DE3132656C2

DE3132656C2 - Extrakt aus der Rinde des Nim-Baumes (Melia azadirachta) mit antineoplastischer Wirkung

Info

Publication number: DE3132656C2
Application number: DE3132656A
Authority: DE
Inventors: Takeo Tokio/Tokyo Nomura; Masaki Shimizu; Tadashi Sudo
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1980-08-19
Filing date: 1981-08-18
Publication date: 1986-09-04
Also published as: FR2488800B1; GB2082066A; DE3132656A1; FR2488800A1; CH650404A5; GB2082066B; US4515785A

Abstract

Zedrachrindenextrakt, hergestellt mittels Vorbehandlung der Rinde des Zedrachbaums mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger, beispielsweise Benzol oder Äthylacetat und Weiterbehandlung des mittels des vorbehaltenen Rückstandes einer Extraktion mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35, beispielsweise mit Methanol oder Äthanol. Die vorliegenden Extrakte besitzen antineoplastische Wirkungen und sind als tumorhemmende Mittel nützlich.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Extrakte aus der Rinde des Nim-Baumes (Melia azadirachta). Die erfindungsgemäßen Extrakte besitzen antineoplastische Wirkungen und sind als tumorhemmende Mittel nützlich.

Bisher war bekannt, daß Extrakte des Nim-Baumes verschiedene pharmakologisch wirksame Bestandteile enthalten. Es sind daher Verfahren zur Herstellung von kosmetischen Mitteln zur Behandlung der Haut aus der Rinde, den Buttern, den Blüten, den Früchten, den Zweigen, der Oberhaut der Wurzel oder dem Harz des Nim-Baumes bekannt, indem man die genannten Produkte des Baums mit Wasser oder einem hydrophilen Lösungsmittel extrahiert, oder indem man die genannten Produkte fein pulverisiert (JP-PS 28 853/77,28 854/77 und 10 125/78); weiter ist ein Verfahren bekannt, aus den Produkten des Nim-Baumes die Bestandteile zu gewinnen, die eine die Funktion des Magen und Darms und der Leber verbessernde Wirkungen besitzen, indem man die Produkte des Nim-Baums mit einem hydrophilen Lösungsmittel und/oder heißem Wasser extrahiert (JP-PS 10 124/78); ein weiteres Verfahren zur Gewinnung dieser Bestandteil aus den Produkten des Nim-Baums, die für die Behandlung von Hautkrankheiten und Rheuma wirksam sind, umfaßt die Extraktion der Produkte mit einem hydrophoben Lösungsmittel (JP-PS 13 689/78).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Extrakt aus der Rinde des Nim-Baumes zu schaffen, der für die Behandlung von bösartigen Geschwulsten, insbesondere von bösartigen Tumoren, wirksam ist
Diese Aufgaue wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichnete Erfindung gelöst
Aufgrund von umfangreichem Untersuchungen der pharmakologischen Wirkung der in dem Nim-Baum enthaltenen Bestandteile hat man herausgefunden, daß die aufeinanderfolgenden Behandlungen der Rinde des Nim-Baumes mit zwei Lösungsn? "JeIn mit unterschiedlichen Dielektrizitätskonstanten zu Bestandteilen führt die ausgezeichnete antineoplastische Wirkungen besitzen.

Die bekannten Verfahren unterscheiden sich von der vorliegenden Erfindung dadurch, daß sie zur Gewinnung der wirksamen Bestandteile keine Vorbehandlung, sondern nur die direkte Extraktion anwenden.

Demgegenüber bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Extrakte der Rinde des Nim-P-aumes, die man erhält, wenn man die Rinde einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10.oder weniger und darauffolgend der Rückstand der ersten Extraktion einer Extraktion mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 unterwirft Gegenstand der Erfindung ist somit ein Extrakt der Rinde des Nim-Baumes (Melia azadirachta) mit antineoplastischer Aktivität, der dadurch gekennzeichnet ist daß bei seiner Herstellung der bekannten Extraktion der Borke mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger eine Extraktion der Borke mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 nachgeschaltet ist. Wie im folgenden unten beschrieben, besitzt der erfindungsgemäße Extrakt mitosehemmende Eigenschaften bei befruchteten Eiern von Seeigeln als auch wachstumshindernde Eigenschaften bei Mäuse-Sarkorn 180 Aszites und festen Geschwulsten und Mäuse L-5178Y Zellen.

