CN108430447A - 包含含有多肽和/或细胞培养物的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物 - Google Patents

包含含有多肽和/或细胞培养物的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含水溶性磨砂颗粒的非水基化妆品组合物，所述水溶性磨砂颗粒含有多肽或细胞培养物组分。更具体而言，本发明涉及包含0.01wt％‑15wt％的硬且有角的水溶性磨砂颗粒的非水基化妆品组合物，所述水溶性磨砂颗粒含有肽(各种多肽，包括寡肽)或细胞培养物组分。此外，本发明的化妆品组合物提供了非水基化妆品组合物，所述非水基化妆品组合物包含同时不含活性成分的水溶性赋形剂磨砂颗粒以用于保持或改善磨砂效果并用于控制粘度或体积。

Description

包含含有多肽和/或细胞培养物的水溶性磨砂颗粒的化妆品 组合物
技术领域
本发明涉及包含含有多肽和/或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物，更具体而言，本发明涉及包含相对于化妆品组合物的总量而言，0.01wt％-15wt％的硬且有尖角的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物，所述水溶性磨砂颗粒含有包含在细胞培养物中的组分或者多个氨基酸缩合的聚合物(如多肽和寡肽)。
背景技术
近年来，随着老龄化社会迅速发展，抗衰老化妆品备受瞩目，并且开发出了含有生长因子或干细胞培养基的生物化妆品。
作为与含有生长因子的化妆品相关的现有技术，韩国专利注册No.10-0433373、韩国专利注册No.10-1289062、韩国专利注册No.10-2013-0024316等已经向公众公开。
此外，与含有干细胞培养基的化妆品相关的现有技术包括韩国专利注册No.10-1063299、韩国专利注册No.10-1047873、韩国专利注册No.10-2010-0098298等。
然而，包含在干细胞培养基中的重组生长因子或生长因子是蛋白，随着物理或化学环境的变化，蛋白是不稳定的，并且容易水解(特别是在水存在的情形下)。因此，当将包含在干细胞培养基中的重组生长因子或生长因子添加到化妆品组合物中时，维持包含在干细胞培养基中的重组生长因子或生长因子的生物活性并不容易。
为了通过保护易水解蛋白的酰胺键以在储存或配送期间或者使用时长时间地维持各种肽的活性，尝试了将蛋白与包含多糖(例如甘露醇等)的组合物一起冷冻干燥以促进其稳定的方法，或将蛋白纯化至高纯度并向液相的纯化蛋白中添加添加剂来稳定蛋白的生物活性的方法。然而，此类技术不容易应用于化妆品中。
特别是，表皮生长因子(以下称为“EGF”)rh-寡肽-1(rh-oligopeptide-1)或sh-寡肽-1(sh-oligopeptide-1)的生物学活性降低，因为不仅在在室温下储存表皮生长因子的情形下，而且在当为了长期储存表皮生长因子而将其保持冷藏的情形下，均发生物理和化学变化。因此，在将表皮生长因子制成用于商品化的制剂(其中储存期和配送期是必需的)方面存在各种问题。
欧洲专利公开No.205,051公开了用于皮肤和眼部的作为霜剂组合物的组合物，该组合物包含EGF、1％-10％表面活性剂、5％-45％脂质和0.3％-0.8％防腐剂，其用于防止EGF的活性降低。
欧洲专利公开No.267,015和美国专利No.4,717,717公开了含有EGF的稳定组合物，其中，向EGF中添加水溶性纤维素聚合物。此外，欧洲专利公开No.398,619公开了含有EGF的稳定组合物，其中，向EGF中添加金属(如锌等)阳离子。
韩国专利公开No.10-1996-0013439公开了稳定的EGF组合物，该组合物含有选自于由以下物质所组成的组中的一种或多种：苯酚、聚乙二醇、脂肪酸盐、表面活性剂、蔗糖、脂肪酸酯、硫酸钠、氨基酸、牛磺酸、甘露醇、明胶、纤连蛋白、透明质酸以及有机酸缓冲溶液。
作为关于使EGF稳定的其它专利，韩国专利注册No.10-0570358公开了含有EGF和硒的纳米载体组合物以及使用该组合物的化妆品，韩国专利注册No.10-0752990公开了用于预防或治疗皮肤病的包含纳米脂质体和天然提取物的组合物。
