WO1997033593A1

WO1997033593A1 - Produit obtenu par traitement thermique d'acide uronique, et aliments, boissons ou medicaments contenant ce produit

Info

Publication number: WO1997033593A1
Application number: PCT/JP1997/000527
Authority: WO
Inventors: Nobuto Koyama; Hiroaki Sagawa; Eiji Kobayashi; Tatsuji Enoki; Hua-Kang Wu; Eiji Nishiyama; Suzu Deguchi; Katsushige Ikai; Hiromu Ohnogi; Motoko Ueda; Akihiro Kondo; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-02-25
Publication date: 1997-09-18
Also published as: TW510798B; AU1735097A; CN1213310A; CA2248648A1; US6482806B1; KR19990087665A; JP4302186B2; EP0888776A1; US20030176393A1; EA199800829A1; EA001535B1; CN1114410C; US20050202064A1; EP0888776A4

Description

ゥ口ン酸類の加熱処理物、それを含有する食品、飲料又は医薬発明の属する技術分野

本発明の目的は、制がん作用、アポトーシス誘発作用等を有する安全性の高い生理活性物質含有物を開発し、該含有物を含有する、生理的効果に優れた機能性食品又は飲料を提供することにある。また本発明は該含有物を有効成分とする抗菌剤、歯磨剤、防腐剤、アポトーシス锈発剤、制がん剤、抗潸瘪剤を提供する。また本発明はアポトーシス機構解明、アポトーシス耪発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトーシス親発方法も提供し、本発明の生理活性物質含有物質の製造方法も提供する。

従来の技術

近年、細胞組織の死に関し、アポトーシス（apoptos is 、アポブト一シスともいう；自燸死あるいは細胞自滅）という様式が注目されている。

このアポトーシスは、病理的細胞死である壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に «初から組込まれている死であると考えられている。すなわち何らかの外部的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を基にプログラム死 il伝子タンパク質が生合成され、生成したブ口グラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至ると考えられている。このようなアポトーシスを所望の組織、細胞で発現させることができれば、不要若しくは病原細胞、例えばがん細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極めて意義深いものである。

発明が解決しょうとする猓題

本発明の目的は、制がん作用、アポトーシス誘発作用等を有する安全性の商い生理活性物質含有物を開発し、該含有物の製造方法及び該含有物を含有する食品又は飲料を提供することにある。また本発明の目的は該化合物を含有する抗菌剤、アポトーシス锈発剤等の医薬品、及び該含有物を有効成分として使用するアポト一シス誘発方法を提供することにある。

锞題を解決するための手段

本発明を概锐すれば、本発明の第 1の発明は下記（ a )、（ b ) 、（ c ) より进択される少なくとも 1種の物の加熱処理物である。

( a ) ゥロン酸又はゥロン酸銹導体、

( b ) ゥロン酸含有糖化合物又はゥロン酸锈導体含有糖化合物、

( c ) ゥロン酸含有糖化合物含有物又はゥ口ン酸锈導体含有糖化合物含有物。本発明の第 2の発明は下記（ a ) 、（ b ) 、（ c ) より選択される少なくとも 1種の物を加熱処理する工程を包含することを特徴とする加熱処理物の製造方法である。

( a ) ゥロン酸又はゥロン酸锈導体、

( c ) ゥロン酸含有糖化合物含有物又はゥ口ン酸锈導体含有糖化合物含有物。本発明者らはゥロン酸、ゥロン酸 81導体、ゥロン酸含有糖化台物、ゥロン酸锈導体含有糖化台物、ゥ口ン酸含有糖化合物含有物又はゥロン酸锈導体含有糖化合物含有物から进択される少なくとも 1種の物の加熱処理物（以下、本発明の加熱処理物と称す）が強い制がん作用、アポトーシス誘発作用、抗菌作用、抗浪瘪作用を有することを見出し、本発明を完成した。図面の簡単な锐明

図 1 はべクチン加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 2は透析処理前後の試料のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 3は限外ろ過ろ液のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 4はゲルろ過画分のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 5はゥロン酸加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 6はゥロン酸加熱処理時の P Hと加熱物のがん細胞に対する作用の関係を示すものである。

図 7はべクチンの酸性下加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである《図 8はべクチンの酸性下加熱処理物の溶媒抽出画分のがん細胞に対する作用を示すものである。図 9はぺクチンのアルカリ性下に次いで酸性下での加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 1 0はガラクッロン酸の酸性下加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 1 1はグルクロン酸の酸性下加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。

図 1 2はべクチン加熱処理液 I のがん細胞に対する作用を示すものである。図 1 3はグルクロン酸加熱処理物の希釈倍数と細胞生存率の関係を示すものである。

図 1 4はアルギン酸加熱処理物のがん細胞に対する作用を示すものである。図 1 5はべクチン加熱処理物の白血病細胞株に対する制がん作用を示すものである。

図 1 6はゥロン酸加熱処理物の白血病細胞株に対する制がん作用を示すものである。

図 1 7はゥロン酸加熱処理物の分化锈導作用を示すものである。発明の実施の形態

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明において、ゥロン酸、ゥロン酸锈導体、ゥロン酸含有糖化合物、ゥロン酸锈導体含有糖化合物、ゥロン酸含有糖化合物含有物又はゥロン酸锈導体含有糖化合物含有物とは、その加熱処理物が制がん作用、アポトーシス誘発性等を有し、その加熱処理物中に制がん活性物質及び Z又はアポトーシス锈発性物質が生成されれば特に限定はない。ゥロン酸はダリクロン酸ともいい、アルドースのアルデヒド基はそのままにして他端の第 1 アルコール基だけをカルポキシル基に酸化したヒドロキシアルデヒド酸の総称であり、天然では動植物の各種の多糖の構成成分として存在する。ゥロン酸を含有する多糖としては、ぺクチン、ぺクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、へパリン、フコィダン、コンドロイチン酸、デルマタン磙酸等があり、種々の生理機能が知られている。

本発明で使用することができるゥロン酸は特に限定されるものでなく、例えばガラクッロン酸、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸、ィズロン酸等があり、ゥロン酸の锈導体としては、それらのラクトン、それらのエステル、それらのアミド、それらの塩等があり、加熱処理により制がん活性物質及び/又はアポトーシス誘発活性物質を生成する物は全て本発明の锈導体に包含される。ゥロン酸のラクトンとしてはグルクロノ一 6 , 3—ラタトン（以下ダルクロノラタトンと略記する）、マンヌロノー 6 , 3—ラクトン、ィズロノ一 6 , 3—ラクトン等が例示される。ゥロン酸エステルとしては、例えばメチルエステル、ェチルエスチル、プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルエステル等がありゥロン酸より製造することができる。又ゥロン酸のァミド化によりゥロン酸アミドも製造することができる。更にこれらの塩は常法により製造することができる。次に本明細書において、ゥロン酸、ゥロン酸锈導体を含有する糖化合物とは、ゥ口ン酸及び/又はゥロン酸锈導体を含有する糖化合物を意味し、それらは特に限定されるものでなく、例えばべクチン、ぺクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、へパリン、フコィダン、コンドロィチン碇酸、コンドロィチン、デルマタン硫酸、それらの化学的、酵素的、物理的処理物である、その分解物、分解物の耪導体、分解物の塩を使用することができる。前記の化学的な処理方法としては、原料糖化合物を例えば室温〜 2 0 O 'Cで数秒 ~数時間、好ましくは 5 0 ~ 1 3 0てで数秒〜 6 0分処理すれば良く、ぺクチンの墁合、例えば P H 6 . 8、 9 5てで数分〜数十分処理することによりー脱離反応が生じ、 2 3 5 n m付近の吸光度が增大した不飽和ゥロン酸及び/又は不飽和ゥロン酸エステルを有する糖化合物が得られる。本発明の糖化合物にはゥロン酸及び/又はゥ口ン酸エステルを含有する多糖類の 9一脱離反応により生成する非還元末端に不飽和ゥロン酸及び Z又は不昀和ゥ口ン酸エステルを含有する糖化合物が含まれる。また前記の酵素学的な処理方法としては、原料糖化合物のゥロン酸及び/又はゥ口ン酸エステル含有多糖加水分解酵素によるゥ口ン酸及び/又はゥロン酸エステル含有多糖の公知の分解が挙げられる。また、ゥロン酸及び/又はゥロン酸ェステル含有多糖リアーゼによるゥロン酸及び/又はゥロン酸エステル含有多糖の公知の分解が挙げられる。例えばべクチン、ぺクチン酸の埸合、各々公知のぺクチンリアーゼ（E C 4. 2. 2. 10) 、ぺクチン酸リアーゼ（EC4. 2. 2, 2) 、ェキソポリガラクッロン酸リアーゼ（EC4. 2. 2. 9) で分解することによって、非遼元末端に 4ーデォキシー L一トレオーへキスー 4一エノビラノシルゥロネ一卜 (4-deoxy-L-threo-hex-4_enopyranosyl uronate) 又はそのメチルエステルを有する糖化合物が得られる。また、ヒアルロン酸の場合はヒアルロン酸リアーゼ（ EC 4. 2. 2. 1 ) 、アルギン酸の場台はアルギン酸リア一ゼ（EC 4. 2. 2. 3) が使用される。この非還元末端に 4ーデォキシー L一トレオーへキスー 4一エノビラノシルゥロネート又はそのメチルエステルを有する酵素分解物も本発明の糖化合物に包含される。更に前妃の物理的な処理方法としては、原料糖化合物の近赤外線、赤外線、マイク口波、超音波処理等が挙げられ、例えばべクチン及び/又はべクチン酸を p H中性又はアルカリ性の溶液中に入れ、温度は適宜、室温以上で、適宜通元下、例えばァスコルビン酸存在下で、時間は 1秒以上、好ましくは 5秒〜 1時間の超音波処理をし、振動エネルギーを与えることが挙げられる。なお超音波以外にもマイクロ波、近赤外線、赤外線等の照射も有効で、これらを組合せ照射しても良い。照射は連较的に行っても良く、断铰的に行っても良い。また本発明においてはこれらのゥロン酸及び/又はゥロン酸锈導体を含有する糖化合物の含有物、例えば果物、果物果皮、果物搾汁かす、野菜、野菜搾汁かす, 海藻等をそのまま、あるいは紇煖、粉砕して用いても良く、またこれらのゥロン酸及び/又はゥロン酸锈導体を含有する糖化合物の含有物よりのゥロン酸及び/ 又はゥロン酸耪導体を含有する糖化合物の抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良い。これらのゥロン酸及び/又はゥ口ン酸锈導体を含有する糖化台物の抽出液の翻製方法、抽出液からの精製方法は公知の方法で行えば良く、待に限定はない, ゥロン酸又はゥロン酸エステルを含有する糖化合物含有物としてはリンゴ、例えばミカン、レモン等の柑橘類、バナナ、白菜、キャベツ、レタス、シソ、カボチヤ、セロリ、ゴボウ、エシャロット、ブロッコリ一、ビーマン、ほうれん草、人参、人参の葉、大根の葉、茶、ゴマ、マメ、ィモ等の双子葉類植物の果実、野菜、葉、種実等、麦、米等の単子葉植物の效物、褐藻類、例えば昆布、ワカメ等、紅藻類、緣藻類、単細胞緑藻類等の藻類、微生物としてはリオブイラムウルマリウム、ノヽタケシメジ、ナメコ、シィタケ、エノキ夕ケ、ヒラタケ、マッシュルーム等の担子菌類、サナギタケ、ノムシタケ等の子のう菌類、酵母、糸状菌、例えば扭菌、細菌、例えば納豆菌、乳酸菌等、動物としては脊椎動物又は無脊椎動物が例示され、本発明においては、これらの植物、微生物又は動物由来のゥロン酸及び又はゥロン酸誘導体を含有する糖化合物の含有物を使用することができる o ゥロン酸、ゥロン酸锈導体を含有する糖化合物である多糖類は公知の化学的、酵素学的、物理的な処理方法により製造することができる。例えばべクチンとしては、例えば柑捅類の果皮及びリンゴの果実より抽出される高分子の多糖類を使用することができる。工業的なぺクチン製造の原料はフルーツで、レモン、ライム等の柑橘類のジュースのしぼりかす（主として内果皮）が用いられるほか、リンゴのジュースのしぽりかすも用いられている。ジュースのしぼりかすには主として不溶性のプロトぺクチンが含まれており、製造の段階でこれを可溶化（抽出）し、ぺクチンを翻製する。可溶化は酸性の温水〜熱水で抽出することによって行うことができ、抽出時の温度、 P H、時間条件を原料に合わせてコントロールすることにより、分子置やエステル化度の一定なぺクチンを高収量で製造することができる。抽出液は遠心分離やろ過によって精製し、濃縮後アルコールを添加してべクチンを沈 ¾させ回収することができる。回収された沈 ¾を乾燥、粉砕し、所定の乾 «gぺクチンを翻製することができる。