Der Nim-Baum ist etwa 10 Meter hoch oder höher, und wächst in den Tropen. Sein botanischer Name ist Melia Azadirachta. Seine Rinde wird in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Rinde wird vorzugsweise getrocknet und zur Verwendung entsprechend fein zerteilt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Extraktion, in dem die Rinde des Nim-Baumes mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger behandelt wird, als Vorbehandlung zur Extraktion der aktiven Bestandteile angewendet.

Reispiele derartiger Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Xylol, η-Hexan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Äthylacetat und Ähnliche. Die Behandlung vor der Extraktion wird entweder einige Stunden oder über Nacht durchgeführt. Der Rückstand der ersten Extraktion wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel extrahiert. Beispiele derartiger, in diesem Verfahrensschritt verwendete Lösungsmittel sind die erwähnten niedrigen Alkohole, wie z. B. Äthanol, Methanoi, Propanol und n-Butanol, Pyridin, Aceton und Ähnliche. Die Extraktion wird über eine Zeitdauer von einigen Stunden oder über Nacht in üblicher Weise durchgeführt. Die Entfernung des Lösungsmittels aus dem Extrakt geschieht beispielsweise mittels Destillation und liefert den Extrakt gemäß der Erfindung. Der so erhaltene Rindenextrakt des Nim-Baumes kann so wie er ist bei der Behandlung von bösartigen Geschwulsten verwendet werden. Alternativ kann der Extrakt gereinigt werden, um einen Extrakt höherer Reinheit zu erhalten, indem man das folgende Verfahren verwendet. Den in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Extrakt löst man in einem wäßrigen niedrigen Alkohol, wie z. B. wäßrigem Methanol und Äthanol, und bringt die sich ergebende Lösung mit einem nicht polaren Harz zur Absorptions-

Chromatographie, wie z.B. Amberlite XAD-2, XAD-4 (Rohme und Haas), Bio Beads SM-1, SM-2 (Biorad), Diaion HP-IO, HP-20, HP-30 (Mitsubishi Chemical Industries) oder Ähnlichem in Berührung, wobei das Absorptionsharz mit einem 10% wäßrigen Methanol behandelt wird. Darauf folgt die Elution des absorbierten Materials mit 30—50% wäßrigem Methanol. Die Entfernung des Lösungsmittels von dem Eluat, beispielsweise mitteis Destillation, ergibt den gewünschten Extrakt des Nim-Baumes.

Der Extrakt gemäß der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Eigenschaften:

1. Aussehen
braunes Pulver

2. IR-Absorptionsspektrum to siehe F i g. 1 und 2

IR*Sf_x ^Rcm-':3400,1600,1435

3. UV Absorptionsspektrum

siehe F i g. 3. Als Lösungsmittel wurde Methanol verwendet

UV λ max: 279 mn λ min.: 259 nm

4. Lösbarkeit

ca. 40 mg/ml Wasser, 50 ing/ml in Methanol

ca. 20 mg/ml in Äthanol, ca. 1,5 mg/ml in Aceton

und fast unlöslich in Benzol, Chlorofonn, Äthylacetat oder n-Hexan.

5. Behandlung bei verschiedenen ph-Werten der vorliegende Extrakt verliert seine antineoplastischen Eigenschaften nicht, wenn er be· 60⁰C 30 Minuten in einer wäßrigen Lösung mit einem ph-Wert von 2,7 oder 9 behandelt wird.

Die erfindungsgemäßen Extrakte sind bei der Behandlung von einer Vielzahl bösartiger Gesch. ,vulste nützlich. Man kann sie parenteral, beispielsweise mittels subkutaner, intravenöser oder intramuskulärer Injektion oder oral in Form von Tabletten, Kapseln, Granulat, Pulver, Sirup oder Ähnlichem verabreichen. Die Dosierung des Extrakts liegt zwischen 1 bis 5 g pro Tag für männliche Erwachsene, obwohl sie in Abhängigkeit vom Alter, vom Körpergewicht und dem Zustand des behandelnden Patienten verändert werden kann.

Die erfindungsgemäßen Extrakte werden in üblicher Weise aufbereitet Beispielsweise wird das getrocknete Pulver des vorliegenden Extrakts in einen Behälter, z. B. einer Viole, eingebracht Getrennt wird beispielsweise in einer Ampulle eine physiologische Kochsalzlösung, eine wässrige Glucoselösung oder eine Suspension von Karboximethylzellulose (CMC) vorbereitet Das Pulver wird bei Gebrauch entweder gelöst oder suspensiert Alternativ kann der Extrakt in einer Emulsion injiziert werden. Im Fall einer Wasser-in-Öl (w/o) Emulsion wird beispielsweise eine Kombination eines Mineralöls, wie z. B. flüssiges Paraffin oder eines Pflanzenöls» wie z. B. Sesamöl oder Erdnußöl, mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. aliphatische Ester der Sorbinsäure, verwendet

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. Es zeigt

F i g. 1 ein IR-Absorptionsspektrum des in Beispiel 1 erhaltenen Rindenextrakts des Nim-Baums; F i g. λ ein IR-Absorptionsspektrum des in Beispiel 5 erhaltenen Rindenextrakts des Nim-Baums; F i g. 3 ein UV-Absorptionsspektrum des gleichen Extrak'·: wie in F i g. 2.