尽管使用了常规技术，在室温配送条件、非无菌条件和水性条件下维持化妆品中EGF的活性并不容易。具体而言，当以化妆品中允许的非常低的浓度水平将EGF添加到化妆品中时，在储存、配送和使用所需的时期内几乎不可能维持EGF的活性。
此外，因为尽管向化妆品中添加了蛋白，由于其大分子量，蛋白并未很好地渗透进皮肤中，难以获得蛋白的效果。因此，在包含生长因子的生物化妆品中主要使用如下方法：采用使用蛋白转导结构域(PTD)的肽融合技术的方法；采用以脂质覆盖生长因子的脂质体技术来帮助皮肤渗透的方法；或者结合微针治疗系统(MTS)的方法。
本发明通过在非水性化妆品组合物中含有以尖锐的、硬且有角的颗粒形式形成的水溶性磨砂颗粒(所述水溶性磨砂颗粒含有多肽和/或细胞培养物组分)，能够长时间稳定地维持易水解肽的活性。
此外，通过将含有水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物施用在皮肤上，并使用包含皮肤乳液的水性基化妆品使磨砂颗粒溶解，由此证实了磨砂颗粒中所含的活性成分(各种肽生长因子或细胞培养物)具有深度渗透进皮肤角质化层的效果，从而完成了本发明。
本申请文件中术语肽是指其中2个至成千上万个氨基酸缩合聚合的物质，并且包括天然多肽、重组多肽或化学合成的多肽，包括所有的二肽、三肽以及寡肽蛋白等。
此外，本发明人通过以下完成了本发明：将不含活性成分(例如多肽或细胞培养物)的水溶性磨砂颗粒与含有活性成分的水溶性磨砂颗粒混合，并将混合物添加至非水性化妆品中，由此制备了能够在不降低磨砂效果的情况下控制含有多肽和/或细胞培养物的水溶性磨砂颗粒的含量的非水性化妆品组合物。
发明内容
技术问题
本发明的基本目的是提供包含0.01wt％-15wt％的尖锐的、硬且有角的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物，所述水溶性磨砂颗粒含有多肽。
本发明的另一目的是提供包含0.01wt％-15wt％的尖锐的、硬且有角的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物，所述水溶性磨砂颗粒含有细胞培养物组分。
本发明的另一目的是提供包含0.01wt％-15wt％的尖锐的、硬且有角的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物，所述水溶性磨砂颗粒同时含有多肽和细胞培养物。
本发明的另一目的是提供非水性化妆品组合物，所述非水性化妆品组合物包含总计0.01wt％-15wt％的含有上述多肽和/或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒，以及用于延展或粘度调节的不含多肽或细胞培养物组分的水溶性赋形剂磨砂颗粒。
技术方案
本发明的上述基本目的可通过提供包含0.01wt％-15wt％的尖锐的、硬且有角的含多肽水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物来实现。
水溶性磨砂颗粒可含有0.0001wt％至0.1wt％的多肽。本发明的多肽为其中2个至成千上万个氨基酸缩合聚合的物质，并且氨基酸的数量通常在2个至成千上万个的范围内、优选在2个至1000个的范围内、更优选在2个至100个的范围内、最优选在2个至80个的范围内。此外，水溶性磨砂颗粒优选以硬且有尖角的颗粒形式形成，并且可具有0.01mm至2mm的粒径。
可以理解的是，当粒径小于0.01mm时，磨砂效果可能会变差，当粒径大于2mm时，由于外部刺激感变得强烈，在皮肤上使用该水溶性颗粒是不优选的。更优选地，磨砂颗粒的粒径为0.1mm至1mm。
含有多肽的本发明的水溶性磨砂颗粒可另外包含多种类型的肽物质。用于本发明的肽可为生长因子，而且可为生长因子中的EGF。
此外，包含含有多肽的本发明的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物可进一步包含含有与所述含有多肽的本发明的水溶性磨砂颗粒不同的多肽的水溶性磨砂颗粒。此外，包含含有多肽的本发明的水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物可进一步包含用于延展或粘度调节的不含活性成分(例如多肽或细胞培养物组分)的水溶性磨砂颗粒。