ぺクチンの主構造は、部分的にメチル化されたガラタツ口ン酸のボリマーである。カルボキシル基はメチルステル化されたり、フリーの酸のままか、あるいはアンそ-ゥム塩、カリウム塩、又はナトリゥム塩化されている。ぺクチンはメチルエステル化度（DM度：全力ルポキシル基に対するメトキシル基の割合）によって、 DM度の高い HMぺクチン及び DM度の低い LMぺクチンに分類され〔吉積智司ほか編、（株）光琳発行、新食品開発用素材便覧、第 1 14~ 1 19頁 ( 1991 ) 〕、本発明においては市販の食品添加物べクチン〔外山章夫編、食品と科学社発行、天然物便覧、第 12版、第 138頁（ 1 993) 〕、市販の H Mぺクチン、 LMぺクチン等（前出の新食品開発用素材便 S) を使用することができる。ゥ口ン酸及び/又はゥ口ン酸锈導体を含有する糖化合物の分解物は、公知の化学的、酵素学的、物理的な処理方法により製造することができる。また台成法により合成されるゥロン酸、ゥロン酸锈導体、オリゴ糖等も本発明に包含されるものである。本発明に使用する加熱処理物は、（ a) ゥロン酸又はゥロン酸誘導体、（b) ゥロン酸含有糖化合物又はゥロン酸锈導体含有糖化合物、（c) ゥロン酸含有糖化合物含有物又はゥロン酸锈導体含有糖化合物含有物から S択される物を原料として製造することができる。本発明の加熱処理物の製造における加熱処理方法としては、ゥロン酸、ゥロン酸耪導体、ゥロン酸含有糖化台物、ゥロン酸锈導体含有糖化台物、ゥロン酸含有糖化台物含有物及び/又はゥロン酸锈導体含有糖化合物含有物を例えば 60~3 50 で数秒 ~数日、好ましくは 80~150てで数分〜数曰加熱処理すれば良く、ぺクチンの場合、例えば 80~ 150てで数分〜数日の加熱処理を行うことにより、制がん作用アポトーシス誘発性等の生理活性を有する加熱処理物を得ることができる。またゥロン酸、ゥロン酸のラタトン、ゥロン酸エステルを 60〜 15 O'Cで数分〜数日加熱処理することにより目的の加熱処理物を得ることがでさる _β 加熱処理時の P Hは特に限定はないが、中性から酸性下で行うのが好ましく、その原料に応じ加熱処理時の P Hを翻整すればよいが、通常は酸性下の加熱処理により、制がん活性物質、アポトーシス誘発活性物質等の生理活性物質の生成が加速される。加熱処理時の原料の »度はその加熱処理により制がん活性物質、アポトーシス锈発活性物質等の生理活性物質を生成しうる範囲内であれば特に限定は無く、操作性、収率等の点を考慮し設定すれば良い。本発明における加熱処理は湿式加熱でも、乾燥加熟でも良い。湿式加熱としては、水蒸気加熱、水蒸気加圧加熱、如圧式加熱等任意の湿式加熱方法を用いることができる。乾燥加熱としては、乾燥熱風による直接加熱法、熱源から隅壁を通して加熱する間接加熱法等が使用できる。直接加熱方法としては、気流乾熱法、噴 S乾熱法等があり、間接加熱法としてはドラム乾熱法等が使用できる。また本発明の加熱処理物の原料は通常の、煮る、焼く、炒る、煎じる、蒸す、炒める、揚げる等の任意の加熱方法で処理することができる。

本発明の加熱処理物とは上記加熱方法で得られる加熱処理物、及び該加熱処理物中の生理活性物質を含有する画分である。本発明の加熱処理物中には複数のアポトーシス锈発作用、制がん作用、抗菌作用、抗ウィルス作用等を示す物質が生成されており、また抗酸化作用を有するレダクトン類も、本発明の加熱処理物中に生成される。従って目的に応じて、加熱処理条件を変えることにより、希望する物質を有する本発明の加熟処理物を翻製することができる。本発明の加熱処理物はその生理活性を指標に分画でき、例えば加熱処理物の分子量分画を公知の方法、例えばゲルろ過法、分子置分画膜による分画法等により行い、各分子 S画分を翻製することにより、高活性の本発明の加熱処理物を翻製することができる。又、溶媒抽出法、分留法、イオン交換樹脂等を用いた各種ク口マトグラフィ一法等により目的の画分を翻製することができる, ゲルろ過法の例としては、セル口ファイン GC L— 300を使用し、例えば分子置 25000超、分子置 25000〜 10000超、分子置 10000-50 00超、分子 S5000以下等の任意の分子量画分を 33製でき、セル口ファイン GC L— 25を用い、例えば分子量 5000以下の画分を分子量 5000〜30 00超、分子置 3000〜 2000超、分子量 2000~ 1000超、分子量 1 000~500超、分子量 500以下等の任意の分子量画分に調製することがでさる。また限外ろ過胰を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製 F E 10— FUS 0382を用いることにより分子量 30000以下の画分を、同 F E— F US— T653を使用することによって分子 S6000以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子釁 500以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合わせることにより、任意の分子量画分を ¾製することができる。本発明の加熱処理物は分子量分画 30000以下の画分に強い制がん活性、ァボトーシス誘発活性を有し、特に分子量分画 10000以下の画分、好適には分子 S500以下の画分に強い制がん活性、アポトーシス锈発活性、抗菌活性等が認められ、目的に応じ、本発明の加熱処理物の分子量分画物を本発明の加熱処理物の有効成分として用いることができる。本発明の加熱処理物はがん細胞增殖抑制活性を有する。本発明の加熱処理物のがん細胞増殖抑制の作用機作は、本発明を何ら限定するものではないが、例えばがん細胞に対するアポトーシス ¾発作用も本発明に包含される。本発明の加熱処理物は、例えばヒト前骨性白血病細胞 H L— 60、ヒト急性リンバ芽球性白血病細胞 MOLT— 3、肺がん細胞 A— 549、 SV40形質転換肺細胞 W I— 38 V A 13、胩がん細胞 H e P G2、結腸がん細胞 HCT 1 16、ヒト結腸がん細胞 SW480、ヒト結腸がん細胞 W i D r、胃がん細胞 A GS、ミエローマ細胞等のがん細胞の增殖抑制作用、アポトーシス誘発活性を有し、本発明の加熱処理物中の制がん活性物質量は制がん活性単位で表示することができる。本明細書において制がん活性単位とは、本発明の加熱処理液を試料とし、その希釈液 0. 5m lを用い、 2. 5X 105個のヒト前骨性白血病細胞 HL— 60細胞（ATCC C C L - 240 ) を含む 10 %牛胎児血清含有 R P M I 1640 培地 4. 5m lに添加し、 5%炭酸ガス存在下 37'Cで 24時間培養した後、生細胞数を測定し、細胞生存率が対照の 50%になる培地 1 m 1当たりの制がん活性を 1単位と定義し、培地 1 m 1当たりの制がん活性が 1単位と算出される場合、試料 1 m 1は 10単位の制がん活性を有する。なお、細胞生存率 R (%) は下記式で計算する。

R=Vs/ (Vs+Ds) X 100 + DcZ (Vc+Dc) X 100

なお、式中で Vs、 Dsはそれぞれ試料添加時の生細胞数と死細胞数、 Vc、 Dc はそれぞれ水添加時の生細胞数と死細胞数を示す。本発明の加熱処理物は天然食物由来物質であり、マウスに経口投与、非経口投与を行っても毒性はうめられない。本発明の食品又は飲料とは、特に限定はないが、例えば原料として效類、いも及びデンプン類、甘味料類、油脂類、種実類、豆類、魚介類、猷鳥 K肉類、卵類、乳類、野菜類、果実類、きのこ類、藻類等を使用して製造される菓子類、パン類、 S類、嗜好飲料類（非アルコール飲料、アルコール飲料）、稠昧料、鑲造物（昧噌、 ¾油、食 K)、酒類及び香辛料類等の農産 ·林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。本発明の食品又は飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に本発明の加熱処理物が含有されていれば良い。

調理及び加工においては、稠理、加工後に制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する本発明の加熱処理物が含有されていれば良い。

すなわち調理 ·加工前、 ¾理 *加工時、更には調理 ·加工後に制がん作用、了ボトーシス誘発性等を有する本発明の加熱処理物を添加してもよいし、調理及び加工品やその材料を、制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する本発明の加熱処理物へ添加し、該加熱処理物を希釈してもよい。次に食品又は飲料の製造においては、任意の工程で、加熱処理を行い、制がん作用、アポトーシス锈発性等を有する、本発明の加熱処理物を含有させれば良く、また制がん作用、アポトーシス锈発性等を有する、本発明の加熱処理物を添加してもよいし、食品又は飲料やその原料を、制がん作用、アポトーシス锈発性等を有する、本発明の加熱処理物へ添加し、該加熱処理物を希釈してもよい。また、添加は 1回又は数回に渡って行ってもよい。したがって、簡便に新規な制がん作用、アポトーシス锈発作用等を有する食品又は飲料を製造することができる。また製造時においてゥロン酸、ゥロン酸のラクトン、ゥロン酸エステル、ゥロン酸及び/又はゥロン酸エステルを含有する糖化合物又は糖化合物含有物を含有せしめ、製造時において生成した制がん作用、アポトーシス锈発性等を有する、その加熱処理物を構成成分とする食品又は飲料も本発明に包含される。いずれの工程を経た場合も、制がん作用、アポトーシス誘発性等を有する、本発明の加熱処理物を含有する食品又は飲料、本発明の加熱処理物を添加及び/又は希釈してなる食品又は飲料は本発明の食品又は飲料と定義される。

本発明において、制がん作用、アポトーシス锈発性、抗菌力等を有する本発明の加熱処理物の食品中の含有量は特に制限されず、その官能と生理活性の点より適宜選択できるが、例えば加熱処理物の含有量は食品 1 0 0部当り加熱処理物固形物換算で 0 . 0 0 1部以上、食品としての官能、制がん作用、ァボトーシス锈発作用、抗菌力等の生理活性の面及びコストの面からは好ましくは 0 . 0 0 5 ~ 1 0部、更に好ましくは 0 . 0 1 ~ 1部である。本発明において、制がん作用、アポトーシス锈発性、抗菌力等を有する本発明の加熱処理物の飲料中の含有量は特に制限されず、その官能と生理活性の点より適宜迸択できるが、例えば加熱処理物の含有量は飲料 1 0 0部当り加熱処理物固形物で 0 . 0 0 1部以上、飲料としての食味、制がん作用、アポトーシス锈発作用、抗菌力等の生理活性の面及びコストの面からは好ましくは 0 . 0 0 5〜 1 0 部、更に好ましくは 0 . 0 1〜 1部である。なお、本明細害において都は重量部を意味する。本発明の制がん作用を有する食品中の加熱処理物含有量は、制がん活性の点より適宜透択できるが、食品 1 0 0 gr当り制がん活性単位として 0 . 1単位以上、好ましくは 1 0単位以上、更に好適には 1 0 0単位以上である。又本発明の制がん作用を有する飲料中の加熱処理物の含有置は特に制限されず、制がん活性の点より適宜进択できるが、飲料 1 0 0 sr当り制がん活性単位として 0 . 1単位以上、好ましくは 1 0単位以上、更に好適には 1 0 0単位以上である。本発明の食品又は飲料としては、本発明の制がん作用、アポトーシス親発性、抗菌力等を有する、本発明の加熱処理物が含有、添如及び/又は希釈されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、頼粒状、カブセル状、ゲル状、ゾル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。本発明の食品又は飲料は生理活性を有する本発明の加熱処理物を多置に含有し、該加熱処理物の有する種々の生理活性、抗菌力、アポトーシス锈発作用、制がん作用、抗ウィルス作用、抗潸痏作用、血管新生抑制作用、肝機能改善作用、食物繊維作用、鉄 ·重金属等の不要金厲除去作用等によって、これらを摂取することにより発がん予防、がん抑制効果、抗潰癢効果、肝機能改善効果、便秘予防効果，インフルエンザウイルスによるかぜの予防効果、アルッハィマー病予防効果を有する健康食品又は飲料であり、特に胃腸健康保持に有用な食品又は飲料である。またその抗菌力により、極めて保存性の良い、食品又は飲料である。本発明の加熱処理物は食品又は飲料の保存性を向上させる防腐剤として使用することができる。また、本発明の加熱処理物を食品又は飲料に添加し、食品又は飲料を防腐する方法に使用することができる。抗菌性を有する本発明の加熱処理物はゥロン酸、ゥロン酸のラクトン、ゥロン酸エステル、ゥロン酸を含有する糖化合物及び/又はゥロン酸エステルを含有する糖化合物等の加熱処理により、容易に翻製でき、天然食品由来の本発明の加熱処理物を含有する抗菌剤の食品又は飲料への使用は極めて安全性に優れたものである。食品又は飲料に添加する場合の本発明の加熱処理物含有抗菌剤の形状は、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、頼粒状等いずれの形状でも良い。取り扱いやすさや、他の添加物と混合して使用することも考えれば、乾 «Iして粉末状、フレーク状、頼粒状にすることが好ましい。乾燥方法としては、通常の乾埕方法、例えばスプレー乾燥、ドラム乾燥、棚式乾 s、真空乾燥、凍結乾《などで行うことができる。本発明の抗菌剤及び防腐剤は当業者に公知のいかなる方法によっても製造することができ、その製造に際しては、製剤上許容される公知の添加物、例えば賦形剤、安定剤、崩壊剤、結台剤、溶解補助剤等を適宜添加しても良い。またエタノール、グリシン、 S酸ナトリウム、ァスコルビン酸、グリセリン脂肪酸エステル，食塩、 E D T A等の他の抗菌性物質と組合せて使用しても良い。