Beispiel 1

Zu 10 g trockener Rinde des Nim-Baumes wurden 100 ml Benzol hinzugefügt. Die Mischung wurde eine Stunde lang stehengelassen, wousi sie zur Durchführung der Extraktion in Abständen geschüttelt wurde. Die sich ergebende Mischung wurde gefiltert und zu dem Rückstand 100 ml Benzol hinzugefügt. Die Mischung wurde dann in der gleichen Weise wie oben behandelt. Die Benzolextraktion wurde insgesamt dreimal wiederholt. Die kombinierten Benzolextrakte wurden bis zur Trockenheit konzentriert, wodurch man ein Pulver erhielt Das so erhaltene Pulver war die Benzolfraktion. Zu der so behandelten Rinde wurden 100 ml Methanol hinzugefügt, woraufhin die Mischung dann der gleichen Behandlung, wie oben mit Benzol beschrieben, unterworfen wurde. Das dann erhaltene Pulver wurde als Methanolfraktion bezeichnet. Ein IR-Absorptionsspektrum der Methanolfraktion ist in F i g. 1 dargestellt

Das erhaltene trockene Pulver wog für die Benzolfraktion 48,2 mg und für die Methanolfraktion 385,4 mg.

Beispiel 2
(Vergleichsbeispiel)

10 g trockene Blätter des Nim-Baumes wurden dem gleichen Extraktic.isverfahren wie im Beispiel 1 unterworfen. Es wurden hierbei 120,2 mg Benzolfraktion und 682,5 mg einer Methanolfrakticn in Form von trockenem Pulver hergestellt

Beispiel 3

Die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 1 wurden mit 10 g trockener Rinde des Nim-Baumes mit der Ausnahme wiederholt, daß statt Benzol Äthylacetat verwendet wurde. Man erhielt 86,0 mg einer Äthylacetatfraktion und 3603 niy einer Methanolfraktion in Form von trockenem Pulver.

Beispiel 4

Es wurden die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 1 mit lOg trockener Rinde des Nim-Baumes mit der Ausnahme wiederholt, daß statt Methanol Äthanol verwendet wurde. Man erhielt 43,9 mg einer Benzolfraktion und 334,8 mg einer Äthanolfraktion in Form von trockenem Pulver.

Die in der oben beschriebenen Weise erzeugten Extrakte des Nim-Baumes wurden mit Seeigeleiern, Mäuse-L-5178Y-Zellen und Mäusesarkom 180 Aszites und festen Geschwulsten untersucht. Es wurden weiter die Wirkungen, die wirksame Dosierung und die Wirkungen im Vergleich zu bekannten tumorhemmenden Mitteln untersucht. Die Versuchsergebnisse werden im folgenden beschrieben.

Versuch I

Die mitosehemmenden Wirkungen der Extrakte wurden mittels Verwendung von Seeigeleiern wie folgt bestimmt:

Befruchtete Seeigeleier, Hemicentrotus pulcherrimus oder Anthocidaris crassispina in der Anzahl von 200 bis 300 wurden zusammen mit 2 ml Seewasser in einem Versuchsröhrchen angeordnet. Unmittelbar darauf wurden 0,2 ml einer wässrigen oder DMSO (Dimethylsulfoxid) Lösung des in den obigen Beispielen erhaltenen Versuchsmaterials dem Versuchsröhrchen zugefügt. Darauf wurde dann die Zellteilung der befruchteten Eier mikroskopisch beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. In der Tabelle stellen drei Pluszeichen, zwei Pluszeichen, ein Stern und ein Bindestrich eine vOllkommene Einstellung der Eiiciiung, eine etwa 5ö bis 80% Eiteilung, ein oder zwei Teilungen der Eier und keine Einstellung der Eiteilung dar.