本发明的非水性化妆品组合物可以精华剂、霜剂或洗剂的剂型形式制备，所述非水性化妆品组合物包含含有多肽和/或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒。本发明的非水性化妆品组合物在皱纹改善等方面具有出色的效果，所述非水性化妆品组合物包含含有多肽的水溶性磨砂颗粒。
本发明中的“生长因子”是指参与细胞分化和生长的肽。生长因子作为由细胞分泌的用于相互通信目的的具有相对低分子量的蛋白，发挥各种生理功能，并且特定的生长因子起到促进特定细胞分化的作用。
用于本发明的生长因子可为EGF。EGF作为来源于外胚层和中胚层的各种上皮细胞的强细胞分化促进因子，是广泛分布于体液中并具有53个氨基酸残基的肽(分子量为6200Da)。
肽EGF作为上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞增殖的强促进剂发挥功能，并在上皮细胞损失过程中促进上皮细胞的移动和增殖。因此，由于具有出色的伤口愈合作用和皱纹改善作用，肽EGF被用作化妆品的原料。
根据本发明的实施方式，EGF可为由重组大肠杆菌(E.coli)或植物制备的EGF，并被纯化至90％以上的纯度。当在使用3T3成纤维细胞的活性测量中将测量的活性值校正成英国国家生物标准和控制研究所(United Kingdom’s National Institute forBiological Standards and Control，NIBSC)的EGF标准产品时，所述EGF显示出每毫克100万国际单位(IU)或更高的活性。
由于在韩国，在化妆品中EGF的混合限制被规定为10ppm(0.001wt％)，并且EGF的价格相对昂贵，除了特殊的化妆品以外，通常以小量使用EGF。由于EGF容易受到水解的特征，在不得不以极少量使用肽EGF的化妆品中，肽EGF大多数情况下没有表现出活性。
如果假设在将肽EGF添加至化妆品中后肽EGF的活性得到维持，即使向1Kg化妆品中添加0.1mg(0.1ppm)EGF，1g化妆品中含有100IU的EGF。因此，即使将肽EGF施用于人体皮肤时，肽EGF可表现出足够的活性。
因此，在本发明中，使用含有1ppm至10,000ppm(相当于0.0001wt％至1wt％)肽EGF的水溶性磨砂颗粒，并且将化妆品组合物中含有上述浓度的EGF的水溶性磨砂颗粒的wt％调节为0.01wt％到15wt％之间，使得在化妆品组合物中最终的肽EGF含量总是在10ppm以下。
此外，为了在少许使用含有肽EGF的水溶性磨砂颗粒时防止磨砂效果降低，添加不含活性成分的水溶性磨砂颗粒，以用于磨砂效果的维持、延展和粘度调节的目的，使得化妆品中水溶性磨砂颗粒的总量的wt％为15wt％以下。
本申请文件中的水溶性磨砂颗粒优选以硬且有尖角的颗粒形式来形成。本发明的有尖角的颗粒可以多棱锥的形式形成。此外，有角的磨砂颗粒可为微针，所述微针以四面体形或棱椎形的微结构形式形成。
此外，微针的各个面可为平坦的，可包括不平整的，或者可为中空的。此外，可能存在缺陷，包括在微针的拐角或尖端的局部破损等。另外，可在微针的一个或多个面上形成凹陷部分，并且凹陷部分可具有对应于不超过微针高度的1/2的深度。
本发明的上述其它目的也可通过提供包含0.01wt％-15wt％的含细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物来实现。
水溶性磨砂颗粒可含有0.0001wt％至10wt％的细胞培养物的干物质。而且，水溶性磨砂颗粒可以有尖角的颗粒的形式形成，并且可具有0.01mm至2mm的粒径。可以理解的是，当粒径小于0.01mm时，磨砂效果可能会变差；当粒径大于2mm时，刺激感会变得强烈。因此，小于0.01mm和大于2mm的粒径都是不优选的。
更优选地，粒径为0.1mm至1mm。
含有细胞培养物的干物质的水溶性磨砂颗粒可另外包含肽。肽可为生长因子，并且可为生长因子中的EGF。
此外，包含含有细胞培养物的干物质的水溶性颗粒的本发明的非水性化妆品组合物可进一步包含含有肽的本发明的水溶性磨砂颗粒。肽可为生长因子，并且可为生长因子中的EGF。
包含含有细胞培养物的干物质的本发明的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物可以精华剂、霜剂或洗剂的剂型制备。包含含有细胞培养物的干物质的本发明的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物在皱纹改善、美白等方面具有效果。
