CN103127202B - 利用红参的红景天发酵物的制造方法及含有该发酵物的改善疲劳和提高运动能力的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用红参的红景天发酵物的制造方法及含有该发酵物的改善疲劳和提高运动能力的组合物，具体涉及一种红景天发酵物的制造方法，为了制造红景天发酵物，该方法包括在红景天提取物中混合红参提取物或将红景天和红参混合而制造红景天和红参的混合提取物的步骤；以及在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵的步骤，还涉及含有由此制造的红景天发酵物作为有效成分的恢复疲劳及提高运动能力的健康功能食品或药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及红景天发酵物的制造方法以及该发酵物作为医药和健康功能食品的用途。
背景技术
红景天（rhodiolarosea）是广泛分布生长在欧洲和亚洲高山地带的植物，是对刺激神经系统、减少抑郁症、提高作业能力、恢复疲劳以及预防高山病等有效的传统药物，在东欧和亚洲有很长的使用历史。尤其是，多在长白山海拔1800m～2300m之间的长有苔藓的原始森林中的白桦林和峡谷的岩石之间生长的多年生草本植物，具有在温差大、干燥、缺氧和紫外线强的高山地带的环境中也能生长的特殊的适应力，因此还称为高山景天或高山红景天等。
红景天的主要成分有红景天苷（Salidroside）、酪醇（Tyrosol）及配醣体，除此之外还有淀粉、蛋白质、脂肪、糖类、黄酮类化合物、氨基酸、无机元素、微量精油等。对红景天的现代研究是从19世纪50年代开始的。已知具有一部分优于人参的药理作用，被证明为完全不具有人参所具有的副作用的新药物，因此，近来在国内外收到广泛瞩目。
已报道红景天的主要功能有恢复元气、长寿、预防肌无力、恢复疲劳等。近来在人们的关注中，对红景天的效果进行了活跃的研究，特别是其作为红景天酒、口服药胶囊、茶、口香糖、糖等30多种健康功能食品或药品的原料，其价值得到了认可，因此对其产品的开发进一步增加。
韩国注册专利第0439209号涉及一种体能增进用天然茶，该天然茶包含作为第一原料的红景天和作为第二原料的选自草苁蓉、蛇床子以及菟丝子中的一种，并且由10～95重量%的第一原料和5～90重量%的第二原料组成；韩国注册专利第0204166号涉及一种含有杜仲、刺五加皮、大枣、枸杞子和甘草以及红参或红景天的抗压力健康食品；都是以红景天提取物本身作为有效成分，并没有记载红景天发酵物，更没有公开单独使用红景天是几乎无法发酵的事实。
本发明的发明人在为了增进红景天的与提高抗疲劳或运动能力相关的活性、并为了生物转化成有利于被人体吸收的红景天苷的非配醣体而对红景天乳酸菌发酵物的制造方法进行研究的过程中，发现在几乎不单独进行发酵的红景天中添加红参时，能够进行发酵，从而得到具有优异的抗疲劳或提高运动能力的功能的组合物，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供难以单独发酵的红景天的发酵方法，并提供与抗疲劳或提高运动能力相关的活性优异、且有利于人体吸收的红景天苷非配醣体含量高的红景天发酵物。
为了制造红景天发酵物，本发明提供一种红景天发酵物的制造方法，该方法包括在红景天提取物中混合红参提取物或将红景天和红参混合而制造红景天和红参的混合提取物的步骤；以及在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵的步骤。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，在上述红景天和红参的混合提取物中，以固体成分为基准，红景天和红参的混合比例或红景天提取物和红参提取物的混合比例为60：40～10：90。
本发明的红景天提取物的制造方法，其特征在于，在上述红景天和红参的混合提取物中，红景天的固体成分含量为0.1～0.8重量%。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述乳酸菌是选自乳酸杆菌属乳酸菌、双歧杆菌属乳酸菌及片球菌属乳酸菌中的一种以上的乳酸菌。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述乳酸菌是选自嗜酸乳杆菌[KCTC2182]、长双歧杆菌[ATCC15707]、短双歧杆菌[ATCC15700]及戊糖片球菌[KCCM11088P]中的一种以上的乳酸菌。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述进行发酵的步骤在25～40℃进行24～96小时。
另外，本发明还提供一种用于恢复疲劳和提高运动能力的健康功能食品，其中，将在红景天和红参的混合物提取物中接种乳酸菌进行发酵而得到的发酵物作为有效成分。
另外，本发明还提供一种用于抗疲劳及运动障碍治疗和预防的药物组合物，其中，将在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵而得到的发酵物作为有效成分。
本发明提供难以单独进行发酵的红景天的发酵方法，另外，通过本发明的方法制造的红景天和红参的混合发酵物具有优异的与抗疲劳或提高运动能力相关的活性，且有利于人体吸收的红景天苷非配醣体的含量高，因此可以用作新型健康功能食品或药品的有效成分。
附图说明