Tabelle I

Wirkung auf die Zellteilung von Seeigelzygoten

Teil des Nim-Baumes Fraktion Konzentration der Testlösung

(Beispiel Nr.) mg/ml

0,25 030 1,0

Rinde Benzol (1) — — —

Methanol (1) - ++ + + +

Äthylacetat (3) — — *

Methanol (3) - + -r + + +

Benzol (4) — - *

Äthanol (4) — * + +

Blätter (Vergleich) Benzol (2) — - -

Methanol (2) - - ^#

Man sieht leicht aus den Ergebnissen des obigen Versuchs in Tabelle I, daß die Methanol (1) Fraktion der Rinde, Methanol (3) Fraktion der Rinde und die Äthanol (4) Fraktion der Rinde und die Methanol (2) Fraktion der Blätter wirksam die Zellteilung befruchteter Seeigeleier im Vergleich zu den anderen Fraktionen hemmt.

Insbesondere hemmen die Methanol (1) und die Methanol (3) Fraktionen die Zellteilung der Eier vollständig. Bei einer Konzentration der Testlösung von 1 mg/ml wurde bei der Äthanol (4) Fraktion eine 50 bis 80% Hemmung beobachtet Nur ein oder zwei Zellteilungen fanden bei der Methanol (2) Fraktion der Blätter statt. Die Benzo! (1) Fraktion von Tabelle I entspricht dem pharmakologisch wirksamen Bestandteil der JP-PA 13 689/78. Es ist daher von Bedeutung, daß die erfindungsgemäßen Extrakte pharmakologisch wirksamer als die früheren sind.

so Versuch II

Der folgende Versuch mit der Methanol (1) Fraktion durchgeführt, welche eine hohe mitosehemmende Wirkung bei befruchteten Seeigeleiern im Versuch gezeigt hat

Zu den Seeigeleiern wurde eine Testlösung hinzugefügt, woraufhin weiter Samenzellen hinzugefügt wurden.

Daraufhin wurde beobachtet, ob die Befruchtung gehemmt wurde. Man beobachtete eine 100% und 80% Hemmung der Befruchtung der Seeigeleier mit einer Testlösung, die eine Konzentration von 0,8 mg/ml bzw. 016 mg/ml aufwies. Die Testlösung mit einer Konzentration von 0,032 mg/ml hemmte die Befruchtung nicht, jedoch wurde die Teilung der Eier nach einer Teilung unterbrochen.

Wenn man eine Testlösung mit einer Konzentration von 0,8 mg/ml 15 Minuten nach der Befruchtung der Eier hinzufügte, wurde die Teilung nach zwei Teilungen unterbrochen.

Die oben beschriebenen Versuchsergebnisse ergaben, daß der erfindungsgemäße Extrakt nicht nur die Zellteilung, sondern ebenfalls die Befruchtung der Eier behinderte. Derartige pharmakologisch wirksame Mittel, die die Befruchtung und Teilung der Eier behindern, können einen weiten Anwendungsbereich als Agrochemikalien und Pharmazeutika finden. Die wirksame Dosierung, die Bereitstellung und Giftigkeit können entsprechend dem beabsichtigten Anwendungsgebiet bestimmt werden.

Versuch III
(Wirkung auf Mäuse L-5178Y Zellen)

1. Vorbereitung des Zellennährbodens

Es wurde unter Verwendung von auf einem RPMI-1640 Nährboden aus 10% fötalen Rinderserum 3 Tage lang kultivierten Mäuse-L5178Y Zellen ein Nährboden mit 1 χ 10⁵ Zellen/ml präpariert. Der Nährboden wurde auf eine U-Mikroscheibe mit 96 Vertiefungen mit einer Menge von 50μ1 pro Vertiefung aufgebracht.

2. Auswertverfahren

Ein Teil des Versuchsmaterial, welches eins der in den obigen Beispielen beschriebenen erfindungsgemäßen Extrakte war, wurde in dem Nährboden bis zu einer Endkonzentration in dem Nährboden, wie in Tabelle II gezeigt, gelöst. Die Menge der Lösung pro Vertiefung betrug 60 μΐ. Das so vorbereitete Versuchsmaterial wurde in einem Kohlendioxidinkubator bei 37 C° zwei Tage lang inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation wurden Zellen gesammelt und Vertiefung für Vertiefung gezählt und dann die Anzahl der Zellen mit der Anzahl der Kontrollzellen verglichen, die nicht im Testmaterial enthalten waren. Die Anzahl der Kontrollzellen betrug ungefähr 8,6 χ lOVml. Zum Vergleich der Wirksamkeit wurde der gleiche Test mit Mitomycin C (MMC) oder Bleomycin (BLM) wiederholt. In Tabelle II stellt T/C das Verhältnis der mit dem Versuchsmaterial behandelten Zeüen ζ·.' Hen nicht mit Versuchsmaterial behandelten Zellen dar. IDm ist die Konzentration des für die Abnahme der Konzentration der Zellen auf ^xh zu den Kontrollzellen erforderlichen Versuchsmaterial.