本発明の加熱処理物の食品又は飲料への添加量は食品又は飲料の種類により異なり、その目的に応じた量を添加すれば良い。本発明の抗菌剤の使用方法として、食品又は飲料に適当な方法で添加する方法が行われる。添加する方法は特に制限はなく、要するに何らかの方法で本発明の加熱処理物が食品又は飲料に含有されれば良い。したがって、本発明の抗菌剤の使用において、添加とは本発明の加熱処理物を食品又は飲料中に含有させるいかなる方法も含む。通常の方法は食品又は飲料の製造工程中に添加するが、本発明の加熱処理物を含有する溶液に食品を一定時間浸溃する方法も用いることができる。更にまた、食品中に添加する方法と浸癀方法を併用することもできる。浸漬方法に適する食品としては、水中でも形くずれしない食品、例えば、蒲蛑、ウインナソーセージ等の魚畜肉棟り製品、ゆで a等の a類、冷凍前の海老、貝、魚類等の冷凍食品などを挙げることができる。本発明の抗菌剤を防腐剤として用いることにより、食品又は飲料の保存性を一段と向上させることができる。また冷凍食品や冷菓等においては、冷凍前の加工工程において、汚染した微生物の增殖を抑制することができ、衛生上極めて好ましい結果を得ることができる。本発明の抗菌剤はグラム s性細菌、グラム陰性細菌の両方に効果を有し、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の薬剤耐性菌、サルモネラ菌、ェンテロトキシン生産性黄色ブドウ球菌、嚙吐型のバシルスセレウス、下痢型のバシルスセレウス、腸出血性大腸菌 0— 1 5 7等の食中毒菌に極めて有効である。また、酵母、カビ等の微生物にも有効である。特に本発明の加熱処理物を含有する防腐剤は天然の食中毒予防剤、除菌剤として有用性が高い。なお、本発明の抗菌剤を用い、衣服、敷布等の殺菌を行うことができ、本発明の抗菌剤を散布すること、本発明の抗菌剤での拭取り等により目的物の除菌、殺菌を行うことができる。本発明の抗菌剤は虫歯菌ゃ齒周病菌にも抗菌活性を示し、本発明の抗菌剤を含有する口内用剤を提供することができる。口内用剤の形状は液状、ペースト状等の公知の形状とすることができる。口内用剤としては歯磨剤が例示される。歯磨剤としては液状でもよく、またペースト状、粉末状でもよく、公知の歯磨剤の形状とすることができる。歯磨剤中の本発明加熱処理物の含有 aは待に制限されず, 虫歯菌ゃ歯周病菌に対する有効 «度が含有されていればよい。歯磨剤中には公知の添加剤、例えば湿潤剤、界面活性剤、結合剤、香料、甘味料等を添加すればよい。本発明の歯磨剤の有効成分としては前述の様に、ゥロン酸、ゥロン酸エステルを含有する糖化合物の含有物、例えばべクチン含有物、例えば野菜、果物等の加熱処理物も使用でき、ぺクチン含有野菜の加熱処理物を含有する口内用剤、例えば歯磨剤も本発明に包含される。本発明のアポトーシス锈発剤は、アポトーシス锈発性を有する、本発明の加熱処理物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。一般的には、本発明の加熱処理物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分敗剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結台剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、頼粒剤、散剤、粉末剤、カブセル剤等の固形剤、通常液剤、懸 ¾剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。本発明のアポトーシス锈発剤は、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することができる。

医薬用担体は、上 3己投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンュット、カルポキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の a製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矮味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。

一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるアポトーシス誘発活性を有する加熱処理物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸 sさせ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより ¾製される。本発明のアポトーシス锈発剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなぐ、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人 1 曰当り 2 0 〜2 0 0 0 m k grである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な埸台もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して S常的に摂取させることもできる。制がん作用を有する本発明の加熱処理物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一般的には、本発明の加熱処理物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、頼粒剤、散剤、粉末剤、カブセル剤等の固形剤、通常液剤、剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。

制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非轻ロ剤のいずれによつても投与することができる。

医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて逸択することができ、上記アポトーシス锈発剤に準じ使用すれば良い。

制がん剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。制がん剤としての投与 Sは、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の量が成人 1日当り 20~2000m sr/k grである。もちろん投与置は、種々の条件によって変動するので、上妃投与量より少ない量で十分な場台もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。本発明の加熱処理物は制がん作用を有するが、低濃度ではがん細胞の分化锈導能を有し、本発明の加熱処理物はがん細胞の分化锈導剤（脱がん剤）としても有用である。本発明の加熱処理物を有効成分とするがん細胞分化誘導剤は、上記制がん剤に準じ、製剤化することができ、制がん剤に準じた方法で投与することができる。がん細胞分化锈導剤としての投与黌は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年餘、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の置が成人 1日当り 0. 2 ~50 Omsr/k 8：である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場台もあるし、あるいは範囲を超えて必耍な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して曰常的に摂取させることもできる。本発明の加熱処理物は抗ウイルス作用や肝機能改善作用を有し、本発明の加熱処理物を有効成分とする抗ウイルス剤や肝機能改善剤を、上纪制がん剤に準じ、製剤化することができ、制がん剤に準じた方法で投与することができる。抗ウィルス剤や肝機能改善剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齡、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明の加熱処理物の Sが成人 1日当り 0. 2~200 OmsrZk 8：である。もちろん投与 Sは、種々の条件によって変動するので、上 3己投与量より少ない璗で十分な場台もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもでき、本発明の加熱処理物含有物を摂取することにより、インフルエンザウイルスによる風邪等のウイルス性疾患が予防、治療でき、肝機能障害も改善され、 G O T、 G P T値が正常化する。本発明の加熱処理物は 7 0— kダルトン等の熱シ a ツクタンパク（heat shock prote in) 锈導活性を有し、肝炎ウィルス、エイズウイルス、インフルエンザゥィルス、ヘルぺスウィルス等の R N Aウィルス、 D N Aウィルスに対する抗ウイルス作用を有する。又抗炎症等の生体防御作用をも有する。抗浪癟作用を有する本発明の加熱処理物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば抗浪痛剤を製造することができる。抗滇瘪剤の製造は上き己方法に準じ行うことができる。一般的には、本発明の加熱処理物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、锾衝剤、安定剤、賦形剤、桔合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、頼粒剤、散剤、粉末剤、カブセル剤等の固形剤、通常液剤、懸頃剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾埕品とすることができる。

抗潰瘍剤としては、経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによつても投与することができる。

医薬用担体は、上妃投与形態及び剤型に応じて退択することができ、上紀アポト一シス锈発剤に準じ使用すれば良い。

抗潸癢剤としては、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮內等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。抗潰癢剤としての投与盪は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される本発明め加熱処理物の Sが成人 1 日当り 2 0 ~ 2 0 0 0 m gr k gである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与置より少ない量で十分な埸合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して B常的に摂取させることもできる。本発明によれば制がん作用、アポトーシス锈発作用等の生理活性を有し、がん患者や、ウィルス性疾患において、病変細胞に制がん作用やアポトーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な食品又は飲料が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の加熱処理物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞の增殖抑制やがん細胞にアポトーシスを起こさせることができるため、本発明の加熱処理物を含有、添加及び/又は希釈してなる食品又は飲料は消化器系がんの治療、予防に優れた効果を有している。

また本発明の加熱処理物は抗ウィルス作用、抗菌作用を有し、抗ウィルス剤、抗菌剤、口内用剤、例えば歯磨剤、食品用又は飲料用防腐剤として有用であり、またその抗潸痛作用により抗潸痛剤、潸癢の予防剤等としても有用である。更にその肝機能改善作用により肝機能改善剤としても有用である。

本発明により、食品又は飲料中に生理活性を有する本発明の加熱処理物を多惫に含有させることが可能となった。本発明の加熱処理物が有する種々の生理活性、アポトーシス锈発作用、抗菌作用、制がん作用、抗ウィルス作用、血管新生抑制作用、異常增殖細胞の抑制作用、抗墳瘠作用、肝機能改善作用、食物繊維作用、鉄 ·重金属等の除去作用等によって、本発明の食品又は飲料は発がん予防、制がん効果、抗菌効果、抗ウィルス効果、抗潘瘙効果、便秘予防効果、肝機能改善効果、アルツハイマー予防効果、アポトーシス锈発作用等の生体の恒常性（ホメォスタシス）維持機能を有する 01康食品又は飲料であり、本発明により、胃腸健康保持に有用な機能性物質入りの食品又は飲料が提供される。また、本発明の加熱処理物、特に分子量 5 0 0以下の画分を添加することにより、食品又は飲料の抗菌カを簡便に増強することができ、本発明の加熱処理物は食品又は飲料の防腐剤としても極めて有用である。本発明の加熱処理物、特に分子 S 1 0 0 0 0以下の画分、好ましくは分子量 5 0 0以下の画分はその種々の生理機能により、食品又は飲料に使用することにより、簡便に食品又は飲料に種々の生理機能を付与することができ、例えば食品又は飲料の抗菌付与用添加剤、食品用又は飲料用の防腐剤として極めて有用である。

更に本発明によれば制がん作用やアポトーシス锈発作用を有し、がん患者や、ウイルス性疾患において、病変細胞の增殖抑制や病変細胞にアポトーシスを锈発させることにより、該疾患の予防、治療に有効なアポトーシス誘発剤、及び制がん剤が提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のがんの場合、本発明の加熱処理物を食品、飲料として経口的に摂取することによりがん細胞の增殖抑制やがん細胞のアポトーシス锈発により、本発明の加熱処理物を添加及び/又は希釈してなる食品又は飲料は消化器系がんの治療、予防に優れた効果を有している。また本発明によれば抗潸痛作用を有し、憤痛患者において、該疾患の予防、治療に有効な抗潰 ¾剤が提供される。消化器系の潸瘪の場合、本発明の加熱処理物を食品、飲料として経口的に摂取することにより抗潸殤作用を発揮させることができるため、本発明の加熱処理物を添加及び Z又は希釈してなる食品又は飲料は消化器系潸攝の治療、予防に優れた効果を有している。本発明の薬剤は、食用果物果皮、食用海藻等を原料として安価に大還に供給可能であり、食品由来で安全性が高い点においても優れている。また、本発明により簡便なアポトーシス锈発方法が提供され、本発明の方法を使用することにより、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻害剤の開発等を行うことができる。実施例

以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に 3兑明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重躉％を意味する。実施例 1

リンゴ製ぺクチン（和光純薬社製） 5 0 0 m grを 1 2 0 m M N a C 1 を含む 5 O m M H E P E S緩衝液（ P H 7 . 0 ) 5 0 m I に懸湖し、 1 2 1 'C、 2 0分問オートクレーブし、ぺクチン加熱処理溶液を調製した。

56て、 30分間処理した牛胎児血清（ギブコ社製）を 10%含む R PM I 1 640培地（日水社製）にて 37てで培養したヒト前骨髄性白血病細胞 H L— 6 0 ( AT C C CRL— 1964) を AS F 104培地（味の素社製）にて 5 X 105個 /9m 1 となるように懸溺した。この魅濁液に対し、ぺクチン加熱処理溶液を 1 m 1添加し、 37て、 5%二酸化炭素存在下で 1 6時間培養した。また確 Sのためアポトーシスを誘発する試薬として知られているァクチノマイシン D (シグマ社製）の水溶液（0. l msr/ m I ) 0. 1 m l及び生理食塩水 0. 9 m 1を前述のぺクチン溶液の代りに用いて同様の培養を行った。

培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、ぺクチン加熱処理溶液、ァクチノマイシン D添加培養細胞に核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお対照の生理食塩水 1 m 1添加培養細胞においてはこれらの現象は S められなかった。

この結果よりぺクチン加熱処理溶液は HL— 60細胞にアポトーシスを锈発することが明らかとなった。実施例 2

市販のリンゴ製ぺクチンを終 ¾度 1 Omsr m 1 となるように 120 mM N a C 1を含む 50 mM HE P E S緩衝液（ P H7. 0) に溶解し、 I N N a OHで P H 7. 0に調整した。これらを 1 2 1て、 30分間加熱処理し、紫外部吸収スぺクトルを測定したところ、加熱処理したものでは加熱前に比べて 235 nm付近の吸光度が增大していた。

この試料を I N NaOHで PH7. 0に翻整し、アポトーシス锈発活性を実施例 1の方法に従って測定した。但し、以下各実施例において、 AS F 104培地の代りに 10%ゥシ胎児血清を含む RPM I 1640培地、細胞は HL— 60 (ATCC CC L— 240) を用い、各試料はアポトーシス锈発活性測定時に 1 N N aOHで PH7. 0に翻整し、そのアポトーシス ¾発活性を測定した。また、細胞懸濁液に 2倍容の 0. 4%トリパンブルー水溶液を加えて光学顕微鏡で観察し、トリパンブルーを排出して無色の細胞を生細胞、青色に染色された細胞を死細胞として計数した。

その結果、ベクチン加熱処理物に顕著な HL— 60細胞に対するアポトーシス誘発活性がみられた。市販のレモン製べクチンを 1 2 OmM N aC lを含む 50mM HEPE S 緩衝液（PH7. 0) に 10mg/m lとなるように溶解すると PH5. 0であつた。これを 121 · (：、 30分間加熱処理したものの紫外部吸収スペクトルを測定すると、加熱処理物では 235 nm付近の吸光度が增大していた。