图1是在本发明的制造例、实施例及比较例中使用的红景天的照片。
图2a、2b、2c及2d分别是表示实施例1的红景天提取物固体成分含量为0.5重量%、1重量%、3重量%及5重量%时，根据乳酸菌的种类及培养时间的pH值变化的图表。
图3a、3b及3c是表示实验例3的比较例5（●）、实施例3实施例4及比较例6（○）的根据培养时间的pH值、酸度及活菌数变化的图表。
图4a及4b是分别表示显示实验例4的制造例3-2和实施例3的总糖及酸性糖含量的图表以及显示蛋白质含量的图表。
图5a、5b及5c是分别表示实验例4的红景天苷及其非配醣体标准品的HPLC色谱图、制造例3-2的HPLC色谱图及实施例3的HPLC色谱图。
图6是测定实施例5的比较例5、实施例3、红参发酵物及维生素的DPPH自由基清除能力并进行比较的图谱。
图7a、7b及7c是实施例6中用于确认对肌细胞的H2O2引起的氧化损伤抑制效果的肌细胞显微镜照片和表示细胞生存能力的MTT实验结果图表，图7a表示制造例3-1的结果，图7b表示比较例5的结果，图7c表示实施例3的结果。
图8a、8b、8c及8d是实施例7中用半定量RT-PCR对Cu/Zn-SOD、GPx及转录因子myoD的基因表达进行分析的结果，图8a是将RT-PCR产物进行电泳后确认DNA条带的结果，图8b是MyoD的基因表达，图8c是Cu/Zn-SOD的基因表达，图8d是GPx的基因表达结果的图表。
具体实施方式
本发明提供一种红景天发酵物的制造方法，为了制造红景天发酵物，该方法包括在红景天提取物中混合红参提取物或将红景天和红参混合而制造红景天和红参的混合提取物的步骤；以及在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵的步骤。
在本发明的上述红景天和红参的混合提取物中，以固体成分为基准，红景天和红参的混合比例或红景天提取物和红参提取物的混合比例为60：40～10：90；优选55：45～50：50。如果红景天或红景天提取物的混合比例超过上述上限值时，乳酸菌的增殖会受到抑制，红景天苷的生物转化受到抑制，因此无法使抗氧化效果、抑制肌肉氧化应激的效果以及提高运动能力的效果达到满意的水平。如果红景天或红景天提取物的混合比例小于上述下限值时，虽然能够较好地进行乳酸菌发酵及红景天苷的生物转化，但是来自红景天的有效成分含量会减少，因此无法使抗氧化效果、抑制肌肉氧化应激的效果以及提高运动能力的效果达到满意的水平。
本发明的上述红景天和红参的混合提取物中，红景天的固体成分含量为0.1～0.8重量%，优选0.2～0.6重量%；超过上述上限值时，即使过量添加红参，也无法充分进行乳酸菌的增殖及发酵；如果未达到上述下限值，来自红景天的有效成分含量减少，仍然无法使抗氧化效果、抑制肌肉氧化应激的效果以及提高运动能力的效果达到满意的水平，制造收率低而效率低。
本发明的红景天发酵物的制造中，可以使用选自乳酸杆菌属、双歧杆菌属及片球菌属中的一种以上的乳酸菌。优选上述乳酸菌为选自嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌及戊糖片球菌中的一种以上，更优选选自在韩国食品研究院保藏中的嗜酸乳杆菌[KCTC2182]、长双歧杆菌[ATCC15707]、短双歧杆菌[ATCC15700]及戊糖片球菌[KCCM11088P]中的一种以上的乳酸菌，最优选嗜酸乳杆菌[KCTC2182]、长双歧杆菌[ATCC15707]。
本发明的红景天发酵物的制造方法的进行发酵的步骤在25～40℃进行24～96小时。
通过上述方法制造的本发明的红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵的发酵物，显示抗氧化效果，抑制肌细胞的氧化应激、具有提高运动能力的活性，因此可以制造出将在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵而得到的发酵物作为有效成分的健康功能食品或药物组合物。
另一方面，在本说明书中用语“作为有效成分含有”是指含有用于达到本发明的红景天发酵物的效能或活性所充分的量。在本发明的一实施方式中，本发明的组合物中含有例如0.001mg/kg以上、优选为0.1mg/kg以上、更有选为10mg/kg以上、进一步优选100mg/kg以上、更进一步优选250mg/kg以上、最优选0.1g/kg以上的红景天发酵物。红景天发酵物是天然物，即使过量使用，人体也不会产生副作用，因此本发明组合物中所含有的红景天发酵物的含量的上限可以由本领域技术人员在适当范围内进行选择而实施。
本发明的用于抗疲劳及运动障碍治疗和预防的药物组合物，除了上述有效成分之外，还可以使用适于药剂学并且生理学上所允许的助剂来制造，上述助剂可以使用赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、包覆剂、膨胀剂、润滑剂、滑剂或香味剂等。
为了将上述药物组合物进行给药，除了上述的有效成分之外，还可以含有药学上可允许的1种以上的载体而很好地制成药物组合物。