Tabelle II

Wirkung auf L-5178Y Mäusezellen

Teil des Nim-Baumes

Beispiel (Beispiel Nr.)

Konzentration des
Versuchsmaterials

ID₅₀
^g/ml)

20

25

Rinde	Benzol (1)	3.	100 30 15	98,1 105 114
	Äthylacetat (3)	100 30 15	94,5 99,8 100,0
	Methanol (1)	100 30 20	1,0 15 60,0
	Äthanol (4)	100 31 15	17,5 58,0 83,0
Blätter (Vergleich)	Benzol (2)	100 31 15	102,4 1103 108,4
	Methanol (2)	100 31 15	94,8 99,2 115
Versuchsmaterial	MMC	1,0 03 0,1	13,4- 24,7 47^
	BLM	100 10 5	8,8 46,1 57,1
	Ergebnisse

21

38

0,09

7,8

Die mit den verschiedenen in den obigen Beispielen erzeugten Fraktionen und den Vergleichsmitteln erzielten Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt Die Benzol- und Äthylacetatfraktion der Rinde des Nim-Baumes und die Methanolfraktion der Blätter zeigen leichte Wirksamkeit Es wurde herausgefunden, daß die Wirksamkeiten sehr gering sind, wenn die IDs₀ Werte sehr hoch sind. Andererseits zeigten die Methanol- oder Äthanolfraktionen eine hohe Wirksamkeit Obwohl die Wirksamkeit unter den Wirksamkeiten von MMC und BLM liegen,

30

35

40

45

50

55

60

65

|§ kann man sie als hocn genug ansehen, wenn der in der Methanol- oder Äthanolfraktion enthaltene wirksame

fj Bestandteil in Betracht gezogen wird.

U '■

p Versuch IV

Il 5 (Wirkungen auf die Aszitesgeschwulst eines Sarkom 180)

1 1. Vorbereitung des Versuchsmaterials

I Ein Teil jeder Extraktionsfraktion wurde in einer 0,5% Suspension von Carboxymethylzellulose (CMC) in

i ίο einer phosphätgepufferten Salzlösung (PBS im Handel erhältlich von den GIBCO Laboratories, mit einem Jj Gehalt von ca. 9,5 mM Phosphat) bis zu einer vorbestimmten Konzentration suspendiert oder gelöst.

'-/■ 2. Transplantation der Geschwulstzellen eines Sarkom 180

;/-j is Geschwulstzellen eines Mäusesarkoms 180, die in ICR Mäusen intraperitoneal subkultiviert wurden, wurden

!_;:i von der Maus zusammen mit der Aszitesflüssigkeit abgezogen und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer

$ Zellenanzahl von 10⁸ pro ml verdünnt. Die so erhaltene Geschwulstzellensuspension wurde dann mittels einer

jg Spritze intraperitoneal in 4 Wochen alte männliche ICR Mäuse mit einer Dosierung von 0,1 ml transplantiert.

p Entsprechend betrug die pro Maus transplantierte Zellenanzahl 1 χ 10⁷.

■jS 3. Verabreichung des Versuchsmaterials

sf Das wie oben beschriebene, hergestellte Versuchsmaterial wurde mit einer Dosierung von 0,1 ml pro Maus 4

% Tage lang 1 Mal pro Tag nach dem auf die Transplantation der Tumorzellen des Mäusesarkoms 180 intraperito-

f* 25 neal verabreicht. Für jede Konzentration jedes Versuchsmaterials wurde eine Gruppe von sechs Mäusen verwendet. Als Wirksamkeitskontrolle wurde MMC, BLM, Aktiomycin D (ACD), 5-Fluorouracil (5-fu) und

'% Zyklophosphamid (CYP) verwendet. Zur Kontrolle wurde das CMC-enthaltende PBS, wie oben beschrieben,

'Ü nur in der gleichen Weise wie oben beschrieben, verabreicht. Die Dosierung wird in Gewicht pro kg Körperge-

€ wicht der Maus ausgedrückt.
30

1 4. Auswertverfahren

Am siebten Tag der Transplantation der Geschwulstzellen wurde das Körpergewicht jeder Maus (X) bestimmt. Dann wurde die Aszitesflüssigkeit sorgfältig von der Maus abgezogen, woraufhin das Körpergewicht (Y)

35 bestimmt wurde. X minus Y wird als die Menge der Aszitesflüssigkeit bestimmt.