包含含有肽或细胞培养物的干物质的水溶性磨砂颗粒的本发明的非水性化妆品组合物可包含油相组分，所述油相组分含有15wt％至25wt％的高级醇、40wt％至65wt％的油、2wt％至3wt％的蜡、以及5wt％至20wt％的乙酸生育酚。高级醇可为选自于以下中的一种或多种：鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、异硬脂醇和硬脂醇，或它们的组合。
油可为选自于天然植物油(例如霍霍巴油、氢化棕榈油、鳄梨油、橄榄油、杏仁油、澳洲坚果油、绣线菊油、棕榈油，椰子油和蓖麻油)中的一种或多种的混合物。
另外，蜡可为合成蜡、微晶蜡或它们的组合。
通过使本发明的化妆品组合物包含85wt％至90wt％、优选87wt％至88wt％的油相组分(所述油相组分含有高级醇、油、蜡和乙酸生育酚)，由此对所述化妆品组合物的硬度进行调节，从而易于将经硬度调节的化妆品组合物填充进容器中。
本发明的非水性化妆品组合物包含0.5wt％-1.9wt％的透明质酸、1.5wt％-10wt％的单糖以及0.0001wt％-0.01wt％的氨丁三醇，所述非水性化妆品组合物包含含有肽和/或细胞培养物组分的本发明的水溶性磨砂颗粒。然而，本发明的非水性化妆品组合物可进一步包含不含多肽或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒，该水溶性磨砂颗粒作为用于维持和改善磨砂效果或者调节粘度或体积的颗粒。
透明质酸可选自于透明质酸钠、水解透明质酸(hydrolyzed hyaluronic acid)及其组合。
单糖可选自于山梨糖醇、抗坏血酸及其组合。
用于维持或改善磨砂效果以及调节整个化妆品组合物的粘度或体积的成型磨砂颗粒(即，不含多肽或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒)起到以下作用：防止化妆品过度湿滑，以及调节化妆品的硬度，以使得化妆品适当地填充在容器中。
本发明的另一目的可通过提供非水性化妆品组合物来实现，在所述非水性化妆品组合物中，将用于成型、增稠或延展的水溶性磨砂颗粒额外地与本发明的含有活性成分的磨砂颗粒混合。提供了即使通过额外使用用于延展的水溶性磨砂颗粒使含有肽或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒从高wt％范围减少至低wt％范围，能够在皮肤上维持预定水平的磨砂刺激效果的技术手段。
因此，本发明的另一目的可通过提供非水性化妆品组合物来实现，所述非水性化妆品组合物包含0.01wt％-15wt％的含有肽或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒和不含活性成分的水溶性磨砂颗粒的混合物。
用于延展的水溶性磨砂颗粒可包含透明质酸或单糖。本发明的用于延展的水溶性磨砂颗粒不包括粒径为2mm以上的用于延展的水溶性磨砂颗粒。由于当用于延展的水溶性磨砂颗粒的粒径为2mm以上时刺激感变得强烈，粒径为2mm以上的用于延展的水溶性磨砂颗粒是不优选的。
通过将本发明的包含含有肽或细胞培养物的干物质的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物施用于皮肤上，并用手轻拍或摩擦该非水性化妆品组合物，从而使得以硬且有角的形状形成的水溶性磨砂颗粒的尖端、拐角等能够对皮肤施加物理压力，以移除皮肤的角质化层(参见图1和图6)。随后，使用水性基化妆品(例如皮肤乳液)使所施用的有角的水溶性磨砂颗粒溶解，以使得包含在本发明的水溶性磨砂颗粒中的活性成分(包括多肽或细胞培养物组分)被吸收到部分移除角质物质的皮肤中。
有益效果
本发明的化妆品组合物能够在储存和配送期间或者直到化妆品使用时，在常温下稳定地维持易水解的肽活性成分或包含在细胞培养物中的活性成分的活性，在所述化妆品组合物中，含有多肽和/或细胞培养物组分、并以硬且有角的颗粒形状形成的水溶性磨砂颗粒包含在非水性化妆品中。