上述药物组合物的制剂形态可以是颗粒剂、散剂、片剂、包衣片、胶囊、栓剂、液体制剂、糖浆、汁、混悬剂、乳剂、点滴剂或可注射的液体剂等。例如，为了制成片剂或胶囊剂的形态，有效成分可以与乙醇、甘油、水等口服无毒性的药学上可允许的惰性载体结合。此外，需要或必要的情况下，可含有适合的结合剂、润滑剂、崩解剂及发色剂或混合物。适合的结合剂包括淀粉、明胶、葡萄糖或β-乳糖等天然糖；玉米甜味剂、刺槐、黄蓍胶或油酸钠等天然及合成胶；硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等，但不限于此。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但不限于此。
作为制成液状溶液的组合物中的可灭菌及对人体适合的可允许的药物载体，可以使用生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、以及可以将这些成分中的1种以上成分混合使用。根据需要，还可以添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他通常的添加剂。另外，还可以进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂以及润滑剂，制成水溶液、混悬液、乳液等注射用剂型，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。
进而，可以利用本领域的适当方法，即在Remington'sPharmaceuticalScience,MackPublishingCompany,EastonPA中公开的方法，根据不同疾病或成分优选地进行制剂。
本发明的药物组合物可口服给药或非口服给药，非口服给药时，可通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药等方式给药，优选口服给药。
本发明的药物组合物的适合的给药量，根据制剂方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病患状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素而不同，一般熟练的医生能够容易的决定和开具对所期望的治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实施方式，本发明的药物组合物的1日给药量为0.001～10g/kg。
本发明的药物组合物，根据本领域技术人员所能容易实施的方法，利用药学上可允许的载体和/或赋形剂进行制剂化，可制造成单位容量的形态或制造成装在多容量容器内。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、混悬液或乳化液形态，或者是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，还可以进一步含有分散剂或稳定剂。
本发明还提供一种含有红景天发酵物作为有效成分的用于恢复疲劳及提高运动能力的健康功能食品。
在本发明中所说的健康功能食品是指，米糠提取物或米糠粉末添加到饮料、茶类、香料、口香糖、饼干类等食品原料中，或者制造成胶囊、粉末、混悬液等的食品，人体将其摄取后能够为健康带来特定效果，与普通药品不同，是以食品为原料，因此具有不会产生长期服用药品时发生的副作用等的优点。如上述制造的本发明健康功能食品由于能够在日常摄取，因此非常有用。在如上述的健康功能食品中，红景天发酵物的添加量根据对应的健康功能食品的种类而不同，无法进行统一的规定，但是在不影响食品原来的口味的范围内添加即可，相对于对象食品，通常为0.01～50重量%，优选0.1～20重量%的范围。另外，如果是丸剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态的健康功能食品时，通常在0.1～100重量%、优选为0.5～80重量%的范围进行添加即可。在一具体实施方式中，本发明的健康功能食品可以是丸剂、片剂、胶囊剂或饮料的形态。
本发明的健康功能食品除了作为有效成分的红景天发酵物之外，还可以含有制造食品时通常添加的成分，例如含有蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂以及香味剂。上述碳水化合物的例子有例如葡萄糖、果糖等单糖；例如麦芽糖、蔗糖、寡糖等双糖；以及例如糊精、环糊精等多糖等通常的糖；以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。香味剂可以使用天然香味剂[索马甜、甜菊叶提取物（例如，莱鲍迪苷A、甘草甜素等）]以及合成香味剂（糖精，阿斯巴甜等）。例如，本发明的健康功能食品制造成饮剂和饮料时，除了本发明的红景天发酵物之外，还可以进一步含有枸橼酸、液状果糖、白糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁以及各种植物提取液等。
以下参照实施例更具体地说明本发明。但以下实施例仅用于帮助理解本发明，本发明的范围并不由下述实施例所限定。
制造例1：红景天单独发酵物的制造
甲：材料
主原料红景天（Rhodiolarosea，图1）在2010年购自中国，微粉碎后，用粉碎机（CyclotecTM1093,FOSSCo.,Denmark）进行粉末化而使用。红参使用市售的红参粉末（NH韩参人，6年根）。
本实验中使用的菌株利用了表1中所示的在韩国食品研究院中保藏的乳酸杆菌属（Lactobacillus）,片球菌属（Pediococcus）及双歧杆菌属（Bifidobacterium）属的10种乳酸菌。菌株在灭菌的50%的甘油中将培养液进行混悬，并在-70℃深冷制冷器（deepfreezer）中长期保存。