Die abgezogene Aszitesflüssigkeit wurde dann in ein Hämatokritzentrifugierglas eingegeben und dann bei 15 000 G 5 Minuten lang mittels eines Hämatokritrotors bei einer niedrigen Temperatur zentrifugiert. Auf diese Weise wurde die Bestimmung des Aszitokritwertes durchgeführt, d. h., das Verhältnis der in der Aszitesflüssigkeit vorhandenen Zeilen, die dem Hämatokritwert in der Hämatologie entsprechen. Das Produkt des Wertes mit

40 dem Volumen der Asziiesflüssigkeit gibt das in der Aszitesflüssigkeit vorhandene Volumen der Zellen. Dies wird als das gesamte Zellvolumen (total packed cell volume, TPCV) bezeichnet. Bei der Überprüfung betrug das gesamte Volumen der Aszitesflüssigkeit 6 bis 10 ml und das TPCV 1,6 bis 2,5 ml.

Die Wirkung auf die Geschwulst wurde als wirkungslos (—) angesehen, wenn das TPCV Verhältnis der behandelten zu den Prüfungsmedien (P/C) 100 bis 66% betrug. Die Wirkung wurde als Plus 1 (+) bezeichnet,

45 wenn sie 65 bis 41%, Plus 2 (+ +), wenn sie 40 bis 11% und Plus 3 (+ + +), wenn sie 10 bis 0% betrug. Die Versuchsergebnisse für die erfindungsgemäßen Stoffe sind im Vergleich zu den bekannten Stoffen in Tabelle III dargestellt.

5. Ergebnisse

Es wurden mit den Benzol und Äthylacetatfraktionen der Rinde des Nim-Baumes als auch mit den Fraktionen der Nim-Baumblätter überhaupt keine Wirkungen beobachtet. Andererseits wurden insbesondere mit den Methanol- und Äthanolfraktionen der Rinde des Nim-Baums hohe Wirkungen beobachtet Obwohl die Wirkungen unter den Wirkungen der wirksamen Prüfstoffe MMC, BLM, usw., lagen, kann man sie als hoch genug 55 ansehen, wenn die wirksamen in der Fraktion enthaltene Bestandteile betrachtet Eine weitere Reinigung dieser Fraktionen zur Erzielung reinerer Bestandteile würde zu gesteigerter Wirksamkeit führen. Die minimale wirksame Dosierung für die Methanolfraktion (1) wurde bei dem Dosierungs T/C-Verhältnis in der Tabelle III zu etwa 30 mg/kg bestimmt

	31	Fraktion	32 656	Dosierung	T/C	Verhält	—
Tabelle III		(Beispiel Nr.)		(mg/kg)	(o/o)	nis	—
Wirkung auf die Aszitesgeschwulst eines Sarkoms	Benzol (1)	180	100	97,6		—
Teil de: Nim-Baumes	Benzol (4)	100	95,2	—
	Äthylacetat (3)	100	96,8	+ +
Rinde	Methanol (1)	20	94,8	+ +
			84,8	+ + +
		50	34,3	+ +
			32,2	+ +
		100	4,8	+ + +
			10,8	+ +
			12,4	+ +
	Methanol (3)	100	8,5
	Äthanol (4)	100	14,8	—
			18,5	+ + +
	Benzol (2)	100	94,8	+ + +
	Methanol {2)	100	76,8	+ + +
	MMC	0,5	0	+ + +
Blätter (Vergleich)		1,5	0	+ + +
	BLM	10	0	+ + +
Prüfstoff	ACD	0,1	0	+ + +
	5-fu	20	0
	CYP	33	0
		67	0

Test V
(Wirkungen auf die feste Geschwulst eines Sarkom 180)

1. Vorbereitung des Versuchsmaterials

Das Versuchsmaterial wurde in der gleichen Weise wie bei dem Versuch IV Ziffer 1 vorbereitet. 2. Transplantation der festen Geschwulstzellen eines Sarkoms 180

Es wurde eine Zellensuspension mit 1 χ 10^s Zellen pro ml in der gleichen Weise wie in Versuch IV Ziffer 2 vorbereitet. Es wurden 4 Wochen alte ICR Mäuse subkutan auf der Rückseite mit 0,1 ml der Suspension mittels einer Spritze geimpft.

3. Verabreichung des Versuchsmaterials

Wie in Versuch IV Ziffer 3 wurden eine Gruppe von sechs Tieren für jede Konzentration jedes Versuchsmaterials verwendet.

