JPS609042B2 - 酸性多糖体の分取法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酸性多糖体の改良分取法に関する。

詳しくは結合組織から酸性多糖体を分取、調製するに際
して、結合組織をあらかじめ加熱処理した後に従来より
公知の方法に従って調製することによって、天然の状態
に近い性状を有するヒアルロン酸、コンドロィチン硫酸
などの酸性多糖体を収率よく、かつ工業的に大量に製造
することができる。ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
は他の酸性多糖体であるへパラン硫酸、ケラタン硫酸な
どと同様に皮膚、頃鞠帯、血管壁、階帯、軟骨、鶏冠な
どの結合組織中に広く存在する。

これら酸性多糖体は結合組織中においては蛋白質と結合
し、蛋白質糖複合体の形で細胞間隙に存在し、その高い
保水性によってゼリー状のマトリックスを形成して細胞
の代謝を円滑ならしめ、組織の柔軟性を維持するなど生
理的には細胞賦活という重要な機能を果しているとされ
ている。このような生理活性を有する酸性多糖体の中、
コンドロィチン硫酸は既に医薬品として、また化粧品基
材として広く用いられているが、他の酸性多糖体につい
てもコンドロィチン硫酸と同様な用途が期待される。

中でも含量、原料確保などの面から見て、ヒアルロン酸
に対する期待は大きい。ヒアルロン酸の製造法としては
多数の方法が報告されているが、高粘性の酸性多糖体で
あるヒアルロン酸は、加熱処理によって非可逆的に粘度
が低下、即ち品質が変化することが知られており、従っ
て結合組織からヒアルロン酸を調製する場合には過激な
加熱処理を避けて比較的温和な条件下で抽出する方法が
用いられていた。例えば、ニワトリのトサカから低温下
で水抽出し、アルコールで沈殿せしめた後除蛋白して得
る方法、またヒトの階帯を蛋白分解酵素で消化抽出し、
アルコールで沈殿せしめた後除蛋白し、ピリジン存在下
で硫安塩析して得る方法（以上松村剛：蛋白質核醗酵素
、１Ｑ２３３１９７１）などがある。これらの方法にお
いては、前者の方法ではニワトリのトサカを圧搾して血
液を除いた後細断してアセトン中に貯え、アセトン中の
着色がなくなるまで数回にわたってアセトンを取り換え
たものを原料とし、また後者の方法では糟帯は直ちに胎
盤から切り離し、水洗した後アセトン中に貯え、２〜Ｉ
Ｑ週間後に細断して新しいアセトン中に貯えたものを原
料としており、何れの方法においても前処理として原料
をアセトンで処理している。

これは原料の脱水る計るよりも、以後の操作を容易に行
なうためにアセトンを用いて組織中の脂肪分を除去する
ことを目的としたもので、小規模の実験室的製造に適し
たものであり、工業的な大量製造には不向きであり、特
にアセトンやピリジンを用いることは工業的な大量製造
には適切な方法とは云い難いｏ本発明者らはニワトリの
トサカからヒアルロン酸を調製する方法について研究を
行なった結果、鶏頭から切断、分離したトサカを直ちに
冷凍した場合と冷凍しなかった場合とでは得られるヒア
ルロン酸の収量ならびに品質に著しい差があり、また冷
凍したトサカを用いる場合、解凍条件によって得られる
ヒアルロン酸の収量ならびに品質に著しい差のあること
を見出し、本発明に到達した。

即ち、鶏頭から切断、分離した後直ちに冷凍したトサカ
を解凍を兼ねて加熱処理することによって天然の状態に
近い性状を有するヒアルロン酸ならびにコンドロィチン
硫酸を収率よく得ることができる。従って本発明の目的
は結合組織から天然の状態に近い性状を有するヒアルロ
ン酸、コンドロィチン硫酸などの酸性多糖体を収率よく
工業的に大量製造する方法を得ることにあり、本目的は
本発明の方法に従い、これら結合組織を分離後直ちに加
熱処理するか、あるいは直ちに冷凍し、解凍時加熱処理
することによって達成される。

次に本発明を詳細に説明する。

本発明の方法によって得られる酸性多糖体は前記の酸性
多糖体の何れも得られるが、特にヒアル。

ン酸およびコンドロィチン硫酸である。本発明の方法に
おいて用いる結合組織は前記の結合組織の何れにも適用
することができるが「 ヒアルロン酸およびコンドロィ
チン硫酸を工業的に大量製造するには含量、原料確保の
面などからみてニワトリのトサカまたはヒトの賭帯など
が適している。