表1
| 区分 | 菌株名 | 使用的培养基 |
| L1 | 嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128） | MRS |
| L2 | 芽乳杆菌144（Lactobacillus plantarum 144） | MRS |
| L3 | 发酵乳杆菌164（Lactobacillus fermentum 164） | MRS |
| L4 | 弯曲乳杆菌166（Lactobacillus curvatus 166） | MRS |
| L5 | 加氏乳杆菌3162（Lactobacillus gasseri 3162） | MRS |
| L6 | 加氏乳杆菌3163（Lactobacillus gasseri 3163） | MRS |
| L7 | 嗜酸乳杆菌K-59(Lactobacillus acidophillus K-59) | MRS |
| B1 | 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum） | RCM/GAM |
| B2 | 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve） | RCM/GAM |
| P0 | 戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus） | MRS |
乙：红景天提取物的制造
红景天提取物是将红景天和蒸馏水一同加入到回流提取装置中，然后在90℃下加热3小时而得到提取液，所得提取液在调节到4℃的离心机（Mega17R,HanilScienceIndusrrialCo.Ltd.,韩国）中进行分离。分离的上清液用滤纸（WatmanNo.2）进行过滤后，将得到的滤液用作红景天提取物。
丙：红景天单独发酵物的制造
稀释至红景天提取物的固体成分含量为0.5重量%、1重量%、3重量%、及5重量%，然后在121℃、1.5气压下，将稀释的红景天提取物灭菌15分钟。
上表1的乳酸菌分别利用MRS肉汤（broth）和GAM肉汤（broth），在37℃静置培养20小时而进行活化后，将乳酸菌培养液1重量%（106CFU/ml）分别接种到红景天提取物中，在37℃培养48小时，从而制造了红景天单独发酵物。
实验例1：红景天单独发酵物的发酵特性的确认
为了确认制造例1的红景天提取物单独发酵物的发酵特性，确认了接种后第24小时及第48小时的发酵物的pH值及活菌数的变化。
活菌数如下计算：将试样1m用灭菌生理盐水9ml稀释并充分混合后，分步进行稀释，取0.1ml，乳酸杆菌(Lactobacillus)属、片球菌(Pediococcus)属涂抹到MRS琼脂，双歧杆菌(Bifidobacterium)属涂抹到含有5％马血的BL琼脂，利用厌气培养罐(BBLGasPak厌氧系统)尽量在厌氧状态下保存，在37℃下培养24～48小时后，测定生成的集落数，在其平均集落数乘以稀释倍数从而计算出每种培养液中的集落。
甲.根据红景天提取物固体成分含量及乳酸菌种类的pH值变化
红景天提取物固体成分含量分别为0.5重量％、1重量％、3重量％及5重量％时，根据乳酸菌种类及培养时间的pH值变化在图2a、2b、2c以及2d中分别表示。
图2a显示红景天提取物的固体成分含量为0.5重量％时，初期pH值为6.25，48小时后最终pH值减少到5.25～5.50。
图2b显示红景天固体成分的含量为1重量％时，初期pH值为6.21，48小时后最终pH值为5.61～5.70，虽然比0.5重量％是较小的减幅，但是出现了减少。
但是，如图2c及2d中所示，红景天的浓度升至3重量％及5重量％，初期pH值为6.15及6.13，48小时后为5.95～6.00及6.04～6.11，根据乳酸菌种类有些差异，但是可知不存在发酵前后的pH值的差异。
从上述结果可以确认红景天含量在3重量％以上时，培养时间增加也不会引起pH值的减少，红景天含量在1重量％以下时，并没有出现在通常的乳酸菌培养中所能观察到的pH值的减少。
按照乳酸菌的种类比较pH的变化，确认了嗜乳酸杆菌128(Lactobacillusacidophillus128)(L1)、长双歧杆菌(Bifidiobacteriumlongum)(B1)、短双歧杆菌(Bifidiobacteriumbreve)(B2)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(P0)的pH值与其他乳酸菌菌株相比相对地大幅减少，因此被选定为适合红景天发酵物制造的菌株。
乙.根据红景天提取物固体成分含量及乳酸菌种类的活菌数变化
选择在10种乳酸菌中pH值变化相对大的4种乳酸菌（L.acidophillus128,B.longum,B.breve,P.pentosaceus）重新进行预培养，为了观察菌株的生长能力，在固体成分的含量为0.5重量%及1重量%的红景天提取物中，分别接种乳酸菌1重量%，在37℃下发酵24小时后，测定活菌数并将其结果在表2中示出。
表2
如上表1所示，将红景天提取物利用嗜乳酸杆菌128（L.acidophillus128）培养时，活菌数反而从最终接种时的7.10*106CFU/ml，在0.5重量%时减少到1.2*103CFU/ml，在1重量%时减少到1.3*102CFU/ml。这与其他微生物比较时，虽然相对菌数略高，但是可知红景天提取物的浓度越高活菌数减少地更显著。