この試料を I N NaOHで PH7. 0に 33整し、上記の方法で H L— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を測定したところ、加熱処理物は顕著なアポト —シス誘発活性を示した。

その拮果を図 1に示す。すなわち図 1は HL— 60細胞の培養液にレモンぺクチンの加熱処理物溶液を 1 msZm 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の閟係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縱軸は培養液中の生細胞数（X 105 コ Z5m 1 ) を示す。図 1中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) はレモンべクチン加熱処理物添加をそれぞれ示し、レモンべクチン加熱処理物は制がん作用を示した。実施例 3

( 1 ) 市販のリンゴ製ぺクチンを 12 OmM N aC lを含む 50mM HE ?£ 5锾衝液（ }17. 0) に 1 OmgrZm 1になるように溶解し、 121でで 20分間加熱処理し、加熱処理液を翻製し、その一部を凍結乾燥し、加熱処理液の凍結乾 «8物を得た。

次に、加熱処理液の残部をセルロース透析膜（分画分子量 12, 000-14, 000、三光純薬社製）又はスぺクトラ/ボア 7透析腴（分画分子 fil , 000、スぺクトラム社製）を用いて純水に対して透析し、それぞれの透析内液を凍桔乾燥して枰量したところ、どちらの透析内液の凍結乾燥物も加熱処理前のぺクチンに比べて約 1 0%その重量が減少していた。

加熱処理液の凍結乾燥物を水に、透析内液の凍結乾燥物を 1 2 OmM N a C I を含む 50mM H E P E S緩衝液（ P H 7. 0 ) にそれぞれ終濃度 1 0 m g /m I になるように溶解し、 I N N a OHで P H 7. 0に 33整し、実施例 2の方法で HL— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を測定した。

加熱処理したぺクチン溶液が活性を有していたのに対して透析した透析内液試料は活性が低下していた。

その結果を図 2に示す。すなわち図 2は H L— 60細胞の培養液に加熱処理液の凍結乾燥物、セルロース透析膜内液の凍桔乾燥物、スぺクトラ /ボア 7透析膜内液の凍結乾燥物をそれぞれ l mer/m l となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 05 コ Z5m ] ) を示す。図 2中において白四角印（ □) は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) は加熱処理液の凍結 KiS物、白丸印（O) はセルロース透析胰内液の «桔乾燥物、白三角印（△) はスぺクトラ / ポア 7透析膜内液の凍結乾燥物の添加をそれぞれ示し、加熱処理液は制がん作用を示した。

( 2) 上 3己加熱処理べクチン溶液を 1 N N a OHで P H7. 0に調整した後、セントリブラス 1 0 (分画分子量 1 0， 00 0、アミコン社製）を用いて限外ろ過し、通過画分を得た。この画分のアポトーシス绣発活性を実施例 2の方法で測定したところ、限外ろ過前の試料と同等の活性を有していた。

その結果を図 3に示す。すなわち図 3は H L— 60細胞の培養液に加熱処理べクチン溶液のセントリブラス 1 0通過画分を 1 msr/m 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の閲係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 05 コ /5m 1 ) を示す。図 3中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) は通過画分添加をそれぞれ示す。なお、加熱処理べクチン溶液は白ひし形印と同様の結果を示し、加熱処理べクチン溶液、通過画分は制がん作用を示した。実施例 4

市販のリンゴ製ぺクチンを 1 2 OmM N aC lを含む 50mM HEPE S 緩衝液（PH7. 0) に 1 Om srZm Iになるように溶解し、 I N N aOHで PH 7. 0に翻整した後 121てで 30分間加熱処理した。この試料 20m lを純水で平衡化したセフアクリル S— 300 ハイロード 26/60 ハイレゾリユーシ β ンカラム（ファルマシア社製）にアブライし、ゲルろ過を行った。移動相は純水で、流速は 1 m 1 /m i ηに設定し、示差屈折計で検出した。

試料をカラムにアブライしてから 1 10分から 1 90分までに溶出してきたものを画分①、 190分から 270分までに溶出してきたものを画分②、 270分から 400分までに溶出してきたものを画分③として、それぞれエバポレーターで澳缩した。各々の画分に終馕度が 12 OmMと 50 mMになるように N a C 1 と H E P E Sを加えて 2 Om 1 とし、 I N N aOHで ρΗ7. 0に調整した。実施例 2の方法に従って HL— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を測定したところ最も低分子側の画分③に強い活性が認められた。その桔果を図 4に示す。すなわち図 4は HL— 60細胞の培養液に上妃画分③ を 1 mg m 1 となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の閱係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 05 コ /5m 1 ) を示す。図 4中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白三角印（厶）は画分③の添加を示し、圇分③は制がん作用を示した。実施例 5

( 1 ) D— α—ガラクッロン酸と D—グルクロン酸を各々 10ms/m lになるように 120mM N aC lを含む 50mM H E P E S緩衝液（ P H 7. 0 ) に溶解し、 121てで 20分間加熱処理した後 1 N NaOHで PH7. 0に翻整した。これらの試料の HL— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を実施例 2の方法で測定したところ、ともに顕著な活性を示した。

その桔果を図 5に示す。すなわち図 5は H L— 60細胞の培養液に加熱処理ガラクッロン酸、加熱処理ダルクロン酸をそれぞれ l msr/m l となるように添加したときの培整時 RDと培狭液中の生細胞数の M係を示す図であり、横軸は培我時 ΠΠ (時 Ι1Π) 、縦軸は培整液中の生細胞数 (X 1 05 コ /5m 1 ) を示す。図 5中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) は加熱処理ガラクッロン酸、白丸印（〇）は加熱処理グルクロン酸の添加をそれぞれ示し、各加熱処理物は制がん作用を示した。

(2 ) ガラクッロン酸を 1 0 m grZm I になるように 1 2 OmM N a C 1を含む 50mM ?1£ £ 3钹衝液（ ^17. 0) に溶解し、 I N N a OHで P H7. 0に 3 整したもの及び p H 8. 0に調整したものを 1 21 'Cで 20分 RJ1加熟処理し、各々の PHを I N N aOHで 7. 0に 33整した。これらの試料の H L一 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を実施例 2の方法で測定したところ、 P H 7. 0で加熱処 ¾した試料が PH8. 0で加熱処理した試料よりも強い活性を示した。

その結を図 6に示す。すなわち図 6は HL— 60細胞の培 ¾液に p H7. 0 加熱処 ί3!ガラクッロン酸、 Ρ Η8. 0加熱処理ガラクッロン酸をそれぞれ 1 m g /m 1 となるように添加したときの培 ¾時 ίίί]と培 ¾5液中の生細胞数の M係を示す図であり、桢軸は培 ¾時 PJ] (畤間）、縦軸は培狡液中の生細胞数（X 1 05 コ / 5m l ) を示す。図 6中において白四角印 (□) は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) は PH7. 0加熱処理ガラクッロン酸、白丸卬（O) は PH8. 0加熱処ガラクッロン酸の添加をそれぞれ示し、 P H 7. 0加熱処理物は制がん作用を示した。

実施例 6

リンゴ製ぺクチンを 120 mM N a C lを含む 50mM HEP E S钹衝液 ( P H 7. 0) に l Omsr/m lになるように溶解し、 1 21 、 20分閗加熱処理して加熱試料①を得た。これを上記セルロース透析股を用いて 1 2 OmM Na C lを含む 50mM H E P E S緩衝液（ P H 7. 0) に対して透析して透析内液試料②を得た。更に透析内液試料②を 1 2 1て、 1時 ί«1加熱処理して 1 Ν N a OHで ΡΗ 7. 0に調整し、再加熱試料③を得た。

1 N N a OHで PH7. 0に調整した試料①〜③を実施例 2の方法に従って HL— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を測定したところ、試料①、 ③は活性を有し、試料②は活性が低下していた。

このことから透析によって活性が低下した加熱処理べクチンの透析内液は、再度加熱処理することにより活性を回復することが明らかになった。実施例 7

市販のリンゴ製べクチンを I N HC 1 に l OmgZm l になるように溶解し、 1 2 1 で 1. 5時間加熱し、加熱処理物を調製した。次に該加熱処理物を N a O Hで P H7. 0に ¾整した後、ヒト前骨 M性白血病細胞 H L— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を次のように測定した。

56て、 30分間処理した牛胎児血清（ギブコ社製）を 1 0%含む R PM I 1 640培地（曰水社製）にて 37てで培養した HL— 60 (AT C C C C L一 240) を RPM 1 1 640培地にて 2. 5 X 1 0⁵ コ 4. 5m l となるように懸溷した。

この懸¾液 4. 5m 1 に対し、前記加熱処理物溶液を 0. 5m l添加し、 37 •C、 5%二酸化炭素存在下で 1 6時間培養した。また確 12のためアポトーシスを锈発する試薬として知られているァクチノマイシン D (シダマ社製）の水溶液（ 0. 1 m g/m 1 ) 0. 05m l及び生理食塩水 0. 45 m l を前述の加熱処理物溶液の代りに用いて同様の培養を行った。

培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、加熱処理物溶液、及びァクチノマイシン D 添加培養細胞に核の凝縮、細胞の箱小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確 3S した。なお対照の生理食塩水 0. 5m 1添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。

また、細胞 ¾S液に 2倍容の 0. 4% トリパンブルー水溶液を加えて光学顕微鏡で観察し、トリパンブルーを排出して無色の細胞を生細胞、青色に染色された細胞を死細胞として計数した。その桔果を図 7に示す。すなわち図 7は H L— 60細胞の培養液にぺクチンの加熱処理物溶液を 1 mg/m l となるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 1 05 コ /5m 1 ) を示す。図中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) はぺクチンの加熱処理物添加をそれぞれ示し、ベクチン加熱処理物は制がん作用を示した。実施例 8

市販のリンゴ製べクチンを水に l OmsrZm lになるように溶解し、 NaOH で p H 7. 0に調整した後 1 2 1 'Cで 1時間加熱した。加熱処理後の P Hは p H 4. 5であった。次にこの加熱処理物を N a OHで再度 P H7. 0に ¾整し、遠心（ 1 0, 000 Xsr、 1 0分間）及び 0. 22 umフィルターを用いたろ過によって不溶物を除いた後、等置のエタノールを加えて遠心（ 10, 000Χ8Γ、 10分間）して得た上清画分と沈殺画分をそれぞれ減圧下濃縮乾固し、最初にぺクチンを溶解した量の水に溶解した。ェタノール処理の上清画分の水溶解液と沈画分の水溶解液を N a ΟΗで ΡΗ7. 0に調整した後、それぞれを HL— 60 細胞培養液 4. 5m lに 0. 5m 1添加してアポトーシス锈発活性を実施例 7の方法で測定した。

その結果、 HL— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性は上清画分に存在することが明らかになった。エタノールの代りに 2—プロビルアルコールを用いても同様の結果であった。その結果を図 8に示す。すなわち図 8は HL— 60細胞の培養液にエタノール処理後、又は 2—プロビルアルコール処理後の上清画分の水溶解液又は沈殿画分の水溶解液を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の閲係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数 (X 1 05 コ /5m 1 ) を示す。図中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白丸印（O) はエタノール処理沈 ¾画分添加、黒丸印（參）はエタノール処理上清画分添加、白三角印（厶）は 2—プロビルアルコール処理沈殿画分添加，黒三角印（▲) は 2—プロビルアルコール処理上清画分添加をそれぞれ示し、各溶媒処理上清画分は制がん作用を示した。ぺクチンの加熱処理物に添加するエタノール又は 2—プロビルアルコールの置を 0. 5倍霾、 1. 5倍量、及び 2倍量にして上記と同様の方法で試料を調製したところ、等置のエタノール又は 2—プロビルアルコールを加えた場合と同様に活性は上清画分にあった。但し、アポトーシス誘発活性は以下の方法で測定した。すなわち、 96穴マイクロタイタープレートの各ゥルに 5, 000個の HL— 60細胞を含む 1 0%牛胎児血清含有1¾?\1 I 1640培地 100 1、試料 1 0 n I、及びアラマ一ブルー（アラマ一バイオサイエンス社製） 10/z 1を添加し、 5%炭酸ガス存在下 37てで 48時間培養した後の 560 n mでの吸光度から 590 n mでの吸光度を引いた値を測定し、これを細胞の增殖度とした。実施例 9

市販のリンゴ製ぺクチンを 1 OmsrZm 1 になるように 0. 1 M炭酸緩衝液に溶解し、 P Hを 9. 5に翻整した。これを 1 21てで 30分間加熱処理した。加熱処理物の PHは PH9. 2であった。次にこの加熱処理物の一部を H C Iで P H 7. 0に翻整し（试料 A) 、残部を PH4. 5に 53整した。 Ρ Η4· 5に整した試料を再度 1 2 1てで 30分間加熱処理し、次に P Hを 7. 0に瘸整した（試料 Β) 。試料 Α、試料 Βの H L— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を実施例 7の方法で測定したところ、试料 Αは活性を持たなかったが、試料 B (ぺクチン加熱処理液 1 1 ) は活性を有していた。

その結果を図 9に示す。すなわち図 9は HL— 60細胞の培養液に試料 A又は試料 Bを l ms/m lになるように添加したときの培 «時間と培養液中の生細胞数の M係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数