此外，在皮肤上摩擦根据本发明的水溶性磨砂颗粒，存在部分地移除皮肤屏障(例如角质物质)的作用(参见图6)。因此，当在将包含含有活性成分的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物施用在皮肤上之后，使用水性基化妆品(包括皮肤乳液)使所述水溶性磨砂颗粒溶解时，通过使包含在本发明的磨砂颗粒中的活性成分(肽生长因子或细胞培养物)渗透并递送进部分移除角质化层的皮肤中，所述非水性化妆品组合物表现出出色的皮肤改善效果(参见图7、图8和图9)。
附图说明
图1为说明将包含角状的水溶性磨砂颗粒的本发明的非水性化妆品组合物施用于皮肤上的概念图。
图2为说明本发明实施例1中制备的含有肽生长因子的角状的水溶性磨砂颗粒(粒径为0.5mm)的显微照片。
图3为本发明实施例1中制备的含有细胞培养物的干物质的角状的水溶性磨砂颗粒(粒径为0.3mm)的显微照片。
图4为本发明实施例6中制备的用于延展的水溶性磨砂颗粒的照片。
图5为同时包含用于延展的磨砂颗粒和本发明的含有活性成分的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物的显微照片。
图6为通过以下获得的照片：用包含含EGF(EGF为肽)的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品对猪皮进行擦洗，用EGF抗体对EGF渗透进猪皮的程度进行染色，从而对EGF渗透的猪皮的横截面进行拍摄。
图7示出了通过以下获得的结果：对通过向人体施用包含含EGF(EGF为肽)的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品所获得的皮肤厚度和密度方面的变化效果，与未擦洗的对照组所获得的皮肤厚度和密度方面的变化效果进行统计学处理和比较。
图8示出了通过以下获得的结果：对通过向人体施用包含含EGF(EGF为肽)的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品所获得的皱纹改善效果与未擦洗的对照组所获得的皱纹改善效果进行统计学处理和比较。
图9为通过向人体施用包含含EGF(EGF为肽)的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品而得到的20位受试者的满意度水平评价结果。
具体实施方式
以下将对本发明的下列实施例或附图进行更详细地描述。然而，本发明可以不同的形式实施，并且不应解释为本发明受限于本文所示的实施例或附图。相反，提供这些实施例或附图是为了使本公开是彻底和完整的，并且将本发明的范围充分地传达给本领域技术人员。
实施例1：含有EGF或细胞培养物组分的水溶性磨砂颗粒的制备
含有EGF或细胞培养物组分的尖角状的水溶性磨砂颗粒通过以下制备：将混合溶液加载到板(所述板的拐角以成尖角的棱椎形状形成)上并在其中形成小孔，然后对加载在板上的混合溶液进行干燥，所述混合溶液通过将2g透明质酸、4g水和200μg EGF混合来获得，或者通过将2g透明质酸和4g细胞培养物混合来获得(参见图2或图3)。本实施例中使用的细胞培养物为韩国专利公开No.10-2010-0098298中描述的细胞培养物，含有多种生长因子，并且由于具有出色的皮肤再生作用而被用作化妆品的原料。
实施例2-实施例5
分别称量油相组分、含有活性成分(如多肽和/或细胞培养物组分)的水溶性磨砂颗粒、用于增稠和延展的赋形剂磨砂颗粒或组分之后，在将所称量的物质加热至60℃的情形下，在搅拌器中将所称量的物质缓慢、均匀地混合约5小时以制备混合物。通过将混合物冷却至30℃来制备本发明的包含有角的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物。包含有角的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品组合物(由表1中实施例4的组成制备)以油霜的形式形成，当通过显微镜对该非水性化妆品组合物进行观察时，从中可看到具有尖锐末端的有角的颗粒。
表1：
实验例1：皮肤施用/皮肤刺激/皮肤弹性的评价
在对实施例2-实施例5的化妆品组合物进行使用测试之后，将测试结果示于表2中。对10名女性进行清洁处理后，在这些女性的面部上均匀地按摩实施例的样品，在经样品按摩的女性的面部上施用水性基皮肤乳液，然后便能使用5分量表，就皮肤施用、皮肤刺激和皮肤弹性对施用水性基皮肤乳液的女性的面部进行评价，以获得平均值。
5分量表如下：
1分：非常不满意
2分：不满意
3分：一般
4分：满意
5分：非常满意