利用长双歧杆菌（B.longum）进行培养，结果最初活菌数为2.10*106CFU/ml，0.5重量%时为2.59*103CFU/ml，1重量%时为1.32*102CFU/ml。
利用短双歧杆菌（B.breve）培养，结果活菌数从最初接种时的1.64*106CFU/ml，0.5重量%时减少到4.40*102CFU/ml，1重量%时减少到8.95*10CFU/ml，活菌数逐渐减少。
利用戊糖片球菌（P.pentosaceus）进行发酵时，活菌数从1.50*106CFU/ml，0.5重量%时减少至2.01*102CFU/ml，1重量%时减少至1.29*10CFU/ml，显示所有乳酸菌均根据红景天的浓度依赖性地减少。
为了比较红景天和红参的乳酸菌发酵特性，按照与制造例1的红景天提取物的制造方法相同的方法制造了红参提取物，分别接种上述各个微生物，并在37℃下发酵24小时时，pH值和活菌数的变化在表3中示出。
表3
根据上述表3的结果，可以确认在0.5重量%的红参提取物中分别接种乳酸菌，在37℃下发酵24小时时，pH值小于4.2，显著地减少了约2以上，而乳酸菌的活菌数反而增殖到2对数周期。与这样的红参提取物的乳酸菌发酵进行比较时，推测红景天提取物的发酵由于红景天的抗菌作用而大大抑制了乳酸菌的生长，因此利用乳酸菌或乳酸菌分泌的酶的红景天有效成分的生物转化效果在红景天单独发酵中甚微。
但是，上述表2的结果中，选择24小时培养后残存的活菌数高于其余的微生物的嗜乳酸杆菌128（Lactobacillusacidophillus128）和长双歧杆菌（Bifidiobacteriumlongum），利用到以下实验中。
制造例2：红景天和红参发酵物的制造
甲.红景天和红参的混合提取物的制造
将制造例1的固体成分含量为0.5重量%的红景天提取物和按照制造例1的红景天提取物的制造方法相同的方法制造的固体成分含量为0.5重量%的红参提取物，按照下表4的混合比例进行混合，从而制造了红景天和红参的混合提取物。
表4
| 区分 | 红景天：红参(重量比) |
| 2-1 | 100：0 |
| 2-2 | 90：10 |
| 2-3 | 80：20 |
| 2-4 | 70：30 |
| 2-5 | 60：40 |
| 2-6 | 50：50 |
乙.红景天和红参混合发酵物的制造
利用上述实验例1的乙中在红景天提取物中生长相对优异的嗜乳酸杆菌128（L.acidophillus128）及长双歧杆菌（B.longum）制造了红景天和红参混合发酵物。
为了研究上述2-1至2-6的红景天和红参的混合提取物的最佳条件，在按照红参添加比例制造的混合提取物中，按照与制造例1相同的方法，将乳酸菌进行活化后，接种了1重量%。使其在37℃下发酵72小时，制造了比较例1～4以及实施例1和2的红景天和红参混合发酵物。
实验例2：根据红景天和红参混合发酵物的混合比例的发酵特性
甲.根据红景天和红参混合比例及乳酸菌种类的pH值和酸度变化
为了确认制造例2的红景天和红参混合发酵物的发酵特性，在接种嗜乳酸杆菌128（L.acidophillus128）后，确认第24、48及72小时的发酵物的pH值变化并在表5中示出。
表5
在接种长双歧杆菌（B.longum）之后，确认第24、48和72小时的发酵物的pH值变化在表6中示出。
表6
在接种嗜乳酸杆菌128（L.acidophillus128）后，确认第24、48及72小时的发酵物的酸度变化并在表7中示出。
表7
在接种长双歧杆菌（B.longum）后，测定第24、48及72小时的酸度变化并在表8中示出。
表8
发酵24小时后的比较例1（红景天单独发酵）和比较例2～4的10重量%、20重量%、30重量%的红参添加组的pH值显示出与比较例1近似的趋势，作为40重量%红参添加组的实施例1与比较例1的pH值相比显示低1.0左右，特别是，作为50重量%红参添加组的实施例2中显示出4.34、4.45的低pH值。这在完成发酵的72小时为止显示出类似的趋势。
此外，比较例2～4以及实施例1～2的pH值与比较例1进行比较时，可知在2种乳酸菌中均显示出红参添加比例越高pH值越低，虽然菌株之间没有差别，但是嗜乳酸杆菌128（L.acidophillus128）与长双歧杆菌（B.longum）相比，发酵进行的更好。
乳酸菌发酵过程中pH值减少现象是由于随着发酵进行而产生的醋酸、丙酸、丁酸、柠檬酸等有机酸的增加引起的，与单独发酵红景天的对照组相比，红参添加组的pH值相对较低的现象可能是因为红参促进了乳酸菌的发酵。
从上述结果预测红景天发酵时红参的含量越高发酵进行的越好，但是如果将红景天发酵物作为主成份含有时，红景天和红参的最佳混合比例以重量比计优选为50：50。
制造例3：根据红景天和红参固体成分含量的并行发酵物的制造
甲.红景天和红参的混合提取物的制造
固定为在制造例1中判断为的红景天和红参的最佳混合比例的50：50重量比，制造仅是红景天和红参混合提取物中的固体成分含量为0.5重量%（制造例3-2）、0.8重量%（制造例3-3）、1重量%（制造例3-4）的红景天和红参混合提取物，还制造了没有混合红参的0.5重量%红景天提取物（制造例3-1）。
乙.红景天和红参混合发酵物的制造
使用在上述实验例1的乙中在红景天提取物中生长相对优异的嗜乳酸杆菌128（L.acidophillus128），制造了红景天和红参混合发酵物。