( 105 コ /5m 1 ) を示す。図中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) は試料 A添加、白丸印（O) は試料 B添加をそれぞれ示し、ぺクチン加熱処理液は制がん作用を示した。実施例 1 0

( 1 ) D—なーガラクッロン酸を 10 msrZm 1になるように水に溶解すると P H 2. 4であった。これを 12 1てで 20分間加熱した。加熱処理物の P Hは P H2. 2であった。この加熱処理物の pHを N aOHで pH7. 0に期整し、実施例 7の方法、但し HL— 60細胞が 3 X 1 05 コ / 4. 5m 1 となるように ¾ 整した細胞懸濁液を使用し、 H L— 60細胞に対するアポトーシス誘発活性を測定したところ本試料は活性を有していた。

この結果を図 1 0に示す。すなわち図 10は HL— 60細胞の培養液にガラクッロン酸の酸性下加熱処理物を l mg/m I になるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 105 コ 5m 1 ) を示す。図中において白四角印（ □) は試料無添加（対照）、白ひし形印（◊) はガラクッロン酸加熱処理物添加をそれぞれ示し、加熱処理物は制がん作用を示した。

(2 ) D—グルクロン酸を 10 msr/m Iになるように 1 2 OmM N a C 1を含む 50mM H E P E S緵衝液（pH7. 0) に溶解したところ、 P H3. 1 8であった。これを 121 で 20分間加熱した後、加熱処理物の P Hを N a 0 Hで PH 7. 0に調整し、実施例 7の方法で H L— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を測定したところ本試料は活性を有していた。

この結果を図 1 1に示す。すなわち図 1 1は HL— 60細胞の培養液にダルクロン酸の加熱処理物を 1 msr/m Iになるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 10⁵ コ /5 m I ) を示す。図中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白丸印（O) はグルクロン酸加熱処理物添加をそれぞれ示し、ゥ口ン酸加熱処理物は制がん作用を示した。実施例 1 1

D— α—ガラクッロン酸を 1 %となるように水に溶解すると pH 2. 4であつた。この溶解液を 121てで 20分間加熱したところ、この加熱処理物の PHは ΡΗ2. 2であった。これを減圧下 40倍に獲縮し、そのうち 20 1をパルパック S型（PALPAK t p e S) カラム（4. 6X250mm) (宝酒造社製）を用いた HPLCに供した。流速は 1 m 1 /分、最初の 30分は 90% ァセトニトリル水溶液、その後 20分かけて 90 %ァセトニトリル水溶液から 5 0%ァセトニトリル水溶液の直線馕度勾配によって、ガラクッロン酸酸性下加熱処理物の分離を行った。 9 0秒ごとにフラクシ aネーシ a ンを行い、各フラクシ aンを減圧下濃縮乾固した後、 80 Iの水に溶解し、そのうち 10 1を用いて H L— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を以下に記載の MTT法で測定した。

その桔果、溶出時間が 4. 5~ 12分と 45~48分の 2画分に活性が見られた。

MTT法：各被検液の希釈液 5 1又は水 5 1をそれぞれ 96穴マイクロタイターブレートのゥルに入れる。そこに 5000個の HL— 60細胞を含む 1 0%ゥシ胎児血清含有 RPM I 1640培地 100 1を加え、 5%崁酸ガス存在下、 37'Cで 48時間培養する。 5msr/m lの 3—（4, 5—ジメチルチアゾールー 2一ィル）一 2, 5—ジフニルテトラゾリゥムブロミド（MTT ; シグマ社製）リン酸緩衝食塩水溶液 10 1を加えて更に 4時間培養を铰けた後、顕微鏡で細胞の生育状態を観察する。また、 0. 04N HC 1含有 2—ブロビルアルコール 100 1を加えてよくかくはんし、 590 nmにおける吸光度を測定してこれを細胞增殖度とする。実施例 12

( 1 ) 市販のリンゴ製べクチンを 2. 5%になるように水に懇»し、次いで N a OHで P H 7. 0に 33整した後、分 S分子量 12000~ 14000の透析チューブに入れ、 15倍量の水で 4回透析した。透析後、再度 PH7. 0に翻整し、次いで 121てで 1時間加熱し、加熱処理液を閼製した。この加熱処理液の PH は PH5. 4であった。この加熱処理液を N a OHで P H 7. 0に 33整し、遠心処理によって不溶物を除去した後、 0. フィルター、 0. 45^mフィルタ一、 0. 22 mフィルターの類でフィルター処理を行い、フィルター処理液を翻製した。次いでこのフィルター処理液を分画分子置 1 0000の限外ろ過胰でろ過した。次に、この限外ろ過胰ろ液を減圧下壤縮乾固し、乾固物を最初にぺクチンを懸濁したときの 1 Z40置の水に溶解し、ぺクチン加熱処理物溶液を翻製した。

このべクチン加熱処理液を、水で平衡化したトヨバール HW— 40 Cカラム（ 4. 4 X 92 c m；東ソ一社製）にアブライして、流速 2. 5 m 1 Z分でゲルろ過を行い、各画分のアポトーシス锈発活性を実施例 8に記載のアラマ一ブルーを用いる方法で測定した。その桔果、溶出時間 448〜472分の間に溶出してきた画分が活性を示した。

(2) D— α—ガラクッロン酸を 1 %になるように水に溶解し、 NaOHで ρΗ 7. 0に調整した。これを 1 2 1 'Cで 20分間加熱し、加熱処理液を実施例 7の方法で HL— 60細胞に対するアポトーシス锈発活性を測定したところ、加熱処理物はアポトーシス锈発活性を示した。実施例 1 3

ぺクチン（和光純薬工業株式会社製 code 167-00542) 、アルギン酸（非膨潤型：和光純薬工業株式会社製 code 011-13341) 、 D- - ガラクッロン酸（ナ力ライテスク製 code 165-18 ) 、及び D-グルクロン酸（ナカライテスク製 co de 169-28) をそれぞれ 1 %になるように蒸留水に溶解し、各溶液を S製した。更に、ぺクチンは、 1 N 酢酸水溶液に溶解した溶液も 33製した。

次に、これらの 1 %溶解液を、 30分、 1時間、 2時閗、 4時間、 1 6時間、 12 1てで加熱処理を行った。各々の加熱処理物を N aOHで PH7に翻整した後、 0.22/zi のフィルター滅菌を行い、アポトーシス ¾|発活性の測定試料を翻製した。これらの試料の 2倍、 5倍、 10倍、 20倍、 50倍、 100倍希釈液を翻製し、そのアポトーシス誘発活性を実施例 1 1に妃載の MTT法でアツセィし、活性の強さを比較した。その結果を下記表 1 ~表 5に示す。

( A ) ぺクチンの 1 %水溶液の pHは PH 3. 4であった。ぺクチン加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表 1 に示すように、 1 20 て、 4時間の加熱処理で、活性が顕著に増加した。表 1 ぺクチン水溶液の加熱処理

(B ) ぺクチンの 1 %酢酸溶液の P Hは P H 2. 6であった。ぺクチン酢酸溶液の加熱処理物の活性は活性が 32められた最大希釈倍率で示した。表 2に示すように、 1 20で、 1 6時間の加熱処理で、活性が顕著に增加した。表 2 ぺクチン齚酸溶液の加熱処理

(C ) ガラクッロン酸水溶液の加熱前の P Hは P H 2. 5であった。ガラクッロン酸加熱処理物の活性は活性が 12められた最大希釈倍率で示した。表 3に示すように、 1 20 、 1時間の加熱処理で、活性が顕著に增加した, 表 3 ガラクッロン酸水溶液の加熱処理

(D ) グルクロン酸水溶液の加熱前の PHは PH 2. 4であった。グルクロン酸加熱処理物の活性は活性が認められた最大希釈倍率で示した。表 4に示すように、 1 2 0て、 3 0分の加熱処理で、活性が顕著に増加した。表 4 グルクロン酸水溶液の加熱処理加熱時間加熱前 pH 加熱後 PH 調整後 PH 活性

(最大希釈倍率）

30分 2.4 2.6 6.9 1 0倍

1時間 2.4 2.7 6.9 20倍

2時間 2.4 2.7 6.9 50倍

4時間 2.4 2.6 7.0 1 00倍

1 6時間 2.4 2.8 7.0 1 00倍 ( E ) アルギン酸水溶液の加熟前の P Hは P H3. 3であった。アルギン酸加熱処理物の活性は活性が 12められた最大希釈倍率で示した。表 5に示すように、 1 20て、 2時間の加熱処理で、活性が顕著に增加した。表 5 アルギン酸水溶液の加熱処理

実施例 1 4

エタノール洗浄（80%エタノール洗挣 → 50%エタノール洗浄 → 8 0%ヱタノール洗浄 → 1 00% タノール洗浄 ·* 減圧乾 ¾S → 粉末の粗精製べクチン）したべクチン（和光純薬社製 code 167-00542) 、未洗浄ぺクチン（和光純薬社製 code 167-00542) 、アルギン酸（非涠型： D -マンヌロン酸型：和光純薬社製 code 011-13341) 、アルギン酸（ K潤型：ぃグルロン酸型：和光純薬社製 code 014-13331) 、 D_グルクロン酸（ナカライテスタ社製 code 169-28 ) 、 D~ - ガラクッロン酸（ナカライテスク社製 code 165-18 ) を 0.5 Sずつ 1 0本（ 1本は未加熱のコントロール）の試 »管に人れ、空気中で、 120て、 150て、 1 80ての 3条件で、試料の色の変化を観察しながら乾熱を行い、色の変化に合せて、 3点でサンプリングし、以下の方法で活性成分を抽出した。乾熱試料を 12.5B1の 5 0 %·ェタノールに懸濁した。懸濁液を 1 6時間室温で振とうした後、遠心分雜して、抽出液を得た。この抽出液を濃縮乾固し、最初の試料換算で、 1 %漉度になるように蒸留水に再溶解した。溶解液の PHを 7付近に調整し、 0.22wmフィルトレーシ βン滅菌して、活性測定用の試料とした。これらの試料を用い、実施例 1 1に記載の ΜΤΤ法で活性のアツセィを行った。その結果を乾熱温度、時間、再溶解時の ΡΗ、 ¾整後の ΡΗと共に表 6〜表 1 1に示した。なお、未加熱の試料についても同様の操作を行ったところ、活性は認められなかつた。なお表 6~ 1 1において活性は活性を示した試料の希釈倍数を示す。このことより、乾熱処理によっても活性物質が産生されることが明らかになつた。表 6 EtOH洗浄（washed) ぺクチンの加熱処理

表 7 ぺクチンの加熱処理乾熱温度（て）時間（分）再溶解時の PH 33整後の PH 活性

(希釈倍数）

1 80 120 3.9 7.0 1 8 アルギン酸（D-マンヌロン酸型）の加熱処理乾熱温度（'C ) 時間（分）再溶解時の PH 調整後の PH 活性

(希釈倍数）

1 5 0 40 3.0 6.8

1 5 0 60 3.0 6.8 1

1 8 0 20 3.0 6.8

1 8 0 30 3.0 6.8

1 8 0 40 3.1 6.9

アルギン酸 (ぃグルロン酸型）の加熱処理乾熱温度（て）時間（分）再溶解時の PH 翻整後の PH 活性

{ e r fi、 v. ?6釈倍数

1 5 0 60 3.3 6.7 1

1 8 0 20 3.3 6.7 1

1 80 30 3.3 6.7 1

1 8 0 40 3.2 6.8 1

表 1 0 グルクロン酸の加熱処理

実施例 1 5 市販のリンゴ製べクチンを 1 %になるように水に溶解し、還流冷却器を取り付けたナス型フラスコに入れて 1 10~ 120てに設定した油浴中 18時間、 42 時間、及び 66時間加熱した。加熱中のぺクチン溶液の温度は 100~ 102 であつた。

上記べクチン溶液を遠心して沈 ¾を除き、その上清を 3倍及び 10倍に水で希釈した試料を調製した。希釈した試料 10 1 と 5000個の HL— 60細胞を含む 10%ゥシ胎児血清含有 R PM I 1640培地を 96穴マイクロタイタ一プレートのゥヱルに添加し、 5%炭酸ガス存在下 37 *Cで 48時間培養後、実施例 1 1に記載の MTT法で活性を測定した。

その結果、 18時間加熱べクチンの 3培希釈液添加区分、 42時間及び 66時間加熱べクチンの 3倍、 10倍希釈液添加区分において生細胞は観察されず、これらの希釈液 »度において 100て加熱べクチンは活性を示した。

一方、 1 8時間加熱べクチンの 10倍希釈液添加区分ではほぼすベての細胞が生細胞であつたが、対照の水添加区分と比べて 590 nmにおける吸光度は低かつた。実施例 16

ポモシンべクチン L M— 13 C G (ハーキュリーズ社製） 5 k gを水道水 10 0リットルに添加し、液温 28てから液温 12 O'Cとなるまで水蒸気吹き込みにより 35分間昇温させ、次いでかくはん下で 120て、 5時問保温し、次いで冷却し、冷却物 135リツトルを ¾製した。次いで冷却物にろ通助剤として、セラィト #545 (セライト社製） 1. 35 k 8T、及びシリカ #600— S (中央シリカ社製） 1. 35 k gを添加し、次いでセライト #545の 0. 1 k g、及びシリカ #600— Sの 0. 1 k gでブレコートしたコンパクトフィル夕一（6ィンチ 16段ろ紙： ADVANTEC#327) でろ過を行った。得られたろ液はプレートヒーター（日阪製作所製）による連枝瞬間加熱処理（98て、 60秒）を行った後冷却し、 150リヅトルのぺクチン加熱処理液 Iを翻製した。