表2
评价项目 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
皮肤施用 3.5 4.1 4.0 3.8
皮肤刺激 4.0 3.9 3.7 3.5
皮肤弹性 3.7 3.9 4.2 3.8
参考表2，在本发明的实施例2-实施例5中制备的所有化妆品组合物在各个项目中均表现出一般以上的高满意度值。根据磨砂颗粒的含量，对关于有角的磨砂颗粒的皮肤刺激的反应表现出不同的倾向。
实验例2：随时间的稳定性的评价
为了评价根据实施例2-实施例5的组成制备的组合物随时间的稳定性，将组合物各自容纳于不透明的塑料注射器容器中，将容纳在不透明的注射器容器中的组合物在低温(4℃)、室温(25℃)和高温(55℃)下单独放置3个月，将内容物从不透明的注射器容器中挤出以对内容物随时间的稳定性进行评价，内容物随时间的稳定性示于表2中。
表3
如表3中所示，虽然本发明的化妆品组合物表现出出色的随时间的稳定性，本发明的化妆品组合物在高温下表现出颜色变化(由抗坏血酸引起)，而且实施例5的组合物(含有大量水溶性磨砂颗粒)在高温下发生轻微的相分离。
实验例3：活性稳定性的评价
使用根据实施例4的组成制备的组合物进行EGF的活性稳定性评价过程。为了评价稳定性，将组合物容纳于不透明的塑料注射器容器中，将容纳于不透明的注射器容器中的组合物在室温(25℃)和高温(55℃)下单独放置3个月，并通过以下方法确定来自内容物的EGF的活性。通过以与实施例4的组合物相同的量将有角的水溶性磨砂颗粒置于皮肤乳液(其为水性基化妆品)中而获得的混合物用作用于活性测量的测试对照组。
实验材料
为了测量EGF的细胞增殖活性，使用Balb/c 3T3成纤维细胞系(ATCC#CCL-163)，将DMEM培养基(含10％牛血清)用作用于细胞系传代的培养基，将UltraMEM无血清培养基用作用于分析的培养基。从英国NIBSC购买的hEGF(人表皮生长因子，rDNA来源，91/530，4000IU/4ug/mL)用作EGF活性测量的标准品，从而在EGF活性测量中使用hEGF。将MTS试剂用于测量由EGF引起的细胞增殖。
测量活性的方法
自生产三个月后，对本发明的化妆品的重量进行测量，将经过重量测量的化妆品置于UltraMEM无血清培养基(用于测量EGF活性的培养基)中(对测量重量的化妆品进行控制，以使得由磨砂颗粒的含量计算出的EGF的最终浓度为1μg/mL)，对置于UltraMEM无血清培养基中的经过重量测量的化妆品进行非常强烈地搅拌，通过离心获得水溶液，并将所述水溶液用于活性分析。在96孔板中将用于活性测量的提取物和EGF活性标准品以两倍进行连续稀释，从而将稀释的用于活性测量的提取物和EGF活性标准品各自以100uL的量注入孔中，将3×103个Balb/c 3T3成纤维细胞注入各孔中以获得混合物，并在5％CO2培养箱中于37℃下将混合物培养72小时。之后，将40μL MTS试剂注入各孔中以获得混合物，在5％CO2培养箱中于37℃下将混合物孵育4小时，通过酶标仪对经孵育的物质在490nm处的吸光度进行测量，并使用PLA 2.0程序通过平行线测定对EGF标准品和提取物的值进行比较，从而计算提取物的EGF活性，并计算每1g包含水溶性磨砂颗粒的化妆品组合物的EGF活性(考虑到提取回收率为60％)。
表4
温度 实施例4 对照组
室温(25℃) 3.60×103IU/g 0IU/g
高温(55℃) 2.05×103IU/g 0IU/g
如表4中所示，将水溶性磨砂颗粒添加到实施例4的非水性化妆品组合物中时的EGF活性比将水溶性磨砂颗粒添加到水性基化妆品中时(对照组)的EGF活性稳定得多。在室温下，添加到非水性化妆品组合物中的水溶性磨砂颗粒保持了5.0×103IU/g(实施例4的化妆品组合物中的初始EGF的平均活性值)的约72％的活性。即使在高温下，添加到非水性化妆品组合物中的水溶性磨砂颗粒保持了约41％的活性。因此，可见所述化妆品组合物表现出了非常出色的EGF活性稳定性。
实施例6用于延展的水溶性磨砂颗粒的制备
将混合溶液(其中透明质酸和水以1:2的比混合)薄薄地加载到平板或托盘上，并对加载到板或托盘上的混合溶液进行干燥，使用破碎机将板或托盘上的经干燥的混合溶液破碎成与有角的水溶性磨砂颗粒的粒径相似的粒径。之后，通过网或筛对破碎物进行筛分，以获得粒径为2mm以下的用于延展的不含肽生长因子或细胞培养物的干物质的水溶性赋形剂磨砂颗粒。
