JPS5935889B2 - 抗悪性新生物剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はニーム（Ｍｅｌｉａ ａｚａｄｉｒａｃｈｔ
ａ。

メリア アザジラクタ）の樹皮から適当な溶剤により抽
出して得られる物質を有効成分とする抗悪性新生物剤に
関するものである。

抗悪性新生物剤はその作用機構または物質起源の面から
アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質および天然物（植
物成分など）に一般に分類され、多くの製剤が開発され
ている。

本発明は天然物（植物成分）からの抽出物を活性成分と
する抗悪性新生物剤に関するものである。

一般に、天然物化学では物質の抽出をベンゼン、エーテ
ル、酢酸エチル等の極性の低い溶媒を用いて行っており
、物質の各成分につき多くのものの化学構造が決定され
ている。

最近では、宿主仲介性抗ガン剤あるいは免疫賦活剤等の
多くは、従来のように低極性溶媒を用いることなく、天
然物をいきなり水、熱水等の極性の比較的高い溶剤で抽
出する方法が採られている。

本発明に関与するこれらの例として、囚 特公昭５２−
２８８５３号、（Ｂ）特公昭５２−２８８５４号、（Ｃ
）特公昭５３−１０１２４号、（Ｄ）特公昭５３−１０
１２５号、（Ｅ）特公昭５３−１３６８９号等が知られ
ている。

（５）〜（Ｄ）ではメチルアルコールまたはエチルアル
コールのような親水性溶媒、水、熱水等でいきなり薬効
成分をニームの樹皮、葉、花、果実、枝、根、樹脂から
抽出したものであり、（匂ではベンゼン、エチルエーテ
ル等の疎水性溶媒で薬効成分を抽出したものである。

その薬効性については、囚ではにきびに、（Ｂ）では荒
れ肌に、（Ｃ）および（Ｉ））ではヌクフィロコツカス
。

アウレウス２０９Ｐに、（Ｅ）ではヌクフィロコツカス
。

アウレウス２０９ Ｐ、バチルス、ズブチリスおよびプ
ルセラ、アボルクスに薬効性があると報告され、本発明
におけるような悪性新生物に対する活性を有するとの報
告はいまだなされていない。

また、一般的に極性の比較的高い溶媒で抽出される物質
のなかには極性がより低い溶媒で抽出される物質も多く
含まれ、上記公知例におけるように極性の高い溶媒でい
きなり抽出すると目的とする成分以外に多くの他の成分
が抽出され、どの成分が有効な薬理効果を発揮するのか
が不明確であり、従って実用性にもとぼしくなる。

ニームは熱帯地域に自生する高さが１０ｍ以上に達する
多年生植物であるが、本発明者等は後に詳述する抗ガン
性を有するニーム抽出物は樹皮において顕著であること
を確認した。

そして、樹皮の抽出についても誘電率（極性）の低い順
序に抽出することにより目的とする有効成分を高濃度で
細別できることも確認した。

このように目的成分を高濃度で抽出した物質について、
後に詳記するが、マウスザルコーマ１８０腹水ガン、マ
ウスザルコーマ１８０固型ガン、マウス孔−５１７８Ｙ
細胞に対して試験を行った処、非常に有効な効果を発揮
することが確認された。

そして、他の既存の有効とされている抗ガン剤について
本発明抗悪性新生物剤と同じ試験を併せて行った結果、
これらのものに比肩する薬効性を有することが確認され
、本発明に至った。

本発明の目的は誘電率の低い順序で抽出を行って得た目
的成分を含む物質を有効成分とする抗悪性新生物剤を提
供しようとするにある。

本発明はニームの樹皮を誘電率１０以下の有機溶媒で抽
出処理し、その抽出残渣を誘電率１５〜３５の親水性溶
媒で抽出して得られる物質を活性成分とする抗悪性新生
物剤を提供する。