ぺクチン加熱処理液 Iの PHは約 3. 5、酸度は 6. 2m 1、糖度は 5. 8 B r i x%であった。なお P Hは P Hメーターで測定し、酸度は試料 1 Om 1を P H7. 0に中和するのに要する 0. I N N a OH量（m I ) で表示した。更に糖度はプリックス糖度計で測定した。本べクチン加熱処理液 Iの、ヒト前骨《性白血病細胞 H L— 60細胞に対する活性を次のようにして測定した。

56て、 30分間処理した牛胎児血清（ギブコ社製）を 10%含む R PM I 1 640培地（曰水社製）にて 37てで培養した HL— 60 (AT C C CRL- 240) を上記培地にて 2. 5X 105 コ /4. 5m l となるように懸濁した。この懸額液 4. 5m lに対して、 20mg/m l、 10 m g/ 1 _Λ 5 m sr/m 1、 2m « /m 1 1 m gr/m 1 > 0. 5msrZm l、 0. 2 m sr /m 1 0. 1 m / 1になるように水で希釈した上記加熱べクチン溶液を 0. 5m 1添加し、 37て、 5%二酸化炭素存在下で 24時間及び 48時間培養した。

細胞培養液にトリバンプルー水溶液を加えて数分間室温で放匱した後光学顕微鏡で観察し、トリパンブルーを排除して無色の細胞を生細胞、青色に染色された細胞を死細胞として計数した。また培養細胞を光学顕微鏡で観察し、 l mg/m 1以上の加熱べクチンを添加した区分において核の凝縮、細胞の縮小、アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。なお 0. 5 m srZm 1以下の加熱べクチンを添加した区分と対照の水 0. 5 m 1添加区分においてはこれらの現象は 32められなかつた。

その桔果を図 1 2に示す。すなわち図 12は H L— 60細胞の培養液に様々な濃度の加熱べクチンを添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示す図であり、横軸は培養時間（時閗）、縦軸は培養液中の生細胞数（X 10⁵ コ /5m l ) を示す。図中において白四角印（口）は試料無添加（対照）、白逆三角印（V) は 2mgr/m l加熱べクチン添加、黒四角印（園）は 1 msrZm I加熱べクチン添加、黒ひし形印（令）は 0. 5 m g/m I加熱べクチン添加、黒丸印（參）は 0. 2msr/m 1加熱べクチン添加、黒三角印（▲) は 0. l mg/ m 1加熱べクチン添加をそれぞれ示し、 5〜20mfir/m 1加熱べクチン添加は白逆三角印（▽) の 2m gr/m 1加熱べクチン添加と同様な活性を示し、加熱べクチン 1 m 8： /m 1以上の添加で制がん作用が Sめられた。実施例 17

市販の D—グルクロン酸（シグマ社製 G 5269 ) を 1 %になるように水に溶解して 121 で 4時間加熱し、 N a OHで P H 7. 0に中和した後、水で 1 0倍、 40倍、 80倍、 160倍に希釈した液を作製した。 2. 5X 105個の HL— 60細胞を含む 10%牛胎児血清含有 RPM I 1640培地 4. 5m lに 0. 5m 1のグルクロン酸加熱物希釈液を添加し、 5%炭酸ガス存在下 37'Cで 24Bき ΙΙΠ培養した後、実施例 7の方法で細胞增¾抑制活性として制がん活性を測定した。その結果、 10~80倍希釈液添加区分では細胞数と細胞生存率の低下が見られた。また、 40〜80倍希釈液添加区分では DNAの低分子化が見られた。なお、細胞生存率 R ( ) は下記式で計算した。

R = Vs/ (Vs+Ds) X 10 O + Dc/ (Vc+ Dc) X 1 00

なお、式中で Vs、 Dsはそれぞれ試料添加時の生細胞数と死細胞数、 Vc、 Dc はそれぞれ水添加時の生細胞数と死細胞数を示す。 Rの碴が 50%になる培地 1 m 1中の制がん活性が 1単位となる。

得られた細胞生存率をグルクロン酸加熱物の希釈倍率の常用対数値に対してブロットすると各点は 1本の直線上に粱り、グルクロン酸加熱物での生存率 R (%) は下記式で算出される。

R= 58. 656 X- 31. 884

〔式中 Xはグルクロン酸加熱物の希釈倍率である〕

この直線から、グルクロン酸加熱物の非希釈物は 250単位/ m Iに相当することが明らかになった。

その結果を図 13に示す。すなわち図 13は H L— 60細胞に様々な希釈倍率のグルクロン酸加熱物を添加し、 24時間培養したときの希釈倍率と細胞生存率の M係を示す図であり、横軸は希釈倍率（倍、対数値）、縦軸は細胞生存率（％) を示す。実施例 18

( 1 ) リンゴ釗皮ピューレ（丸善食品工業社製）、バナナピューレ（小川香料社製）、青ジソエキス 1 / 4 (ダンフーズ社製）、パンプキンエキス 60 (ダンフーズ社製）、バンプキンミンチ（ダンフーズ社製）、セロリピューレ（ダンフーズ社製）、ゴボウピューレ（ダンフーズ社製）、エシャロットエキス 60 (ダンフーズ社製）の各 25%溶液を調製し、 1 21て、 40分の加熱処理を行った _t 又同様に各 25%溶液を調製し 1 21て、 4時間の加熱処理を行った。各処理液は冷却後、ろ過を行い、各加熱処理溶液を翻製した。

1 21て、 20分加熱処理物の糖度、 pHを表 1 2に示す。表 1 2 原料糖度 PH

(B r i X ) リンゴ剁皮ピューレ 3. 6 3. 6

バナナピューレ 6. 0 5. 9

青ジソエキス 1 Z 4 2. 2 5. 8

パンプキンエキス 60 1 6. 8 5. 3

ハ'ンブキンミンチ 4. 0 5. 7

セロリピューレ 1. 6 5. 5

ゴボウピューレ 2. 4 5. 8

ェシャロットエキス 60 1 5. 6 4. 9

1 2 1て、 4時間加熱処理物の糖度、 PHを表 1 3に示す, 表 1 3 原料糖度 PH

(B r i x) リンゴ釗皮ピューレ 3. 6 3. 6

バナナピューレ 5. 5 4. 6

青ジソエキス 1ノ 4 2. 5 5. 3

ハ*ンブキンエキス 60 1 6. 6 4. 7

ハ'ンブキンミンチ 3. 0 5. 0

セロリピューレ 1 - 6 4. 9

ゴボウピューレ 2. 5 4. 8

ェシャロット工キス 60 1 3. 8 4. 3

各加熱処理液は分子量分画 1万以下の画分に実施例 17記載の制がん活性が確 12された。

次に糖度（B r i X ) 値を 1に澳度饑整し、各加熱処理液の官能検査を行った。各加熱処理液共に食品用又は飲料用として良好な官能を示した。

(2) バナナピューレ、リンゴピューレ、セロリピューレの各々 25 %水溶液の 1 21て、 4時間加熱処理物を代表例とし、実施例 17記載の方法に準じ各加熱処理物の制がん活性単位を測定した。その結果を表 14に示す。加熱処理により制がん活性物質が各処理液で生成した。表 1 4

実施例 19

①大根葉、 ②人参葉、 ③人参、 ④キャベツ、 ⑤ナスの皮を除いた中身、 ⑥バナナ及び⑦ハッサクのアルべド各々 40 srに 1 60m 1の水を加えてミキサーでホモジナイズした。この一部を 1 21てで 4時間加熱した後遠心し、その上清を N aOHで p H6に翻整した物を試料 A、残りを HC 1で pH3に ¾整した後 12 1てで 4時間加熟し、その遠心上清を N a OHで PH 6に翻整した物を試料 Bとした。

①〜⑦から稠整した各試料 A、 Bを希釈し、希釈液 10 1を用い、制がん活性を実施例 1 1記載の MTT法で測定した。その結果を表 15に示す。なお、表 15に示す数値は活性が観察される希釈倍率であり、一は非希釈液添加区分で活性が観察されないことを示す。各果物、野菜においてその加熱処理物に活性の生成が 12められた。なお表中において希釈倍数は完全に細胞が死滅した希釈倍数、括弧内の数字は細胞に釤 Siの出た希釈倍数を示す。表 15

実施例 20

非膨潤性アルギン酸（和光純薬社製、 011-13341) 及び蟛涠性アルギン酸（和光純薬社製、 014-13331) を 1 %になるように水に ¾Sしたところ、 PHはそれぞれ 3. 32と 3. 38であった。これらを 121てで 20分間加熱し、実施例 7の方法で H L— 60細胞に対する細胞增殖抑制活性として、その制がん活性を測定した。但し、培餐閧始時の HL— 60細胞数は 3 X 105儷 /5m 1 とした。その結果を図 1 4に示す。すなわち図 14は H L— 60細胞の培養液に非膨潤性アルギン酸及びアルギン酸、蟛潤性アルギン酸の加熱処理物溶液を 1 m8r/m 1になるように添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の閱係を示す図であり、横軸は培養時間（時間）、 f¾軸は培養液中の生細胞数（X 10⁵倔 /5m 1 ) を示す。図中において白四角印 (□) は試料無添加（対照）、白菱形印（◊) は非膨潤性アルギン酸加熱処理物添加、白三角印（厶）は蟛涠性アルギン酸加熱処理物添加をそれぞれ示す。非膨潤性アルギン酸加熱処理物に高活性が認められた。実施例 21

アルギニ：；クァシツド HFD (大日本製薬社製）の 1 %の水懸 S溶液を調製し， 120*C> 4時間の加熱処理を行った。加熱処理液の遠心上清物について実施例 17記載の方法で制がん活性を測定し、制がん活性単位を算出した。結果を表 1 6に示す。アルギン酸加熱処理物に活性物質の生成が認められた。表 16

実施例 22

アルギニックァシド HFD (大日本製薬社製） 1 gを 5 Om Iの水に懸濁し、各 30分、 1時間、 2時間、 1 4時間、 121てで加熱処理した。各加熱処理物の溶液を遠心分離法で S3製し、その分子量を測定した。なお分子置測定は下記条件下で行った。

ガードカラム： TSKガードカラム PWH

カラム： TS Kゲル G3000PW

溶出剤： 0. 2M N a C 1

検出： 210 n mの吸収加熱時間 30分では分子量 1 800、加熱時間 1時間では分子量 1200、 6 30、加熱時間 2時間では分子量 1 100、 630、加熱時間 4時間では 1 10 0、 630、加熱時間 14時間では分子量 620、 400を各々主要ビークとする低分子分解物が生成しており、同時に低分子分解物も生成していた。なお分子量 1万以上の高分子は含有されず、制がん活性、抗菌活性は分子量 500以下の画分に認められた。実施例 23

( 1 ) 市販のダルクロノラクトン（メルク社製 code No. 100282) を 1 %になるように水に溶解し、 1 21てで0. 5時間、 1時間、 2時問、 4時間または 1 6時間加熱した。本加熱処理液の制がん活性を実施例 17の方法に従って測定した。加熱時間 0. 5時間で制がん活性物質の生成が認められ、制がん活性物質の生成は加熱時間を長くするに従って增加し、加熱時間 4時間、 1 6時間でそれぞれ加熱時間 0. 5時間の約 10倍となった。

( 2) 上妃グルクロノラクトンを 0. 1 %、 1 %、 2%> 5%、 10%、または 20%になるように水に溶解し、 121てで 4時間加熱した。本加熱処理液の制がん活性を実施例 1 7の方法に従って測定した。いずれの濃度においても制がん活性物質の生成が認められたが、使用したダルクロノラタトン当たりの加熱処理物の制がん活性の強度は、 0. 1 %ダルクロノラタトン水溶液を用いた場合が最も強かつた。

( 3 ) 上妃グルクロノラクトンの 1 %水溶液の P Hを HC 1または N aOHで 1、 2、 3、または 4. 5に »整し、 121てで 4時間加熱した。本加熱処理液の制がん活性を実施例 1 7の方法に従って測定した。グルクロノラクトンの加熱処理による制がん活性物質の生成は各 P Hで 12められたが、使用したダルクロノラクト当たりの加熱処理物の制がん活性の強度は P H 3から 4. 5で PH 1の約 1 5倍を示した。

( 4 ) 市販の D—グルクロン酸（シグマ社製 G 5269 ) を 1 %になるように水に溶解し、 1 2 1 'Cで 4時間加熱し、 P H未翻整の試料（PH2. 6) と N aOHでpH6. 6に翻整した試料を翻製した。各々を 1 m 1ずつ分注し、一 2 0 、 4て、 37てで保存した後、制がん活性を実施例 1 7の方法に従って測定した。

その結果、 25 S間保存後では、 37でで保存した場台に加熱処理物の制がん活性はやや減少していたが、— 4て、 - 20てではほぽ安定であった。実施例 24

ボモシンべクチンタイプ LM— 13CG (ハーキュリーズ社製 ) 、アルギニックァシッド HFD (大日本製薬社製）、 D—グルクロン酸（ナカライテスク社製）及びグルクロノラクトン（メルク社製）を 1 %となるように水に溶解、又は懇 S し、 95て、 121て又は 132てで 16時間加熱した。この加熱処理物の制がん活性単位を実施例 17の方法で測定した。その結果を表 17に示す。