4. Auswertverfahren ^er

Das gewachsene Geschwulstgewebe wurde am 15. bis 21. Tag der Geschwulstzellentransplantation resektiert und gewogen. Zur Auswertung wurde ein Mittelwert der Gruppe von 6 Tieren genommen. Die Wirkung wurde auf Grundlage des Verhältnisses des mittleren Gewichts der behandelten Tiere zu dem der Kontrolltiere ausgewertet Das mittlere Gewicht betrug 1,5 bis 3,5 g für die Kontrolltiere. Verhältnisse (T/C) von 100 bis 71 % wurden als wirkungslos (—), von 70 bis 51 % als Plus 1 (+), Von 50 bis 21% als Plus 2 (+ +) und von 20 bis 0% als Plus 3 (+ + +) bezeichnet Die Ergebnisse mit den erfindungsgemäßen Versuchsmaterialien und den bekannten Mitteln sind in Tabelle IV dargestellt

Tabelle IV Wirkungen auf die feste Geschwulst eines Sarkoms 180 Teil des Nim-Baumes Fraktion Dosierung T/C Verhält

(Beispiel Nr.) (mg/kg) (%) nis

Rinde Benzol (1) 100 86,4 -

92,0 -

Benzol (4) 100 913 -

to Äthylacetat (3) 100 94,2 -

Methanol (1) 20 105,4 —

128,2 -

50 833 -

88,0 -

100 40,7 + +

65,0 +

200 24,1 + +

Methanol (3) 100 50,8 +

Äthanol (4) 100 68,2 +

513 +

Blätter {Vergleich} Benzo! (2) iOö 933 —

Methanol (2) 100 953 —

Prüfstoff MMC 0,5 71,0 -

1,5 324 + +

50,2 +

BLM 10 43^ + +

523 +

ALD 0,1 102,4 -

5-Fu 20 47,8 +

CYP 33 0 + + +

67 0 + + +

5. Ergebnisse

Die Methanolfraktionep. der Nim-Baum-Rinde zeigten eine hohe Wirksamkeit, wohingegen mii den Benzo und Äthylacetatfraktionen der Rinde als auch mit den Fraktionen der Blätter überhaupt keine Wirkunger beobachtet wurden. Die minimale wirksame Dosis für die Methanolfraktion (1) beträgt von dem Dosierungs T/C-Verhältnis ungefähr 65 mg/kg. Obwohl die Wirksamkeiten verglichen mit den wirksamen Prüfstoffen, wie z. B. MMC und BLM, niedrig sind, führt eine weitere Reinigung der erfindungsgemäßen Extrakte hinsichtlich dei aktiven Bestandteile zu höheren Wirksamkeiten.

Akute Toxizität

Der LDso-Wert für die Methanolfraktion betrug bei intraperitonealer Verabreichung bei männlichen ICR-Mäusen von 19—21 g 1100 mg/kg Körpergewicht

Beispiel 5

Es wurden 100 g trockene Rinde des Nim-Baumes einem Liter Benzol zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang hingestellt und in Abständen zur Durchführung der Extraktion geschüttelt. Die erhaltene Mischung wurde gefiltert und der Rückstand einem Liter Benzol zugegeben. Die Mischung wurde dann in der gleichen Weise wie oben behandelt. Die Benzolextraktion wurde insgesamt dreimal wiederholt. Der nach dieser Extraktion erhaltene Rückstand wurde mit 1 Liter Methanol versetzt und extrahiert. Diese Methanoleytraktion wurde wie oben bei Benzol beschrieben insgesamt dreimal wiederholt. Nach Abziehen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer erhielt man 3,9 g des Extraktes als trockenes Pulver. Von dem so erhaltenen pulverigen Extrakt wurden 2,1 g in 1 Liter 10% Methanol gelöst und daraufhin sorgfältig mit 300 mi Amberlite XAD-2 gemischt. Die Mischung wurde in eine 3,0 χ 40 cm Säule eingegeben. Durch die Säule wurden nacheinander 10% wässeriges Methanol, 50% wässeriges Methanol und 100% Methanol gegeben. Jedes der Eluate wurde dann bis zur Trockenheit konzentriert. Man erhielt 0,81 g der 10% Methanolfraktion, 0,84 g der 50% Methanolfraktion und 0,22 g der 100% Methanolfraktion in entsprechend pulveriger Form.

Beispiel 6

Es wurden die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 5 wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt einem Liter Methanol als Extraktionsmittel ein Liter Äthanol verwendet wurde. Man erhielt 0,69 der 10% Methanolfraktion, 0^0 g der 50% Methanolfraktion und 033 g der 100% Methanolfraktion in entsprechender pulveriger Form.