本発明において抽出に用いられる溶媒は誘電率に基準を
おいて目的成分を抽出するためのものであり、代表的例
を次表■に示す。

以下、本発明の抗悪性新生物剤につき、その抽出例、抽
出物の薬効試験、有効投与量、既存の制ガン剤との効果
比較例、製剤、毒性等に関して具体的に説明する。

〔抽出例 Ｉ〕

ニーム乾燥樹皮１０９にベンゼン１００ＴＬｌを加え、
ときどき振盪しながら１時間抽出操作を行った。

その後口過してその抽出残渣にさらに１００ＴＬｌのベ
ンゼンを加えて同様の操作を行い、合計３回ベンゼンに
よる抽出を繰り返した。

３回の抽出液を合わせ、濃縮乾固し、粉末化した。

これをベンゼン画分とする。

ベンゼン抽出残渣に１００ｍ１のメタノールを加え、ベ
ンゼンにおけると同様の操作を加えた。

得られた粉末をメタノール画分ととする。

このメタノール画分の赤外線吸収スペクトル図を図面に
示す。

得られた乾燥粉末は、ベンゼン画分で４８．２〜、メタ
ノール画分で３８５．４ｍ９であった。

〔抽出例 ■〕

ニーム乾燥葉１０ｇに抽出例■と同様の抽出操作を加え
た処、ベンゼン画分乾燥粉末１２０．２■、メタノール
画分乾燥粉末６８２．５ｍ９を得た。

〔抽出例 ■〕

ニーム乾燥樹皮１０．９を、ベンゼンの代りに酢酸エチ
ルを用い、抽出例■と同様の操作を施した。

その結果、酢酸エチル画分乾燥粉末８６．０ｒｎ９、メ
タノール画分乾燥粉末３６０．３７Ｑを得た。

〔抽出例 ■〕

ニーム乾燥樹皮１０ｇを、メタノールの代りにエタノー
ルを用い、抽出例■と同様の操作を加えた処、ベンゼン
画分で４３．９７７１１ｐ、エタノール画分で３３４．
８ｍｇの乾燥粉末を得た。

以上のようにして得られたニーム抽出成分をマウス孔−
５１７８Ｙ細胞、マウスザルコーマ１８０腹水ガンおよ
びマウスザルコーマ１８０固型ガンに適用する試験を行
って、その有効性、投与量、既存の制ガン剤との比較効
果について検討した結果を以下に説明する。

〔試験例 ■〕

（マウス孔−５１７８Ｙ細胞に対する効果）（１）細胞
調製 １０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ−１６４０培地で３日
間培養したマウスのＬ−５１７８Ｙ細胞１×１０５個／
ｍＡ’を含む培地を調製し、９６穴Ｕ底マイクロプレー
トに１穴当り５０μｌずつ入れた。

（２）判定方法 上記１穴ずつに培地に溶かした上述した本発明による抽
出物試料を５０μｌ入れた。

次表■に示す試料濃度とは最終的培地濃度を意味する。

これを３７℃の炭酸ガス培養器中で２日間培養した。

培養後１穴ずつ細胞を集め、細胞数を数え、試料を入れ
ない対照のものと細胞数を比較する。

対照の細胞数は約８．６Ｘ１０５個／ＴＬｌであった。

効果比較のためマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）およびプレ
オマイシン（ＢＬＭ）を用いて同様の試験を行った。

次表中、Ｔ／Ｃは試料により処理したものの細胞数／試
料を入れないものの細胞数を意味する。

■Ｄ５ｏとは対照と比べて細胞濃度が１／２となるに必
要な試料濃度を意味する。

（３）結果 上記抽出例の種々の画分および比較薬剤について上表■
のような結果が得られた。

ニームの樹皮のベンゼン画分および酢酸エチル画分、葉
のメタノール画分にわずかに効果が認められるが、その
■Ｄ５ｏ値は非常に高く、活性は極く弱いと思われる。

これに対し、ニーム樹皮メタノール（エタノール）画分
は活性が強い。

プラスの対照として用いたＭＭＣやＢＬＭには及ばない
が、メタノール（エタノール）画分の成分組成から考え
れば充分に活性のあるものと考えられる。

〔試験 ■〕

（ザルコーマ１８０腹水ガンに対する効果）（１）試料
調製 リン酸緩衝食塩水（ギブコ社製ＰＢＳ、ｌＪン酸約９．
５ｍＭ含む）に０．５％カルボキシメチルセルロースナ
トリウム塩（ＣＭＣ）を懸濁させた溶液にそれぞれの濃
度になるように各抽出画分試料を懸濁または溶解させた
。