表 1 7

実施例 25

( 1 ) 1. 5 sのリンゴぺクチン（和光純薬社製）を 100m 1の水にし、 N a OHで P H 12に 33整した。 N a 0 Hを徐々に添加して P Hを 12に保ちながら 4 で »梓した。 8時間経過後からは Ρ Ηの降下は見られなかった。 24時間経過後 H C 1で Ρ Η 5に瞩整し、 4倍容のエタノールを加え、 4てで 1時間 » 拌後據紙で ¾過した。沈 ίδを 65%エタノールに！ ¾いて 99. 5%エタノールで洗浄し、減圧下乾燥したところ 1. 32 srのべクチン酸を得た。 (2) 上記（ 1 ) で得られたぺクチン酸 200msrを 200m lの水に溶解し，濃塩酸 2m 1を徐々に加えた。 80てで 66時間加熱後、 20000X srで 30 分間遠心し、上清と沈殿を得た。上清を N a OHで pH7に翻製し、分画分子量 1 000の透析膜で水に対して透析した後凍結乾燥して 1 8. 4mgrの酸可溶性画分を得た。沈殿を 3 Om Iの水に懸濁し、 N aOHで PH6に ¾製し、分画分子量 1 000の透析膜で水に対して透析した後凍結乾燥して 1 1 4msrの酸不溶性画分を得た。

(3) 上記（2) で得られた酸可溶性画分と酸不溶性画分をそれぞれ 1 %になるように水に溶解し、 HC 1で PH3に ¾整した後、 12 1てで 20分間加熱した。これらの加熱処理物の制がん活性を実施例 2のアラマ一ブルーを用いる方法で細胞增殖抑制活性として測定した。その桔果、酸可溶画分加熱処理物に制がん活性が見られた。実施例 26

( A) D-グルクロン酸（ナカライテスク製 code 169-28 ) を蒸留水に 1 %になるように溶解し、 120 てで一晩加熱した後、 pHを 7付近に NaOHで翻節した。このグルクロン酸加熱物を用いて抗菌活性を下記の様に検討した。

被検菌を L-プロス（IX トリブトン、 0.5 %酵母エキス、 5X NaCl pH 7.0 )で、ー晚種培養した。 5麵1 のいプロスに 50^ 1、 100謹 1、 250 1、 500 I、 10 00 Iのグルクロン酸加熱物を添加した培地及び何も添加していない培地に 5 n I の種培養液を植菌し、 37てで振とう培養し生育を測定した。培養開始時と 8時間後に、富士デジタル濁度計（販売元苗士工業株式会社、製造元秋山電機製作所）を用い、翻製目盛を 82.3の条件で培養物の濁度を測定し、 8時間後の濁度の値から培養開始時の濁度の値も引いた値（生育濁度）で被検菌の生育を測定した。なお被検菌⑥については L一ブロスの代わりにブレインハートインヒュ一ジ _B ン培地を使用した。

被検菌としてはエシリヒアコリ（Escherichia col i) HB101 (ATCC 33694 ：被検菌①）、サルモネラティフィムリウム（Sal観 onel la typhi朧 uriuB) LT- 2 (ATCC 27106：被検菌②）、シユードモナスァルギノーサ（ Pseudcmonas a eruginose) ( 1F0 3080：被検菌③）、スタフイロコツカスァゥレウス（Staph ylococcus aureus ) 3A (NCTC 8319:被検菌④）、バチルスズブチリス（Bacil lus subtil is ) ( IFO 3034::被検菌⑤）、ストレブトコッカスミュータンス（ Streptococcus nutans) GS5 (国立予防衛生研究所保存株：被検菌⑥）を使用した , 表 1 8 加熱処理物添加量（ 1 /5 m 1 培地）

被検菌 0 50 100 250 500

① 239 1 83 8 Θ 6 10

② 247 177 36 5 1 1

③ 273 262 212 237 61

285 251 247 20 1 1

⑤ 280 258 205 73 13

® 1 40 1 36 131 125 10 各被検菌に対し加熱処理物は 100~500 1 /5m 1の添加のいずれかで抗菌活性を示した。なお加熱処理物はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ェンテロトキシン生産性黄色ブドウ球菌、哂吐型のバシルスセレウス、下痢型のバシルスセレウス、腸出血性大腸菌 0— 157にも抗菌活性を示した。

(B ) 食品添加用アルギン酸（アルギユックアシッド HFD ：大曰本製薬株式会社製）を蒸留水に 1 ¾ になるように溶解し、 120 'Cで一晩加熱した後、 PHを 7付近に NaOHで調節した。このアルギン酸加熱物を用いて上記の方法に頫じ、加熱処理液を 250~ 1000 l添加し、被検菌①〜⑥への抗菌活性を検討した' なお被検菌⑥の埸合は 1 500 1 まで添加した。その結果を表 19に示す。表 1 9

生育濁度

加熱処理物添加量（ u 1 / 5m 培地）

被検菌 0 250 500 1 000 1 500

① 239 30 8 1 3

② 247 10 8 1 2

③ 273 233 1 88 30

④ 285 222 12 1 5

⑤ 280 1 58 22 1 3

⑥ 1 40 1 38 1 30 10 1 12 各被検菌に対し加熱処理物は 250~1500 1 /5 m 1の添加のいずれかで抗菌活性を示した。なお加熱処理物はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、エレテロトキシン生産性黄色ブドウ球菌、 ¾吐型のバシルスセレウス、下痢型のバシルスセレウス、臈出血性大腸菌 0— 157にも抗菌活性を示した。実施例 27

市販のリンゴ製ぺクチン 58：を、 200mM N a C 1の 500 m Iに溶解し、 N a OHで PH7. 0に親整した。これを 1 2 1てで 30分間加熱処理後、更に Na OHで PH7. 0に再 31整した。 12， 000 r P m (約 1 0 , 000 X sr ) で 30分間遠心分離を行い、得られた上清（本試料）の制がん作用を閼ベた。マウス固形がん Me t h A ( 4 1 06細胞/マウス）を、 1 0週齡の BAL B/cマウス（メス、体重約 208Γ) の腹部に皮下注射した。その後、引き烷ぃて同じ面所に 10日間連耪して本試料（ l O Omsr/k g:/日）を皮下注射した。

—方コントロール群には、本試料の代りに生理食塩水を同様に皮下注射した。

2週間後にマウス腹部に形成された固形がん組織を摘出して、その重 Sを測定した。結果を表 20に示す。すなわちコントロール群においては、平均がん重置は 1. 268：であったのに対し、本試料投与群においてのそれは 0. 888：であり、約 30. 1 %のがん抑制率を示し、本試料に制がん作用が認められた。表 20

実施例 28

マウス白血病細胞株 P— 388 ( 1 X 106細胞 /_m 1 ) を、実施例 27で翻製した本試料（ 1 msr/m 1 ) と共に 10 %ゥシ胎児血清を含む R P M 1 164 0培地で 6時間インビトロ（ i n V i t r o) で培養した後、 5週齡の D B AZ2マウス（メス、体重約 208Γ) にそのまま l m l /マウスを腹腔内に注射した（P— 388 ： 1 X 106 細胞 Zマウス、本試料： 5 Omg k 8：) 。

一方コントロール群マウスには、本試料の代りに生理食塩水と共に、同様の条件で培養した P— 388を注射した。

それぞれ 8匹ずつの 2群において、マウスの生存数、平均生存日数、延命率を算定した。結果を図 15に示した。すなわち図 15は本試料の白血病細胞に対する制がん作用を示す図であり、縦軸はマウスの生存数、横軸は生存日数を示す。図中、破線はコントロール群を、実線は本試料投与群を示している。すなわちコントロール群では平均生存日数が 8. 0日であつたが、本試料投与群においては平均生存曰数は 1 4. 6曰であり、その延命率は 1 82. 5%を示し、本試料に有意な延命効果が認められた。

なお、同時に並行して行った実験で、 6時間インビトロで培養した後の P— 388細胞の生存率は本試料の添加、無添加の両処理とも差がなく、細胞生存率は各 100 %であつた。実施例 29

ガラクッロン酸又はダルク口ン酸を各々 50msrZm l となるように蒸留水に溶解し、 121てで 20分間加熱処理した後、 1 Nの Na OHで PH7. 0に ¾ 整した。本サンブルを、生理的食塩水で所定の壤度に希釈し、以下の試験を行つた。

( 1 ) M e t h A細胞（4X 10⁶ 細胞/マウス）を 8週令の B AL BZcマウス（雌、体重約 208Γ) の腹部に皮下注射した。その後、引き校いて同じ箇所に 1 0日間連 ί¾してガラクッ口ン酸加熱処理物（ 1 O Omsr/k sr/曰）又はグルクロン酸加熱処理物（ 1 OOmgrZksr/曰）を皮下注射した。

2週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出して、その重量を測定した _c 結果を表 21に示す。すなわち、コントロール群では平均がん重量は 1. 48 8：であったのに対し、ガラクッロン酸加熱処理物投与群では 0. 94s、ダルクロン酸加熱処理物投与群では 0. 86 gであり、抑制率は各々 26、 5 %、 41. 9%でいずれも有意（コントロール群に対し p <0. 05) な制がん作用が認められた, 表 2 1 マウス匹数腫攝重 S ( 8T) 抑制率 (%) 平均土 S D コントロ一ル 8 1. 48 土 0. 54

ガラクッロン酸加熱 6 0. 94 土 0. 25 26. 5

処理物

グルクロン酸加熱処理物 7 0. 86 土 0， 3 1 4 1. 9

(2) 6週齡の «I性 I CR系マウス（体重約 26 8：) 1 6匹を用い、 S a r c o m a - 1 80 ( 5. 5 1 06 細胞/マウス）を腹部に皮下注射し、コント口ール群 8匹及びダルク口ン酸加熱処理物投与群 8匹を設定した。

ダルク口ン酸加熱処理物投与群には、グルクロン酸化熱処理物の摂取量が約 1 gZ k g/曰となるよう上記ダルク口ン酸加熟処理物を水道水に希釈し、給水瓶にて自由摂取させた。コントロール群には同様に水道水を与えた。餌は両群とも実験期間中、自由摂食とした。

S a r c oma— 1 80皮下注射後 35日目の生存個体数はコントロール群で 8例中 2例、グルクロン酸加熱処理物投与群で 8例全例で、グルクロン酸加熱処理物の経口摂取による顕著な延命効果が SSめられた。実施例 30

マウス白血病細胞株 P - 388 ( 1 X 1 06 細胞 Zm 1 ) を実施例 29で翻製したガラクッロン酸加熱処理物（ 1 m g/m 1 ) 、グルクロン酸加熱処理物（ 1 m«/m 1 ) と共に 1 0%ゥシ胎児血消を含む RPM I 1 640培地で 6時間ィンビトロ（ i n V i t r o ) で培養した後、 8週令の DBAZ2マウス（雌、体重約 208Γ)にその l m lを-マウス腹腔内に注射した（P— 388 : 1 X 106 細胞 Zマウス、加熱処理物50018：/1< «r) 。コントロール群には生理的食塩水と共に同様の条件で培養した P— 388細胞（ 1 X 103 細胞/マウス）を注射した。なお、同時に並行して行った試驗で、 6時間のインビトロで培養した後の P— 388細胞の生存率は加熱処理物添加群と生理食塩水添加群においての差はなく、いずれも生存率 100%であった。各群それぞれマウス 8匹ずつを使用し、その生存数より、平均生存日数及び延命率を算出した。

結果を図 16に示す。すなわち図 16は各群の P— 388細胞移植後の日数とマウスの生存数の関係を示す図であり、 «(軸はマウス生存数、横軸はマウスの生存日数を示し、図中、実線はコントロール群、破線はガラクッロン酸加熱物投与群、二点鎖線はグルクロン酸投与群を示す。

図 16の結果から算出されるように、コントロール群では平均生存日数芽 1 1. 4曰であつたが、ガラクッロン酸加熱処理物投与群（50mgZk 8T) においては細胞移植後 24日目において平均生存日数 23. 5日以上、延命率 206. 1 %以上、グルクロン酸加熱処理物投与群 (5 Omsr/k においては平均生存曰数 16. 8曰、延命率 147. 3%を示し、それぞれコントロール群に比べ有意な延命効果が 38められた。実施例 31

1 08：の D—グルクロン酸（シグマ社製 G5269) を 1 1の水に溶解し、 121 で 4時間加熱した後 N aOHで ΡΗ7に中和した。

l X 105 m lのHL— 60細胞（ATC C C C L- 240 ) を含む 10% 牛胎児血清含有 RPM I 1640培地に 500 sr/m l、 5/ gr/m lまたは 0. 05 S/m 1の本加熱物を添加し、 5%炭酸ガス存在下 37'Cで 3日間培養した。次に培養細胞の一部をとつてスライドガラスに塗抹し、「組織培養の技術」（日本組織培養学会編、朝倉書店、 1982年） 19 1頁に記載のライト一ギムザ染色を行い、光学顕微鏡で分化程度を観察した。その結果、添加したグルク口ン酸加熱物の壙度に依存し、がん細胞が単球またはマクロファージ様細胞に分化し、培養細胞中の成熟骨髄細胞比率が高くなつた。その結果を図 1 7に示す。すなわち図 1 7は培養時間と、培養細胞中において成熟骨 ¾細胞の占める比率の閟係を示す図であり、横軸は培養時間（曰）、縦軸は培養細胞中において成熟骨髄細胞の占める比率（％) を示す。図 1 7において白四角印（口）は試料無添加 (対照）、白菱形印（◊) は 500 g/m 1 グルクロン酸加熱物添加、白丸印 (O) は 5 srZm 1 グルクロン酸加熱物添加、白三角印（厶）は 0， 05 g /m 1 ダルク口ン酸加熟物添加をそれぞれ示す。実施例 32

