 우론산이 갈락튜론산, 글루큐론산, 글루론산, 맨뉴론산 및/또는 이듀론산인 가열-처리 산물의 제조 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 유도체가 우론산 락톤, 우론산 에스테르, 우론산 아미드 또는 이의 염인 가열-처리 산물의 제조 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 당 화합물이 펙틴, 펙트산, 알긴산, 히알루론산, 헤파린, 퓨코이단, 콘드로이틴 설페이트, 콘드로이틴, 더마탄 설페이트 및/또는 이의 분해 산물 중에서 선택되는 당 화합물인 가열-처리 산물의 제조 방법.
  23. 제 19 항 내지 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열이 60 내지 350℃에서 수 초 내지 수 일 동안 수행되는 처리인 가열-처리 산물의 제조 방법.
  24. 제 19 항 내지 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열이 산성 내지 중성 조건하에서 수행되는 처리인 가열-처리 산물의 제조 방법.
  25. 제 19 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 가열-처리 산물의 분자량 분획화 수행 단계가 포함되는 가열-처리 산물의 제조 방법.
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