（２）ザルコーマ１８０ガン細胞移植 ＩＣＲマウス腹腔中で培養継代されてきたマウスザルコ
ーマ１８０ガン細胞を腹水とともにとり出し、生理食塩
水で適当に希釈して細胞数が１×１０８個／ｍｌとなる
よう調整した。

このガン細胞懸濁液０．１ ｍｌを４週令雄ＩＣＲマウ
ス腹腔へ１匹ずつ注射器を用いて移植した。

従って１匹当りの移植細胞数は１×１０７個である。

（３）試料投与 マウスザルコーマ１８０ガン細胞を移植した次の日より
１日１回連続４日間上述したようにして調整した試料を
注射器を用いて同じく腹腔に０．１ ｍｌ投与した。

１試料、■濃度につき６匹のマウス使用した。

なお、効果をもつプラスコントロール試料として、マイ
トマイシンＣ（ＭＭＣ）、プレオマイシン（ＢＬＭ）、
アクチノマイシンＤ（ＡＣＤ）、５−フルオロウラシル
（５−ＦＵ）、サイクロフォスアミド（ＣＹＰ）を用い
た。

対照は上述したＣＭＣ入りＰＢＳのみを同様に投与した
ものとした。

投与量の表示はマウス体重１ｋｇ当りの重量とした。

（４）効果判定法 ガン細胞移植後７臼目にそれぞれのマウスの体重間を測
定した。

次に腹腔に貯った腹水を全量とり出した後、マウスの体
重（Ｙ）をもい一度測定した。

Ｘ−Ｙを腹水量とする。とり出した腹水をヘマトクリッ
ト管に吸い込ませ、ヘマトクリット測定用ロークーを用
いて低温で１５，０ＯＯＧで５分間遠心分離し、血液で
いえばヘマトクリット値に相当するアサイドクリット値
（腹水中に占める細胞の割合）を測定した。

腹水量にこの値をかければ、全腹水中に占める細胞の容
量が出る。

これを全細胞容量（ＴＰＣＶ；ｌ−−クル、パックド、
セル、ボリューム）とする。

対照で全腹水量は６〜１０ｍ１ＴＰＣＶは１．６〜２．
５ｍｌであった。

試料を投与したものと対照とのＴＰＣＶの比（Ｔ／Ｃ）
をとって、１００〜６６％のものをガンに対する効果な
しく→とじ、６５〜４１％のものをガンに対するプラス
１の効果（１）とし、４０〜１１％のものを同２（＋＋
）、１０〜０％のものを同３（＋＋＋）として本発明の
試料および比較のための既存の試料につき下表■に試験
結果を表示する。

（５）結果 ニーム樹皮のベンゼン画分、酢酸エチル画分ならびにニ
ーム葉の各両分については全く効果が認められなかった
が、ニーム樹皮の特にメタノールおよびエタノール画分
では高い活性が認められた。

比較的対照として用いたＭＭＣ。ＢＬＭ等には及ばない
が、メタノール画分の成分組成から考えれば充分に活性
のあるものと考えられ、今後の有効成分の精製によって
より活性が高められるであろうと思われる。

