DE2157970A1 - Verfahren zur herstellung von 6aminopenicillansaeure durch enzymatische spaltung von penicillinen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von 6aminopenicillansaeure durch enzymatische spaltung von penicillinenInfo
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Description
FARBENFABRIKEN BAYER AG
LEVERKUSEN-Bayerwerk 2 2. U\}\' ΪΩ71
Zentralbereich
Patente, Marken und Lizenzen
Si/Gk
Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch, enzymatische Spaltung von Penicillinen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
6-Aminopenicillansäure (6-APS) durch enzymatische Spaltung von Penicillinen.
Bei der gegenwärtigen großtechnischen Produktion von 6-APS
wird eine Penicillin-G-Lösung mit einem Bakterienschlamm
versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (P.A.), (E.C. 3.5. 1.11) enthält. Durch die Einwirkung des Enzyms wird die
seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der ß-Lactamring geöffnet wird. Auf der
Wirkung dieses Enzyms beruht das Verfahren der Deutschen
Patentschrift 1 111 778 zur Herstellung von 6-APS aus Penicillin G.
Die Verwendung des Bakterienschlammes, z.B. von E. coli ATCC
11 105, hat folgende Nachteile:
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ORIGINAL INSPECTED
a. Der Bakterienschlamm enthält außer der intracellulären
P.A. weitere Proteine und Enzyme, sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren
Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation- entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich
bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.
b. Der Bakterienschlamm kann nur einmal eingesetzt werden.
c. Der Bakterienschlamm enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin G und/oder
6-APS durch Öffnung des ß-Lactamringes inaktivieren.
d. Der Bakterienschlamm enthält nur kleine Mengen an P.A., Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z.B.
zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringeren) Gehalt von
Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich.
e. Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden P.A,-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen
ab.
f. Die vollständige Abtrennung der Bakterienzellen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansätze
einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen
Verunreinigung, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte
nötig (Britische Patente 1.169.696; 1.078.847; 1.114.311).
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Alle genannten Nachteile werden erfindungsgemäß vermieden, wenn man anstelle des Bakterienschlammes Penicillinacylase
verwendet, die durch kovalente Bindung an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid
gebunden und in Wasser unlöslich ist. Die Herstellung eines derartigen Enzympräparates ist in der
DOS (Anmeldung Le A 14 043 vom gleichen Tage)
beschrieben.
Versuche, 6-APS durch enzymatische Spaltung mit trägergebundener
Penicillinacylase herzustellen, sind zwar bekannt, DOS 1 917 057, DOS 1 907 365 konnten ,jedoch nicht in einen
technischen Maßstab übergeführt werden.
Die erfindungsgemäße Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener
Penicillinacylase läßt sich einfach und auch im großtechnischen Maßstab durchführen. Das unlösliche Enzym
wird in einer Lösung mit 75 - 150.000 E/ml Penicillin, z.B. Penicillin G-Kalium, suspendiert. Die enzymatische Spaltung
wird bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6-8 durchgeführt. Zur Neutralisation der abgespaltenen Phenylessigsäure
verwendet man wässrige AlkalilÖsungen, z.B. Kali- oder
Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triäthylamin. Mit Triäthylamin bleibt z.B. die Aktivität des unlöslichen
Enzyms auch nach mehrfachem Einsatz erhalten.
Die erfindungsgemäße enzymatische Spaltung wird vorzugsweise bei pH 7,8 durchgeführt. Bei pH-Werten oberhalb von
8,0 kann Penicillin oder 6-APS unter Öffnung des ß-Lactamringes
inaktiviert werden. Bsi kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes
Penicillin, so daß die Spaltung unvollständig bleibt. Vorzugsweise
wird bei pH 7,8 gearbeitet. Es ist vorteilhaft, die Spaltung bei niedrigem pH-Wert zu beginnen und gegen
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Ende der Reaktion langsam auf 7,8 zu erhöhen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von dem Einsatz an trägergebundenem
Enzym ab. So ist z.B. ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100.000 E/ml Penicillin G-Kalium
nach 12 Std. bei pH 7,8 und 380C vollständig zu 6-APS und
Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 10 Einheiten Penicillin G eingesetzt werden. (Eine
Enzymeinheit (E) ist definiert als die Aktivität, die 1/uMol
Pencillin G pro Minute bei 370C zu 6-APS und Phenylessigsäure
hydrolysiert). Werden pro Einheit Penicillinacylase 5 χ 10 Einheiten Penicillin G eingesetzt, dauert die vollständige
Spaltung 6'Std.. Es sind auch kürzere Reaktionszeiten
bei noch höherem Enzymeinsatz möglich. Entsprechend muß man um so langer spalten, je weniger Enzym verwendet
wird. Spaltungszeiten von mehr als 20 Stunden führen aber infolge der Inaktivierung von Pencillin und/oder 6-APS zu
Ausbeuteeinbußen.
Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 380C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die
Aktivität des Enzyms' ab. Wird die Spaltung z.B. bei 25°C durchgeführt, muß doppelt soviel Enzym wie bei 38°C eingesetzt
werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden
sollen.