在上述3-1、3-2、3-3和3-4的红景天和红参的混合提取物中，按照与制造例1相同的方法，将乳酸菌活化之后，接种了1重量%。将这些各个提取物在37℃发酵72小时，从而制造了比较例5、实施例3以及4和比较例6的红景天和红参混合发酵物。
实验例3：根据红景天和红参混合发酵物的固体成分含量的发酵特性
将红景天提取物和红参提取物的混合重量比固定为50：50，测定根据调节红景天提取物和/或红参提取物的固体成分含量而制造的红景天和红参混合发酵物的培养时间的pH值、酸度及活菌数，并在图3a～3c中示出。图3a～3c中，●作为对照组，是将固体成分含量为0.5重量%的红景天提取物单独发酵的比较例5的发酵物；是固体成分含量为0.5重量%的红景天和红参的混合提取物并行发酵的实施例3的发酵物；是固体成分含量为0.8重量%的红景天和红参混合提取物并行发酵的实施例4的发酵物；○是固体成分含量为1重量%的红景天和红参提取物并行发酵的比较例6的发酵物。
比较例5的红景天单独发酵物中，红景天的固体成分含量在0.5重量%的低含量时，初期pH值为6.20，在24小时后为5.31、48小时后为5.28、在72小时后为5.23，比实施例3和4高；酸度在初期为0.021%的较高值，可知发酵没有很好地进行。酸度从0.022%经24小时上升到0.040%，但是在48小时后、72小时后为0.044%、0.045%，在24小时后几乎没有变化。
因此，即使在红景天提取物中混合红参提取物，固体成分含量为1重量%的红景天和红参的混合提取物中并没有显示出乳酸菌的增殖、pH值的减少以及酸度的增加，因此确认红景天的发酵没有进行。
实验例4：红景天及红参并行发酵前后的糖、蛋白质及非配醣体的比较
确认了制造例3-2的红景天和红参混合提取物以及将其发酵的实施例3的总糖含量、酸性糖含量、作为红景天的指标物质的红景天苷是否转化为非配醣体。
使用苯酚-硫酸（phenol-sulfuricacid）法测定了总糖含量，使用咔唑-硫酸（carbazole-sulfuricacid）法测定了酸性糖含量；Lowry法测定蛋白质含量。此外，将红景天苷（S）以及红景天苷非配醣体（SH）溶解在甲醇中作为标准品，使用ODS-C18柱，在25℃下，以1ml/min的流速，使用将甲醇和蒸馏水以15：85重量比混合而得到的溶剂，用HPLC进行测定。
如图4a所示，可以确认发酵前的总糖含量从76.6%减少到发酵后的51.5%，减少了25.1%；酸性多糖体的含量从发酵前的27.4%减少到发酵后的25.6%。推测糖含量均减少是因为微生物通过分解糖进行增殖或生成其他物质时利用了糖，因此，发酵后糖含量减少。
此外，如图4b所示，发酵后红景天发酵物的蛋白质含量从32.92%增加到36.37%。
红景天的主要成分指标成分已知为红景天苷（Salidroside）及作为配醣体的酪醇（Tyrosol），并已知主要显示刺激神经系统、减少抑郁症、恢复疲劳、预防高山病等功效，与人参一样具有适应原（adaptogen）的功效。
图5a是标准品的图谱，所述标准品是以1mg/ml溶解在甲醇中的红景天苷（S）和红景天苷非配醣体（SH）标准品，图5b是发酵前的红景天和红参提取物的图谱，图5c是发酵的红景天和红参发酵物的图谱。
与发酵之前检出250%水平的红景天苷和部分红景天苷苷元相比，相反在发酵后的红景天和红参发酵物中，只检测出了大部分红景天苷由乳酸菌发酵转化成非配醣体的红景天苷苷元。从通常进行利用乳酸菌等的天然原料的发酵时将配醣体形态的指标成分转化为非配醣体而提高体内吸收率和功能性的事实来看，这样的结果可以期待能够显示出增进红景天功能性成分的功能性和吸收率的效果。
实验例5：红景天和红参混合发酵物的抗氧化效果
利用比较例5的红景天单独发酵物、实施例3的红景天红参混合发酵物、作为对照组的将0.5重量%的红参提取物通过与实施例3相同的方法发酵的红参提取物、作为其他对照组的1mg/ml的维生素C，比较了DPPH自由基的清除功能，并在图6中示出。
比较例5的红景天发酵物显示出71%的自由基清除能力，相反实施例3的红景天和红参混合发酵物时为87%，显示高出约18.4%左右的自由基清除能力。此外，与红景天一起在并行发酵中使用的红参提取物进行单独发酵时，显示出50%左右的自由基清除功能，从而判断出未对红景天及红参并行发酵物的自由基清除能力的增加产生大的影响。
实验例6：红景天和红参混合发酵物的肌细胞保护效果
在运动过程中，随着对能量的需求量增加，组织比安静时需要增加数十倍的氧供给，氧需求量增加使线粒体代谢成正比地增加，随之氧的游离基和活性氧的生成也增加。所增加的氧的游离基和活性氧在生物体内氧化各种分子，随着线粒体中的O2的氧的比例增加，氧分子的量无法通过有限的细胞色素氧化酶（cytochromeoxidase）控制，导致不完整的活性氧增加，最终由于过度的氧应激导致运动能力低下、慢性疲劳等。
对制造例3-1的红景天提取物、比较例5的红景天单独发酵物及实施例3的红景天和红参混合发酵物，确认肌细胞内的氧化应激抑制效果。