通常これらの原料を大量に入手する場合、ニワトリのト
サカは鶏頭から切り離して凍結した状態で、またヒトの
賭帯は胎盤から切り離してアルコール漬けにした状態で
入手することができる。このような状態で入手した原料
をその形状のまま速やかに加熱処理した後に従来より公
知の方法に準じて蛋白質分解酵素を用いて消化、抽出し
、不溶物を除去した後塩化セチルピリジニウムを加え、
生じた沈殿を分取し、水洗後アルコールを含む食塩水に
溶かし、更にアルコールを加え、生じた沈殿を分取し、
これを水に溶かし、約０．６飽和になるように硫安を加
えて溶かし、更に有機溶媒を加え、析出する浮上物を分
取し、水に溶かし、脱塩後アルコールを加え、生じた沈
殿を分取、乾燥して高純度のヒアルロン酸を収率よく得
ることができる。他方、有機溶媒添加によって析出した
浮上物を除いた残りの液について水相を分取し、脱塩、
濃縮した後アルコールを加え、生じた沈殿を分取、乾燥
してコンドロィチン硫酸を得ることができる。ニワトリ
のトサカからこのようにして得られるコンドロィチン硫
酸はＢタイプが約８０％、残りがＡおよびＣタイプから
なっており、更にイオン交換樹脂を用いて分離、精製す
る方法（Ｓ．Ｓｃｈｉｌｌｅｒ、ｅ脚．：Ｊ．Ｂｏｉｌ
．Ｃｈｅｍ．、２３６、９８３、１９６１）、酢酸カル
シウムなどによる塩析法（ＫＮ燈ｙｅｒ．ｅｔ ａｌ．
：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ松．Ａｃｔａ．３２「
３１５、１９５６）など従来より公知の方法に従ってコ
ンドロィチン硫酸Ｂタイプを分離精製することができる
。

本発明の方法における加熱処理の温度は加熱時間との関
係で決ってくるが、約７０〜１３０００の温度範囲にお
いて約１０〜３００分加熱することによって目的を達す
ることができる。

この場合１００００未満の温度においては所定の温度の
温水中に原料を投入することによってトまた１００２０
を超える温度においては所定の温度の加圧・加熱釜中に
投入することによってその目的に達するこができる。加
熱温度が７０ｏｏ未満の温度では、加熱温度が低くなる
に従って目的物の抽出が不充分となり、１３０００を超
える温度では酸性多糖体、就中ヒアルロン酸が分解され
「品質の変化ならびに収量の低下を来たすので好し〈な
い。加熱時間も短時間では目的物の抽出が不十分となり
、又長時間でも品質の変化などを来し、目的物の収量が
低下するので好しくない。本発明の方法における加熱処
理に際しては原料をそのままの形状、即ち鶏頭から切り
離したままの形状、あるいは胎盤から切り離したままの
形状で加熱処理を行なうことによってのみ目的を達成す
ることができる。

原料をミッチあるいはホモジナィズなどの処理によって
細分化した後加熱処理を行なうと酸性多糖体、就中ヒア
ルロン酸の収量の低下ならびに品質の低下を来たすので
好しくなし、。また凍結状態にあるトサカを室温あるい
は流水中など温和な温度条件下に保って徐々に解凍した
後に加熱処理を行なっても本目的を達することはできず
、加熱処理によって迅速な解凍を行なうことによっての
み本目的を達することができる。

まだ鶏頭から切り離したトサカは室温に放置することな
く直ちに凍結するか、あるいは本発明の方法における加
熱処理を行なった後に凍結することによって本目的を達
成することができる。これらのことは、鶏頭から切り離
したトサカを加熱処理前に長時間室温に放置することは
好しくないことを示すものである。通常ニワトリのトサ
カは鶏頭から切り離した後直ちに冷凍され、凍結状態で
大量に入手することができるので、解凍を兼ねてそのま
）の状態で加熱処理を行なえばよい。また胎盤から切り
離した脂帯の場合はニワトリのトサカほど顕著ではない
が、室温にそのま）長時間放置した場合には特にヒアル
ロン酸の収量の低下および品質の変化の傾向がみられる
ので、胎盤から切り離した後直ちにアルコール漬けにす
るか、あるいは加熱処理することが望しし、。本発明の
方法における加熱処理によって結合組織、例えば凍結状
態にあるニワトリのトサカが迅速に解凍されるのは当然
であるが、組織中に共存するこれら酸性多糖体を分離す
る酵素が失活するので、これら酵素による影響が最少限
に喰い止められて天然の状態に近い性状を維持すること
ができ、他方、これら酸性多糖体が結合している蛋白質
が熱変性して蛋白質分解酵素の作用を受け易くなってい
るので酸性多糖体が抽出され易く、また加熱処理によっ
て原料中の脂肪分が溶出除去されるので以後の操作を容
易にするなどのために、天然の状態に近い性状を有する
酸性多榛体を収率よく得ることができるものと考えられ
る。本発明の方法において用いる有機溶媒はエタノール
、イソプロ／ゞノール、ｎ−フ。