Beispiel 7

Es wurden die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 5 wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt einem Liter Benzol als Extraktionsmittel ein Liter Athylacetat verwendet wurde. Man erhielt 0,78 g der 10% Methanolfraktion, 0,82 g der 50% Methanolfraktion und 03 g der 100% Methanolfraktion in entsprechender pulveriger Form.

Die in den Beispielen 5 bis 7 erzeugten Extrakte wurden hinsichtlich ihrer Wirkungen an L-5178Y Zellen, Aszitesflüssigkeit eines Sarkom 180 und der festen Geschwulst entsprechend den in den Versuchen 2 bis 4 beschriebenen Verfahren untersucht

Die Ergebnisse sind in den Tabellen V und Vl angegeben.

Tabelle V

Wirkung auf L-5178Y Zellen

	Versuchsmaterial	M ethanolfraktion	Beispiel	Methanolfraktion	!D₅₀	T/C	Ver	_
	Beispiel		Nr.		^g/ml)	(%)	hält	_
	Nr.	10% MeOH					nis	—
	5	50% MeOH		10% MeOH	>100	100,25	—
		100% MeOH			16,5	99,2	+ +
		50% MeOH			67,5	98,8	+ + +
	6	50% MeOH	5	50% MeOH	35,0	77,5	—
	7				18,0	38,0	—
Tabelle VI		Wirkungen auf transplantierte Geschwülste eines Sarkoms 180 (Mäuse)				7,9	—
	Art der Geschwulst		100% MeOH		102,5	+
			Dosierung	99,8	+ + +
			(mg/kg)	1073	+ +
Aszitesgeschwulst	6	50% MeOH		413	+ + +
			25	10,2
	7	50% MeOH	50	40,2	—
			100	8,5	—
		10% MeOH	25	101,3	+
			50	89,2	+
			100	76,9	+ +
		50% MeOH	25	63,6
			50	60,7	_
	5		100	37,5	—
		100% MeOH	50	99,9	+
			100	98,4	+ +
			50	91,7	+
feste Geschwulst	6	50% MeOH	100	59,0
			25	45,0
	7	50% MeOH	50	53,5
			100	41,2
	25
	50
	100
	25
	50
	100
	50
	100
	50
100

10

20 25 30

45

55

Aus Tabelle V und VI sieht man, daß die 50% Methanolfraktion hohe antineoplastische Wirksamkeit besitzt. Der Extrakt hat eine minimale wirksame Dosierung von 30 mg/kg Körpergewicht bei Mäusen für die Aszitesgeschwulst und eine minimale wirksame Dosierung von 25 mg/kg Körpergewicht bei Mäusen für die feste Geschwulst. Die akute Toxitität in Form des LD50 Wertes bei männlichen Mäusen betrug 390 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Verabreichung.

60 65

10

Ansatz Beispiel 1

Es wurden in 500 ml steriler 5% Glucoselösung zur Injektion 1000 mg von in Beispiel 1 hergestelltem Nim-Baum-Rindenextrakt suspendiert. Die Suspension wurde aseptisch in Violen in Mengen von 5 ml pro Viole aufgeteilt und gefriergetrocknet Man erhielt einen Ansatz, bestehend aus 10 mg Extrakt pro Viole. Zur Verwendung wird er in destilliertem Wasser zur Injektion suspendiert

Ansatz Beispiel 2

Es wurde ein Violenansatz in der gleichen Weise wie in dem obigen Beispiel vorbereitet Es wurden 500 ml einer 0,5% Suspension von CMC J.P. in einer physiologischen Kochsalzlösung zur Injektion statt der 500 ml der 5% sterilen Glucoselösung zur Injektion verwendet Zur Verwendung wurde zur Injektion eine Suspension in destilliertem Wasser verwendet

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

30 35

40 45 50 55 60 65

Claims

OOD Patentansprüche:

1. Extrakt der Rinde des Nim-Baumes (Melia azadirachta) mit antineoplastischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß bei seiner Herstellung der bekannten Extraktion der Borke mit einem organisehen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger eine Extraktion der Borke mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 nachgeschaltet ist

2. Extrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Extrakt einer Reinigung unterworfen wird, die die folgenden Stufen umfaßt: Entfernen des Lösungsmittels von dem Extrakt Lösen des erhaltenen Rückstandes in einem niedrigen Alkohol, Inberührungbringen der sich ergebenden Lösung mit

ίο einem nichtionischen Harz zur Absorptionschromatographie, Behandlung des Absorptionsharze;· mit 10%igen wäßrigen Methanol, darauffolgende Elution mit 30- bis 5O°/oiger Methanollösung und nachfolgendes Entfernen des Lösungsmittels aus dem Eluat