Die Aktivität der unlöslichen trägergebundenen Penicillinacylase nimmt deutlich in Lösungen mit höherer Substrat-Konzentration
ab. Die Spaltung einer Lösung mit 75.000 E/ml Penicillin G dauert 12 Std. und mit 150.000 E/ml 15 Std., '
wenn nur die Konzentration, nicht aber das Verhältnis Enzym zu Penicillin G geändert wird. Vorzugsweise werden Lösungen
mit 75.000 - 100.000 E/ml Penicillin G eingesetzt.
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Die 6-APS läßt sich einfach isolieren, wenn das'erfindungsgemäße
Enzympräparat verwendet wird. Der Anteil an trägergebundener Penicillinacylase ist mit 0,05 Gew.-% so gering,
daß am Träger kaum 6-APS adsorbiert werden kann. Die trägergebundene
Penicillinacylase läßt sich nach der Spaltung durch Zentrifugation oder Filtration abtrennen und mehrmals für
weitere Spaltungsansätze einsetzen.
Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird aus
der Reaktionslösung, welche vom unlöslichen Enzym abgetrennt und dann im Vakuum konzentriert wurde, durch Ausfällung am
isoelektrischen Punkt bei pH 4,3 kristallisiert erhalten.
Bei der Spaltung von Penicillin G mit dem erfindungsgemäßen
unlöslichen Enzympräparat werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten als bei Verwendung von E. coli-Sehlamm.
So wurde, wie im Beispiel gezeigt wird, 6-APS bei mehrfachem
Einsatz der unlöslichen Penicillinacylase in einer durchschnittlichen Ausbeute von 87 % d. Th. isoliert. Die Reinheit
der Präparate betrug im Durchschnitt 97 %. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung.
Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäßen 6-APS ausgeschlossen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
57 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase (spezifische Aktivität 0,044 E/mg), die nach dem Verfahren der DOS.......
(Anmeldung Le A 14 043 vom gleichen Tage) hergestellt wurde,
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und 160 g Penicillin G-Kalium werden nacheinander zu 2500
ml Wasser gegeben und "bei 38° gerührt. Die Mischung hält
man durch Zugabe von Triäthylamin konstant bei pH 7,8. Nach 12 Stunden wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Das
trägergebundene'Enzym wird abfiltriert, mit jeweils 100 ml
Wasser und 100 ml 0,2 m Kochsalzlösung nachgewaschen und für weitere Spaltungsansätze erneut eingesetzt. Das Filtrat
einschließlich Waschwasser engt man im Vakuum auf 300 ml ein und fällt die 6-APS am isoelektrischen Punkt bei pH 4,3
in Gegenwart von 500 ml Methylisobutylketon aus. Nach Stunden bei 50C filtriert man ab und wäscht mit 200 ml Wasser
und mit 200 ml Aceton nach. Getrocknet wird im Vakuum bei 400C.
Schmp. 2080C, Ausbeute 88,3 % d.Th.
Die trägergebundene Penicillinacylase wurde nacheinander wie zuvor beschrieben zehnmal zur enzymatischen Spaltung
von Penicillin G eingesetzt. Die erzielten Ausbeuten sind nachstehend zusammengestellt:
2. Spaltung 87,8
3. Spaltung 86,3
4. Spaltung ' _ ·8&,·2' ' ·
5. Spaltung 87,5
6. Spaltung 86,9
7. Spaltung 88,1 v
8. Spaltung . 87/5 9* Spaltung . 85,0
10. Spaltung 86,5
0 87,2 % Beispiel 2;
110 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase (spez. Akti-
110 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase (spez. Akti-
- 6 Le A 14 044
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vität 0,044 E/mg) werden wie im Beispiel 1 beschrieben mit 160 g Penicillin G-Kalium in 2500 ml Wasser 6 Std. bei 380C
und pH 7,8 gerührt. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 89,5 % d.
Th. - ■ . -
30 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase (spez. Aktivität 0,044 E/mg) werden wie im Beispiel 1 beschrieben mit
160 g Penicillin G-Kalium in 2500 ml Wasser 20 Stunden bei 380C und pH 7,8 gerührt. Die Ausbeute an 6-APS beträgt
86,1 % d. Th.
— 7 —
Le A 14 044
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Claims (3)
- Patentansprüche - . ·M)} Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatisch© Spaltung von Penicillinen, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicillinlösungen "bei pH 6-8, vorzugsweise 7-7,8 und Temperaturen von 20-500C, vorzugsweise 380C, mit Suspensionen von Penicillinacylasen, die kovalent an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbieaerylamid und Maleinsäureanhydrid gebunden sind, 3-20 Stunden in Berührung bringt, das Gemisch neutralisiert und 6-Aminopenicillansäure in an sich be- ■ kannter Weise isoliert.
- 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicillin G-Lösung verwendet.
- 3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Neutralisierung des sauren Gemisches·· organische Amine, vorzugsweise Triethylamin, verwendet.- 8 -
Le A 14 Okh309821/1190
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