ロ／ｆノール、ジオキサン、ピリジンなどである。以上
に詳述したように、本発明の方法に従ってニワトリのト
サカあるいはヒトの腰帯などの結合組織をその形状のま
ま、あなかじめ加熱処理した後に従来よりの公知の方法
に準じて抽出、分離、精製することによって天然の状態
に近い状態の性状を有する酸性多糖体を収率よく得るこ
とができる。

次に実施例、比較例によって本発明の分取法を詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り下記の実施
例によって限定されるものではない。

実施例 １ 鶏頭から切り離した後直ちに凍結したトサカ１０ｋ９を
１０その沸とう水中に投入し、沸とう状態に４５分間保
った後分取し、ミンチし、水１５夕を加え、袖を７．５
に調整し、プワナーゼ（科研化学■製、蛋白質分解酵素
の商品名）４５０００山単位を加えて５０℃に４時間保
った後炉逸し、炉液２．３夕に５％塩化セチルピリジニ
ゥム溶液２．６そを加え、生じた沈殿を炉取し、０．８
Ｍの塩化ナトリウムを含む３０％エタノールに溶かし、
更に同量のエタノールを加え、生じた沈殿を炉取し、水
１０〆に溶かし、０．７飽和になるように硫酸アンモニ
ウムを加えて溶かし、次いでエタノール３．２〆を加え
、析出した浮上物を分取し、洗条後水に溶かし、脱塩後
２倍量のエタノールを加え、生じた沈殿を分取、乾燥し
てヒアルロン酸６７夕を得た。

このものは極限粘度２９．入Ｎ ３．４０％、Ｓ Ｏ．
０％であった。極限粘度は日局八版一級試験法第２３頁
粘度測定法によって測定した。硫酸アンモニウム塩析に
よって析出した浮上物を除いた残液の水相を分取し、脱
塩後１′２蟹客まで濃縮し、５％になるように酢酸カル
シウム、０．弧になるように酢酸を加えてよく混和し、
次いで３５％になるようにエタノールを加え、生じた沈
殿を分取し、洗条後乾燥してコンドロィチン硫酸Ｂタイ
プ８夕を得た。

このものは極限粘度０．９ふ Ｎ ２．８０％、Ｓ ６
．４８％であった。実施例 ２アルコール漬けのヒト勝
帯ｌｋ９をアルコール中から取り出し、８０℃の温水２
〆中に１２０分間保った後分取し、ミンチし、水３夕を
加えてＰＨを７．５に調整し、プロナーゼ４５０００単
位を加えて４２０に５時間保った後炉過し、炉液２．５
〆に５％塩化セチルピリジニウム溶液２００の上を加え
、生じた沈殿を炉取し、０．８Ｍの塩化ナトリウムを含
む４０％エタノールに溶かし、更に同量のエタノールを
加え、生じた沈殿を分取し、水１夕に溶かし、０．７飽
和になるように硫酸アンモニウムを加えて溶かし、次い
でエタノール３６０の‘を加え、析出した浮上物を分取
し、洗条後水に溶かし、脱塩後２倍量のエタノールを加
え、生じた沈殿を分取、乾燥してヒアルロン酸４．０夕
を得た。

このものは極限粘度３２．ふ Ｎ ３．４５％、Ｓ Ｏ
％であった。実施例 ３鶏頭から切り離したトサカｉｏ
ｋ９を直ちに９３ｏｏの温水２０そ中に６０分間保った
後分取し、ミンチ後水２０そを加えてｐＨを７．０に調
整し、プロリシン（上田化学工業■製、蛋白質分解酵素
の商品名）５００００■単位を加えて５０ｏＣに３時間
保った後炉過し、得られた炉液について以下実施例１と
同様に処理してヒアルロン酸６．５夕、コンドロィチン
硫酸Ｂタイプ７．９夕を得た。