观察了在C2C12肌细胞分化过程中，红景天发酵提取物导致的细胞损伤程度。源自小鼠的C2C12细胞株从美国菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollection）（ATCC,CL-173,Manassas,VA,USA）购买使用。根据实验目的，C2C12肌细胞在60mm培养皿（petridish）中分别接种（seeding）1*106后，在含有FBS（10%）以及P/S（1%）的高浓度葡萄糖DMEM（89%）中培养到80%汇合（confluence）。之后使用HS（2%）诱导了肌细胞的分化。肌细胞分化（0天）时，在DMEM中分别用1mM的H2O2和试样100μg/ml、250μg/ml及500μg/ml进行处理，从而观察抑制H2O2导致的氧化损伤的效果。肌细胞的分化是通过每两天持续对含有2%HS的培养基用H2O2和各个试样进行处理后，分化5天，并用显微镜观察了形态（morphology）。
对C2C12的试样的细胞生存能力的评价通过利用MTT（thiazolybluetetrazoliumbromid）进行了测定。即，C2C12细胞在实验前一天，以1*106的细胞浓度在96孔板进行接种后，用100μg/ml、250μg/ml及500μg/ml的试样进行处理，培养了24小时。之后，将在-4℃中保管的MTT以5mg/ml的浓度在PBS中溶解后，利用注射器（syringe）过滤，利用移液管（pipet）吸取96孔培养基（96-wellmedium）体积的20%的量，跟别添加到各个孔，将板（plate）贴在台面的状态下前后左右轻轻摇晃进行混合。在CO2培养箱（incubator）中培养5小时后，用DMSO溶出，并在CO2培养箱中培养30分钟。30分钟后，将溶出的溶液移到新的96孔板，利用ELISA测定吸光度，由在550nm处的吸光度值中减去650nm处的吸光度值而得到的结果值来计算细胞生存能力。
制造例3-1的未发酵的红景天提取物（NFR;non-fermentedrhodiolaextract）中，在100μg/ml、250μg/ml及500μg/ml的浓度下均未显示出对氧化损伤的抑制效果（图7a）。
此外，将制造例3-1发酵的比较例5的红景天单独发酵物（FR:fermentedrhodiola）中，在100μg/ml、250μg/ml及500μg/ml的浓度下与只用H2O2处理的对照组相比均显示出低细胞生存率（图7b）。
但是，可以确认实施例3的红景天和红参混合发酵物（MFR:mixedfermentedrhodiolaextract）浓度依赖性地抑制了H2O2引起的氧化损伤，特别是，500μg/ml的浓度与只用H2O2处理的对照组相比，细胞生存率显著提高，显示与未经H2O2处理的对照组（CON）类似的水平（图7c），即，由H2O2诱导了氧化应激的细胞的细胞活性（cellviability）为79.7%（对照组为基准100%），相反，红景天和红参混合发酵物在100μg/ml、250μg/ml及500μg/ml的浓度中分别显示87.6%、87.7%及98.9%的细胞生存率，这显示出比用已知为抗氧化剂的N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcystein，NAC）1mM处理的肌细胞的生存率87.0%高的氧化损伤抑制效果（未示出NAC处理组的数据）。
从这些结果来看，可推测红景天和红参混合发酵物抑制了肌细胞的氧化损伤，增加细胞内抗氧化酶的基因变化，从而减少细胞内的活性氧簇（reactiveoxygenspeices）。
实验例7：景天和红参混合发酵物对肌细胞分化相关基因的影响
为了确认对于在C2C12细胞内的氧化损伤抑制效果的作用机制，使用半定量RT-PCR对Cu/Zn-SOD（copper/zincsuperoxidedismutase）（铜/锌超氧化物歧化酶），GPx（gluthathioneperoxidase）（谷胱甘肽过氧化物酶）等抗氧化酶和肌细胞分化相关的转录因子myoD基因表达进行了分析。
图8a是为了确认RT-PCR产物，取5μl在1.5%琼脂糖（agarose）凝胶中进行电泳后，用EtBr（ethidiumbromide）（溴化乙锭）进行染色，并用紫外线透视仪（transilluminator）测定扩增的DNA条带的结果。图8a的结果是利用imageJprogram将DNA条带以条带强度（bandintensity）数值化而表示，MyoD的基因表达在图8b中表示，Cu/Zn-SOD在图8c中表示，GPx在图8d中表示。
由H2O2诱导了氧化损伤的肌细胞的MyoD与对照组相比显示出减少的趋势。此外，用红景天提取物及红景天单独发酵物处理的肌细胞的myoD与对照组相比显示出显著的减少值。但是，就用红景天和红参混合发酵物处理的肌细胞而言，MyoD的基因表达在由H2O2诱导了氧化损伤的肌细胞中与MyoD基因表达相比显示出增加。
此外，抗氧化酶中Cu/Zn-SOD及GPx的基因表达比H2O2诱导了氧化损伤的肌细胞显示出大的增加值。
从以上结果看，红景天和红参发酵物与红景天提取物及红景天单独发酵物相比，对氧化损伤显示出大的抑制效果，因此判断是通过调节红景天和红参混合发酵物处理的肌细胞内抗氧化酶的表达的氧化损伤抑制效果。
实验例8：红景天和红参混合发酵物的运动能力提高效果
为了确认红景天和红参混合发酵物是否具有运动能力提高效果，利用跑步机（Treadmill）进行了有氧运动负荷实验。
实验动物使用从中央实验动物购买的350g左右的ICR雄性小鼠，在适应1周后用于实验。饲养条件为23℃、湿度为50%，在实验期间水和饲料可自由摄取，体重1周测定1回。