使用破碎机将经干燥的混合溶液(包含抗坏血酸)破碎成与有角的磨砂颗粒的粒径相似的粒径。用网或筛对破碎物进行筛分，以获得粒径为2mm以下的用于延展的不含多肽(生长因子)或细胞培养物的干物质的水溶性磨砂颗粒。
实施例7：非水性化妆品的制备
除了如下表5中所示的含有活性成分的本发明的有角的水溶性磨砂颗粒和用于延展的水溶性赋形剂磨砂颗粒以外，根据实施例4制备所有组合物的组分。
表5
实验例1
根据含有活性成分(如多肽(EGF)或细胞培养物组分)的水溶性磨砂颗粒与不含活性成分的水溶性赋形剂磨砂颗粒的混合比，对实施例7-实施例11的化妆品组合物进行皮肤刺激对比测试，并将测试结果示于表6中。皮肤刺激对比测试旨在基于该判断来对其中添加有含有活性成分的水溶性磨砂颗粒和不含活性成分的水溶性赋形剂磨砂颗粒的化妆品的皮肤刺激值之间的差异进行评价。对10名女性进行清洁处理后，在这些女性的面部上均匀地按摩实施例的样品，在经样品按摩的女性的面部上施用水性基皮肤乳液，然后便能够使用5分量表，对施用水性基皮肤乳液的女性的面部上的皮肤刺激进行评价，以获得平均值。
5分量表如下：
1分：存在非常大的差异
2分：有差异
3分：很难说
4分：没有差异
5分：没有大的差异
评价过程通过盲测进行，对包含含有活性成分的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品(作为对照组)和包含不含活性成分的水溶性赋形剂磨砂颗粒的非水性化妆品(作为测试组)之间的皮肤刺激值进行比较。
表6
如表6中所示，获得了以下结果：未能辨别对照组和测试组的皮肤刺激值之间的明显差异。此类结果说明通过控制不含活性成分的水溶性赋形剂磨砂颗粒的wt％，本发明能够提供包含含有各种浓度的肽生长因子或细胞培养物的干物质的水溶性颗粒的非水性化妆品组合物，而不会使含有活性成分的有角的水溶性磨砂颗粒的给予效果减小。
实施例12猪皮渗透测试
通过使用包含含有EGF的本发明的水溶性磨砂颗粒的非水性化妆品作为测试组，并使用具有与该非水性化妆品相同的内容物和量但不使用水溶性磨砂颗粒的EGF化妆品作为对照组，对测试组和对照组进行猪皮渗透测试，其中，除了将在对照组中使用的60％蒸馏水添加到测试组中以使得磨砂颗粒被蒸馏水溶解以外，在相同的组成和条件下对对照组和测试组进行猪皮渗透测试。
取0.1g测试组并将其涂覆在猪皮表面，擦洗猪皮表面上涂覆的测试组20秒，并向溶化磨砂颗粒中添加0.06g蒸馏水，以使溶化的磨砂液颗粒额外涂覆在猪皮表面上20秒。取0.16g对照组(EGF通过添加蒸馏水溶化)并涂覆在猪皮表面40秒。
在涂覆猪皮后，在4℃下将涂覆的猪皮培养12小时，使用10％固定液对培养后的猪皮进行固定，从而制成石蜡块并制作厚度为4mm的切片。将组织放置在载玻片上，从组织中移除石蜡并使移除石蜡的组织经过水合处理之后，对组织的切片实施封闭处理30分钟。用抗EGF抗体对经过封闭处理的组织进行处理，以在4℃下使组织与抗EGF抗体反应18小时。第二天，用PBS洗涤与抗EGF抗体反应的组织，将用PBS洗涤的组织用二抗进行处理，使组织与二抗通过DAB试剂进行反应以获得反应产物，并通过显微镜观察反应产物。
如图6中所示，证实了与对照组(图6B)相比，实验组通过擦洗移除角质物质的效果(图6C)。此外，证实了本发明的以下效果：比起对照组，能够通过擦洗使肽生长因子EGF较深地渗透到真皮部分中。
实施例13临床测试
对20名无皮肤疾病的健康成年男性和女性进行了关于皮肤皱纹改善的临床测试，更具体而言，对20名成年男性和女性进行了关于眼睛周围的皱纹的临床测试。将对照组涂覆在受试者的左眼周围，将测试组涂覆在受试者的右眼周围。对照组通过在使用对照组之前，向测试组中添加60％的蒸馏水以使用蒸馏水将测试组的水溶性磨砂颗粒溶化而获得。临床测试通过以下方法来进行：在眼睛周围皮肤上涂覆各样品，每天一次，并观察和测量眼睛周围皮肤上涂覆的样品8周。在对照组的情况中，在对施用区域进行清洁之后，将0.16g对照物质涂覆在清洁的施用区域上约40秒。在测试组的情况中，在对施用区域进行清洁之后，将0.1g测试物质涂敷在清洁的施用区域上。将对照物质和测试物质涂覆在施用区域上之后，擦洗涂覆在施用区域上的对照物质和测试物质约20秒，向施用区域上的经擦洗的对照物质和测试物质中添加约60μL蒸馏水，并使用蒸馏水额外擦洗施用区域上的经擦洗的对照物质和测试物质约20秒。在涂覆测试物质后1周、2周、3周、4周和8周，通过观察和测量施用区域上的对照物质和测试物质来执行测量处理。