ヒアルロン酸は極限粘度２８．０ Ｎ ３．５１％、Ｓ
Ｏ％であった。

コンドロイチン硫酸Ｂタイプは極限粘度０．９３、Ｎ
２．８３％、Ｓ ６．５１％であった。実施例 ４鶏頭
から切り離した後直ちに凍結したトサカ５ｋ９を１２０
００に１０分間保った後分取し、ミンチし、水２０夕を
加えてｐＨ７．０に調整し、プロリシン３００００山単
位を加えて５０ｏ ０に４時間保った後炉過し、得られ
た炉液について以下実施例１と同様に処理してヒアルロ
ン酸３３夕、コンドロィチン硫酸Ｂタイプ３．９夕を得
た。

ヒアルロン酸は極限粘度２９．０ Ｎ ３．２９％、Ｓ
Ｏ％であった。

コンドロィチン硫酸Ｂタイプは極限粘度０．９３、Ｎ
２．８５％、Ｓ ６．７０％であった。実施例 ５鶏頭
から切り離した後直ちに凍結したトサカ１０ｋｇを７５
ｑｏの温水２０そ中に１８０分間保った後分取し、ミン
チし、水２０夕を加えてｐＨを７．５に調整し、プロリ
シン７００００■単位を加えて３７ｑ０に３時間保った
後炉遇し、得られた炉液について以下実施例１と同様に
処理してヒアルロン酸６４夕、コンドロィチン硫酸Ｂタ
イプ７．８夕を得た。

ヒアルロン酸は極限粘度２８．９、Ｎ ３．３８％、Ｓ
Ｏ％であった。

コンドロィチン硫酸Ｂタイプは極限粘度０．９６、Ｎ
２．９０％、Ｓ ６．８３％であった。比較例 １鶏頭
から切り離した後直ちに凍結したトサカについて以下の
条件に従って解凍した。

各試料はトサカ２ｋ９である。試料一１：雛とう水中で
３０分間加熱したもの試料−２：成可くばらばらにほぐ
した後室塩に２４時間放置したもの試料−３：成可くば
らばらにほぐした後４℃に９６時間放置したもの試料を
ミンチし、水４夕を加えてＰＨを７．５に調整した後プ
ロナーゼ９０００の単位を加え、以下実施例１と同様に
処理してヒアルロン酸を得た。

得られたヒァルロン酸の収量（乾燥物換算）ならびに極
限粘度は表１の通りであった。表・ 以上の結果から明らかな如く、本発明の方法に従って加
熱処理した試料−１に比して加熱処理を行なわなかった
他の試料では収量が少なく、かつ極限粘度も低かった。

このことは加熱処理を行なわなかった場合には原料から
ヒアルロン酸が抽出されにくいため収量が低下し、かつ
解凍中に原料中のヒアルロン酸の低分子化が生じている
ことを示すものである。従って天然の状態に近い性状を
有するヒアルロン酸を収量よく得るには加熱処理を行な
うことが必要であることは明らかである。比較例 ２比
較例１と同じ試料について、試料−２および−３につい
て解凍後試料−１と同様に沸とう水中で３び分間加熱し
、以下比較例１と同様に処理してヒアルロン酸を得た。

得たヒアルロン酸の収量（乾燥物換算）および極限粘度
は表２の通りであつた。表２ 以上の結果から明らかな如く、試料一１に比して他の試
料では収量も少なく、かつ極限粘度も低かった。

このことは解凍後に加熱処理を行なっても、天然の状態
に近い性状を有するヒアルロン酸を収量よく得ることは
できず、速やかに加熱処理を行なうことによってのみ本
発明の目的を達成できることは明らかである。比較例
３ 鶏頭から切り離したトサカについて次のような処理を行
なって試料とした。

各試料のトサカは２ｋ９である。試料一１：織とう水中
で３０分間加熱したもの試料−２：トサカを断面約５×
５側の大きさに細断した後鍵とう水中で３０分間加熱し
たもの 試料−３：トサカに水４夕を加えてホモジナイズした後
１００℃で３び分間加熱したもの試料一１および−２は
ミンチした後水４そを加え、試料−３そのものについて
、以下比較例１と同様に処理してヒアルロン酸を得た。

得たヒアルロン酸の収量（乾燥物換算）および極限粘度
は表３の通りであった。表３ 以上の結果から明らかな如く、試料一１に比して他の試
料では収量も少なく、かつ極限粘度も低かった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 結合組織から酸性多糖体を分取するに際して、前処
   理として結合組織をその形状のまま約７０〜１３０℃に
   加熱処理した後に蛋白質分解酵素処理し、常法により処
   理することを特徴とする酸性多糖体の分取法。