作为适应运动试验而进行的预运动实验，在第1天以5m/分钟的速度运动5分钟；在第2天以10m/分钟的速度运动10分钟；在第3天以15m/分钟的速度运动15分钟；在第4～5天以20m/分钟的速度运动20分钟，将运动能力显著下降的个体进行排除。通过预实验选定的动物分为对照组（Control）、制造例3-1的红景天提取物摄取组（NFR）、实施例3的红景天和红参混合发酵物低浓度摄取组（FRPM（L））以及实施例3的红景天和红参混合发酵物高浓度摄取组（FRPM（H））4个组而进行，每组由6只组成。从第6天起，上午口服给药蒸馏水、200mg/kg的溶解在蒸馏水中的红景天提取物试样以及红景天发酵物试样，在下午以20m/分钟的速度运动20分钟，持续2周。最后一天刚结束运动后进行眼窝采血，以2000g/10分钟进行离心，分离血浆后，在-70℃保管用于分析。
将各组的给药前后的体重变化示于表9。其结果未能观察到各组之间的体重差异。
表9
为了评价强制游泳运动能力，将红景天提取物和红景天发酵物、红景天-红参并行发酵物以高浓度和低浓度进行给药，比较给药前后的实验动物的强制游泳时间，并将结果在表10中示出。
表10
| 组别 | 计量(g/kg/d) | 游泳时间(min) |
| FRPM(L) | 0.450 | 154.74±54.08 |
| FRPM(H) | 0.900 | 175.69±79.51 |
| NFR | 0.330 | 126.49±37.77 |
| 对照组 | 0.000 | 132.35±59.24 |
根据上述表10，红景天和红参混合发酵物的情况与对照组相比，显示强制游泳的时间在低浓度增加16.9%，在高浓度增加32.0%左右的趋势；红景天提取物与对照组相比，强制游泳时间完全没有增加。
下面对含有本发明的红景天发酵物的组合物的剂型例进行说明，但是这些剂型例仅用于具体说明，并不限定本发明。
剂型例1：散剂的制造
实施例3的红景天发酵物粉末20mg
乳糖100mg
滑石10mg
将上述成分进行混合并填充到气密包装中，从而制造散剂。
剂型例2：片剂的制造
将上述成分混合后，按照通常的片剂的制造方法打片，从而制造了片剂。
剂型例3：胶囊剂的制造
按照通常的胶囊的制造方法将上述成分进行混合后，填充到明胶胶囊中，从而制造胶囊。
剂型例5：液体制剂的制造
按照通常的液体制剂的制造方法，在精制水中加入各成分并进行溶解，加入适当柠檬香之后，混合上述成分之后，加入精制水调节为100后，填充到棕色瓶中进行灭菌，从而制造了液体制剂。
制造例6：健康功能食品的制造
上述维生素及矿物质混合物的组成比是将比较适合健康功能食品的成分作为优选实施例进行了混合，其配比可以进行任意的改变实施，按照通常的健康功能食品的制造方法将上述成分进行混合后，制造颗粒，并按照通常的方法用于健康功能食品组合物的制造。
剂型例7：功能性饮料的制造
按照通常的健康饮料的制造方法将上述成分混合后，在85℃下搅拌加热约1小时之后，将制得的溶液过滤，装在灭菌的2L容器中密封后在冷藏保管，用于本发明功能性饮料组合物的制造。
上述组成比是将比较适合喜欢的饮料的成分作为优选实施例进行混合而组成，也可以根据需要阶层、需要国家、使用用途等地域、民族等嗜好，可任意变化其配比。
Claims (7)
1.一种红景天发酵物的制造方法，为了制造红景天发酵物，该方法包括在红景天提取物中混合红参提取物或将红景天和红参混合而制造红景天和红参的混合提取物的步骤；以及在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵的步骤，其特征在于，以固体成分为基准，红景天和红参的混合比例或红景天提取物和红参提取物的混合比例为60∶40～10∶90。
2.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述红景天和红参的混合提取物中，红景天的固体成分含量为0.1～0.8重量％。
3.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述乳酸菌是选自乳酸杆菌属乳酸菌、双歧杆菌属乳酸菌及片球菌属乳酸菌中的一种以上的乳酸菌。
4.根据权利要求3所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述乳酸菌是选自嗜酸乳杆菌KCTC2182、长双歧杆菌ATCC15707及短双歧杆菌ATCC15700中的一种以上的乳酸菌。
5.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述进行发酵的步骤在25～40℃进行24～96小时。
6.一种用于恢复疲劳及提高运动能力的健康功能食品，其中，在红景天提取物中混合红参提取物或将红景天和红参混合而制造红景天和红参的混合提取物，将在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵而得到的发酵物作为有效成分，其特征在于，以固体成分为基准，红景天和红参的混合比例或红景天提取物和红参提取物的混合比例为60∶40～10∶90。
7.一种用于抗疲劳及运动障碍治疗和预防的药物组合物，其中，在红景天提取物中混合红参提取物或将红景天和红参混合而制造红景天和红参的混合提取物，将在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵而得到的发酵物作为有效成分，其特征在于，以固体成分为基准，红景天和红参的混合比例或红景天提取物和红参提取物的混合比例为60∶40～10∶90。
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