上表からメタノール（Ｉ）画分の最小有効濃度は投与量
−Ｔ／Ｃ関係図より約３０を／）ｗであることがわかっ
た。

〔試験 ■〕

（ザルコーマ１８０固型ガンに対する効果）（１）試料
調整 試験■の（１）と同様にして行った。

（２）ザルコーマ１８０固型ガン細胞移植１×１０８個
／ＴＬｌの細胞懸濁液を試験■の（２）と同様にして調
製した。

この懸濁液０．１罰を４週令雄ＩＣＲマウス背部皮下に
注射器を用いてガン細胞を移植した。

（３）試料投与 試験■の（３）と同様に、１試料、■濃度につき６匹の
マウスを使用して行った。

（４）効果判定法 ガン細胞移植後１５口重に成長したガン組織を切り取り
、その重量を測定し、１群６匹の平均値をとった。

この平均重量と対照のものの平均重量との比をとって効
果判定を行った。

対照のものではこの重量が１．５〜３．５ｇであった。

比の値（Ｔ／Ｄ）が１００〜７１％のものをガンに対す
る効果なし←）とし、７０〜５１％のものをガンに対す
るプラス１の効果（１）とし、５０〜２１％のものを同
２（＋＋）、２０〜０％のを同３（＋＋＋）として発明
の試料および既存のものの試料につき試験結果を下表■
に表示する。

（５）結果 ニーム樹皮のベンゼンおよび酢酸エチル画分ならびにニ
ーム葉の各画分ては全く効果が認められないが、ニーム
樹皮のメタノール画分では高い活性が認められた。

メタノール（Ｉ）画分についての最小有効濃度は投与量
−Ｔ／Ｃ関係図より約６５１ｖ／ｋｇであることがわか
った。

比較対照であるＭＭＣ，ＢＬＭ等の活性には及ばないが
、本発明抽出物は今後更に有効成分が精製されればより
活性が大きくなるであろうことが予想される。

〔製剤〕

上述した抽出例に記載されたようにして得られたニーム
抽出成分の乾燥粉末をバイアル等の容器に入れ、別にア
ンプル等の容器に生理食塩水、ブドウ糖液あるいはカル
ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）懸濁液を用意し、用
時粉末を懸濁溶解して注射する。

これの他、エマルジョンにして注射してもよい。

例えば、油中水（Ｗｌｏ）型エマルジョンは流動パラフ
ィン等の鉱物油、ゴマ油、ビーナツツ油等の植物油にソ
ルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤を組み合せて用
いる。

（１）製剤例 Ａ 抽出例Ｉで得られたニーム樹皮のメタノール抽出物２０
０■を無菌５％注射用ブドウ糖溶液１００ＴｆＬｌ中に
懸濁し、この液を１ｍｌずつバイアルに無菌的に分注し
、凍結乾燥した。

このようにして１バイアル中に２〜のニーム樹皮メタノ
ール抽出部を含む製剤を得た。

片時、注射用蒸留水に懸濁して使用する。

（２）製剤例 Ｂ 上記Ａと同様にしてバイアルに製剤をつくつた。

ただし、無菌５％注射用ブドウ糖溶液１００ｍ１の代り
に薬局法ＣＭＣの０．５％注射用生理食塩水懸濁液１０
０ｍ１を使用した。

片時、注射用蒸留水に懸濁して使用する。

〔急性毒性〕 □ ニーム樹皮メタノール画分のＩＣ，Ｒマウス雄（体重１
９〜２１ｇ）を用いたしＤ５ｏ値は腹腔内投与（ｉｐ）
で１，１００■／ｋｙであった。

上述したように、本発明の方法により抽出されたニーム
抽出物は上記試験で実証されたように諸種の悪性新生物
に対して、顕著な効果を発揮し、既存の有効な制ガン剤
にも比肩し得るものであり、今後の一層の精製、無毒化
等により有効な抗悪性新生物剤としての開発が期待され
ている。

【図面の簡単な説明】

添付図面は実施例■で得たニーム樹皮のメタノール抽出
物のＩＲ吸収スペクトル図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ニーム（Ｍｅｌｉａ ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ、
   メリア アザジラクタ）の樹皮を誘電率１０以下の有機
   溶媒で抽出処理し、その抽出残渣を誘電率１５〜３５の
   親水性溶媒で抽出して得られる物質を活性成分とする抗
   悪性新生物剤。