使用A-one pro面部诊断设备，Ultrascan UC22皮肤超声设备，研究者总体评估(IGA)和患者总体评估(PGA)作为临床评价指标。根据皱纹严重程度评分量表(WSRS)(为5分量表)通过两位皮肤科医生的视觉评价对皱纹程度进行打分，来对IGA进行数字化。PGA通过4分量表将受试者的满意度数字化成值来表示。
临床测试的结果证实了相比于对照组，在测试组中皮肤真皮的厚度和密度增加(参见图7)，并且证实了通过含有肽EGF颗粒的擦洗使皮肤皱纹得到改善的效果(参见图8)。此外，由受试者的满意度调查结果证实了，通过相比于关于对照组的50％的满意程度，对于测试组表现出70％的高满意度，受试者显示出对擦洗的排斥较低(参见图9)。

Claims (17)

1.一种非水性化妆品组合物，所述非水性化妆品组合物包含0.01wt％-15wt％的含有多肽且粒径为0.01mm-2mm的有角的水溶性磨砂颗粒。
2.一种非水性化妆品组合物，所述非水性化妆品组合物包含0.01wt％-15wt％的含有细胞培养物组分且粒径为0.01mm-2mm的有角的水溶性磨砂颗粒。
3.一种非水性化妆品组合物，所述非水性化妆品组合物包含0.01wt％-15wt％的含有多肽和细胞培养物组分且粒径为0.01mm-2mm的有角的水溶性磨砂颗粒。
4.如权利要求1所述的非水性化妆品组合物，其中，所述非水性化妆品组合物进一步包含不含所述多肽或所述细胞培养物组分且粒径为2mm以下的有角的水溶性赋形剂磨砂颗粒，以使得水溶性磨砂颗粒的总含量为所述化妆品组合物的总重量的0.01wt％-15wt％。
5.如权利要求2所述的非水性化妆品组合物，其中，所述非水性化妆品组合物进一步包含不含所述多肽或所述细胞培养物组分且粒径为2mm以下的有角的水溶性赋形剂磨砂颗粒，以使得水溶性磨砂颗粒的总含量为所述化妆品组合物总重量的0.01wt％-15wt％。
6.如权利要求3所述的非水性化妆品组合物，其中，所述非水性化妆品组合物进一步包含不含所述多肽或所述细胞培养物组分且粒径为2mm以下的有角的水溶性赋形剂磨砂颗粒，以使得水溶性磨砂颗粒的总含量为所述化妆品组合物总重量的0.01wt％-15wt％。
7.如权利要求4所述的非水性化妆品组合物，其中，所述含有多肽的有角的水溶性磨砂颗粒含有0.0001wt％-1wt％的所述多肽。
8.如权利要求5所述的非水性化妆品组合物，其中，所述含有细胞培养物组分的有角的水溶性磨砂颗粒含有0.0001wt％-10wt％的所述细胞培养物组分。
9.如权利要求1或4所述的非水性化妆品组合物，其中，所述多肽为表皮生长因子。
10.如权利要求2或5所述的非水性化妆品组合物，其中，所述细胞培养物组分包含表皮生长因子。
11.如权利要求3或6所述的非水性化妆品组合物，其中，所述多肽为表皮生长因子，所述细胞培养物组分包含表皮生长因子。
12.如权利要求2、5或8所述的非水性化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物以选自于由以下所组成的组中的剂型形式形成：精华剂、霜剂和洗剂。
13.如权利要求4所述的非水性化妆品组合物，其中，所述不含所述多肽或所述细胞培养物组分且粒径为2mm以下的有角的水溶性赋形剂磨砂颗粒包含透明质酸或单糖。
14.如权利要求5所述的非水性化妆品组合物，其中，所述不含所述多肽或所述细胞培养物组分且粒径为2mm以下的有角的水溶性赋形剂磨砂颗粒包含透明质酸或单糖。
15.如权利要求6所述的非水性化妆品组合物，其中，所述不含所述多肽或所述细胞培养物组分且粒径为2mm以下的有角的水溶性赋形剂磨砂颗粒包含透明质酸或单糖。
16.如权利要求1、4或7所述的非水性化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物以选自于由以下所组成的组中的剂型形式形成：精华剂、霜剂和洗剂。
17.如权利要求3或6所述的非水性化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物以选自于由以下所组成的组中的剂型形式形成：精华剂、霜剂和洗剂。
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