ダルク口ン酸加熱処理物の抗浪瘪作用

D-グルクロン酸（シグマ社製 G 5269) を 1 Om srZm 1 になるように蒸留水に溶解し、 1 2 1てで 4時間加熱処理した後、 1 Nの N a OHで PH7. 0に 33整した後、凍結乾燥処理により 200 msrZm 1 まで «縮し、グルクロン酸の加熱処理濃縮物を ¾製し、以下の実驗を行った。

W i s t a r ラット（体重 220〜275 sr) は、 24時間絶食し、実験開始 3時間前には絶水とした。

ラ -ノトに 99. 5%エタノールを 1 m 1経口投与し、 1時間後にエーテル麻酔下、胃を摘出した。摘出した胃は、幽門及び噴門を桔紮し、 1 %ホルマリン液を注入後、同液中に 1 0分間浸した。胃を大湾部に沿って切開し、腺胃部に発生している憤癟の長さ（mm) を測定した。

グルクロン酸加熱処理物投与群は、ェタノール投与の 30分前に 1 g/k 8：の割合で上記ダルク口ン酸加熱処理 »箱物を経口投与した。コントロール群には同様に、蒸留水を投与した。

ェタノール投与 1時間後の攛癢の長さは、コントロール群（N = 6) で 78. 2± 28. 5mm (平均 ± S. E. ) であった。一方、グルクロン酸加熱処理物投与群 (N = 3) では潰瘪は全く存在せず、顕著な抗潰瘰作用が認められた。実施例 33 注射剤実施例 8記載のエタノール処理の上清画分の «I縮乾固物を注射用蒸留水に溶解し、 1 %溶液を調製した。この溶液を凍桔乾燥用バイアル瓶 1バイアル中に、上清画分の乾 IS物換算で 1 Oms充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水 2m 1を添加した。実施例 34 注射剤

ガラクッロン酸を 1 Omsr/m 1 となるように注射用蒸留水に溶解し、 121 て、 20分間の加熱処理を行い、次いで冷却後中和処理を行い加熱処理物の中性溶液を翻製した。この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶 1バイアル中に、加熱処理物の乾煥物換算で 5 Omsr充てんし、凍桔乾燥を行った。別に溶解液として生理食塩水 2m 1を添加した。実施例 35 錠剤

下記処方に従い錠剤を頃製した。ぺクチン酸加熱処理物 l Omsr

コーンスターチ 65ms:

カルポキシメチルセルロース 20 m 8：

ボリビニルピロリドン 3 m 8：

ステアリン酸マグネシウム 2m8r

1錠当り計 l OOmgr

ぺクチンを実施例 7に記載の方法で加熱処理し、中和後の凍結乾 «I物をべクチン加熱処理物として使用した。実施例 36

緑茶葉 1 0 sr、ビタミン C O. 28Γ及びイオン交換水 1000m 1を用い、常法に従って緑茶を翻製した。本発明品 1は、実施例 16記載のぺクチン加熱処理液 Iを用い、製品 100m 1当り固形物換算で 50 mgrを添加した。対照は、無添加のものとした。パネラー 20名で、 5段階（5良、 1悪）の官能評価を行い，その桔果の平均値を表 22に示した, 表 22 官能評価本発明品 1 対照味の幅 4. 1 3. 2

味のバランス 3. 8 3. 4 味の総合 4. 1 3. 3

表 22より、本発明品 1は対照に比べて、味の幅と広がりが增し、味とのバンスが整い、茶の香味が引き立ち、隠し味の効果が出ているとの評価であった, 実施例 37

アルコール含有飲料を表 23に示す配合で、常法に従い翻製した。

表 23 配合表温州冷凍旗縮果汁（B r i X度 45) 1 10 8Γ グラニュー糖 80 sr クェン酸 2 8：

クェン酸ナトリウム 0. 58：

オレンジエッセンス 2 sr

5V/V%アルコール水溶液残余合計 1000m l 注：配合の飲料を 5てに冷却後、ソーダ一サイホンによって

炭酸を含有させる。本発明品 2は、実施例 16記載のぺクチン加熱処理物 Iを用い、製品 100m 1当たり固形物換算で 45 msr添加した。対照はべクチン加熱処理物 I無添加のものを用いた。官能評価は、実施例 36と同様にして行い、その結果を表 24に示した。表 24 官能評価本発明品 2 対照味の幅 3. 9 3. 3

味のバランス 4. 0 2. 7 味の総台 3. 9 3. 0 表 2 4に示すごとく、本発明品 2は対照に比較的し、味の幅と広がりが增した _t 特に、本発明品 2は酸味がマイルドになり、みかんの風味が引き立つように仕上がった。実施例 3 8

常法により調製された清酒を用い、本発明品 3は、実施例 93己載のぺクチン加熱処理物 I I を用い、製品 1 0 O m 1 当り固形物換算で 3 5 m rを添加した。対照は、ぺクチン加熱処理物無添加のものを用いた。

官能評価は、実施例 3 6と同様にして行った。評価項目に香り、舌ざわり感を追加し、その結果を表 2 5に示した。表 2 5 官能評俩

表 2 5より、本発明品 3は対照に比べて、味の幅や広がりが改善され、舌ざわり慼も向上して、 ¾好品としての味及び食惑が改善される効果を見出した。実施例 39

常法により ¾製されたみりん及び発酵調味料を用い、本発明品 4 (みりん）及び 5 (発酵翻味料）は、実施例 16記載のぺクチン加熱処理液 Iを用い、製品 1 00 m 1当り固形物換算で 40 mgを添加した。対照は、ぺクチン加熱処理物無添加のものを用いた。

官能評価は、実施例 36と同様にして行った。その結果を表 26に示した。表 26 官能評価

表 26より、本発明品 4及び本発明品 5は、それぞれの対照に比べ、味のバランスと幅において向上効果を示し、奥みのある味の調味料とすることができた。実施例 40

ふりかけとして、魚粉 4. 7 k sr、海苔 0. 8k s、ごま 2. 5 k s、食塩 1. 0 k sr グルタミン酸ソーダ 0. 5k srを混台し、常法に従って造粒して翻製した。

本発明品 6は、実施例 9 己載のぺクチン加熟処理液 I Iを用い、製品 100 sr 当り固形物換算 1 000ms:を添加した。対照は、ぺクチン加熱処理物無添加のものとした。これらふりかけを米飯にふりかけ、食感の官能轷価を実施例 3 6と同様にして行った。

その結果、本発明品 6は対照に比べて、口に含んだとき、米飯とよくなじみ、味のバランスがよく、マイルドに仕上がり、総合してふりかけの品質を向上させることがわかった。実施例 4 1

野菜、果物の加熱処理物を用いて、飲料を作成した。その配台を表 2 7に示す _t 表 2 7 人参（根茎部） 2 0 0 8：

パイナッブル（果実） 5 0 0 8Γ

バナナ（果実） 5 0 0 ?

グラニュー糖 7 6 8Γ

無水クェン酸 2 g

水残部針 2 0 0 0 8：

表 2 7の配合の人参、パイナップル、バナナは各々市販のミキサーを用いて充分にかくはん、粉砕して、ピューレ状とした。本発明用品はこれらの人参、バイナッブル、バナナのピューレを各々別に、密閉状態で 1 2 1て、 4時間の加熱処理を行った後、配合表に従って、混合し飲料とした。一方、対照は加熱処理することなく、そのまま配合表に従ってその粉砕物を混合し対照飲料とした。本発明品及び対照の官能評価を実施例 3 6と同様に行った < その結果を表 2 8に示す。表 2 8 官能評価（平均値）

表 2 8より、本発明品は対照と比較して、マイルドで味訓れに優れ、香りに一体感があり、舌触りもまろやかで、飲みやすい飲料に仕上がった。発明の効果

本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又は昂進あるいはがん疾患、ウィルス性疾患、潸瘪、歯周病等の治療剤として用いることができる。また本発明のアポトーシス 81発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウィルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス锈発阻害剤の開発等に有用である。特に、食用品中の本発明の糖化台物は食品として長い歴史を有するものであり、これらから調製した本発明の加熱処理物は経口投与の場合において、極めて安全性の高いものである。また本発明の加熱処理物を含有する食品又は飲料、本発明の加熱処理物を添加及び/又は希釈してなる食品又は飲料、食品用又は飲料用防腐剤等は当然安全性は高く、そのアポトーシス誘発作用、制がん作用、血管新生抑制作用、抗ゥィルス作用、抗潰摄作用等により、消化器系がん、インフルエンザウイルスによるかぜ等のウィルス性疾患、潰痛等の予防、治療に、肝機能改善等極めて有用である。以上、本発明の加熱処理物は、安価に簡便に製造でき、その種々の生理的機能により、食品又は飲料の添加剤として使用することにより、食品又は飲料に簡便に種々の生理的機能、抗菌力、アポトーシス誘発作用、制がん作用、抗ウィルス作用等を付与することができ、本発明の加熱処理物は食品又は飲料への添加剤、特に食品又は飲料用防腐剤として極めて有用である。

Claims

猜求の範囲

1. 下記（ a ) 、（ b ) 、（ c ) より iS択される少なくとも 1極の物の加熱処理物。

( a ) ゥロン酸又はゥロン酸锈導体、

( c ) ゥロン酸含有糖化合物含有物又はゥ口ン酸锈導体含有糖化合物含有物。

2. ゥロン酸がガラクッロン酸、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸及び/又はィズロン酸である 2寿求項 1に記載の加熱処理物。

3. 锈導体がゥロン酸ラクトン、ゥロン酸エステル、ゥロン酸アミド又はその塩である請求項 1 に記載の加熱処理物。

4. 糖化合物がぺクチン、ぺクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、へパリン、フコィダン、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン碇酸及びノ又はその分解物から透択される糖化合物である請求項 1に記載の加熱処理物。

5. 6 0〜3 5 0て、数沙~数日加熱処理して得られる加熱処理物である請求項 1 ~ 4のいずれか 1項に記載の加熱処理物。

6. 酸性〜中性の条件下で加熱処理を行って得られる加熱処理物である猜求項 1 ~ 5のいずれか 1項に妃載の加熱処理物。

7. 加熱処理物が分子分画物である請求項 1 ~ 6のいずれか 1項に記載の加熱処理物。

8. 3胄求項 1 ~ 7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を含有することを特 ¾とする食品又は飲料。

9. 讃求項 1 ~ 7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を添加及び Z又は希釈してなる猜求項 8に記載の食品又は飲料。

10. 請求項 1 ~ 7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を含有することを待 ¾とする制がん作用を有する食品又は制がん作用を有する飲料。

1 1 . 請求項 1 ~ 7のいずれか 1項に 3己載の加熱処理物を含有することを特徴とする抗菌剤。

12. 請求項 1 1 に記載の抗菌剤^含有することを待微とする防腐剤。

13. ^求項 1 1 に記載の抗菌剤を含有することを特 ¾とする齒磨剤。

14. 猜求項 1~ 7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を含有することを特微とするアポトーシス锈発剤。

15. 請求項 1 ~7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を含有することを特徴とする制がん剤。

16. 請求項 1 ~7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を含有することを特徴とするがん細胞分化誘導剤。

17. 猜求項 1 ~ 7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を含有することを特徴とする抗潸 ¾剤。

18. 請求項 1 ~7のいずれか 1項に記載の加熱処理物を有効成分として使用することを特徴とするアポトーシス锈発方法。

19. 下記（a) 、（b) 、（c ) より ¾択される少なくとも 1種の物を加熱処理する工程を包含することを特徴とする加熱処理物の製造方法。

( a) ゥロン酸又はゥロン酸 «導体、

( b ) クロン酸含有糖化合物又はゥロン酸锈導体含有糖化合物、

( c ) ゥロン酸含有糖化合物含有物又はゥ口ン酸誘導体含有糖化合物含有物。

20. ゥロン酸がガラクッロン酸、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸及び Z又はィズロン酸である耩求項 19に記載の加熱処理物の製造方法。

21. 誘導体がゥロン酸ラクトン、ゥロン酸エステル、ゥロン酸アミド又はその塩である猜求項 1 9E載の加熱処理物の製造方法。

22. 糖化合物がぺクチン、ぺクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、へパリン、フコィダン、コンドロイチン ¾£酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸及び/又はその分解物から選択される糖化合物である請求項 1 9に記載の加熱処理物の製造方法。

23. 60 ~350て、数秒〜数日の加熱処理である猜求項 19~22のいずれか 1項に 3S載の加熱処理物の製造方法。

24. 酸性 ~中性の条件下で加熱処理を行う諝求項 19〜 23のいずれか 1項に記載の加熱処理物の製造方法。

25. 加熱処理物の分子量分画を行う工程を包含する請求項 19~24のいずれか 1項に記載の加熱処理物の製造方法。